MS 10310030156

Anti-TP (Sífilis)Imuno-ELISA

Kit para determinação qualitativa de Anticorpos Anti-Treponema pallidum no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA).

Kit for the qualitative detection of Anti-Treponema pallidum Antibody in human serum or plasma, by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Kit para la determinación cualitativa de anticuerpos anti-Treponema pallidum en suero o plasma humano, por enzima inmunoensayo (ELISA).

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WAMA DiagnósticaRua Aldo Germano Klein, 100 - CEATCEP 13573-470 - São Carlos - SP - BrasiFone 55 16 3377.9977 / Fax 55 16 3377.9970www.wamadiagnostica.com.brObelis S.A.Boulevard Général Wahis 53 1030 Brussels, BELGIUMPhone. +(32) 2 732-59 54Fax : +(32) 2 732-60 03www.obelis.netSAC 0800 772 9977

EC REP

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PORTUGUÊSIMPORTÂNCIA CLÍNICAA sífilis é uma doença infecciosa humana produzida por um espiroqueta, o Treponema pallidum. Ela é principalmente uma doença transmitida sexualmente. Outras possíveis vias de transmissão são a transfusão de sangue infectado, hoje praticamente eliminada através de triagem sorológica de rotina, e a perinatal (sífilis congênita) transmitida in útero, pelos treponemas procedentes da mãe infectada para o feto em desenvolvimento.Clinicamente, após um período de incubação que varia de 10 a 90 dias, pois é inversamente relacionado com a quantidade do inoculado, ocorre, em 85 % dos pacientes, o surgimento de um cancro, que é uma lesão solitária e indolor, caracterizando a sífilis primária. Aproximadamente 4 a 10 semanas após o aparecimento do cancro, surgem frequentemente sintomas como perda de peso, cefaléia, anorexia, mialgia, artralgia, mal-estar, febre baixa, linfadenopatia generalizada e exantema (presente em 75 a 100 % dos casos), o que caracteriza a sífilis secundária. Podem ocorrer também neste estágio manifestações de comprometimento do sistema nervoso central. Após as manifestações primárias ou secundárias ocorre o período conhecido como sífilis latente, caracterizado por testes sorológicos positivos e ausência de achados clínicos. Pode ter duração de 1 a 2 anos. Sem tratamento, cerca de um terço dos pacientes apresenta sífilis terciária, que pode manifestar-se como goma (15 %), sífilis cardiovascular (10 %) ou neurossífilis (8 a 10 %).Os testes sorológicos para sífilis são classificados como não treponêmicos, como o VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) e o RPR (Rapid Plasma Reagin), e treponêmicos, como o TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination), FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody – Absorption) e ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

O Imuno-ELISA anti-TP (Sífilis) da WAMA é um teste imunoenzimático, tipo “sanduiche” que utiliza proteínas recombinantes do Treponema pallidum para detectar a presença de anticorpos anti-Treponema pallidum no soro ou plasma humano, com a finalidade de triagem de doadores de sangue ou como um auxiliar ao diagnóstico clínico da sífilis.

PRINCÍPIO DO MÉTODOAs cavidades da placa de microtitulação são cobertas com proteínas recombinantes do T. pallidum (fase sólida), as quais correspondem a epítopos altamente antigênicas do T. pallidum. Quando anticorpos anti-TP estão presentes na amostra de soro ou plasma, eles reagem com um segundo antígeno recombinante do T. pallidum marcado com peroxidase adicionado junto com a amostra. Durante o período de incubação, o imunocomplexo antígeno marcado-anticorpo específico é capturado pelos antígenos recombinantes imobilizados na fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um substrato cromógeno (TMB e peróxido de hidrogênio uréia) é adicionado, o qual revelará uma cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente, indicando a presença de anticorpos anti-TP. Uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática é adicionada, a qual mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos anti-TP é diretamente proporcional a intensidade da cor da reação.

APRESENTAÇÃO DO KIT 45096-E - 96 determinações1. Microplaca com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do T. pallidum (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada)2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (1 x 50 ml)3. Conjugado proteínas recombinantes do T. pallidum marcadas com peroxidase (1 x 12,0 ml)4. Substrato Cromógeno – Solução A (Peróxido de Hidrogênio Uréia) (1 x 7,0 ml)5. Substrato Cromógeno – Solução B (TMB) (1 x 7,0 ml)6. Solução Stop (1 x 7,0 ml)7. Soro Controle Negativo (1 x 0,5 ml)8. Soro Controle Positivo (1 x 0,5 ml)9. Instruções para uso

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45192-E - 192 determinações1. Microplaca com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do T. pallidum (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada)2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (2 x 50 ml)3. Conjugado proteínas recombinantes do T.pallidum marcadas com peroxidase (2 x 12,0 ml)4. Substrato Cromógeno – Solução A (Peróxido de Hidrogênio Uréia) (2 x 7,0 ml)5. Substrato Cromógeno – Solução B (TMB) (2 x 7,0 ml)6. Solução Stop (2 x 7,0 ml)7. Soro Controle Negativo (2 x 0,5 ml)8. Soro Controle Positivo (2 x 0,5 ml)9. Instruções para uso

PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES• MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC.• TAMPÃO DE LAVAGEM 20 x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), pH=7,4, contendo Tween-20 como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 1000 ml com água destilada ou deionizada (diluição 1:20). Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350µl. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar.• CONJUGADO PROTEÍNAS RECOMBINANTES DO T. pallidum MARCADAS COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar.• SUBSTRATO CROMÓGENO – SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO URÉIA) (4): estabilizado e pronto para uso. Estável entre 2-8 °C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar.• SUBSTRATO CROMÓGENO – SOLUÇÃO B (TMB) (5): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico.• SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 2,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco.• SORO CONTROLE NEGATIVO (7): soro humano diluído em tampão estabilizador de proteínas, negativo para T. pallidum. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante.• SORO CONTROLE POSITIVO (8): soro humano diluído em tampão estabilizador de proteínas, positivo para T. pallidum. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante.

Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2 - 8ºC).

AMOSTRASUsar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação.A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser homogeneizadas antes do teste. Evitar formação de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados.

MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO• Micropipeta de 20µl, 50µl e 100 µl e ponteiras.• Água destilada ou deionizada para diluição do tampão de lavagem.

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• Agitador de microplaca.• Incubador com temperatura de 37 ºC.• Leitor de microplaca com filtro de 450 nm.• Lavadora de microplaca.• Papel absorvente.• Recipiente para descarte de material.

PROCEDIMENTOIMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do “blank” deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm.

1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 3 cavidades para o soro controle negativo (7) e 2 cavidades para o soro controle positivo (8). Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50 µl do substrato cromógeno – Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno – Solução B (5). 2. Dispensar 100 µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank.3. Dispensar 20 µl dos soros controles positivo e negativo (sem diluir) conforme o estabelecido no item 1. Dispensar 20 µl das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Ao adicionar a amostra, a cor verde do conjugado torna-se azul escura. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação.4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos.6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante.7. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar ao conteúdo da microplaca, dispensar 350 µl de solução de lavagem diluída (2) em cada cavidade, aguardar 30-60 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática.ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio.8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual.9. Dispensar 50 µl do substrato cromógeno – Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno – Solução B (5) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento de cor azul clara onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 °C por 15 minutos, protegendo da luz.11. Bloquear a reação dispensando 50 µl da solução stop (7) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.12. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank do substrato, dentro de 5 minutos.

NOTA: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível.

IMPORTANTE:• O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas.• A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada.• O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos.

RESUMO DO PROCEDIMENTO1. Pipetar 100 µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto Blank.2.Pipetar 20 µl dos controles negativos (7) (3 cavidades) e controles positivos (8) (2 cavidades). Usar 1 cavidade para o Blank. Pipetar 20 µl da amostra nas outras cavidades. A mistura dará uma cor azul escura a solução.3.Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37°C por 60 minutos.4.Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 5 vezes com solução de lavagem (2).5.Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual.6.Pipetar 50 µl do Substrato Cromógeno - Solução A (4) e 50 µl do Substrato Cromógeno - Solução B (5) em cada cavidade da placa, inclusive no blank. A cor da solução fica azul clara onde houver peroxidase. 7.Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 °C por 15 minutos.8.Pipetar 50 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. A cor da solução ficará amarela.9.Homogeneizar por 30 segundos.10.Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 5 minutos.

CÁLCULOS DOS RESULTADOSDeterminar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank quando utilizar um único filtro. Se a leitura é realizada com duplo comprimento de onda, não subtrair a D.O. do blank das D.Os. das amostras e controles.Determinar o valor do Cut-off:

Atenção: Se o valor da D.O. de um dos controles negativos não atender a faixa controle especificada para validação do teste, a D.O. deste controle deveria ser descartada. Se mais do que um controle negativo não atender, o teste deve ser considerado inválido e deve ser repetido.

Exemplo de cálculo do valor do Cut-off: Valor Médio da D.O. dos Controles Negativos = 0,06 Então, CUT-off = 0,06 + 0,18 = 0,24

VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se:• A D.O. do blank, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop, é menor do que 0,080 a 450 nm.• O valor da D.O. dos controles negativos é igual ou menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm após

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EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA

1 2 3 4 .......... ......... 12A Blank A3B Controle Neg. A4C Controle Neg.

A5D

Controle Neg.

A6E

Controle Pos.

A7F

Controle Pos.

G

A1

H A2

Cut-off = média da D.O. dos Controles Negativos + 0,18

subtrair o blank.• O valor da D.O. dos controles positivos é igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOSDividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do Cut-off. O teste é considerado:

REAGENTE: se valor maior do que 1,1.DUVIDOSO (Borderline): se valor entre 0,9 e 1,1.NÃO REAGENTE: se valor menor do que 0,9.

ATENÇÃO: É SEMPRE RECOMENDADO REPETIR O TESTE NAS AMOSTRAS REAGENTES.

SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTEEm um estudo realizado com 382 amostras de soro e plasma obtidas de um Laboratório de referência, das quais 74 eram positivas e 308 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ELISA anti-TP (Sífilis) da WAMA.

Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100

ESPECIFICADADE ANALÍTICANão foi observada reação cruzada em soros de pacientes infectados por vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus hepatite C, citomegalovírus, HIV e Treponema pallidum. Nenhuma interferência foi verificada com fator reumatóide até a concentração de 2.000 U/ml.Durante os testes realizados, nenhum efeito “Hook” para altas concentrações de anticorpos foi observado.A performance característica do teste não é afetada por concentrações elevadas de bilirrubina e hemoglobina.

PRECISÃO DO TESTEa. Precisão Intra-EnsaioForam selecionadas 2 amostras de soro do controle de qualidade para realizar o teste de repetibilidade. Uma das amostras era reagente alta e outra reagente baixa. Foram feitas 20 repetições do teste com mesmo operador e no mesmo dia.De acordo com os testes realizados, foi verificado que o kit IMUNO ELISA anti-TP (Sífilis), repetiu os resultados com as amostras testadas nas mesmas condições. b. Precisão Inter-EnsaioForam selecionadas 2 amostras do controle de qualidade para realizar o teste de reprodutibilidade. Uma das

amostras era reagente alta e outra reagente baixa. Foram feitas 20 repetições do teste com operador

diferente (cada operador realizou 10 repetições).De acordo com os testes realizados, foi verificado que o kit IMUNO ELISA anti-TP (Sífilis), reproduz os

resultados com as amostras testadas mesmo em diferentes condições e com operadores diferentes.

LIMITAÇÕES DE USO• O teste Imuno-ELISA Anti-TP (Sífilis) da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade

e especificidade e o método “sanduiche” minimiza as reações inespecíficas com desconhecidos interferentes

na amostra. Ressalta-se também que os anticorpos podem ser indetectáveis nos estágios iniciais da doença e

em alguns indivíduos imunossuprimidos.• Resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do

paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais.

VerdadeirosPositivos

FalsosPositivos

VerdadeirosNegativos

FalsosNegativos

Sensibilidade(%)

Especificidade(%)

RESULTADO 74 2 306 0 100 99,35

• Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não

reagentes.• Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido a várias

razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem.• A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste.

PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 – 8 ºC.2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit.3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol.4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível.5. O Imuno-ELISA Anti-TP (Sífilis) da WAMA contém materiais de origem humana, os quais foram

testados, com resultados negativos para anticorpos anti-HIV I e II, antígeno de superfície da hepatite B

(HBsAg) (exceto o Soro Controle Positivo) e anti-HCV. Porém, como nenhum método diagnóstico oferece

completa segurança, na ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar todos os

reagentes como materiais potencialmente infecciosos, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes

materiais.6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes.7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente (20 – 25 ºC) antes de iniciar os testes.8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso.9. Não deixar os cavidades da microplaca secar durante o ensaio.10. Evitar repetidas pipetagem dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação.11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste.12. Não usar reagentes após a data de validade.13. Descartar o material conforme regulamentações locais.14. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais.

TERMO DE GARANTIAA WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições.

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ENGLISHSUMMARYSyphilis is an infectious disease produced by a human spirochete, the Treponema pallidum. It is

primarily a sexually transmitted disease. Other possible routes of transmission are the transfusion of

infected blood, today virtually eliminated through serologic screening, and the perinatal (congenital

syphilis) transmitted in utero, by treponema from infected mother to the fetus in development.Clinically, after an incubation period that ranges from 10 to 90 days, because it is inversely related to

the quantity of inoculated, occurs in 85% of patients, the onset of a canker, which is an isolated lesion

and painless, characterizing the primary syphilis. Approximately 4 to 10 weeks after the onset of

canker, often appear symptoms such as weight loss, headache, anorexia, myalgia, arthralgia,

malaise, low-grade fever, generalized lymphadenopathy and exanthema (present in 75 to 100 % of

the cases), which characterizes the secondary syphilis. May also occur in this stage symptoms of

central nervous system compromise. After the primary or secondary manifestations occurs the

period known as latent syphilis, characterized by positive serological tests and absence of clinical

findings. It can last for 1 to 2 years. Without treatment, approximately one third of patients has

tertiary syphilis, which can manifest itself as goma (15 %), cardiovascular syphilis (10 %) or

neurosyphilis (8 to 10 %).The serologic tests for syphilis are classified as non-treponemic, as the VDRL (Veneral Disease

Research Laboratory) and the RPR (Rapid Plasma Reagin), and treponemic, as the TPHA (Treponema

pallidum Hemagglutination), FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody-Absorption) and ELISA (

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

The Imuno-ELISA anti-TP (Syphilis) from WAMA is an immunoenzymatic test, sandwich type

that uses recombinant proteins of Treponema pallidum to detect the presence of anti-Treponema

pallidum antibodies in human serum or plasma, with the purpose of screening of blood donors or as

an auxiliary to the clinical diagnosis of syphilis.

PRINCIPLE OF THE METHODThe wells of the microtitre plate are coated with recombinant proteins of T. pallidum (solid phase),

which corresponds to highly antigenic epitopes of T. pallidum. When anti-TP antibodies are present in

the serum or plasma sample, they react with a second recombinant antigen of T. pallidum marked

with peroxidase added along with the sample. During the incubation period, the immunocomplex

labeled antigen-specific antibody is captured by recombinant antigens bound to the solid phase.

Material not bound is removed by washing. A chromogen substrate (TMB+ urea hydrogen peroxide)

is added, which will review a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is present,

indicating the presence of anti-TP antibody. An acidic stop solution to block the enzymatic reaction is

added, which will change the color of the solution to yellow. The absorbance is then measured at 450

nm. The concentration of anti-TP antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction

color.

KIT PRESENTATION 45096-E - 96 determinations1. Microplate with wells coated with T. pallidum recombinant proteins (12 removable strips with 8

wells each)2. Wash Solution – concentrated 20x (1 x 50 mL)3. Conjugate of T. pallidum recombinant proteins marked with peroxidase (1 x 12.0 ml)4. Chromogen Substrate – Solution A (Urea Hydrogen Peroxide) (1 x 7.0 mL)5. Chromogen Substrate – Solution B (TMB) (1 x 7.0 mL)6. Stop Solution (1 x 7.0 mL)7. Negative Serum Control (1 x 0.5 mL)8. Positive Serum Control (1 x 0.5 mL)9. Instructions for use

45192-E - 192 determinations1. Microplate with wells coated with T. pallidum recombinant proteins (24 removable strips with 8

wells each)2. Wash Solution – concentrated 20x (2 x 50 mL)3. Conjugate of T. pallidum recombinant proteins marked with peroxidase (2 x 12.0 ml)4. Chromogen Substrate – Solution A (Urea Hydrogen Peroxide) (2 x 7.0 mL)5. Chromogen Substrate – Solution B (TMB) (2 x 7.0 mL)6. Stop Solution (2 x 7.0 mL)7. Negative Serum Control (2 x 0.5 mL)8. Positive Serum Control (2 x 0.5 mL)9. Instructions for use

REAGENT PREPARATION AND STABILITY• MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach

room temperature (20 – 25°C). The strips that will not be used must be returned to the sealing

envelope, with desiccant, and kept at 2 – 8°C.• WASH SOLUTION (20x Concentrated) (2): Phasphate Buffered solution (PBS), ph=7,4,

containing Tweene-20 as deterggent Dilute the volume of the concentrate, filling it to 1000 ml with

distilled or deionized water (dilution 1:20). If crystals are formed in the concentrated diluent, they

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05must be dissolved at 37°C before the dilution is made. During each wash cycle, each cavity should be

supplemented with approximately 350µl. Let it reach room temperature (20-25 °C) before using. • CONJUGATE OF T. pallidum RECOMBINANT PROTEINS MARKED WITH PEROXIDASE (3):

ready to use. Stable at 2 – 8°C \up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it

to reach room temperature (20 – 25°C) before using it.• CHROMOGEN SUBSTRATE – SOLUTION A (UREA HYDROGEN PEROXIDE) (4): stabilized

and ready for use. Stable at 2 – 8°C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it

to reach room temperature (20 – 25°C) before using it.• CHROMOGEN SUBSTRATE – SOLUTION B (TMB) (5): solution stabilized with Tetramethyl

Benzidine. Ready to use. Stable at 2 – 8 °C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze.

Allow it to reach room temperature (20 – 25°C) before using it. The TMB is not mutagenic and not

carcinogenic.• STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains 2.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care.

Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room

temperature (20 – 25°C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle.• NEGATIVE SERUM CONTROL (7): human serum diluted in proteins stabilizer buffer, negative for

T. pallidum. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 – 8°C \up to the expiration date

printed on the bottle. Contains ProClin 300 0.1% as preservative.• POSITIVE SERUM CONTROL (8): diluted human serum in stabilized protein buffer, positive for T.

pallidum. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 – 8°C \up to the expiration date

printed on the bottle. Contains ProClin 300 0.1% as preservative.

Note: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration

date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 °C).

SPECIMENSUse serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated.The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 ° C for 48 hours. For long-term storage,

serum or plasma must be kept in the freezer at – 20ºC. Frozen specimens must be homogenized

before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freezing and thawing as this may lead to false results.

MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED• Micropipette of 20µl, 50 µl and 100 µl and tips.• Distilled and deionized water for the dilution of the wash solution.• Microplate shaker.• Incubator at 37 °C.• Microplate reader with 450nm filter.• Microplate washer.• Absorbent paper.• Container for material disposal.

PROCEDUREIMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630

nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded,

since it should be used only when using a 450 nm single filter.

1. In accordance with the plan established plan for the plate distribution, use 3 wells for the serum

negative control (7) and 2 wells for the serum positive control (8). Use 1 well for the “blank”, which

will have only 50 µL of the chromogen substrate – Solution A (4) and 50 µL of the chromogen

substrate – Solution B (5). 2. Pipete 100µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank.3. Pipette 20µl of the positive and negative serum control (without diluting them) as instructed in

step 1. Pipete 20µl of the samples to be tested into the other microplate wells. When adding sample,

the green color of the conjugate will turn dark blue. Use individual tips for each sample, to avoid

05contamination.4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or

use a microtiter plate shaker.5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37° C for 60 minutes.6. Discard the contents of the microplate in container with disinfecting solution.7. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents).

Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution (2) in each well, wait 30-

60 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cycles).

We recommend using a microplate washer (manual or automatic).WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test.8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual

liquid.9. Pipette 50µl of chromogen substrate – Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B

(5) in each well of the microplate, including the blank. A light blue color will develop wherever the

peroxidase enzyme is present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges

and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds.10. Cover the plate with adhesive sheet and incubate at 37° C for 15 minutes, protecting if from the

light.11. Block the reaction by dispensing 50µl of Stop Solution (7) in each well of the microplate, including

the blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding

the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds.12. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the

substrate, within 5 minutes.NOTE: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is

recommended when available.

IMPORTANT:• The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in

inaccurate readings or falsely elevated absorbance.• Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended.• The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes.

SUMMARY OF THE PROCEDURE1. Pipette 100µl of conjugate (3) in each well of the plate, except blank.2. Pipette 20 µl of negative controls (7) (3 wells) and positive controls (8) (2 wells). Use 1 well for the

Blank. Pipette 20 µl of the sample in other cavities. The mixture will give a dark blue color to the

solution.3. Mix for 30 seconds and incubated at 37° C for 60 minutes.4. Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash

5 times with wash solution (2).5. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid.6. Pipette 50µl of chromogen substrate - Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B

(5) in each well of the microplate, including the blank. The color of the solution turns light blue

wherever there is peroxidase. 7.Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37° C for 15 minutes.8. Pipette 50µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. The color of the solution will

turn yellow.9. Mix for 30 seconds.10. Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double

wavelength (450/630 nm), within 5 minutes.

05

CALCULATION OF RESULTSDetermine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD when using a single filter. If the reading is carried out with double wavelength, do not subtract the OD of the blank from the OD of the samples and controls.Determine the Cut-off value:

Warning: If the value of OD of one of the negative controls does not fall within the control range specified in the test validation, the OD of this this control should be discarded. If more than one negative control does not meet the specification, the test should be considered invalid and must be repeated.

Exemple of the Cut-off calculation: Average OD of Negative Control = 0.06 Therefore, CUT-off = 0,06 + 0,18 = 0,24TEST VALIDATION: The test is valid if:• The O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and Stop Solution is less than 0.080 at 450 nm.• The O.D. value of the negative controls is less than or equal to 0.100 at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank.• The O.D. value of the positive controls must be greater than or equal to 0.800 at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank.

INTERPRETATION OF THE RESULTSDivide the OD value of the patient sample by the Cut-off value. The test is considered:

REACTIVE: if value is greater than 1.1.INDETERMINATE ( Borderline ) : if value is between 0.9 and 1.1.NON-REACTIVE: if value is less than 0.9.

WARNING: IT IS ALWAYS RECOMMENDED REPEAT THE TEST IN THE REACTIVE SAMPLES.

SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TESTIn a study conducted with 382 samples of serum and plasma obtained from a reference laboratory, of which 74 were positive and 308 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA anti-TP (Syphillis) from WAMA.

EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPLATE

1 2 3 4 .......... ......... 12A Blank A3B Neg. Control A4C Neg. Control A5D Neg. Control A6E

Pos. Control

A7

F Pos ControlG A1H A2

Cut-off = average OD of Negative Control + 0.18

Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100

ANALYTICAL SPECIFICITYThere was no cross-reaction in sera from infected patients by the hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, Cytomegalovirus, HIV, and Treponema pallidum. No interference was verified with rheumatoid factor until the 2,000 U/mL concentration.During the tests, no effect "Hook" for high concentrations of antibodies was observed.The performance characteristic of the test is not affected by high concentrations of bilirubin and hemoglobin.

PRECISION OF THE TEST:a.Intra-Assay Precision2 serum samples from quality control were selected to perform the repeatability test. One of the samples was reactive high and another reactive low. 20 repetitions of the test was done by the same operator and on the same day.According to the tests carried out, it was verified that the kit IMUNO-ELISA anti-TP (Sifilis), repeated satisfactorily the results with the samples tested under the same conditions.

b.Inter-Assay Precision2 samples were selected from quality control to perform the repeatability test. One of the samples was reactive high and another reactive low. 20 Repetitions were done with different technicians (each technician carried out 10 repetitions).According to the tests carried out, it was verified that the kit IMUNO-ELISA anti-TP (Sifilis), repeated satisfactorily the results different conditions and differente technicians.

LIMITATIONS OF USE• The Imuno-ELISA Anti-TP (Sifilis) from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity and the sandwich method minimizes the nonspecific reactions with unknown interferents in the sample. Also note that that the antibodies may be undetectable in the initial stages of the disease and in some immunosuppressed individuals.• Results repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with other laboratory test results.• Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive.• Due to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step.• The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test.

PRECAUTIONS AND WARNINGS1. The reagents should be kept between 2 - 8 ºC.2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box.3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight.4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage.5. The Imuno-ELISA anti-TP (Sifilis) from WAMA contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-HIV I and II antibodies, Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg) (except in the positive serum control) and anti-HCV. However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to deal with all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the disposing these materials.

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True

PositivesFalse

Positives True

Negatives False

NegativesSensitivity

(%)Especificity

(%)

RESULTS 74 2 306 0 100 99 35

6. Do not use reagents or microplates fof different batches.7. Allow the reagents to reach the room temperature (20 -25ºC) before starting the test.8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use.9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test.10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination.11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions.12. Do not use the reagent after the expiration date.13. Discard the material following local regulations.14. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials.

WARRANTYWAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions.

IMPORTANCIA CLÍNICALa sífilis es una enfermedad infecciosa producida por una espiroqueta humano, el Treponema pallidum. Es principalmente una enfermedad de transmisión sexual. Otras posibles vías de transmisión son las transfusiones de sangre infectada, hoy prácticamente eliminada por pruebas serológicas, y perinatal (sífilis congénita) transmitida en el útero, por el treponema de la madre infectada al feto en desarrollo.Clínicamente, después de un período de incubación que varía de 10 a 90 días, ya que está inversamente relacionada con la cantidad de inoculado, ocurre en 85% de los pacientes, la aparición de un cancro, que es una lesión aislada y sin dolor, caracterizada por la sífilis primaria. Aproximadamente 4 a 10 semanas después de la aparición de cancro, a menudo aparecen síntomas tales como pérdida de peso, dolor de cabeza, anorexia, mialgias, artralgias, malestar general, fiebre de bajo grado, linfadenopatía generalizada y exantema (presente en 75 a 100% de los casos), lo que caracteriza la sífilis secundaria. También puede ocurrir en esta etapa los síntomas que compromete el sistema nervioso central. Después de las manifestaciones primarias o secundarias ocurre el período conocido como sífilis latente, caracterizada por serología positiva y la ausencia de signos clínicos. Puede durar de 1 a 2 años. Sin tratamiento, aproximadamente un tercio de los pacientes con sífilis terciaria, que puede manifestarse como goma (15%), la sífilis cardiovascular (10%) o neurosífilis (8 a 10%).Las pruebas serológicas para sífilis se clasifican como no- treponémicas, como la (Laboratorio de Investigación de Enfermedades Veneral) VDRL y el RPR (Rapid Plasma Reagin) y treponémicas, como el TPHA (Hemaglutinación de Treponema pallidum ), FTA - Abs (anticuerpos treponémicos fluorescentes - Absorción) y ELISA (Enzyme - método inmunoenzimático).

Lo Imuno-ELISA anti-TP (Sífilis) de WAMA es una prueba inmunoenzimática, tipo "sandwich" que utiliza proteínas recombinantes de Treponema pallidum para detectar la presencia de anticuerpos anti-Treponema pallidum en suero o plasma humano, con lo propósito de detección de donantes de sangre o como auxiliar para el diagnóstico clínico de enfermedad.

PRINCIPIO DEL MÉTODOLos pocillos de la placa de microtitulación se recubren con proteínas recombinantes de T. pallidum (fase sólida), que corresponde a altamente epítopos antigénicos de T. pallidum. Cuando anti-TP anticuerpos están presentes en la muestra de suero o plasma, ellos reaccionan con un segundo antígeno recombinante de T. pallidum marcado con peroxidasa añadido junto con la muestra.

05

ESPAÑOL

Durante el período de incubación, el inmunocomplejo antígeno marcado - anticuerpo específico es capturada por los antígenos recombinantes unidos a la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un substrato (TMB + peróxido de hidrogênio) es adicionado, el cual revelará un color azul en los pocillos donde la enzima peroxidasa esté presente, indicando la existencia del anticuerpo anti-HBsAg. Una solución ácida de parada para bloquear la reacción enzimática es adicionada, que va a cambiar el color de la solución a amarillo. Entonces, la absorbancia se mide a 450 nm. La concentración de anticuerpos anti-TP es directamente proporcional a la intensidad de la reacción.

PRESENTACIÓN DEL KIT CÓDIGO: 45096-E - 96 determinaciones1. Microplacas con pocillos recubiertos con T. pallidum proteínas recombinantes (12 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno)2. Solución de lavado - 20 x concentrada (1 x 50 ml)3. Conjugado de proteína recombinante de T. pallidum marcados con peroxidasa (1 x 12,0 ml)4. Sustrato Cromógeno – Solución A (Peróxido de Hidrógeno Uréia) (1 x 7,0 ml)5. Sustrato Cromógeno – Solución B (TMB) (1 x 7,0 ml)6. Solución Stop (1 x 7,0 mL)7. Suero control negativo (1 x 0,5 ml)8. Suero control positivo (1 x 0,5 ml)9. Instrucciones de uso

CÓDIGO: 45192-E - 192 determinaciones1. Microplacas con pocillos recubiertos con T. pallidum proteínas recombinantes (24 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno)2. Solución de lavado - 20 x concentrada (2 x 50 ml)3. Conjugado de proteína recombinante de T. pallidum marcados con peroxidasa (2 x 12,0 ml)4. Sustrato Cromógeno – Solución A (Peróxido de Hidrógeno Uréia) (2 x 7,0 ml)5. Sustrato Cromógeno – Solución B (TMB) (2 x 7,0 ml)6. Solución Stop (2 x 7,0 mL)7. Suero control negativo (2 x 0,5 ml)8. Suero control positivo (2 x 0,5 ml)9. Instrucciones de uso

PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE REACTIVOS• MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente (20 - 25 °C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2 - 8 °C.• SOLUCIÓN DE LAVADO (20x concentrado) (2): Solución tamponada de fosfato (PBS), ph=7,4 , que contiene Tween-20 como detergente. Diluir el volumen del concentrado, llenando hasta 1000 ml con agua destilada o desionizada (dilución 1:20). Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37° C antes de la dilución. Durante cada ciclo de lavado, cada cavidad debe ser complementada con aproximadamente 350 µl. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar. • CONJUGADO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE DE T. pallidum MARCADOS CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2 - 8 °C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar.• SUBSTRATO CROMÓGENO – SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO UREIA) (4): estabilizado y listo para su uso. Estable a 2 - 8°C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar.• SUSTRATO CROMÓGENO - SOLUCIÓN B (TMB) (5): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2 - 8 °C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico.• SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene 2,0 M de ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con

05

REF

REF

cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar

que alcance la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar. Estable °C hasta la fecha de

vencimiento impresa en el frasco.• SUERO DE CONTROL NEGATIVO (7): Suero humano diluido en buffer com proteína

estabilizadora, negativo para T. pallidum. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido.

Estable entre 2 - 8 °C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene ProClin 300 0,1

% como conservante.• SUERO DE CONTROL POSITIVO (8): Suero humano diluido en tampón de proteína estabilizado,

positivo para T. pallidum . Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2 - 8

°C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene ProClin 300 0,1 % como

conservante.

Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable

hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la

temperatura indicada (2 - 8ºC).

ESPECÍMENESUsar muestras de suero o plasma libres de hemólisis, lipemia y contaminación.Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Para un período

mayor, deben guardarse en freezer a -20 ºC. Muestras congeladas deberán homogeneizarse antes

del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados

falsos.

MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO• Micropipeta de 20μl, 50μl y 100μl y puntas de pipeta.• Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado.• Agitador de microplaca.• Incubadora con una temperatura de 37 º C• Lector de micro placa con filtro de 450 nm.• Lavador de microplaca.• Papel absorbente.• Recipiente para descarte de material.

PROCEDIMIENTOIMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud

de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco"

debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm.

1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 3 pocillos para lo suero control

negativo (7) y 2 pocillos para el suero control positivo (8). Usar 1 pocillo para el blank, el cual

contendrá solamente 50μl de sustrato cromógeno – Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno –

Solución B (5). 2. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank.3. Pipetear 20 µl de suero control positivo y negativo (sin diluir) como se indica en el paso 1. Pipetear

20 µl de las muestras que serán testeados en los otros pocillos. Al agregar muestra, el color verde de

lo conjugado se volverá a azul oscuro. Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo,

evitando la contaminación.4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por

vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37° C por 60 minutos.6. Descartar el contenido de la microplaca placa en un recipiente con solución desinfectante.

05

7. Lavar la placa 5 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los

Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado diluida (2)

en cada pocillo, esperar 30-60 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este

procedimiento (total de 5 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática

o manual.ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los

procedimientos de lavado sean adecuados.8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar

cualquier residuo líquido.9. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno – Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno – Solución

B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá una color azul clara donde esté

presente la enzima. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la

placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37° C por 15 minutos, protegiendo de la luz.11. Bloquear la reacción dispensando 50 μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca,

inclusive el blank. La solución se cambiará al color amarillo. Homogeneizar suavemente,

tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de

placa) por 30 segundos.12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del

sustrato, en un plazo de 5 minutos.

NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda

de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible.

IMPORTANTE:• El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a

lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas.• Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio.• El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos.

RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO1.Dispensar 100µl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank.2.Pipetear 20 µl de los controles negativos (7) (3 pozos) y controles positivos (8) (2 pozos). Utilice 1

y para el blanco. Pipetear 20 µl de la muestra en otras cavidades. La mezcla le dará un color azul

oscuro a la solución.3.Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37° C por 60 minutos.4.Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 5 vezes

con solución de lavado (2).5.Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido.6.Dispensar 50µl del sustrato cromógeno - Solución A (4) y 50µl del sustrato cromógeno - Solución B

(5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. El color de la solución se volverá azul claro

donde hay peroxidasa. 7.Homogeneizar por 30 segundos e Incubar en la oscuridad a 37 °C por 15 minutos.8.Pipetear 50µl de la Solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca. El color de la solución se

volverá amarillo.9.Homogeneizar por 30 segundos.10.Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del

sustrato, o en una doble onda (450/630 nm), en un plazo de 5 minutos.

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CÁLCULO DE LOS RESULTADOSDeterminar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene

restando de la lectura de la D.O. el valor del blank se utiliza un solo filtro. Si la lectura se lleva a cabo

con doble longitud de onda, no le rete la D.O. de lo blanco de la DO de las muestras y los controles.Determinar lo valor de Cut-off:

Advertencia: Si el valor de DO de uno de los controles negativos no se encuentra dentro del rango

de control especificado en la validación de las pruebas, la D.O. de este este control debe ser

desechada. Si más de un control negativo no se ajusta a la especificación, la prueba debe ser

considera no válida y debe repetirse.

Ejemplo de cálculo de Cut-off: Promedio de la DO del Control Negativo = 0,06 Por lo tanto, Cut-off = 0,06 + 0,18 = 0,24

VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si:• La D.O. del blanco, que contiene solamente Sustrato Cromógeno A y B y Solución Stop, debe ser

inferior a 0,080 a 450 nm.• Lo valor de la D.O. de lo control negativo es inferior a 0,100 a 450/630 nm o a 450 nm después de

sustraer el "blank".• Lo valor de la D.O. de lo control positivo deve ser igual o mayor a 0,900 a 450/630 nm o a 450 nm

después de sustraer el "blank".

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSDivida el valor de DO de la muestra del paciente por lo valor de Cut-off. La prueba se considera:

REACTIVO : Si el valor es superior a 1,1 .INDETERMINADO ( Borderline ) : Si el valor está entre 0.9 y 1.1 .NO REACTIVO: Si el valor es inferior a 0,9 .

ADVERTENCIA: SIEMPRE SE RECOMIENDA REPETIR LA PRUEBA EN LAS MUESTRAS

REACTIVAS.

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1 2 3 4 .......... ......... 12

Cut-off = medio de D.O. de Controle Negativo + 0.18

EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA

A Blank A3B Controle Neg. A4C Controle Neg. A5D Controle Neg.

A6E Controle Pos.

A7F Controle Pos.

G A1H A2

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SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TESTEn un estudio de 382 muestras de suero y plasma obtenidas de un laboratorio de referencia, de los

cuales 74 eran positivos y 308 negativos, se determinó la sensibilidad y especificidad de Imuno-

ELISA anti-TP (Sifilis) de WAMA.

Sensibilidad = Positivos Verdaderos / Positivos Verdaderos + Falsos Negativos) x 100Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos ) x 100

ESPECIFICIDAD ANALÍTICANo hubo reacción cruzada en sueros de pacientes infectados por el virus de la hepatitis A, virus de la

hepatitis B, virus de la hepatitis C, Citomegalovirus, VIH y Treponema pallidum. No hay interferencia

verificada con factor reumatoide hasta la concentración de 2.000 U/mL.Durante las pruebas, , no se observó ningún efecto "gancho" para las altas concentraciones de

anticuerpos.La característica de rendimiento de la prueba no se ve afectado por las altas concentraciones de

bilirrubina y hemoglobina.

PRECISIÓN DEL TEST:a.Precisión IntraensayoSe seleccionaron 2 muestras de suero de control de calidad para realizar la prueba de repetibilidad.

Una de las muestras fue reactivo alto y otro reactivo bajo. 20 repeticiones del test fueran corridas por

los mismo operador y en mismo dia.De acuerdo a las pruebas realizadas, se verificó que el kit IMUNO - ELISA anti - TP (Sífilis), repitió

satisfactoriamente los resultados con las muestras analizadas en las mismas condiciones. b.Precisión InterensayoSe seleccionaron 2 muestras de suero de control de calidad para realizar la prueba de repetibilidad.

Una de las muestras fue reactivo alto y otro reactivo bajo. 20 repeticiones se realizaron con técnicos

diferentes (cada técnico llevó a cabo 10 repeticiones).De acuerdo a las pruebas realizadas, se verificó que el kit IMUNO - ELISA anti - TP (Sifilis), repitió

satisfactoriamente los resultados de diferentes condiciones y técnicos diferentes.

LIMITACIONES DE USO• El Imuno-ELISA anti-TP (Sifilis) de WAMA fue desarrollado para obtener la máxima

sensibilidad y especificidad y el método sándwich minimiza las reacciones no específicas con

interferentes desconocidos en la muestra. También tenga en cuenta que que los anticuerpos pueden

ser indetectables en las etapas iniciales de la enfermedad y, en algunos individuos

inmunodeprimidos.• Resultados repetidamente reactivos deben interpretarse con la información clínica del paciente con

otro resultado de las pruebas de laboratorio.• Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no

reactivo.• Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a

diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado

inadecuado.• La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba.

VerdaderoPositivos

FalsoPositivos

VerdaderoNegativos

FalsoNegativos

Sensibilidad(%)

Especificidad(%)

RESULTADOS 74 2 306 0 100 99,35

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PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS1. Los reactivos deben conservarse entre 2 – 8 ºC.2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la

caja del kit.3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa.4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles.5. La Imuno-ELISA anti-TP (Sífilis) de WAMA contiene materiales de origen humano, que se han

ensayado, con resultados negativos para anti-VIH anticuerpos I y II, antígeno de superficie de la

Hepatitis B (HBsAg) (excepto en el suero de control positivo) y anti-hepatitis C (VHC). Como ninguna

prueba puede ofrecer completa seguridad, en la ausencia de éstos y otros agentes infecciosos, se

recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos,

y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales.6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes.7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente (20 – 25 ºC) antes de iniciar los tests.8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma

inmediata después de su uso.9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo.10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación.11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo

para mantener las mismas condiciones del test.12. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad.13. Desechar el material siguiendo regulaciones locales.14. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y

eliminación de los materiales.

TÉRMINO DE GARANTÍAWAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha

de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la

ejecución, la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA y sus distribuidores no se

responsabiliza por fallas en el rendimiento de los kits en estas condiciones.

Edição I: Rev. 02/2012

BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA

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