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Facu l tad de Fa rm ac ia

INCIDENCIA Y NIVELES DE OCRATOXINA A Y

CINCO ANÁLOGOS EN VINO TINTO

Rebeca Remiro Íñigo

TESIS DOCTORAL

F a c u l t a d d e F a r m a c i a

El presente trabajo de investigación titulado:

INCIDENCIA Y NIVELES DE OCRATOXINA A Y CINCO

ANÁLOGOS EN VINO TINTO

que presenta Dª Rebeca Remiro Íñigo para aspirar al grado de

Doctor por la Universidad de Navarra, ha sido realizado en el

Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica, bajo la

dirección de la Dra. Elena González-Peñas y la Dra. Elena

Lizarraga Pérez.

Pamplona, diciembre de 2011

Dra. Elena González-Peñas Dra. Elena Lizarraga Pérez

AGRADECIMIENTOS

AGRADECIMIENTOS

Me gustaría expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a

todas las personas que han contribuido a la realización de esta tesis

doctoral.

En primer lugar, gracias a la Universidad de Navarra por su apoyo e

impulso a la investigación científica y el cuidado de sus alumnos.

A las entidades que han financiado el proyecto y las becas recibidas

para su elaboración: Plan de Investigación de la Universidad de Navarra

(PIUNA), Fundación Caja Navarra y Asociación de Amigos de la

Universidad de Navarra.

A las bodegas navarras que han cedido de manera desinteresada

muestras de vino para este estudio: Aristu, Azpea, Biurko Gorri, Lezaún,

Iturbide, Navarsotillo y Vega del Castillo. A la Dra. Eleni Pontiki por el

envío de las muestras griegas.

Al Dr. Antonio Monge, director de CIFA, y a todas las personas que

forman parte de este centro, por todos los momentos compartidos. A

Estefanía y, en especial, a Carlos por su amabilidad, disposición y el

interés mostrado. A Laura por su ayuda con el inglés de esa manera tan

graciosa y singular.

A las doctoras Elena González-Peñas y Elena Lizarraga Pérez,

directoras de esta investigación, muchas gracias por compartir conmigo

vuestra experiencia y por mostrarme siempre vuestra confianza y

comprensión.

A mis compañeros de laboratorio, los que estaban al empezar esta

etapa y los que están al acabarla. A Susana, fuiste mi maestra en el

manejo del HPLC y en el mundo de las ocratoxinas, es imposible olvidar

tu sonrisa y paciencia en tus lecciones. A Mayte y Teresa, que aún con

mi “desorden” habéis estado conmigo cada día, ayudándome y

apoyándome siempre. A Ángel, por socorrerme ante los problemas

AGRADECIMIENTOS

dejando de lado tus asuntos con tal de auxiliarme. Sin duda, lo mejor

que me llevo de estos años es vuestra amistad, surgida entre matraces

y debates cromatográficos y confirmada en la vida personal. Ha sido un

placer trabajar a vuestro lado.

A todas las personas que han pasado por el laboratorio durante

estos años, en especial a Olaia, por tus ganas de aprender, por

escucharme y reírte conmigo.

A los que forman parte del departamento vecino, Toxicología, en

especial a Ariane, Leire, Amaia, Cecilia, Celia y David por todos los

buenos momentos vividos, por preocuparos por mí y por esta tesis, por

animarme y compartir conmigo vuestro buen humor. A la Dra. Adela

López de Cerain, por su ayuda e interés, y dedicar siempre una sonrisa.

A mis químicas, Asun, Lau, Ele y Mary por escucharme y

aconsejarme siempre y por contagiarme vuestra alegría. Habéis vivido,

y sufrido esta tesis conmigo, en especial y más de cerca María, pero hoy

ya la acabamos (en plural). Ele, en este momento ¡doctoras a tu tercera

química! Lau, Asun, tengo que daros las gracias una vez más por todo lo

que habéis hecho por mí, habéis sido mis muletas, no me habéis dejado

caer y me habéis ayudado a levantar, nunca podré olvidarlo. Sin

vosotras este día nunca hubiera llegado.

Dicen que los verdaderos amigos son los que aún conociendo todo

sobre ti, te siguen queriendo. Gracias a Robe, David, Itzi, Pau, Patxi y

Monty por quererme y creer en mi. Me habéis acompañado en los malos

momentos y convertido en “brujeta” en los buenos ¡gracias! Hemos

demostrado que nuestra amistad es más fuerte que cualquier altibajo y

así será aunque un océano nos separe.

A todas las personas de Mirafuentes que en estos años me han

mostrado su apoyo y cariño, en especial a Maite, Lucía, Silvi y Silvia, y a

los incondicionales de las 8. Alda, siempre estarás en mi corazón.

AGRADECIMIENTOS

A toda mi familia por vuestro interés y cariño. Gracias, en especial,

a mi tía Ana y abuela Tutus por cuidarme siempre, preocuparos por mí y

ponerle velas a la Virgen para que todo me fuera bien.

A mis padres, Vicente y Emma, no hay palabras para describir el

agradecimiento enorme que siento. Sin vuestro esfuerzo, comprensión y

apoyo no hubiera conseguido esto.

¡¡GRACIAS A TODAS Y A TODOS!!

ABREVIATURAS

ABREVIATURAS

AOAC: Asociación Oficial de la Comunidad Analítica

AEFI: Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria

ANOVA: Test de Análisis de la Varianza (Analysis of variance)

BPL: Buenas Prácticas de Laboratorio

CCAH: Comité Científico de la Alimentación Humana

CE: Comunidad Europea

CIA: Columnas de Inmunoafinidad

CIT: Citrinina

CPAEN: Consejo de la Producción Agraria de Navarra

CV: Coeficiente de Variación

DL50: Dosis Letal 50

D.O.: Denominación de Origen

EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food

Safety Authority)

ELISA: Ensayo Inmunoenzimático en Fase Sólida

ELL: Extracción Líquido-Líquido

ER: Error relativo

EURACHEM: Asociación Europea de Química Analítica

EtOTα: Etil éster de ocratoxina α

EtOTB: Etil éster de ocratoxina B

FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la

Agricultura (Food and Agricultural Organization of the United Nations)

FDA: Agencia Americana para alimentos y medicamentod (Food and

Drug Administration)

FLD: Detector de Fluorescencia (Fluorescence detector)

FR: Factor Respuesta

GC-MS: Cromatografía Gaseosa con Detector de Espectrometría de

Masas (Gas Chromatography – Mass Spectrometry)

HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High Permormance

Liquid Chromatography)

ABREVIATURAS

HPTLC: Cromatografía en Capa Fina de Alta Resolución (High

Permormance Thin Layer Chromatography)

IARC: Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer

(International Agency for Research on Cancer)

IC: Intervalo de Confianza

ICH: Conferencia Internacional de Armonización (International

Conference of Harmonization)

IGT: Indicación Geográfica Típica

IT: Trampa iónica (Ion Trap)

IUPAC: Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (International

Union of Pure and Applied Chemistry)

JECFA: Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios

(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)

LC: Limite de Cuantificación

LC-MS: Cromatografía Líquida con Detector de Espectrometría de Masas

(Liquid Chromatography – Mass Spectrometry)

LD: Límite de Detección

LOAEL: Nivel Más Bajo al que se Observan Efectos Adversos (Lowest

Observed Adverse Effect Level)

MeOTα: Metil éster de ocratoxina α

MeOTA: Metil éster de ocratoxina A

MeOTB: Metil éster de ocratoxina B

MIP: Polímeros Marcados Molecularmente (Moleculary Imprinted

Polymers)

MS: Detector de Espectrometría de Masas (Mass Spectrometry)

MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol

NCF: Normas de Correcta Fabricación

NEB: Nefropatía Endémica de los Balcanes

NEL: Nivel Sin Efecto (No Effect Level)

ABREVIATURAS

NOAEL: Nivel al que No se Observan Efectos Adversos (No Observed

Adverse Effect Level)

OIV: Organización Internacional de la Vid y el Vino

OMS: Organización Mundial de la Salud

OTα: Ocratoxina α

OTA: Ocratoxina A

OTB: Ocratoxina B

OTC: Ocratoxina C

PAT: Patulina

PBS: Tampón Fosfato Salino (Phosphate Buffer Saline)

PM: Peso Molecular

PTDI: Ingesta Tolerable Diaria Provisional (Provisional Tolerable Daily

Intake)

PTWI: Ingesta Tolerable Semanal Provisional (Provisional Tolerable

Weekly Intake)

SCOOP: Programa de Cooperación Científica de la Unión Europea en

Cuestiones Relacionadas con la Seguridad Alimentaria (Scientific

Cooperation on Questions Relating to Food)

SPE: Extracción en Fase Sólida (Solid Phase Extraction)

SPME: Microextracción en Fase Sólida (Solid Phase Micro-Extraction)

TDI: Ingesta Tolerable Diaria (Tolerable Daily Intake)

TOF: Tiempo de vuelo (Time of Flight)

TWI: Ingesta Tolerable Semanal (Tolerable Weekly Intake)

TLC: Cromatografía en Capa Fina (Thin Layer Chromatography)

UE: Unión Europea

UV: Ultravioleta

WHO: Organización Mundial de la Salud (World Health Organization)

ÍNDICE

ÍNDICE

I

INTRODUCCIÓN ...........................................................................1

1. MICOTOXINAS ..................................................................... 3

ORIGEN E HISTORIA ........................................................ 5

TOXICIDAD DE LAS MICOTOXINAS .................................... 5

PRESENCIA DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS .................... 8

INGESTA Y EVALUACIÓN DEL RIESGO .............................. 10

2. OCRATOXINAS ................................................................... 13

ESTRUCTURAS QUÍMICAS ............................................... 13

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS ..................................... 15

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE OCRATOXINAS ....................... 16

Determinación simultánea de ocratoxinas .................... 18

TOXICIDAD ................................................................... 19

Toxicidad de la ocratoxina A ....................................... 20

Toxicidad combinada ................................................. 22

PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN ALIMENTOS .................. 23

INGESTA DIARIA TOLERABLE DE OTA .............................. 25

LEGISLACIÓN ................................................................ 27

3. OCRATOXINAS EN VINO ...................................................... 29

4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS ............................... 37

MUESTREO ................................................................... 40

APLICABILIDAD ............................................................. 41

ESTABILIDAD ................................................................ 41

ROBUSTEZ .................................................................... 42

SELECTIVIDAD .............................................................. 42

LINEALIDAD .................................................................. 43

PRECISIÓN ................................................................... 46

EXACTITUD ................................................................... 47

LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................... 47

JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS.............................51

ÍNDICE

II

MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................. 55

1. MATERIAL.......................................................................... 57

REACTIVOS .................................................................. 57

APARATOS Y EQUIPOS ................................................... 58

2. MUESTRAS ........................................................................ 63

VINOS TINTOS NAVARROS ............................................. 63

Vinos de agricultura tradicional................................... 64

Vinos ecológicos ....................................................... 65

Condiciones climatológicas ......................................... 66

VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ................................ 67

Vinos de España ....................................................... 68

Vinos de Francia ....................................................... 70

Vinos de Italia .......................................................... 71

Vinos de Croacia ....................................................... 72

Vinos de Grecia. ....................................................... 73

Vinos de Turquía ...................................................... 74

Vinos de Israel ......................................................... 76

Vinos del norte de África ............................................ 77

3. MÉTODOS ......................................................................... .79

DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS ....................... 79

DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO .......................... 81

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN ........................................ 81

DETERMINACIÓN POR HPLC-FLD ..................................... 83

CONFIRMACIÓN POR LC-MS ............................................ 83

4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO .................................. 85

SELECTIVIDAD .............................................................. 85

LINEALIDAD E INTERVALO .............................................. 86

RECUPERACIÓN ............................................................. 88

LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................... 89

ROBUSTEZ.................................................................... 89

ÍNDICE

III

ESTABILIDAD ................................................................ 90

CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO ............................... 90

5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................... 91

RESULTADOS ............................................................................. 93

1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO ........................... 95

DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS ....................... 95

DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO .......................... 96

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN ........................................ 97

PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO ........... 99

MÉTODO DEFINITIVO ................................................... 101

METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα. ............. 102

CONFIRMACIÓN POR LC-MS .......................................... 105

2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ................................ 113

SELECTIVIDAD ............................................................ 113

LINEALIDAD ................................................................ 114

RECUPERACIÓN ........................................................... 123

LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................. 127

ROBUSTEZ .................................................................. 128

ESTABILIDAD .............................................................. 131

CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO ............................. 134

3. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA .................................... 137

4. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS NAVARROS ........... 141

VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL ......................... 141

VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA ............................ 143

PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS EN VINOS NAVARROS .................................................. 145

INFLUENCIA DEL TIPO DE AGRICULTURA EN LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS ............................. 146

INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR DE VINO TINTO NAVARRO ............................................ 148

ÍNDICE

IV

RELACIÓN ENTRE LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS ........ 149

OCRATOXINAS Y CLIMA................................................ 151

5. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ........ 153

VINOS DE ESPAÑA ....................................................... 153

VINOS DE FRANCIA ..................................................... 153

VINOS DE ITALIA ........................................................ 154

VINOS DE CROACIA ..................................................... 155

VINOS DE GRECIA ....................................................... 155

VINOS DE TURQUÍA ..................................................... 156

VINOS DE ISRAEL ........................................................ 157

VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA ...................................... 157

PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ......................... 158

INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN EN LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS ............................. 159


DISCUSIÓN.............................................................................. 169

1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO ......................... 171

DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS ..................... 171

DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO ........................ 173

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN ...................................... 174

PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO ......... 176

METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα .............. 178

CONFIRMACIÓN POR LC-MS .......................................... 180

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ........................... 183

SELECTIVIDAD ............................................................ 183

LINEALIDAD................................................................ 184

RECUPERACIÓN ........................................................... 186

LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .................. 186

ROBUSTEZ.................................................................. 187

ÍNDICE

V

ESTABILIDAD .............................................................. 187

CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO ............................. 188

2. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA .................................... 189

3. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS NAVARROS ........... 191

VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL ......................... 191

VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA ............................ 192

PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS

EN VINOS NAVARROS .................................................. 192

INFLUENCIA DEL TIPO DE AGRICULTURA EN LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS ............................. 193

INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR DE VINO TINTO NAVARRO ............................................ 194


OCRATOXINAS Y CLIMA ................................................ 196

4. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ........ 197

VINOS DE ESPAÑA ....................................................... 197

VINOS DE FRANCIA ..................................................... 198

VINOS DE ITALIA ........................................................ 198

VINOS DE CROACIA ..................................................... 199

VINOS DE GRECIA ....................................................... 199

VINOS DE TURQUÍA ..................................................... 200

VINOS DE ISRAEL ........................................................ 200

VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA ...................................... 201

PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS

EN VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS ......................... 201

INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN EN LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS ............................. 202


CONCLUSIONES ....................................................................... 205

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................ 209

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN: Micotoxinas

- 3 -

1. MICOTOXINAS

El término micotoxina (del griego, mikes y toxina, hongo y veneno

respectivamente) se refiere a una variedad de compuestos tóxicos, de

bajo peso molecular, producidos en el metabolismo secundario de

hongos filamentosos.

Dependiendo de la definición empleada, unos autores hablan de

menos de 100 sustancias identificadas como micotoxinas; otros, entre

300 y 400. En un sentido amplio, considerando aquellos metabolitos

secundarios de origen fúngico que al interaccionar con las células alteran

su desarrollo normal, el número de micotoxinas podría estimarse en un

número muy superior. Sin embargo, solo unas pocas tienen interés por

su presencia en productos agroalimentarios de forma natural y porque

se asocian habitualmente a problemas de micotoxicosis en el hombre y

en los animales (Soriano, 2007).

Las micotoxinas constituyen un grupo muy heterogéneo, tanto por

sus diferentes efectos tóxicos, como por su estructura y propiedades

químicas, por lo que también son difíciles de clasificar. Debido a sus

diversas estructuras químicas y orígenes biosintéticos, su multitud de

efectos biológicos y su producción por un amplio número de especies

fúngicas, los sistemas de clasificación tienden a basarse en alguna de

estas características. Desde la medicina, a menudo, se ordenan por el

órgano al que afectan, por lo que se catalogan como hepatotoxinas,

nefrotoxinas, neurotoxinas, inmunotoxinas, y así sucesivamente. Los

químicos orgánicos han tratado de clasificarlas por su estructura química

(por ejemplo, lactonas, cumarinas, etc.); los bioquímicos de acuerdo a

su origen biosintético (policetonas, derivados de aminoácidos, etc.), y

los micólogos por los hongos que las producen (por ejemplo, toxinas de

Aspergillus o Penicillium). Sin embargo, ninguna de estas clasificaciones


- 4 -

es del todo satisfactoria, ya que el mismo compuesto puede pertenecer

a diferentes categorías (Bennett y Klich, 2003).

Todas las micotoxinas son de origen fúngico; sin embargo, no todos

los compuestos tóxicos producidos por hongos se denominan

micotoxinas. El objeto de la toxicidad y la concentración del metabolito

son importantes. Por ejemplo, los compuestos fúngicos que son

principalmente tóxicos para las bacterias (como la penicilina) se

denominan antibióticos y los productos de hongos que son tóxicos para

las plantas se llaman fitotoxinas. Las micotoxinas son producidas por

hongos y son tóxicas para los vertebrados y otros grupos de animales

en bajas concentraciones. Otros metabolitos fúngicos de bajo peso

molecular, como el etanol, que son tóxicos solo en altas

concentraciones, no se consideran micotoxinas (Bennett y Klich, 2003).

La mayoría de las micotoxinas conocidas han sido identificadas

como metabolitos secundarios de hongos microscópicos, los Fungi

imperfecti, entre los que cabe destacar particularmente los de los

géneros Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Claviceps, Alternaria,

Byssochlamys, Stachybotrys, Trichoderma, Chaetomium, Paecilomyces,

y Rhizopus, entre otros (Soriano, 2007).

Las micotoxinas más importantes desde el punto de vista

agroalimentario y que participan en procesos de micotoxicosis naturales

son las aflatoxinas, la citrinina, las fumonisinas, la ocratoxina A, la

patulina, los tricotecenos, y la zearalenona. Fundamentalmente son

producidas por especies pertenecientes a los géneros Aspergillus,

Fusarium y Penicillium, que son los que agrupan un mayor número de

especies productoras (Soriano, 2007). Ya que los hongos toxicogénicos

son ubicuos, las micotoxinas son contaminantes ambientales presentes

en gran número de materias primas y de alimentos en todas las partes

del mundo.


- 5 -

ORIGEN E HISTORIA

El termino micotoxina fue acuñado en 1962 a raíz de una inusual

crisis veterinaria cerca de Londres, durante la cual murieron alrededor

de 100.000 pavos. Cuando esta enfermedad del pavo, inicialmente

desconocida, se vinculó a cacahuetes contaminados con metabolitos

secundarios de Aspergillus flavus (aflatoxinas), los científicos se

sensibilizaron sobre la posibilidad de que otros metabolitos fúngicos

desconocidos pudieran ser mortales.

Pronto, se incluyeron dentro del término micotoxinas sustancias

conocidas anteriormente (por ejemplo, los alcaloides del cornezuelo),

algunos compuestos que habían sido aislados como antibióticos (por

ejemplo, la patulina), y una serie de nuevos metabolitos secundarios

encontrados específicamente en investigaciones centradas en el

descubrimiento de micotoxinas, por ejemplo, la ocratoxina A (Bennett y

Klich, 2003).

El período entre 1960 y 1975 se denominó la fiebre del oro de las

micotoxinas (mycotoxin gold rush), ya que se llevó a cabo el

descubrimiento de un gran número de ellas y muchos científicos se

dedicaron a la búsqueda de estos agentes tóxicos (Maggon y col.,

1977).

Aunque el estudio de las micotoxinas no se inició hasta la década de

1960 con el descubrimiento de las aflatoxinas, el ergotismo (producido

por alcaloides del Claviceps) es una de las micotoxicosis más antigua

reconocida y que ha tenido una mayor importancia histórica.

TOXICIDAD DE LAS MICOTOXINAS

Las micotoxicosis, tanto en el hombre como en los animales, se

caracterizan por ser enfermedades relacionadas con alimentos

contaminados con especies fúngicas, no contagiosas, no infecciosas,


- 6 -

pero sí transferibles. Teniendo en cuenta la concentración y el tiempo de

exposición a una determinada micotoxina y, considerando también

factores individuales como edad, sexo, dieta o cualquier otra condición

general, las micotoxicosis pueden inducir una de las siguientes formas

de intoxicación (Cameán y Repetto, 2007):

- micotoxicosis agudas: se producen cuando se consumen

micotoxinas a concentraciones de moderadas a altas, causando

manifestaciones específicas, síndromes de enfermedad aguda o

incluso la muerte;

- micotoxicosis crónicas: se producen por la ingesta de niveles de

toxinas de bajos a moderados, causando enfermedades crónicas

específicas; y

- micotoxicosis indirectas: producidas por la ingesta de muy bajas

concentraciones de toxinas, causando un aumento de la

susceptibilidad a otras infecciones o enfermedades.

Los factores que afectan a la magnitud de la toxicidad de las

micotoxinas para el hombre y los animales se resumirían en: especies

fúngicas implicadas, mecanismos o modos de acción, metabolismo y

mecanismos de defensa del organismo vivo afectado.

El modo de acción tóxica de las micotoxinas está determinado por

su estructura química. Dado el amplio rango de estructuras químicas

existentes entre las micotoxinas, sus efectos bioquímicos a nivel celular,

entre otros, incluyen: interacciones con membranas celulares,

interferencia con el metabolismo energético, interacciones con el ADN o

moléculas proteicas, inhibición de la replicación del ADN, inhibición de la

transcripción, interferencia con el metabolismo de purinas e interacción

con receptores hormonales.


- 7 -

Dependiendo del modo de acción celular, las micotoxinas pueden

originar en los organismos diana una serie de efectos biológicos que

varían mucho según las micotoxinas. En general, los efectos biológicos

de la mayoría de ellas comprenden: hepatotoxicidad, nefrotoxicidad,

actividad inmunosupresora, teratogenicidad, mutagenicidad,

carcinogenicidad, estrogenicidad y acción diabetógena (Cameán y

Repetto, 2007).

En cuanto a su posible carcinogenicidad, la Organización Mundial de

la Salud (OMS, WHO) y la Agencia Internacional de Investigación sobre

el Cáncer (IARC) han evaluado, desde 1971, más de 900 agentes

(incluyendo algunas micotoxinas) de los cuales aproximadamente 400

han sido identificados como carcinógenos o potencialmente carcinógenos

para el hombre. La clasificación se realiza de acuerdo a los siguientes

grupos:

Grupo 1: el agente es carcinógeno en humanos.

Grupo 2A: agente probablemente carcinógeno en humanos; existe

limitada evidencia sobre humanos pero suficiente con animales.

Grupo 2B: agente posiblemente carcinógeno; la evidencia en

humanos es limitada y tampoco hay suficiente evidencia con animales

de experimentación.

Grupo 3: el agente no es clasificable como carcinógeno para

humanos y no puede incluirse en otro grupo.

Grupo 4: el agente probablemente no es carcinógeno en humanos;

la evidencia disponible, tanto de humanos como de experimentación

animal así lo sugiere.

En la tabla 1 se resume la evaluación realizada por la IARC en

relación al poder carcinógeno de las micotoxinas más relevantes:


- 8 -

MICOTOXINAS GRUPO Vol. AÑO

Aflatoxinas 1 56, 82 2002

Aflatoxina M1 2B 56 1993

Citrinina 3 40 (7) 1987

Esterigmatocistina 2B 10 (7) 1987

Fumonisina B1 2B 82 2002

Ocratoxina A 2B 56 1993

Patulina 3 40 (7) 1987

Toxinas derivadas de Fusarium graminearum, F. culmorum y F. crookwellense (Zearalenona, Deoxinivalenol, Nivalenol y Fusarenona X)

3 56 1993

Toxinas derivadas de Fusarium moniliforme (Fumonisinas B1 y B2 y Fusarina C)

2B 56 1993

Toxinas derivadas de Fusarium sporotrichioides (toxina T-2)

3 56 1993

Tabla 1: Clasificación de las micotoxinas según la IARC.

PRESENCIA DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS

Las micotoxinas suponen una amenaza para la salud humana y

animal debido a su presencia natural en productos agrícolas de todo el

mundo. Se estima que una cuarta parte de las cosechas mundiales

están contaminadas por micotoxinas. Un amplio estudio publicado en

2007, realizado con unas 2.800 muestras de cereales y piensos, reveló

que más de la mitad de las muestras de origen europeo y una tercera

parte de las de la región Asia-Pacífico estaban contaminadas con niveles

de micotoxinas por encima del límite de cuantificación de los métodos

aplicados (Binder y col., 2007).

Se han realizado un gran número de estudios sobre la presencia de

micotoxinas en alimentos, tanto en piensos animales como en productos

destinados al consumo humano. Su presencia es tan común que están

consideradas como el factor más importante de riesgo crónico en la

alimentación, mayor incluso que los contaminantes sintéticos, las


- 9 -

toxinas de plantas, los aditivos alimentarios o los pesticidas (Paterson y

Lima, 2010).

Conocidos sus efectos tóxicos y su presencia en alimentos,

gobiernos, agencias y organismos internacionales han establecido

diferentes límites máximos permitidos de estas sustancias en productos

alimenticios. Desafortunadamente, en ocasiones, los límites legislados

están basados más en las capacidades analíticas actuales que en

criterios de salud (Bennett y Klich, 2003).

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la

Agricultura (FAO) resumió los reglamentos a nivel mundial para las

micotoxinas en alimentos (FAO, 2004). Para concretar y ejemplificar los

productos más susceptibles de contaminación por micotoxinas, se

enumeran los alimentos para los que se aplica el Reglamento Nº

1881/2006 de la Unión Europea*:

- Aflatoxinas: cacahuetes y otras semillas oleaginosas, almendras,

pistachos y huesos de albaricoque, avellanas y nueces del Brasil,

frutos de cáscara arbóreos, frutas pasas, cereales y productos a

base de cereales, maíz y arroz, leche y algunas especias.

- Ocratoxina A: cereales no elaborados y productos derivados, uvas

pasas, café, vino y zumo de uva, algunas especias y regaliz.

- Patulina: zumos de frutas, zumo de manzana, sidra y otras

bebidas fermentadas elaboradas con manzana o que contengan

zumo de manzana, productos sólidos elaborados con manzanas.

- Deoxinivalenol: Cereales, trigo duro, avena y maíz no elaborados,

cereales destinados al consumo humano directo, harina de cereales,

salvado y germen, pasta, pan (incluidos pequeños productos de

* Reglamento modificado por los Reglamentos 1126/2007, 105/2010 y 165/2010.


- 10 -

panadería), pasteles, galletas, aperitivos de cereales y cereales para

desayuno.

- Zearalenona: Cereales y maíz no elaborados, cereales y maíz

destinados al consumo humano directo, harina de cereales, salvado

y germen, aceite de maíz refinado, pan (incluidos pequeños

productos de panadería), pasteles, galletas, aperitivos de cereales y

cereales de desayuno.

- Fumonisinas: Maíz no elaborado, maíz y alimentos a base de maíz

destinados al consumo humano directo, cereales para el desayuno a

base de maíz y aperitivos de maíz.

- Toxinas T-2 y HT-2: Cereales no elaborados y productos a base de

cereales.

INGESTA Y EVALUACIÓN DEL RIESGO

El conocimiento sobre la presencia de micotoxinas en alimentos, y

por tanto el desarrollo de métodos analíticos fiables que lo permitan,

cobran especial importancia al hablar de seguridad alimentaria y

evaluación del riesgo para la población.

El riesgo que representa la ingestión de productos alimenticios

contaminados con micotoxinas en el hombre puede ser evaluado

relacionando la exposición a esas micotoxinas (con los valores medios

de consumo diario de los alimentos, los niveles de micotoxinas en el

alimento que es consumido y el peso corporal), con la dosis tolerable de

micotoxina ingerida diariamente (TDI) y la dosis a la cual el 50% de los

individuos pueden desarrollar tumores malignos (TD50). Otros factores

como el estado fisiológico del individuo y la edad también pueden

aumentar o disminuir la toxicidad (Gimeno y Martins, 2005).


- 11 -

Con los datos obtenidos en estudios toxicológicos se hacen

interpolaciones y se establecen algunos parámetros (Gimeno y Martins,

2005):

- NOAEL (No Observed Adverse Effect Levels) es la estimación del

nivel de micotoxina con el que no se observan efectos adversos.

- TD50 es la dosis de micotoxina a la cual el 50% de los individuos

pueden desarrollar tumores malignos, estableciéndose así una

estimación del potencial cancerígeno.

- NEL (No Effect Level) es la estimación del nivel de micotoxina que

no causa efecto.

- LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level) es el nivel de

micotoxina con el cual se observan los efectos adversos más bajos.

Finalmente, existe un parámetro comúnmente utilizado, la TDI

(Tolerable Daily Intake), o ingesta de micotoxina diaria que puede ser

tolerada. Todos los parámetros anteriores se expresan en cantidad de

micotoxina·kg de peso corporal (p.c.)-1·día-1 o en el caso de la TDI

puede expresarse en algunos casos en valor semanal, TWI (Tolerable

Weekly Intake).

Normalmente, el valor de TDI se suele obtener dividiendo el valor

de NOAEL, o el valor de NEL, por un factor de seguridad que corrige las

diferencias entre animales y personas, y entre diferentes personas, y

que puede oscilar entre 50 y 50.000. Se puede hacer lo mismo con el

valor de TD50, dependiendo del método de extrapolación utilizado,

siendo este último el más utilizado en las micotoxinas carcinogénicas. La

TDI se corrige con un factor de riesgo que normalmente es 1/100.000.

Cuando el valor de TDI está aún en estudio y por lo tanto es provisional,

se utiliza la denominación PTDI (Provisional Tolerable Daily Intake)

(Gimeno y Martins, 2005).

INTRODUCCIÓN: Ocratoxinas

- 13 -

2. OCRATOXINAS

En 1961, y después del interés despertado por el descubrimiento de

las aflatoxinas y la alta incidencia en África de ciertas enfermedades de

etiología desconocida, micólogos del Consejo Sudafricano para la

Investigación Científica e Industrial iniciaron una investigación sobre la

microflora de leguminosas locales y productos de cereales.

Se identificaron 46 cepas de 22 especies de hongos que eran

tóxicas en patos. Aspergillus ochraceus apareció con frecuencia en el

transcurso de esta investigación y pronto se vio que se encontraba

ampliamente en la naturaleza. Para la investigación química y

toxicológica de sus metabolitos se seleccionó una de las variedades más

tóxicas de este hongo, denominada K-804, aislada del sorgo (Steyn,

1971).

En 1965 Van der Merwe y col. detectaron y caracterizaron

químicamente por primera vez las ocratoxinas A, B y C (Van der Merwe

y col., 1965a y b). En 1967, Steyn y Holzapfel también aislaron los metil

y etil ésteres derivados de las ocratoxinas A y B como metabolitos de

Aspergillus ochraceus (Steyn y Holzapfel, 1967a). De entre estos

compuestos, la ocratoxina A se consideró el principal, debido a su

toxicidad e incidencia.

ESTRUCTURAS QUÍMICAS

Las ocratoxinas contienen una 3,4-dihidro-3-metilisocumarina unida

a una molécula de L-β-fenilalanina por el grupo carboxilo en posición 7

mediante un enlace amida. Las ocratoxinas objeto del presente estudio:

ocratoxina A (OTA), ocratoxina B (OTB), sus metil ésteres (MeOTA y

MeOTB) y sus etil ésteres (OTC y EtOTB) difieren básicamente en el

átomo de cloro en R1 y/o en la esterificación en el grupo ácido de la

fenilalanina (figura 1).


- 14 -

O

OH

R1

O

CH3

O

NH

OO

R2

Ocratoxina R1 R2 Fórmula

molecular PM

(g·mol-1)

Ocratoxina A Cl H C20H18ClNO6 403,82 Metilocratoxina A Cl CH3 C21H20ClNO6 417,84

Etilocratoxina A (OTC) Cl CH3-CH2 C22H22ClNO6 431,87 Ocratoxina B H H C20H19NO6 369,37

Metilocratoxina B H CH3 C21H21NO6 383,40 Etilocratoxina B H CH3-CH2 C22H23NO6 397,42

Figura 1: Estructura de las ocratoxinas.

Tanto en cultivos de células (vegetales y animales) como en

animales se han identificado otros metabolitos derivados de la

ocratoxina A (Stormer y col., 1983; Xiao y col., 1996a y b; Ruhland y

col., 1996; Li y col., 2000). Por ejemplo, los compuestos hidroxilados en

posición 4 (4-hidroxi-OTA) o en posición 10 (10-hidroxi-OTA), los

productos resultantes de la hidrólisis de la OTA y OTB, la ocratoxina alfa

(OTα) y beta (OTβ) respectivamente, o la forma abierta de la lactona

(OP-OTA). Todos ellos se pueden ver en la figura 2:

O

OH O

CH2

R1R2

R3

O

R4

OH O

CH2

R1R2

R3

O

R4

OH

OH

Ocratoxina R1 R2 R3 R4

4-hidroxi-OTA OH Cl -NH-CH(COOH)-CH2-Fenil H 10-hidroxi-OTA H Cl -NH-CH(COOH)-CH2-Fenil OH

OTα H Cl OH H OTβ H H OH H

OP-OTA H Cl -NH-CH(COOH)-CH2-Fenil H Figura 2: Estructura de otros metabolitos de la ocratoxina A.


- 15 -

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

Steyn y col. (1965) se basaron en los datos físicos y químicos para

elucidar la estructura química de los compuestos tóxicos aislados de

Aspergillus ochraceus. Estudiaron el punto de fusión, el espectro

infrarrojo, la reacción con cloruro férrico, la absorción ultravioleta, el

espectro de resonancia magnética nuclear, el espectro de masas, los

productos obtenidos de la hidrólisis y degradación y el espectro de

dispersión óptica rotatoria para identificar su estereoquímica (Steyn,

1971).

Estos autores describen la OTA como un compuesto cristalino

incoloro de fórmula molecular C20H18ClNO6. Su punto de fusión con una

molécula de benceno de cristalización es de 94-96ºC, mientras que a

partir de xileno cristaliza sin molécula de disolvente y funde a 169ºC.

Sus características ultravioletas en etanol son: λmax 213 y 332 nm

(ε = 36.800 y 6.400 M-1 cm-1, respectivamente).

La OTB (C20H19NO6) cristalizada desde metanol funde a 221ºC. Su

espectro UV muestra un desplazamiento hipsocrómico de 14 nm con

respecto a la longitud de onda alta de la OTA, λmax 218 y 318 nm

(ε = 34.300 y 6.750 M-1 cm-1, respectivamente) (Steyn y Holzapfel,

1967b).

Desde entonces, la ocratoxina A ha sido ampliamente estudiada; sin

embargo, la información disponible sobre las demás ocratoxinas es muy

limitada. Así, se sabe que la OTA es un compuesto fluorescente, muy

soluble en disolventes orgánicos polares, moderadamente soluble en

agua y soluble en bicarbonato sódico. El carácter de ácido débil de la

OTA es importante para los procedimientos analíticos. Su valor de pka

está entre 4,2-4,4 para el grupo carboxi del residuo de fenilalanina y

entre 7,0-7,3 para el grupo hidroxilo de la isocumarina (Valenta, 1998).

No se dispone de información similar de las demás ocratoxinas.


- 16 -

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE OCRATOXINAS

Las referencias bibliográficas sobre la presencia de micotoxinas en

alimentos se cuentan por miles. La gran diferencia en las estructuras

químicas de las micotoxinas, la amplia variedad de alimentos y

productos agrícolas en los que se encuentran y, además, el hecho de

que sus concentraciones varíen sustancialmente en ellos, plantea un

reto en el desarrollo de métodos analíticos. Esto hace que muchos de los

métodos publicados se centren en una única toxina o en un sustrato

específico (Bennett y Klich, 2003). La mayoría de los métodos analíticos

desarrollados para ocratoxinas se refieren al análisis de OTA.

Los métodos cuantitativos se basan en la preparación de curvas de

calibrado con soluciones estándar de ocratoxina A. Tal y como menciona

Valenta (1998), la concentración de las soluciones estándar de OTA

utilizadas para el análisis cuantitativo debe ser determinada

espectrofotométricamente, ya que generalmente solo se adquieren unos

miligramos de ésta para fines analíticos. La cantidad exacta en el vial no

se especifica, el pesaje exacto de cantidades tan pequeñas es difícil y

además, se debe evitar la manipulación de micotoxinas en seco por el

riesgo de dispersión debido a cargas electrostáticas. Este paso resulta

crucial en las determinaciones analíticas, sin embargo se han descrito

distintos coeficientes de absortividad molar para la ocratoxina A, incluso

en el mismo disolvente (Valenta, 1998).

Existen multitud de métodos analíticos para el control de la

presencia de ocratoxina A en alimentos y materias primas (Scott, 2002;

Visconti y De Girolamo, 2005). La mayoría de los métodos de análisis de

OTA incluyen purificación por columnas de inmunoafinidad (CIA) en

combinación con la cromatografía líquida con detección de fluorescencia

(HPLC-FLD) (Castellari y col., 2000; Visconti y col., 2001; Monaci y

Palmisano, 2004) y también con espectrometría de masas (MS) (Zöllner


- 17 -

y col., 2000; Leitner y col., 2002; Bacaloni y col., 2005; Sforza y col.,

2006; Reinsch y col., 2007; Noba y col., 2008).

La OTA debe ser extraída de los productos alimenticios antes de su

análisis, una extracción alcalina muestra generalmente mejores

recuperaciones que el uso de medios ácidos (Senyuva y col., 2005).

Convencionalmente se han utilizado la extracción líquido-líquido y en

fase sólida (Saéz y col., 2004; Serra y col., 2004; Buttinger y col.,

2004; Hernandez y col., 2006; Fabiani y col. 2010,). Sin embargo, en

los últimos 15 años, la mayoría de los laboratorios han tendido a la

utilización de columnas de inmunoafinidad ya que el proceso es

relativamente fácil de llevar a cabo y proporciona, por lo general,

extractos libres de interferencias (EFSA, 2006).

Otros procedimientos de extracción desarrollados incluirían: la

microextracción en fase sólida o líquida (González-Peñas y col., 2004;

Yu y Lai, 2005; Aresta y col., 2006; Varelis y col., 2006; Yu y Lai, 2006;

Romero-González y col., 2010), la extracción líquido-líquido dispersiva

(Campone y col., 2011; Arroyo-Manzanares y col., 2011), los polímeros

marcados molecularmente (MIP) (Maier y col., 2004; Wei y col., 2007;

Yu y Lai, 2007), la extracción coacertiva (Garcia-Fonseca y col., 2008) o

incluso la inyección directa de muestras líquidas (Dall'Asta y col., 2004;

Tafuri y col., 2008; Altiokka y col., 2009; Pena y col., 2010; Tessini y

col., 2010).

También están disponibles métodos por cromatografía en capa fina

(TLC) (Santos y Vargas, 2002; Braicu y col., 2008), TLC de alta

resolución (HPTLC) (Kumagai y col., 2008; Welke y col., 2010), ELISA

(Alarcón y col., 2004; Flajs y col., 2009; Fabiani y col., 2010; Radoi y

col., 2009), cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

(GC-MS) (Tessini y col., 2010; Soleas y col., 2001) o electroforesis


- 18 -

capilar (González-Peñas y col., 2006; Koller y col., 2006; Almeda y col.,

2008).

Se han desarrollado métodos analíticos novedosos basados en

biosensores (Ngundi y col., 2005), inmunosensores (Adanyi y col.,

2007; Prieto-Simon y col., 2008), resonancia de plasma superficial

(Yuan y col., 2009), ICP-MS (Giesen y col., 2010) o inmunoensayos de

polarización de fluorescencia (Zezza y col., 2009), pero aún no son

utilizados regularmente.

Determinación simultánea de ocratoxinas

Debido a la presencia simultánea de diferentes toxinas en una

misma matriz, cada vez más se están desarrollando métodos analíticos

que permiten cuantificar conjuntamente diferentes toxinas en un mismo

análisis; tanto para el control de su presencia en alimentos, como para

la realización de estudios toxicológicos. La técnica de elección suele ser

la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS),

debido a que la detección es universal y no depende de las propiedades

fisicoquímicas del analito (p.e. absorción ultravioleta o emisión de

fluorescencia) pero su uso ha estado restringido por el difícil

acoplamiento de ambas técnicas (Krska y Molinelli, 2007).

Los métodos analíticos por LC-MS para la determinación de

micotoxinas en alimentos incluyen a la OTA junto a otras micotoxinas,

como aflatoxinas, fumonisinas o tricotecenos. Un resumen completo de

estos métodos se puede encontrar en las revisiones de Zöllner (2006) y

Krska (2007) (Zöllner y Mayer-Helm, 2006; Krska y Molinelli, 2007).

En el caso de las ocratoxinas, los métodos cromatográficos

disponibles para la determinación simultánea de ocratoxina A y varios

análogos han sido diseñados más para estudios de farmacocinética y

metabolismo que para su uso en el estudio de su presencia en alimentos


- 19 -

(Lerch y Muller, 1990; Xiao y col., 1996b; Li y col., 1998 y 2000; Harris

y Mantle, 2001; Jonsyn-Ellis, 2001; Stander y col., 2001; Boudra y

Morgavi, 2006)

TOXICIDAD

De entre todas las ocratoxinas, la ocratoxina A es el compuesto más

importante en cuanto a toxicidad debido, en parte, a que es producida

en mayor concentración que sus derivados. La OTC y MeOTA, que

también poseen el átomo de cloro y la fenilalanina, presentan similar

toxicidad aguda, sin embargo no han despertado ningún interés en

investigación a través de los años por su baja incidencia. Steyn y

Holzapfel (1967) demostraron que la dosis letal 50 (DL50) para las 3

ocratoxinas cloradas era similar (135-170 µg/pato), mientras que la OTB

y sus ésteres eran mucho menos tóxicas (Steyn y Holzapfel, 1967a).

Así, se puso de manifiesto que la toxicidad se debía a la presencia de

cloro en la molécula (Steyn y Holzapfel, 1967b).

Doster y col. (1972) no pudieron obtener la DL50 para la OTB en

truchas, sencillamente porque no hubo mortalidad de ningún animal.

Observaron cambios patológicos significativos en hígados y riñones

similares a los producidos por la OTA cuando a las truchas se les

administraba una concentración de OTB 10 veces superior a la de OTA

(Doster y col., 1972). Un estudio similar de este grupo realizado

posteriormente con los ésteres de la OTA y OTB, demostró que la OTC

es el doble de tóxica que la OTA (DL50 OTC = 3,0 mg·kg p.c.-1,

DL50 OTA = 5,5 mg·kg p.c.-1) mientras que la EtOTB lo era la mitad

(DL50 = 13,0 mg·kg p.c.-1). Estos datos hacen suponer que la toxicidad

es mayor cuanto mayor es el peso molecular del compuesto, de ahí que

la OTB no presente DL50 y sí su etil éster (Doster y col. 1974).


- 20 -

La OTB se ha descrito como diez veces menos tóxica que la OTA

(Marquardt y Frohlich, 1992; Li y col., 1997), pero algunos estudios

también mencionan su citotoxicidad (Dietrich y col., 2001),

nefrotoxicidad (Mally y col., 2005b) y efectos teratogénicos (O'Brien y

col., 2005). No obstante, la información sobre este aspecto es menor a

la disponible para la OTA.

Con respecto a la OTC, se ha comentado que posee una toxicidad

similar a la de la ocratoxina A (Marquardt y Frohlich, 1992; Xiao y col.,

1996a, Li y col., 1998) o incluso superior, según los experimentos en

truchas realizados por Doster y colaboradores (Doster y col., 1974).

Investigaciones más recientes en estudios in vitro también describen su

mayor potencial tóxico, al menos en lo que se refiere a efectos

inmunotóxicos en cultivos celulares (Müller y col., 2003 y 2004). La

esterificación facilita la penetración de la OTC en la célula y se convierte

rápidamente en OTA al entrar en el organismo; ambos hechos afectan a

la concentración máxima en tejidos y por tanto, a la toxicidad total,

mostrando un efecto tóxico sinérgico entre ambas ocratoxinas (Pfohl-

Leszkowicz y Manderville, 2007).

Toxicidad de la ocratoxina A

La toxicidad aguda de la ocratoxina A muestra muchas variaciones

entre especies. La DL50 por vía oral se encuentra en un intervalo entre

aproximadamente 20 y 50 mg·kg p.c.-1 en ratas y ratones, y hasta 0,2-

1 mg·kg p.c.-1 en perros, cerdos y pollos, que son las especies más

sensibles. Los síntomas de intoxicación aguda consisten en hemorragias

multifocales en los principales órganos y trombos de fibrina en bazo,

cerebro, hígado, riñón y corazón, así como nefrosis y necrosis hepática y

en el tejido linfoide (Soriano, 2007).


- 21 -

Los efectos crónicos de la ocratoxina A son los que generan mayor

preocupación. Está demostrado que el consumo crónico de OTA produce

una nefropatía intersticial en los animales de granja como pollos y

cerdos, que puede causar además, importantes pérdidas económicas. A

pesar de las diferencias en cuanto a la toxicocinética en diversas

especies, las lesiones renales en cerdos, aves y roedores son muy

similares (Soriano, 2007).

En el ser humano se ha relacionado con la etiología de una

nefropatía endémica en la zona de los Balcanes (denominada Nefropatía

Endémica de los Balcanes, NEB), que presenta una gran semejanza

histopatológica con la que se produce en los animales. Es una

enfermedad renal crónica y progresiva que representa actualmente el

11% de todas las enfermedades primarias diagnosticadas en la antigua

Yugoslavia, y que fue observada más frecuentemente en mujeres (de 30

a 50 años) que en hombres. Esta enfermedad se acompaña a veces de

tumores malignos del tracto urinario superior que resultan muy

agresivos (Marquardt y Frohlich, 1992; Pfohl-Leszkowicz y col., 2002;

Bamias y Boletis, 2008).

La OTA es también teratogénica, hepatotóxica, neurotóxica e

inmunotóxica (López de Cerain y col., 2000; Pfohl-Leszkowicz y

Manderville, 2007). Además, está clasificada por la IARC como posible

carcinógeno humano clase 2B ya que produce tumores renales en

animales de experimentación (IARC, 1993). Existen discrepancias en

cuanto a sus efectos genotóxicos (Arbillaga y col., 2004): algunos

autores afirman que no existen evidencias de que la OTA forme aductos

con el ADN (Mally y col. 2005a; Arbillaga y col. 2007), mientras que

otros, sin embargo, apoyan esta hipótesis (Pfohl-Leszkowicz y col.,

1993; Grosse y col., 1995).


- 22 -

Toxicidad combinada

La literatura científica ofrece una amplia información sobre los

efectos tóxicos individuales de micotoxinas en varias especies animales.

Sin embargo, la exposición simultánea a múltiples micotoxinas puede

ser más probable, debido a que un hongo puede producir distintas

micotoxinas y un mismo alimento puede estar contaminado, a su vez,

por varias especies fúngicas.

Algunos artículos científicos sobre los efectos sinérgicos de

micotoxinas en niveles agudos de toxicidad estudian combinaciones de

aflatoxinas con varios tricotecenos, así como ocratoxina A y

fumonisinas, y fumonisinas y deoxinivalenol. Sin embargo, hay que

señalar que son necesarios más trabajos en este campo de

investigación, así como sobre los niveles de contaminación de varias

toxinas en un mismo alimento (Binder y col., 2007).

Cabe esperar que, si las micotoxinas tienen una estructura química

similar o son producidas por la misma especie de hongos, su modo de

acción o perfil tóxico sea semejante. Es importante conocer los efectos

aditivos que estas micotoxinas relacionadas puedan ejercer (Speijers y

Speijers, 2004).

Teniendo en cuenta este hecho, y en relación a las ocratoxinas,

Knasmuller y col. (2004) estudiaron la actividad genotóxica de las

ocratoxinas A y B y la citrinina en células de hígado humano (HepG2).

Señalaron que el efecto combinado de estas micotoxinas en los

alimentos podría tener impacto en el riesgo total de cáncer para el

hombre (Knasmuller y col., 2004).

Heussner y col. (2006) revisaron la citotoxicidad, individual y

combinada, de las micotoxinas OTA, OTB, citrinina (CIT) y patulina

(PAT) en células renales de cerdo (LLC-PK1) con el ensayo de reducción


- 23 -

del MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) y

mostraron el efecto sinérgico de la citrinina con las ocratoxinas A y B

(Heussner y col., 2006).

En general, la administración simultánea de OTA y citrinina

aumenta la citotoxicidad, genotoxicidad y la incidencia de tumores

renales en ratones macho (Pfohl-Leszkowicz y Manderville, 2007).

PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN ALIMENTOS

Las micotoxinas en general, y las ocratoxinas en particular, cobran

gran importancia en la salud humana ya que pueden llegar al ser

humano a través de la cadena alimentaria, bien por el consumo de

alimentos vegetales contaminados o por el de sus productos

transformados, o bien por el de productos de animales que hayan

acumulado las toxinas después de una alimentación con piensos

contaminados.

La OTA ha sido estudiada y encontrada en un gran número de

alimentos, mientras que sus compuestos derivados minoritarios no han

despertado interés.

La presencia de ocratoxina A se ha descrito en: granos de cereales

(cebada, trigo, maíz, avena), semillas de café verde, cacao, cacahuetes,

carne de pollo y cerdo, frutos secos, vino, cerveza, zumo de uva y

especias, entre otros alimentos (Zimmerli y Dick, 1995; Jørgensen,

1998; Scudamore y MacDonald, 1998; López de Cerain y col., 2002;

MacDonald y col., 2003; Araguás y col., 2005; Amézqueta y col., 2005;

Murillo y col., 2007; Zaied y col., 2010; Ibáñez-Vea y col., 2011; Brera

y col., 2011). Esta relación es solo un ejemplo de la amplia literatura

científica existente sobre el tema.

En 1995 se publicó el primer informe relativo a la evaluación de la

ingesta diaria de ocratoxina A por la población de los Estados miembros


- 24 -

de la UE, en el marco del sistema de Cooperación Científica para asuntos

relacionados con la alimentación (SCOOP, 1995).

En este informe, que se completó y actualizó en 2002, participaron

13 países y se procesaron 18.599 muestras, clasificando los alimentos

en: cereales (trigo, centeno, cebada, maíz, avena, mijo y arroz), café

(verde y procesado), cerveza, vino, productos de cacao, frutos secos,

productos cárnicos y especias. Por ser el estudio con mayor número de

muestras analizadas, la tabla 2 resume los niveles de OTA encontrados y

da una idea de la presencia de ocratoxina A en los alimentos (SCOOP,

2002).

Tabla 2: Número de muestras analizadas y positivas de cada tipo de alimento, concentraciones medias y máximas (μg·kg-1) de OTA (SCOOP, 2002).

De forma similar, la JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on

Food Additives) evaluó la presencia de ocratoxina A en 10.000 muestras

Alimento Nº de

muestras Muestras positivas

Media (μg·kg-1)

Máximo (μg·kg-1)

País

Cereales

Trigo 979 273 0,27 31,60 Dinamarca

Centeno 444 236 0,60 33,00 Dinamarca

Cebada 142 34 0,30 6,40 Reino Unido

Maíz 267 35 0,17 4,90 Italia

Avena 164 49 0,19 5,90 Reino Unido

Mijo 34 24 0,14 0,83 Grecia

Arroz 63 4 0,22 1,40 Francia

Café

Café verde 1.704 620 1,62 200,90 Grecia

Café procesado 1.184 549 0,72 11,50 Italia

Cerveza 496 192 0,03 0,29 Alemania

Vino 1.470 872 0,36 15,60 Italia

Cacao y derivados 547 445 0,24 3,60 Alemania

Frutos secos 800 582 2,30 53,60 Reino Unido

Carne y productos cárnicos

1.828 328 0,20 9,33 Alemania

Especias 361 188 1,15 16,43 Alemania

Otros 4.927 2.472 0,20 16,43 Alemania


- 25 -

de cereales, vino, cerveza, zumo de uva, café procesado, cacao y

derivados y productos cárnicos (JECFA, 2001). En general, no hay

diferencias en los niveles de ocratoxina A entre estos datos y los

publicados en el informe SCOOP 2002, salvo en el caso del cacao, donde

las concentraciones medias de los datos del SCOOP y de la JECFA son

0,24 y 0,55 μg·kg-1, respectivamente (EFSA, 2006).

El primer dato sobre la presencia de OTB en alimentos se dio en

1983 analizando pan enmohecido responsable de micotoxicosis en unos

animales de granja (Visconti y Bottalico, 1983). Aunque se conoce que

aparece frecuentemente junto con la OTA (EFSA, 2006), hay muy pocos

métodos disponibles que las analicen conjuntamente (Boudra y Morgavi,

2006; Gareis 1999). Algunos investigadores asiáticos han puesto su

atención en la determinación simultánea de OTA, OTB y citrinina en

algunos alimentos (Han y col., 2010; Kawamura, 2010; Tabata y col.,

2008a; Nakazato M y col., 1996; Ibe y col., 1984).

Valero y col. (2008) sugieren que un pico no identificado, presente

en los cromatogramas de todas las muestras contaminadas con

ocratoxina A de vinos especiales europeos, pudiera deberse a la

presencia de OTB (Valero y col., 2008).

Zimmerli y Dick (1996), a la par que desarrollaban por primera vez

un método analítico para la determinación de OTA en vino, también

pusieron de manifiesto la presencia de OTC en esta matriz (Zimmerli y

Dick, 1996). Sin embargo, no hay más estudios acerca de la presencia

de OTC en alimentos.

INGESTA DIARIA TOLERABLE DE OTA

La ingesta diaria tolerable (TDI) para la OTA no está aún

suficientemente bien establecida. Si se establece basándose en estudios

carcinogénicos, el intervalo de TDI oscila entre 1,2 y 5,7 ng·kg p.c.-1 con


- 26 -

unos factores de seguridad de 50.000 y 5.000, respectivamente, y un

factor de riesgo de 1/100000 (Kuiper-Goodman, 1996). De forma

similar, un grupo de expertos en seguridad alimentaria de los países

nórdicos propusieron un valor de TDI de 5 ng·kg p.c.-1·día-1, que

también fue adoptado por el Comité Científico de la Alimentación

Humana (CCAH) (Kuiper-Goodman y col., 2010).

La JECFA en 1991, basándose en estudios efectuados en cerdos con

respecto a las alteraciones de la función renal, y dividiendo el valor de

LOAEL con un factor de seguridad de 500, estableció una ingesta

tolerabla diaria provisional (PTDI) de 16 ng·kg p.c.-1·día-1 (PTWI =

112 ng·kg p.c.-1·semana-1) (JECFA, 1991). Redondeó este valor semanal

a 100 ng·kg p.c.-1 en 1995 (JECFA, 1995), reevaluándolo y

manteniéndolo constante en 2001 y 2007, considerando los nuevos

estudios de toxicidad y valores de contaminación de OTA encontrados en

alimentos (JECFA, 2001 y 2007). El valor más alto de ingesta semanal

tolerable provisional (PTWI) es de 120 ng·kg p.c.-1 establecido por la

EFSA en 2006 (EFSA, 2006) y que es el que se menciona en el

Reglamento de la Unión Europea que fija el contenido máximo de OTA

en diferentes alimentos (Reglamento Nº 1881/2006).

Es evidente que este intervalo de PTDI tan amplio y que va de 1,2 a

17,1 ng·kg p.c.-1·día-1, es consecuencia del efecto tóxico en el que se

basan los estudios, de los diferentes métodos de extrapolación y de los

diferentes factores de seguridad que se aplican. Sería necesario un

mayor número de estudios al respecto. Probablemente la tendencia sea

la de establecer un valor de TDI igual o inferior a 5 ng·kg p.c.-1·día-1

basándose en los estudios carcinogénicos. Sin embargo, no hay todavía

suficientes evidencias de que la OTA sea carcinogénica para los

humanos, aunque sí las hay de que lo sea para los animales (Walker,

2002).


- 27 -

LEGISLACIÓN

Con el objetivo de garantizar la seguridad del consumidor y

conseguir que no se superen los valores de TDI fijados, el reglamento de

la Comisión Europea Nº 1881/2006 relativo al contenido máximo de

determinados contaminantes en los productos alimenticios (Reglamento

Nº 1881/2006) y el reglamento Nº 105/2010 que modifica el anterior

(Reglamento Nº 105/2006), establecen los siguientes límites máximos

(μg·kg-1) para la ocratoxina A en algunos alimentos (tabla 3).

Alimentos (μg·kg-1)

Cereales no elaborados 5

Todos los productos derivados de cereales no elaborados, incluidos los productos transformados a base de cereales y los cereales destinados al

consumo humano directo.

3

Uvas pasas (pasas de Corinto, sultanas y otras variedades de pasas) 10

Café tostado en grano y café tostado molido, excluido el café soluble 5

Café soluble (café instantáneo) 10

Vino (incluidos los vinos espumosos y excluidos los vinos de licor y los vinos

con un grado alcohólico mínimo de 15 % vol.) y vino de frutas 2

Vino aromatizado, bebidas aromatizadas a base de vino y cócteles

aromatizados de productos vitivinícolas 2

Zumo de uva, zumo de uva concentrado reconstituido, néctar de uva, mosto

de uva y mosto de uva concentrado reconstituido, destinados al consumo humano directo

2

Alimentos elaborados a base de cereales y alimentos infantiles para lactantes y niños de corta edad

0.5

Alimentos dietéticos destinados a usos médicos especiales dirigidos

específicamente a los lactantes 0.5

Especias

Capsicum spp. (frutos de dicho género secos, enteros o pulverizados, con inclusión de los chiles, el chile en polvo, la cayena y el pimentón)

Piper spp. (frutos, con inclusión de la pimienta blanca y negra) Myristica fragrans (nuez moscada)

Zingiber officinale (jengibre) Curcuma longa (cúrcuma)

Mezclas de especias que contengan una o más de las especias antes mencionadas

30 (desde el 1.7.2010

hasta el 30.6.2012)

15

(a partir del 1.7.2012)

Regaliz (Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza inflata y otras especies) Raíz de regaliz, ingrediente para infusiones

Extracto de regaliz, para uso alimentario, especialmente en bebidas y confitería

20

80

Tabla 3: Límites máximos permitidos (µg·kg-1) de ocratoxina A en diferentes productos

alimenticios.

INTRODUCCIÓN: Ocratoxinas en vino

- 29 -

3. OCRATOXINAS EN VINO

La presencia de ocratoxina A en el vino ha sido investigada

considerablemente en todo el mundo, ya que se supone la segunda

fuente más importante de ingesta de OTA en humanos (SCOOP, 2002).

Se conocen ampliamente los métodos analíticos a utilizar, niveles en el

vino, hongos productores en la uva, factores que afectan a su

concentración, etc.

Actualmente, una búsqueda en ISI Web of Knowledge, por ejemplo,

con “ochratoxin” y “wine” como palabras clave en el título aporta más de

250 resultados. De éstos, el artículo más citado es el de Zimmerli y

Dick, Ochratoxin A in table wine and grape-juice: Occurrence and risk-

assesment (Zimmerli y Dick, 1996). Este hecho refleja su relevancia y

que la mayoría de métodos publicados para la determinación de OTA en

vino utilicen sus condiciones o alguna modificación de este proceso, que,

en esencia, se basa en el uso de columnas de inmunoafinidad para la

extracción y purificación y HPLC en fase reversa con detección de

fluorescencia, para su análisis y cuantificación. Sin embargo, es de

extrañar que, después de 15 años, no se haya profundizado sobre la

información que aporta este conocido documento referente a la

presencia de ocratoxina C.

En la tabla 4 se muestran las características de los métodos

analíticos utilizados para la cuantificación de OTA en vino.


- 30 -

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- 33 -

En la tabla 5 se muestran valores de ocratoxina A descritos en la

bibliografía en muestras de vino tinto de diferentes países.

Referencia Nº >LD/

Nº total

Media

(µg·L-1)

Mediana

(µg·L-1)

Intervalo

(µg·L-1) País*

Zimmerli y Dick, 1996 77/79 0,039 0,013 <0,003-0,388 I, F, S, NA, E,

otros

Burdaspal y Legarda, 1999

84 / 91 0,054 NE <0,003–0,603 Total

66/72 0,038 NE <0,003-0,155 España

8/8 0,225 NE 0,004-0,452 Francia

6/8 0,052 NE <0,003-0,191 Italia

2/2 0,016 NE 0,011-0,020 Portugal

1/1 0,005 0,005 0,005 Hungría

Visconti y col., 1999 37/38 1,24 0,76 <0,01-7,63 Italia

Castellari y col., 2000 7/7 2,60 3,05 0,06-5,00 Italia

1/1 0,74 0,74 0,74 España

1/1 2,14 2,14 2,14 EEUU

Otteneder y Majerus, 2000

165/305 0,201 0,02 <0,01-3,31 Mundial

Filali y col., 2001 20/20 0,912 0,785 0,04-3,24 Marruecos

Pietri y col., 2001 82/96 0,419 0,090 <0,0006-3,177 Italia

Markaki y col., 2001 31 / 31 NE NE 0,010-3,4 Mediterráneo

Soleas y col., 2001 96/580 0,18 <0,05 0,15-0,20+ Mundial

López de Cerain y col., 2002

13/28 0,147 NE 0,05-0,316+ E (Navarra)

Aboul-Enein y col., 2002

2/2 7,47 NE 3,80-11,14 NE

Stefanaki y col., 2003 71/104 0,34 0,09 <0,05–2,69 Grecia

Soufleros y col., 2003 9/14 0,68 0,09 <0,02–2,51 Grecia

Shepard y col.,2003 9/9 0,24 NE 0,07–0,39 Sudáfrica

5/5 0,58 NE 0,23-0,91 Italia

Miceli y col., 2003 14/14 0,32 0,16 0,05-1,28 Italia

Hocking y col., 2003 49/344 NE <0,02 <0,02-0,62 Australia

Lo Curto y col., 2003 7/7 0,49 0,22 0,10-2 Italia

Bellí y col., 2004 24/130 0,46 <0,05 <0,05–4,24 España

Dall’Asta y col., 2004 30/60 NE >0,2 <0,05–>0,5 Italia

Tabla 5: Presencia de ocratoxina A en muestras de vino tinto de diferentes países. +Intervalo en muestras >LC. *I (Italia), F (Francia), S (Suiza), NA (Norte de África), E (España). NE: No especificado.


- 34 -

Referencia Nº >LD/

Nº total

Media

(µg·L-1)

Mediana

(µg·L-1)

Intervalo

(µg·L-1) País*

Rosa y col., 2004 3/10 0,035 0,028-0,042 Brasil

2/7 0,035 0,028-0,042 Argentina

2/5 0,050 0,028-0,071 Chile

1/4 0,042 0,042 España

2/5 0,028 0,028 Francia

3/5 0,033 0,028-0,042 Italia

3/7 0,040 0,028-0,057 Portugal

Blesa y col., 2004 21/61 0,28 <0,01 O,06-0,53+ E (Valencia)

Maier y col., 2004 5/11 0,21 <0,01 0,12-0,30+

1AU, 1AS,

1CH, 1SA, 5I, 1CA, 1CR

Ng y col., 2004 5/36 0,024 <0,008 <0,008-0,333 Canada

26/48 0,211 <0,050 <0,008-2,320 9FR, 10GR,

9IT, 7E, 1TUR,

1AL, 11 EEUU

Brera y col., 2005 134/159 0,5 <0,10 <0,01–4,00 Italia

0/27 <0,01 <0,01 <0,01 Hungría

Berente y col., 2005 7/57 NE <0,024 <0,125+ Hungría

Pacin y col., 2005 0/54 <0,008 <0,008 <0,008 Argentina

0/14 <0,012 <0,012 <0,012 Chile

Czerwiecki y col., 2005 49/53 0,478 0,039 0,0022-6,71+ Holanda

(importados)

Lin y col., 2005 5/10 0,3 NE 0,2-0,5+ Taiwan

(importados)

Domijan y Peraica, 2005 7/7 0,022 0,022 0,012-0,047 Croacia

Bacaloni y col., 2005 36/43 0,031 NE 0,04-1,44 Italia

Anli y col., 2005 36/36 0,728 NE 0,04-1,92 Turquía

Varga y col., 2005 33/33 0,117 NE 0,03-0,533 Hungría

Aresta y col., 2006 16/29 NE 0,72+ 0,31-2,92+ Italia

Cigic y col., 2006 3/3 NE <0,01 <0,01-0,04 Eslovenia

Chiodini y col., 2006 NE/14 0,18 0,073 <0,05-0,75 9F, 4I, 1SA

Tradicionales

NE/12 0,16 0,066 <0,05-0,72 7F, 3I, 1SA,

1AL Orgánicos

Shundo y col., 2006 9/29 NE NE 0,10-1,33+ Brasil

18/34 NE NE <0,03-0,32 Importados

Tabla 5 cont.: Presencia de ocratoxina A en muestras de vino tinto de diferentes países. +Intervalo en muestras >LC. * E (España), AU (Australia), AS (Austria), CH (Chile), SA

(África del Sur), I (Italia), CA (California), CR (Croacia), F (Francia), AL (Alemania). NE: No especificado.


- 35 -

Referencia Nº >LD/

Nº total

Media

(µg·L-1)

Mediana

(µg·L-1)

Intervalo

(µg·L-1) País*

El Khoury y col., 2006 42/70 NE NE 0,012-0,126+ Líbano

Belajová y Rauova,

2007 12/18 NE NE 0,011-0,463+ Eslovaquia

7/7 NE NE 0,011-0,122 Importados

Var y col., 2007 44/51 0,110 NE <0,010-0,815 Turquía

Perrone y col., 2007 88/112 0,64 NE <0,01-4,93 Italia

García-Fonseca y col., 2008

1/5 NE <0,015 <0,015-<0,025 España

Brera y col., 2008 535/773 0,34 0,10 <0,01-7,50 Italia

Flajs y col., 2009 8/10 0,015 0,015 <0,005-0,021 Croacia

Rusanova y col., 2009 3/7 2,9 <0,5 1,8-4,4+ Rusia

Altiokka y col., 2009 20/20 2,85 NE 0,39-7,96 Turquía

Tessini y col., 2010 27/154 NE <0,01 NE CH, AR, FR

Welke y col., 2010 1/34 4,5 <0,016 4,5 Brasil

Pena y col., 2010 9/35 NE <1,0 1,23 Portugal

Spadaro y col., 2010 696/1002 0,121 NE <0,072-2,63 Italia

Campone y col., 2011 13/16 0,287 0,040 0,017-1,53+ Italia

Quintela y col., 2011 54/94 0,037 NE 0,004-0,179+ E (La Rioja)

Tabla 5 cont.: Presencia de ocratoxina A en muestras de vino tinto de diferentes países. +Intervalo en muestras >LC. *CH (Chile), AR (Argentina), F (Francia), E (España). NE: No especificado.

Algunos autores apuntan que la presencia de ocratoxina A en vinos

del sur de Europa es mayor debido a las condiciones climatológicas más

cálidas (Otteneder y Majerus, 2000; Blesa y col., 2006; Brera y col.,

2008). Sin embargo, la EFSA menciona que no se encuentran

diferencias sistemáticas entre países (EFSA, 2006).

Según los diferentes tipos de vino, los vinos tintos contienen

mayores concentraciones de OTA que los rosados o los blancos (Mateo y

col., 2007).

INTRODUCCIÓN: Validación de métodos analíticos

- 37 -

4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

La validación de un método analítico se define como el

establecimiento documental de que un procedimiento analítico

conducirá, con un alto grado de seguridad a la obtención de resultados

precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de

calidad previamente establecidos (AEFI, 2001).

Previamente a la validación, se desarrolla la puesta a punto del

método analítico, que incluye desde los primeros estudios de tanteo con

patrones, hasta la utilización del método en muestras reales que

garanticen el buen comportamiento del método en el momento del

análisis. En ocasiones, se puede adaptar un método existente para una

nueva aplicación. En otras, es preciso el desarrollo de uno nuevo en su

totalidad. Siempre, el método debe ser optimizado, de manera que se

decidan bien las características del método final antes de la validación.

El proceso de validación demuestra y verifica documentalmente que

el método es adecuado para el análisis propuesto en las condiciones

descritas, permite el conocimiento del método analítico y ofrece

confianza y seguridad en los resultados. La alta calidad de los datos

obtenidos con un método validado ha hecho que este proceso reciba una

considerable atención desde la industria y organismos reguladores. Los

laboratorios analíticos que requieran cumplir legislación o normas de

calidad (BPL, NCF, ISO 17025…) deben validar sus métodos analíticos.

Por ello, diferentes organizaciones proporcionan guías cuya amplitud

depende de los requerimientos exigidos, aunque el objetivo de la

validación es siempre el mismo. Algunos ejemplos son:

La Food and Drug Administration de EEUU (FDA) desarrolló dos

guías para la industria sobre validación de métodos analíticos: Guidance

for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry,


- 38 -

Manufacturing, and Controls Documentation (2000) y Guidance for

Industry. Process Validation. General Principles and Practices (2011).

La International Conference on Harmonisation of Technical

Requeriments for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)

tiene una guía para validación de métodos analíticos: Validation of

Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1) (2005).

La International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)

publicó Harmonized guidelines for Single-Laboratory Validation of

Methods of Analysis (2002).

La red de organizaciones EURACHEM, A Focus for Analytical

Chemistry in Europe, desarrolló una guía oficial para los laboratorios

acreditados bajo normas ISO: The fitness for Purpose of Analytical

Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics

(1998).

La Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence (AOAC

International) ofrece métodos oficiales de análisis y guías sobre

validación en un solo laboratorio (AOAC Guidelines for Single Laboratory

Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals,

2002) o en estudios colaborativos (Guidelines for Collaborative Study

Procedures to Validate Characteristics of a Method of Analysis, 2002).

La Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI)

publicó un libro sobre validación de métodos analíticos aplicados en el

análisis de productos farmacéuticos (2001).

La Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) escribió

un informe técnico sobre Recomendaciones Armonizadas para la

Validación de Métodos de Análisis en un solo Laboratorio (Resolución

OENO 8/2005) y otro centrado en análisis enológicos, Guía práctica para


- 39 -

la validación, el control de calidad y la estimación de la incertidumbre de

un método de análisis enológico alternativo (Resolución OENO 10/2005).

La Comisión Europea (CE) estableció la Decisión de la Comisión de

12 de agosto de 2002 por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del

Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la

interpretación de los resultados, y el Reglamento (CE) Nº 401/2006 de

la Comisión de 23 de febrero de 2006 por el que se establecen los

métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido

de micotoxinas en los productos alimenticios.

Los parámetros a evaluar en una validación dependen del tipo de

análisis y su aplicación. Las definiciones y algunos términos varían entre

organismos, esto se muestra en la tabla 6.

Este contraste de conceptos hace que a veces las guías resulten

confusas o que no todos los parámetros puedan/tengan que ser

estudiados para una determinada aplicación, ya que la secuencia óptima

de experimentos analíticos necesarios para el desarrollo de un método

depende del objetivo del método. Sin embargo, el objetivo de la puesta

a punto y validación del método siempre es demostrar que el método

ofrece resultados exactos y precisos, por lo que el papel del

investigador, su conocimiento del método y su criterio ante los

resultados obtenidos cobran un papel significativo. Los términos

utilizados dejan de ser importantes siempre que se cumpla el objetivo

buscado y conocer las definiciones más comunes de cada parámetro

ayuda a ello.


- 40 -

Parámetro Término Organismo

Aplicabilidad Aplicability (scope) AOAC, CE, IUPAC, OIV

Selectividad Specificity USP, ICH, CE, EURACHEM

Selectivity ISO 17025, AOAC, OIV, IUPAC, EURACHEM

Precisión Fidelidad OIV

Precision USP, ICH, IUPAC, OIV

Reliability AOAC

Repetibilidad Repeatability ICH, ISO 17025, CE, AOAC, EURACHEM

Precisión intermedia Intermediate precision ICH, AOAC

Reproducibilidad Reproducibility ICH, ISO 17025, CE, AOAC, EURACHEM

Exactitud Veracidad OIV, CE

Accuracy

USP, ICH, AOAC, ISO 17025, EURACHEM,

Trueness or bias CE, IUPAC, OIV, EURACHEM

Recovery AOAC, CE, IUPAC, EURACHEM, OIV

Incertidumbre Uncertainty AOAC, CE, IUPAC, EURACHEM, OIV

Linealidad Linearity USP, ICH, ISO 17025, IUPAC

Calibration AOAC, CE, IUPAC, OIV

Intervalo, rango Range USP, ICH, IUPAC, EURACHEM, OIV

Límite de detección Limit of detection USP, ICH, ISO 17025, IUPAC, EURACHEM, OIV

Limit of determination AOAC

Detection capability CE

Límite de cuantificación Limit of quantitation USP, ICH, ISO 17025, IUPAC, EURACHEM, OIV

Limit of determination IUPAC, OIV

Decision limit CE

Sensibilidad Sensitivity OIV, IUPAC

Robustez Robustness ICH, ISO 17025, EURACHEM

Ruggedness USP, AOAC, CE, OIV, IUPAC, EURACHEM

Tabla 6: Parámetros de validación y organismo que los mencionan.

MUESTREO

La toma de muestras es un paso que suele obviarse en las guías

porque a menudo la muestra es suministrada y este aspecto no está

bajo el control del laboratorio (AOAC, 2002). Sin embargo, para el

análisis de micotoxinas en alimentos, el muestreo tiene un papel


- 41 -

fundamental ya que las micotoxinas están muy heterogéneamente

distribuidas en los lotes. El Reglamento 401/2006 establece el

procedimiento de muestreo para el control oficial del contenido de

micotoxinas en los productos alimenticios (Reglamento Nº 401/2006).

APLICABILIDAD

También se denomina especificación, ámbito de validación o

practicabilidad (scope of validation, fitness-for-purpose). El método

analítico se aplica para determinar un analito específico, en un intervalo

de concentraciones determinado, en un tipo de material particular

utilizado para un propósito específico. En general, la validación debe

comprobar que el método se comporta de forma adecuada para la

finalidad perseguida en todo el conjunto de concentraciones del analito y

de materiales de ensayo a los que se aplica. En ocasiones, este es un

factor que, erróneamente, no se tiene en cuenta y se utiliza un mismo

método para diferentes matrices, sin tener en cuenta el efecto de éstas

en los resultados obtenidos (diferente recuperación, límite de

cuantificación…). En la Decisión 2002/657/CE se utiliza el término

aplicabilidad como sinónimo de robustez de los cambios menores

(Decisión 2002/657/CE).

ESTABILIDAD

La demostración de la estabilidad de los analitos en la muestra y de

los patrones durante el tiempo comprendido entre su tratamiento y la

finalización de los análisis es un requerimiento básico, especialmente

cuando se utilizan equipos de análisis automáticos en donde las

muestras pueden permanecer horas antes de ser analizadas (AEFI,

2001). De la misma forma debe demostrarse la estabilidad de los

analitos en las condiciones de almacenamiento de las muestras.


- 42 -

ROBUSTEZ

La robustez es la medida de la capacidad de un método analítico

para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones

en ciertos parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad

durante su empleo en rutina (AEFI, 2001).

El estudio de robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del

valor de los parámetros del método antes de validar. Deben identificarse

y evaluarse los aspectos del método susceptibles de afectar a los

resultados. La Farmacopea USP utiliza el término ruggedness pero

asimilado al término reproducibilidad (USP, 2009). La guía EURACHEM

menciona los dos términos en inglés (robustness, ruggedness)

indistintamente aunque prefiere ruggedness (ERACHEM, 1998). La CE,

además, emplea la diferenciación cambios importantes-cambios

menores (Decisión 2002/657/CE).

SELECTIVIDAD

La selectividad es la capacidad de un método analítico para medir

y/o identificar simultánea o separadamente los analitos de interés, de

forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que puedan

estar presentes en la muestra (AEFI, 2001).

Frecuentemente el término especificidad se utiliza como sinónimo,

aunque debería reservarse para aquellas situaciones donde la respuesta

obtenida solo se puede producir con una única entidad química. Como

existen muy pocos métodos que den respuesta específica solo a un

único analito, el término selectividad es, normalmente, más apropiado.

La selectividad de un método analítico es uno de los parámetros

más importantes y debería determinarse antes de iniciar el estudio de

cualquier otro parámetro de validación, dado que debe conocerse en qué

grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el


- 43 -

analito, sin interferencias de otras sustancias relacionadas con él de una

u otra forma. La presencia de interferencias imposibilita la identificación

inequívoca del analito (aparición de falsos positivos) y puede

distorsionar su respuesta (AEFI, 2001).

LINEALIDAD

La linealidad se define como la capacidad del método para

proporcionar resultados que son directamente (o por medio de

transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del

analito en la muestra dentro de un intervalo establecido (AEFI, 2001). El

término linealidad es el más extendido ya que generalmente se buscan

relaciones lineales entre respuesta y concentración del analito; sin

embargo, no siempre ocurre así, como por ejemplo en métodos

inmunológicos y, en este caso, el término calibración resulta más

apropiado.

El intervalo de concentración dentro del cual el método puede

considerarse validado es la diferencia en magnitud entre la

concentración superior e inferior de analito para la cual se ha

demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad (AEFI, 2001).

Para evaluar la linealidad se recomienda estudiar al menos 5 niveles

de concentración dentro del intervalo establecido y analizarlos por

triplicado (k = 5, nº de réplicas = 3, n = 15) (AEFI, 2001). Aunque lo

deseable sería analizar las muestras de manera aleatoria, no obstante,

se establece como criterio práctico analizarlas en sentido creciente de

concentración para minimizar posibles efectos memoria en el equipo.

El estudio de linealidad no solo implica una representación gráfica

área/concentración, sino que es necesario realizar una comprobación

estadística (AEFI, 2001).


- 44 -

Ecuación de la recta. Pendiente y ordenada en el origen.

En la recta de regresión y=b·x+a, x es la concentración, y la

respuesta, b el valor de la pendiente y a la ordenada en el origen.

La pendiente b está relacionada con la sensibilidad del método de

forma que a mayor pendiente, mayor sensibilidad (respuesta del método

frente a los cambios de la concentración de analito). La ordenada en el

origen a es la intersección de la recta con el eje de ordenadas y es

indicativa del error sistemático, no difiriendo estadísticamente de cero

en caso de no existir sesgo.

Coeficiente de correlación (r) y coeficiente de determinación (r2).

El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la

concentración y la respuesta. Si r es cercano a la unidad significa que

existe correlación con una probabilidad elevada.

La información obtenida mediante el cálculo de r es limitada y no

justifica por sí sola la linealidad, siendo el coeficiente de determinación

r2 el que aporta una mayor significación estadística ya que expresa la

proporción de la variación total de y explicada por el modelo.

Varianza residual constante (homoscedasticidad).

La representación de los residuales (diferencia entre el valor “y”

estimado y el valor obtenido) frente a los valores estimados debe seguir

una distribución aleatoria y no reflejar ninguna tendencia.

Análisis de la varianza: ANOVA

Para poder realizar un ANOVA se deben cumplir los siguientes

supuestos:

-Homogeneidad de varianzas. Se puede comprobar aplicando un

test de Cochran que indica si el factor de concentración tiene alguna

influencia en la variabilidad de los resultados. Deben normalizarse


- 45 -

previamente las respuestas, ya que, de lo contrario, se comparan

coeficientes de variación que corresponden a medias de

concentración diferentes entre sí. Las varianzas no deben ser

estadísticamente diferentes entre sí para el grado de significación

escogido (α = 0,05), Gexp < Gtablas.

-Normalidad de los residuales. Puede comprobarse mediante

representación gráfica o aplicando un test de normalidad.

Una vez comprobados estos supuestos, se calcularán los

estadísticos F1 y F2. F1exp > F1tablas demuestra la existencia de una

pendiente distinta de cero. F2exp < F2tablas demuestra la linealidad entre

los resultados obtenidos.

Test de linealidad.

Existen varios procedimientos para verificar la linealidad:

Coeficiente de variación de los factores respuesta (f)

El factor respuesta (f) expresa la relación entre el área y la

concentración y puede tomarse como una expresión aproximada de la

sensibilidad del calibrado. Los factores respuesta deben ser semejantes

entre sí y cercanos al valor de la pendiente. En general, valores del

coeficiente de variación superiores al 5% serían indicativos de una

posible falta de linealidad (AEFI, 2001).

Significación estadística de la desviación estándar de la pendiente

Se trata de comprobar que la pendiente es significativamente

distinta de cero mediante una prueba t de Student. El intervalo de

confianza de la pendiente no debe incluir al cero.


- 46 -

Test de proporcionalidad

Permite evaluar si la recta pasa por el origen de coordenadas

determinando si la variable independiente es significativamente distinta

de cero. En el intervalo de confianza debe estar incluido el cero.

PRECISIÓN

Es la capacidad de un método para proporcionar resultados

próximos entre si. La guía ICH indica que se puede estudiar a tres

niveles (ICH, 2005):

- Repetibilidad: Se refiere al grado de concordancia de los

resultados cuando las condiciones de los análisis se mantienen lo más

constantes posible: mismo analista, reactivos, equipos e instrumentos, y

se realizan en un corto período de tiempo (precisión intraensayo, within-

day precision).

- Precisión intermedia: Evalúa la precisión frente a variaciones de

analista, equipo y día (precisión intralaboratorio o precisión interensayo,

within-laboratory precision, between-day precision).

- Reproducibilidad: Evalúa la precisión entre laboratorios (precisión

interlaboratorios, between-laboratory precision).

Uno de los factores que más puede afectar en la repetibilidad del

método de análisis es la concentración de analito, ya que la desviación

estándar de las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la

concentración de analito. Así, cuando se trabaja a concentraciones bajas

se aceptan coeficientes de variación mayores que cuando se trabaja a

concentraciones altas.

La AEFI propone valores límite del coeficiente de variación del

método en función de la concentración de analito según la tabla 7:


- 47 -

Concentración (µg·L-1)

CV (%)

1 30

10 21

100 15

Tabla 7: Valores límite de CV de un método analítico (AEFI, 2001).

EXACTITUD

La exactitud expresa la proximidad entre el valor que es aceptado

convencionalmente como valor verdadero o valor de referencia y el valor

experimentalmente encontrado (AEFI, 2001). La recuperación se puede

englobar dentro de este término ya que expresa la proximidad al valor

verdadero cuando sobre la muestra se aplica el método completo.

La recuperación se expresa como porcentaje y se calcula conforme

a la expresión:

El Reglamento (CE) Nº 401/2006 fija los siguientes valores de

recuperación para los métodos de análisis de OTA en alimentos

(tabla 8). Además, establece los criterios en condiciones de repetibilidad

(CVr) y reproducibilidad (CVR) que deben cumplir los métodos de análisis

para el control oficial del contenido de micotoxinas en productos

alimenticios.

Contenido de OTA (µg·kg-1)

Recuperación (%)

CVr (%) CVR (%)

<1 50 - 120 40 60

1-10 70 - 110 20 30

Tabla 8: Criterios de recuperación fijados para métodos de análisis de OTA.

LÍMITES DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN

El límite de cuantificación (LC) es la mínima cantidad de analito que

puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y


- 48 -

precisión (AEFI, 2001). Experimentalmente, puede calcularse

analizando, por triplicado, muestras fortificadas con concentraciones

decrecientes de analito, comprobando cuál es la concentración a la que

los valores de recuperación y coeficiente de variación son adecuados.

El límite de detección (LD) es la mínima cantidad de analito en una

muestra que puede ser detectado, aunque no necesariamente

cuantificado, con precisión y exactitud (AEFI, 2001).

Entre el límite de detección y cuantificación hay un intervalo de

concentración en el que, si bien no puede cuantificarse el analito con

razonable certeza, sí puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos

positivos.

El LD no debe confundirse con la sensibilidad, ya que ésta es la

capacidad de un método de análisis para discriminar pequeñas

diferencias en la concentración. Una alta sensibilidad del método

analítico no siempre permite suponer inferiores LC y LD, ya que lo que

definirá estos límites es la relación entre el ruido y la señal debida al

analito. A este respecto, siempre es preferible un sistema con un bajo

ruido de fondo a costa de una menor sensibilidad.

De acuerdo con la IUPAC, puede calcularse el LD de un método

analítico a partir del conocimiento de la desviación estándar atribuible a

la respuesta de una muestra placebo y la pendiente de la recta de

calibrado del analito (AEFI, 2001). Este procedimiento, al igual que el de

la relación señal/ruido plantea el problema de cómo calcular la señal

media de un blanco, así cómo su desviación estándar. Por ello, se

recomienda utilizar el método basado en la extrapolación de la recta de

calibrado a concentración cero (AEFI, 2001).

Para calcular el límite de detección se utiliza la pendiente de una

recta de calibrado (b) realizada a niveles de concentración cercanos a

los límites esperados y el valor de la señal del blanco se sustituye por el


- 49 -

resultante de la extrapolación de dicha recta. La intersección con el eje y

corresponderá teóricamente al valor de la respuesta a concentración

cero de analito (ybl). La desviación estándar del blanco se estima como

la ordenada en el origen de la recta calculada representando la

desviación estándar de las concentraciones frente a la concentración

(sbl). El límite de detección se calcula a través de la fórmula:

JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y

OBJETIVOS

JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS

- 53 -

El presente proyecto se enmarca dentro de la línea de investigación

sobre “Presencia de micotoxinas en alimentos y su implicación en la

salud humana”, que se desarrolla conjuntamente en los departamentos

de Química Orgánica y Farmacéutica (sección Técnicas Instrumentales)

y Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología, de la Universidad

de Navarra.

La presencia de ocratoxina A (OTA) se ha estudiado ampliamente

en multitud de matrices alimentarias, incluido el vino. Este producto ha

sido identificado como la segunda fuente de ingesta de esta micotoxina

para el hombre después de los cereales. La concentración e incidencia

de esta toxina parece depender de las condiciones climatológicas y se ha

postulado que los vinos del sur de Europa presentan niveles más altos

de OTA debido a las condiciones de temperatura y humedad de la zona.

Otros compuestos relacionados, como la ocratoxina B y los metil y

etil ésteres de ambas ocratoxinas, son producidos por las mismas

especies de hongos y, por ello, pueden ser también contaminantes

naturales de diversos alimentos. La presencia de ocratoxina C en el vino

se describió por primera, y única, vez en 1996 y se indicó que su

concentración podía ser 10 veces inferior a la correspondiente de OTA

(Zimmerli y Dick, 1996). Desde entonces, no se han llevado a cabo más

estudios al respecto.

Valero y col. (2006) mencionaron que en los cromatogramas de

muestras de vino contaminadas por ocratoxina A aparecía otro pico a

menor tiempo de retención, sugiriendo que podía deberse a la presencia

de ocratoxina B.

Los efectos tóxicos de estas ocratoxinas relacionadas son en gran

parte desconocidos, pero los de la OTA podrían verse aumentados, o al

menos modificados, cuando ésta va acompañada de estos compuestos.

Por ello, conocer si aparecen o no en el vino junto a la OTA y en qué

JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS

- 54 -

niveles es de gran interés para evaluar el riesgo de ingestión de

ocratoxinas a través de esta matriz.

Cabe esperar que los niveles de contaminación de los compuestos

análogos de la OTA sean menores que los de esta micotoxina. Para su

cuantificación, se hace necesario un método analítico con menores

límites de detección que los descritos hasta ahora en la bibliografía para

la ocratoxina A.

El objetivo general de este trabajo es el estudio de la presencia

conjunta de OTA y otras ocratoxinas (OTB, MeOTA, OTC, MeOTB y

EtOTB) en vino tinto, a fin de aportar datos sobre la exposición humana

a estas micotoxinas.

Este objetivo general se concreta en los siguientes objetivos

específicos:

1. Puesta a punto y validación de un método analítico por HPLC-FLD

que permita la cuantificación simultánea de OTA, OTB, MeOTA,

OTC, MeOTB y EtOTB en vino tinto.

2. Estudio de los niveles de ocratoxinas (OTA, OTB, MeOTA, OTC,

MeOTB y EtOTB) en muestras de vino tinto de la Comunidad Foral

de Navarra. Estudio de la influencia del tipo de cultivo (tradicional o

ecológico) y las condiciones meteorológicas en los niveles

encontrados.

3. Estudio de los niveles de ocratoxinas en muestras de vino tinto

de países que circundan el mediterráneo.

4. Evaluación de la posible transformación de ocratoxina C en

ocratoxina A en vino tinto.

5. Estudio de la posible relación en la presencia de las diferentes

ocratoxinas.

MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL Y MÉTODOS: Material

- 57 -

1. MATERIAL

REACTIVOS

Ocratoxinas

- Ocratoxina A de Aspergillus Ochraceus, 1 mg. Sigma-Aldrich (ref:

O1877).

- Ocratoxina B de Aspergillus Ochraceus, 1 mg. Sigma-Aldrich (ref:

O1382).

- Disolución de ocratoxina alpha en acetonitrilo, 1 mL, 10 µg·mL-1.

Biopure (ref: S02053)

- Metanol CHROMASOLV® para HPLC. Sigma-Aldrich (ref: 34860).

- Etanol absoluto PAI*. Panreac (ref: 361086).

- Ácido clorhídrico fumante 37% PA. Merck (ref: 1003171000).

- Diclorometano PA. Merck (ref: 1060501000).

- Hidrogenocarbonato de sodio. Riedel-de Häen (ref: 31437).

Extracción y purificación

- Hidróxido de sodio, lentejas. Panreac (ref: 131687).

- PBS, buffer de fosfato. Biochrom AG (ref: L-182-05).

- Columnas de inmunoafinidad Ochraprep®. R-Biopharm Rhône

(ref: P14B).

- Metanol CHROMASOLV® para HPLC. Sigma-Aldrich (ref: 34860).

*PAI: para análisis instrumental (UV, IR, HPLC…). PA: reactivos especialmente indicados

para aplicaciones analíticas generales. PA-ACS: ACS indica que el producto cumple, además, con las normas de American Chemical Society específicas para él.


- 58 -

Cuantificación y confirmación

- Acetonitrilo CHROMASOLV® para HPLC. Sigma-Aldrich (ref:

34851).

- Acetonitrilo UpS Ultragradiente ROMIL. Teknokroma (ref: RM-

H050L).

- Agua desionizada de calidad Milli-Q®, recogida diariamente

(resistividad 18,2 MΩ·cm).

- Ácido fórmico 98% PA-ACS. Panreac (ref: 131030).

- Filtros Millex®-HV, 0,45 µm, PVDF, 13 mm, no estériles. Millipore

(ref: SLHVX13NK).

- Kit Viales: viales ámbar de rosca 2 mL, tapones y septum. Agilent

Technologies (ref: 5182-0554).

- Inserto para vial 400 µL vidrio desactivado. Agilent Technologies

(ref: 5183-2086).

APARATOS Y EQUIPOS

Preparación y almacenamiento de disoluciones patrón

- Espectrofotómetro de doble haz UVIKON 922 de Kontron

Instruments.

- Campana de seguridad Cruma 990.

- Agitador rotatorio SBS.

- Congelador vertical Zanussi ZD 2050 VPR.

Extracción

- pH-metro Basic 20 Crison.

- Balanza Mettler Toledo XP 205 DeltaRange®.


- 59 -

- Colector múltiple de vacío vacuum manifold VisiprepTM 24 de

Supelco.

- Baño de agua termostatizado Selecta acoplado a un sistema de

evaporación con gas nitrógeno.

- Agitador Vórtex Techno Kartell TK3S.

Cuantificación

- Pipetas automáticas Brand Transferpette® entre 5 y 1.000 µL.

- Vórtex-evaporador 230V 4322 100 de Labconco.

- Equipo de purificación de agua Milli Q Gradient de Millipore.

- Baño ultrasonidos Selecta.

- Cromatógrafo de líquidos HPLC 1100 de Agilent Technologies

(figura 3), dotado de desgasificador de vacío G1322A, sistema de

bombeo cuaternario G1311A, inyector automático G1313A,

compartimento termostatizado para columnas G1316A, detector de

fluorescencia G1321A y programa informático Chemstation 3D. Columna

Zorbax Eclipse XDB-C18, 5 µm, 150 x 4,6 mm de Agilent Technologies y

precolumna Tracer Extrasil ODS, 5 µm, 1 0,4 cm de Teknokroma.

Figura 3: Equipo HPLC-FLD.


- 60 -

Confirmación

- Cromatógrafo de líquidos HPLC 1200 de Agilent Technologies,

dotado de desgasificador de vacío G1379B, sistema de bombeo binario

SL G1312B, inyector automático SL G1367C, termostato para inyector

G1330B, compartimento termostatizado para columnas G1316B,

detector de fluorescencia G1321A y programa informático Chemstation

3D. Columna Zorbax Eclipse Extend-C18, 3,5 µm, 50 x 2,1 mm de

Agilent Technologies.


acoplado a un espectrómetro de masas tipo TOF (Time of Flight) 6220

Accurate-Mass TOF LC/MS (figura 4). El equipo consta además de:

desgasificador de vacío G1379B, sistema de bombeo binario SL G1312B,

inyector automático G1367C, termostato del inyector G1330B,

compartimento termostatizado de columna G1316B, detector

ultravioleta G1315B y programa informático Mass Hunter.

Figura 4: Accurate-Mass TOF LC/MS de Agilent Technologies.


acoplado a un espectrómetro de masas tipo trampa iónica LC/MSD

Trap XCT Plus (figura 5). El equipo consta además de:


- 61 -

desgasificador de vacío G1379B, sistema de bombeo binario

G1312B, inyector automático G1367C, termostato del inyector

G1330B, compartimento termostatizado para columnas G1316B,

detector ultravioleta G1315B y los programas informáticos Agilent

Chemstation 3D y LC/MSD Trap software.

Figura 5: HPLC 1200/MSD Trap XCT Plus de Agilent Technologies.

MATERIAL Y MÉTODOS: Muestras

- 63 -

2. MUESTRAS

VINOS TINTOS NAVARROS

Se han analizado 51 vinos tintos de la Comunidad Foral de Navarra.

De estos, 35 son vinos tintos de agricultura tradicional y 16 cuentan con

la certificación de vino ecológico del Consejo de la Producción Agraria

Ecológica de Navarra (CPAEN).

En Navarra, la Denominación de Origen data del año 1933. Una de

las principales características que la definen es la gran diversidad de

paisajes y climas que se dan en los más de 100 km que separan el norte

de la zona, situada en las cercanías de Pamplona, del sur, enclavada en

la ribera del Ebro.

La confluencia en Navarra de los climas atlántico, continental y

mediterráneo define las 5 zonas de producción vitivinícolas diferenciadas

por su localización geográfica, su orografía, las variedades cultivadas, el

suelo y el clima. Las cinco áreas son: Baja Montaña, Valdizarbe, Tierra

Estella, Ribera Baja y Ribera Alta (ver mapa). Entre ellas se alcanza una

superficie superior a las 15.000 hectáreas de viñedo.

Figura 6: Mapa de las 5 zonas de la D.O. Navarra y municipios de donde se ha analizado vino.


- 64 -

La elaboración de vino tinto supone un 70% de la producción total

de vino de Navarra, mientras que la producción de rosado y blanco

constituye un 25 y 5%, respectivamente. En cuanto a la

comercialización, el 70% se vende en territorio nacional y un 30% se

exporta a Alemania, Holanda, Reino Unido y EEUU, principalmente

(Consejo Regulador de la D.O. Navarra, www.navarrawine.com).

Figura 7: Comercialización de vino navarro y principales países de exportación.

Vinos de agricultura tradicional

Los 35 vinos de agricultura tradicional analizados se han adquirido

en diferentes comercios de Navarra, y se han clasificado en base al año

de cosecha. Así, 23 muestras son vinos jóvenes de los años 2006 y

2007 y las 10 restantes son vinos crianza de la cosecha de 2004. En la

tabla 9 se muestran el municipio de la bodega, la zona viticultora a la

que pertenece, el porcentaje de alcohol (% alc.) indicado en la etiqueta,

la variedad de uva y el año de cosecha.

Código Municipio Zona Año % alc. Tipo Uva

1J Corella Ribera Baja NE 12 NE

2J Cascante Ribera Baja NE 13,5 Tempranillo

3J Muruarte de Reta Valdizarbe NE 13 NE

2Jb Corella Ribera Baja 2006 12,5 Tempranillo, CS

4J Olite Ribera Alta 2006 13,5 Tempranillo, Merlot, CS,

Garnacha

5J Azcona Estella 2006 13 Tempranillo

11J Los Arcos Estella 2006 13,5 Tempranillo

12J Obanos Valdizarbe 2006 13,5 Garnacha

13J Carcastillo Ribera Alta 2006 13,5 NE

14J Falces Ribera Alta 2006 14,5 Cabernet Sauvignon, Merlot

Tabla 9: Características de los 35 vinos tintos de agricultura tradicional analizados. NE: No especificado en la etiqueta. J: joven, C: crianza. CS: Cabernet Sauvignon.


- 65 -


6J Carcastillo Ribera Alta 2007 13,5 NE

7J Corella Ribera Baja 2007 13 Tempranillo

8J Corella Ribera Baja 2007 12,5 NE

9J Obanos Valdizarbe 2007 13 Tempranillo, Cabernet

Sauvignon

10J Corella Ribera Baja 2007 13,5 NE

15J San Martin de Unx Baja

Montaña 2007 13,5

70% Tempranillo, 20%

Garnacha, 10% CS+Merlot

16J Murchante Ribera Baja 2007 13,5 Tempranillo

17J Añorbe Valdizarbe 2007 13,5 Tempranillo, Merlot

18J Olite Ribera Alta 2007 13 Garnacha, Tempranillo

19J Lerín Ribera Alta 2007 13 Tempranillo

20J Olite Ribera Alta 2007 13,5 Tempranillo, Merlot, CS,

Garnacha

21J Corella Ribera Baja 2007 13 Tempranillo, CS

22J Corella Ribera Baja 2007 13 60% Tempranillo, 40%

Garnacha

23J Murchante Ribera Baja 2007 13,5 Tempranillo

24J Murchante Ribera Baja 2007 13 Tempranillo

1C Cintruénigo Ribera Baja 2004 12,5 Tempranillo, Garnacha,

Cabernet Sauvignon

2C Olite Ribera Alta 2004 13 Tempranillo

3C Muruarte de Reta Valdizarbe 2004 13 NE

4C Olite Ribera Alta 2004 14,5 Tempranillo, Cabernet

Sauvignon, Merlot

5C Azcona Estella 2004 13 Merlot, Cabernet Sauvignon,

Tempranillo

6C Carcastillo Ribera Alta 2004 13,5 Merlot, Cabernet Sauvignon,

Tempranillo

7C Corella Ribera Baja 2004 13,5 NE

8C Corella Ribera Baja 2004 13,5 NE

9C Puente la Reina Estella 2004 13 NE

10C Corella Ribera Baja 2004 13,5 Tempranillo, Cabernet

Sauvignon, Merlot

Tabla 9 cont.: Características de los 35 vinos tintos de agricultura tradicional analizados.

NE: No especificado en la etiqueta. J: joven, C: crianza. CS: Cabernet Sauvignon.

Vinos ecológicos

Los 16 vinos de agricultura ecológica analizados han sido

suministrados por siete bodegas navarras y provienen de las cosechas

de 2007 y 2008. Todas las bodegas están inscritas como elaboradores

de productos ecológicos en el Consejo de la Producción Agraria Ecológica

de Navarra (CPAEN).


- 66 -

El municipio y zona de viticultura de cada vino, con el año de

vendimia, el porcentaje de alcohol (% alc.) mostrado en la etiqueta y el

tipo de uva empleada de los vinos de agricultura ecológica se muestran

en la tabla 10.


1-EC-2007 Olite Ribera Alta 2007 13,5 NE

2-EC-2007 Peralta Ribera Alta 2007 14 60% Tempranillo, 30%

Garnacha, 10% CS

2-EC-2007b Peralta Ribera Alta 2007 15,5 Tempranillo, Garnacha

3-EC-2007 Lakar Estella 2007 14 50% Tempranillo, 20%

Merlot, 30% CS

4-EC-2007 Andosilla Rioja Baja 2007 NE NE

5-EC-2007 Bargota Rioja Baja 2007 13,5 Tempranillo

6-EC-2007 Lumbier Baja Montaña 2007 14 Garnacha, Cabernet

Sauvignon, Tempranillo

7-EC-2007 Lumbier Baja Montaña 2007 13,5 Garnacha

1-EC-2008 Olite Ribera Alta 2008 13,5 NE

2-EC-2008 Peralta Ribera Alta 2008 14 60% Tempranillo, 30%

Garnacha, 10% CS

3-EC-2008 Lakar Estella 2008 13,5 Tempranillo

4-EC-2008 Andosilla Rioja Baja 2008 NE NE

5-EC-2008 Bargota Rioja Baja 2008 13,5 Tempranillo

7-EC-2008 Lumbier Baja Montaña 2008 13,5 Garnacha

8-EC-2008 Igúzquiza Estella 2008 13 75% Tempranillo, 25%

Cabernet Sauvignon

9-EC-2008 Igúzquiza Estella 2008 13 Tempranillo 100%

Tabla 10: Características de los 16 vinos tintos de agricultura ecológica analizados. NE: No especificado en la etiqueta. EC: ecológico. NE: No especificado. CS: Cabernet

Sauvignon.

Condiciones climatológicas

Los datos referentes a la temperatura media, humedad relativa

media y precipitación de los dos meses anteriores a la vendimia (julio y

agosto) del año correspondiente de cada vino, en cada municipio, se han

tomado de la página web de la Agencia Nacional de Meteorología y el

Gobierno de Navarra y se muestran en la tabla 11.

(http://meteo.navarra.es/estaciones/mapadeestaciones.cfm).


- 67 -

Año Municipio Tª media (ºC) Humedad

relativa (%)

Precipitación

acumulada (L·m-2)

2004

Cintruénigo 21,9 56,9 49,6

Olite 22,4 58,1 90,1

Muruarte de Reta 20,2 70,0 69,9

Azcona Yerri 20,8 61,7 136,8

Carcastillo 21,9 61,3 55,8

Puente la Reina 21,0 60,0 56,8

Corella 21,8 56,0 50,2

2006

Corella 22,5 52,9 32,2

Olite 22,9 56,5 36,8

Azcona, Yerri 21,4 63,0 57,7

Los Arcos 22,0 58,6 36,8

Obanos 21,3 61,2 78,8


Falces 22,9 57,1 37,4

2007


Obanos 19,8 61,5 49,0

Corella 21,4 49,4 8,2

San Martin 21,1 53,4 20,2

Murchante 22,1 50,5 20,6

Añorbe 19,8 61,5 49,0

Olite 21,5 54,7 24,3

Lerín 20,3 55,4 9,5

Peralta 21,4 56,1 5,2

Lakar 19,6 63,1 36,6

Andosilla 21,3 61,0 13,2

Bargota 20,8 54,9 21,8

Lumbier 19,7 59,3 44,4

2008

Olite 22,1 57,5 26,5

Peralta 20,8 57,9 25,5

Lakar 19,7 66,2 49,8

Andosilla 21,6 62,1 23,0

Bargota 21,0 59,1 69,8

Lumbier 19,9 64,1 38,0

Igúzquiza 20,2 61,2 46,3

Tabla 11: Temperatura media (ºC), humedad relativa media (%) y precipitación acumulada (L) de julio y agosto de cada año de vendimia en cada municipio.

VINOS DE PAÍSES MEDITERRÁNEOS

Diversos trabajos (Blesa y col., 2006; Otteneder y Majerus, 2000;

Mateo y col., 2007) han concluido que los vinos de los países del Sur de

Europa son más susceptibles de contaminación por ocratoxina A debido

al clima cálido (tipo mediterráneo). Con el objetivo de conocer los

niveles de ocratoxina A y sus análogos en los países que bordean el

Mediterráneo se han analizado 96 vinos tintos procedentes de 9 países


- 68 -

de este entorno geográfico: España, Francia, Italia, Croacia, Grecia,

Turquía, Israel, Túnez y Argelia. Su situación geográfica se muestra en

el siguiente mapa:

Figura 8: Localización de los países mediterráneos de los que se han analizado vinos.

Vinos de España

Dentro de todas las denominaciones de origen de vino tinto de

España se ha elegido Cataluña por ser una zona con clima típicamente

mediterráneo.

En la Comunidad Autónoma de Cataluña el viñedo ocupa una

extensión aproximada de 71.000 hectáreas y cuenta en la actualidad

con diez denominaciones de origen (D.O. Alella, Conca de Barberà,

Costers del Segre, Empordà, Montsant, Penedès, Pla del Bages, Priorat,

Tarragona, Terra Alta) más una denominación de carácter genérico

creada en el año 2001 con el nombre de Denominación de Origen

Catalunya a la que pueden adscribirse las ya existentes (Ver figura 9).

De los 12 vinos analizados, 6 se adquirieron en diferentes comercios

de Pamplona y otros 6 por Internet (www.lavinia.es). Sus características

se muestran en la tabla 12.


- 69 -

Figura 9: Mapa de las denominaciones de origen en Cataluña.

Código D.O. Año % alc. Tipo Uva

1-CA-XXXX Penedés NE 12,5 Tempranillo, Merlot

2-CA-XXXX Catalunya NE 12,5 NE

3-CA-2007 Catalunya 2007 13 Tempranillo, Garnacha, Monastrell

4-CA-2007 Catalunya 2007 13 Cabernet Sauvignon, Merlot, Tempranillo

5-CA-2007 Catalunya 2007 13,5 Garnacha tinta, Mazuelo

6-CA-2008 Penedés 2008 13,5 Tempranillo, Garnacha, Monastrell

7-CA-2006 Penedés 2006 13,5 Cabernet Sauvignon, Merlot

8-CA-2008 Penedés 2008 14 Tempranillo

9-CA-2008 Montsant 2008 14 53% Cariñena, 28% Garnacha, 12%

Cabernet Sauvignon, 7% Tempranillo

10-CA-2008 Montsant 2008 14 85% Garnacha, 15% Syrah

11-CA-2009 Priorato 2009 14,5 Garnacha, Cariñena, Cabernet Sauvignon

12-CA-2008 Priorato 2008 15 80% Garnacha, 20% Cariñena

Tabla 12: Características de los 12 vinos tintos catalanes analizados. NE: No especificado

en la etiqueta.CA: Cataluña. XXXX: Año vendimia desconocido. D.O.: Denominación de origen. % alc.: porcentaje de alcohol.


- 70 -

Vinos de Francia

Las muestras de vino francés analizadas han sido adquiridas en

comercios de Pamplona (10 vinos) o a través de Internet (2)

(www.lavinia.es). Sus características se muestran en la tabla 13.

Código Región Dpto D.O. Año % alc Uva

1-FR-2006 L’Atlantique Gironda Bordeaux 2006 12 Cabernet Merlot

2-FR-2007 L’Atlantique Gironda Bordeaux 2007 12,5 NE

3-FR-2007 Vin de Pays d'Oc NE Coteaux du

languedoc 2007 13 NE

4-FR-2007 Vin de Pays d'Oc NE Coteaux du

languedoc 2007 13 NE

5-FR-2007 Vin de Pays d'Oc NE Pays d’Oc 2008 13 Merlot

6-FR-2008 Vin de Pays d'Oc NE Pays d’Oc 2007 13 Merlot

7-FR-2009 Comtés

Rhodaniens NE Beaujolais 2009 12,5 NE

8-FR-2009 Comtés

Rhodaniens Ródano

Côtes du Rhône

2009 13 Garnacha,

Syrah

9-FR-2006 L’Atlantique Gironda Bordeaux 2006 13 NE

10-FR-2008 Comtés

Rhodaniens NE Beaujolais 2008 12 Gamay

11-FR-2006 Comtés

Rhodaniens Ródano

Côtes du Rhône

2006 14,5 Garnacha

Cariñena, Syrah

12-FR-2007 Comtés

Rhodaniens Loira

Saumur Champigny

2007 13 NE

Tabla 13: Características de los 12 vinos tintos franceses analizados. Dpto:

Departamento. D.O.: Denominación de origen. % alc.: porcentaje de alcohol. NE: No especificado en la etiqueta. FR: Francia.

Figura 10: Mapa de las regiones y departamentos de Francia.


- 71 -

Vinos de Italia

Italia es el mayor productor de vino del mundo y el país con mayor

índice de consumo por

habitante.

Se ha analizado vino de

las regiones señaladas en la

figura 11. Las muestras

analizadas han sido adquiridas

en comercios de Pamplona (9

vinos) o a través de Internet (3

vinos) (www.lavinia.es). En la

tabla 14 se muestran el código,

la denominación de origen

(D.O.), la región, el año, el

porcentaje de alcohol (% alc.)

y el tipo de uva empleada.

Figura 11: Mapa de Italia.

Código D.O. Región Año % alc. Uva

1-IT-XXXX IGT Emilia-Romaña NE 11,5 NE

2-IT-2005 DOC Calabria 2005 13,5 Gaglioppo

3-IT-2006 DOC Cerdeña 2006 13 NE

4-IT-2007 DOC Emilia-Romaña 2007 11,5 NE

5-IT-2007 DOCG Toscana (Chianti) 2007 12,5 NE


7-IT-2007 IGT Apulia (Salento) 2007 13,5 NE

8-IT-2007 IGT Apulia (Salento) 2007 13,5 NE


10-IT-2005 IGT Toscana 2005 13,5 95% Sangiovese, 5%

Colorino

11-IT-2005 IGT Toscana 2005 14 NE

12-IT-2006 IGT Toscana 2006 14 CS 40%, Merlot 20%, Syrah

20%, Sangiovese 20%

Tabla 14: Características de los 12 vinos tintos italianos analizados. NE: No especificado

en la etiqueta. IT: Italia. CS: Cabernet Sauvigon. XXXX: Año vendimia desconocido.


- 72 -

Vinos de Croacia

Se indican en la figura 12 las regiones croatas de donde se han

analizado vinos.

Figura 12: Mapa de Croacia, señalados los condados de origen de las muestras.

Las muestras de vino croata se adquirieron a través de la página

web alemana www.jadrovino.de.

Código Origen Condado Año % alc. Uva

1-CR-2004 Stari Grad Split-Dalmacia 2004 13,5 Plavac mali

2-CR-2004 Konavle Dubrovnik-Neretva 2004 12,4 Cabernet Sauvignon

3-CR-2005 Peljesac Dubrovnik-Neretva 2005 12 Cuvée

4-CR-2005 Hvar Split-Dalmacia 2005 12 Plavac mali

5-CR-2006 Imotski Split-Dalmacia 2006 13,3 Merlot, Vranac, Trnjak

6-CR-2006 Konavle Dubrovnik-Neretva 2006 12,9 CS, Merlot

7-CR-2006 Dubrovnik Dubrovnik-Neretva 2006 12,3 Plavac mali

8-CR-2006 Peljesac Dubrovnik-Neretva 2006 11,5 Plavac mali

9-CR-2007 Ston Dubrovnik-Neretva 2007 12,5 Plavac mali

10-CR-2007 Kutjevo Eslavonia 2007 12,4 Pinot noir

11-CR-2008 Šibenik Šibenik-Knin 2008 13 Babic

12-CR-2008 Brtonigla Istria 2008 13,5 Merlot

Tabla 15: Características de los 12 vinos tintos croatas analizados. % alc.: porcentaje de

alcohol. CR: Croacia. CS: Cabernet Sauvignon


- 73 -

Vinos de Grecia

Grecia puede considerarse la cuna de las viñas y el vino en Europa

con más de 4.000 años de cultura vinícola. Este país exporta más de 28

millones de litros anuales, siendo Alemania su principal mercado, con la

mitad de las ventas totales, seguida de Francia e Italia.

Las zonas de donde se ha recogido vino pueden verse en la figura:

Figura 13: Mapa de Grecia, señaladas las regiones de procedencia de las muestras.

De las 12 muestras analizadas, 6 fueron adquiridas por la Dra. Eleni

Pontiki en comercios de Tesalónica (Grecia). Las restantes se

adquirieron por Internet (www.iamatrade.com). Las características de

estos vinos, código, origen, zona, año, porcentaje de alcohol (% alc.) y

variedad de uva empleada se muestran en la tabla 16.


- 74 -

Código Origen Zona Año % alc. Tipo Uva

1-GR-XXX Nemea Peloponeso 2007 13 Agiorgitiko

2-GR-2007 Nemea Peloponeso 2007 12,5 Agiorgitiko

3-GR-2007 Rodas Islas del mar Egeo 2007 11,5 Mandilaria

4-GR-2007 Halkidiki Macedonia 2007 13,5 Limnio

5-GR-2007 Nemea Peloponeso 2007 12,5 Agiorgitiko

6-GR-2007 Creta Islas del mar Egeo 2007 12,5 NE

7-GR-XXXX Santorini Islas del mar Egeo NE 12,5 Mandilaria

8-GR-2003 Tripoli Peloponeso 2003 13,5 CS merlot

9-GR-2004 Santorini Islas del mar Egeo 2004 12,5 Mandilaria Agiorgitiko

10-GR-2004 Grevena Macedonia 2004 12 Moschomavro

11-GR-2004 Acaya Peloponeso 2004 13,5 60% Mavrodaphne,

40% merlot

12-GR-2005 Drama Macedonia 2005 13 CS Merlot Limnio

Tabla 16: Características de los 12 vinos tintos griegos analizados. NE: No especificado en

la etiqueta. GR: grecia. CS: Cabernet Sauvigon. XXXX: Año vendimia desconocido.

Vinos de Turquía

El consumo de bebidas alcohólicas en general, y de vino en

particular, está cada vez más extendido en Turquía, pese a ser un país

de mayoría musulmana, aunque el consumo per cápita es de tan solo un

litro por persona al año (www.icex.es).

Turquía es el sexto país productor de uvas del mundo y el cuarto en

superficie dedicada a viñedos, sin embargo solo el 12% de las uvas

producidas se dedica a la elaboración de vino.

Las regiones de las cuales se han analizado vinos se muestran en la

figura 14.


- 75 -

Figura 14: Mapa de Turquía, señaladas las regiones de procedencia de las muestras.

Las muestras de vino turco se adquirieron a través de la página web

alemana www.tuerkischer-weinversand.de. Sus características se

muestran en la tabla 17.

Código Región Año % alc. Tipo Uva

1-TUR-2003 Egeo 2003 11,5 Öküzgözü, Bogazkere

2-TUR-2003 Mármara 2003 12,5 Gamay, Bogazkere

3-TUR-2005 Anatolia oriental 2005 11,5 Öküzgözü

4-TUR-2005 Sureste de Anatolia 2005 12,5 Bogazkere

5-TUR-2005 Egeo 2005 13 Syrah

6-TUR-2005 Mármara 2005 13 CS, Merlot

7-TUR-2005 Anatolia Central 2005 13 Kalecik Karasi

8-TUR-2005 Egeo 2005 12,5 Syrah, Kalecik Karasi, CS

9-TUR-2006 Egeo 2006 13 Kalecik Karasi

10-TUR-2006 Anatolia oriental 2006 13 Öküzgözü, Bogazkere

11-TUR-2007 Egeo 2007 14,5 CS, Syrah

12-TUR-2007 Egeo 2007 13,5 Syrah, Merlot, Kalecik

Karasi, Bogazkere

Tabla 17: Características de los 12 vinos tintos turcos analizados. TUR: Turquía. CS: Cabernet Sauvigon. % alc.: porcentaje de alcohol.


- 76 -

Vinos de Israel

La principal característica de los vinos de Israel es su certificación

de vino kosher (“puro”). Esto significa que el vino cumple con los

estrictos criterios de producción que imponen los rabinos.

Israel está dividido en seis regiones productoras de vino: Galilea,

los montes de Judea, Sansón, la llanura de Sharon, Haifa y los Altos del

Golán.

Figura 15: Mapa de Israel, señaladas las regiones de las muestras.

Las muestras de vino israelí se adquirieron a través de Internet

(www.judaicawebstore.com), sus características se muestran en la

tabla 18:

Código Región Año % alc. Tipo Uva

1-IS-2006 Altos del Golán, Alta Galilea 2006 13,9 CS, Merlot, Cabernet Franc

2-IS-2006 Altos del Golán 2006 14,5 Merlot

3-IS-2006 Altos del Golán 2006 14,5 Sangiovese

4-IS-2007 Baja Galilea, Sansón 2007 14 Shiraz

5-IS-2008 Galilea, montes de Judea 2008 13 Cabernet Sauvignon,

Merlot, Shiraz

6-IS-2008 Alta Galilea 2008 14,5 Cabernet Sauvignon

Tabla 18: Características de los 12 vinos tintos israelíes analizados. NE: No especificado

en la etiqueta. IS: Israel. CS: Cabernet Sauvigon. % alc.: porcentaje de alcohol.


- 77 -

Código Región Año % alc Tipo Uva

7-IS-2008 Altos del Golán 2008 14,5 Cabernet Sauvignon

8-IS-2008 Altos del Golán 2008 14,5 Merlot

9-IS-2009 Altos del Golán 2009 14 Sangiovese, Syrah, Gamay Noir, Pinot Noit (Nebbiolo,

Napa Gamay)

10-IS-2009 Galilea 2009 NE Cabernet Sauvignon

11-IS-2009 Altos del Golán 2009 14

Cabernet Sauvignon,

Merlot, Cabernet Franc, Malbec, Petit Verdot.

12-IS-2008 Alta Galilea 2008 14,5 Merlot

Tabla 18 cont.: Características de los 12 vinos tintos israelíes analizados. NE: No especificado en la etiqueta. IS: Israel. CS: Cabernet Sauvigon. . % alc: porcentaje de

alcohol.

Vinos del norte de África

Los principales países productores de la región mediterránea son

Argelia, Marruecos y Túnez. Siendo la población de estos países

mayoritariamente practicantes del Islam, la producción de vinos se

destina sobre todo a la exportación.

En la imagen se muestran las zonas de Argelia y Túnez de donde se

han seleccionado las muestras de vino.

Figura 16: Mapa de Argelia (izquierda) y Túnez (derecha).


- 78 -

Se han analizado 7 muestras de vino argelino y 5 originarias de

Túnez (ver tabla 19), adquiridas a través de Internet

(www.bahadourian.com y www.weine-aus-marokko.de).

Código Región Provincia/

Gobernación Año % alc. Tipo Uva

1-AR-XXXX Muaskar Muaskar NE 12,5 NE

2-AR-1998 Zaccar Djelfa 1998 12,5 NE

3-AR-2004 Muaskar Muaskar 2004 12,5 NE

4-AR-2006 Dahra Chlef 2006 13 NE

5-AR-2006 Médéa Médéa 2006 13 NE

6-AR-2008 Tlemecén Tlemecén 2008 13 NE

7-AR-XXXX Muaskar Muaskar NE 13 NE

1-TU-XXXX Mornag Túnez NE 12 Cariñena, Syrah

2-TU-XXXX Tebourba Manouba NE NE NE

3-TU-XXXX Mornag Túnez NE 13,5 NE

4-TU-2005 Mornag Túnez 2005 13,5 Cariñena, Garnacha, Syrah

5-TU-2006 Mornag Túnez 2006 12,5 Syrah, Merlot

Tabla 19: Características de los 12 vinos tintos africanos analizados. % alc.: porcentaje

de alcohol. NE: No especificado en la etiqueta. AR: Argelia. TU: Túnez. XXXX: Año vendimia desconocido.

MATERIAL Y MÉTODOS: Métodos

- 79 -

3. MÉTODOS

DISOLUCIONES MADRE DE OCRATOXINAS

OCRATOXINA A

Se disuelve 1 mg de ocratoxina A en 1 mL de metanol. El metanol

se inyecta con una jeringa de 2 mL directamente en el vial de la OTA en

polvo sin abrir para evitar la dispersión del polvo. De esta solución se

toman alícuotas de 0,1 mL en tubos con tapa (eppendorfs) a los que se

añaden 0,9 mL de metanol.

Cada alícuota posee una concentración teórica de 100 mg·L-1. La

concentración real se determina por espectrofotometría UV a 333 nm

aplicando la ley de Lambert-Beer:

Donde, A es la media de los 10 valores de absorbancia medidos con

el espectrofotómetro,

ε es el coeficiente de extinción molar (ε = 5.500 M-1·cm-1)

(Jiménez y col., 2001),

c es la longitud de la cubeta de medida (c = 1 cm),

PM es el peso molecular de la OTA (PM = 403,82 g·mol-1).

OCRATOXINA B

Se procede de la misma manera que con la ocratoxina A, utilizando

etanol en lugar de metanol y midiendo la absorbancia a 318 nm,

PMOTB = 369,37 g·mol-1, ε318 (EtOH) = 6.900 M-1·cm-1 (Cole y col.,

2003).


- 80 -

SÍNTESIS DE METILOCRATOXINA A Y OCRATOXINA C

Los metil y etil ésteres de la OTA (MeOTA y OTC, respectivamente)

se sintetizan según el procedimiento de Li y col. (1998), basado en la

esterificación alcohólica de la molécula de OTA (Li y col., 1998).

Se evaporan 500 µL de una disolución patrón de OTA de 100 mg·L-1

en un tubo de vidrio. El residuo se redisuelve en 2 mL de metanol, para

la síntesis de MeOTA, y en 2 mL de etanol, para la síntesis de OTC, y se

les añade a cada tubo 100 µL de HCl 12 M. La mezcla se deja en

agitación durante 48 h a temperatura ambiente. Después, el disolvente

se evapora bajo corriente de nitrógeno a 60ºC.

Como no se alcanza una conversión cuantitativa de la ocratoxina A,

los ésteres obtenidos se purifican con una extracción líquido-líquido con

NaHCO3 (0,25%) y diclorometano (DCM). El residuo seco de los

productos obtenidos de la síntesis se disuelve en 5 mL de bicarbonato, a

los que se añaden 2,5 mL de DCM. Se agita durante media hora en un

agitador rotatorio y se separa la fase orgánica, que contiene cada uno

de los ésteres. Este proceso se repite con otros 2,5 mL de DCM. Para

cada uno de los ésteres, se juntan las fases orgánicas y se evapora el

disolvente. Los ésteres así purificados se disuelven en 700 µL de etanol,

comprobándose la pureza mediante HPLC-FLD y la confirmación de los

productos obtenidos mediante LC-MS. La concentración de estos

patrones se calcula por espectrometría de la misma manera que para la

OTA y OTB (PMMeOTA = 417,84 g·mol-1, PMOTC = 431,87 g·mol-1,

ε333 (OTC, EtOH) = 7.000 M-1·cm-1 (Cole y col., 2003)).

SÍNTESIS DE METIL Y ETILOCRATOXINA B

Los ésteres derivados de la OTB se sintetizan de la misma manera

que en el caso de los ésteres derivados para la OTA. Debido a que se

desconocen sus coeficientes de absortividad molar no se pueden

determinar sus concentraciones.


- 81 -

DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO

A partir de las disoluciones madre de concentración conocida se

preparan tres disoluciones de 400, 40 y 4 µg·L-1 en metanol, cada una

de ellas conteniendo las 4 ocratoxinas (OTA, OTB, MeOTA y OTC) en las

concentraciones indicadas. Estos estándares se almacenan a -20ºC en

frascos de polipropileno con cierre hermético.

Los patrones de calibración se preparan evaporando a 40ºC bajo

corriente de nitrógeno los volúmenes adecuados de estas disoluciones

de trabajo, para que al evaporar el disolvente y resuspender en 250 μL

de fase móvil (42:58 acetonitrilo:ácido fórmico 0,4%), se obtenga la

concentración deseada de patrón.

Los extractos en metanol obtenidos de las muestras de vino se

preparan de la misma manera (evaporando y resuspendiendo en 250 μL

de fase móvil) para su inyección en el HPLC.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

La extracción y purificación de las ocratoxinas desde el vino se lleva

a cabo con una modificación del procedimiento descrito en las

instrucciones de uso de las columnas de inmunoafinidad.

Aproximadamente, 60 mL de vino tinto se ajustan a pH 7,2 con una

disolución acuosa de NaOH 2 M. La mezcla se filtra por gravedad con

papel de filtro, se cogen 50 mL con una pipeta aforada de vidrio y se

conservan en un tubo de plástico para su paso por las columnas.

Las columnas de inmunoafinidad se colocan en el colector múltiple

de vacío con jeringas de 20 mL en su extremo superior, que sirven de

depósito para la muestra. Es importante que no queden burbujas de aire

en la parte inferior de la columna para evitar su atasco. Las columnas

quedan ubicadas como se muestran en la figura siguiente.


- 82 -

Figura 17: Montaje del sistema de purificación.

Cada columna se acondiciona con 10 mL de PBS antes de añadir la

muestra. Posteriormente, se lava la columna con 10 mL de PBS y 20 mL

de agua Milli-Q. Para secarla se pasan varias emboladas de aire con

ayuda de una jeringa.

Las ocratoxinas se eluyen con 4 mL de metanol sobre un tubo de

vidrio de fondo cónico. Primero, se añaden 2 mL de metanol y cuando

cae la primera gota se cambia la dirección del flujo con una jeringa para

asegurar la completa desnaturalización de los anticuerpos y la elución

total de las ocratoxinas. Se cierra la conexión y se dejan en contacto

columna y metanol durante 3 minutos, se abre la conexión y se añaden

los 2 mL de metanol restantes. Una vez que todo el disolvente ha

atravesado la columna, ésta se seca con varias emboladas de aire.


- 83 -

DETERMINACIÓN POR HPLC-FLD

Los extractos en metanol obtenidos de las muestras de vino tinto se

evaporan a sequedad en un baño de agua a 40ºC bajo corriente suave

de nitrógeno. El residuo se resuspende en 250 L de fase móvil (42:58

acetonitrilo:ácido fórmico 0,4%) agitando en vórtex durante 3 minutos.

Este volumen se filtra con un filtro de jeringa de 0,45 µm, antes de

colocarlo en un vial de vidrio para su análisis por HPLC.

Las condiciones cromatográficas se describen en la tabla 20:

Factores Condiciones

Aparato HPLC 1100 Agilent Technologies

Columna Zorbax Eclipse XDB-C18, 150 x 4,6 mm (5 µm)

Temperatura de horno 40 ºC

Volumen de inyección 100 μL

Fase móvil Acetonitrilo:Ácido fórmico 0,4%

42:58 de 0 a 10 min 60:40 de 15 a 25 min

Flujo 1 mL·min-1

Detector Fluorescencia λexc: 318 nm (0-7,5 min)

333 nm (7,5-25 min) λem: 461 nm

Ganancia = 13 Tabla 20: Condiciones empleadas para la cuantificación de ocratoxinas por HPLC-FLD.

CONFIRMACIÓN POR LC-MS

La detección por espectrometría de masas requiere un flujo de fase

móvil menor que el utilizado en el método de cuantificación por

fluorescencia. La transferencia de métodos HPLC se realizó teniendo en

cuenta las fórmulas teóricas que relacionan el flujo (F) con el diámetro

de columna (dc) y el volumen de inyección (V), y la longitud (L) con el

diámetro de partícula (dp) y el tiempo (t) (Agilent, 2009).

La disminución del diámetro interior de la columna permite la

reducción del flujo y el volumen de inyección a través de las relaciones:


- 84 -

2

,

2

,

anteriorc

nuevoc

anteriornuevod

dFF

2

,

2

,

anteriorc

nuevoc

anteriornuevod

dVV

Reducir de manera simultánea la longitud de columna y el diámetro

de partícula permite tiempos de análisis más cortos manteniendo la

eficacia del sistema. Las relaciones a tener en cuenta son:

anteriorp

nuevop

anteriorcnuevocd

dLL

,

,

,,

anteriorc

nuevoc

anteriornuevoL

Ltt

,

,

El efecto de estas nuevas condiciones en la separación

cromatográfica se probó primero en un HPLC 1200 con detector de

fluorescencia, antes de aplicarlas en el LC-MS, ya que este modelo de

HPLC es similar al disponible en los acoplamientos instrumentales LC-MS

(ion trap) y LC-MS (TOF). Las condiciones utilizadas se muestran en la

tabla 21:


Aparato HPLC 1200 Agilent Technologies Columna Zorbax Extend-C18, 50 x 2,1 mm (3,5 µm)

Temperatura de horno 40 ºC Volumen de inyección 20 μL


35:65 de 0 a 2 min, 53:47 de 2,1 a 15 min

Flujo 0,2 mL·min-1

Tabla 21: Nuevas condiciones cromatográficas a emplear en la confirmación de

ocratoxinas por LC-MS.

Esta optimización previa permite transferir de manera muy sencilla

el método analítico a cualquiera de los dos equipos de espectrometría de

masas, cambiando únicamente las condiciones de detección:


Detector MS Trampa iónica MS TOF Interfase electrospray electrospray Polaridad positiva positiva

Presión del nebulizador 40 psi 40 psi Flujo del gas de secado 8 L·min-1 8 L·min-1

Tª del gas de secado 350 ºC 350 ºC Target mass [M+H]+ [M+H]+

Tabla 22: Condiciones de detección empleadas en la confirmación de ocratoxinas por LC-MS.

MATERIAL Y MÉTODOS: Validación del método analítico

- 85 -

4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

La validación del método analítico para la cuantificación simultánea

de OTA, OTB, MeOTA y OTC en muestras de vino tinto se ha basado en

el estudio de los siguientes parámetros: selectividad, linealidad,

precisión, exactitud, recuperación, límite de detección, límite de

cuantificación, robustez y estabilidad.

SELECTIVIDAD

La selectividad del método se ha asegurado con la especificidad de

las columnas de inmunoafinidad usadas en el proceso de extracción, la

separación cromatográfica y el uso de un detector de fluorescencia, con

una longitud de onda de excitación y emisión características para estos

compuestos.

Además, se ha verificado la capacidad del método para medir

inequívocamente las ocratoxinas, comprobando que sus tiempos de

retención coinciden en una disolución patrón, en muestras naturalmente

contaminadas y en muestras contaminadas y fortificadas y que, en estas

últimas, los picos no presentan desdoblamientos ni deformaciones.

El alto factor de concentración aplicado a las muestras de vino

puede aumentar el riesgo de interferencias debidas a la matriz, por lo

que también se han estudiado, en vinos con baja concentración de los

analitos, los siguientes parámetros cromatográficos: factor de retención,

simetría del pico, anchura de pico a media altura, número de platos

teóricos y, especialmente, la resolución cromatográfica de cada

compuesto con el pico anterior.

El factor de retención o factor de capacidad (k’) representa la

relación del tiempo que el soluto pasa en la fase estacionaria con

respecto al que pasa en la fase móvil y se calcula a través de la

expresión:


- 86 -

Donde, tR es el tiempo de retención del compuesto, t’R es el tiempo

de retención relativo y tM es el tiempo muerto.

La simetría y la anchura de pico a media altura (wh) son

suministradas por el equipo para cada pico integrado.

El número de platos teóricos (N) es la longitud de la columna

requerida para que se establezca un equilibrio del soluto entre las fases

estacionaria y móvil. Mide la calidad de una columna y se calcula con la

fórmula:

2

54,5h

R

w

tN

La resolución (Rs) determina las separaciones entre picos. La calcula

el equipo para cada compuesto en relación con el pico anterior, por lo

que se debe analizar en un cromatograma de una muestra y no de

patrón.

LINEALIDAD E INTERVALO

El estudio de linealidad se ha realizado en un amplio intervalo de

concentraciones con el fin de incluir los niveles de ocratoxinas que

pueden encontrarse en muestras contaminadas naturalmente. La

linealidad se ha estudiado desde la concentración de patrón más baja

que puede observarse con el detector de fluorescencia (con adecuada

precisión y exactitud) hasta 400 µg·L-1 en patrón, que corresponden a

2 µg·L-1 en vino, la concentración máxima permitida por la Unión

Europea para la OTA en vinos.

Se han preparado tres rectas con disoluciones patrón en los

intervalos 0,1-1, 1-20, 20-400 µg·L-1. Dentro de cada intervalo se han


- 87 -

estudiado 5 niveles de concentración por triplicado. En la siguiente tabla

se muestran los niveles de concentración considerados.

Intervalo Concentración (µg·L-1)

0,1 - 1 0,1 0,2 0,4 0,6 1

1 - 20 1 4 8 12 20

20 - 400 20 60 120 200 400

Tabla 23: Niveles de concentración estudiados para cada intervalo.

Las rectas de calibrado se han obtenido representando las áreas de

los picos obtenidos para cada ocratoxina a cada concentración frente a

dicha concentración. El estudio de linealidad no solo ha consistido en

una representación gráfica, sino que se ha realizado la correspondiente

comprobación estadística.

El método se ha considerado lineal si ha cumplido los objetivos

establecidos en la guía AEFI: coeficientes de correlación y determinación

> 0,990, coeficiente de variación de los factores respuesta < 5%

(< 10% para las rectas de concentración inferior, 0,1-1 µg·L-1),

pendiente significativamente distinta de cero, intervalo de confianza al

95% de la ordenada en el origen incluye al cero, la representación de los

residuales debe generar una distribución de puntos al azar y test ANOVA

significativo, comprobando los supestos de homogeneidad de varianzas

y normalidad de los residuales (AEFI, 2001).

La repetibilidad se ha estudiado analizando por triplicado

disoluciones patrón de ocratoxinas con concentraciones

correspondientes a los niveles bajo, medio y alto de cada recta de

calibrado: 0,1, 0,4, 1, 8, 20, 120 y 400 µg·L-1. La precisión intermedia

se ha realizado llevando a cabo estos análisis en tres días diferentes. Los

resultados se han expresado como coeficiente de variación (CV, %).

Las mismas muestras se han empleado para evaluar la exactitud

instrumental, expresada como error relativo, a través de la fórmula:


- 88 -

100(%)real

obtenidareal

C

CCER

Se ha considerado que el análisis de patrones era preciso y exacto

si los valores del coeficiente de variación y del error relativo son

inferiores al 10%. Se han aceptado valores inferiores al 15% para el

nivel de concentración más bajo estudiado.

RECUPERACIÓN

El estudio de recuperación se ha efectuado sobre una serie de

alícuotas de muestras de vino tinto fortificado, que se analizan

independientemente desde el principio (preparación de la muestra)

hasta el final (lectura de resultados). Debido al amplio intervalo de

concentraciones estudiado se han analizado 5 niveles por triplicado en

un día (n = 15) para establecer la repetibilidad del método, y en tres

días diferentes (n = 45) para la precisión intermedia.

Las alícuotas de vino se fortificaron con volúmenes adecuados de

las disoluciones patrón (400, 40 y 4 µg·L-1) para alcanzar los niveles de

0,0005, 0,003, 0,04, 0,6 y 2 µg·L-1.

La recuperación se ha expresado como porcentaje y se ha calculado

corrigiendo la concentración medida con la concentración del blanco

conforme a la expresión:

Se han aceptado valores de recuperación entre el 50-120% y un

coeficiente de variación inferior al 20% (Reglamento Nº 401/2006). Los

valores de recuperación obtenidos en condiciones de precisión

intermedia para cada ocratoxina se han empleado como factor de

corrección de los resultados en el análisis de las muestras.


- 89 -

LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Los límites de detección y cuantificación se han calculado

fortificando muestras de vino tinto a 0,3, 0,4 y 0,5 ng·L-1 por triplicado.

Se ha considerado como límite de cuantificación el nivel de

concentración cuya recuperación esté comprendida entre el 50 – 120%

y cuyo coeficiente de variación en el estudio de repetibilidad sea inferior

al 20% (Reglamento Nº 401/2006).

El límite de detección se ha calculado matemáticamente por el

método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a

concentración cero (AEFI, 2001), tal y como se explica en el capítulo

Introducción.

ROBUSTEZ

Se ha empleado únicamente una columna cromatográfica durante

todo el desarrollo de este trabajo, por lo que no se ha considerado el

factor de cambio de columna en el estudio de la robustez. Los factores

considerados han sido el pH al que se ajusta el vino antes de su paso

por las CIA y el volumen de inyección.

Para estudiar el efecto de cambios de pH en la cuantificación, se ha

evaluado la influencia en la recuperación del ajuste del pH a 6,8, 7,2 y

7,6 en muestras de vino fortificadas a 0,05 µg·L-1. El análisis se ha

realizado por duplicado y las áreas obtenidas, restando las áreas del

blanco, se han comparado con las áreas de una disolución de calibración

de 10 µg·L-1. El método se ha considerado robusto si el coeficiente de

variación de las recuperaciones obtenidas es inferior al 5%.

Para analizar la influencia del volumen de inyección en el HPLC en la

exactitud de los resultados se han realizado 9 análisis para cada

concentración de 4, 40 y 400 µg·L-1, con un volumen de inyección de

20 µL. Las concentraciones ensayadas se han comparado con las


- 90 -

obtenidas al multiplicar por cinco las concentraciones calculadas a partir

de las áreas con 20 µL. Se ha considerado robusto si el error relativo es

inferior al 5%.

ESTABILIDAD

Se ha estudiado la estabilidad de las disoluciones estándar de

trabajo almacenadas en congelación a -20ºC. Las disoluciones de 4, 40

y 400 µg·L-1 de OTA, OTB, MeOTA y OTC en metanol se analizaron por

triplicado el día de su preparación, y 1, 3, 6 y 12 meses después. Se ha

calculado la exactitud (ER %) de la concentración media de los 3 análisis

con respecto a la concentración inicial, aceptándose un valor máximo del

5%.

Además, se ha comprobado la estabilidad de los analitos disueltos

en fase móvil una vez colocados en el vial y en el inyector del HPLC

durante 48 horas. Se analizaron cada 3 horas patrones de

concentraciones 8 y 100 µg·L-1, y muestras de vino fortificadas a 0,04 y

0,3 µg·L-1 (equivalente a 8 y 60 µg·L-1 en vial). Se ha estudiado la

exactitud de cada concentración con respecto al valor a tiempo 0,

considerándose estables si el error relativo es menor del 5%.

CONTROL DE CALIDAD DEL MÉTODO

Durante el análisis de las muestras y con el objetivo de garantizar el

perfecto funcionamiento del equipo, se ha procedido de la siguiente

forma: se colocan dos patrones de concentración conocida al principio

de la secuencia de análisis, uno más cada diez muestras a analizar y dos

al final de la secuencia, siguiendo un orden de concentración creciente y

abarcando todo el intervalo de concentraciones de trabajo esperado. El

criterio fijado de aceptación de resultados es un error relativo igual o

inferior al 10% de la concentración ensayada en, al menos, el 75% de

los patrones.

MATERIAL Y MÉTODOS: Análisis estadístico

- 91 -

5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La evaluación estadística de los datos obtenidos se ha realizado de

acuerdo con la guía AEFI y con un manual de bioestadística aplicada

(AEFI, 2001; García-Granero, 2010). Se ha utilizado el programa UnStat

versión 1.0 para el análisis de los resultados.

Los parámetros del estudio de linealidad se han calculado con el

test de regresión. Además, se ha realizado el análisis de la varianza

(ANOVA) para cada recta. La normalidad de los residuales se ha

comprobado con el test D’Agostino Pearson y se ha utilizado el test de

Cochran para examinar la homogeneidad de varianzas de los factores

respuesta, calculando el estadístico G a través de las desviaciones

estándar (s) con la fórmula:

2

2

exp

i

máxima

s

sG

El cálculo de las concentraciones medianas de ocratoxinas en los

vinos se ha realizado teniendo en cuenta todos los valores obtenidos,

incluidos los valores entre el LD y LC y las concentraciones inferiores al

LD, para las que se ha empleado el valor LD/2. En el cálculo de las

medias se han considerado solo las concentraciones superiores al LC.

La normalidad de los datos a los que se han aplicado test

estadísticos se ha estudiado con el test D’Agostino Pearson. Se han

empleado test no paramétricos debido a la significación (p<0,05)

obtenida con este test en todos los casos.

El estudio acerca de la transformación de ocratoxina C en OTA se ha

analizado con el test de Friedman para k muestras relacionadas.

El test de Kruskal-Wallis para k muestras independientes se ha

empleado en el caso del análisis de las concentraciones entre diferentes

MATERIAL Y MÉTODOS: Análisis estadístico

- 92 -

años de los vinos navarros de agricultura tradicional y con las muestras

de los vinos de países mediterráneos.

Cuando el resultado de estos test ha sido significativo se han

realizado test a posteriori de comparaciones múltiples para detectar las

diferencias: test DMS recomendado para 3 muestras y test de

Bonferroni.

El test U de Mann-Whitney para dos muestras independientes se ha

utilizado para comparar los resultados de las cosechas de vinos

ecológicos de Navarra y para estudiar la influencia del tipo de cultivo en

las concentraciones de ocratoxinas.

La correlación de las concentraciones de ocratoxinas entre sí y de

éstas con las condiciones climatológicas (temperatura media, humedad

relativa media y precipitación acumulada) se ha observado con el

coeficiente de correlación no paramétrico de Spearman. Valores de este

coeficiente entre 0,3 y 0,5 muestran una relación mediana, moderada

entre ambas variables, entre 0,5 y 0,7 existe una relación grande, entre

0,7 y 0,9 la asociación es muy elevada y con valores mayores de 0,9 la

asociación es prácticamente perfecta (García-Granero, 2010).

RESULTADOS

RESULTADOS: Puesta a punto del método analítico

- 95 -

1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO



La síntesis propuesta por Li y col. (Li y col., 1998) no produjo una

conversión completa de la OTA en sus respectivos ésteres, como se

puede apreciar en los cromatogramas obtenidos al analizar las

disoluciones tras la reacción de esterificación (figura 18).

Figura 18: Cromatogramas obtenidos después de la síntesis de a) MeOTA y b) OTC, antes

de su purificación.

La purificación de los ésteres obtenidos se intentó con extracciones

líquido-líquido utilizando diferentes mezclas de disolventes.

- K2CO3 (2%) – hexano

- K2CO3 (2%) – acetato de etilo

- Agua – diclorometano (DCM)

- NaHCO3 (1 %) – DCM

- NaHCO3 (0,5 %) – DCM

- NaHCO3 (0,25 %) – DCM


- 96 -

Se utilizaron disoluciones de diferentes carbonatos debido a que

habían sido empleadas en el laboratorio con anterioridad para la

eliminación de OTA en la cáscara de cacao (Amézqueta y col., 2008).

La mezcla de disolventes NaHCO3 (0,25 %) – DCM fue la que dio

lugar a una separación completa de la OTC y MeOTA de la OTA no

reaccionante. La figura 19 muestra los cromatogramas obtenidos a

partir de los productos purificados. En ellos se observa la desaparición

del pico de OTA a 11,1 min.

Figura 19: Cromatogramas obtenidos después de la síntesis y purificación de a) MeOTA y

b) OTC.


Las disoluciones estándar de trabajo de 400, 40 y 4 µg·L-1 de OTA,

OTB, MeOTA y OTC conjuntamente se prepararon en metanol, ya que al

prepararlas en acetonitrilo se observó una disminución de la

concentración de OTA y OTB detectable en concentraciones bajas.

Se puede observar esta disminución de áreas en los cromatogramas

obtenidos al analizar un patrón de calibrado de 4 µg·L-1 preparado a

partir de la disolución en metanol y otro obtenido a partir de la

disolución en acetonitrilo (figura 20).


- 97 -

Figura 20: Cromatogramas de disoluciones estándar de trabajo de 4 µg·L-1 preparadas en metanol (___) y en acetonitrilo (___).


La extracción y purificación de la ocratoxina A del vino se realiza

comúnmente con columnas de inmunoafinidad, pero la aplicación de las

mismas para la cuantificación de las demás ocratoxinas no se menciona

ni en las instrucciones de la casa comercial de las columnas ni en la

bibliografía.

La retención de los compuestos análogos resultó ser diferente según

la marca comercial de las columnas. Inicialmente, se utilizaron las CIA

Ochratest® de la marca Vicam, ya que son las habitualmente empleadas

en el laboratorio para la purificación de la OTA. Sin embargo, se observó

que retienen la OTA y sus ésteres pero no la OTB, impidiendo su

análisis. Cuando se utilizaron las columnas Ochraprep® de R-Biopharm,

las 4 ocratoxinas fueron retenidas en las columnas. Por esta razón, se

eligieron estas columnas para la extracción de las ocratoxinas desde el

vino. En la figura 21 se observan dos cromatogramas correspondientes a

vino fortificado con los 4 compuestos. El primero de ellos se ha obtenido

tras extraer las ocratoxinas con columnas Ochratest®; mientras que en

el segundo caso se han empleado columnas Ochraprep®


- 98 -

Figura 21: a) Retención de OTA, MeOTA y OTC por las CIA Ochratest®, b) Retención de OTB, OTA, MeOTA y OTC por las CIA Ochraprep®.

Se realizaron algunos cambios en la metodología para la extracción

de las ocratoxinas respecto a las instrucciones de uso propuestas por la

casa comercial Ochraprep®.

Con la intención de disminuir los límites de detección y

cuantificación, a la columna se aplicaron 50 mL de vino en vez de utilizar

20 mL. La elución de las ocratoxinas se realizó con 4 mL de metanol en

lugar de emplear 1,5 mL de disolución metanol:ácido acético (98:2 v/v),

debido a que la estabilidad de las ocratoxinas podría verse alterada con

esta disolución ácida de metanol.

En las instrucciones se propone analizar este eluido directamente en

el HPLC, no obstante se evaporaron los 4 mL del metanol de elución y el

residuo se resuspendió en 250 μL de fase móvil.

Estas modificaciones han permitido concentrar los niveles de

ocratoxinas 200 veces en lugar de las 13,3 veces que se hubiesen

conseguido con el procedimiento recomendado por el fabricante.


- 99 -

PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO

El método cromatográfico desarrollado es una variación del

procedimiento descrito por la Organización de la Vid y el Vino (OIV) y

del utilizado anteriormente en el laboratorio para la determinación de

OTA en vino (OIV, 2001; López de Cerain y col., 2002), ya que estos

métodos fueron desarrollados para la cuantificación de ocratoxina A,

pero no para la de sus análogos.

Al aplicar las condiciones isocráticas descritas en el método de la

OIV se observó muy poca retención para la OTB y unos tiempos de

retención altos para la MeOTA y la OTC. Con el objetivo de acortar el

tiempo de análisis, se optimizó la separación con un gradiente de fase

móvil acetonitrilo: agua (ácido fórmico 0,4%).

Aumentar la temperatura del horno de columna hasta 60ºC no

redujo de manera importante la duración del cromatograma (figura 22).

Figura 22: Patrón de calibrado de 1 µg·L-1 analizado a 40, 50 y 60 ºC.


- 100 -

En cuanto a la detección y con objeto de reducir el ruido en el

cromatograma, se cambió la longitud de onda de excitación de

fluorescencia de la OTA comúnmente empleada en el laboratorio,

225 nm, a 333 nm. En el caso de las muestras analizadas en este

estudio, reducir el ruido ha sido de gran interés para bajar el límite de

detección. A 333 nm, aunque las áreas de pico obtenidas son menores,

la estabilidad de la línea base es mayor, alcanzándose límites de

detección más bajos. En la figura 23 se muestran los cromatogramas

obtenidos al analizar el mismo patrón de calibración con una u otra

longitud de onda.

Figura 23: Patrón de calibrado de 0,6 µg·L-1 con λexc a 225 y 333 nm.

La mezcla de acetonitrilo:solución acuosa de ácido fórmico 0,4%

(42:58), que se eligió como disolvente para la reconstitución del residuo

y posterior inyección de las muestras, produjo en el cromatograma una

interferencia inesperada cuando se utilizaban viales de HPLC de plástico.

Esta interferencia se evidenció a tiempos de retención altos, una vez que

el gradiente alcanza el 60% de acetonitrilo, afectando a la cuantificación


- 101 -

de MeOTA. En la figura 24 se muestran ejemplos de los cromatogramas

obtenidos tras un análisis de vino y de patrón.

Figura 24: Interferencia causada por el uso de viales de HPLC de plástico. a) muestra de

vino tinto, b) patrón de calibrado.

Esta interferencia desapareció cuando se empleaban viales para

HPLC de vidrio para recoger el extracto resuspendido de las muestras.

Por esta razón se eligieron este tipo de viales para la realización del

presente estudio.

MÉTODO DEFINITIVO

Todo lo anterior ha definido el procedimiento de extracción y

purificación y el método cromatográfico para la cuantificación de la OTB,

OTA y sus metil y etil ésteres descrito en el apartado material y métodos

y que se resume a continuación:

a) Extracción desde el vino


- 102 -

- Se ajusta el pH de 60 mL de vino tinto a 7,2 con NaOH 2 M y se

filtra por gravedad.

- 50 mL de la mezcla anterior se pasan por las CIA Ochraprep®

previamente acondicionadas con 10 mL de PBS.

- Se lavan las columnas con 10 mL de PBS y 20 mL de agua.

- Las ocratoxinas se eluyen con 4 mL de metanol

- Los extractos en metanol se evaporan a sequedad y el residuo se

resuspende en 250 µL de fase móvil 42:58, ACN:H2O (0,4%

ácido fórmico).

b) Separación cromatográfica y detección


Aparato HPLC 1100 Agilent Technologies

Columna Zorbax Eclipse XDB-C18, 150 x 4,6 mm (5 µm)

Temperatura de horno 40 ºC

Volumen de inyección 100 μL


42:58 de 0 a 10 min 60:40 de 15 a 25 min

Flujo 1 mL·min-1

Detector Fluorescencia λexc: 318 nm (0-7,5 min)

333 nm (7,5-25 min) λem: 461 nm

Ganancia = 13 Viales Vidrio desactivado

Tabla 24: Condiciones definitivas del método HPLC optimizado.

METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα

Los análisis de algunas muestras de vino con el método ya

optimizado y validado mostraron cómo, además de los cuatros picos

correspondientes a OTB, OTA, MeOTA y OTC, aparecían otros picos

(figura 25).

El hecho de utilizar columnas de inmunoafinidad y condiciones de

fluorescencia propias de los compuestos estudiados, hizo pensar que


- 103 -

estos picos podrían corresponder a otras ocratoxinas presentes en el

vino.

Figura 25: Cromatograma de una muestra de vino tinto.

Para confirmar esta hipótesis, se sintetizaron los metil y etil ésteres

de la OTB y de la OTα, utilizando para ello el mismo procedimiento

empleado en la síntesis de los ésteres de la ocratoxina A. Ejemplos de

los cromatogramas obtenidos tras el análisis por HPLC de disoluciones

conteniendo estos ésteres se muestran en las figuras 26 y 27, y los

tiempos de retención se indican en la tabla 25.

Figura 26: Análisis simultáneo de MeOTB y EtOTB después de su síntesis a partir de OTB.


- 104 -

Figura 27: Análisis simultáneo de MeOTα y EtOTα después de su síntesis a partir de OTα.

OTα OTB MeOTα OTA EtOTα MeOTB EtOTB MeOTA OTC

tR 2,7 5,6 8,9 11,1 14,2 14,3 17 18,5 21,3

Tabla 25: Tiempos de retención (min) de las 9 ocratoxinas.

La ocratoxina alpha y sus ésteres resultaron no ser retenidos por las

CIA, por lo que no aparecerán en el análisis de las muestras de vino. Los

tiempos de retención de MeOTB y EtOTB corresponden con los de dos

picos minoritarios que se observan en algunos análisis. En la figura 28

se muestra un cromatograma de un vino fortificado con las 6

ocratoxinas.

Figura 28: Análisis de un vino fortificado con OTB, OTA, MeOTB, EtOTB, MeOTA y EtOTB.

El estudio posterior de los espectros de masas correspondientes a

estos picos (ver apartado Confirmación por LC-MS) confirmó su

identidad.


- 105 -

El coeficiente de absortividad molar de los ésteres de la OTB no se

ha encontrado tras una consulta detallada de la bibliografía. Por lo tanto,

no se pudieron preparar disoluciones de concentración conocida y el

método analítico no se pudo validar para ellos. Por esta razón, se

decidió calcular las concentraciones aproximadas de MeOTB y EtOTB

utilizando las rectas, recuperación, LC y LD de MeOTA (para MeOTB) y

de OTC (para EtOTB). De esta forma se han conseguido los datos de

concentración que aparecen en el apartado de análisis de muestras.


La confirmación de la presencia de las ocratoxinas en las muestras

se ha llevado a cabo reanalizando un 10% de las mismas por LC-MS.

El método cromatográfico utilizado para la determinación de

ocratoxinas con detección de fluorescencia tuvo que ser modificado para

hacer compatible el flujo de la fase móvil empleado con el detector de

fluorescencia con la detección por espectrometría de masas, como ya se

ha indicado en el apartado material y métodos.

Las fórmulas teóricas facilitaron la conversión del método y

aportaron las nuevas condiciones de análisis. En la tabla 26 se pueden

ver las condiciones calculadas y las aplicadas finalmente:

Método de

cuantificación Transferencia

teórica Transferencia

aplicada

Columna (mm) 150 x 4,6 50 x 2,1 50 x 2,1

dp (µm) 5 1,8 3,5

Flujo (mL·min-1) 1 0,21 0,20

V inyección (µL) 100 21 20

Gradiente

t (min) % ACN t (min) % ACN t (min) % ACN

0 42 0 42 0 35

10 42 3,3 42 2 35

15 60 5 60 2,1 53

25 60 8,3 60 15 53

Tabla 26: Condiciones calculadas y aplicadas al transferir el método de cuantificación.

El cromatograma obtenido al optimizar el método en el HPLC 1200

con detector de fluorescencia se puede ver en la figura 29.


- 106 -

Figura 29: Cromatograma de una solución patrón de las 6 ocratoxinas a 0,2 mL·min-1.

Se han empleado dos detectores de espectrometría de masas: un

detector de tiempo de vuelo (TOF, time-of-flight) y uno de trampa iónica

(ion trap).

El detector MS-TOF es un detector de “masa exacta” y ofrece los

m/z de cada compuesto con 4 decimales. El cromatograma se obtiene

extrayendo el ion M+1 de cada compuesto. Al no haber fragmentación

de la molécula, el espectro obtenido corresponde al ión molecular

detallado con 4 decimales. Se puede extraer no solo el m/z máximo del

pico del espectro, sino también su anchura en masa, obteniendo un

intervalo que tiene en cuenta las contribuciones isotópicas. El m/z

máximo [M+H]+ y los intervalos extraídos para cada ocratoxina se

muestran en la tabla 27. Los cromatogramas obtenidos extrayendo los

intervalos de la tabla se muestran en las figuras 30 y 31.

OT m/z máximo Intervalo m/z

OTB 370,1158 370,0855 – 370, 1530

OTA 404,0766 404,0437 – 404,1115

MeOTB 384,1307 384,1017 – 384,1626

EtOTB 398,1463 398,1183 – 398,1747

MeOTA 418,0900 418,0669 – 418,1133

OTC 432,1080 432,0703 – 432,1656

Tabla 27: Máximo e intervalo de m/z para cada ocratoxina obtenidos con el LC-MS (TOF).


- 107 -

Figura 30: Cromatograma de un patrón de 6 ocratoxinas en el LC-MS (TOF).

Figura 31: Cromatograma de LC-MS (TOF) de un vino contaminado naturalmente.


- 108 -

La trampa de iones aísla un m/z característico, el [M+H]+ en este

caso, en un intervalo de tiempo concreto y ofrece los espectros de

masas de los compuestos encontrados. Los iones de fragmentación

característicos de cada compuesto pueden utilizarse para obtener el

cromatograma de ion extraído (EIC) del cromatograma de iones totales

(TIC). Los tiempos obtenidos (min), sus m/z correspondientes y los

iones de fragmentación característicos se muestran en la tabla 28.

Ocratoxinas tR Intervalo m/z [M+H]+ Iones fragmentación

OTB 3,6 0 - 5 370,1 324,1; 352,1; 307,1

OTA 6,7 5 – 7,2 404,0 358,1; 386,1; 341,1

MeOTB 7,4 7,2 – 8,3 384,0 324,1; 352,1; 307,1

EtOTB 8,7 8,3 – 9,4 398,0 324,1; 352,1; 307,1

MeOTA 9,8 9,4 – 11 418,1 358,1; 386,1; 341,1

OTC 12,1 11 - 14 432,1 358,1; 386,1; 341,1

Tabla 28: Tiempos de retención y masas características obtenidas con LC-MS (IT).

Los cromatogramas obtenidos para una disolución patrón y una

muestra naturalmente contaminada se muestran en la figura 32.

Figura 32: a) TIC de una disolución patrón y b) EIC de una muestra contaminada.

a)

b)


- 109 -

Los espectros de masas (MS-IT) obtenidos de cada compuesto se

muestran en las figuras siguientes. Se indican las posibles pérdidas de

grupo para explicar los iones característicos.

Figura 33: Espectro de masas de la ocratoxina B.

Figura 34: Espectro de masas de la ocratoxina A.


- 110 -

Figura 35: Espectro de masas de la metilocratoxina B.

Figura 36: Espectro de masas de la etilocratoxina B.


- 111 -

Figura 37: Espectro de masas de la metilocratoxina A.

Figura 38: Espectro de masas de la ocratoxina C.

RESULTADOS: Validación del método analítico

- 113 -

2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO*

SELECTIVIDAD

La selectividad del método se ha favorecido con el uso de técnicas

de inmunoafinidad en el proceso de extracción y la utilización de

fluorescencia en la detección.

En la figura 39, se muestra un cromatograma de los obtenidos para

una disolución patrón de ocratoxinas, una muestra naturalmente

contaminada y una muestra fortificada. En este último se observa cómo

ningún pico presenta hombros ni deformaciones.

Figura 39: Cromatogramas obtenidos de a) una disolución patrón, b) una muestra de vino

tinto naturalmente contaminada y c) una muestra fortificada.

Los tiempos de retención de OTB, OTA, MeOTA y OTC con las

condiciones descritas son 5,6, 11,1, 18,5 y 21,3 minutos

respectivamente, y coinciden en las disoluciones patrón y en las

muestras contaminadas.

* Resultados publicados en Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 8249-8256.

Validation of a liquid chromatography method for the simultaneous quantification of

ochratoxin A and its analogues in red wines. Rebeca Remiro, María Ibáñez-Vea, Elena González-Peñas, Elena Lizarraga.


- 114 -

Los parámetros cromatográficos obtenidos estudiando un

cromatograma de vino tinto fortificado a 0,5 ng·L-1 con las 4 micotoxinas


FACTOR OTB OTA MeOTA OTC

Tiempo retención (tR) (min) 5,7 11,2 18,5 21,4

Tiempo muerto (tm) (min) 1 1 1 1

Factor de retención (k') 4,7 10,2 17,5 20,4

Simetría 0,78 0,89 0,91 0,88

Anchura de pico (wh) 0,32 0,52 0,27 0,36

Platos teóricos (N) 5.125 7.496 77.829 88.456

Resolución (Rs) 1,4 2,3 1,4 9,2

Tabla 29: Parámetros cromatográficos obtenidos.

LINEALIDAD

En las tablas 30 y 31 se muestran, para las 3 rectas de cada una de

las 4 ocratoxinas, el área media (Amedia) obtenida de las tres réplicas

analizadas para cada nivel de concentración, el factor respuesta (f)

medio (n = 3), junto con el valor medio calculado para cada recta fM

(n = 15) y su coeficiente de variación (CVf).

La representación gráfica de las rectas de calibrado obtenidas para

cada ocratoxina se muestra en la figura 40 y los parámetros obtenidos

del estudio estadístico de la linealidad se muestran en la tabla 32.


- 115 -

OTB OTA

c (µg·L-1) Amedia f fM CVf (%) Amedia f fM CVf (%)

0,1 2,05 20,5

23,0 7,3

1,98 19,8

23,8 9,8

0,2 4,63 23,2 4,86 24,3

0,4 9,43 23,6 9,82 24,5

0,6 14,5 24,1 15,2 25,3

1 23,8 23,8 24,9 24,9

1 23,8 23,8

23,3 2,6

24,9 24,9

24,1 2,7

4 91,7 22,9 94,8 23,7

8 185 23,1 191 23,9

12 284 23,7 294 24,5

20 458 22,9 473 23,6

20 458 22,9

21,6 3,8

473 23,6

22,5 3,5

60 1266 21,1 1320 21,9

120 2600 21,7 2700 22,5

200 4360 21,8 4540 22,7

400 8260 20,6 8620 21,5

Tabla 30: Áreas y factores respuesta obtenidas para OTB y OTA en el estudio de linealidad.

MeOTA OTC

c (µg·L-1) Amedia f fM CVf (%) Amedia f fM CVf (%)

0,1 2,27 22,7

25,3 5,9

2,19 21,9

24,6 6,4

0,2 5,13 25,6 5,10 25,5

0,4 10,4 26,0 10,1 25,2

0,6 15,8 26,3 15,4 25,7

1 25,8 25,8 24,9 24,9

1 25,8 25,8

25,1 2,6

24,9 24,9

24,4 2,6

4 98,6 24,7 96,2 24,0

8 199 24,8 194 24,2

12 306 25,5 298 24,8

20 493 24,6 480 24,0

20 493 24,6

23,3 3,8

480 24,0

22,8 3,6

60 1370 22,8 1340 22,3

120 2810 23,4 2740 22,9

200 4700 23,5 4600 23,0

400 8900 22,3 8730 21,8

Tabla 31: Áreas obtenidas y factores respuesta para MeOTA y OTC en el estudio de

linealidad.


- 116 -

Figura 40: Rectas de calibrado para cada una de las ocratoxinas

Ocratoxina C Metil-ocratoxina A Ocratoxina B Ocratoxina A

A=

24

,16

2C

-0

,23

3R

² =

0,9

99

7

05

10

15

20

25

30

00

,20

,40

,60

,81

1,2

ÁreaC

on

cen

trac

ión

ocr

ato

xin

a B

(µ

g/L)

Rec

ta 0

,1 -

1 µ

g/L

OTB

A=

22

,97

9C

+ 1

,66

4R

² =

0,9

99

5

0

50

10

0

15

0

20

0

25

0

30

0

35

0

40

0

45

0

50

0

05

10

15

20

25

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

B (

µg/

L)

Rec

ta 1

-20

µg/

L O

TB

A=

20

,58

6C

+ 9

2,8

27

R²

= 0

,99

91

0

10

00

20

00

30

00

40

00

50

00

60

00

70

00

80

00

90

00

05

01

00

15

02

00

25

03

00

35

04

00

45

0

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

B (

µg/

L)

Rec

ta 2

0 -4

00 µ

g/L

OTB

A=

25

,43

2C

-0

,34

8R

² =

0,9

99

6

05

10

15

20

25

30

00

,20

,40

,60

,81

1,2

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

A (

µg/

L)

Rec

ta 0

,1 -

1 µ

g/L

OTA

A=

23

,71

8C

+ 1

,99

4R

² =

0,9

99

4

0

10

0

20

0

30

0

40

0

50

0

60

0

05

10

15

20

25

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

A (

µg/

L)

Rec

ta 1

-20

µg/

L O

TA

A=

21

,50

7C

+ 8

9,1

17

R²

= 0

,99

92

0

10

00

20

00

30

00

40

00

50

00

60

00

70

00

80

00

90

00

10

00

0

05

01

00

15

02

00

25

03

00

35

04

00

45

0

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

A (

µg/

L)

Rec

ta 2

0 -4

00 µ

g/L

OTA

A =

26

,13

5C

-0

,14

0R

² =

0,9

99

6

05

10

15

20

25

30

00

,20

,40

,60

,81

1,2

Área

Co

nce

ntr

ació

n m

eti

l-o

crat

oxi

na

A (

µg/

L)

Rec

ta 0

,1 -

1 µ

g/L

MeO

TA

A=

24

,72

3C

+ 1

,74

2R

² =

0,9

99

5

0

10

0

20

0

30

0

40

0

50

0

60

0

05

10

15

20

25

Área

Co

nce

ntr

ació

n m

eti

l-o

crat

oxi

na

A (

µg/

L)

Rec

ta 1

-20

µg/

L M

eOTA

A=

22

,19

5C

+ 1

02

,43

1R

² =

0,9

99

1

0

10

00

20

00

30

00

40

00

50

00

60

00

70

00

80

00

90

00

10

00

0

05

01

00

15

02

00

25

03

00

35

04

00

45

0

Área

Co

nce

ntr

ació

n m

eti

l-o

crat

oxi

na

A (

µg/

L)

Rec

ta 1

-20

µg/

L M

eO

TA

A=

25

,12

8C

-0

,02

9R

² =

0,9

99

1

05

10

15

20

25

30

00

,20

,40

,60

,81

1,2

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

C (

µg/

L)

Rec

ta 0

,1 -

1 µ

g/L

OTC

A=

24

,09

0C

+ 1

,71

0R

² =

0,9

99

5

0

10

0

20

0

30

0

40

0

50

0

60

0

05

10

15

20

25

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

C (

µg/

L)

Rec

ta 1

-20

µg/

L O

TC

A=

21

,77

6C

+ 9

3,1

58

R²

= 0

,99

92

0

10

00

20

00

30

00

40

00

50

00

60

00

70

00

80

00

90

00

10

00

0

05

01

00

15

02

00

25

03

00

35

04

00

45

0

Área

Co

nce

ntr

ació

n o

crat

oxi

na

C (

µg/

L)

Rec

ta 2

0 -

400

µg/

L O

TC


- 117 -

OTB OTA

Intervalo (µg·L-1)

0,1-1 1-20 20-400 0,1-1 1-20 20-400

r 0,9998 0,9997 0,9996 0,9998 0,9997 0,9996

r2 0,9997 0,9995 0,9991 0,9996 0,9994 0,9992

Pendiente 24,2 23,0 20,6 25,4 23,7 21,5

IC* 95% pendiente

(23,4; 24,9) (22,0; 23,9) (19,5; 21,7) (24,5; 26,4) (22,7; 24,8) (20,4; 22,6)

Ordenada -0,233 1,66 92,8 -0,348 1,99 89,1

IC 95% ordenada

(-0,649; 0,184)

(-9,13; 12,4) (-140; 326) (-0,885; 0,189)

(-9,74; 13,7) (-147; 325)

MeOTA OTC

Intervalo (µg·L-1)

0,1-1 1-20 20-400 0,1-1 1-20 20-400

r 0,9998 0,9997 0,9995 0,9996 0,9998 0,9996

r2 0,9996 0,9995 0,9991 0,9991 0,9995 0,9992

Pendiente 26,1 24,7 22,2 25,1 24,1 21,8

IC* 95% pendiente

(25,1; 27,1) (23,7; 25,7) (21,0; 23,4) (23,8; 26,5) (23,1; 25,1) (20,6; 22,9)

Ordenada -0,140 1,74 102 -0,029 1,71 93,2

IC 95% ordenada

(-0,696; 0,416)

(-9,65; 13,1) (-156; 361) (-0,785; 0,726)

(-9,27; 12,7) (-149; 336)

Tabla 32: Parámetros de linealidad para cada ocratoxina en cada intervalo estudiado. *IC: intervalo de confianza.

Además de estos parámetros, se ha realizado el análisis de la

varianza (ANOVA) para cada recta, comprobando que se cumplen los

supuestos de homogeneidad de varianzas (a través del Test de Cochran)

y la normalidad de los residuales. En las siguientes tablas se muestran

los valores de los factores respuesta obtenidos para cada concentración,

la varianza (s2) de éstos y el estadístico G calculado. También, se dan el

estadístico K2 de la prueba de normalidad de D’Agostino Pearson de los

residuales, con su correspondiente significación, y la F del ANOVA con su

probabilidad. La representación gráfica de los residuales frente a la

concentración de cada ocratoxina se muestra en la figura 41.


- 118 -

OTB

C (µg·L-1) Factores respuesta s2 G exp K2 F

0,1 19,5 19,7 22,4 2,69

0,37 4,831

(p=0,089) 5.367,28 (p<0,001)

0,2 24,0 21,5 24,0 2,08

0,4 21,9 24,4 24,4 2,03

0,6 24,2 24,0 24,3 0,02

1 24,0 24,4 23,0 0,52

1 24,0 24,4 23,0 0,52

0,44 1,717

(p=0,424) 11.716,87 (p<0,001)

4 23,1 23,1 22,7 0,06

8 22,2 23,4 23,7 0,66

12 23,8 23,2 24,1 0,21

20 23,1 22,6 23,0 0,07

20 23,1 22,6 23,0 0,07

0,36 0,325

(p=0,850) 10.801,13 (p<0,001)

60 20,8 20,9 21,6 0,18

120 21,8 22,0 21,2 0,14

200 21,9 21,6 21,8 0,02

400 20,3 20,8 20,9 0,10

Tabla 33: Estudio estadístico de normalidad y homoscedasticidad de los residuales para la OTB. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.

OTA


0,1 21,1 16,9 21,6 6,74

0,86 1,127

(p=0,569) 9.374,13 (p<0,001)

0,2 24,6 23,7 24,6 0,28

0,4 24,0 24,8 24,8 0,19

0,6 24,5 25,7 25,6 0,41

1 25,0 25,4 24,4 0,22

1 25,0 25,4 24,4 0,22

0,53 1,713

(p=0,425) 12.109,52 (p<0,001)

4 24,0 23,6 23,5 0,09

8 23,0 24,3 24,4 0,60

12 24,5 24,1 24,9 0,16

20 23,9 23,3 23,7 0,07

20 23,9 23,3 23,7 0,07

0,33 0,355

(p=0,838) 11.204,76 (p<0,001)

60 21,7 21,7 22,4 0,17

120 22,7 22,8 22,0 0,18

200 22,9 22,6 22,7 0,02

400 21,2 21,7 21,8 0,11

Tabla 34: Estudio estadístico de normalidad y homoscedasticidad de los residuales para la OTA. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.


- 119 -

MeOTA


0,1 23,5 22,6 21,9 0,57

0,40 11,054

(p=0,004) 9.288,27 (p<0,001)

0,2 25,6 26,6 24,7 0,90

0,4 25,3 26,4 26,3 0,33

0,6 26,1 26,5 26,4 0,06

1 26,2 26,2 25,1 0,39

1 26,2 26,2 25,1 0,39

0,51 1,128

(p=0,569) 13.657,65 (p<0,001)

4 24,8 24,8 24,4 0,05

8 23,9 25,2 25,4 0,68

12 25,6 25,0 25,8 0,14

20 24,8 24,4 24,7 0,06

20 24,8 24,4 24,7 0,06

0,35 0,176

(p=0,916) 10.335,34 (p<0,001)

60 22,5 22,6 23,3 0,18

120 23,6 23,7 22,9 0,21

200 23,7 23,4 23,4 0,03

400 21,9 22,4 22,5 0,11

Tabla 35: Estudio estadístico de normalidad y homoscedasticidad de los residuales para la MeOTA. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.

OTC


0,1 21,4 22,9 21,4 0,70

0,28 7,712

(p=0,021) 4.692,87 (p<0,001)

0,2 26,1 25,8 24,7 0,52

0,4 24,4 26,1 25,2 0,70

0,6 25,4 25,9 25,7 0,07

1 25,0 25,7 23,9 0,76

1 25,0 25,7 23,9 0,76

0,42 1,632

(p=0,442) 13.319,80 (p<0,001)

4 24,4 24,2 23,7 0,13

8 23,3 24,5 24,9 0,67

12 24,9 24,3 25,2 0,19

20 24,1 23,8 24,1 0,05

20 24,1 23,8 24,1 0,05

0,34 0,258

(p=0,879) 11.486,26 (p<0,001)

60 22,0 22,0 22,8 0,19

120 23,0 23,2 22,4 0,19

200 23,2 22,9 22,9 0,03

400 21,5 21,9 22,1 0,09

Tabla 36: Estudio estadístico de normalidad y homoscedasticidad de los residuales para la OTC. Valor del estadístico F y significación del ANOVA.


- 120 -

Ocratoxina C Metil-ocratoxina A Ocratoxina A Ocratoxina B

-0,2

-0,10

0,1

0,2

0,3

00,

51

1,5

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TB (µ

g/L)

-50510

05

1015

2025

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TB (µ

g/L)

-1000

100

200

010

020

030

040

050

0

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TB (µ

g/L)

-0,3

-0,2

-0,10

0,1

0,2

0,3

00,

51

1,5

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TA (µ

g/L)

-50510

05

1015

2025

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TA (µ

g/L)

-1000

100

200

010

020

030

040

050

0

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TA (µ

g/L)

-0,4

-0,20

0,2

0,4

00,

51

1,5

Residuos

Conc

entr

ació

n M

eOTA

(µg/

L)-50510

05

1015

2025

Residuos

Conc

entr

ació

n M

eOTA

(µg/

L)-1

000

100

200

010

020

030

040

050

0

Residuos

Conc

entr

ació

n M

eOTA

(µg/

L)

-0,4

-0,20

0,2

0,4

00,

51

1,5

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TC (µ

g/L)

-50510

05

1015

2025

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TC (µ

g/L)

-1000

100

200

010

020

030

040

050

0

Residuos

Conc

entr

ació

n O

TC (µ

g/L)

Figura 41: Residuales correspondientes a las rectas de calibrado de cada ocratoxina.


- 121 -

Los resultados de repetibilidad y precisión intermedia de la

linealidad se detallan en la tabla 37. Se muestran las concentraciones

medias para cada concentración ensayada y el coeficiente de variación

(CV, %).

Repetibilidad (n=3) Precisión intermedia (n=9)

C (µg·L-1)

C media

(µg·L-1) CV (%)

C media

(µg·L-1) CV (%)

OTB

0,1 0,095 7,18 0,091 8,61

0,4 0,400 5,92 0,393 4,14

1 0,995 2,99 1,01 3,25

8 7,97 3,55 7,82 2,93

20 19,8 1,17 19,8 1,63

120 122 1,81 122 2,21

400 396 1,54 398 2,04

OTA

0,1 0,092 11,1 0,092 9,83

0,4 0,400 1,74 0,392 3,92

1 0,994 1,87 1,01 2,99

8 7,96 3,28 7,81 2,76

20 19,8 1,14 19,8 1,54

120 122 1,97 121 2,14

400 397 1,54 397 1,99

MeOTA

0,1 0,092 3,06 0,091 3,26

0,4 0,403 2,23 0,395 2,42

1 0,993 2,42 1,01 2,39

8 7,96 3,34 7,80 2,75

20 19,9 1,02 19,8 1,65

120 122 2,02 121 2,29

400 396 1,52 396 2,12

OTC

0,1 0,088 3,84 0,087 4,84

0,4 0,403 3,34 0,395 3,57

1 0,991 3,51 1,02 3,00

8 7,98 3,41 7,82 2,78

20 19,8 0,94 19,8 1,64

120 122 1,96 121 1,76

400 396 1,37 397 2,11

Tabla 37: Resultados de repetibilidad y precisión intermedia de la linealidad para cada ocratoxina.


- 122 -

Los resultados de exactitud de la linealidad se detallan en la

tabla 38. Se muestran las concentraciones medias para cada

concentración ensayada y el error relativo (ER, %).

Exactitud 1 día (n=3) Exactitud 3 días (n=9)

C (µg·L-1)

C media (µg·L-1)

ER (%) C media (µg·L-1)

ER (%)

OTB

0,1 0,095 5,36 0,091 8,48

0,4 0,400 0,10 0,393 1,86

1 0,995 0,57 1,01 1,32

8 7,97 0,37 7,82 2,28

20 19,8 0,73 19,8 1,08

120 122 1,42 122 1,73

400 396 0,86 398 0,44

OTA

0,1 0,092 8,31 0,092 6,55

0,4 0,400 0,35 0,392 2,11

1 0,994 0,33 1,01 0,96

8 7,96 0,49 7,81 2,34

20 19,8 0,75 19,8 1,02

120 122 1,31 121 0,99

400 397 0,84 397 0,82

MeOTA

0,1 0,092 7,87 0,091 9,15

0,4 0,403 0,75 0,395 1,37

1 0,993 0,67 1,01 1,07

8 7,96 0,51 7,80 2,49

20 19,9 0,69 19,8 1,22

120 122 1,53 121 1,00

400 396 0,89 396 0,87

OTC

0,1 0,088 11,8 0,087 12,5

0,4 0,403 0,66 0,395 1,25

1 0,991 0,91 1,02 1,64

8 7,98 0,30 7,82 2,25

20 19,8 0,71 19,8 1,07

120 122 1,41 121 1,72

400 396 0,85 397 0,74

Tabla 38: Resultados de exactitud de la linealidad para cada ocratoxina.

Tras obtener estos resultados se ha considerado que el método es

lineal para cada ocratoxina en los intervalos de concentración

ensayados.


- 123 -

RECUPERACIÓN

Los estudios de exactitud (expresada como recuperación) y de

precisión (repetibilidad y precisión intermedia) del método analítico se

han calculado a partir de la fortificación, extracción y análisis de

muestras de vino como se indica en el capítulo de material y métodos y

se muestran en las siguientes tablas.

- Ocratoxina B

Repetibilidad OTB C (µg·L-1) Rec (%) Media (n=3) CV (n=3) Global (n=15) CV (n=15)

0,0005

67,8

71,7 7,7%

87,0 13%

69,3

78,1

0,003

104

101 14% 112

85,2

0,04

82,7

83,4 6,4% 89,0

78,4

0,6

91,4

93,5 2,0% 94,2

94,9

2

80,0

85,7 5,8% 88,1

89,1

Tabla 39: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la OTB.

Tabla 40: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la OTB.

Precisión intermedia OTB

C (µg·L-1) Recuperación (%) Media

(n=9)

CV

(n=9)

Global

(n=45)

CV

(n=45) día 1 día 2 día 3

0,0005

67,8 61,8 70,4

63,8 13%

81,7 16%

69,3 53,3 54,5

78,1 66,4 52,8

0,003

104 51,3 75,5

83,9 20% 112 71,5 87,0

85,2 83,8 84,4

0,04

82,7 85,0 82,1

84,9 4,2% 89,0 88,0 82,0

78,4 86,8 89,6

0,6

91,4 84,8 95,5

92,7 3,3% 94,2 94,5 91,4

94,9 93,5 94,0

2

80,0 66,4 85,6

83,1 8,4% 88,1 87,5 83,2

89,1 78,5 89,9


- 124 -

- Ocratoxina A

Repetibilidad OTA

C (µg·L-1) Rec (%) Media (n=3)

CV (n=3) Global (n=15) CV

(n=15)

0,0005

97,6

93,3 4,7%

91,1 4,8%

93,7

88,8

0,003

93,4

92,9 2,3% 94,8

90,6

0,04

88,6

89,6 5,3% 94,8

85,4

0,6

90,9

93,8 2,7% 95,2

95,2

2

80,3

85,7 5,5% 88,7

88,2

Tabla 41: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la OTA.

Tabla 42: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la OTA

Precisión intermedia OTA

C (µg·L-1) Rec (%) Media

(n=9) CV

(n=9) Global (n=45)

CV (n=45) día 1 día 2 día 3

0,0005

97,6 120 93,5

104 11%

93,5 10%

93,7 111 112

88,8 95,8 120

0,003

93,4 97,1 98,3

95,7 8,3% 94,8 113 98,8

90,6 95,6 80,4

0,04

88,6 91,1 87,9

90,8 3,7% 94,8 94,0 89,0

85,4 90,7 96,1

0,6

90,9 87,2 94,3

93,8 3,1% 95,2 94,5 96,5

95,2 93,2 97,1

2

80,3 67,0 84,1

83,7 8,3% 88,7 86,5 88,4

88,2 78,9 90,7


- 125 -

- Metilocratoxina A

Repetibilidad MeOTA

C (µg·L-1) Rec (%) Media (n=3)

CV (n=3) Global (n=15) CV

(n=15)

0,0005

83,2

80,0 9,5%

76,7 8,6%

71,4

85,5

0,003

78,2

76,6 2,1% 76,6

74,9

0,04

77,0

77,2 5,2% 81,4

73,4

0,6

78,9

82,7 4,2% 85,7

83,6

2

63,2

66,7 5,1% 70,0

66,7

Tabla 43: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la MeOTA.

Precisión intermedia MeOTA

C (µg·L-1) Rec (%) Media (s)

(n=9) CV

(n=9) Global (n=45)


0,0005

83,2 89,7 81,1

80,7 19%

76,0 13%

71,4 89,5 109

85,5 56,2 60,2

0,003

78,2 74,1 74,2

75,6 5,6% 76,6 83,3 77,4

74,9 75,6 66,4

0,04

77,0 77,8 71,9

76,3 4,5% 81,4 78,9 72,6

73,4 73,0 80,9

0,6

78,9 76,4 82,7

82,4 3,9% 85,7 83,7 86,4

83,6 79,4 84,7

2

63,2 54,4 57,8

64,8 8,7% 70,0 62,3 73,4

66,7 68,4 66,9

Tabla 44: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la

MeOTA.


- 126 -

- Ocratoxina C

Repetibilidad OTC


(n=3) CV (n=3) Global (n=15)

CV (n=15)

0,0005

63,3

65,7 19%

74,2 11%

79,0

54,7

0,003

81,0

77,3 4,7% 77,0

73,7

0,04

78,3

78,0 3,5% 80,4

75,1

0,6

79,1

83,2 4,5% 86,3

84,0

2

63,8

67,0 4,8% 70,2

67,1

Tabla 45: Estudio de recuperación y repetibilidad del método analítico para la OTC.

Precisión intermedia OTC


(n=9) CV

(n=9) Global (n=45)


0,0005

63,3 52,5 83,6

65,0 19%

73,4 13%

79,0 51,4 63,7

54,7 55,6 81,0

0,003

81,0 80,3 76,8

77,1 6,4% 77,0 85,0 76,6

73,7 77,8 66,1

0,04

78,3 78,5 73,5

77,3 4,0% 80,4 79,8 74,5

75,1 73,4 82,1

0,6

79,1 77,7 82,4

82,7 3,8% 86,3 83,9 86,4

84,0 79,1 85,5

2

63,8 54,8 57,1

64,9 8,9% 70,2 62,3 73,8

67,1 68,8 66,6

Tabla 46: Estudio de recuperación y precisión intermedia del método analítico para la OTC


- 127 -

En el posterior análisis de las muestras se ha empleado la

recuperación obtenida en condiciones de precisión intermedia como

factor de corrección de los resultados analíticos. Los valores empleados


OTB OTA MeOTA OTC

Recuperación (%) 81,7 93,5 76,0 73,4

Tabla 47: Recuperación en condiciones de precisión intermedia para cada ocratoxina.


Como se indica en el apartado de material y métodos, para la

obtención de los límites de detección y cuantificación, se han fortificado

alícuotas de vino a tres concentraciones cercanas a los límites

presumibles.

Las concentraciones obtenidas para cada ocratoxina, para cada

nivel de concentración ensayado, así como su valor medio, CV y

recuperación se muestran en la tabla 48.

C (ng·L-1) C medida (ng·L-1)

C media (ng·L-1)

CV (%) Recuperación

(%)

OTB

0,3 0,092 0,121 0,227 0,147 48,5 48,9

0,4 0,433 0,166 0,262 0,287 47,2 71,8

0,5 0,379 0,388 0,437 0,401 7,73 80,3

OTA

0,3 0,108 0,078 0,116 0,100 19,7 33,5

0,4 0,336 0,268 0,347 0,317 13,6 79,3

0,5 0,538 0,513 0,481 0,511 5,53 102,1

MeOTA

0,3 0,297 0,284 0,162 0,248 30,0 82,5

0,4 0,291 0,242 0,273 0,269 9,32 67,2

0,5 0,416 0,357 0,428 0,400 9,47 80,0

OTC

0,3 0,100 0,089 0,008 0,066 76,7 21,9

0,4 0,258 0,325 0,251 0,278 14,7 69,4

0,5 0,317 0,395 0,273 0,328 18,8 65,7

Tabla 48: Concentraciones, CV (%) y recuperación obtenidas en el estudio del LD y LC.


- 128 -

La concentración más baja para la que se obtiene, para todas las

micotoxinas, adecuados valores de recuperación (entre 50-120%) y

coeficiente variación (< del 20%) es 0,5 ng·L-1; por esta razón, se ha

fijado este nivel como límite de cuantificación para todas ellas.

En el cálculo del límite de detección, se ha representado señal

(recta 1) y desviación estándar (recta 2) frente a concentración. Con

estos datos, y la ecuación descrita en el apartado material y métodos,

se han obtenido los valores que se indican en la tabla 49 para cada

micotoxina.

Recta 1 Recta 2 LD (ng·L-1)

OTB A=5,2297C - 0,9482 s=-0,8245C + 0,6552 0,32

OTA A=8,1365C - 2,0270 s=0,1669C + 0,0538 0,16

MeOTA A=3,4610C + 0,0014 s=-0,8251C + 0,5375 0,27

OTC A=5,7508C - 1,3204 s=0,2502C + 0,1230 0,17

Tabla 49: Rectas obtenidas para el cálculo del LD y valor obtenido.

ROBUSTEZ

Para el estudio de la robustez se han valorado los factores pH del

vino y volumen de inyección. Los resultados obtenidos se muestran a

continuación.

- pH ajustado del vino

Se ha estudiado el efecto del pH adecuado del vino antes de su

paso por las columnas de inmunoafinidad. El pH al que se ajustan las

muestras de vino en el método desarrollado ha sido de 7,2. Se ha

estudiado la influencia del pH en la recuperación para los valores 6,8 y

7,6. Las áreas obtenidas para un vino fortificado a 0,05 µg·L-1, restando

las áreas del blanco, se compararon con las áreas de una disolución de

calibración de 10 µg·L-1. Los resultados se muestran en la tabla 50.


- 129 -

OTB OTA MeOTA OTC

A Amedia Rec A Amedia Rec A Amedia Rec A Amedia Rec

pH=6,8 208

216 92,7 211

221 92,4 190

198 79,9 179

189 78,1 224 230 207 199

pH=7,2 197

205 88,0 212

221 92,4 203

204 82,0 197

197 81,5 214 229 204 198

pH=7,6 190

202 86,5 209

223 93,4 191

201 80,7 187

198 81,6 257 237 210 208

10 µg·L-1 233 239 249 242

Media 89,1 92,7 80,9 80,4

CV (%) 3,62 0,63 1,34 2,48

Tabla 50: Áreas, áreas medias y recuperación (Rec, %) obtenidas a partir del análisis de vino fortificado a pH 6,8, 7,2 y 7,6.

El método es robusto a los cambios de pH, como se deduce de los

bajos coeficientes de variación obtenidos para la recuperación para cada

ocratoxina.

- Volumen de inyección.

El volumen de inyección del método analítico desarrollado es de

100 µL. Se ha comprobado la influencia en la exactitud de inyectar un

volumen muy diferente, 20 µL. Se ha realizado la experiencia a tres

niveles de concentración y 9 análisis por cada ocratoxina. En la tabla 51

se muestran las concentraciones calculadas multiplicando por cinco la

concentración obtenida con 20 µL y la exactitud de la media con

respecto a la concentración ensayada.

Los errores relativos obtenidos, todos inferiores al 5%, indican que

el método es robusto al cambio de volumen de inyección, siempre que

se tenga en cuenta la dilución al calcular la concentración.


- 130 -

OTB

(µg·L-1) OTA

(µg·L-1) MeOTA (µg·L-1)

OTC (µg·L-1)

4 µg·L-1

4,04 3,80 4,01 3,92

4,05 3,91 4,03 4,01

4,13 4,01 4,00 3,89

4,03 3,80 3,92 3,79

3,91 3,91 3,97 3,80

4,09 4,10 3,95 3,88

4,04 3,84 4,02 3,81

3,99 3,84 3,96 3,86

4,03 3,87 4,04 3,89

Media 4,04 3,90 3,99 3,87

ER (%) 0,89 -2,57 -0,26 -3,19

40 µg·L-1

39,8 39,1 39,4 39,1

39,7 39,1 39,2 39,1

39,1 38,4 38,7 38,4

40,6 39,9 39,9 39,8

40,3 39,7 39,8 39,6

40,5 39,6 39,8 39,5

41,1 40,2 40,3 40,3

41,0 40,0 40,3 40,0

40,1 39,5 39,5 39,4

Media 40,2 39,5 39,7 39,5

ER (%) 0,58 -1,23 -0,85 -1,38

400 µg·L-1

396 386 387 387

396 386 386 386

393 383 383 383

385 377 376 376

383 375 375 374

378 370 369 369

405 397 397 397

397 388 388 388

397 388 389 388

Media 392 383 383 383

ER (%) -1,99 -4,18 -4,19 -4,27

Tabla 51: Resultados del estudio de robustez frente a cambios en el volumen de

inyección.


- 131 -

ESTABILIDAD

- Estabilidad de disoluciones de patrones en congelación

En la tabla 52 se muestran las concentraciones obtenidas (n = 3) a

tiempo cero, uno, tres, seis y doce meses (µg·L-1) y el error relativo de

la concentración media con respecto a la concentración inicial.

OTB OTA MeOTA OTC

C (μg·L-1)

t (mes)

C media

ER (%)

C media

ER (%)

C media

ER (%)

C media

ER (%)

4

0 3,85 0,00 3,86 0,00 3,89 0,00 3,84 0,00

1 3,88 -0,78 3,85 0,26 3,86 0,77 3,85 -0,33

3 3,86 -0,26 3,86 0,00 3,88 0,20 3,84 0,06

6 3,99 -3,64 3,91 -1,30 3,97 -1,93 3,86 -0,54

12 4,04 -4,94 4,05 -4,92 4,05 -4,03 4,03 -4,95

40

0 38,8 0,00 38,8 0,00 38,6 0,00 38,6 0,00

1 38,8 -0,18 38,5 0,73 38,4 0,47 38,4 0,55

3 38,8 -0,08 38,6 0,54 38,6 0,13 38,5 0,20

6 39,2 -1,19 38,4 1,06 38,4 0,46 38,2 0,98

12 39,1 -0,85 39,2 -0,96 39,2 -1,41 39,4 -1,91

400

0 394 0,00 393 0,00 392 0,00 392 0,00

1 393 0,25 390 0,71 389 0,75 389 0,77

3 395 -0,16 392 0,13 392 -0,17 392 -0,06

6 394 0,02 385 1,91 385 1,58 385 1,84

12 405 -2,76 402 -2,34 407 -3,84 408 1,88

Tabla 52: Concentraciones medias (µg·L-1) y ER (%) a t=0, 1, 3, 6 y 12 meses de las disoluciones de patrones de 4, 40 y 400 µg·L-1 a -20ºC.

El error relativo se mantiene en todos los casos dentro del ±5% de

la concentración a tiempo 0, por lo que las disoluciones en metanol

pueden considerarse estables almacenadas a -20ºC.

- Estabilidad de las ocratoxinas en vial y en el inyector del HPLC

Se han inyectado durante 48 h disoluciones de patrones y muestras

de vino fortificado, a distintos tiempos, y a dos concentraciones

diferentes. En las tablas 53-56 se muestran las concentraciones (μg·L-1)

obtenidas, así cómo su exactitud con respecto al valor inicial. En verde


- 132 -

se han indicado los valores de exactitud superiores al 5% y en rojo los

superiores al 10%.

OTB

Patrón Vino

t (h) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%)

0 7,75 0,00 96,4 0,00 7,11 0,00 51,6 0,00

3 7,75 0,03 97,2 0,78 7,16 0,81 51,7 0,37

8,5 7,99 3,19 98,6 2,28 7,19 1,15 52,0 0,79

14 7,99 3,15 99,9 3,63 7,28 2,40 51,8 0,41

18,5 7,97 2,91 100 4,00 7,31 2,88 52,0 0,79

21,5 8,06 4,11 100 3,74 7,30 2,67 52,0 0,88

24,5 8,11 4,71 102 5,33 7,29 2,59 52,1 1,02

27,5 8,06 4,04 103 6,66 7,39 4,01 52,2 1,19

30,5 8,13 4,92 103 7,27 7,41 4,29 52,4 1,56

33,5 8,15 5,23 105 8,65 7,42 4,36 52,5 1,81

36,5 8,28 6,85 105 9,05 7,54 6,07 52,7 2,13

39,5 8,31 7,34 106 10,8 7,50 5,48 52,6 2,05

42,5 8,33 7,48 108 11,6 7,53 5,99 52,9 2,53

45,5 8,42 8,72 109 13,5 7,39 4,05 53,0 2,82

48,5 8,44 9,02 111 15,4 7,49 5,41 - -

Tabla 53: Concentraciones de OTB (µg·L-1) y ER (%) a distintos tiempos en el inyector del

HPLC.

OTA

Patrón Vino

t (h) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%)

0 7,61 0,00 97,1 0,00 8,49 0,00 60,8 0,00

3 7,69 1,08 97,3 0,30 8,72 2,66 61,1 0,50

8,5 7,83 2,83 98,9 1,88 8,73 2,81 61,2 0,60

14 8,00 5,16 100 3,22 8,72 2,65 61,2 0,59

18,5 7,91 3,96 101 3,71 8,84 4,10 61,3 0,79

21,5 7,89 3,63 101 4,23 8,77 3,26 61,6 1,28

24,5 8,02 5,35 102 5,09 8,83 4,03 61,8 1,53

27,5 8,04 5,64 103 6,11 8,97 5,59 61,9 1,70

30,5 8,08 6,19 104 7,32 8,99 5,85 61,9 1,76

33,5 8,14 6,97 105 8,31 8,98 5,77 62,1 2,07

36,5 8,15 7,12 106 9,07 9,00 5,93 62,2 2,32

39,5 8,34 9,59 107 10,7 9,06 6,67 62,5 2,74

42,5 8,27 8,62 109 11,8 9,07 6,83 62,7 3,14

45,5 8,36 9,83 110 13,4 9,06 6,67 62,7 3,12

48,5 8,22 8,04 111 14,7 9,05 6,56 - -

Tabla 54: Concentraciones de OTA (µg·L-1) y ER (%) a distintos tiempos en el inyector del

HPLC.


- 133 -

MeOTA

Patrón Vino

t (h) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%)

0 7,74 0,00 96,2 0,00 5,77 0,00 53,0 0,00

3 7,76 0,15 96,6 0,42 5,87 1,73 53,0 0,05

8,5 8,00 3,32 98,0 1,83 5,90 2,21 53,2 0,53

14 7,98 3,09 99,3 3,17 5,83 0,99 53,1 0,27

18,5 8,00 3,34 99,3 3,24 5,94 2,87 53,2 0,50

21,5 7,95 2,65 99,9 3,78 5,98 3,61 53,4 0,83

24,5 8,02 3,61 101 4,76 6,03 4,40 53,6 1,12

27,5 8,05 3,92 102 5,96 6,04 4,56 53,7 1,32

30,5 8,08 4,36 103 7,08 6,03 4,54 53,9 1,69

33,5 8,22 6,13 104 7,93 6,10 5,62 53,9 1,68

36,5 8,18 5,68 105 8,74 6,05 4,87 53,9 1,79

39,5 8,28 6,91 106 9,87 6,16 6,75 53,9 1,83

42,5 8,34 7,69 107 11,3 6,15 6,54 54,2 2,39

45,5 8,48 9,50 109 13,0 6,07 5,07 54,2 2,36

48,5 8,47 9,36 110 14,5 6,14 6,40 - -

Tabla 55: Concentraciones de MeOTA (µg·L-1) y ER (%) a distintos tiempos en el inyector del HPLC.

OTC

Patrón Vino

t (h) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%) C

(µg·L-1) ER (%)

C (µg·L-1)

ER (%)

0 7,74 0,00 97,1 0,00 5,96 0,00 55,6 0,00

3 7,87 1,63 97,7 0,66 6,00 0,82 55,8 0,33

8,5 8,04 3,79 98,9 1,89 6,10 2,35 55,9 0,52

14 7,95 2,68 100 3,36 6,10 2,49 55,9 0,54

18,5 7,88 1,81 101 3,47 6,08 2,02 55,9 0,52

21,5 7,96 2,79 101 4,19 6,07 1,94 56,1 0,81

24,5 8,06 4,07 102 5,42 6,19 3,95 56,3 1,10

27,5 8,08 4,33 103 6,01 6,11 2,65 56,4 1,30

30,5 8,01 3,39 104 7,36 6,17 3,64 56,6 1,64

33,5 8,15 5,25 105 8,53 6,10 2,48 56,5 1,55

36,5 8,14 5,08 106 8,92 6,19 3,89 56,7 1,98

39,5 8,26 6,63 107 10,2 6,27 5,23 56,7 1,98

42,5 8,26 6,73 108 11,1 6,24 4,87 57,0 2,43

45,5 8,44 8,29 110 13,1 6,24 4,79 57,1 2,55

48,5 8,44 8,29 111 14,8 6,18 3,83 - -

Tabla 56: Concentraciones de OTC (µg·L-1) y ER (%) a distint0s tiempos en el inyector del HPLC.


- 134 -

Aunque la estabilidad varía para cada ocratoxina, se ha considerado

que una disolución de todas ellas sería estable (ER < 5%) durante

21,5 h, disueltas en fase móvil (42:58 ACN:H2O (0,4% ácido fórmico)) a

temperatura ambiente en el inyector del HPLC. En el caso del vino, en

general, las ocratoxinas parecen más estables, aunque se ha

considerado que una muestra de vino que contuviera todas ellas sería

estable 24,5 h. De todas formas, durante el estudio ninguna muestra (ni

de patrón ni de vino) ha permanecido en el inyector del equipo más de

8 h.


Durante el análisis de las muestras del presente trabajo las

disoluciones de patrones analizadas a la vez que las muestras han

presentado valores de exactitud adecuada, por debajo del límite

establecido para aceptación de los mismos. Representando la exactitud,

como error relativo, de los diferentes patrones cada día frente al tiempo,

se observa cómo, en todos los casos, son inferiores a ±10%.

-10

-5

0

5

10

0 5 10 15 20 25

Exactitud (ER %) OTB

Figura 41: Exactitud de la OTB en los patrones analizados junto con las muestras.


- 135 -

-10

-5

0

5

10

0 5 10 15 20 25

Exactitud (ER %) OTA

Figura 42 Exactitud de la OTA en los patrones analizados junto con las muestras.

-10

-5

0

5

10

0 5 10 15 20 25

Exactitud (ER %) MeOTA

Figura 43: Exactitud de la MeOTA en los patrones analizados junto con las muestras.


- 136 -

-10

-5

0

5

10

0 5 10 15 20 25

Exactitud (ER %) OTC

Figura 44: Exactitud de la OTC en los patrones analizados junto con las muestras.

Estos resultados indican que el método cromatográfico se ha

comportado adecuadamente a lo largo del análisis de las muestras.

RESULTADOS: Transformación de OTC en OTA

- 137 -

3. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA

Zimmerli y Dick propusieron que la presencia de ocratoxina C en el

vino podía deberse a que es producida por los mismos hongos que la

ocratoxina A, o que ésta podía sufrir una esterificación, al ser el vino un

medio ácido y con contenido alcohólico (Zimmerli y Dick, 1996).

Conociendo que la OTA es estable en vino durante al menos un año

(López de Cerain y col., 2002), se decidió estudiar el comportamiento de

la OTC en esta matriz.

Se fortificaron 500 mL de 5 vinos a 0,5 µg·L-1 y otros 5 a 2 µg·L-1.

Los 10 vinos se analizaron a tiempo cero, una semana, dos semanas, un

mes, dos meses y un año, almacenados a temperatura ambiente. Los

resultados de concentración de OTC y OTA en el tiempo se muestran en

las tablas 57 y 58 y en las figuras 45 y 46.

Debido a la ausencia de normalidad, detectada con la prueba

d’Agostino Pearson (p < 0,05), las concentraciones se compararon con

el test no paramétrico de Friedman para k muestras relacionadas. Tanto

la concentración de OTC como la de OTA, presentan diferencias

altamente significativas (p< 0,001).

El test a posteriori de comparaciones múltiples de Bonferroni reveló

que la concentración de OTC a la semana 8 difiere significativamente de

la concentración inicial (p=0,035 cuando OTC inicial 0,5 µg·L-1,

p=0,0004 cuando OTC inicial 2 µg·L-1). Para la OTA esta diferencia se

aprecia a las 4 semanas (p=0,016 cuando OTC inicial 0,5 µg·L-1,

p=0,0075 cuando OTC inicial 2 µg·L-1).


- 138 -

Tabla 57: Concentraciones en el tiempo de OTC y OTA (µg·L-1) en los cinco vinos

fortificados inicialmente con 0,5 µg·L-1 de OTC.

Figura 45: Representación gráfica de las concentraciones medias de OTC y OTA frente al

tiempo para los 5 vinos fortificados inicialmente con 0,5 µg·L-1 de OTC. *Diferencia estadísticamente significativa con respecto a la concentración inicial.

OTC inicial 0,5 µg·L-1

Vino t=0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año

C OTC (µg·L-1)

A 0,47 0,44 0,47 0,43 0,39 0,19

B 0,48 0,43 0,41 0,38 0,30 0,04

C 0,53 0,49 0,53 0,52 0,50 0,22

D 0,43 0,42 0,40 0,42 0,39 0,27

E 0,41 0,45 0,49 0,43 0,42 0,18

Media 0,46 0,45 0,46 0,44 0,40 0,18

C OTA (µg·L-1)

A 0,01 0,01 0,02 0,03 0,04 0,09

B 0,04 0,06 0,07 0,10 0,13 0,12

C 0,02 0,02 0,02 0,03 0,03 0,05

D 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,04

E 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,05

Media 0,02 0,02 0,03 0,04 0,05 0,07

0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año

*

*


- 139 -

OTC inicial 2 µg·L.1

Vino t=0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año

C OTC (µg·L-1)

F 2,29 2,01 2,16 1,85 1,41 0,60

G 1,98 1,91 1,62 1,49 0,90 0,34

H 2,24 2,01 1,92 1,74 1,53 0,33

I 2,08 2,13 2,11 2,11 1,92 0,63

J 1,63 1,59 1,73 1,55 1,42 0,40

Media 2,04 1,93 1,91 1,75 1,44 0,46

OTA (µg·L-1)

F 0,01 0,04 0,07 0,10 0,15 0,27

G 0,02 0,08 0,12 0,22 0,25 0,81

H 0,02 0,11 0,17 0,33 0,55 1,07

I 0,01 0,02 0,03 0,04 0,06 0,11

J 0,02 0,02 0,04 0,05 0,07 0,15

Media 0,01 0,05 0,08 0,15 0,22 0,48

Tabla 58: Concentraciones en el tiempo de OTC y OTA (µg·L-1) en los cinco vinos

fortificados inicialmente con 2 µg·L-1 de OTC.

Figura 46: Representación gráfica de las concentraciones medias de OTC y OTA frente al

tiempo para los 5 vinos fortificados inicialmente con 2 µg·L-1 de OTC. *Diferencia estadísticamente significativa con respecto a la concentración inicial.

0 1 sem 2 sem 4 sem 8 sem 1 año

*

*

RESULTADOS: Presencia de ocratoxinas en vinos navarros

- 141 -

4. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS

NAVARROS

VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL

En la tabla siguiente se muestran las concentraciones obtenidas en

el análisis de 35 vinos tintos de agricultura tradicional de Navarra,

utilizando el método validado para la OTB, OTA, MeOTA y OTC, y las

aproximaciones realizadas para MeOTB y EtOTB.

Concentración (ng·L-1)

Código OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB

1J 70,0 94,9 0,32* 4,47 2,10 2,42 Año cosecha

sin especificar

2J 11,4 26,7 1,28 1,10 1,46 0,31*

3J 10,6 5,44 0,95 0,38* 1,10 < LD

2Jb 20,1 33,8 < LD 2,41 0,92 0,20*

Joven

Cosecha 2006

4J 4,10 1,35 < LD 0,19* 0,79 < LD

5J 13,5 0,49* 0,37* < LD 1,00 < LD

11J 7,17 6,56 < LD 0,38* 2,81 < LD

12J 4,37 3,35 < LD 0,26* 2,14 < LD

13J 19,5 44,8 < LD 3,69 1,08 0,57

14J 8,00 19,0 < LD 2,71 1,07 0,20*

6J 12,8 15,2 < LD 0,82 1,33 < LD

Joven Cosecha

2007

7J 7,15 6,02 0,36* 2,84 0,81 < LD

8J 10,8 15,9 0,55 0,68 1,74 < LD

9J 22,8 3,58 0,78 < LD 1,32 < LD

10J 4,92 3,81 0,33* < LD 0,54 < LD

15J 15,2 6,72 0,65 0,58 2,84 < LD

16J 3,89 3,31 0,32* 2,84 1,45 < LD

17J 7,14 5,30 0,30* 0,39* 8,98 0,63

18J 10,1 10,8 < LD 1,15 5,34 0,25*

19J 7,22 13,5 < LD 1,35 3,49 0,24*

20J 11,5 3,83 < LD < LD 1,78 < LD

21J 10,1 14,6 < LD 1,74 1,57 < LD

22J 3,21 5,20 < LD < LD 1,18 0,18*

23J 5,29 3,22 0,34* < LD 3,80 < LD

24J 6,02 12,2 0,34* 1,17 1,82 < LD

1C 8,28 9,46 < LD 0,49* 1,34 0,62

Crianza

Cosecha 2004

2C 6,42 6,71 < LD 0,60 0,69 0,50*

3C 8,84 21,33 < LD 1,74 0,57 0,18*

4C 5,12 3,91 0,29* 1,82 0,89 0,77

5C 15,3 0,66 < LD < LD 1,20 0,29*

6C 5,38 8,23 < LD 0,72 0,34* < LD

7C 11,1 5,36 < LD 0,50 < LD 0,39*

8C 5,48 4,91 < LD 0,23* < LD < LD

9C 7,07 6,18 < LD 0,56 < LD < LD

10C 5,45 4,26 < LD 0,18* < LD < LD

Tabla 59: Concentraciones de las 6 ocratoxinas en muestras de vino tinto tradicional de Navarra. *Valor entre límite de detección (LD) y de cuantificación (LC).


- 142 -

Los datos medios agrupados por año y ocratoxina se muestran en la

tabla 60.

Tabla 60: Resultados obtenidos de cada ocratoxina en 3 años diferentes de cosecha.

*Valor entre LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si <LD, LD/2 (ng·L-1).

El test no paramétrico de Kruskal-Wallis para muestras

independientes revela que no hay diferencias significativas (p > 0,05)

entre las concentraciones de OTB, OTA, OTC y EtOTB encontradas para

los vinos tintos de la cosecha 2006 y 2007, ni tampoco con los crianzas

del 2004.

OTB (ng·L-1) OTA (ng·L-1)

2006 2007 2004 2006 2007 2004

+/Total 7/7 15/15 10/10 7/7 15/15 10/10

% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Intervalo 4,10 - 20,1 3,21 - 22,8 5,12 - 15,4 0,49 - 44,8 3,22 - 15,9 0,66 - 21,3

Media 11,0 9,22 7,85 18,1 8,22 7,10

Mediana 7,96 7,22 6,74 6,56 6,02 5,77

Sig. Asint. 0,758 0,963

MeOTA (ng·L-1) OTC (ng·L-1)

2006 2007 2004 2006 2007 2004

+/Total 1/7 9/15 1/10 6/7 10/15 9/10

% 14,3% 60% 10% 85,7% 66,6% 90%

Intervalo < LD - 0,37 < LD - 0,78 < LD - 0,29 < LD - 3,69 < LD - 2,84 < LD - 1,82

Media - 0,67 - 2,94 1,46 0,99

Mediana < LD 0,32* < LD 0,38* 0,68 0,53

Sig. Asint. p < 0,001 0,909

MeOTB (ng·L-1) EtOTB (ng·L-1)

2006 2007 2004 2006 2007 2004

+/Total 7/7 15/15 6/10 3/7 4/15 6/10

% 100% 100% 60% 42,9% 26,6% 60%

Intervalo 0,79 - 2,81 0,54 - 8,98 < LD - 1,34 < LD - 0,57 < LD - 0,65 < LD - 0,77

Media 1,40 2,53 0,94 0,57 0,63 0,70

Mediana 1,07 1,74 0,45* < LD < LD 0,24*

Sig. Asint. p < 0,001 0,562


- 143 -

Con respecto a los metil ésteres de la ocratoxina A y B, las

diferencias son altamente significativas (p < 0,001). Para ambas

micotoxinas, no hay diferencias entre las concentraciones de vinos

jóvenes, sin embargo los niveles en los vinos de crianza son

estadísticamente menores que los obtenidos para vinos jóvenes, según

el test a posteriori de comparaciones múltiples DMS (tablas 61 y 62).

Z Test DMS para MeOTA

P asint.

2006 2007 2004

2006 0,2149 0,0377

2007 1,240 0,0001

2004 2,078 3,899

Tabla 61: Test a posteriori de comparaciones múltiples DMS para MeOTA.

Z Test DMS para MeOTB

P asint.

2006 2007 2004

2006 0,1847 0,0378

2007 1,326 0,0002

2004 1,897 3,777

Tabla 62: Test a posteriori de comparaciones múltiples DMS para MeOTB.

VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA

Se han analizado 16 vinos tintos certificados como producto

ecológico por el CPAEN (Consejo de la Producción Agraria Ecológica de

Navarra) para evaluar si las prácticas ecológicas tienen alguna influencia

en los niveles de ocratoxinas en vinos. Los resultados pueden

observarse en la tabla 63.


- 144 -


Código OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB

1-EC-2007 5,78 7,06 0,38* 0,66 1,58 0,22*

Joven Cosecha

2007

2-EC-2007 24,2 63,0 0,37* 4,75 1,20 0,32*

2-EC-2007b 41,5 142 0,33* 14,3 0,72 0,98

3-EC-2007 10,1 1,49 < LD < LD 0,67 < LD

4-EC-2007 5,62 4,17 < LD 0,42* 0,60 < LD

5-EC-2007 4,09 2,37 0,88 0,29* 0,40* 0,19*

6-EC-2007 9,37 0,60 4,27 < LD 0,29* < LD

7-EC-2007 7,80 1,24 0,38* < LD 0,62 < LD

1-EC-2008 5,45 4,89 0,45* 0,40* 1,17 0,34*

Joven Cosecha

2008

2-EC-2008 44,3 127 < LD 10,1 0,34* 1,24

3-EC-2008 3,53 0,85 < LD < LD 0,41* < LD

4-EC-2008 4,44 3,31 < LD 0,17* 0,44* 0,25*

5-EC-2008 4,36 3,83 < LD < LD 0,27* < LD

6-EC-2008 4,00 1,80 < LD < LD 0,46* < LD

7-EC-2008 3,08 1,00 < LD < LD 0,88 < LD

8-EC-2008 4,13 1,19 < LD < LD 0,40* < LD

Tabla 63: Concentraciones de las 6 ocratoxinas en muestras de vino tinto de agricultura ecológica de Navarra. *Valor entre LD y LC.

Los datos medios agrupados por año y ocratoxina se muestran en la

tabla 64. El test no paramétrico de U de Mann-Whitney indicó que solo

las concentraciones de OTB y MeOTA son significativamente diferentes

entre las cosechas de 2007 y 2008 (p<0,05).

OTB (ng·L-1) OTA (ng·L-1) MeOTA (ng·L-1)

2007 2008 2007 2008 2007 2008

+/Total 8/8 8/8 8/8 8/8 6/8 1/8

% 100% 100% 100% 100% 75% 12,5%

Intervalo 4,09-41,5 3,08-44,3 0,60-142 0,85-127 <LD-4,27 <LD-0,45*

Media 13,6 9,16 27,8 18,0 2,57 -

Mediana 8,59 4,24 3,27 2,56 0,37* < LD

Sig. Exacta p < 0,05 p > 0,10 p < 0,01

OTC (ng·L-1) MeOTB (ng·L-1) EtOTB (ng·L-1)

2007 2008 2007 2008 2007 2008

+/Total 5/8 3/8 8/8 8/8 4/8 3/8

% 62,5% 37,5% 100% 100% 50% 37,5%

Intervalo <LD-14,3 <LD-10,1 0,29-1,58 0,27-1,17 <LD-0,98 <LD-1,24

Media 6,56 10,1 0,90 1,02 0,98 1,24

Mediana 0,36* < LD 0,64 0,43* 0,18* < LD

Sig. Exacta p > 0,10 p > 0,10 p > 0,10

Tabla 64: Resultados obtenidos de cada ocratoxina en las cosechas 2007 y 2008. *Valor entre LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si <LD,

LD/2 (ng·L-1).


- 145 -

PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS EN

VINOS NAVARROS

En este estudio ha quedado demostrada la presencia simultánea de

varias ocratoxinas en el vino. Considerando los resultados obtenidos de

los 51 vinos navarros, tanto tradicionales como ecológicos, la OTA

aparece conjuntamente con la OTB en el 100% de las muestras. En el

71% de las muestras, ambas aparecen además junto a la OTC. En

algunas de ellas aparecen 2 o 3 de los ésteres estudiados.

En 10 vinos de los 51 analizados hay niveles de 3 ocratoxinas por

encima del límite de detección, 4 aparecen en 16 vinos, 5 en 16, y las

seis estudiadas aparecen juntas en 9. Los porcentajes se indican en la

figura 47.

Figura 47: Porcentaje de aparición simultánea de varias ocratoxinas en el vino tinto.


- 146 -

INFLUENCIA DEL TIPO DE AGRICULTURA EN LA

PRESENCIA DE OCRATOXINAS

Las concentraciones de ocratoxinas en los vinos navarros han sido

comparadas con el test no paramétrico U de Mann-Whitney para

observar si existen diferencias entre las concentraciones obtenidas en

los vinos de agricultura tradicional y los elaborados con prácticas

ecológicas. Los resultados se muestran en la tabla 65.

OTB (ng·L-1)

Tradicional Ecológico Total

+/Total 35/35 16/16 51/51 % 100% 100% 100%

Intervalo 3,21 - 70,0 3,08 - 44,3 3,08 - 70,0 Media 11,0 11,4 11,1

Mediana 7,96 5,54 7,17 P asintótica 0,113 -

OTA (ng·L-1)


+/Total 35/35 16/16 51/51 % 100% 100% 100%

Intervalo 0,49 - 94,9 0,60 - 142 0,49 - 142 Media 12,7 22,9 15,9

Mediana 6,18 2,84 5,30 P asintótica 0,037 -

MeOTA (ng·L-1)


+/Total 14/35 7/16 21/51 % 40,0% 43,8% 41,2%

Intervalo < LD - 0,95 <LD - 4,27 < LD - 4,27 Media 0,84 2,57 1,34

Mediana < LD < LD < LD P asintótica 0,743 -

OTC (ng·L-1)


+/Total 28/35 8/16 36/51 % 80,0% 50,0% 70,6%

Intervalo < LD - 4,47 <LD - 14,3 < LD - 14,3 Media 1,70 7,44 2,63

Mediana 0,58 < LD 0,42* P asintótica 0,090 -

Tabla 65: Concentraciones de ocratoxinas en vinos tradicionales y ecológicos. *Valor entre LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si <LD, LD/2.


- 147 -

MeOTB (ng·L-1)


+/Total 31/35 16/16 47/51

% 88,6% 100% 92,2%

Intervalo < LD - 8,98 <LC - 1,58 < LD - 8,98

Media 1,90 0,93 1,70

Mediana 1,20 0,53 1,00

P asintótica 0,003 -

EtOTB (ng·L-1)


+/Total 15/35 7/16 22/51

% 42,9% 43,8% 43,1%

Intervalo < LD - 2,42 <LD - 1,24 < LD - 2,42

Media 1,00 1,11 1,03

Mediana < LD < LD < LD


Tabla 65 cont.: Concentraciones de ocratoxinas en vinos tradicionales y ecológicos.

*Valor entre LD y LC. +: valores > LD. Media: valores > LC. Mediana: todos los valores, si <LD, LD/2.

Las concentraciones medianas de OTA y MeOTB son

estadísticamente menores en los vinos de agricultura ecológica que en

los vinos de viticultura tradicional. Para otras ocratoxinas no se observa

diferencias significativas entre ambos tipos de cultivo.

Considerando la presencia global de las 6 ocratoxinas presentes en

el vino, se observan diferencias significativas entre ambos tipos de

cultivo (tabla 66), obteniéndose valores de mediana menores para el

cultivo ecológico.

Concentraciones totales de ocratoxinas (ng·L-1)


Intervalo 6,71 - 174 5,11 - 200 5,11 - 200

Media 26,6 37,7 30,1

Mediana 17,8 10,7 15,7


Tabla 66: Concentraciones totales de ocratoxinas presentes en cada tipo de vino.


- 148 -

INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR DE

VINO TINTO NAVARRO

La ingesta semanal de OTA y de la suma total de ocratoxinas se ha

calculado teniendo en cuenta el consumo de vino con D.O. por la

población total (24,2 mL·día-1 y 70,2 kg de peso corporal medio) y el

realizado a través de un consumo saludable, típico de la dieta

mediterránea (360 mL·día-1 y 76,8 kg para hombres, y 240 mL·día-1 y

64,2 kg para mujeres). Se ha considerado esta diferenciación en el

consumo con el objetivo de realizar una estimación de la ingesta más

adecuada, como se recomienda en el informe SCOOP (2002). El

consumo de vino por la población total se ha encontrado en la página

web del Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM,

2009). Para el volumen de consumo saludable de vino se ha considerado

el recomendado por la Fundación para la Investigación del Vino y

Nutrición (FIVIN, 2008). Los pesos medios de la población total,

hombres y mujeres se han encontrado en la página web del Instituto

Nacional de Estadística (www.ine.es).

En la tabla 67 se muestran los resultados calculados para las

concentraciones media y máxima de OTA obtenidas de los 51 vinos con

D.O. Navarra (15,9 y 142 ng·L-1, respectivamente) y de la suma total de

las 6 ocratoxinas (OTs) (30,1 y 200 ng·L-1, respectivamente).

Consumidores Población total

Hombres Mujeres

OTA OTs OTA OTs OTA OTs

C max 4,70 6,61 3,70 5,22 0,34 0,48

C media 0,53 1,00 0,42 0,79 0,04 0,07

Tabla 67: Ingesta semanal de OTA y OTs (ng·kg p.c.-1·semana-1).


- 149 -

RELACIÓN ENTRE LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS

El hecho de que todas las muestras analizadas contengan 3, 4, 5 o

6 ocratoxinas plantea la hipótesis de que pueda existir una relación

entre su presencia.

Se ha realizado un test de correlación para los siguientes pares de

ocratoxinas OTA-OTB, OTA-OTC, OTB-EtOTB, con los niveles de

concentración encontrados para las 51 muestras de vino navarro. Los

gráficos de dispersión junto con el estadístico no paramétrico rho de

Spearman se muestran en las siguientes figuras y tablas:

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ocratoxina B (ng·L-1)

Ocra

toxin

a A

(n

g·L

-1)

Figura 48: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTB.

Correlación de Spearman

IC95%

rS Sig N L. Inf L. Sup.

0,561 < 0,001 51 0,338 0,725 Tabla 68: Estadísticos de correlación OTA-OTB.


- 150 -

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Ocratoxina C (ng·L-1)

Ocra

toxin

a A

(n

g·L

-1)

Figura 49: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTC.


IC95%


0,849 < 0,001 51 0,749 0,912 Tabla 69: Estadísticos de correlación OTA-OTC.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Etilocratoxina B (ng·L-1)

Ocra

toxin

a B

(n

g·L

-1)

Figura 50: Gráfico de dispersión de la concentración de OTB frente a EtOTB.


- 151 -


IC95%


0,427 0,002 51 0,172 0,629 Tabla 70: Estadísticos de correlación OTB-EtOTB.

La probabilidad obtenida de todos los test (p < 0,01) indica una

muy significativa correlación positiva entre todas las variables. El valor

del coeficiente de correlación entre las concentraciones OTA-OTB

muestra una asociación grande entre ambas variables. Para OTA-OTC la

relación es muy elevada y es moderada en el caso de la OTB-EtOTB.

OCRATOXINAS Y CLIMA

Los coeficientes de correlación de Spearman obtenidos entre los

datos climatológicos (temperatura media, humedad relativa media y

precipitación) y las concentraciones de cada ocratoxina, se muestran en

la tabla siguiente:

OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB

Temperatura ns 0,367 ns 0,451 ns ns

Humedad ns -0,415 -0,356 -0,385 -0,346 ns

Precipitación ns -0,301 -0,498 ns -0,337 ns

Tabla 71: Coeficientes de correlación de Spearman entre las concentraciones de cada

ocratoxina y los datos climatológicos.

Las concentraciones de ocratoxina A y C tienen una asociación

positiva moderada con la temperatura media de los meses de julio y

agosto, mientras que no existe relación para los metil ésteres. La

correlación es negativa para la humedad y las concentraciones de OTA,

MeOTA, OTC y MeOTB. También es negativa para la precipitación en el

caso de OTA, MeOTA y MeOTB. La ocratoxina B y su etil éster no

muestran asociación con los datos climatológicos.

RESULTADOS: Ocratoxinas en vinos de países mediterráneos

- 153 -

5. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES

MEDITERRÁNEOS

Las concentraciones de las 6 ocratoxinas obtenidas del análisis de

vinos tintos de países mediterráneos se muestran en las siguientes

tablas.

VINOS DE ESPAÑA

De los 12 vinos de Cataluña analizados, en 8 (66,7%) aparecen las

6 ocratoxinas de manera simultánea, en 3 (25%) están presentes 5 y en

1 muestra (8,3%) aparecen 4 (tabla 72).



1-CA-XXXX 25,3 46,5 0,89 2,47 1,93 0,61

2-CA-XXXX 31,2 97,5 1,42 7,49 0,99 1,07

7-CA-2006 48,5 104 < LD 14,3 0,99 2,49

3-CA-2007 24,3 56,5 0,61 3,39 2,38 0,92

4-CA-2007 10,8 18,2 0,64 1,13 0,98 0,40*

5-CA-2007 13,9 32,1 0,38* 3,63 0,74 0,54

6-CA-2008 33,7 63,8 2,14 4,87 2,01 1,10

8-CA-2008 8,41 8,61 0,27* 0,58 0,50 0,26*

9-CA-2008 3,78 4,52 < LD 0,39* 0,47* 0,43*

10-CA-2008 6,29 7,05 0,69 0,73 0,34* 0,34*

12-CA-2008 4,66 6,45 1,15 0,73 3,34 < LD

11-CA-2009 5,26 1,05 < LD < LD 0,59 0,30*

Tabla 72: Concentraciones de ocratoxinas en vinos catalanes. *Valor entre LD y LC.

VINOS DE FRANCIA

Las 6 ocratoxinas aparecen de manera simultánea en 3 vinos tintos

franceses (25%), 2 muestras tienen 5 (16,7%), tres vinos presentan 4 y

3 ocratoxinas respectivamente (25%) y en 1 muestra (8,3%) aparecen

solo 2 (tabla 73).


- 154 -



1-FR-2006 9,03 0,89 < LD 1,86 0,55 < LD

9-FR-2006 6,28 0,42* < LD < LD 0,88 < LD

11-FR-2006 2,05 0,25* < LD < LD 0,61 0,29*

12-FR-2007 6,94 6,24 0,69 0,51 1,91 1,31

2-FR-2007 10,0 0,20* < LD 1,25 < LD < LD

3-FR-2007 29,4 66,8 0,42* 5,54 0,62 0,71

4-FR-2007 39,01 88,3 0,61 7,33 1,45 0,88

5-FR-2007 14,9 29,4 < LD 2,58 0,28 0,33*

6-FR-2008 25,5 58,1 0,46* 5,17 < LD 0,64

10-FR-2008 8,03 < LD 2,37 < LD < LD < LD

7-FR-2009 2,41 0,72 0,46* < LD < LD < LD

8-FR-2009 6,53 18,30 0,34* 0,68 < LD < LD

Tabla 73: Concentraciones de ocratoxinas en vinos franceses. *Valor entre LD y LC.

VINOS DE ITALIA

En los vinos italianos, las 6 ocratoxinas aparecen de manera

simultánea en 5 vinos (41,7%), el resto de las muestras (58,3%) están

contaminadas por al menos cinco (tabla 74).



1-IT-XXXX 11,7 20,6 < LD 2,57 4,01 0,64

2-IT-2005 119 286 41,4 23,5 2,85 4,20

10-IT-2005 6,60 7,24 < LD 0,91 1,04 0,23*

11-IT-2005 8,28 15,4 0,31* 1,53 1,88 < LD

12-IT-2006 11,7 30,4 0,27* 3,22 1,22 < LD

3-IT-2006 18,5 36,4 0,79 4,19 2,11 0,80

4-IT-2007 3,12 6,59 0,34* 3,29 1,36 0,22*

5-IT-2007 3,98 5,18 0,48* 1,53 1,94 < LD

7-IT-2007 24,8 81,0 35,2 4,18 4,25 0,59

8-IT-2007 46,8 121 48,2 8,86 1,07 0,94

6-IT-2008 8,45 19,4 0,45* 5,75 1,66 < LD

9-IT-2008 6,76 17,0 < LD 1,57 1,52 0,28*

Tabla 74: Concentraciones de ocratoxinas en vinos italianos. *Valor entre LD y LC.


- 155 -

VINOS DE CROACIA

Solo en un vino croata (8,3%) están presentes las 6 ocratoxinas de

manera simultánea. En 6 muestras (50%) aparecen 5, en 1 (8,3%)

cuatro y en 4 vinos (33,3%) hay al menos 3 ocratoxinas (tabla 75).


Croacia OTB OTA MeOTA OTC MeOTB EtOTB

1-CR-2004 27,0 37,6 < LD 3,01 3,32 2,33

2-CR-2004 2,60 1,70 < LD < LD 0,90 < LD

3-CR-2005 15,2 33,4 0,28* 2,63 0,70 0,76

4-CR-2005 26,3 61,3 < LD 2,97 0,45* 0,82

5-CR-2006 5,01 2,46 0,59 < LD 1,55 0,73

6-CR-2006 13,0 13,3 < LD 0,99 0,29* 0,84

7-CR-2006 4,13 4,88 < LD < LD < LD 0,44*

8-CR-2006 4,88 8,84 < LD 0,92 < LD 0,38*

9-CR-2007 7,85 18,2 < LD 0,88 0,30* 0,80

10-CR-2007 4,39 0,36* < LD < LD < LD 0,18*

11-CR-2008 3,83 6,47 < LD 0,59 0,29* 0,17*

12-CR-2008 3,63 0,40* < LD < LD < LD 0,37*

Tabla 75: Concentraciones de ocratoxinas en vinos croatas. *Valor entre LD y LC.

VINOS DE GRECIA

Las 6 ocratoxinas aparecen de manera simultánea en 10 vinos

tintos griegos (83,3%), y dos muestras (16,7%) están contaminadas

por al menos cinco (tabla 76).


- 156 -



7-GR-XXXX 69,8 212 0,69 23,5 2,44 1,81

8-GR-2003 6,28 4,35 0,68 1,09 0,85 0,26*

9-GR-2004 58,3 174 0,64 20,0 1,10 1,13

10-GR-2004 27,9 49,3 0,44* 4,86 0,29* 0,82

11-GR-2004 8,19 8,29 < LD 1,07 0,40* 0,21*

12-GR-2005 55,9 115,2 0,83 9,58 1,04 0,68

1-GR-2007 19,8 16,8 0,44* 1,15 3,64 0,26*

2-GR-2007 40,5 26,3 0,53 2,59 0,61 0,71

3-GR-2007 23,8 42,5 < LD 3,35 1,58 0,55

4-GR-2007 13,6 37,1 0,31* 3,24 0,57 0,42*

5-GR-2007 8,39 7,93 1,33 0,53 1,07 0,21*

6-GR-2007 9,63 18,8 0,35* 1,50 1,39 0,57

Tabla 76: Concentraciones de ocratoxinas en vinos griegos. *Valor entre LD y LC.

VINOS DE TURQUÍA

En 5 muestras de vino turco (41,7%) aparecen de manera

simultánea las 6 ocratoxinas y 5 están presentes en el resto de las

muestras (58,3%) (tabla 77).



1-TUR-2003 10,4 28,8 0,60 2,24 4,30 3,04

2-TUR-2003 50,3 101 < LD 11,2 0,72 1,99

3-TUR-2005 13,0 52,6 < LD 4,47 0,74 0,88

4-TUR-2005 22,4 62,8 0,27* 6,08 1,46 1,13

5-TUR-2005 5,15 13,7 < LD 0,90 0,70 0,38*

6-TUR-2005 22,6 27,3 < LD 3,21 1,49 0,70

7-TUR-2005 3,50 10,0 < LD 0,90 0,48* 0,19*

8-TUR-2005 6,53 13,5 < LD 1,07 0,81 0,27*

9-TUR-2006 2,06 3,22 1,03 0,27* 1,47 1,26

10-TUR-2006 13,0 48,4 < LD 5,69 1,07 0,40*

11-TUR-2007 6,99 9,45 0,79 0,58 0,97 2,16

12-TUR-2007 3,19 2,91 0,55 0,29* 1,45 1,00

Tabla 77: Concentraciones de ocratoxinas en vinos turcos. *Valor entre LD y LC.


- 157 -

VINOS DE ISRAEL

Ocho muestras de vino israelí (66,7%) están contaminadas con las

6 ocratoxinas estudiadas, y en 4 vinos (33,3%) aparecen 5 (tabla 78).



1-IS-2006 15,8 7,33 1,35 0,98 3,18 2,24

2-IS-2006 12,7 3,63 0,79 0,43* 2,24 < LD

3-IS-2006 22,4 11,0 2,26 1,16 8,11 0,64

4-IS-2007 26,2 49,3 1,77 3,99 3,06 0,89

5-IS-2008 43,8 65,4 2,52 4,41 5,02 < LD

6-IS-2008 13,3 14,6 2,29 1,11 2,28 0,39*

7-IS-2008 7,17 4,64 0,97 0,40* 2,89 < LD

8-IS-2008 21,9 13,4 3,64 1,60 4,74 0,39

12-IS-2008 17,4 7,69 2,88 0,84 2,97 2,65

9-IS-2009 16,3 23,1 1,69 2,39 1,86 0,63

10-IS-2009 19,9 9,69 0,56 1,39 0,40* 0,17*

11-IS-2009 11,4 12,5 1,16 1,24 0,89 < LD

Tabla 78: Concentraciones de ocratoxinas en vinos israelíes. *Valor entre LD y LC.

VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA

Las 6 ocratoxinas aparecen juntas en 3 vinos tintos de Argelia y

Túnez (25%), 5 muestras tienen 5 (41,7%), y cuatro vinos presentan 4

ocratoxinas (33,3%) (tabla 79).



1-TU-XXXX 92,7 455 < LD 31,5 < LD 2,66

2-TU-XXXX 45,5 110 < LD 10,6 0,45* 1,16

3-TU-XXXX 75,7 255 0,30* 17,1 4,56 2,39

1-AR-XXXX 64,3 152 0,45* 10,3 < LD 1,46

7-AR-XXXX 36,6 84,4 < LD 5,92 1,26 1,60

2-AR-1998 45,3 101 < LD 12,6 < LD 1,60

3-AR-2004 65,8 180 < LD 14,8 < LD 1,86

4-TU-2005 79,2 326 0,71 22,7 1,82 3,08

5-TU-2006 43,3 181 0,30* 12,3 2,75 1,52

4-AR-2006 87,2 235 < LD 15,6 < LD 2,27

5-AR-2006 61,1 162 0,39* 9,21 < LD 2,03

6-AR-2008 70,1 101 0,60 8,17 < LD 1,68

Tabla 79: Concentraciones de ocratoxinas en vinos argelinos (AR) y de Túnez (TU). *Valor

entre LD y LC.


- 158 -



Teniendo en cuenta las 96 muestras analizadas, los porcentajes de

la presencia simultánea de ocratoxinas en vino tinto se muestran en la

figura 51. Las 6 ocratoxinas estudiadas aparecen juntas en 43 vinos, 5

de ellas aparecen en 36 muestras, en 9 vinos están presentes 4, en 7

aparecen 3 y en una única muestra solo hay dos ocratoxinas.

Figura 51: Presencia simultánea de ocratoxinas en 96 muestras de vino tinto de países mediterráneos.

Las concentraciones de ocratoxinas (ng·L-1) obtenidas para los 96

vinos tintos de países mediterráneos en conjunto se muestran en la

tabla 80.


+/Total 96/96 95/96 60/96 86/96 80/96 80/96

% 100% 99,0% 62,5% 89,6% 83,3% 83,3%

Min (ng·L-1) 2,05 < LD < LD < LD < LD < LD

Max (ng·L-1) 119 455 48,2 31,5 8,11 4,20

Media (ng·L-1) 23,5 54,2 4,22 5,20 1,85 1,37

Mediana (ng·L-1) 13,4 19,1 0,38 2,32 0,99 0,62

Tabla 80: Resumen de las concentraciones de ocratoxinas encontradas en los vinos de

países mediterráneos. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si <LD, LD/2.


- 159 -

INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN EN LA


Las concentraciones de cada ocratoxina, agrupadas por países se

muestran en las siguientes tablas. Se dan el número de muestras con

concentraciones superiores al LD, su porcentaje, los valores mínimos y

máximos encontrados en cada país y las concentraciones media y

mediana calculadas. Se ha utilizado el test de Kruskal Wallis para

comparar las medianas de cada país y el test a posteriori de

comparaciones múltiples de Bonferroni para detectar el origen de las

diferencias (nº de comparaciones = 28).

- Ocratoxina B

OTB (ng·L-1)

España Francia Italia Croacia Grecia Turquía Israel N.África

+/Total 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12

% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Min 3,78 2,05 3,12 2,60 6,28 2,06 7,17 36,6

Max 48,5 39,1 119 27,0 69,8 50,3 43,8 92,7

Media 18,0 13,4 22,5 9,82 28,5 13,3 19,0 63,9

Mediana 12,4 8,53 10,1 4,95 21,8 8,71 16,8 65,1

Tabla 81: Resumen de las concentraciones de OTB encontradas en 8 países mediterráneos.

+: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si <LD, LD/2.

Todos los vinos mediterráneos analizados están contaminados con

ocratoxina B (tabla 81). El mayor valor encontrado (119 ng·L-1)

corresponde a una muestra italiana de la región de Calabria, al sur del

país. El menor valor de concentración se ha encontrado en un vino

francés. Los vinos croatas son los menos contaminados por esta

micotoxina, ya que poseen las menores media y mediana.

Por países, la concentración mediana de OTB sigue el orden:

Croacia < Francia ≈ Turquía < Italia < España < Israel < Grecia < Norte

de África. Solo los vinos de Túnez y Argelia muestran diferencias


- 160 -

significativas con respecto a los demás, según el test de Kruskal-Wallis

(p<0,001) y el test de Bonferroni (tabla 82).

Z Test de Bonferroni para OTB

P asint.

España Francia Italia Croacia Grecia Turquía Israel N. África

España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0002

Francia 0,635 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0000

Italia 0,231 0,577 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0184

Croacia 1,732 0,924 1,270 0,1264 1,0000 0,4058 0,0000

Grecia 1,155 1,935 1,386 2,771 0,9308 1,0000 0,0184

Turquía 1,097 0,144 0,635 0,462 2,136 1,0000 0,0002

Israel 0,693 1,905 1,443 2,425 0,577 1,905 0,0001

N. África 3,926 4,099 3,233 4,157 3,233 3,926 4,041

Tabla 82: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para OTB.

- Ocratoxina A

OTA (ng·L-1)


+/Total 12/12 11/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12

% 100% 91,7% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Min 1,05 <LD 5,18 0,36* 4,35 2,91 3,63 84,4

Max 104 88,3 286 61,3 212 101 65,4 455

Media 37,2 33,6 53,9 18,8 59,4 31,1 18,5 195

Mediana 25,1 3,56 20,0 7,65 31,7 20,5 11,7 171

Tabla 83: Resumen de las concentraciones de OTA encontradas en 8 países mediterráneos. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si <LD, LD/2.

El 99% de los vinos mediterráneos analizados contienen ocratoxina

A con niveles por encima del límite de detección (>0,16 ng·L-1). Solo un

vino francés de D.O. Beaujolais no presenta OTA. El mayor valor

encontrado (455 ng·L-1) corresponde a una muestra de Túnez. Ningún

vino ha superado el límite máximo permitido por la UE de 2 µg·L-1 para

la ocratoxina A en vino (tabla 83).

Por países, la concentración mediana de OTA sigue el orden:

Francia < Croacia < Israel < Italia ≈ Turquía < España < Grecia < Norte


- 161 -

de África. Sin embargo, solo los vinos de Túnez y Argelia muestran

diferencias significativas con respecto a los demás, según el Test de

Kruskal-Wallis (p<0,001) y el test de de Bonferroni (tabla 84).

Z Test de Bonferroni para OTA

P asint.


España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0002

Francia 1,674 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0000

Italia 0,346 1,790 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0104

Croacia 1,559 0,462 1,963 0,7958 1,0000 1,0000 0,0000

Grecia 0,693 1,963 0,520 2,194 1,0000 1,0000 0,0312

Turquía 0,115 1,386 0,520 1,732 0,751 1,0000 0,0000

Israel 0,693 0,924 1,501 0,981 1,848 0,981 0,0000

N. África 3,926 4,099 3,349 4,157 3,118 4,099 4,157

Tabla 84: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para OTA.

- Metilocratoxina A

MeOTA (ng·L-1)


+/Total 9/12 7/12 9/12 2/12 10/12 5/12 12/12 6/12

% 75,0% 58,3% 75,0% 16,7% 83,3% 41,7% 100% 50,0%

Min <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,56 <LD

Max 2,14 2,37 48,2 0,59 1,33 1,03 3,64 0,71

Media 1,08 1,22 31,4 0,59 0,78 0,74 1,82 0,66

Mediana 0,63 0,38* 0,40* <LD 0,48* <LD 1,73 0,28*

Tabla 85: Resumen de las concentraciones de MeOTA de los 8 países mediterráneos. *Valor entre LD y LC. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si

<LD, LD/2.

El 62,5% de los vinos presentan MeOTA por encima de 0,27 ng·L-1.

El mayor valor (48,2 ng·L-1) corresponde a una muestra italiana con

Indicación Geográfica Típica (IGT) de Salento, en la región de Apulia.

Croacia y Turquía son los países menos contaminados por esta

micotoxina, cuyas concentraciones medianas están por debajo del límite

de detección. Con concentraciones muy bajas, les siguen los vinos del

Norte de África, Francia, Italia, Grecia, España e Israel. Según el test de


- 162 -

Bonferroni, los vinos croatas presentan diferencias significativas con

respecto a los de Italia, Grecia e Israel. Y la concentración de MeOTA de

los vinos israelíes es estadísticamente diferente a la obtenida en

Croacia, Turquía, Norte de África, Francia y Grecia (tabla 86).

Z Test de Bonferroni para MeOTA

P asint.


España 1,0000 1,0000 0,1380 1,0000 1,0000 0,5120 1,0000

Francia 0,983 1,0000 0,0512 1,0000 1,0000 0,0040 1,0000

Italia 0,058 0,809 0,0240 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000

Croacia 3,416 3,118 3,266 0,0200 1,0000 0,0000 1,0000

Grecia 0,231 1,214 0,260 3,737 1,0000 0,0020 0,6772

Turquía 1,856 1,074 1,624 2,046 1,939 0,0004 1,0000

Israel 3,002 3,523 1,992 4,210 3,638 3,849 0,0001

N. África 1,914 1,161 1,711 2,140 2,229 0,000 4,051

Tabla 86: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para MeOTA.

- Ocratoxina C

OTC (ng·L-1)


+/Total 11/12 8/12 12/12 7/12 12/12 12/12 12/12 12/12

% 91,7% 66,7% 100% 58,3% 100% 100% 100% 100%

Min <LD <LD 0,91 <LD 0,53 0,27* 0,40* 5,92

Max 14,3 7,33 23,5 3,01 23,5 11,2 4,41 31,5

Media 3,93 3,12 5,09 1,71 6,04 3,63 1,91 14,2

Mediana 1,80 0,97 3,26 0,74 2,92 1,66 1,20 12,5

Tabla 87: Resumen de las concentraciones de OTC encontradas en 8 países mediterráneos.

+: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los valores, si <LD, LD/2.

El 89,6% de los 96 vinos analizados están contaminados con OTC.

Un vino tinto de Túnez presenta el mayor valor de 31,5 ng·L-1

(tabla 87). Las concentraciones obtenidas para los vinos del Norte de

África son estadísticamente diferentes a las demás, que siguen el orden

creciente: Croacia < Francia < Israel < Turquía ≈ Cataluña < Grecia <

Italia < Norte de África. La concentración de OTC de los vinos croatas

difiere además de los vinos italianos (tabla 88).


- 163 -

Z Test de Bonferroni para OTC

P asint.


España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0014

Francia 0,810 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0000

Italia 1,328 1,968 0,0240 1,0000 1,0000 0,3386 0,0077

Croacia 1,620 0,588 3,183 0,0816 1,0000 1,0000 0,0000

Grecia 0,982 1,736 0,404 2,893 1,0000 1,0000 0,0264

Turquía 0,029 1,100 1,328 2,026 1,184 1,0000 0,0006

Israel 0,289 0,347 2,483 1,736 1,674 0,404 0,0000

N. África 3,696 4,108 3,407 4,166 2,710 3,811 4,157

Tabla 88: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para OTC.

- Metilocratoxina B

MeOTB (ng·L-1)


+/Total 12/12 7/12 12/12 8/12 12/12 12/12 12/12 5/12

% 100% 58,3% 100% 66,7% 100% 100% 100% 41,7%

Min 0,34* <LD 1,04 <LD 0,29* 0,48* 0,40* <LD

Max 3,34 1,91 4,25 3,32 3,64 4,30 8,11 4,56

Media 1,45 0,90 2,07 1,62 1,43 1,38 3,38 2,60

Mediana 0,98 0,41* 1,77 0,30* 1,06 1,02 2,93 <LD

Tabla 89: Resumen de las concentraciones de MeOTB encontradas en 8 países mediterráneos. *Valor entre LD y LC. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos los

valores, si <LD, LD/2.

El 83,3% de los vinos presentan MeOTB por encima de 0,27 ng·L-1.

El valor más alto de 8,11 ng·L-1 se obtuvo en una muestra israelí de los

Altos del Golán (tabla 89).

Los vinos del norte de África, Croacia y Francia son los países

menos contaminados por MeOTB y muestran diferencias significativas

con respecto a los más contaminados, Italia e Israel (tabla 90).


- 164 -

Z Test de Bonferroni para MeOTB

P asint.


España 0,5737 0,7958 0,3386 1,0000 1,0000 0,4058 1,0000

Francia 2,312 0,0040 1,0000 0,6772 0,1907 0,0020 1,0000

Italia 2,194 3,525 0,0139 0,5737 0,3380 1,0000 0,0405

Croacia 2,484 0,405 3,292 0,6772 0,2812 0,0139 1,0000

Grecia 0,231 2,225 2,310 2,254 1,0000 0,2322 1,0000

Turquía 0,260 2,630 2,454 2,513 0,318 0,1907 1,0000

Israel 2,425 3,640 1,617 3,292 2,570 2,656 0,0401

N. África 1,849 0,029 2,426 0,491 1,675 1,791 3,061

Tabla 90: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para MeOTB.

- Etilocratoxina B

EtOTB (ng·L-1)


+/Total 11/12 6/12 8/12 11/12 12/12 12/12 8/12 12/12

% 91,7% 50,0% 66,7% 91,7% 100% 100% 66,7% 100%

Min <LD <LD <LD <LD 0,21* 0,19* <LD 1,16

Max 2,49 1,31 4,20 2,33 1,81 3,04 2,65 3,08

Media 1,12 0,89 1,43 1,04 0,89 1,52 1,41 1,94

Mediana 0,49* 0,19* 0,26* 0,59 0,56 0,94 0,39* 1,77

Tabla 91: Resumen de las concentraciones de EtOTB encontradas en 8 países mediterráneos. *Valor entre LD y LC. +: > LD. Media: valores > LC. Mediana: con todos

los valores, si <LD, LD/2.

El 83,3% de los vinos presentan EtOTB por encima del límite de

detección (0,17 ng·L-1). El valor más alto de 4,20 ng·L-1 corresponde a

una muestra italiana de la región de Calabria (tabla 91).

Francia, Italia e Israel son los países menos contaminados por esta

micotoxina. Con concentraciones muy bajas, les siguen los vinos de

Cataluña, Grecia, Croacia y Turquía. Los vinos del Norte de África

presentan diferencias significativas con respecto a las concentraciones

de los seis primeros (tabla 92).


- 165 -

Z Test de Bonferroni para EtOTB

P asint.


España 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0029

Francia 1,862 1,0000 1,0000 1,0000 0,2322 1,0000 0,0000

Italia 1,271 0,794 1,0000 1,0000 0,9308 1,0000 0,0056

Croacia 0,289 1,695 0,954 1,0000 1,0000 1,0000 0,0020

Grecia 0,116 1,601 1,098 0,029 1,0000 1,0000 0,0006

Turquía 1,180 2,590 2,137 1,588 1,473 1,0000 0,2322

Israel 0,867 0,979 0,029 0,695 0,925 1,734 0,0312

N. África 3,580 4,132 3,466 3,638 3,813 2,599 3,122

Tabla 92: Test de comparaciones múltiples de Bonferroni para EtOTB.


Se ha realizado un test de correlación para los pares de ocratoxinas

OTA-OTB, OTA-OTC y OTB-EtOTB, con los niveles de concentración

encontrados en las 96 muestras de vino tinto de países mediterráneos.

Los gráficos de dispersión junto con el estadístico no paramétrico rs de

Spearman se muestran en las siguientes figuras y tablas.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 20 40 60 80 100 120 140

Ocra

toxin

a A

(n

g·L

-1)

Ocratoxina B (ng·L-1) Figura 52: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTB.


- 166 -


IC95%


0,897 < 0,001 96 0,849 0,930

Tabla 93: Estadísticos de correlación OTA-OTB.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 5 10 15 20 25 30 35

Ocra

toxin

a A

(n

g·L

-1)

Ocratoxina C (ng·L-1) Figura 53: Gráfico de dispersión de la concentración de OTA frente a OTC.


IC95%


0,934 < 0,001 96 0,903 0,956

Tabla 94: Estadísticos de correlación OTA-OTC.


- 167 -

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5

Ocra

toxin

a B

(n

g·L

-1)

Etilocratoxina B (ng·L-1) Figura 54: Gráfico de dispersión de la concentración de OTB frente a EtOTB.


IC95%


0,648 < 0,001 96 0,515 0,751

Tabla 95: Estadísticos de correlación OTB-EtOTB.

Los valores del coeficiente de correlación de Spearman obtenidos

son superiores a los del estudio realizado para los vinos navarros,

posiblemente debido al mayor número de muestras. Las concentraciones

de OTA-OTB muestran una asociación muy elevada. Para OTA-OTC la

relación es prácticamente perfecta y es grande en el caso de la OTB-

EtOTB.

DISCUSIÓN

DISCUSIÓN

- 171 -

1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO



Li y col. propusieron un método para la síntesis de OTC y MeOTA

para utilizarlo como método de confirmación de OTA en muestras

biológicas o para la preparación de patrones de ambas ocratoxinas (Li y

col., 1998).

Estudiaron el porcentaje de conversión de OTA con respecto al

tiempo de incubación, la concentración de ácido clorhídrico, la

proporción disolvente:ácido y la influencia de usar etanol o metanol,

respectivamente. Concluyeron que la OTA se convertía al 100% en sus

ésteres con 48h de incubación de la síntesis, HCl 12M y una proporción

en volumen de metanol:ácido 20:1. Sin embargo, la síntesis cuantitativa

no pudo reproducirse en nuestro laboratorio.

La preparación posterior de las disoluciones patrón de trabajo con

las cuatro ocratoxinas, requiere que cada disolución madre contenga

únicamente la ocratoxina de interés (sin restos de OTA en el caso de los

ésteres sintetizados a partir de ella) para no alterar la concentración de

OTA en la disolución. Sin embargo, tras seguir el procedimiento descrito

por Li y col. para la síntesis de los ésteres de la OTA, se observó

presencia de esta ocratoxina en las disoluciones resultantes. Por esta

razón se necesitó realizar la purificación de la OTC y MeOTA

sintetizadas.

Se decidió emplear la técnica de la extracción líquido-líquido para la

separación de la OTA de sus ésteres. Para ello, era preciso elegir dos

disolventes inmiscibles entre sí y de los que uno de ellos debía

solubilizar la ocratoxina A y el otro retener los ésteres.

DISCUSIÓN

- 172 -

La solubilidad de la OTA en disoluciones acuosas de bicarbonato

sódico y carbonato potásico es conocida. Además, estos disolventes

habían sido utilizados en nuestro laboratorio para eliminar la OTA de la

cáscara de cacao (Amézqueta y col., 2008). Por estas razones, se

consideraron óptimos para ser empleados en la purificación.

Las propiedades de solubilidad de los ésteres de OTA no han sido

tan investigadas como las de la ocratoxina A; sin embargo, por los

mayores tiempos de retención de éstos en cromatografía en fase

reserva, se pudo deducir que su polaridad debía ser menor. Así, para su

extracción, se eligieron disolventes apolares no miscibles con las

soluciones acuosas de bicarbonato sódico y carbonato potásico.

El empleo de NaHCO3 (0,25 %) y diclorometano produjo una

separación completa de los ésteres y la OTA no reaccionante,

consiguiéndose así disoluciones de OTC y MeOTA en las que por

cromatografía de fluorescencia no se pudieron detectar niveles de OTA.

La concentración exacta de estas disoluciones pudo determinarse

por espectrofotometría empleando la Ley de Lambert-Beer, para lo que

se necesitó conocer el coeficiente de absortividad molar a una longitud

de onda característica y un disolvente determinado. Teniendo en cuenta,

que la OTC y MeOTA son compuestos poco estudiados hasta la fecha,

resultó difícil encontrar el coeficiente de estas micotoxinas en la

bibliografía.

Finalmente, se halló el valor de 7.000 M-1·cm-1 a 333 nm en etanol

para la ocratoxina C (Cole y col., 2003). La absorción a esta longitud de

onda se debe al grupo hidroxilo de la isocumarina (Steyn, 1971), por lo

que se asumió que la sustitución del grupo etilo del éster por un grupo

metilo no ofrecería cambios sustanciales en las propiedades ultravioleta-

visible de ambos compuestos. Así, se utilizó este valor para calcular las

DISCUSIÓN

- 173 -

concentraciones de las disoluciones madre tanto de OTC como de

MeOTA.


Inicialmente se utilizó acetonitrilo para la preparación de las

disoluciones estándar de trabajo de las 4 ocratoxinas. Se descartó

utilizar un alcohol, por ejemplo metanol, para evitar que la OTC pudiera

sufrir una transesterificación a MeOTA. Sin embargo, se observó que al

preparar las disoluciones en acetonitrilo, la concentración de OTA y OTB

era menor a la esperada, especialmente en la concentración más baja

preparada (4 µg·L-1).

Este hecho se advirtió en los cromatogramas debido a que, a una

misma concentración, los 4 compuestos presentan áreas similares y al

analizar la disolución de menor concentración en acetonitrilo, las áreas

de los picos de OTA y OTB eran mucho menores que las de MeOTA y

OTC. Además, las áreas de pico para OTA y OTB obtenidas al analizar

patrones de 4 µg·L-1 preparados por dilución de las disoluciones de 40 y

400 µg·L-1 no coincidían con las áreas del patrón de 4 µg·L-1 preparado

independientemente.

Este fenómeno no se observó al utilizar metanol como disolvente.

Esto, y el hecho de que fueran los compuestos ácidos y no los ésteres

los que vieran afectada su concentración, hizo suponer como posible

explicación, que los grupos hidroxilo del metanol podrían bloquear los

posibles lugares de unión del vidrio con la OTA y OTB, retenidas a través

del OH del ácido carboxílico.

Por lo tanto, a partir de esta observación, se evitó la utilización

conjunta de vidrio y acetonitrilo (como único disolvente) cuando se

trabajó con las ocratoxinas A y B.

DISCUSIÓN

- 174 -


Las columnas de inmunoafinidad (CIA) son un método ampliamente

utilizado para la extracción de la OTA de diferentes matrices

alimenticias, incluido el vino (Fabiani y col., 2010; Wu y col., 2011;

Solfrizzo y col., 2008).

Inicialmente, se utilizaron las columnas Ochratest® de la marca

comercial Vicam, ya que eran las que se habían utilizado en el

laboratorio en la purificación de OTA a partir de diferentes matrices

(López de Cerain y col., 2002; Murillo y col., 2007; Araguás y col.,

2005; Amézqueta y col., 2004).

En las columnas de inmunoafinidad de cualquier marca comercial se

incluyen indicaciones con respecto a su uso para el análisis de

ocratoxina A, pero no se menciona nada sobre el comportamiento de las

columnas para compuestos análogos. De esta forma, resultó que las

columnas de la casa Vicam retuvieron la OTA y sus ésteres, pero no la

OTB, por lo que su uso habría imposibilitado el análisis de esta

ocratoxina.

La tendencia actual del análisis simultáneo de micotoxinas ha hecho

que se desarrollen columnas de inmunoafinidad para la extracción de

varias micotoxinas a la vez. Por ejemplo, se pueden encontrar columnas

de inmunoafinidad que permitan el análisis simultáneo de aflatoxinas,

ocratoxina A y zearalenona; aflatoxinas y zearalenona; aflatoxinas y

patulina o para el análisis conjunto de tricotecenos tipo A y B. Sin

embargo, la familia de ocratoxinas sigue sin explorarse.

La extracción en fase sólida con columnas C18 podría ser una

opción para analizar las 4 ocratoxinas simultáneamente. Sin embargo,

se les puede suponer algunas desventajas: en primer lugar, para

propiciar la detección de compuestos minoritarios como la OTC o la

DISCUSIÓN

- 175 -

MeOTA se necesitan menores límites de detección que los conseguidos

en general con ellas (Saéz y col., 2004; Tessini y col., 2010; Berente y

col., 2005). Por otro lado, el grado de concentración de la matriz

necesario para conseguir límites de detección lo suficientemente bajos,

conduciría probablemente a cromatogramas con picos interferentes o

con ruido y, más aún, cuando se trata de una matriz compleja como es

el vino.

Boudra y Morgavi (2006) desarrollaron un método analítico para la

determinación de OTA, OTB y OTα en plasma y leche cruda de ovejas

alimentadas con pienso contaminado (Boudra y Morgavi, 2006).

Utilizaron las columnas de inmunoafinidad Ochraprep® de R-Biopharm

para la extracción de las ocratoxinas de la leche y apuntaron que la OTα

no era retenida por ellas pero sí la OTA y OTB. No se mencionaba nada

acerca de los ésteres de la ocratoxina A. Con esta información, se

decidió probar esta marca comercial para la cuantificación de OTA, OTB,

OTC y MeOTA.

Sin embargo, las instrucciones de estas columnas explican los

procedimientos para la extracción de OTA desde cerveza, cereales y café

verde o soluble, pero no describen, curiosamente, el método a seguir

con el vino. Por esta razón, se decidió utilizar una modificación del

protocolo propuesto para la extracción de OTA en cerveza, ya que al

tratarse de una matriz líquida era la más parecida al vino. Las

modificaciones realizadas respecto al método propuesto por la casa

comercial fueron las siguientes: se utilizaron 50 mL de muestra en lugar

de 20 mL con la intención de disminuir los límites de detección y

cuantificación, comprobando previamente que la columna no sufría

saturación al paso de este volumen de muestra. La elución de las

ocratoxinas se realizó con 4 mL de metanol en lugar de emplear 1,5 mL

de disolución metanol:ácido acético (98:2 v/v) para evitar problemas de

DISCUSIÓN

- 176 -

estabilidad en la disolución ácida. Finalmente, en el procedimiento

descrito para la purificación de OTA desde la cerveza, se indica que el

eluido puede ser analizado directamente en el HPLC; sin embargo, al

incluir un paso de evaporación y reconstitución del eluido en un volumen

inferior de fase móvil se ha conseguido una mayor concentración de la

OTA desde la muestra.

Extrayendo 50 mL de muestra, evaporando los 4 mL de metanol de

elución y redisolviendo el residuo en 250 µL de fase móvil se consigue

concentrar 200 veces los niveles de ocratoxinas en el vino, en vez de las

13,3 propuestas en el protocolo de las CIA. Esto ha permitido obtener

un método analítico con un límite de detección para la OTA inferior a los

descritos en la bibliografía y con límites de detección adecuados para la

determinación de sus análogos.

PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO

El método cromatográfico desarrollado es una modificación del

propuesto por la Organización de la Vid y el Vino y del utilizado

anteriormente en el laboratorio para la determinación de OTA en vino

(OIV, 2001; López de Cerain y col., 2002).

Las modificaciones realizadas sobre el método de López de Cerain y

col. fueron las siguientes. En primer lugar, la columna (25 x 0,4 cm,

5 µm) se sustituyó por una de 15 x 0,46 cm (5 µm) con el objetivo de

reducir disolventes y residuos. Esto llevó también a un cambio del flujo

de 1,5 a 1 mL·min-1. Como fase móvil, en vez de utilizar una mezcla

isocrática ternaria acetonitrilo:metanol:agua (acetato sódico 5 mM) se

eligió una mezcla binaria acetonitrilo:agua (ácido fórmico 0,4%), con la

que resultó más fácil optimizar el gradiente. Respecto al método de la

OIV se cambió la separación isocrática por una en gradiente.

DISCUSIÓN

- 177 -

Los tiempos de retención de los cuatro compuestos resultaron muy

diferentes. Mientras la OTB aparecía al principio del cromatograma muy

poco retenida, la MeOTA y OTC resultaban tan afines por la fase

estacionaria que presentaron tiempos de retención grandes (40 min)

incluso con una fase móvil isocrática con un 60% de acetonitrilo. Para

obtener un tiempo de análisis moderado se hizo necesario el uso de

gradiente, con baja proporción de fase orgánica al inicio, para evitar la

interferencia de la OTB con el frente, y mayor proporción de acetonitrilo

al final del análisis para la elución de los ésteres.

Para disminuir el tiempo de análisis se evaluó también la posibilidad

de aumentar la temperatura del horno de columna hasta 60ºC; sin

embargo, no supuso un descenso significativo del tiempo necesario para

la elución de las ocratoxinas y empeoraba la selectividad.

Por estas razones, las condiciones que se fijaron para la fase móvil

fueron, una mezcla de acetonitrilo:agua (ácido fórmico 0,4%) en

gradiente 42:58 de 0 a 10 min y 60:40 de 15 a 25 min. La temperatura

de la columna se fijó en 40ºC. Estas condiciones dieron lugar a la

separación y elución de todos los analitos en 25 minutos.

En cuanto a las condiciones de la detección por fluorescencia, la

longitud de onda de excitación más utilizada en la bibliografía para la

OTA es 333 nm, que corresponde con un máximo en el espectro de

absorción UV-visible. La OTA presenta otro máximo en torno a 225 nm,

que al utilizarlo como λ de excitación produce una mayor respuesta en

la fluorescencia (Murillo y col., 2007; Amézqueta y col., 2004). Sin

embargo, se observó que el ruido de fondo también era mayor, y por

tanto, la relación señal/ruido. La longitud de onda de excitación de

333 nm permitió conseguir límites de detección más bajos. Esto coincide

con Soufleros y col. (2003), quienes apuntan que la OTA puede

DISCUSIÓN

- 178 -

excitarse en ultravioleta o visible según la necesidad de una señal más

alta o una línea base más estable (Soufleros y col., 2003).

La longitud de onda de emisión de 333 nm corresponde también

con el máximo del espectro de absorción de los ésteres de la OTA. En el

caso de la OTB presenta un máximo a 318 nm, y fue la que se utilizó

como λ de excitación para este compuesto.

Durante la puesta a punto del método analítico, se observó como en

algunos análisis aparecía una interferencia en forma de pico a tiempos

de retención altos (figura 24), que afectaba a la cuantificación de la

MeOTA y solo aparecía al aumentar el porcentaje de fase orgánica en la

fase móvil. Se pensó en el deterioro de la columna, de la precolumna,

en la contaminación del equipo, fases móviles, filtros, inyector,

problemas en la extracción, compuestos interferentes de la matriz… Las

múltiples pruebas que se realizaron mostraron que la interferencia era

causada por los viales de HPLC de plástico en contacto con la fase móvil

durante más de 4h y que desaparecía al utilizar viales de vidrio

desactivados. Por ello, durante la validación y análisis de las muestras

se utilizaron viales de vidrio.

METIL Y ETIL ÉSTERES DE LA OTB Y DE LA OTα

En los cromatogramas de algunas muestras de vino analizadas se

percibió cómo, además de los cuatro picos correspondientes a las 4

ocratoxinas estudiadas, aparecían otros no interferentes. Utilizar

durante la extracción columnas de inmunoafinidad especificas para la

OTA, y durante el análisis por HPLC longitudes de onda de emisión y

excitación de fluorescencia propias de los compuestos estudiados, hizo

suponer que esos picos podrían corresponder a otras ocratoxinas.

Debido a que los esteres de la ocratoxina B también han sido

descritos como compuestos producidos naturalmente por Aspergillus

DISCUSIÓN

- 179 -

ochraceus (Steyn, 1971; Steyn y Holzapfel, 1967a), se probó la síntesis

de sus etil y metil ésteres por el mismo procedimiento por el que la OTC

y la MeOTA se sintetizaron a partir de la OTA. De la misma manera, se

sintetizaron los metil y etil ésteres de la ocratoxina α. Las disoluciones

obtenidas de estos compuestos se cromatografiaron en las condiciones

del método para comprobar sus tiempos de retención.

Los tiempos de retención de la ocratoxina alpha y sus ésteres en las

condiciones analíticas empleadas resultaron ser 2,7, 8,9 y 14,2 min. Sin

embargo, se comprobó que no eran retenidos por las columnas de

inmunoafinidad utilizadas, por lo que no pueden aparecer en los

cromatogramas a partir de muestras de vino.

El metil y etil éster de la ocratoxina B tienen tiempos de retención

de 14,3 y 17 minutos, respectivamente que coinciden con picos que

aparecen en los cromatogramas de las muestras. No interfieren en el

análisis de OTB, OTA, MeOTA y OTC y son retenidos por las columnas de

inmunoafinidad empleadas. Además, en el estudio de confirmación de la

presencia de las ocratoxinas en las muestras por LC-MS se obtuvieron,

para los picos a estos tiempos de retención, los espectros de masas

característicos de estos compuestos.

No se encontraron en la bibliografía los coeficientes de absortividad

molar de MeOTB y EtOTB, por lo que no pudieron prepararse patrones

de concentración conocida para la validación.

Se decidió calcular las concentraciones aproximadas de estos

compuestos en las muestras suponiendo un comportamiento analítico

semejante a sus análogos de la ocratoxina A. Así, se utilizaron las

rectas, recuperación, LC y LD obtenidos para la MeOTA para la

cuantificación de la MeOTB, y los de la OTC para la EtOTB.

DISCUSIÓN

- 180 -


La detección por espectrometría de masas requiere flujos menores

que el utilizado en el método por HPLC-FLD desarrollado. Aunque los

equipos permiten la utilización de hasta 1 mL·min-1, se recomiendan

flujos más bajos para una mejor ionización en la fuente electrospray

(ESI).

Tener en cuenta las fórmulas teóricas para la transferencia de

métodos permite la optimización de las nuevas condiciones en menor

tiempo y aporta un conocimiento anticipado de los posibles resultados.

El flujo y el volumen de inyección se redujeron a 0,2 mL·min-1 y

20 µL, respectivamente. Para ello, se utilizó una columna de diámetro

interior de 2,1 µm en vez de la de 4,6 µm utilizada en HPLC-FLD. Y, a su

vez, para mantener la eficacia de la separación y emplear menores

tiempos de retención, se eligió una columna de menor longitud y

diámetro de partícula, 5 cm y 3,5 µm, respectivamente.

Con la relación teórica se pueden obtener

los nuevos tiempos del gradiente de fase móvil. Sin embargo, al no

cambiar solo la longitud de la columna sino también el diámetro interior

y de partícula, se necesitó una optimización de las condiciones. Ésta se

llevó a cabo en un equipo HPLC 1200 con detector de fluorescencia, ya

que su manejo es más sencillo que los detectores de masas a utilizar

(MS-IT y MS-TOF) y las condiciones de fluorescencia son conocidas.

Además, este modelo de HPLC era similar al acoplado tanto a la trampa

de iones como al TOF, lo que permite transferir de manera muy sencilla

esta optimización previa a cualquiera de los dos equipos de masas.

La utilización de los dos detectores de espectroscopía de masas

permite una confirmación inequívoca de la presencia de las 6

ocratoxinas en muestras de vino tinto. En el TOF, el m/z [M+H]+

DISCUSIÓN

- 181 -

extraído con cuatro decimales para cada ocratoxina en disoluciones

patrón coincide con los de muestras de vino contaminadas

naturalmente, a los mismos tiempos de retención.

La trampa iónica además de aislar el mismo m/z que en el TOF, en

un intervalo de tiempo concreto, ofrece los espectros de masas de los

compuestos encontrados. Las áreas de cada pico en el cromatograma de

ion extraído (EIC), tanto de muestras como de patrones, se obtienen por

la abundancia de tres iones de fragmentación característicos de cada

compuesto, lo que ofrece cinco puntos de confirmación. Los fragmentos

utilizados coinciden con los descritos por otros autores (Reinsch y col.,

2005; Tabata y col., 2008b; Nielsen y Smedsgaard, 2003).

Por lo tanto, en este trabajo y por primera vez, se ha puesto a

punto un método analítico por cromatografía de líquidos y detección de

fluorescencia capaz de cuantificar simultáneamente 6 ocratoxinas (OTA,

OTB, MeOTA, OTC, MeOTB y EtOTB) en vino tinto.

DISCUSIÓN

- 183 -

2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

El método analítico desarrollado fue validado para la cuantificación

simultánea de OTB, OTA, MeOTA y OTC en muestras de vino tinto y

cumplió los objetivos establecidos para los criterios de selectividad,

linealidad, precisión, exactitud, recuperación, límite de detección, límite

de cuantificación, robustez y estabilidad.

SELECTIVIDAD

La selectividad del método se ha favorecido con la especificidad de

las columnas de inmunoafinidad usadas en el proceso de extracción, la

separación cromatográfica y el uso de un detector de fluorescencia, con

longitudes de onda de excitación y emisión características para estos

compuestos.

El uso de columnas de inmunoafinidad en el proceso de extracción

de la ocratoxina A de cualquier matriz es un método ampliamente

utilizado, debido a su especificidad. El hecho de que las CIA retengan no

solo la OTA, sino también sus compuestos análogos, ha supuesto una

gran ventaja en esta investigación, pero puede ser inconveniente en

otras aplicaciones en las que no se haya comprobado la selectividad del

método para las otras ocratoxinas.

Los tiempos de retención de las ocratoxinas, coincidentes entre

patrón y muestra sirven para la confirmación de la identidad de los

analitos. Además, se ha comprobado que los picos de muestras

fortificadas no presentan hombros ni deformaciones.

Los parámetros de resolución cromatográfica estudiados aseguran

también la selectividad, demostrando que el alto factor de concentración

aplicado a las muestras de vino no causa interferencias debidas a la

matriz.

DISCUSIÓN

- 184 -

El factor de capacidad k’ determina la retención de un soluto. Para

que la selectividad no se vea comprometida, el primer compuesto de

interés debe eluir al menos dos veces el tiempo muerto (Decisión

2002/657/CE). Esto es k’>1, valores mayores de 2 aseguran una óptima

resolución (AEFI, 2001). Como se observa en la tabla 29, el menor valor

de este factor lo da el compuesto menos retenido, la OTB, y es cercano

a 5.

Todos los compuestos tienen un factor de simetría próximo a 0,9,

menos la OTB (0,78) que es el compuesto más influenciado por la

matriz. Como norma general, el factor de asimetría debería encontrarse

entre 0,8 y 1,5 (AEFI, 2001).

El número de platos teóricos (N) es una medida de la eficacia del

sistema. Aunque existen varias fórmulas para determinarlo, se basa en

la relación entre el tiempo de retención y la anchura del pico y en

general, se recomiendan valores superiores a 2.000 (AEFI, 2001). Para

todos los compuestos se han obtenido valores de N superiores a 5.000.

La resolución (Rs) es la medida de la separación entre dos picos. Un

valor de 1,5 representa una separación hasta la línea base de picos de

tamaño similar (AEFI, 2001). OTA y OTC presentan una muy buena

separación con valores de 2,3 y 9,5 respectivamente. El valor de 1,4 de

OTB y MeOTA se debe a la presencia de picos cercanos con tamaño muy

diferente, que no afectan a la cuantificación.

LINEALIDAD

Se han cumplido todos los objetivos establecidos para verificar la

linealidad:

Los coeficientes de correlación (r) y determinación (r2) son

superiores a 0,999 en las doce rectas de calibración.

DISCUSIÓN

- 185 -

El test t de Student muestra que las pendientes son

estadísticamente diferentes de cero y sus intervalos de confianza al 95%

no incluyen al cero. Por el contrario, los intervalos de confianza de las

ordenadas en el origen incluyen el cero (p=0,95).

El coeficiente de variación de los factores respuesta es inferior al

5%, excepto para las rectas de niveles inferiores (0,1 a 1 µg·L-1), en las

que se ha aceptado un 10%. De los valores obtenidos, se deduce que

esta mayor variabilidad en las rectas de concentraciones menores se

debe a la menor respuesta del extremo más bajo (0,1 µg·L-1), límite de

cuantificación, para el que se han admitido errores relativos mayores.

El test de Cochran indica que la concentración no influye en la

variabilidad de los resultados (las varianzas de los factores respuesta

son homogéneas). Para ello, la G calculada tiene que ser menor que la G

tabulada, Gtab (α=0,05, k=5, n=3) = 0,68. Se cumple en todas las

rectas, salvo en la del intervalo de concentraciones más pequeñas de

OTA (0,1-1 µg·L-1) y por la misma razón que en el caso anterior, es

decir, la variabilidad al nivel de concentración 0,1 µg·L-1.

La representación de los residuales exhibe una distribución de los

puntos al azar y no refleja ninguna tendencia. La normalidad (p>0,05)

se cumple para todas las rectas, excepto en las rectas a niveles bajos de

concentración MeOTA y OTC. En estos casos, el test no paramétrico de

regresión robusta de Kendall-Theil arroja la misma conclusión y valores

muy similares de pendiente y ordenada en el origen que los obtenidos

con el test t de Student.

En todos los casos, el test significativo del ANOVA (p<0,001)

prueba la dependencia lineal del área respecto de la concentración.

Se han obtenido adecuados valores de precisión y exactitud de la

linealidad, ya que los coeficientes de variación y error relativo obtenidos

del estudio de repetibilidad (n = 3) y precisión intermedia (n = 9) son

DISCUSIÓN

- 186 -

inferiores al 10% para las 4 ocratoxinas. En el caso de la concentración

más baja de 0,1 µg·L-1 se han aceptado, y obtenido, valores menores al

15%.

RECUPERACIÓN

La exactitud y precisión del método analítico, expresadas como

recuperación y coeficiente de variación respectivamente, se evaluaron

en todo el intervalo de concentración estudiado (0,0005-2 µg·L-1),

fortificando muestras de vino tinto a 5 niveles de concentración.

Los estudios de repetibilidad (1 día, n = 15) y de precisión

intermedia (3 días, n = 45) muestran valores semejantes de

recuperación para cada una de las ocratoxinas. Todos los valores están

dentro del intervalo 50-120% recomendado para la ocratoxina A por el

Reglamento (CE) Nº 401/2006 por el que se establecen los métodos de

muestreo y análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas

en los productos alimenticios. Concretamente, los valores encontrados

oscilan entre 73,4 y 93,5%. Asimismo, el coeficiente de variación es

inferior al 20% en todos los casos (entre el 4,8 y el 16 %).


Se ha obtenido experimentalmente un límite de cuantificación de

0,5 ng·L-1 para todas las ocratoxinas, considerando la mínima cantidad

de analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada

exactitud (recuperación entre 50-120%) y precisión (CV% < 20%)

(AEFI, 2001). Para una concentración de 0,5 ng·L-1 de cada ocratoxina

en vino tinto fortificado, el valor de recuperación ha sido superior al

65,7% y la precisión menor del 18,8% para todas ellas.

Los límites de detección, calculados a partir del procedimiento

explicado en el apartado Material y métodos, han resultado ser 0,32,

DISCUSIÓN

- 187 -

0,16, 0,27 y 0,17 ng·L-1 para OTB, OTA, MeOTA y OTC,

respectivamente.

Tanto el límite de cuantificación, como los límites de detección

obtenidos en este trabajo, son los más bajos encontrados en la

literatura para la cuantificación de ocratoxina A en muestras de vino

tinto. Los límites de cuantificación descritos hasta ahora están dentro del

intervalo 0,001 – 0,5 µg·L-1, y los de detección entre 0,0006 y 0,2 µg·L-1

(ver tabla 3 de la Introducción).

ROBUSTEZ

El estudio de robustez se ha llevado a cabo con el objetivo de

controlar los factores que pueden afectar a la cuantificación de las

ocratoxinas.

El pH de la muestra antes de su paso por las columnas de

inmunoafinidad considerado es un punto importante para evitar la

pérdida de OTA en la cuantificación (Castegnaro y col., 2006). Por ello,

se estudió la robustez del método a tres pH diferentes: 6,8, 7,2 y 7,6.

Los valores de recuperación próximos entre sí y los bajos coeficientes de

variación obtenidos demuestran que el método es robusto a este

cambio.

El método permite un volumen de inyección de 20 µL en caso de no

haber muestra suficiente o tener que repetir un análisis. Se obtiene un

error relativo inferior al 5% al corregir la concentración teniendo en

cuenta la dilución.

ESTABILIDAD

La estabilidad de la ocratoxina A en metanol a -20ºC ha sido

descrita anteriormente (Valenta, 1998). Sin embargo, no se tenían

DISCUSIÓN

- 188 -

datos de las otras ocratoxinas y se temía por la estabilidad y posible

transesterificación de los ésteres.

La disoluciones de calibración de 4, 40 y 400 µg·L-1, preparadas en

metanol como se indica en Material y métodos, de las 4 ocratoxinas

juntas y conservadas en congelación, han resultado estables durante al

menos un año. El pequeño aumento de la concentración de las

disoluciones desde el momento de su preparación hasta los 12 meses

sugiere posibles pérdidas ocasionadas por evaporación del disolvente al

almacenar estas disoluciones, pero este hecho no ha afectado a la

exactitud de la cuantificación.

La estabilidad de los analitos disueltos en fase móvil en el inyector

del HPLC a temperatura ambiente, a dos concentraciones diferentes,

tanto de patrón como después de la extracción de muestras de vino

fortificadas, ha quedado demostrada. Tomando como criterio un error

relativo inferior al 5% con respecto a la concentración inicial, las 4

ocratoxinas han resultado estables durante al menos 21,5 h. Se observa

una mayor estabilidad en las disoluciones obtenidas a partir de vino

fortificado, que llega a ser de 45 h, con la concentración superior.


Se ha garantizado el perfecto funcionamiento del equipo durante el

análisis de las muestras analizando patrones de calibrado de ocratoxinas

a la vez que los extractos de vino tinto. La exactitud de todos los

patrones ha mostrado un error relativo inferior al 10% de las

concentraciones ensayadas.

DISCUSIÓN

- 189 -

3. TRANSFORMACIÓN DE OTC EN OTA

La concentración de ocratoxina C en el vino disminuye con el tiempo

mientras que la de OTA aumenta, incluso hasta hacerse prácticamente

iguales. Esto sugiere que la OTC se hidroliza a OTA y el equilibrio se

desplaza hacia la forma no esterificada, en presencia de agua.

Estadísticamente, a los dos meses la concentración de OTC

comienza a ser significativamente muy diferente con respecto al valor

inicial, tanto en el caso de la fortificación a 0,5 µg·L-1 como en el de a

2 µg·L-1. Para la OTA, esta diferencia se muestra a las 4 semanas.

Si la OTC estuviera presente en el vino como contaminante fúngico

natural, con el tiempo podría transformarse en OTA. Esto hace necesario

determinar las concentraciones de ambas ocratoxinas para cumplir con

los niveles máximos permitidos y evitar subestimar la ingesta total de

ocratoxina A.

DISCUSIÓN

- 191 -

4. PRESENCIA DE OCRATOXINAS EN VINOS

NAVARROS

VINOS DE AGRICULTURA TRADICIONAL

Los 35 vinos de agricultura tradicional con D.O. Navarra, adquiridos

en comercios navarros, se clasificaron en base al año de la vendimia.

Así, en 3 muestras no está especificada, 7 son vinos jóvenes de la

cosecha 2006, 15 son del 2007 y 10 son vinos crianza del 2004.

Con el test estadístico de Kruskal-Wallis se estudió la influencia del

año de cosecha y del proceso de crianza en las concentraciones

encontradas de las 6 ocratoxinas.

Las concentraciones medianas de OTB, OTA, OTC y EtOTB

encontradas no difieren estadísticamente entre los vinos tintos de las

cosechas 2006 y 2007, ni tampoco con los crianzas del 2004. Otros

autores también confirman que el proceso de crianza no afecta a los

niveles de OTA en el vino (Bellí y col., 2004; Quintela y col., 2011). Sin

embargo, López de Cerain y col. (2002) encontraron diferencias entre

los niveles de OTA de los vinos de 1997 y 1998, posiblemente debidas a

las diferentes condiciones climáticas de ambos veranos (López de Cerain

y col., 2002).

Con respecto a los metil ésteres de las ocratoxinas A y B, las

diferencias son altamente significativas. Las concentraciones de vinos

jóvenes de 2006 y 2007 no difieren entre sí, pero sí lo hacen con los

vinos de crianza. Esto puede ser debido a la baja concentración e

incidencia (mediana < LC) encontradas para estas micotoxinas en el año

2004.

DISCUSIÓN

- 192 -

VINOS DE AGRICULTURA ECOLÓGICA

Los 16 vinos de agricultura ecológica analizados han sido

suministrados por siete bodegas navarras y provienen de las cosechas

2007 y 2008. Todas ellas están inscritas como elaboradores de

productos ecológicos en el Consejo de la Producción Agraria Ecológica de

Navarra (CPAEN).

Al igual que para los vinos tradicionales se han comparado los

niveles de ocratoxinas entre las cosechas de los dos años. Las

concentraciones medianas de las seis ocratoxinas son menores en 2008

que en el año anterior, pero solo se han encontrado diferencias

significativas en el caso de OTB y MeOTA.

PRESENCIA SIMULTÁNEA DE OCRATOXINAS EN VINOS NAVARROS

Los bajos límites de detección y cuantificación obtenidos con el

método analítico han permitido demostrar la presencia simultánea de

varias ocratoxinas en vinos tintos navarros. Todas las muestras están

contaminadas con al menos 3 ocratoxinas. Así, la OTA va acompañada

de la OTB en el 100% de las muestras, y ambas van acompañadas a su

vez de 1, 2, 3 ó 4 de los ésteres estudiados. De los 51 vinos navarros

analizados, en 10 hay niveles de 3 ocratoxinas por encima del límite de

detección (19,6%), 4 aparecen en 16 vinos (31,4%), 5 en 16 (31,4%),

y las seis estudiadas aparecen simultáneamente en 9 (17,6%).

Las concentraciones de OTA media y mediana encontradas en los

51 vinos navarros fueron 15,9 y 5,30 ng·L-1, respectivamente, valores

mucho más bajos que los 2 µg·L-1 permitidos por la UE en vino. Además,

ninguna muestra ha superado este valor.

La concentración media de OTA encontrada por otros autores en

vinos de La Rioja (0,035 µg·L-1) (Quintela y col., 2011) es similar a los

DISCUSIÓN

- 193 -

valores descritos en este estudio. Sin embargo, vinos tintos analizados

en regiones más al sur de España parecen tener mayores valores de

esta micotoxina (0,25 µg·L-1) (Blesa y col., 2004).

Las concentraciones medianas de 7,17 y 5,30 ng·L-1 obtenidas para

OTB y OTA confirma la hipótesis de que la OTA va acompañada de la

OTB en alimentos y que su presencia e incidencia son similares (EFSA,

2006).

Zimmerli y Dick describieron la presencia simultánea de OTA y OTC

en vino, sin embargo, no se han llevado a cabo más estudios al

respecto. En este estudio, la OTC aparece en el 71% de las muestras de

vino tinto y su concentración mediana (0,42 ng·L-1) verifica que su nivel

es aproximadamente el 10% del de la ocratoxina A (Zimmerli y Dick,

1996).

INFLUENCIA DEL TIPO DE CULTIVO EN LA PRESENCIA DE OCRATOXINAS

Con el objetivo de observar si las prácticas ecológicas tienen

influencia en los niveles de ocratoxinas se han comparado las muestras

de los 35 vinos tradicionales y los 16 orgánicos.

Las concentraciones medianas de las 6 ocratoxinas son menores en

los vinos tintos de agricultura ecológica y hay diferencias significativas

en el caso de la OTA y MeOTB. Chiodini y col. (2006) analizaron 44 vinos

tintos, rosados y blancos de diferentes orígenes geográficos y obtenidos

tradicional y orgánicamente. Tratando en conjunto los diferentes tipos

de vinos, concluyeron que las concentraciones de OTA en vinos

ecológicos y tradicionales no difierían significativamente, pero no

efectuaron ninguna conclusión al considerar vinos tintos únicamente

(Chiodini y col., 2006).

DISCUSIÓN

- 194 -

Miceli y col. (2003) también mencionan que la concentración de

ocratoxina A en vinos tintos ecológicos es menor, sin embargo solo

analizaron 6 vinos con esta característica y 9 tradicionales (Miceli y col.,

2003).

Si se considera la suma total de las concentraciones de las 6

ocratoxinas presentes en cada vino, también se observan diferencias

significativas, siendo menor la concentración mediana en vinos

ecológicos. Al igual que ocurre con la ocratoxina A, la media de las

concentraciones es superior en el caso de los vinos ecológicos. Esto es

debido a que el mayor valor de OTA encontrado en los 51 vinos

(142 ng·L-1) corresponde a un vino ecológico.

INGESTA DE OTA Y OCRATOXINAS A PARTIR DE

VINO TINTO NAVARRO

El conocimiento sobre la presencia de micotoxinas en alimentos y el

desarrollo de métodos analíticos sensibles que lo permitan, cobran

especial importancia al hablar de seguridad alimentaria y evaluación del

riesgo para la población.

Según el informe relativo a la evaluación de la ingesta diaria de

Ocratoxina A por la población de los Estados miembros de la UE

(SCOOP, 2002) y el Comité mixto FAO/WHO de expertos en aditivos

alimentarios (JECFA, 2001), el vino representa en Europa la segunda

fuente de ingesta de OTA, detrás de los cereales. La ingesta media

diaria de OTA en España a través del vino tinto, publicada en el informe

SCOOP, es de 0,03 ng·kg p.c.-1·día-1 (SCOOP, 2002).

Para establecer la exposición a ocratoxinas en Navarra a través del

consumo de vino, se calculó la ingesta semanal de OTA y de ocratoxinas

totales en base a las concentraciones media y máxima de OTA (15,9 y

142 ng·L-1, respectivamente) y de la suma total de las 6 ocratoxinas

DISCUSIÓN

- 195 -

(30,1 y 200 ng·L-1, respectivamente), obtenidas de los 51 vinos con

D.O. Navarra.

La ingesta semanal media de OTA y ocratoxinas es inferior a 1

ng·kg p.c.-1 en los tres grupos de consumidores estudiados. En el peor

caso, hombres consumidores de vino con la mayor contaminación, la

ingesta semanal es de 4,70 y 6,61 ng·kg p.c.-1 para la ocratoxina A y la

suma total de ocratoxinas, respectivamente. Considerando la ingesta

semanal tolerable provisional de OTA establecida por la JECFA en 2007

de 100 ng·kg p.c.-1, los valores calculados contribuyen un 4,7 y 6,6% a

esta exposición.

Con los bajos niveles encontrados, el consumo de vino no parece

ser un factor de riesgo importante en la ingesta de ocratoxina A para los

consumidores navarros. Sin embargo, también se ha demostrado en

este estudio que la ingesta de ocratoxinas se infravalora si se calcula

solamente con el análisis de OTA en vino.

Para evaluar el riesgo real para el consumidor de la presencia

simultánea de ocratoxinas en alimentos, son necesarios más estudios en

relación a su presencia conjunta en otras matrices y estudios de su

toxicidad combinada.


Los estadísticos de correlación de Spearman obtenidos para los

pares de ocratoxinas OTA-OTB y OTB-EtOTB, de 0,561 y 0,427

respectivamente, muestran una relación moderada positiva entre sus

concentraciones. El valor de 0,849 obtenido para OTA y OTC describe

una asociación muy elevada entre ambas.

Esto refleja que cuanto mayor sea la concentración de ocratoxina A

mayor será también la presencia de las otras ocratoxinas, por lo que

será necesario extender la vigilancia y control a estas últimas.

DISCUSIÓN

- 196 -

OCRATOXINAS Y CLIMA

La contaminación fúngica de las uvas en el campo depende de las

condiciones climáticas. Algunos trabajos han estudiado la infección de

Aspergillus en relación a las temperaturas máximas, mínimas y medias

del mes anterior a la recogida de muestra, la humedad relativa y las

precipitaciones. Bellí y col. revelaron una significativa correlación

positiva con las temperaturas y no encontraron correlación ni con la

humedad ni con las precipitaciones (Bellí y col., 2006).

Visto que las concentraciones de ocratoxinas en el vino pueden

variar entre cosechas, se estudió la relación de las condiciones

meteorológicas con los niveles encontrados. En general, aparecen

relaciones moderadas entre las variables.

Las concentraciones de ocratoxina A y C tienen una asociación

positiva moderada con la temperatura media de los meses de julio y

agosto anteriores a la vendimia, mientras que no existe relación para las

demás ocratoxinas. La correlación es negativa con la humedad para

OTA, MeOTA, OTC y MeOTB. También es negativa para la precipitación,

en el caso de OTA, MeOTA y MeOTB. La ocratoxina B y su etil éster no

muestran asociación con los datos climatológicos.

Esto coincide con la hipótesis de que la frecuencia y concentración

de OTA sea mayor en climas cálidos del sur de Europa (Brera y col.,

2008; Blesa y col., 2006; Otteneder y Majerus, 2000; Mateo y col.,

2007). Cuanto mayor sea la temperatura del verano anterior a la

vendimia, y menores las precipitaciones y el porcentaje de humedad

relativa, mayores podrían ser las concentraciones de ocratoxina A en el

vino.

DISCUSIÓN

- 197 -

5. OCRATOXINAS EN VINOS DE PAÍSES

MEDITERRÁNEOS

Diversos trabajos han concluido que los vinos de los países del Sur

de Europa son más susceptibles de contaminación por ocratoxina A

debido al clima cálido, tipo mediterráneo (Brera y col., 2008; Blesa y

col., 2006; Otteneder y Majerus, 2000; Mateo y col., 2007).

No se ha publicado nada acerca de la presencia de los análogos de

OTA en los vinos producidos en esta región. Con el objetivo de estudiar

de manera novedosa la presencia simultánea de seis ocratoxinas en el

vino de los países ribereños del mediterráneo se analizaron vinos tintos

de 9 países de la región mediterránea: España, Francia, Italia, Croacia,

Grecia, Turquía, Israel y Túnez y Argelia.

VINOS DE ESPAÑA

Dentro de todas las denominaciones de origen de vino tinto de

España se ha elegido Cataluña como zona de clima típicamente

mediterráneo.

Los 12 vinos catalanes analizados están contaminados con al menos

4 ocratoxinas con niveles superiores al límite de detección. De los 12

vinos de Cataluña analizados, en 8 (66,7%) aparecen las 6 ocratoxinas

de manera simultánea, en 3 (25%) están presentes 5 y en 1 muestra

(8,3%) aparecen 4.

Con respecto a la ocratoxina A, se obtuvieron concentraciones entre

1,05 y 104 ng·L-1, con una media de 37,2 ng·L-1. Este valor es similar al

descrito por Burdaspal y Legarda en vinos tintos españoles de

0,038 µg·L-1, aunque su nivel máximo es superior (0,603 µg·L-1)

(Burdaspal y Legarda, 1999).

DISCUSIÓN

- 198 -

Bellí y col. (2004) analizaron 20 vinos tintos jóvenes catalanes

(D.O. Penedés y Costers del Segre) y encontraron 3 muestras por

encima del límite de detección (0,05 µg·L-1) con valores entre 0,06 y

0,69 µg·L-1, superiores a los obtenidos en este estudio.

VINOS DE FRANCIA

Todos los vinos franceses están contaminados con ocratoxina B y al

menos otra ocratoxina. Un vino con D.O. Beaujolais es el único de todo

el estudio que no ha resultado contaminado con OTA (< 0,16 ng·L-1),

este vino tampoco contiene OTC o los ésteres de la OTB, en él solo

están presentes la OTB y MeOTA.

Las 6 ocratoxinas aparecen de manera simultánea en 3 vinos tintos

(25%), 2 muestras tienen 5 (16,7%), tres vinos presentan 4 y 3

ocratoxinas respectivamente (25%).

El intervalo de concentraciones de ocratoxina A en las muestras

positivas va de 0,20 a 88,3 ng·L-1. La media es de 33,6 ng·L-1 y la

mediana de 3,56 ng·L-1. Otros autores encuentran valores medios

similares: 0,038 µg·L-1 (Rosa y col., 2004), 0,070 µg·L-1 (Otteneder y

Majerus, 2000) o superiores 0,225 µg·L-1 (Burdaspal y Legarda, 1999)

en vinos franceses.

VINOS DE ITALIA

Los 12 vinos italianos están contaminados por al menos 5 de las

ocratoxinas estudiadas. Las 6 aparecen de manera simultánea en 5

muestras (41,7%).

Italia es el país en el que más se ha estudiado la presencia de

ocratoxina A en vinos, y uno de los que ha ofrecido valores más altos de

contaminación, cerca de los 8 µg·L-1 (Brera y col., 2008; Visconti y col.,

1999).

DISCUSIÓN

- 199 -

Los valores encontrados en este estudio van de 5,18 a 286 ng·L-1

(media 53,9 ng·L-1, mediana 20,0 ng·L-1) y son inferiores a los

encontrados por otros autores (Castellari y col., 2000; Aresta y col.,

2006; Campone y col., 2011; Dall'Asta y col., 2004; Pietri y col., 2001;

Brera y col., 2005; Perrone y col., 2007; Spadaro y col., 2010). Solo

Bacaloni y col. (2005) describen valores similares con una media de

0,031 µg·L-1 en 36 de 43 muestras positivas (Bacaloni y col., 2005).

VINOS DE CROACIA

Solo en un vino croata (8,3%) están presentes las 6 ocratoxinas de

manera simultánea. En 6 muestras (50%) aparecen 5, en 1 cuatro

(8,3%) y en 4 vinos (33,3%) hay al menos 3 ocratoxinas.

Los valores máximos de OTB, OTA, MeOTA y OTC encontrados en

este país son los más bajos en comparación con el resto de países

estudiados, por lo que parece que los vinos croatas son los menos

contaminados por estas micotoxinas. En el caso de los ésteres de la

ocratoxina B, son los segundos con una concentración máxima menor.

Las concentraciones de ocratoxina A van de 0,36 a 61,3 ng·L-1 con

una media de 18,8 ng·L-1. Esta media es similar a la descrita por

Domijan (22 ng·L-1) y Flajs (15 ng·L-1), aunque el valor máximo de este

estudio es algo superior a los encontrados por estos autores; de 47 y

21 ng·L-1 (Flajs y col., 2009; Domijan y Peraica, 2005).

VINOS DE GRECIA

Diez de los doce vinos griegos están contaminados por las 6

ocratoxinas estudiadas y en los dos restantes no aparece la MeOTA.

Los valores de ocratoxina A encontrados van de 4,35 a 212 ng·L-1,

con una media y mediana de 59,4 y 31,7 ng·L-1 respectivamente.

Stefanaki y col. (2003) analizan 104 muestras de vino tinto griego,

DISCUSIÓN

- 200 -

encontrando 71 positivas con una media de 0,34 µg·L-1 (mediana =

0,09 µg·L-1, máximo 2,69 µg·L-1). Estos autores apuntan, además, un

gradiente de concentración Norte-Sur en Grecia, obteniendo mayores

concentraciones en las islas del mar Egeo (Stefanaki y col., 2003). El

presente estudio tiene pocas muestras para confirmar esta hipótesis, sin

embargo los dos valores más altos de OTA encontrados aparecen en

vinos originarios de esta región.

VINOS DE TURQUÍA

Todos los vinos de Turquía están contaminados por OTB, OTA, OTC,

MeOTB y EtOTB. Además en 5 muestras (41,7%) aparece también la

MeOTA, con la que estarían presentes las 6 ocratoxinas de manera

simultánea.

Los valores de ocratoxina A en los vinos turcos están dentro del

intervalo 2,91 a 101 ng·L-1 (media, 31,1 ng·L-1; mediana, 20,5 ng·L-1).

Las concentraciones medias de otros autores son superiores a estos

valores (Altiokka y col., 2009; Anli y col., 2005; Var y Kabak, 2007). En

el estudio de Altiokka y col. se encuentra un valor de OTA de incluso

7,96 µg·L-1.

VINOS DE ISRAEL

Ocho muestras de vino de Israel (66,7%) están contaminadas con

las 6 ocratoxinas estudiadas, y en 4 vinos (33,3%) aparecen todas ellas

a excepción de la EtOTB.

El intervalo de concentraciones de ocratoxina A en las muestras va

de 3,63 a 65,4 ng·L-1. La media es 18,5 ng·L-1 y la mediana, 11,7 ng·L-1.

No se han encontrado en la bibliografía estudios sobre la presencia de

OTA en vinos de este país.

DISCUSIÓN

- 201 -

Las concentraciones medianas de MeOTA y MeOTB (1,73 y

2,93 ng·L-1, respectivamente) son estadísticamente superiores a las de

los otros países mediterráneos.

VINOS DEL NORTE DE ÁFRICA

Se han analizado 7 vinos de Argelia y 5 de Túnez y las

concentraciones obtenidas se han estudiado en conjunto debido a la

dificultad de obtener 12 muestras de un mismo país.

Las 6 ocratoxinas aparecen juntas en 3 vinos tintos de Argelia y

Túnez (25%), 5 muestras tienen 5 (41,7%), y cuatro vinos presentan 4

ocratoxinas (33,3%).

Todos los vinos presentan OTB, OTA, OTC y EtOTB y sus

concentraciones medianas son estadísticamente superiores a las del

resto de los países estudiados.

Las concentraciones de OTA varían entre 84,4 y 455 ng·L-1, con una

media y mediana de 195 y 171 ng·L-1, respectivamente. Este valor es el

mayor obtenido en este estudio y corresponde a un vino de Túnez de la

región de Muaskar. Los niveles encontrados son similares a los descritos

por Zimmerli y Dick en dos muestras de vino tinto de Argelia y una de

Túnez: 194, 292 y 388 ng·L-1, respectivamente (Zimmerli y Dick, 1996).

No se ha encontrado en la bibliografía más estudios acerca de los

niveles de ocratoxinas en vinos de estos países.



De nuevo, los bajos límites de detección y cuantificación del método

analítico han permitido demostrar, por primera vez, la presencia

simultánea de varias ocratoxinas en vinos tintos de esta zona

geográfica.

DISCUSIÓN

- 202 -

Considerando los valores hallados en los 96 vinos de países

mediterráneos, la OTB, OTA, MeOTA, OTC, MeOTB y EtOTB están

presentes en el 100%, 99%, 62,5%, 89,6%, 83,3% y 83,3% de las

muestras, respectivamente. La concentraciones medias encontradas han

sido de 23,5, 54,2, 5,22, 5,20, 1,85 y 1,37 ng·L-1 respectivamente.

Ningún vino ha superado el límite máximo permitido para la OTA de

2 µg·L-1 establecido por la UE para esta matriz.

El 44,8% de los vinos tintos presenta las 6 ocratoxinas estudiadas

de manera simultánea. Cinco aparecen en un 37,5%, cuatro en un 9,4%

y en un 7,3 y 1,0% de las muestras aparecen 3 y 2, respectivamente.

Las concentraciones medianas de 13,4 y 19,4 ng·L-1 obtenidas para

OTB y OTA de nuevo confirman la hipótesis de que OTA va acompañada

de la OTB en alimentos y que su presencia e incidencia son similares

(EFSA, 2006).

En cuanto a la presencia simultánea de OTA y OTC en las muestras,

la OTC aparece en el 89,6% de ellas y su concentración mediana

(2,32 ng·L-1) supone aproximadamente el 10% de la de ocratoxina A

(Zimmerli y Dick, 1996)

INFLUENCIA DEL PAÍS DE ORIGEN EN LA


En general, las concentraciones obtenidas de cada ocratoxina en

cada país son del mismo orden, por lo que no puede afirmarse que los

niveles dependan del origen geográfico, salvo para el caso de los vinos

de Túnez y Argelia que presentan diferencias significativas con respecto

a los demás para OTB, OTA, OTC y EtOTB. En el caso de los metil

ésteres de la OTA y OTB los niveles son superiores en los vinos de

origen israelí.

DISCUSIÓN

- 203 -

En relación al supuesto de que los vinos del Norte de Europa poseen

menores cantidades de OTA, se han encontrado en la literatura valores

medios de 0,48 y 2,9 µg·L-1 en vinos de Holanda y Rusia,

respectivamente (Czerwiecki y col., 2005; Rusanova y col., 2009). Este

último trabajo solo analiza 7 vinos tintos y encuentra OTA en 3 de ellos,

en un intervalo de 1,8-4,4 µg·L-1, valores muy superiores a los

encontrados en este estudio. Los valores de esta investigación parecen

similares a los encontrados en Hungría (intervalo: 0,03-0,53 µg·L-1,

media: 0,12 µg·L-1) o Eslovaquia (intervalo: < 0,01-0,46 µg·L-1) (Varga

y col., 2005; Belajová y Rauova, 2007). Esto confirma los resultados del

informe SCOOP (2002), donde se apunta que los niveles de ocratoxina A

en vinos originarios del Norte de Europa parecen ser cercanos a los

valores del Sur del continente.

En cualquier caso, hay que indicar que es difícil comparar los

resultados de este estudio con los encontrados en la literatura, debido

sobre todo a los diferentes límites de detección de los métodos

analíticos.


En cuanto a la relación entre la presencia de ocratoxinas, de nuevo

se observan correlaciones altamente significativas. Los valores del

coeficiente de correlación de Spearman obtenidos son superiores a los

del estudio realizado para los vinos navarros, posiblemente debido al

mayor número de muestras. Las concentraciones de OTA-OTB muestran

una asociación muy elevada, con un coeficiente de correlación de 0,897.

Para OTA-OTC la relación es prácticamente perfecta debido al alto valor

del coeficiente de correlación de 0,934 y es grande en el caso de la OTB-

EtOTB (rs = 0,648).

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES

- 207 -

1. Se ha desarrollado un método analítico por HPLC-FLD que ha

permitido, por primera vez, la cuantificación simultánea de 6

ocratoxinas: ocratoxina B, ocratoxina A, metilocratoxina B,

etilocratoxina B, metilocratoxina A y ocratoxina C en vino.

2. La validación del método analítico ha demostrado que presenta

adecuada selectividad, linealidad, exactitud, precisión, recuperación,

límites de detección y cuantificación, estabilidad y robustez para la

cuantificación de estas ocratoxinas en vino. Además, el límite de

detección obtenido para la OTA en esta matriz es el más bajo descrito

hasta ahora en la literatura.

3. Se ha demostrado, por primera vez, la presencia simultánea de

OTB, MeOTB, EtOTB, OTA, MeOTA y OTC, en vinos tintos de Navarra y

de diferentes países que circundan el Mediterráneo. Además, en este

trabajo se ha evidenciado que la OTC se transforma en OTA en el vino.

Todo esto indica que la ingesta de ocratoxinas a través de esta matriz se

infravalora si se tienen en cuenta únicamente los niveles de OTA.

4. En relación a los vinos navarros, la OTA va acompañada de la

OTB en el 100% de las muestras analizadas. En un 71% aparece

además la OTC. Las 6 ocratoxinas aparecen simultáneamente en el

17,6% de las muestras.

5. En los vinos navarros, no se han observado diferencias

significativas en la presencia de ocratoxinas en cuanto al año de

cosecha. Se obtienen menores niveles de ocratoxina A y de ocratoxinas

totales en vinos tintos de agricultura ecológica.

6. Las concentraciones de ocratoxina A y C tienen una asociación

positiva moderada con la temperatura, mientras que no existe relación

para las demás ocratoxinas. La correlación es negativa con la humedad

para OTA, MeOTA, OTC y MeOTB. También es negativa para la

CONCLUSIONES

- 208 -

precipitación, en el caso de OTA, MeOTA y MeOTB. La ocratoxina B y su

etil éster no muestran asociación con los datos climatológicos.

7. En el caso de los vinos de países mediterráneos, la OTA va

acompañada de la OTB prácticamente en el 100% de las muestras

analizadas. En un 90%, aparece además la OTC.

8. En general, los vinos tintos de España, Francia, Italia, Croacia,

Grecia, Turquía e Israel presentan niveles de ocratoxinas del mismo

orden, por lo que no puede afirmarse que los niveles dependan del

origen geográfico, salvo para el caso de los vinos de Túnez y Argelia que

presentan diferencias significativas con respecto a los demás para OTB,

OTA, OTC y EtOTB

9. Por los resultados obtenidos en este estudio, no se puede afirmar

que los niveles de ocratoxina A en los vinos de países del sur de Europa

sean mayores que los descritos en países del norte de Europa, lo que

coincide con los resultados del informe SCOOP en 2002.

10. Se ha encontrado una asociación estadística muy elevada para

la presencia conjunta de OTA-OTB y OTA-OTC en el vino tinto. Las

concentraciones de OTB-EtOTB también muestran una relación

significativa, aunque en este caso el coeficiente de correlación es menor.

11. Dado que se ha demostrado la presencia conjunta de varias

ocratoxinas en el vino, y con el fin de evaluar el riesgo real para el

consumidor, sería necesario realizar estudios de su toxicidad combinada

así como de su presencia en otras matrices.

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