Patch clamp : étude des

canaux ioniques

Mathieu SCHMITT

http://www.ipmc.cnrs.fr/~duprat/neurophysiology/images/pipette.jpg

Pour la science n°175 Mai 1992: la technique du patch clamp

Technique électrophysiologique permettant l’étude

biophysique et biomoléculaire des canaux ioniques

Neher et Sakmann 1981: mise au point des techniques de patch clamp.

Prix Nobel de médecine en 1991

Intérêt du patch clamp

Dépression dans la

pipette

Forte résistance

Isolement du fragment

(formation du seal)

Possibilités :

- Potentiel imposé

- Enregistrement de courants unitaires ou macroscopiques

Concept du patch clamp

Pour la science n°175 Mai 1992: la technique du patch clamp

Micromanipulateur sur table

anti-vibration sur coussin

d’air et cage de faraday

Micropipette de 200-300 µm et

pointe de 1 µm et tige d’argent

Dispositif expérimental

(étude d’un canal, conservation

milieu intracellulaire)

Configurations membranaires

Inside-out

(étude de tous les canaux, milieu

intracellulaire non préservé)

Oustide-out

Cellule entière

Cellule attachée

http://butler.cc.tut.fi/~malmivuo/bem/bembook/04/04x/0427x.htm

Etudes des canaux ioniques

Maintien du potentiel de membrane Activation des canaux

Technique du potentiel imposé

http://nicholas.boulais.free.fr/website/BOULAIS%20Neurophysiologie%20Sensorielle%201.pdf

R : résistance membranaire (Ohm)

V: potentiel électrique (volt)

I: courant ionique (ampère)

G : conductance (Siemens)

γ : conductance (Siemens)

Eion: Potentiel équilibre de l’ion

Em : Potentiel de membrane

Loi d’Ohm:

U = R x I

courants unitaires

ix = γx x (Em – Ex)

I = g x U

R = 1

g

Mesure de la conductance = facilité des passages des ions

dans le canal

I total = Gx . (Em - Ex)

courants macroscopiques

R: constante des gaz parfaits; R=8,314 V.C.K-1.mol-1

T: température en Kelvin; T=T°c+273

Z: valence de l'ion

F: constante de Faraday; F=96500 C.mol-1

Loi de Nernst

I total = N . Po . ix

I total = N . PO . γx . (Em - Ex)

Mesures électrophysiologiques

3 états: Fermé : canal fermé, pas de courant, ouvert par un stimulus

Ouvert : canal ouvert, passage de courant

Inactivé : fermé non ouvrable qui suit l’état ouvert

plusieurs canaux

Configuration :

• Cellule attachée

• Inside-out

• Outside-out

Déterminer :

-Nombre d’états de conductance

-Vitesse de transition

Modèle cinétique du canal

Traitement

informatique

Courant enregistrés

Courants idéalisés

Analyses des courants unitaires

Electrophysiologie moléculaire I: Technique du patch M.Joffre

Probabilité d’ouverture et de fermeture d’un canal

Pouvert = aire ouvert

aireouvert + airefermé

Pfermé= aire fermé

aireouvert + airefermé

Analyses des courants macroscopiques

Configuration: cellule entière

Plus faible résistance MΩ

Sommation de l’activité des N canaux

Sommation de courant unitaire

Comportement moyen d’un canal

I total = Po . N . ix

= N . PO . γx . (Em - Ex)

- influx de cation

- efflux d’anion

Ex: influx de Ca2+

- influx d’anion

- efflux de cation

Ex: efflux de K+

Dépolarise :

Hyperpolarise:

Configuration : cellule attachée

Mise au point par Horn et Marty en 1988

Formation de pores par la

nystatine ou amphotéricine B

Perméabilise la membrane

Accès électrique à l’espace

intracellulaire donc des courants

de l’ensemble de la membrane

Conserve le milieu

intracellulaire avec les

messagers secondaires

Avantage de la configuration cellule

entière sans dilution du milieu

Patch perforé

Physiologie du neurone D.Trisch. Doin

Changement du milieu extracellulaire:

Analyses des canaux ioniques stimulés par des récepteurs

de la face externe en outside-out (ex : Ach)

Analyse de seconds messagers qui activent ou régulent des

canaux ioniques en inside-out (ex : PKA, AMPc)

Possibilité d’étude sur des tissus (ex : réseau neuronal)

Utilisation de sondes fluorescentes( ex: fura 2) et de molécules photosensibles

Possibilité de changer le milieu intrapipette

Etudes de substances pharmacologiques

Techniques auxiliaires

Exemples d’applications

Epilepsie généralisée avec des

convulsions fébriles (GEFS+)

Epilepsie myoclonique grave de

l'enfance (SMEI).

Activation et inactivation plus

rapides

DII mutation T875M

DIV mutation R1648H

Exemple d’application 1

Le gène SCN1A code pour la sous-unité α

du canal sodique Nav1.1.

Sous-unité du segment S4 du domaine IV

Subtitution des histidines en arginine

Functional Effects of Two Voltage-Gated

Sodium Channel Mutations That Cause

Generalized Epilepsy with Febrile Seizures

Plus Type 2

Jay Spampanato and al. The Journal of

Neuroscience, Octobre 1, 2001, 21 7481-7490

Mucovisidose de Classe IV :

Mutations altérant la conduction

Mutations des régions

transmembranaires des canaux CFTR

Exemple : mutations faux sens dans TM1 et TM2

R117H (Arginine en histidine)

R334W (Arginine en tryptophane)

Exemple d’application 2

Chloride channel and chloride conductance regulator domains of

CFTR, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

Erik M. Schwiebert and al PNAS Mars 3, 1998 vol. 95 no. 5 2674-2679

Technique: Whole-cell

Transfection de cellule

épithélial bronchique IB3-1

Injection d’AMPc

A: Wild-type

B : Δ259-M265V CFTR

C: TMD

Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator–associated ATP

Release Is Controlled by a Chloride Sensor

Qinshi Jiang and al. J Cell Biol. 1998 November 2 : 645–657.

Les CFTR est sélectif pour les

anions Br>Cl>I

Mutation altérant la sélectivité ionique

Technique:

Whole-cell

Transfection d’un oocyte

IBMX

Forskolin

inhibiteur de

phosphodiestérase

Active

adenylate cyclase

↗AMPc

Altération de la cinétique

d’inactivation du canal

Migraine hémiplégique familiale de type 1

Exemple d’application 3

Rôle du canal calcique P/Q dans la migraine hémiplégique familiale

Norbert Weiss and al. MEDECINE/SCIENCES 2007 ; 23 : 53-63

Mutation du gène CACNA1A qui

code pour une sous-unité de Cav2.1

mutation S218L dans la boucle

entre S4 et S5

Conclusion

Analyse de l’activité des canaux:

Biophysique

Sélectivité ionique

Sensibilité aux inhibiteurs comme aux activateurs

Sensibilité au potentiel

Propriété d’activation, inactivation et déactivation

Mise en évidence des fonctions

des canaux cellulaires:

Contraction

Exocytose

Transmission axonale

Odorat

Absorption

Pression osmotique

www.patrick-meuth.de/neuromod.html

A three-dimensional reconstruction of the

quadruple recording shown

www.physiol.ucl.ac.uk/research/hausser_m

Etude la physiologie cellulaire Etude des dysfonctionnement

canaux ioniques

Pathologies

Merci à M. -----------------

Permet de mesurer une I très faible

Resistance (Rseal) et bruit de fond

Si Rseal est très grande