Pérez, 2013 Tesis Veronica
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8/16/2019 Pérez, 2013 Tesis Veronica
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALCENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PIGMENTANTE DE HARINA DEJAMAICA (Hibiscus sabdariffa) EN PECES DE ORNATO (Carassius
auratus)
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DEDOCTORADO EN CIENCIAS
EN
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
PRESENTA
M. en C. VERÓNICA PÉREZ ESCALANTE
DIRECTORES
Dra. ALMA ANGÉLICA DEL VILLAR MARTÍNEZDr. GABRIEL AGUIRRE GUZMÁN
Yautepec, Morelos, Septiembre 2013
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El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Biología Molecular del
Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del
Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Alma Angélica Del Villar
Martínez y del Dr. Gabriel Aguirre Guzmán. Para la realización de los estudios se
contó con el apoyo económico (202136) de CONACyT. La investigación fue
realizada con el financiamiento otorgado por el proyecto Fomix-Morelos (93763).
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AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Politécnico Nacional que a través de ceprobi me permitió realizar mis
estudios de doctorado. A la Dra. Alma Angélica Del Villar por haberme permitido trabajar en su grupo enel Laboratorio de Biología Molecular. Por su dirección en el trabajo y confianzapara la realización del mismo.
Al Dr. Pablo Emilio Vanegas por sus observaciones y comentarios para elfortalecimiento del manuscrito.
Al Dr. Gabriel Aguirre Guzmán por su valiosa aportación en la revisión de la tesis ycomentarios que contribuyeron al mejoramiento del manuscrito. También por elrecibimiento en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Autónomade Tamaulipas para la realización de la parte de histología.
A la Dra. Liliana Alamilla por su apoyo en el uso del equipo de secado poraspersión para la realización del trabajo.
A todos los integrantes del comité tutorial por sus observaciones y comentariosdurante la realización del trabajo.
A todos los miembros del área administrativa por el apoyo para la realización delos trámites durante el desarrollo de la tesis.
A todos mis compañeros y amigos del laboratorio por su apoyo en los diferentesmomentos durante mi estancia en este lugar de trabajo.
A todos mis compañeros y amigos de ceprobi y los que ya no están en ceprobipero que estuvieron en algún momento, que me alentaron para que culminara misestudios.
A mi familia que estuvo apoyándome en todo momento para que llegara aconcluir esta etapa de mi vida. En especial a mi papá, hermanos por suconfianza y apoyo. A mí cuñada Norma por la ayuda y apoyo que me habrindado. A mis sobrinos Beni, Marquitos, Sebas y Marlen que los quieromucho.
Gracias a todos…
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ÍNDICE DE CONTENIDO
ÍNDICE DE TABLAS…………………………………………………………….... xiii
NDICE DE FIGURAS…………………………………………………………….. xiv
RESUMEN………………………………………………………………… ............. xvi
ABSTRACT………………………………………………………………………… xviii
CAP TULO 1. EFECTO DE LA HARINA DE JAMAICA (Hibiscus
sabdar i f fa ) ADICIONADA A LA DIETA DEL PEZ DORADO (Carassius
auratus )……………………………………………………………………………. 1
1.1. Introducción……………………………………………… .………………….. 1
1.2. Marco teórico.……………………………………………………………….... 3
1.2.1. Cultivo de peces de ornato………………...…………………………... 3
1.2.2. Importancia del alimento en la acuacultura………………………….. 6
1.2.3. Aspectos generales de la pigmentación de los peces……………… 7
1.2.4. Uso de los pigmentos en la acuacultura……………...……………... 8
1.2.5. Uso de los pigmentos en los peces de ornato…………………… ..... 11
1.2.6. Hibiscus sabdariffa (jamaica)............................................................ 13
1.2.7. Propiedades de las antocianinas……...……………………………... 14
1.3. Justificación………………………………………………………………… .. 18
1.4. Objetivos................................................................................................... 19
1.4.1. Objetivo general………………………………………………………… 19
1.4.2. Objetivos específicos..……………………….………………………..... 19
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1.5. Materiales y Métodos……………………………………………………… ... 20
1.5.1. Material vegetal………………………………..………………………... 20
1.5.2. Extracción y cuantificación de antocianinas……………..………….. 20
1.5.3. Elaboración de dietas experimentales…………………….……….... 21
1.5.4. Cría experimental de los peces……………………………...………... 21
1.5.5. Parámetros biométricos evaluados………………………….………... 22
1.5.6. Análisis histológico……………………………………………..………. 23
1.5.6.1. Fijación de los tejidos…..…………………………………..……... 23
1.5.6.2. Deshidratación de los tejidos……………………………………. 23
1.5.6.3. Inclusión de los tejidos…………………………………………… 23
1.5.6.4. Corte de las muestras………...…………………………………. .. 23
1.5.6.5. Tinción histológica con hematoxilina y eosina…......…..……... 24
1.5.6.6. Análisis de las muestras en microscopio óptico..…………....... 24
1.5.7. Análisis estadístico……….……………………………………………. 24
1.6. Resultados y Discusión………………………………………...………… ... 26
1.6.1. Composición de la harina de jamaica………………………………... 26
1.6.2. Concentración de antocianinas………………………………………. 28
1.6.3. Efecto de las dietas experimentales…………………………………. 29
1.6.4. Análisis de la piel de los organismos alimentados con harina de
jamaica …………………………………………………………………………. 33
1.7. Conclusiones………………………………………………………………. ... 40
1.8. Referencias…………………………………………………………………... 41
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CAP TULO 2. OBTENCI N DE MICROENCAPSULADOS DE
ANTOCIANINAS DE JAMAICA (Hibiscus s abdar i f fa )……………………... 53
2.1. Introducción…………………………………………………………………... 53
2.2. Marco teórico………………………………………………………………..... 54
2.2.1. Generalidades de la microencapsulación………………………........ 54
2.2.2. Secado por aspersión…………………………………………………... 57
2.2.3. Etapas del secado por aspersión……………….……………….......... 58
2.2.4. Aplicaciones de la microencapsulación……………………………… 60
2.2.5. Maltodextrina como material pared………………………………….... 61
2.2.6. Tamaño y distribución de partícula………………………………….... 62
2.2.7. Caracterización morfológica y microestructural de los
microencapsulados…...…………………..……………………….………….. 63
2.2.8. Forma de las partículas…………………..…………………………….. 64
2.2.9. Microestructura de las partículas…………………………………….... 65
2.3. Justificación…………………………………………………………………… 66
2.4. Objetivos................................................................................................... 67
2.4.1 Objetivo general…………………………………………………………. 67
2.4.2. Objetivos específicos………………………………………………….... 67
2.5. Materiales y Métodos………………………………………………………... 68
2.5.1. Extracción y cuantificación de antocianinas de jamaica.…..…….... 68
2.5.2. Elaboración de microencapsulados………………………………….. 69
2.5.3. Determinación de sólidos totales…………………………………….. 69
2.5.4. Secado por aspersión…………………………………………………... 69
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2.5.5. Análisis de los microencapsulados por microscopia electrónica de
barrido (MEB)…………………………........…………………………………… 70
2.5.6. Distribución de tamaño de los microencapsulados……………….... 70
2.5.7. Eficiencia de microencapsulación…………………………………..... 70
2.6. Resultados y Discusión………………………………………………………. 72
2.6.1. Microencapsulación de antocianinas……………………………….... 72
2.6.2. Determinación de la humedad de los microencapsulados………... 72
2.6.3. Morfología de los microencapsulados…………….…………………... 73
2.7. Conclusiones……………………………………………………………….... 79
2.8. Referencias…………………………………………………………………... 80
CAPÍTULO 3. EFECTO DE LA DIETA ADICIONADA CON
ANTOCIANINAS MICROENCAPSULADAS EN PECES DE ORNATO
Carassius auratus ……………………………………….……………………..... 89
3.1. Introducción…………………………………………………………………... 89
3.2. Marco teórico.……………………………………………………………….... 90
3.2.1. Función y organización de los cromatóforos en la piel de los
peces......................................................................................................... 90
3.2.2. Función de los cromatóforos en la piel.………...………………….... 93
3.2.3. Características de los cromatóforos…………………………………. 94
3.2.4. Crecimiento de los organismos acuáticos………............................ 98
3.2.5. Alimentos microencapsulados......................................................... 99
3.3. Justificación………………………………………………………………...... 102
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3.4. Objetivos................................................................................................... 103
3.4.1. Objetivo general………………………………………………………… 103
3.4.2. Objetivos específicos………………………………………………….. 103
3.5. Materiales y Métodos……………………………………………………….. 104
3.5.1. Dietas experimentales adicionadas con pigmentos
microencapsulados……………………………………………………………. 104
3.5.2. Cría experimental de los peces………………………………………. 104
3.5.3. Evaluación de los parámetros biométricos…………………………... 105
3.5.4. Análisis histológico…………………………………………………...... 105
3.5.5. Observación de las muestras en el microscopio óptico……………. 106
3.5.6. Análisis estadístico…………………………………………………….. 108
3.6. Resultados y Discusión……………………………………...……………… 109
3.6.1. Evaluación de las dietas experimentales……………………………. 109
3.6.2. Análisis estructural……………………………………………………... 115
3.6.3. Identificación de las células en la piel..……………………………… 117
3.6.4. Distribución de las células epidérmicas……………………………… 117
3.7. Conclusiones………………………………………………………………… 121
3.8. Referencias…………………………………………………………………... 122
Recapitulación………………………………………………………………......... 132
Anexos…………………………………………………………………………...... 134
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ÍNDICE DE TABLAS
CAPÍTULO 1
No. Pág
1.1 Lista de peces or namentales cultivados en México.……………..... 5
1.2 Paso para la tinción con hematoxilina y eosina para la
observación de células pigmentantes……………………………..... 25
1.3 Composición de la harina de jamaica (Hibiscus sabdariffa)............ 27
1.4 Efecto de la harina de jamaica en los parámetros biométricos en
Carassius auratus............................................................................ 31
CAPÍTULO 3
3.1 Pasos para teñir los cromatóforos con hematoxilina y eosina para la
observación de las células…………….……………………………....... 107
3.2 Efecto de las dietas adicionadas con microencapsulados de
jamaica (H. sabdariffa) en los parámetros biométricos de (C.
auratus)……........................................................................................ 111
3.3 Número de células epiteliales en la cabeza, dorso y aleta caudal
alimentados con antocianinas microencapsuladas………………….. 120
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ÌNDICE DE FIGURAS
No. CAPÍTULO 1 Pág.
1.1 Principales antocianinas distribuidas en la naturaleza y su
estructura general............................................................…………… 16
1.2 Tejido de la cabeza del control donde se ubican los cromatóforos... 34
1.3 Identificación de los iridóforos en tejido de los peces alimentados
con las dietas experimentales………………………………………….. 36
1.4 Número de cromatóforos por campo en diferentes partes del
cuerpo de Carassius auratus, alimentados con diferentes
concentraciones de antocianinas………………..………………….... 38
1.5 Cortes histológicos de los peces alimentados con las dietas
experimentales.................................................………………………. 39
CAPÍTULO 2
2.1 Formas de microencapsulación…………………………….…............. 56
2.2 Principio del funcionamiento del secado por aspersión……............. 59
2.3 Estructura externa de los microencapsulados….……………………. 74
2.4 Tamaño de los microencapsulados…………………………………… 77
2.5 Eficiencia de microencapsulación...................................................... 78
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CAPÍTULO 3
3.1 Esquema de las principales estructuras de la piel de peces............. 92
3.2 Distribución de las células en la piel de los peces…….…………….. 96
3.3 Apariencia física de los peces alimentados con dietas adicionados
con microencapsulados de antocianinas……………..……………….. 114
3.4 Corte histológico de C. auratus...................................……................ 116
3.5 Cortes de las diferentes zonas del cuerpo de C. auratus…………… 118
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RESUMEN
En este estudio se evaluó el efecto de los pigmentos de la jamaica (Hibiscus
sabdariffa) sobre el crecimiento y la pigmentación de la piel en peces de ornato (C.
auratus). En una primera evaluación se analizó el efecto de la harina de jamaica
en la dieta de C. auratus. Posteriormente los pigmentos de la harina de jamaica se
microencapsularon para su protección contra los diversos factores ambientales,
éstos se adicionaron a la dieta de los peces, y se evaluó su efecto en los
parámetros biométricos y en la pigmentación. Los peces se alimentaron con dietas
adicionadas con la harina de brácteas de jamaica a diferentes concentraciones
(40, 80 y 160 mg de pigmento/kg alimento) y microencapsulados (150, 300 y 450
mg de pigmento/kg alimento). Los peces experimentales se evaluaron durante 8
semanas, se alimentaron tres veces al día a una proporción del 6% con relación al
peso. En ambos experimentos se evaluaron los parámetros biométricos: peso
final, tasa de crecimiento, consumo de alimento, tasa de conversión alimenticia y
supervivencia. Se evaluó la presencia de las células que almacenan los pigmentos
en la piel. Las dietas adicionadas con harina de jamaica no fueron rechazadas por
los peces y no se observó un efecto negativo en los parámetros biométricos, se
observó incremento en la tasa de crecimiento en los peces alimentados con las
dietas analizadas, así como también se observó la presencia de células que
podrían almacenar pigmentos, se logró identificar melanóforos e iridóforos
distribuidos en la piel. Se observó una mayor densidad de células que acumulan
pigmentos, en la cabeza seguida de la aleta caudal y el dorso. Los
microencapsulados se analizaron estructuralmente antes de ser adicionados a las
dietas; se observaron partículas de forma esférica y de superficie lisa, con un
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tamaño de 1.5-17 µm, algunas presentaron forma irregular con hendiduras en la
superficie, pero libres de grietas o rupturas, la eficiencia de encapsulación fue del
87% lo que sugiere que tanto el material pared como las condiciones del secado
fueron las adecuadas para la obtención de antocianinas microencapsuladas. Con
las dietas adicionadas con microencapsulados de 150 y 300 mg de pigmentos/kg
de alimento se mostró un incremento en el crecimiento y peso ganado comparado
con el control (P˂0.05). Con la concentración de 450 mg de pigmentos en la dieta,
el crecimiento y los parámetros biométricos no se vieron favorecidos. En los cortes
histológicos se observaron principalmente células epiteliales y mucosas en la
epidermis. No se lograron identificar células que acumulan pigmentos por lo que
se sugiere que los pigmentos microencapsulados no se asimilaron por el pez, pero
por otro lado se puede recomendar la dieta adicionada con microencapsulados a
ciertas concentraciones de pigmentos de jamaica para el crecimiento y la harina
de las brácteas de jamaica como aditivo también para incrementar el crecimiento y
la pigmentación de la piel de peces ornamentales.
Palabras clave: Carassius auratus, Hibiscus sabdariffa, pigmentos,
microencapsulados, crecimiento
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ABSTRACT
In this study, the effect of roselle (Hibiscus sabdariffa) pigments on growth
and skin pigmentation in ornamental fish (Carassius auratus) was evaluated in a
first evaluation the effect roselle calyx flour added to the C. auratus diet was
analyzed. Subsequently the flour pigments were microencapsulated for protection
against various environmental factors, they were added to the diet of fish, and
assessed effect on biometric parameters and pigmentation. The fish were fed with
diets added with roselle calyx flour at different concentrations (40, 80 and 160 mg
of pigment/kg feed) and microencapsulated (150, 300 and 450 mg of pigment/kg
feed). Experimental fish were evaluated for 8 weeks, were fed three times daily at
rate of 6% relative to the weight. In both experiments biometric parameters were
evaluated: final weight, growth rate, feed intake, feed conversion rate and survival.
The presence of the cells that store the pigments in the skin was evaluated. Diets
with added roselle flour were not rejected by the fish and no negative effect was
observed in the biometric parameters, increased growth rate, and the presence of
cells that could store pigments were also observed iridophores and melanophores
distributed on the skin were identified. A higher pigment-accumulating cell density
was observed in the head followed by the caudal fin and dorso.
Microencapsulated, were structurally analyzed before being added to the diet,
spherical particles with a smooth surface were observed, with a size from 1.5-17
µm, with some irregularly shaped on the surface, but free of cracks or ruptures,
encapsulation efficiency was 87% suggesting that both the wall material as the
drying conditions were appropriated for obtaining microencapsulated anthocyanins.
The diet added with 150 and 300 mg of microencapsulated pigments/kg feed,
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showed an increased growth and weight gain compared to control (P˂0.05). With
450 mg of pigment concentration in the diet, growth and the biometric parameters
were not favored. In histological sections mainly epithelial and mucosal cells were
mainly observed in the epidermis. It was not possible to identify pigment
accumulating. Cells so suggested that microencapsulated pigments have not been
assimilated by the fish, but otherwise can recommend the diet supplemented with
microencapsulated roselle pigments for growth and roselle calyx flour as additive to
increase growth and pigmentation of ornamental fish.
Keywords: Carassius auratus, Hibiscus sabdariffa, pigments, microencapsules
growth.
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CAPÍTULO 1
EFECTO DE LA HARINA DE JAMAICA (Hibiscus sabd ar if fa ) ADICIONADA A
LA DIETA DEL PEZ DORADO (Carassius auratus )
1.1. Introducción
La producción de peces de ornato es una actividad importante en la
comercialización, así como también uno de los pasatiempos más populares en el
mundo, siendo esta actividad relevante para el desarrollo económico de países no
desarrollados (Livengood y Chapman, 2007). Carassius auratus es uno de los
peces de ornato más populares y tienen un alto valor en el mercado. La forma del
cuerpo, aletas, tamaño y pigmentación del mismo, son criterios importantes que
determinan el precio en el comercio de los organismos. Para lograr una mejor
aceptación así como el precio de los peces y, debido a que estos organismos
obtienen sus pigmentos a partir de lo que consumen, éstos deben ser alimentados
con dietas con pigmentos hasta lograr un color rojo o anaranjado (Paripatanamont
y col., 1999; Gouveia y Rema, 2005).
La pigmentación de los peces dorados se ha logrado a través de la dieta
suplementada con pigmentos sintéticos como de zeaxantina, luteína o astaxantina
y se han observado que mejoran la pigmentación de la piel del organismo. Sin
embargo, estudios recientes se han enfocado en usar compuestos naturales como
una alternativa a los pigmentos sintéticos, debido a que existe la preocupación de
que los pigmentos sintéticos puedan tener efectos adversos en el metabolismo del
organismo además de los altos costos de los mismos (Gomes y col., 2002).
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Una dieta rica en pigmentos de diversas fuentes naturales puede mejorar la
pigmentación de la piel del organismo (Meyers, 2000). Para ello se han utilizado
algunas plantas que contienen carotenoides como las algas Arthrospira maxima,
Chlorella vulgaris Haemotococcus pluvialis y Xanthophyllomyces dendrorhous
(Gouveia y col., 2003; Gouveia y Rema, 2005; Xu y col., 2006), y plantas como
Medicago sativa (Yanar y col., 2008). Se ha demostrado que los carotenoides
además de pigmentar la piel, también tienen una función como nutrientes y son
vitales para el crecimiento y la reproducción en organismos acuáticos (Miki, 1991).
Sin embargo, Bjerkeng y col. (2000) comentan que la eficiencia de pigmentación
de los peces está influenciada por el tipo de pigmento, fuente del mismo,
concentración, longitud de cadena del pigmento e ingredientes que posee la dieta
y de otros factores como tamaño del pez, edad, tiempo de alimentación,
composición de la dieta, madurez sexual, factores genéticos y ambientales
(Torrisen, 1985; Paripatanamont y col., 1999; Xu y col., 2006).
Existen otras fuentes naturales de pigmento, además de los carotenoides
que pueden ser una alternativa para la pigmentación de los peces. Las
antocianinas, son moléculas responsables de la coloración roja, violeta y azul de
algunos tejidos específicos de las plantas (Prior y Wu, 2006). Esta propiedad de
pigmentación y su baja toxicidad ha abierto la posibilidad de usarlos como
colorantes naturales en los alimentos (Hirunpanich y col., 2005). En la acuacultura
existen pocas investigaciones de las antocianinas relacionadas con su capacidad
pigmentante en los organismos acuáticos, es por ello que este punto es relevante
en la presente investigación.
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En este experimento se utilizó como fuente de pigmentos la jamaica ( H.
sabdariffa), la cual pertenece a la familia de las malváceas y se cultiva en regiones
tropicales. Esta planta posee compuestos fenólicos como las antocianinas, que le
dan el color rojo a las brácteas, los cuales se emplean como aromatizante en
salsas, jaleas, mermeladas, bebidas y como colorante en los alimentos (Ju y
Howard, 2003). Garzón. (2008) señala que en México, la producción de jamaica se
concentra en quince estados dentro de los cuales destacan: Guerrero (60%),
Oaxaca (21%), Nayarit y Michoacán (4%). Por lo que la jamaica es sugerida para
utilizarse como una alternativa de pigmentos naturales para diversos propósitos en
la acuacultura.
1.2 Marco teórico
1.2.1 Cultivo de peces de ornato
En términos generales, los peces ornamentales se describen como
organismos acuáticos almacenados en un acuario, como un pasatiempo o
distracción para el público. Los peces más cultivados para el comercio son los
organismos de agua dulce (Livengood y Chapman, 2007). En Estados Unidos
(EU), Florida es el estado que más peces ornamentales produce representando el
95% de la producción. Los productores de peces de ornato cultivan 800
variedades de organismos de agua dulce, con una producción en el 2003 de 47
millones de dólares (Hill y Yanong., 2006). En general, la industria ornamental
genera aproximadamente ingresos que van desde 175 a 247 millones de dólares
al año aproximadamente, solamente en EU (FAO, 2006; Hill y Yanong, 2006).
Otros países que propagan tradicionalmente peces de ornato son China,
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Indonesia, Japón, Malasia, Singapur y Tailandia; recientemente el cultivo de peces
ornamentales se ha extendido a otras regiones como Bélgica, España, Holanda,
Israel, y la República Checa (Livengood y Chapman, 2007).
En cuanto a la generación de recursos económicos, se estima que la
importación al mayoreo en los distintos países es de aproximadamente 900
millones de dólares y al menudeo es de aproximadamente 300 millones de dólares
con una tasa de crecimiento del 14% anual desde 1985, estimándose un valor de
15 mil millones al año (Panné-Huidobro y Luchini, 2008).
En México, la acuacultura se inició en la década de los 70's desde ahí se ha
convertido en una actividad económica y de beneficio social (FAO, 1999). En este
país el estado que más se ha dedicado al cultivo de peces de ornato es Morelos,
ya que se coloca en primer lugar a nivel nacional al tener, 290 unidades de
producción de peces ornamentales, con una producción de aproximadamente 20
millones de peces y una derrama económica de 58 millones de pesos. Cabe
destacar que esta actividad genera alrededor de 1,700 empleos, mismos que
podrían duplicarse, si se impulsa mejores líneas de exportación y rendimientos de
mercado. Anualmente 20 variedades de peces de ornato producidos en México se
exportan a Los Ángeles, California, E.U. La Tabla 1.1 muestra los principales
peces de ornato que se cultivan en México.
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Tabla 1.1. Especies de peces ornamentales cultivados en México (FAO, 2003)
Nombre científico Nombre común
Astronotus ocellatus Oscar
Brachydanio albolineatus Pez rosa
B. rerio Pez cebra
Carassius auratus Carpa dorada
Cichlasoma severum Disco severum
Cyprinus carpio Carpa koi
Hyphessobrycon spp. TetraLebistes reticulatus Guppy
Mollienesia velífera Molinesia
M. latipinna
M. sphenops
Rasbora spp. Rasbora
Trichogaster leeri Gurami perla
T. trichopterus Gurami azul
T. cosby Gurami mosaico
T. microlepis Gurami luz de luna
Puntius spp. Barbos
Pterophyllum scalare Escalario
Xiphophorus helleri Pez espada
X. maculatus Platy
X. variatus Platy variatus
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1.2.2 Importancia del alimento en la acuacultura
Es fundamental una nutrición adecuada en los animales para mantener un
buen sistema de producción, económicamente sustentable así como organismos
saludables y productos de alta calidad. En el cultivo de los peces, la nutrición es
importante porque debe cubrir todas las necesidades del organismo, y es una
actividad que representa del 40 al 50% de los costos de producción. Las dietas de
los peces han ido cambiando con los años, y se han desarrollado nuevos
alimentos que promueven el crecimiento, además de mejorar la salud de los
organismos (Francis-Floyd, 2002).
En México, la industria de alimentos balanceados para acuacultura ha
incrementado hasta un 150% en los últimos años, lo cual contribuye con 65
millones de dólares, este incremento ha sido proporcional a la producción de
peces ya que cada año aumenta de un 10 a un 14% (FAO, 2006) por lo que el
consumo de alimentos se ha triplicado. Las principales industrias fabricantes de
alimentos son: Aceitera de Junta, Agribrands Purina, Forrajes El Barro, Malta
Clayton, Piasa, Rangen, Silver Cup, Super-Zeigler, y Zenzone. Agribrands Purina
es la que tiene el dominio del mercado (60%). El principal reto que tienen estos
fabricantes de alimentos es aumentar el volumen de producción así como mejorar
el precio de venta (http://www.panoramaacuicola.com/articulos_y_entrevistas.html)
Los alimentos para peces se encuentran disponibles en dos formatos según
su contenido de humedad: en forma de gránulos secos (humedad
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fáciles de almacenar, transportar y distribuir. Estos se elaboran en forma de copos
u hojuelas y tienen la ventaja de ser suaves, pequeños, mejor estabilidad en agua
y mayor digestibilidad, por lo mismo son usados ampliamente en peces de ornato
(Castelló, 2000; Francis-Floyd, 2002). Los alimentos semi-húmedos requieren de
un tratamiento adicional antes de ser suministrado, este se mezcla con alimentos
secos para que absorban parte de la humedad o bien ser secados para mejorar el
tiempo de almacenamiento. Esta segunda forma de presentación es la preferida
por algunas especies ya que puede tener mejor palatabilidad y digestibilidad,
proporcionando mejores resultados (FAO, 1999).
1.2.3 Aspectos generales de la pigmentación de los peces
La determinación del color en la piel de los peces es un proceso complejo
que involucra una serie de factores celulares, fisiológicos y genéticos. Algunos de
estos factores producen un fenotipo de color estable mientras que otros están
influenciados por el ambiente, el cual puede producir cambios en el fenotipo
(Colihueque, 2010).
Los factores celulares en la pigmentación involucran la existencia de células
especializadas llamados cromatóforos, las cuales pueden almacenar pigmentos
específicos. Existen al menos cinco tipos de cromatóforos en los peces:
eritróforos, iridóforos, leucóforos, melanóforos, y xantóforos. Este tipo de células
pueden almacenar pigmentos específicos de color amarillo, anaranjado o rojo
(carotenoides), azul, dorado, iridiscente o plateado (guanidina), blanco (gránulos
de guanina), negro o café (melanina). Algunos de estos cromatóforos pueden
absorber luz, como es el caso eritróforos, melanóforos, xantóforos, mientras que
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otros pueden reflejar luz como ocurre con los iridóforos y leucóforos generando
colores iridiscentes debido a sus variaciones en la organización estructural de sus
organelos cristalinos basados en la estructura de purina (Fujii, 2000).
1.2.4 Uso de los pigmentos en la acuacultura
En la naturaleza existen muchos pigmentos presentes en las plantas; como
por ejemplo, antocianinas, carotenoides, clorofilas y porfirinas los cuales tienen un
papel importante en las células vegetales protegiéndolas de la fotoxidación
(Palozza y Krinsky, 1992). Los carotenoides son pigmentos que se encuentran
ampliamente distribuidos en la naturaleza y están presentes en muchas algas,
animales, microorganismos y plantas (Britton, 1993). Debido a que los peces no
pueden sintetizar sus propios pigmentos, estos los adquieren de forma natural en
su dieta, es por ello que la acuacultura ha buscado fuentes alternativas de
pigmentos para adicionarlos a los alimentos (Meyers y Latscha, 1990; Torrisen,
1985). Se ha observado que la coloración mejora al incluir fuentes naturales de
astaxantina extraídos de algas (Phaffia rhodozyma) (Moretti y col., 2006),
crustáceos como el camarón (Pleisonika sp.), y levaduras (Haemotococus
pluvialis) (Bowen, 2002), comparados con la astaxantina sintética.
El salmón (Salmon salar ) es uno de los peces con el que más se han hecho
esfuerzos para pigmentar su carne debido a que el color rosa de la misma es muy
apreciado por los consumidores en el mercado (Leclerco y col., 2010). Buttle y col.
(2001) evaluaron la eficiencia de deposición de dos carotenoides en la piel del
salmón reportando que se deposita mejor la cantaxantina que la astaxantina,
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debido a que cada carotenoide difiere en su distribución en los isómeros y debido
a que la absorción o utilización de los pigmentos difiere entre especies.
Los carotenoides proporcionan el color depositándose en la piel o carne de
los peces y algunos como el β-caroteno actúa como fuente de vitamina A. Amar y
col. (2001) determinaron que los pigmentos participan en el mecanismo de
defensa de Oncorhynchus mykiss (trucha arcoíris). Se reportó que la astaxantina,
β-caroteno, y cantaxantina incrementan los factores humorales, complemento
(componentes de la respuesta inmunitaria), actividad de la lisozima, así como los
factores celulares como la fagocitosis y la citotoxicidad no específica.
La astaxantina sintética de forma no esterificada (Carophyll pink) y
esterificada (NatuRose) ha sido empleada en dietas para pargo australiano
(Pagrus auratus) para determinar su efecto en aumentar la pigmentación en piel.
Se reporta que ambos pigmentos de astaxantina incrementan significativamente el
contenido de carotenoides en la piel, sin diferencias entre los dos pigmentos. Lo
contrario sucede en otros peces como el salmón y trucha arcoíris que solo utilizan
astaxantina esterificada o no esterificada (Booth y col., 2004; Doolan y col., 2008).
Kalinowiski y col. (2007) adicionaron harina de camarón como fuente de
astaxantina esterificada evaluando el tiempo de alimentación adecuado para que
P. auratus adulto pudiera adquirir la coloración rosa-rojo. Se observó que el tiempo
de alimentación y concentración de astaxantina esterificada incrementa la
pigmentación del tegumento del pez y la coloración se mantiene estable después
del tratamiento.
Se determinó el efecto de dietas suplementadas con astaxantina en el
camarón blanco Litopenaeus vannemei juvenil, observando que estos organismos
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mejoran su crecimiento, supervivencia y resistencia a ser cultivados bajo
concentraciones de salinidad al contar con este componente en sus dietas (Flores
y col., 2007).
Estos estudios demuestran que la utilización de pigmentos difiere entre
especies y que los carotenoides tienen funciones en los peces tales como:
pigmentar la piel y la carne, servir como antioxidante, favorecer el metabolismo
reproductivo y disminuir los efectos del estrés (Buttle y col., 2001; Wang y col.,
2006).
Investigaciones con otros peces han demostrado que los carotenoides
dietarios juegan un papel importante en la reproducción y la respiración. Con
varias pruebas alimenticias han mostrado que el suplemento con carotenoides en
la dieta también mejora la eficiencia alimenticia, acelera la tasa de crecimiento y
mejora la sobrevivencia larvaria (Meyers, 2000).
Miki. (1991) en su estudio demuestra que la astaxantina tiene fuerte actividad
inhibidora de peroxidación lipídica mediada por formas activas de oxígeno,
también Palozza y Krinsky. (1992) han documentado el papel de la astaxantina
como un antioxidante eficiente. Por lo que sugieren que los carotenoides son
importantes en la protección de los lípidos de las membranas contra la
peroxidación (Miki, 1991).
Durante el crecimiento los salmónidos absorben los carotenoides y los
depositan en el músculo en forma de astaxantina y cantaxantina. Durante la
maduración sexual, el pigmento es movilizado y transferido a la piel en machos y a
los huevos en las hembras. Los estudios más avanzados sobre el metabolismo de
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los pigmentos se han realizado en salmón y se ha observando que la astaxantina
es absorbida, metabolizada, transportada a los tejidos y órgano blanco de los
salmónidos. El carotenoide es reducido a zeaxantina y metabolizado como
vitamina A. la absorción ocurre en el intestino donde el carotenoide es convertido
a vitamina A en la pared intestinal. La astaxantina es transportada en la sangre por
lipoproteínas siendo el hígado el mayor órgano metabólico.
1.2.5 Uso de los pigmentos en los peces de ornato
Algunas características importantes para la calidad en peces de ornato
enviados a mercado son el tamaño, forma y coloración de los mismos. Por lo que
se han realizado esfuerzos para obtener peces con mayor pigmentación en la piel.
En C. auratus se ha evaluado el efecto de la astaxantina en la pigmentación de la
piel, tratando de obtener la dosis adecuada de pigmento (25, 50, 75 y 100mg de
astaxantina) para la coloración así como la estabilidad del color (Paripatanamont y
col., 1999). Los resultados mostraron que 36-37 mg de astaxantina/kg de alimento
es la dosis que permite adquirir y mantener el color después del tratamiento y
observaron que a mayor concentración de pigmentos la distribución de
cromatóforos en la piel se incrementa (Paripatanamont y col., 1999).
Gouveia y Rema (2005) evaluaron el efecto de la astaxantina extraída de
Chorella vulgaris y astaxantina sintética, a concentraciones de 45, 80 y 120 mg de
pigmento y a diferentes temperaturas sobre C. auratus. Demostrando que la mejor
pigmentación fue con astaxantina de C. vulgaris y que la temperatura es uno de
los factores ambientales que influye en la pigmentación logrando una mejor
pigmentación a temperaturas de 26 a 30ºC.
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Se realizaron estudios del efecto de los carotenoides en la pigmentación de
la piel de peces payaso ( Amphiprion ocellaris) en donde se probaron tres tipos de
pigmentos (astaxantina, β-caroteno y cantaxantina) adicionados a la dieta a
concentraciones de 20, 50 y 100 ppm, revelando que la dosis de pigmento no
cambia el brillo, coloración o tonalidad del organismo, pero que el tipo de pigmento
si altera el tono siendo la astaxantina quien incrementó el tono de color rojo.
También se observó que, si este pigmento es eliminado de la dieta, el tono no se
reduce, pero si la saturación del mismo (Yasir y Qin, 2010).
En Hyphessobrycon callistus o pez tetra, se evaluó el uso de astaxantina, β-
caroteno y una mezcla de éstos en la sobrevivencia, crecimiento, pigmentación y
capacidad antioxidante. Se demostró que al incrementar la concentración de
pigmentos, se ve favorecida la coloración en el cuerpo del pez, además este
organismo convierte el β-caroteno a astaxantina para almacenarlo y depositarlo en
la piel y al incrementar la concentración de pigmentos, la coloración en el cuerpo
también es mayor. Además, se ha observado que este tipo de carotenoide tiene
capacidad antioxidante disminuyendo la actividad de las enzimas endógenas
como la superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, alanina transaminasa,
aspartato transaminasa, lo que protege al hígado de los radicales libres (Wang y
col., 2006).
Grether y col. (2008) han observado que los carotenoides también tienen un
efecto en la fecundación y descendencia en Poecilia reticulata (guppies), ya que
estos peces depositan los pigmentos en los huevos favoreciendo la eclosión en un
90%.
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Además de usar pigmentos sintéticos y naturales provenientes de algas y
levaduras, también se han evaluado carotenoides de plantas como Capsicum
annum que contiene capsantina, luteína, zeaxantina y β-criptoxantina. Estos se
han probado en peces de ornato (Zacco platypus) para incrementar la
pigmentación en piel, demostrando que la concentración de capsantina y
zeaxantina incrementa significativamente la pigmentación (Choong-Ryul y col.,
2010).
1.2.6 Hibiscus sabdariffa (jamaica)
Hibiscus sabdariffa es una planta que pertenece a la familia Malvaceae, ésta
se originó en Malasia y es cultivada principalmente en regiones tropicales y
subtropicales (Appell, 2003). En México se le conoce como jamaica y fue
introducido por los españoles durante la colonización (SAGARPA-ASERCA, 1999).
Los principales países productores de la jamaica son China, India y Sudán
entre otros en donde México ocupa el séptimo lugar de esta lista. Su producción
se concentra en 15 estados: Campeche, Colima, Guerrero, Jalisco, Nayarit,
Michoacán, Morelos, Oaxaca, Puebla, Quintana Roo, Sinaloa, Tabasco,
Tamaulipas, Veracruz y Yucatán (INEGI, 2005; Garzón, 2008).
Los cálices deshidratados de la jamaica son apreciados comercialmente
porque a partir de estos pueden obtenerse extractos concentrados de color rojo
con aplicación en la industria alimentaria y farmacéutica. Los compuestos
responsables de esta coloración roja son las antocianinas éstas pertenecen al
grupo de los flavonoides (Galicia-Flores y col., 2008). Además, los cálices de la
jamaica contiene diversos compuestos como: ácido cítrico, acido esteárico, ácido
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málico, ácido protocatecuico, ácido ascórbico, alcaloides, anisaldehído,
antocianinas, cera, galactosa, mucopolisacáridos, pectina, polisacáridos,
quercetina, β-caroteno y β-citosterol (Duke, 2002; Hirupanich y col., 2005).
En algunas regiones, a los extractos de esta planta se les han atribuido
diversas propiedades medicinales con acción astringente, efectos coleréticos,
digestivo, diuréticos, emoliente, reducción de la presión arterial y niveles de
colesterol, y sedativa (Tsai y col., 2002; Duke y col., 2003). También se les ha
señalado con efectos contra la hipertensión (Haji y Tarkhani, 1999; Odigie y col.,
2003), e inflamación (Dafallah y Al-Mustafa, 1996). Chia-Wen y col. (2007)
demostraron que los extractos de H. sabdariffa tienen actividad antioxidante y
antitumoral, así como capacidad para inhibir la oxidación de los lípidos de baja
densidad (LDL) la cual reduce la arterioesclerosis, e inhibe la proliferación de la
células del músculo liso, induciendo la apoptosis.
1.2.7 Propiedades de las antocianinas
Las antocianinas son compuestos solubles en agua, siendo identificadas por
dos tipos de estos compuestos (cianidinas y delfinidinas) (Pouget y col., 1990).
Las antocianinas pertenecen al grupo de los flavonoides y son hidrosolubles,
poseen un peso molecular de 400 a 1200, presentan carga positiva en su
estructura y son moléculas que proporcionan color (azul, morado y rojo). La
mayoría de las antocianinas están glucosiladas en la posición 3´ del anillo C, o en
la posición 5´ y 7´ del anillo A (Prior y Wu, 2006).
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La arabinosa, galactosa, glucosa, ramnosa y xilosa son los azúcares que
están unidos a las antocianidinas como di o tri sacáridos; existiendo
aproximadamente 17 antocianinas, pero solo seis de éstas están ampliamente
distribuidas en la naturaleza y se muestran en la figura 1.1. La antocianinas
pueden presentar también acilaciones como compuestos aromáticos o ácidos
alifáticos, por lo que la estructura de éstas varía dependiendo de su glucosilación
o acilación (Prior y Wu., 2006).
En fase acuosa, las antocianinas pueden presentar diversas formas
moleculares como: base hemiacetal, base quinoidal, catión flavilio, y chalcona, su
color relativo depende del pH (Cooke y col., 2005). Las antocianinas permanecen
estables cuando se encuentra en la forma de catión flavilio y con pH diferentes
posee variaciones en el color rojo (pH 2), incoloro (pH 5) y azul púrpura (pH 7-8).
La estabilidad de las antocianinas puede verse afectada por el pH, oxígeno y
las condiciones de almacenamiento (Kalt y col., 2000). Además de mejorar el color
en los alimentos, las antocianinas pueden prevenir la auto-oxidación de lípidos de
la pared así como la peroxidación de lípidos en sistemas biológicos (Narayan y
col., 1999).
Las antocianinas están relacionadas en muchas actividades biológicas que
impactan de manera positiva en la salud de los humanos (reducción de varias
enfermedades coronarias y cáncer, además de favorecer la actividad
neuroprotectora) (Wrolstad, 2004; Cooke y col., 2005). Las antocianinas más
importantes en las brácteas de jamaica son la delfinidina-3-sambubiósido y
cianidina-3-sambubiósido (Gradinaru y col., 2003; Hou y col., 2005).
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Figura 1.1 Principales antocianinas distribuidas en la naturaleza y su estructura
general (Prior y Wu, 2006).
Antocianinas R1 R2 R3 Espectro luz/visible (color)
Pelargonidina (Pg) H H OH 494 (anaranjado)
Cianidina (Cy) OH H OH 506 (rojo-violeta)
Delfinidina (Dp) OH OH OH 508 (violeta-azul)
Feonidina (Pn) OCH3 H OH 506 (anaranjado-rojo)
Petunidina (Pt) OCH3 OH OH 508 (azul-rojo)
Malvidina (Mv) OCH3 OCH3 OCH3 510 (azul-rojo)
c
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En la planta, las antocianinas poseen diferentes funciones como la atracción
de polinizadores, para la dispersión de semillas y la protección contra los rayos
UV. El color está dado por el número y la posición de los grupos hidroxilo y
metoxilo en la molécula, el incremento de grupos hidroxilo producen tonalidades
hacia el color azul mientras que incrementos de grupos metoxilo producen
coloración roja (Garzón, 2008).
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1.3 Justificación
En la acuacultura, el color de la piel de los peces de ornato es muy
importante ya que es un indicador de la calidad del pez y puede afectar su
aceptación en el comercio además de su precio. Por ello es que para mejorar el
color de la piel y músculo en algunos peces se han usado pigmentos sintéticos
que usualmente son agregados a la dieta comercial.
Se ha reportado que la adición de los pigmentos en el alimento incrementa
los costos de producción del alimento así como la misma operación del sector
acuacultura. Por ello es que se buscan alternativas disponibles y de bajo costo
que sustituyan a los pigmentos sintéticos. La jamaica puede ser considerada como
un pigmento alternativo para la pigmentación de peces de ornato dado que se ha
observado que posee pigmentos que pueden favorecer la pigmentación de los
peces. Sin embargo su potencial pigmentante requiere ser evaluado para
determinar su aplicación y beneficios en los peces dorados.
Para este estudio se eligió el pez dorado porque es uno de los peces más
populares en el comercio y también es de los más usados como modelo de
estudio para la evaluación de diversos tipos de pigmento, principalmente los
carotenoides por lo que es interesante estudiar el efecto de los pigmentos de
jamaica en la pigmentación de la piel y en los parámetros biométricos de los
mismos.
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1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de los pigmentos de la harina de jamaica de Hibiscus sabdariffa
sobre la pigmentación y los parámetros biométricos del pez dorado (Carassius
auratus).
1.4.2 Objetivos específicos
Conocer la composición fisicoquímica de la harina de la jamaica
Identificar la concentración de antocianinas totales en el cáliz de la jamaica
Evaluar el efecto de las dietas adicionadas con harina sobre los parámetros
biométricos, como respuesta a diferentes concentraciones de pigmento
utilizadas.
Evaluar el efecto de las dietas experimentales sobre la pigmentación de C.
auratus en relación a la acumulación en las células de la piel del pez.
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1.5 Materiales y Métodos
1.5.1 Material vegetal
La jamaica (Hibiscus sabdariffa, línea R5-4N) fue donada por el Ingeniero
Quintín Obispo González. Esta planta fue cultivada en el campo experimental del
Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero (CSAEGRO), Iguala
Guerrero, México. El cáliz seco se molió en un procesador de alimento (Sunbeam,
motor de 220 watts), por 3 min a temperatura ambiente. La harina fue almacenada
a 4ºC en recipientes herméticos y opacos para evitar la degradación de los
pigmentos. La harina se analizó fisicoquímicamente conforme a los siguientes
parámetros: humedad (NOM-116-SSA1-1994), extracto graso (NMX-F-615-
NORMEX-2004), proteína (NMX-F-608-NORMEX-2002), cenizas (NMX-F-607-
NORMEX-2002), fibra cruda (NMX-F.613-NORMEX-2003).
1.5.2 Extracción y cuantificación de antocianinas
A 8 g de la harina de jamaica se le adicionaron 100 mL de etanol acidificado
con ácido clorhídrico al 0.1% (v/v) (Zhao y col., 2008); la suspensión se mantuvo
en agitación orbital (200 rpm) por 24 h en oscuridad, finalmente el extracto se
separó de la harina mediante un filtrado con papel Watman No. 42.
Las antocianinas se cuantificaron mediante espectrofotometría (510-550 nm)
(Longo y col., 2005). El contenido total de las antocianinas (CTA), expresado en
mg de cianidin 3-glucósido equivalentes por 100 g de muestra seca (Zhao y col.,
2008), se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación:
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Donde AB es la absorbancia, e es el coeficiente de extinción molar de cianidin 3-
glucósido (26900); L es la longitud de la celda (1 cm); MW es el peso molecular de
antocianinas con respecto a la cianidina (449.2); D es el factor de dilución; V es el
volumen final (mL) y G es el peso seco en mg.
1.5.3 Elaboración de dietas experimentales
Se utilizó dieta comercial en polvo para tilapia (Agribrands, PURINA S.A de
C.V, México), compuesta de 45% de proteína, 10% de grasa y 4.5% de fibra
cruda. A la dieta comercial se le adicionó almidón de papa (1%) previamente
solubilizado en agua destilada y precalentado a 60ºC (Francis-Floyd, 2002) como
aglutinante. Posteriormente se le adicionó el pigmento a diferentes
concentraciones (40, 80, 160 mg de antocianina/kg de alimento). La dieta control
se elaboró de la misma forma sin adicionarle antocianinas.
La mezcla se peletizó en un molino de alimentos (Sunbeam, 220 watts motor,
Kitchen Aid, Canadá) a fin de obtener pelets de 2 mm de diámetro, los cuales se
secaron en horno a 60ºC por 24 h. Los pelets se almacenaron en obscuridad con
recipientes herméticos y opacos a 4ºC (Royes y Chapman, 2003) para su posterior
uso.
1.5.4 Cría experimental de los peces
Se emplearon alevines de pez japonés (C. auratus) de 8 semanas de edad y
con un peso de 6.3 - 7.4 g, los organismos se aclimataron a las condiciones del
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laboratorio a una temperatura de 25 ± 2ºC, y un nivel de oxígeno disuelto de 7
ppm, alimentándolos con la dieta control durante una semana.
El bioensayo se realizó utilizando peceras de vidrio de 20L con 10 peces por
pecera, los cuales fueron distribuidos homogéneamente. Cada pecera se
consideró como una repetición y cada dieta experimental un tratamiento con tres
repeticiones. Los peces se alimentaron tres veces al día (09:00; 13:00 y 18:00 h)
en una proporción de 6% de peso corporal durante 8 semanas, la cantidad de
alimento se ajustó cada semana (Kalinowski y col., 2007).
El bioensayo se llevó a cabo bajo un fotoperiodo de 12/12 h, con agua libre
de cloro y peceras equipadas con un filtro para extraer los sedimentos. Además se
sifoneó el agua de las peceras una vez por semana reponiendo 1/3 del volumen
total del agua de la pecera y se cambió totalmente el agua cada ocho días (Yanar
y col., 2008). Durante el bioensayo se monitorearon diariamente los siguientes
parámetros: oxígeno disuelto (6-7 ppm), pH (7.3 - 7.5) y temperatura (25 ± 2ºC).
1.5.5 Parámetros biométricos evaluados
Durante el bioensayo se analizaron los siguientes parámetros biométricos:
peso corporal inicial y final, tasa de crecimiento [(peso final (g)-peso inicial
(g))/(peso inicial) * 100]; tasa de crecimiento específico [(Ln peso final (g)-Ln peso
inicial (g)/no. días)*100], el consumo de alimento [consumo de alimento (g) por los
peces durante el período de 8 semanas]; aumento de peso, tasa de conversión del
alimento [consumo de alimento (g)/ganancia de peso (g)] y la tasa de
supervivencia [(peces vivos al final/peces vivos al inicio)*100] (Gouveia y col,
2003; Kalinowski y col., 2007).
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1.5.6 Análisis histológico
1.5.6.1 Fijación de los tejidos
Al final del bioensayo se sacrificaron al azar tres peces por tratamiento, se
removieron 0.5 cm2 de la cabeza, dorso y aleta caudal. Los tejidos obtenidos se
sumergieron en formalina amortiguada al 10%: 100 mL de formalina al 37%, 900
mL de agua destilada, 4 g de fosfato de sodio dihidrogenado monohidratado
(NaH2PO4 H2O), y 6.5 g de fosfato disódico anhídrido (Na2HPO4) por 24 h con la
finalidad de preservar los tejidos (Luna, 1992).
1.5.6.2 Deshidratación de los tejidos
Se inició con una serie gradual de soluciones de alcohol etílico como agente
deshidratante. Las muestras se sumergieron en etanol al 70%, seguida de una
solución al 80%, 2 cambios con alcohol al 96% y 3 cambios de etanol absoluto
todos se incubaron por 60 min. Una vez deshidratada la muestra, se pasó a una
solución de cloroformo concentrado por 60 min para aclarar el tejido (Luna, 1992).
1.5.6.3 Inclusión de los tejidos
La inclusión se realizó infiltrando parafina líquida a 60ºC dentro de un
histocasette con el tejido, se mantuvo por 24 h en parafina y posteriormente se
sacó el histocasette y se guardó a -20ºC para su solidificación (Luna, 1992).
1.5.6.4 Corte de las muestras
Se realizaron 3 cortes histológicos de un área específica de la muestra a 10
mµ de espesor en el micrótomo (LEICA, RM2125, China). Los cortes se colocaron
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en un baño de flotación a una temperatura de 38ºC, con la finalidad de que la
muestra incluida se extienda en el agua y no forme pliegues, la muestra se
recuperó del agua con una laminilla, los cortes se fijaron a 60ºC (Luna, 1992).
1.5.6.5 Tinción histológica con hematoxilina y eosina
La tinción de los cortes se realizó con Hematoxilina de Harris y eosina
amarillenta, cuyo procedimiento se describe en la Tabla 1.2 (Luna, 1992).
Una vez teñidas las muestras, se dejaron en xileno mientras se realizó el
proceso de montaje, la muestra se cubrió con bálsamo de canadá, se colocó un
cubreobjetos para fijar la muestra, evitando que se formaran burbujas, y se dejó
secar a 50ºC (Luna, 1992).
1.5.6.6 Análisis de las muestras en el microscopio óptico
Las muestras se observaron en el microscopio óptico (NIKON eclipse, 80i,
Japón) a diferentes objetivos 20, 40 y 100X. Siendo fotografiados los tejidos con
una cámara de video integrada al microscopio (Data Image, ds 33, Japón). Se
adquirieron 30 campos por tejido para el análisis de imágenes para definir tamaño,
forma y color de las células pigmentadas (Hirata y col., 2003). Se cuantificaron
manualmente los cromatóforos de 30 campos capturados.
1.5.7 Análisis estadístico
Para el análisis de los datos se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de
una vía con una comparación de medias aplicando Tukey con un nivel de
significancia de P˂0.05. El paquete estadístico que se utilizó fue Sigma plot
versión 11.0.
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Tabla 1.2. Paso para la tinción con hematoxilina y eosina para la observación
de células pigmentantes.
Compuesto de tinción de tinción ti Tiempo
Xileno I 3 min
Xileno II 3 min
Etanol xileno 3 min
Etanol absoluto I 3 minEtanol al 90% 3 min
Agua destilada 3 min
Hematoxilina de Harris 10 min
Agua destilada 3 min
Alcohol ácido Tres rápidas sumergidas
Agua destilada Lavar abundantemente
Eosina 20 s a 1 min
Etanol al 96% 2 min
Etanol absoluto II 2 min
Etanol absoluto III 2 min
Xileno III 5 min
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1.6 Resultados y Discusión
1.6.1 Composición de la harina de jamaica
Para este trabajo fue importante conocer la composición proximal del cáliz de
la jamaica ya que se reporta que cambia con respecto a otras variedades
estudiadas por diferentes autores. Además de que es necesario saber qué
componentes se adicionaron a la dieta junto con los pigmentos, dentro de los
componentes del cáliz, se trata de una muestra con un contenido apreciable de
proteína, cenizas y fibra (Tabla 1.3). Se reporta que el componente mayoritario de
los cálices es la fibra dietética. Para esta variedad de planta, el contenido de fibra
fue de 10.02 ± 0.48 g/100 g de peso seco, contra otra variedad de jamaica que
reportan Sáyago-Ayerdi y col. (2007) que contiene 33.9 g/100 g, esta variación se
justifica debido a que son variedades diferentes y además son cultivadas bajo
diferentes condiciones ambientales que influyen en su composición (Babalola y
col., 2001).
Se determinó el contenido de ceniza, en la jamaica se encontró un contenido
de 7.36 ± 0.21 g/100g de peso seco. Babalola y col. (2001) señalan que el
contenido de la ceniza está constituido principalmente de calcio, magnesio,
potasio y zinc. Los valores referenciados en cuanto al contenido de cenizas son
más homogéneos. El potasio y calcio parecen ser los principales componentes
minerales, aunque la jamaica también es fuente interesante de hierro y magnesio
desde el punto de vista nutricional (Babalola y col., 2001). Además, los cálices
presentan en su composición vitaminas tales como tiamina, niacina y
principalmente vitamina C (Morton, 1987).
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Tabla 1.3. Composición de la harina de jamaica (H. sabdariffa)
Determinaciones g/100 g
Humedad % 10.64 ± 0.22
Grasas (g) 0.293 ± 0.0028
Proteína (g) 9.44 ± 0.79
Cenizas (g) 7.36 ± 0.21
Fibra cruda (g) 10.02 ± 0.48
Carbohidratos (g) 72.0
Azúcares reductores % 13.2 ± 0.13
Sodio (mg/kg)
Antocianinas (mg/g)
˂3.0
3.55±0.35
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Se sugiere que los micronutrientes de la jamaica podrían tener un efecto
benéfico en la salud de los peces, ya que se reporta que una deficiencia de estos
elementos en la dieta cotidiana de los peces se asocia a diversas enfermedades,
por ejemplo la presencia de cataratas en los ojos de los salmones específicamente
(Waagbo y col., 2003).
En cuanto al contenido de humedad de la harina, éste fue de 10.64 ± 0.22
g/100 g (Tabla 1.3). Algunos autores reportan que la humedad debe ser menor al
12% del cáliz deshidratado, debido a que los valores elevados de humedad
podrían repercutir en la estabilidad del color, el cual es afectado por la absorción
de agua que incrementa las velocidades de reacción así como el desarrollo de olor
(Gradinaru y col., 2003).
Otros componentes importantes del cáliz de la jamaica son la proteína,
observándose un contenido de 9.44 ± 0.79 g/100 g de muestra seca, grasas 0.293
± 0.0028 g/100 g, y la presencia de las antocianinas (Tabla 1.3). Los pigmentos
proporcionan el color rojo, los cuales está demostrado que tienen capacidad
antioxidante en humanos (Babalola y col., 2001).
1.6.2 Concentración de antocianinas
La concentración de antocianinas en la jamaica fue de 3.55 ± 0.35 mg/g la
cual es mayor en comparación con otras fuentes de pigmentos reportados como
Aristotelia chilensis (Maqui) que reportan una concentración de 2.119 ± 0.6 mg/g
en peso seco (Escribano-Bailón y col., 2006). En maíz morado chino se reporta
una concentración de 3.045 ± 1.63 mg/g de antocianinas totales en las semillas
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secas (Zhao y col., 2008). El contenido de los pigmentos tiene relación con la
metodología que se use para la extracción (Salinas-Moreno y col., 2003), se ha
encontrado que al utilizar metanol acidificado al 1% como solvente de extracción,
la cantidad de pigmentos extraídos aumenta considerablemente. Sin embargo, el
metanol es tóxico, los pigmentos de jamaica se extraen utilizando agua como
disolvente u otros solventes que no sean tóxicos. Para este trabajo se utilizó el
etanol acidificado ya que es un solvente que extrae eficientemente los pigmentos
más que el agua, además no es tóxico y se evapora fácilmente, por lo que se optó
por utilizar este solvente para la extracción de los pigmentos ya que puede ser
utilizado para la elaboración de las dietas debido a que es menos tóxico que otros
solventes (Galicia-Flores y col, 2008).
1.6.3 Efecto de las dietas experimentales
La acuacultura es un sector que se ha dedicado al cultivo de peces y
camarones y es una de las actividades de mayor importancia económica debido a
la alta demanda de sus productos en el mercado. Este sector invierte recursos
económicos para mejorar las dietas usadas en la alimentación de los organismos
bajo cultivo.
Estas mejoras favorecen el nivel nutricional de las dietas, eficientando el
crecimiento, reproducción y otras funciones fisiológicas. Además de la mejora en
el sentido nutricional de las dietas, la acuacultura también tiene el interés de
elaborar dietas con otros aditivos para incrementar la pigmentación de la carne de
los salmones y la piel de peces ornamentales, los pigmentos más utilizados son
los de color rojo o amarillo, principalmente la astaxantina sintética, o de algunas
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fuentes naturales de algas, cianobacterias o plantas (Maltby y col., 2003). Para
algunos peces de ornato ya se han usado fuentes de pigmentos naturales,
principalmente carotenoides que son extraídos de algunas algas, levaduras y
plantas, para incrementar la pigmentación en C. auratus (Paripatanamont y col.,
1999; Gouveia y col., 2003; Gouveia y Rema, 2005).
Los organismos mostraron un comportamiento activo de alimentación a lo
largo del bioensayo, acercándose a la dieta y consumiéndola en cuanto la
detectaban sin dejar residuos de ellas entre 5-8 min después de ser
proporcionada. Los organismos de cada réplica (dieta experimental o control)
consumieron de 40 a 47 g aproximadamente de las respectivas dietas por
semana, observándose una diferencia significativa entre los tratamientos y el
control (Tabla 1.4).
En cuanto a los parámetros biométricos evaluados en este estudio con C.
auratus se encontró que al aumentar la dosis de antocianinas en la dieta, la tasa
de crecimiento y peso ganado se incrementan, con diferencias significativas con
relación al control (Tabla 1.4).
En un estudio realizado con pigmentos de alfalfa, se observó que al
incrementar la dosis de pigmento, la tasa de crecimiento y el peso ganado
disminuye, atribuyéndose a que alguno de los componentes de la planta son
utilizados pobremente por el pez o que actúan como un antinutriente en la dieta
(Yanar y col., 2008). Con este estudio se demuestra que los pigmentos de la
jamaica pueden ser usados en C. auratus para su crecimiento, siendo este el
primer reporte sobre la aplicación de la jamaica como fuente de pigmentos
naturales en C. auratus.
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Tabla 1.4. Efecto de la harina de jamaica (H. sabdariffa) en los parámetros biométricos en C. auratus.
Misma letra en la misma fila no hay diferencia significativa (P˂0.05)
Concentración de pigmentos/kg de alimento (mg/kg)Parámetros Control 40 80 160Peso inicial (g) 7.43 ± 0.14 7.36 ± 0.22 6.33 ± 0.42 7.43 ± 0.23
Peso final (g) 16.73 ± 0.52 19.66 ± 0.60 17.41 ± 2.03 19.58 ± 2.07
Crecimiento (%) 124.63 ± 5.01b 167.15 ± 12.4 9a 163.16 ± 15.91a 176.26 ± 21.92a
Tasa especifica decrecimiento
1.26 ± 0.34b 1.534 ± 0.72a 1.50 ± 0.124a 1.56 ± 0.129ab
Alimento consumido (g) 42.08 ± 2.14ab 47.11±1.64a 40.70 ± 3.12b 44.84 ± 2.55a
Peso ganado (g) 11.70 ± 0.26b 14.08 ± 1.25a 11.69 ± 1.25b 13.38 ± 0.65a
Tasa de conversiónalimenticia
3.70 ± 0.11b 3.34 ± 0.03a 3.04 ± 0.20a 3.35 ± 0.04a
Supervivencia (%) 90.00 ± 0 96.6 ± 5.10 96.6 ± 5.10 96.6 ± 5.10
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En un estudio realizado con Colisa lalia se demostró que al utilizar
antocianinas y betalainas sintéticas en la dieta no presentaron un efecto
significativo en la pigmentación de la piel ni en el crecimiento comparado con el
control (Barón y col., 2008).
Durante el bioensayo se monitoreó la calidad de agua para evitar que los
peces sufrieran algún tipo de estrés. Ya que se reporta que puede afectar el
proceso del crecimiento, el organismo dedica energía para la formación de
estructuras y tejidos, este puede estar afectado por los diferentes factores
ambientales por ello es importante monitorear y mantener la calidad del agua.
(Barker y Scheibling, 2008).
En cuanto a la tasa de conversión alimenticia de los peces, no se observó
diferencia significativa entre los tratamientos, pero al comparar esos resultados
con el control se observaron diferencias, ya que al aumentar la dosis la eficiencia
disminuye (Tabla 1.4). Caso contrario a lo que se reportan con el uso de la alfalfa,
la tasa de conversión es más alta cuando la dosis de pigmentos también aumenta
(Yanar y col., 2008). Se reporta que entre más bajo sea este valor, el organismo
es capaz de convertir su alimento en biomasa. Con C. lalia al experimentar con
dietas adicionadas con antocianinas y betalainas reportaron que no se observa un
efecto significativo en la coloración de la piel en comparación con los
carotenoides, pero si en el crecimiento, además de que los pigmentos utilizados
no fueron de fuentes naturales (Barón y col., 2008).
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Con C. auratus las diferencias externas de color no fueron muy aparentes,
sin embargo con el análisis histológico se observó una agregación de células
donde se almacenan los pigmentos. La literatura reporta que la pigmentación de la
piel de los peces está influenciada por el tipo de pigmento suplementado en la
dieta y otros factores como: fuente, concentración y estructura del pigmento en la
dieta (Paripatananont y col., 1999; Gouveia y col., 2003); además de la edad y
tamaño del pez (Torrisen, 1985) así como de los factores ambientales.
1.6.4 Análisis de la piel de los organismos alimentados con harina de jamaica
En los cortes histológicos se logró identificar un tipo de cromatóforos de
acuerdo a su morfología se encontraron melanóforos e iridóforos (Fig 1.2). Los
melanóforos son un tipo de cromatóforos que acumulan pigmentos de color oscuro
o negro, y se pueden encontrar formando gránulos de pigmentos dispersos o
agregados en el citoplasma, los gránulos dispersos se caracterizan por tener
proyecciones citoplasmáticas que salen del centro de la célula y se entrelazan con
fibras de tejido conectivo (Kaleta, 2009), los melanóforos son el principal tipo de
células que se identificaron en todo el cuerpo del pez, siendo más abundantes en
el área de la cabeza, esté tipo de células se identificaron primeramente en la
muestra control (Fig. 1.2).
En la figura 1.2 se muestra al grupo control, donde se observa la presencia
de los melanóforos distribuidos en cabeza, dorso y aleta caudal este tipo de
células se identificó de acuerdo a lo reportado en la literatura por su tamaño que
va de los 10-100 µm, a su forma oval y presencia de color oscuro.
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Figura 1.2. Tejido de la cabeza del control donde se ubican los cromatóforos.
Melanóforos
20 µm
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Otro tipo de células identificado de acuerdo a su forma y tamaño fueron los
iridóforos (Fig.1.3); se reporta en la literatura que estas células son filamentosas y
su principal característica es que reflejan la luz y por lo tanto hacen que se tornen
de diferentes tonalidades iridiscentes, la figura 1.3 muestra el tejido de peces
alimentados con pigmentos 160 mg/kg de alimento en esta figura se observa la
presencia de los iridóforos en la cabeza, dorso y aleta caudal del pez.
En los tratamientos se identificaron estas mismas estructuras con algunas
diferencias entre ellos con lo cual se pudiera sugerir que tanto la presencia y
distribución de los melanóforos en la piel fueron debidas a la adición de pigmentos
en la dieta.
La pigmentación de los peces puede deberse a la combinación entre
iridóforos y melanóforos detectados (Fig. 1.2 y 1.3), la cual se reportada como una
cooperación entre estas células que proporcionan la coloración de la piel en los
peces (Hirata y col., 2003; Kaleta, 2009). Por otro lado se reporta que los gránulos
de melanina agregados en los melanóforos hacen que los iridóforos se descubran,
y por lo tanto dispersan y reflejan la luz sobre los xantóforos filtrando la luz
creando diferentes tonos en la piel (Hirata y col., 2003).
Después de haber identificado las células se realizó la cuantificación de
éstas en las partes del cuerpo de los peces, se observó una mayor distribución en
el área caudal seguida de la cabeza y dorso (Fig.1.4).
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Figura 1.3. Identificación de los iridóforos en tejido de los peces alimentados con
las dietas experimentales (160 mg/kg de alimento). Muestra de tejido con luz
polarizada, a) tejido de la cabeza; b) dorso; c) cola. Muestras observadas a 20x.
(b)
(a) (b)
(c)
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En la figura 1.5 se muestran los cortes histológicos donde se observa la
distribución de las células de cada tratamiento, en todos se encontraron
melanóforos e iridóforos donde la diferencia se logra observar en la distribución de
las células en los diferentes tejidos analizados (cabeza, dorso y aleta caudal). De
acuerdo con estos resultados y con lo reportado por Xu y col. (2006) la distribución
de los pigmentos en el cuerpo de C. auratus no se encuentra de manera
homogénea. Con los resultados obtenidos en la presente investigación se observa
que la distribución y cantidad de los cromatóforos está relacionada con la
localización en el cuerpo y la edad del espécimen, tal como lo sugiere Xu y col.
(2006). En la figura 1.5 se muestran todos los cortes histológicos donde se
observa la distribución de las células de cada tratamiento, en todos se encontraron
melanóforos e iridóforos donde la diferencia fue en la distribución (Fig. 1.5)
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Figura 1.4. Número de cromatóforos por campo en diferentes partes del cuerpo deCarassius auratus, alimentados con las diferentes concentraciones deantocianinas. Misma letra no hay diferencia significativa P˂0.05
DIETAS
sin pigmento (40 mg) (80 mg) (160 mg)
Núm
erodecélulas/área
0
50
100
150
200
250
cabeza
dorso
aleta
0 40 80 160
Antocianinas mg/kg de alimento
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Figura 1.5. Cortes histológicos de los peces alimentados con las dietas experimentales. Se hace una comparación
de la distribución entre los tratamientos y el control. C: cabeza, D: dorso y A: aleta caudal.
D
A
C
0 mg 40 mg 80 mg 160 mg
39
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1.7 Conclusiones
El uso de las antocianinas como aditivo en la dieta de los peces es una
alternativa para fortalecer el crecimiento en peces de ornato.
C. auratus utilizó eficientemente la jamaica como fuente de pigmentos.
Los resultados del presente estudio indican que C. auratus utilizó
eficientemente la jamaica como fuente de pigmentos y que la adición de
antocianinas como fuente natural de pigmentos no afectó negativamente los
parámetros.
Se observó la presencia de células que pudieran estar acumulando los
pigmentos.
Se observó una mayor densidad de los melanóforos en aleta caudal en los
peces alimentados con pigmentos de mayor concentración comparación
con control y con las concentraciones de pigmento menores.
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