Facultad de Ingenierıa, Universidad

de Buenos Aires

Tesis de Grado

Modelo de la deformacion de unamembrana celular bajo campos

electromagneticos

Juan Ignacio Marchese

DirectoresDr. Alejandro Soba

Dr. Guillermo MarshallLic. Adriana Echeverria

Abril, 2017

Indice

1. Introduccion 3

2. Fundamentos teoricos 72.1. Potencial electrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.2. Tensor de Tensiones de Maxwell . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.3. Deformacion elastica de la membrana . . . . . . . . . . . . . . . 10

3. Metodos numericos empleados 133.1. FEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133.2. Geometrıa del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.3. Condiciones de borde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.4. Mallado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173.5. Descripcion del Codigo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.5.1. Campo electrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193.5.2. Problema mecanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.6. Herramientas para analisis de resultados . . . . . . . . . . . . . . 243.6.1. Jupyter Notebook . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243.6.2. ParaView . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4. Modelo Electrico 264.1. Analisis parametrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264.2. Potencial electrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264.3. Potencial transmembrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5. Deformacion de la membrana 365.1. Fuerza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365.2. Deformacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385.3. Potencial transmembrana sobre la celula deformada . . . . . . . 415.4. Lımite del modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

6. Comparacion con resultados experimentales 466.1. Campo electrico de alta frecuencia . . . . . . . . . . . . . . . . . 476.2. Pinzas opticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

7. Comportamiento mecanico de celulas sanas y enfermas 54

8. Conclusiones 58

A. Diagrama de flujo del codigo 59

B. Instalacion del programa 60

C. Parametros de entrada 60

D. Archivos de salida 62

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Resumen

Una membrana celular posee poros que comunican el medio extra celularcon el intracelular. Naturalmente esos poros se abren o se cierran de acuerdoa estımulos electroquımicos o cambios de potencial debidos a la interaccion dela membrana con diferentes moleculas o compuestos. De igual modo existenestımulos externos que pueden activar esos mecanismos, por ejemplo, al apli-car un campo electrico externo pulsante, que produce un proceso denominadoelectroporacion, cuya principal consecuencia es forzar la apertura de poros entreotros fenomenos. Si el campo aplicado es intenso, la apertura puede llegar a des-truir la membrana en forma irreversible y matar consecuentemente a la celula(proceso de ablacion celular). Para campos moderados, la apertura de poros esreversible, y este mecanismo permite la entrada de antineoplasicos o antibioticoantitumoral, que provocan la muerte celular por disrupcion mitotica selectiva.Para un tratamiento mediante electroporacion de un tejido enfermo, ambos ti-pos de electroporacion son utilizados y la disipacion del campo electrico fuerade la zona de ablacion genera regiones de celulas electroporadas reversiblementesusceptibles a la penetracion de drogas.

Se ha observado en recientes estudios que al aplicar pulsos electricos no solose modifica el potencial transmembranal (PTM) sino que se producen cambiosen la forma de la membrana, que ademas es expuesta a una modificacion del pHy de isomolaridad del medio, factores que a su vez alteran dicho potencial PTM yconsecuentemente la forma de la celula. El grado de electroporacion de la celuladepende de la magnitud del PTM inducido y su repuesta mecanica al mismo.Caracterizar la interaccion entre campos electricos pulsantes, las membranascelulares y los tejidos, ası tambien como analizar el proceso de transporte ionicosubyacente en la zona de tratamiento, resulta de fundamental importancia parael problema de la electroporacion y sus diferentes tratamientos asociados.

En esta tesis se desarrolla un modelo que da cuenta de la respuesta mecanicade la membrana celular a la aplicacion de un campo electromagnetico medianteel metodo de los elementos finitos. Para ello se trabaja sobre una geometrıabidimensional con simetrıa axial lo que permite representar una celula esfericasimetrica. Siendo el mallado del dominio a analizar de vital importancia, se hadesarrollado un mallador acoplado al codigo para poder aumentar el grado deprecision de nuestros elementos finitos sobre la membrana y poder dar cuentaapropiada de su comportamiento. El codigo resuelve la distribucion de campoelectrico sobre el dominio, calcula las tensiones sobre la membrana y la de-formacion inducida. Los resultados se comparan con resultados experimentalesobtenidos de la literatura.

Palabras claves: membrana celular, electroporacion, deformacion elastica,elementos finitos.

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1. Introduccion

El proceso de electroporacion celular tiene como objetivo permeabilizar lamembrana de una celula, mediante la aplicacion de un campo electrico externo,para lograr el transporte a traves de la misma de drogas o agentes terapeuticosque naturalmente no son solubles en la membrana por medio de difusion ymigracion. Este proceso es utilizado en diferentes tratamientos electroquımicosde tumores [1, 2] como por ejemplo, en la electro quimioterapia (ECT) dondese utilizan drogas quimioterapicas clasicas o en el caso de la ElectroterapiaGenica (GET), en donde se utilizan moleculas de ADN y ARN [3]. El procesose optimiza cuando ese campo es pulsado, dependiendo del voltaje aplicado, laduracion de los pulsos y la frecuencia de los mismos [3, 4].

La membrana esta compuesta por una bicapa lipıdica con su interior hi-drofobico, que actua como una barrera altamente impermeable a la mayorıa demoleculas polares, impidiendo que la mayor parte del contenido hidrosoluble dela celula salga de ella. A tiempo infinito cualquier molecula difundira a travesde una bicapa lipıdica libre de proteınas, a favor de su gradiente de concentra-cion. Sin embargo la velocidad a la que una molecula difunde a traves de unabicapa lipıdica varıa enormemente, dependiendo en gran parte del tamano de lamolecula y de su solubilidad relativa al aceite (es decir, cuanto mas hidrofobi-ca o no polar), tanto mas rapidamente difundira a traves de una bicapa [5, p.470-471]. Una de las funciones mas importantes de la membrana es controlar lacomunicacion entre el medio intracelular y el exterior a traves del transporte.Dentro de la celula tienen lugar dos tipos de transporte que se llevan a cabo atraves de la membrana: el transporte pasivo y el activo.

El transporte pasivo consiste en un proceso de difusion de sustancias a travesde la membrana dado por la diferencia de concentracion de las mismas y eltransporte a traves de proteınas que actuan como canales hidrofılicos. Estosprocesos son naturales y no requieren de energıa externa. El transporte activo,en cambio, es un proceso que necesita de energıa para transportar las moleculasde uno a otro lado de la membrana a traves de una permeabilizacion natural,ya que la membrana asila el interior de la celula del medio externo. Un campoexterno aplicado induce una potencial transmembranal aun mayor debido aque la conductividad electrica de la membrana es seis (6) ordenes de magnitudmas pequena que la de los medios intra y extra celular. Ademas este potencialmodificado permite la formacion de poros acuosos que actuan a manera decanales de conduccion a traves de la membrana[8]. Sin potencial aplicado dichosporos poseen un radio relativamente pequeno, (del orden de medio nanometro)que solo permiten el paso de sustancias especıficas de un medio al otro productode reacciones electroquımicas en su proximidad. La mayor o menor facilidad delas moleculas para atravesar la membrana celular dependen de la carga electricay la masa molar. Moleculas pequenas o con carga electrica neutra pasan lamembrana mas facilmente que elementos cargados electricamente y moleculasgrandes. Por otra parte la membrana es selectiva, lo que significa que permitela entrada de unas moleculas y restringe la de otras.

Las moleculas pequenas no polares se disuelven facilmente en las bicapas

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lipıdicas y por lo tanto difunden con rapidez a traves de ellas. Las moleculas po-lares, si su tamano es suficientemente reducido, tambien difunden rapidamente.Ejemplos de estas sustancias son los solventes organicos, como el metanol, laacetona, el etanol, la urea, etc.

La permeabilidad depende de los siguientes factores:

Solubilidad en los lıpidos: Las sustancias que se disuelven en los lıpidos(moleculas hidrofobas, no polares) penetran con facilidad en la membranadado que esta compuesta en su mayor parte por fosfolıpidos.

Tamano: la mayor parte de las moleculas de gran tamano no pasan atraves de la membrana. Solo un pequeno numero de moleculas polares depequeno tamano pueden atravesar la capa de fosfolıpidos.

Carga: las moleculas cargadas y los iones no pueden pasar, en condicio-nes normales, a traves de la membrana. Sin embargo, algunas sustanciascargadas pueden pasar por los canales proteicos o con la ayuda de unaproteına transportadora.

Sin embargo, cuando se aplica un campo electrico al medio, la poblacion deporos de la membrana responde al PTM en forma dinamica, abriendose a medidaque este potencial aumenta, para despues cerrarse en muchos casos o alcanzarun tamano estable en otros siguiendo una compleja estadıstica analizada en [9].En respuesta a esta apertura se modifica el coeficiente de conductividad electricay el de difusion de la membrana facilitando el transporte a traves de la misma[10]. Basicamente en este caso por mecanismos guiados por la difusion y lamovilidad de las especies ionicas. Estos fenomenos tambien se ven influenciadospor la distribucion de las tensiones elasticas que se desarrollan en la membranadebido a la aparicion del PTM, fuertemente dependientes del potencial externoaplicado y la orientacion de la celula frente al campo exterior.

Al aplicar un campo electrico sobre la misma se puede estimar medianteel tensor de Maxwell la tension local que se concentra en la membrana y queproduce una deformacion en la celula, que genera que la misma tome una formaoblada o prolada, segun sean los campos aplicados [11, 12]. Esta deformacioncoadyuva a abrir los poros junto con el PTM. Una vez aplicado el campo yabiertos los poros, las especies pueden entrar o salir de la celula de acuerdo algradiente de concentracion y la carga neta de las mismas.

Es necesario destacar que el modelo de electroporacion propuesto en estatesis y que sigue el trabajo de diferentes autores [9, 8] es un mecanismo aunno establecido y sobre el que persisten algunos puntos que se continuan anali-zando. Es por ese motivo que investigaciones de este tipo resultan valiosas yaque permiten confirmar predicciones y poner en duda suposiciones teoricas quedeben ser estudiadas en detalle.

Este conjunto de simulaciones debe encararse mediante una compleja baterıade modelos acoplados unos con otros y mutuamente dependientes. En esta tesisse propone por primera vez un mecanismo de funcionamiento en conjunto detodos estos fenomenos. Cada uno de estos modelos debe ser abordado por una

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tecnica numerica adecuada. En primer lugar nos proponemos simular la distri-bucion de potencial y campo electrico sobre el dominio conformado por el lıquidointracelular, el lıquido extracelular y la membrana mediante el metodo de loselementos finitos [13, 14], discretizando explıcitamente la membrana celular [8].Es necesario destacar que la membrana celular posee un espesor que es un parde ordenes de magnitud menor que el radio celular, lo que representa un desafıonumerico novedoso al intentar discretizar la misma mediante elementos finitos.En la literatura la membrana es tratada mediante una condicion de contornoque separa los medios extra e intra celular [5].

Siendo el mallado del dominio a analizar de vital importancia, se proponedesarrollar un mallador integrado al codigo para poder aumentar el grado deprecision de nuestras mallas al valor requerido para modelar una membranacelular. Este mallador parte de suponer que la geometrıa de la celula es esfericay propone trabajar con elementos cuadrangulares lineales.

En un trabajo realizado en paralelo a esta tesis se modelizo la dinamicade creacion y evolucion de la poblacion de poros sobre la membrana. Ademas,el modelo predice el tamano de los mismos al resolver una serie de ecuacionesdiferenciales ordinarias, cuya parte temporal se resuelve mediante un algoritmode un paso simple[15]. Con la informacion provista por este modelo se recalculala nueva conductividad electrica y el coeficiente de difusion de la membranapermeabilizada. Este modelo requiere conocer la distribucion de tensiones sobrela membrana o proveer una estimacion adecuada de la misma, ya que dichatension retroalimenta el modelo de creacion de poros y el de conductividad demembrana [11].

Por este motivo resulta de importancia crucial desarrollar un modelo que decuenta de la manera mas exacta posible como se distribuye la tension y el campode deformaciones sobre la bicapa lıpida que conforma la membrana celular. Estecalculo volvera a realizarse mediante el metodo de elementos finitos sobre elmismo mallado utilizado para obtener la distribucion de potencial electrico.

Son numerosos los parametros relevantes a tener en cuenta cuando se realizauna simulacion tan compleja. En primer lugar, debemos analizar los parametrosgeometricos. Es necesario entonces explorar el adecuado dominio de resolucion,el tamano de la celula puede variar en un rango que va de los 5 micrones a los 50micrones de diametro. El dominio general puede abarcar un espacio circundan-te amplio o restringir el estudio a unos pocos micrones fuera de la membrana.Ademas, resulta crucial el grosor de membrana utilizado. Como ya expresamosmas arriba, el espesor de la membrana vive entre los 5 y los 20 nanometros de-pendiendo de la celula. Toda esta exploracion geometrica es fundamental paraparametrizar los modelos y a ella dedicamos una buena parte del tiempo involu-crado en este trabajo. Algunos de los resultados de este estudio se presentaranen los capıtulos 4 y 5.

Un punto a destacar es el relativo al tratamiento de las mallas de elementosfinitos utilizadas. Nuestro mallador ha tenido que ser sometido a rigurosas prue-bas de consistencia hasta adecuarlo a nuestro problema, ademas de compararlos resultados con otros similares. Algunas de las pruebas llevadas a cabo eneste analisis se presentan en el capıtulo 4 .

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Los resultados numericos obtenidos son comparados con datos experimenta-les existentes en la literatura. Cada uno de los modelos por separado se comparatambien con resultados numericos provistos por otros codigos [16, 17]. En generalhemos obtenido muy buenos acuerdos con los experimentos, como se mostraraen el capıtulo 6.

Los modelos complejos proveen una gran cantidad de resultados que es ne-cesario manipular adecuadamente para poder comprender la informacion quedichos datos proveen ademas de entender si el modelo esta funcionando bien omal. Las tecnicas utilizadas para el analisis de datos se explican en la seccion3.6.

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2. Fundamentos teoricos

2.1. Potencial electrico

El potencial electrico sobre el dominio es generado por dos electrodos sepa-rados una distancia L (a determinar segun el caso a estudiar) entre los que seaplica una diferencia de potencial constante. Dicho potencial se calcula en cadapunto del dominio considerado mediante la ecuacion de Laplace suponiendo queen el medio no hay cargas electricas libres. Esta ecuacion se resuelve numerica-mente mediante el metodo de elementos finitos (que sera descrito en detalle ensecciones siguientes)

∇(σ∇φ) = 0 (1)

donde φ representa el potencial electrico y σ la conductividad del materialde cada medio. Las conductividades de los medios intra y extra celular sonaproximadamente del mismo orden, pero la de la membrana es varios ordenesde magnitud menor a ellos, por lo que se produce un efecto de aislamientoelectrico del interior de la celula para con el exterior, al generarse en el contornouna diferencia de potencial denominado potencial transmembrana (PTM) [6].Al aplicar un campo exterior dicho potencial modifica su forma e intensidad.

Este potencial se obtiene mediante una sencilla ecuacion que mide la dife-rencia de potencial a traves del espesor de la membrana:

PTM = φi − φe (2)

Donde φi es el potencial del lımite interior de la membrana celular y φe ellımite exterior. Analıticamente existen expresiones para calcular este potencial[6]en funcion del campo aplicado, el angulo polar y diversos factores geometricos,como se observa en la siguiente ecuacion:

PTM = fsER cosϕ (3)

fs =3λo[3dR

2λi + (3d2R− d3)(λm − λi)]2R3(λm + 2λo)(λm + 1

2λi)− 2(R− d)3(λo − λm)(λi − λm)(4)

Donde E es el campo electrico aplicado, R el radio celular, ϕ es el angulopolar sobre la membrana, d es el espesor de la membrana. En la ecuacion 4λo, λi y λm refieren a las conductividades del medio extracelular, citoplasmay membrana respectivamente. Sabiendo que λm es al menos cinco ordenes demagnitud mas chico que λo y λi el factor fs es aproximadamente 3/2, por lotanto la ecuacion final toma la forma:

PTM =3

2ER cosϕ (5)

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2.2. Tensor de Tensiones de Maxwell

El potencial aplicado a la membrana introduce una tension mecanica sobrela misma que sera el motor de la deformacion efectiva. Para hallar esta tensionse utiliza el llamado Tensor de tensiones de Maxwell, un tensor de segundo ordenque representa la interaccion entre los campos electromagneticos y las partıculascargadas que conforman determinado material. Dado un campo electrico E sobreun conjunto de cargas de densidad ρ la fuerza que este ejerce puede expresarsemediante la fuerza de Lorenzt [7]:

f ≡ ρE + J×B (6)

Donde J es la densidad de corriente y B el campo magnetico. Ahora sireemplazamos las densidades de corriente y carga utilizando las ecuaciones deMaxwell:

ρ = ε0∇E (7)

J =1

µ0∇×B− ε0

∂E

∂t(8)

obtenemos

f = (ε0∇E)E +[ 1

µ0∇×B− ε0

∂E

∂t

]×B (9)

Donde ε0 y µ0 son las permitividad electrica y permeabilidad magnetica enel vacıo. Derivando en el tiempo con la regla del producto:

∂

∂t(E×B) =

∂E

∂t×B + E× ∂B

∂t(10)

Y aplicando la ley de Faraday

∂B

∂t= −∇×E (11)

se obtiene:

∂E

∂t×B =

∂

∂t(E×B)−E× ∂B

∂t(12)

∂E

∂t×B =

∂

∂t(E×B) + E× (∇×E) (13)

Si insertamos (13) en (9) y operando con identidades de algebra vectorialobtenemos una expresion para la fuerza:

f = ε0[(∇E)E+(E∇)E]+1

µ0[(∇B)B+(B∇)B]−1

2∇(ε0E

2+1

µ0B2)−ε0

∂

∂t(E×B)

(14)

8

Si no existen campos magneticos aplicados esta expresion puede resumirseen forma compacta a:

f = ∇T (15)

donde T representa al tensor de tensiones de Maxwell [7]:

Tij ≡ ε0

(EiEj −

1

2δijE

2)

(16)

Donde δij es la Delta de Kronecker. La fuerza total se obtiene integrandoen volumen la expresion 16. Es importante resaltar que el tensor es simetricoTij = Tji[7].

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2.3. Deformacion elastica de la membrana

A partir de las tensiones generadas por el Tensor de Maxwell calculadascomo se ha descripto en la seccion anterior, se calculan las deformaciones sobrela membrana. Para ello se utiliza un modelo basado tambien, como en el caso delcalculo de potencial, en elementos finitos. En este caso, sobre el mismo malladosobre el que se definio el problema de campo, se pasa a resolver un problemamecanico.

Como se esta trabajando con un sistema de coordenadas cilındricas la dis-tribucion de tensiones σij sobre un elemento de volumen toma la forma de laFigura 1. Tanto el tensor de tensiones como el de deformaciones poseen seiscomponentes independientes (eq. 17 y 18)

{σ}t = {σrrσθθσzzσrθσzθσrz} (17)

{ε}t = {εrrεθθεzzεrθεzθεrz} (18)

En un material elastico la tension se relaciona con la deformacion mediantela ley de Hooke que toma forma matricial y se puede obtener a partir de laecuacion 19 donde D es la matriz que define la rigidez de cada material, estase puede apreciar en la ecuacion 20, donde E es el modulo de Young, µ es elmodulo de Poisson, d = 1−µ

1−2µ , b = µ1−2µ

{σ} = [D]{ε} (19)

[D] =E

1 + µ

d b b 0 0 0b d b 0 0 0b b d 0 0 00 0 0 1/2 0 00 0 0 0 1/2 00 0 0 0 0 1/2

(20)

De la teorıa de elasticidad sabemos que el vector deformacion total se rela-ciona con las funciones de desplazamiento u, v y w segun las direcciones r, θ yz a traves de las ecuaciones 21

erθ =1

r

∂µ

∂θ+∂v

∂r− v

r

erz =∂µ

∂z+∂w

∂r

eθz =∂v

∂z+

1

r

∂w

∂θ

err =∂u

∂r

eθθ =u

r+

1

r

∂v

∂θ

ezz =∂w

∂z

(21)

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Figura 1: Distribucion de tensiones en un elemento de volumen encoordenadas cilındricas

Las incognitas del problema son las funciones de desplazamiento, que se pue-den ver en las ecuaciones 22, y que surgen del analisis del problema mecanicode un medio al que se le aplican tensiones y sobre el que se producen las defor-maciones pertinentes siguiendo la ley de elasticidad lineal. En nuestro analisisnumerico, en el que consideramos simetrıa de revolucion alrededor del eje z, nosindependizamos de la variable θ, por lo que podemos eliminar dos componentesde los tensores de tension y deformacion (eq. 23 y 24).

u(r, θ, z)

v(r, θ, z)

w(r, θ, z)

(22)

u = f(r, z)

v = 0

w = g(r, z)

(23)

11

erz =∂µ

∂z+∂w

∂r

err =∂u

∂r

eθθ =u

r

ezz =∂w

∂z

(24)

Entonces eliminamos las columnas y las filas rθ y zθ de la matriz D delmaterial y de los vectores σ y ε, ecuaciones 25, 26 y 27 respectivamente, obte-niendo la relacion final entre tensiones y deformaciones con simetrıa de revolu-cion.[20, 21, 22, 23]

{σ}t = {σrrσθθσzzσrz} (25)

{ε}t = {εrrεθθεzzεrz} (26)

[D] =E

1 + µ

d b b 0b d b 0b b d 00 0 0 1/2

(27)

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3. Metodos numericos empleados

3.1. FEM

El metodo de elementos finitos (FEM, Finite Element Method) consiste enusar una formulacion integral para generar un sistema de ecuaciones algebrai-cas. Utiliza funciones llamadas de forma, continuas, para aproximar los valoresdesconocidos del problema.El metodo se aplica sobre ecuaciones diferenciales en derivadas parciales de se-gundo orden y puede caracterizarse de manera generica mediante una serie depasos sucesivos[13, 14, 21, 22, 24]:

A continuacion expresamos dichos pasos en el caso del calculo del potencial.Una extension al caso mecanico requiere de modificaciones sobre esta lista queno afectan a la logica del metodo y pueden hallarse en las referencias citadas.

Se discretiza el dominio en una malla formada por elementos unidos pornodos. En este trabajo estos elementos seran cuadrilateros. Los elementosdeben ser disjuntos y ocupar todo el domino, cada punto del mismo estaocupado por un solo elemento. Los nodos son los vertices de los elementosy pueden pertenecer a mas de uno a la vez.

Se determinan las funciones de forma a utilizar. Hay una funcion de formapor nodo del elemento y toman el valor 1 cuando se evalua en el nodosobre el que estan centradas y 0 cuando se evaluan en los demas nodos,interpolando el resto de la superficie del elemento.

Se plantea la ecuacion R(e) =∫vN(L(u) + fv)dv para cada elemento,

donde L(u) + fv = 0 es la ecuacion diferencial a resolver, N es un vectorcon las funciones de forma, y R(e) es el residuo del elemento que se quiereminimizar. Se iguala el residuo a 0 y se obtiene un sistema de ecuacioneslineales de la forma Ku = f donde K es una matriz de ne × ne, con ne lacantidad de nodos por elemento, u es el vector con los valores incognitade la ecuacion a resolver (el potencial sobre cada nodo en el caso electricoy los desplazamientos nodales en el caso mecanico) y f es un vector delongitud ne que contiene las condiciones de contorno y los terminos fuentesdel sistema. Para un sistema mecanico, la matriz K se denomina de rigidezy el vector f de fuerzas aplicadas.

Se ensamblan todas las matrices elementales en un sistema general, contantas ecuaciones e incognitas como nodos en la malla. El proceso deensamblaje se realiza reescribiendo cada sistema elemental obtenido en elpunto anterior por un sistema global de n× n, donde cada elemento de lamatriz de rigidez K se coloca en la posicion correspondiente al nodo querepresenta segun la numeracion global de los nodos.

Se agregan las condiciones de borde al sistema global. En algunos casoses posible realizar este paso al generar las ecuaciones elementales, es decirantes de ensamblar el sistema. Para la condicion de borde de Dirichlet,

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por ejemplo, en donde el valor en el nodo i esta prefijado, se reemplaza lafila i de la matriz de rigidez por una fila con 1 en la posicion i y ceros enlas demas posiciones, y reemplazando el valor de la posicion i del vectorde fuerza por el valor indicado por la condicion de borde, de modo que lasolucion esta determinada directamente en esa fila.

Por ultimo se resuelve el sistema con algun metodo algebraico iterativo.En el caso de esta tesis se utiliza un metodo de Gradientes Conjugadoscon precondicionador de Jacobi.

3.2. Geometrıa del sistema

En nuestro trabajo estudiamos una unica celula idealizada de forma esferi-ca y compuesta por dos materiales: el lıquido intracelular (citoplasma) y unamembrana celular. La celula se encuentra sumergida en un lıquido conductorextracelular. A este sistema se le aplica una diferencia de potencial electricoconstante por medio de dos electrodos equidistantes. Los electrodos se encuen-tran en los bordes superior e inferior del dominio, en la Figura 2 se puedeobservar un diagrama ilustrativo de esto.Para representar la celula se utilizara simetrıa axysimetrica, por lo cual solo sesimulara media circunferencia sobre un sistema cartesiano que representa a lascoordenadas radial (R) y axial (Z). En la Figura 3 se presenta un esquema dedicho sistema de coordenadas.

3.3. Condiciones de borde

Para la ecuacion 1 se usan las condiciones de borde de Dirichlet con poten-ciales fijos en los electrodos, esto se ve en la ecuacion 28, en donde φa es parael anodo, segun Figura 3 todos los nodos que z = −L/2, y φc para el catodo,todos los nodos que z = L/2, donde L es la separacion entre anodo y catodo.

φ = φa

φ = φc = 0(28)

Para las ecuaciones de deformacion consideramos que la membrana esta su-jeta en la direccion x, para los nodos que coinciden con el eje y y, opuestamente,fijo el movimiento en la direccion y para los nodos que coinciden con el ejex. Esta condicion es requerida ya que en todo problema mecanico es necesarioanular el movimiento en la menos un nodo en cada direccion para eliminar elmovimiento libre de nuestro sistema.

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Figura 2: Diagrama ilustrativo de la geometrıa utilizada.

15

Figura 3: Diagrama del sistema de coordenadas empleado para lassimulaciones

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3.4. Mallado

Como el mallado del dominio es de vital importancia y en particular en nues-tra aproximacion al problema estabamos interesados en conseguir una discretiza-cion optimizada de la membrana celular se procedio a construir uno incorporadoen el codigo. Para ello se eligieron elementos isoparametricos de cuatro nodosadaptativos a la geometrıa particular de nuestro sistema. Esto nos garantizo po-seer la capacidad de poder modificar y adecuar los elementos a la estructura denuestro sistema. Los parametros que se deben tener en cuenta para caracterizardicho sistema son:

Densidad de elementos

Separacion entre el anodo y el catodo

Radio de la celula

Espesor de la membrana

Capas de la membrana

Como se plantea utilizar elementos de cuatro nodos, a la hora de construir elmallador se tuvo en cuenta que para tener un mallado de calidad los elementosdeben poseer area maxima, lo que, nos dice que los angulos se deben aproximara 90 grados [19].

Para alcanzar esta premisa se enfrento el problema de adecuar la transicionentre los elementos de la membrana celular que describen media circunferencia ylos de los bordes. Para lo cual se procedio a dividir el dominio en cinco secciones,como se pueden observar en la Figura 4, luego en la Figura 5 se puede tener unpanorama general de como es la malla alcanzada.

El proceso de elaboracion de la malla para nuestro dominio es el siguiente:

Primero se generan los elementos de la membrana. Se describe media cir-cunferencia, se utilizan los parametros de radio celular, espesor de mem-brana, cantidad de capas y densidad de elementos, este ultimo indicaracuantas subdivisiones tendra la celula.

Segundo se generaron los elementos exteriores que siguen una disposicioncircular, para esto se procedio igual que con la membrana, pero se proponıaun aumento en el radio para que las lıneas resultaran cada vez mas rectas(una lınea recta es una circunferencia con radio infinito).

Tercero se generaron los elementos exteriores que siguen una disposicionrecta, estos debıan aumentar su tamano ya que a medida que nos alejamosde la zona de la membrana no es necesaria tanta precision. Se utiliza elparametro de separacion entre anodo y catodo para determinar cuandodetenerse.

En cuarto lugar se generaron los elementos que siguen una disposicioncircular internos de una forma similar al segundo paso.

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Figura 4: Sectores en los que se dividio la malla: 1. Interior celularrectos (rojo), 2. Interior celular curvo (verde), 3. Membrana (azul), 4.Exterior celular curvo (amarillo), 5. Exterior celular rectos (violeta)

Por ultimo se generaron los elementos que siguen una disposicion rectainternos de una forma similar al tercer paso.

3.5. Descripcion del Codigo

El codigo de partida, escrito en Fortran 90, resolvıa la distribucion de campoelectrico sobre el dominio, calculaba las tensiones sobre la membrana y resolvıael problema mecanico para obtener la deformacion inducida.

Lo que restaba implementar es la generacion de la malla, la carga de losparametros y la integracion de las diferentes subrutinas, ademas de acoplar elproblema de campo con el mecanico. Para ello se procedio a implementar uncodigo basado en el lenguaje de programacion C++ ya que posee una sintaxismas amena ademas de que el compilador facilita la integracion del codigo deFotran.

Como el principal objetivo de este trabajo fue analizar como se comportaba elsistema al variar los distintos parametros, se decidio no paralelizar el codigo queresolvıa el problema pero en su lugar se implementaron scripts para lanzar variasinstancias distintas del programa, cada una con un conjunto de parametrosdistintos, y ası con una sola corrida del script tener varios sets de resultados.

18

Figura 5: Ejemplo de malla utilizada con detalle de la membranacelular

Esto permitio agilizar la busqueda de parametros al comparar con resultadosexperimentales obtenidos en la literatura.

3.5.1. Campo electrico

Para calcular el campo electrico sobre este mallado se partio de la Ecuacion(1) a resolver sobre una malla generada por el mallador construido. En esteproblema la matriz de rigidez, que contiene informacion sobre conductividady coordenadas de los elementos, resulta simetrica definida positiva y con muypocos elementos distintos de cero.

3.5.2. Problema mecanico

Con el potencial definido sobre todo el dominio, se procede a establecer,utilizando el Tensor de Maxwell, las tensiones o fuerzas sobre la membrana.Resolviendo las ecuaciones de elasticidad se obtiene la deformacion final delsistema.

Para el caso de la ecuacion diferencial que gobierna al problema elastico, lasincognitas del problema se duplican, ya que en cada nodo existen dos desplaza-mientos posibles, uno por cada direccion. Cada vector incognita {U} para cadanodo i tendra dos componentes: U2i−1 en la direccion r y U2i en la direccion z.De esta forma todas las dimensiones de las matrices del sistema se duplicaran,esto se puede ver en la Figura 6.

Para resolver el problema mecanico partimos de la relacion entre las tensio-nes y los desplazamientos sobre el dominio, suponiendo pequenas deformaciones.Al aplicar el principio de desplazamientos virtuales (o trabajos virtuales) paraobtener las ecuaciones de equilibrio, basadas en que, para cualquier desplaza-miento virtual impuesto al dominio en el equilibrio, el trabajo interno virtual

19

Figura 6: En el problema elastico cada nodo posee dos variablesincognitas, una por cada direccion asociada a las dimensiones delproblema.

debe igualarse a los esfuerzos volumetricos y las fuerzas aplicadas desde el ex-terior. La ecuacion simplificada toma la forma:

1

2

∫V

σT · eEldV =

∫V

fV udV +

∫Γ

fExtΓ udΓ (29)

Donde el primer miembro representa al trabajo interno y el segundo se divideentre fuerzas volumetricas, fuerzas de superficies. En nuestro esquema supone-mos que no existen fuerzas externas aplicadas, y la unica fuente de deformaciones impuesta por la deformacion interna producto del tensor de Maxwell. Laforma final de la ecuacion sera

Λ(e) =1

2

∫V

σT · eEldV − 1

2

∫V

σMax · eEldV (30)

Donde(εEl)

es el vector deformacion elastica del elemento. Utilizando la leyde Hooke

Λ(e) =1

2

∫V

(εEl)T

[D](εEl)dV (31)

Donde [D] es la matriz del material. Si tenemos en cuenta que en el presentetrabajo solamente analizamos la deformacion elastica podemos escribir:

(e) =(εEl)

(32)

Donde (e) es la deformacion total. Introduciendo esta expresion en la integral

20

para la energıa elastica obtenemos:

Λ(e) =1

2

∫V

(e)T

[D] (e) dV (33)

Como las deformaciones totales (e) estan vinculadas a los desplazamientosnodales y las funciones de forma del elemento:

u = NiU2i−1 +0U2i+NjU2j−1 +0U2j +NkU2k−1 +0U2k+NlU2l−1 +0U2l (34)

v = 0U2i−1 +NiU2i+0U2j−1 +NjU2j +0U2k−1 +NkU2k+0U2l−1 +NlU2l (35)

Usando la notacion matricial:[u(r, z)v(r, z)

]=[N] [U (e)

](36)

Y aplicando las diferenciaciones a las funciones desplazamiento, obtenemosla relacion con el vector deformacion total utilizando la matriz de derivadas defunciones de forma [B]

erreθθezzerz

=

bi 0 bj 0 bk 0 bl 0Ni

r 0Nj

r 0 Nk

r 0 Nl

r 00 ci 0 cj 0 ck 0 clci bi cj bj ck bk cl bl

U2i−1

U2i

U2j−1

U2j

U2k−1

U2k

U2l−1

U2l

(37)

Donde Ni (i=1:4) son las funciones de forma lineales para los cuatro nodosi, j, k y l respectivamente; bi (i=1:4) son las derivadas de dichas funciones enla direccion radial y bi (i=1:4) las derivadas en direccion axial. Reemplazandoen las integrales de la energıa y minimizando de igual modo que en el caso decampo, obtenemos la ecuacion para la matriz de rigidez elemental donde ahoralas incognitas seran los desplazamientos nodales:[

K(e)]

=

∫V

[B]T

[D] [B] dV (38)

Y un vector fuerza asociado a cada contribucion del tensor de Maxwell alsistema de la forma: (

f (e))

=

∫V

[B] (σ)Mx

dV (39)

21

Los terminos elementales se ensamblan del modo ya explicado y se alcanzaun sistema algebraico de ecuaciones de dimension 2N × 2N

[K] (U) = (f) (40)

Las condiciones de contorno impuestas sobre el dominio seran desplazamien-to nulo en todos los bordes normales exteriores. Con lo que para la membranasignifica que los nodos situados sobre el eje radial no podran desplazarse endireccion z, mientras que los nodos situados sobre el eje axial no pueden des-plazarse en la direccion r, en la Figura 7 se puede observar como se distribuyenestas restricciones. ∫

σεdV =

∫V

fExtV udV +

∫V

fExtΓ udΓ (41)

22

Figura 7: Diagrama con las condiciones de contorno, los nodos enlos bordes solamente se pueden mover en un eje, mientras que los delas esquinas estan fijos.

23

3.6. Herramientas para analisis de resultados

Para poder analizar los resultados obtenidos por el proceso se utilizarondiferentes herramientas, tanto para la etapa de pruebas iterativas como para laetapa de analisis de resultados.

3.6.1. Jupyter Notebook

Jupyter es una herramienta con una interface web que permite crear docu-mentos interactivos [36], facilita el procesamiento y la visualizacion de datos.Cada documento creado recibe el nombre de Notebook y permite ejecutar codi-go en varios lenguajes de programacion.Los notebooks se dividen en unidades llamadas celdas. Cada celda puede con-tener texto o codigo, las que tengan codigo generan una salida que aparece pordebajo de ellas. En la Figura 8 se puede ver una celda con texto que le da eltıtulo Test al ejemplo, luego una celda con codigo y por debajo un grafico comoresultado.

Jupyter en sı mismo no tiene capacidad de generar graficos, ni de procesardatos, para esto es necesario utilizar bibliotecas especializadas del lenguaje deprogramacion que se utilice para escribir los notebooks. En nuestro caso se eli-gio el lenguaje Python [37], esta decision se baso en que es un lenguaje facilde aprender y que ofrece una gran variedad de bibliotecas, como por ejemploMatPlotlib [38], la cual brinda una interfaz amigable para generar una granvariedad de graficos con calidad de publicacion. Ademas, se utilizo la bibliotecaNumPy que brinda las herramientas fundamentales para computacion cientıfica[39].

Con este conjunto de herramientas se logro agilizar el trabajo de procesa-miento de datos, de una manera facil y completamente gratuita.

3.6.2. ParaView

Si bien con la herramienta anterior se pudo realizar gran parte del analisisde los datos, la tarea de analizar como se comportaba la malla de la membranaera demasiado complicada como para programarla desde cero. En la Figura 9se puede apreciar de una captura de pantalla de la interfaz de usuario del pro-grama.Para llevar adelante dicha tarea se utilizo el programa ParaView [40]. Esta esuna herramienta orientada a la visualizacion de grandes conjuntos de datoscientıficos. En el presente trabajo se utilizo para visualizar la geometrıa resul-tante luego de procesar el modelo.Con esta aplicacion se obtuvo una forma sencilla de tener un panorama generaldel resultado de un procesamiento, ya que permite ver la geometrıa resultantede la celula y la distribucion del campo electro magnetico.

24

Figura 8: Interfaz de usuario de Jupyter

Figura 9: Interfaz de usuario de ParaView

25

4. Modelo Electrico

En esta seccion se analizara la respuesta del modelo a los campos electricosaplicados entre los electrodos, prestando especial atencion al potencial trans-membrana generado en la superficie de la celula.

4.1. Analisis parametrico

El codigo se desarrollo de tal manera que pueda ser parametrizado facilmen-te. En primer lugar, se realizo un analisis parametrico de nuestro modelo paraintentar acotar el rango de validez del mismo, relativo a los rangos experimen-tales conocidos o estimados de cada uno de los parametros relevantes.

Despues de realizar una busqueda exhaustiva en la bibliografıa disponiblesobre el tema, se obtuvo una lista de parametros a relevar sensibles a la variaciondel potencial aplicado. Los mismos se listan en la Tabla 1.

Parametro Mınimo MaximoRadio celular 1 µm 20 µmEspesor membrana 1 nm 20 nmSeparacion anodo-catodo 100 µmDiferencia de potencial 1 V 100 VConductividad exterior 2× 10−8 S/µmConductividad interior 5× 10−7 S/µmConductividad membrana 1× 10−13 S/µm

Tabla 1: Rango de valores utilizados

4.2. Potencial electrico

En particular y basados en valores experimentales los graficos que siguenen esta seccion se realizaron con un valor del radio celular que representa eltamano aproximado de un globulo rojo, celula utilizada en diversas referencias[27, 26, 28].

La densidad del campo electrico en general fue fijada en 100 kV/m, uno delos valores usuales utilizados en distintas referencias [26, 30, 31].

Por ultimo para los valores de la conductividad se eligieron valores tomadosde la referencia[26, 9].

En la Figura 10 se puede observar el comportamiento del campo electrico entodo el recinto, mientras que en la Figura 11 en la vecindad de la celula y ensu interior. Si bien en una primera observacion parece que el campo intracelulares constante, un analisis detallado como el realizado en la figura 12 muestra

26

como al modificar la escala se puede apreciar una variacion de densidad de al-rededor de 1.8 kV/m, mas de 50 veces inferior que el inducido por los electrodos.

El mallador implementado para este trabajo nos permite agregar elementosdentro de la membrana por lo que podemos observar en detalle como se comportael campo dentro de la misma. En la Figura 13 se grafica el comportamientodel campo en la region mas cercana del catodo, donde la densidad del campoelectrico es de alrededor de 73 MV/m. Por otro lado en la Figura 14 se observael comportamiento del campo en la zona que mas cercana al anodo, en dondesu densidad es de la misma intensidad que en el sector opuesto. Por ultimo laFigura 15 nos muestra la forma del campo en el sector de la membrana queesta a la misma distancia del anodo y del catodo, en este caso la densidad depotencial es mucho menor, se puede apreciar como la misma se reduce a medidaque se acerca al centro de la celula. Esta variacion en la densidad de potencialsera estudiada con detalle en la seccion de potencial transmembrana.

Figura 10: Diferencia de potencial en todo el entorno

27

Figura 11: Diferencia de potencial en todo el entorno

Figura 12: Escala ajustada para ver detalle de V dentro de la celula

28

Figura 13: Escala ajustada para ver detalle de V dentro de la mem-brana en el sector superior

Figura 14: Escala ajustada para ver detalle de V dentro de la mem-brana en el sector inferior

Figura 15: Escala ajustada para ver detalle de V dentro de la mem-brana en el sector central

29

4.3. Potencial transmembrana

En la Figura 16 se compara el potencial transmembrana (PTM) calculadode forma teorica desde la ecuacion 5 con el resultado obtenido de nuestra si-mulacion utilizando la formula de la ecuacion 2, los parametros utilizados paraconfigurar el programa estan en la Tabla 2. En esa figura se puede observar unacuerdo excelente entre ambas predicciones. En la Figura 17 se puede apreciar elerror porcentual entre las dos medidas. En todo momento este error no alcanzaal 1 %, una diferencia explicable por el error introducido en el metodo numericoutilizado.

Figura 16: Comparacion del PTM teorico y el obtenido a partir dela simulacion para una celula de 10 µm de radio y una densidad depotencial de 100 kV/m

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Figura 17: Error porcentual del PTM obtenido a partir de la simu-lacion contra el calculado teoricamente

Parametro ValorRadio celular 10 µmEspesor membrana 5 nmSeparacion anodo-catodo 100 µmDiferencia de potencial 100 kV/mConductividad exterior 2× 10−8 S/µmConductividad interior 5× 10−7 S/µmConductividad membrana 1× 10−13 S/µm

Tabla 2: Rango de valores utilizados

Al analizar la Ecuacion (5) se puede deducir que el valor del potencial trans-membrana es directamente proporcional al radio celular y a la diferencia depotencial, esto quiere decir que duplicar el potencial tendrıa el mismo resultadoque duplicar el radio celular.En la Figura 22 se puede ver como varıa el PTM al variar el radio celular y enla Figura 20 al variar la densidad de campo, si comparamos ambas figuras sepuede confirmar que el modelo acompana a lo predicho por la teorıa.

Por ultimo, se analizo como evoluciona el error al evaluar un rango de valoresdejando los otros constantes. En primer lugar se vario el ancho de la membra-na, desde 1,0nm a 20nm, este resultado se puede observar en la Figura ??, lasecuaciones (3) y (4) tienen en cuenta este valor, pero la aproximacion utilizada,ecuacion (5), no. En la Figura 18 se puede apreciar que la diferencia es mınima

31

entre los distintos valores, y al analizar el error porcentual en la Figura 19 sepuede ver que para 1,0nm el error ronda el 2,7 % mientras que para el resto esinferior al 1,0 %.

Tambien se vario el radio celular (Figura 22) y la densidad del campo electri-co (Figura 20). En la Figura ?? se puede ver que al variar el campo electrico elerror es constante, todas las curvas terminan solapadas, pero en la Figura ?? alvariar el radio dicho error cambia de forma considerable, aunque cabe destacarque el error no es proporcional al valor del radio. Se puede deducir de aquı quela variacion en la geometrıa es la principal causante de las diferencias entre losvalores teoricos y medidos.

Figura 18: Comparacion de PTM para distintos espesores de mem-brana.

32

Figura 19: Error porcentual del PTM para distintos espesores demembrana, se puede observar que el error es inversamente proporcio-nal al espesor.

Figura 20: Comparacion de PTM para distintas densidades de cam-po electrico

33

Figura 21: Error porcentual del PTM para distintas densidades decampo electrico, todas la curvas se solaparon, lo que indica que elerror se mantiene constante al variar la densidad de campo.

Figura 22: Comparacion de PTM para distintos radios celulares

34

Figura 23: Error porcentual del PTM para distintos radios celulares,en este grafico se observan los valores mas altos de error porcentualy se puede ver que en este caso el error no es proporcional al radio.

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5. Deformacion de la membrana

Para analizar la deformacion de la membrana se fijaron los valores paralos parametros relevantes del problema listados en la Tabla 3, los parametrosgeometricos y de las conductividades se tomaron de [15], mientras que los valoresde elasticidad se obtuvieron de [26].

Parametro ValorRadio celular 10 µmEspesor membrana 5 nmSeparacion anodo-catodo 100 µmConductividad exterior 2× 10−8 S/µmConductividad interior 5× 10−7 S/µmConductividad membrana 1× 10−13 S/µmDiferencia de potencial 1 kV/m - 100 kV/mModulo de Young extra celular 10−5dyn/µmModulo de Young membrana 0,003dyn/µmModulo de Young intra celular 10−5dyn/µmModulo de Poisson extra celular 0.499Modulo de Poisson membrana 0.49Modulo de Poisson intra celular 0.499

Tabla 3: Valores utilizados

5.1. Fuerza

El campo electrico aplicado es el generador de la tension sobre la membrana,a traves del tensor de Maxwell, analizado en la Seccion 2.2. A partir de esatension puede estimarse una fuerza que actua sobre la membrana celular. En laFigura 24 se puede observar la evolucion de dicha fuerza en los polos de la celulaa medida que se varıa el campo electrico. Claramente la tension generada sobrela membrana aumenta con el campo aplicado en forma exponencial cuando seesta cerca del lımite de resistencia de la bicapa lıpida.

En la Figura 25 se grafican las componentes radial y axial de la fuerzaestimada, dependiendo del angulo axial, presentando un punto maximo en los0.4 y 2.7 radianes aproximadamente, zona de mayor exigencia para la membrana.

36

Figura 24: Evolucion de la fuerza segun la densidad de campoelectrico aplicado, se puede observar un comportamiento exponen-cial

Figura 25: Modulo de las componentes Z y R de la fuerza segun elangulo axial

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5.2. Deformacion

La tension ejercida sobre la membrana celular produce una deformacion queaumenta directamente con el campo electrico, del mismo modo que la fuerza.En la Figura 26 puede verse como varıa esa deformacion en una imagen delcontorno de la celula comparada, al incrementarse el campo electrico.

Figura 26: Contorno celular para varias densidades de campo electri-co.

Es posible observar que para potenciales mayores a 80kV/m se produce unadepresion pronunciada en el eje R, en la Figura 27 se aprecia el detalle de lazona afectada, en la Seccion 6 se hacen comparaciones con mediciones hechas acelulas reales y este comportamiento no se observa, lo que nos indica que estamosllegando a un punto donde el modelo numerico no representa la realidad.

En la Figura 28 se puede ver la evolucion de los radios en ambos eje paralas distintas intensidades del campo electrico, las curvas resultantes tienen unaforma exponencial, pero la del eje Z tiene una mayor aceleracion.

38

Figura 27: Detalle del contorno celular en la proximidad Z = 0 paravarias densidades de campo electrico.

39

Figura 28: Variacion del radio celular en ambos ejes al variar laintensidad del campo.

40

5.3. Potencial transmembrana sobre la celula deformada

Al variar la forma de la celula es de esperar que el potencial transmembranase vea afectado tambien. Esto puede observarse en los resultados graficados enlas Figura 29 y 30 en donde se compara el PTM para una celula sin deformaciony con deformacion inducida por el campo aplicado.

Figura 29: Comparacion del PTM para una celula en reposo y unadeformada para un campo de 35kV/m

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Figura 30: Comparacion del potencial transmembrana para unacelula en reposo y una deformada para un campo de 80kV/m

Se puede observar que en los extremos los valores absolutos del potencialaumentan, estos extremos coinciden con el polo superior e inferior de la celu-la, detalle graficado en la Figura 31, en donde la escala de colores senala laintensidad del potencial transmembrana.

42

Figura 31: Representacion visual del potencial transmembrana parauna celula en reposo y una deformada para una densidad de campoelectrico de 80kV/m

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5.4. Lımite del modelo

Al aumentar el potencial aplicado sobre el sistema es posible observar quedespues de cierto punto el modelo comienza a comportarse de manera irregular.En la Figura 32 se muestra como para una diferencia de potencial de 125kV/men la zona de la vecindad de las puntas de la celula comienza a aparecer unasuperposicion de elementos, esta es mınima y es para elementos que estan fuerade la celula.

Figura 32: A la izquierda se puede contemplar como a los 125kV/mla superposicion de elementos esta fuera de la celula, a la derecha undetalle del mismo.

En la Figura 33 se observa que al aumentar la densidad de campo a 185kV/mla superposicion de elementos es considerable y en este caso la celula se veafectada.

Por ultimo, en la Figura 34, observamos que al aumentar el campo de granmanera (500kV/m), la superposicion es extrema.

Como los problemas se dan cuando hay una deformacion celular considerable,se puede concluir que siempre y cuando la deformacion se mantenga en un rangono muy amplio el modelo es valido. Para deformaciones extremas el mismocomienza a tener sectores que dejan de ser confiables.

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Figura 33: A los 185kV/m la superposicion de elementos es consi-derable, a la izquierda un plano general de la celula, a la derecha eldetalle de la superposicion

Figura 34: Superposicion para 500kV/m, a la izquierda un planogeneral, a la derecha el detalle de un extremo de la celula

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6. Comparacion con resultados experimentales

En primer lugar, la busqueda bibliografica estuvo orientada hacia la deter-minacion de valores aceptados para los modulos de Young y de Poisson de unamembrana celular. En este conjunto de trabajos se suele aplicar una fuerza so-bre un tipo de celulas determinado (por lo general globulos rojos) y se mide ladeformacion obtenida sobre estas. Los distintos metodos reportados presentanresultados levemente diferentes, esto es debido a que cada uno interactua deforma distinta con la celula e introduce fuerzas que no permiten calcular deforma rigurosamente exacta los valores de los modulos antedichos.

Algunos de los metodos encontrados son:

Aspiracion por micropipeta: Se aspira una celula con una micropipeta yse mide su deformacion. [29]

Microreologıa de esferas magneticas: Se le colocan pequenas esferas ferro-magneticas a la celula y luego se aplica un campo magnetico para que laspresionen. [34]

AFM (Microscopio de fuerza atomica): Se aplica un fuerza mediante unapunta empujada con un laser. [33]

Pinzas opticas: Se adhieren dos perlas a extremos opuestos de la celula ymediante un laser se aplica fuerza para separarlas. [27]

Campo de alta frecuencia: Se adhiere la celula a un electrodo y se aplicaun campo electrico de alta frecuencia para generar una deformacion. [26]

Solamente los dos ultimos metodos nos ofrecıan una deformacion que sepuede comparar con nuestro modelo, en las siguientes secciones se presentanlos resultados obtenidos. Por otro lado, si bien el metodo de Microscopio defuerza atomica no proporciona una deformacion comparable con nuestro modelo,se encontro bibliografıa en donde se utilizo dicho metodo para comparar laspropiedades elasticas de celulas sanas contra celulas cancerıgenas, en base aestos resultados experimentales se simulo el comportamiento de ambos tipos decelulas en la seccion 7.

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6.1. Campo electrico de alta frecuencia

En la bibliografıa encontrada [26] se fijan globulos rojos y se les aplica uncampo electrico alterno de alta frecuencia (entre 0.5 MHz y 10 MHz) para me-dir la deformacion inducida. Con ello se calcula la fuerza ejercida por el campoelectrico y en base a la deformacion medida se obtiene la magnitud del modulode elasticidad y de viscosidad.En la Figura 35 se pueden ver los resultados del experimento citado en referen-cia [26].

Figura 35: Figura tomada de [26], diferentes estados de deformacionde un globulo rojo para diferentes densidades de campos electricos,de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo 5, 20, 35, 50, 150,0 kV/m respectivamente, con la herramienta Medir del programaAdobe Acrobat Reader se agregaron las dimensiones de cada imagen.

Cabe aclarar que las fuerzas estimadas en el trabajo de referencia presentandiferencias con las calculadas en este trabajo ya que los autores de dicha investi-gacion proponen una fuerza distribuida sobre todo el volumen celular mientrasque en nuestro modelo se plantea que el campo electrico actua solamente sobrela membrana de la celula, por lo tanto, la fuerza que estimamos es menor. Noobstante, se pudieron obtener resultados similares para la deformacion.

Al realizar las ejecuciones para simular la deformacion obtenida en referenciase pudo encontrar que el modulo de Young de la membrana no era constante, amedida que la deformacion aumentaba la cantidad de campo electrico necesaria

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para obtener una deformacion similar aumentaba. En la Tabla 4 se encuentranlos parametros utilizados.

Parametro ValorRadio celular 3.9 µmAncho membrana 0.005 nmDiferencia de potencial 5 - 150 kV/mModulo de Young extra celular 10−7dyn/µmModulo de Young membrana 0.0027 - 0.035 dyn/µmModulo de Young intra celular 10−7dyn/µmModulo de Poisson extra celular 0.499Modulo de Poisson membrana 0.49Modulo de Poisson intra celular 0.499

Tabla 4: Valores utilizados

En la Figura 36 se pueden ver los valores del modulo de Young de la membra-na para los cinco puntos que se comparan, ademas de la curva de interpolacionde dichos puntos. Se utilizo una curva logıstica de cinco parametros [32], cuyaformula es la indicada en la Ecuacion 42 y los parametros en la Tabla 5.

y = d+(a− d)(

1 +(xc

)b)g (42)

Parametro Valora 2,643 · 10−3

b 3,645c 64,31d 14,34g 7,113 · 10−4

Tabla 5: Parametros de la ecuacion 42

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Figura 36: Los puntos azules representan los valores del modulode Young de la membrana encontrados para densidades de campoelectrico de5, 20, 35, 50 y 150 kV/m, la lınea roja es la funcion queaproxima dichos puntos.

En la Figura 37 se agrego a la imagen capturada de la referencia citada lasilueta de la membrana predicha en nuestra simulacion. En la tabla 4 se en-cuentran los parametros utilizados. Con estos resultados se observa que paravalores de 0, 5 y 20 kV/m la deformacion obtenida por el modelo se acerca a lareportada en referencia, pero para los valores de 35, 50 y 150 kV/m comienzana observarse diferencias:En primer lugar, la deformacion sobre el eje R en nuestro modelo es menospronunciada que la experimental.En segundo lugar, se puede observar que en el extremo superior de la celula elmodelo no representa la curvatura observada experimentalmente.

Sin embargo, nuestro modelo reproduce cualitativamente la deformacion ge-neral de la celula. Por otro lado, en la referencia de la que se obtuvo este ex-perimento indican que la deformacion tan pronunciada en los polos de la celulapuede explicarse a una interaccion entre la membrana y el citoesqueleto, situa-cion imposible de reproducir con el actual modelo analizado. Cabe destacar quedistintos tipos de celula representarıan distintos comportamientos frente a losmismos estımulos mecanicos. En referencia [33] se analiza el comportamientofısico de las celulas dependiendo si estas son sanas o cancerıgenas. Explican losautores que la causa de esta diferencia de comportamiento se debe a un cambioen la morfologıa interior de la misma. En la seccion 7 presentamos un breve

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Figura 37: Comparacion de la imagen original de la referencia [26]con la deformacion obtenida con nuestro modelo (lıneas en rojo), deizquierda a derecha y de arriba hacia abajo 5, 20, 35, 50, 150, 0 kV/mrespectivamente.

analisis de esta variacion morfologica.

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6.2. Pinzas opticas

En este metodo [27] se adhieren a un globulo rojo perlas de sılice, estas estandentro de pinzas opticas a las que se le aplica un laser para separarlas, de estaforma se consigue estirar la membrana celular con dos fuerzas opuestas. La fuer-za aplicada se calibra con el laser, se mide la deformacion que se produce en lamembrana y en base a estos dos resultados se calcula el modulo de elasticidad.En la Figura 38 se muestran los resultados a los que llego el paper, y los parame-tros utilizados en nuestro modelo son los presentes en la tabla 6.

Parametro ValorRadio celular 3.8 µmAncho membrana 0.05 nmDiferencia de potencial 0.25 - 5 kV/mModulo de Young extra celular 10−9dyn/µmModulo de Young membrana 25× 10−7dyn/µmModulo de Young intra celular 10−9dyn/µmModulo de Poisson extra celular 0.49Modulo de Poisson membrana 0.44Modulo de Poisson intra celular 0.49

Tabla 6: Valores utilizados

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Figura 38: Deformacion que indica [27] para distintas fuerzas apli-cadas, en rojo se puede ver las dimensiones de las celulas, estas seagregaron utilizando la herramienta Medir del programa Adobe Acro-bat Reader.

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En la Figura 39 se comparan los valores obtenidos por Henon et al con lossimulados. Se puede ver que se logro una buena aproximacion de los resultadosexperimentales manteniendo los valores de los modulos de Young y de Poissonconstantes, esto se debe a que la deformacion fue lo bastante pequena comopara permanecer en el regimen lineal.

Figura 39: En el eje X esta la fuerza aplicada sobre la celula y enel eje Y se encuentra la relacion del radio de los polos de la celuladeformada sobre el de la celula original, la lınea azul representa a lasmediciones de [27] mientras que la roja a los valores obtenidos connuestro modelo.

En todos los resultados aquı presentados se observa que nuestro modelo pre-dice deformaciones similares a las reportadas en las diferentes fuentes consulta-das en bibliografıa. Sin embargo, es necesario volver a decir que esto se consiguesiempre y cuando la deformacion sea pequena y los parametros utilizados noaparten al modelo de la linealidad.

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7. Comportamiento mecanico de celulas sanas yenfermas

Se pueden encontrar referencias bibliograficas que indican que las celulas can-cerıgenas presentan propiedades mecanicas diferentes a las sanas. Estas varıanconsiderablemente dependiendo del tipo de cancer que se este estudiando y laetapa del mismo, pero siempre se observa que las celulas enfermas son mas blan-das que las sanas. En la Figura 40 se presentan mediciones del modulo de Youngde celulas de diversa procedencia y condicion obtenidas por [33].

Figura 40: Captura del artıculo [33] en donde se compara el modulode Young de celulas sanas y celulas cancerıgenas, aproximados confunciones Gaussianas, (A) celulas de pecho, (B) celulas de prostata,los graficos de color azul representan celulas sanas, el resto son can-cerıgenas. La equivalencia de unidades es 1kPa = 100dyn/µm, peroen este trabajo hasta el momento se utilizaron Modulos de Young deglobulos rojos que son significativamente menores

Si bien las celulas estudiadas en [33] presentan un modulo de Young variosordenes de magnitud mayor que los globulos rojos utilizados en este trabajo

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Parametro ValorRadio celular 10.0 µmAncho membrana 0.015 µmDiferencia de potencial 0 - 45 kV/mModulo de Young extra celular 10−9dyn/µmModulo de Young intra celular 10−9dyn/µmModulo de Young membrana 5× 10−7- 25× 10−7dyn/µmModulo de Poisson extra celular 0.499Modulo de Poisson membrana 0.49Modulo de Poisson intra celular 0.499

Tabla 7: Valores utilizados

como referencia, se realizo un analisis de este comportamiento utilizando nues-tro modelo, variando el valor del modulo de Young. Los valores empleados seencuentran en la Tabla 7.

En la Figura 41 se puede observar que a medida que el valor del modulode Young para la membrana se hace mas chico, la deformacion aumenta, estadiferencia se acentua mas al aumentar la densidad del campo electrico. La Figura42 muestra el PTM para para una densidad de campo de 35 kV/m, se puedever que para las celulas que tienen un modulo de Young menor (por lo tanto sedeforman mas) poseen un valor del modulo del PTM en los polos mayor.

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Figura 41: Radio de la celula en los polos segun densidad de cam-po aplicado, para distintos modulos de Young de la membrana, seve claramente que al disminuir el modulo de Young la deformacionaumenta.

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Figura 42: Comparacion del PTM para una densidad de campoelectrico de 35kV/m de una celula en reposo con varias celulas defor-madas, cada una de estas ultimas con un modulo de Young diferente.Se puede ver que al reducir el modulo de Young (celula mas blanda)el modulo del PTM en los polos (extremos del grafico) aumenta.

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8. Conclusiones

A lo largo de este trabajo se ha desarrollado un modelo numerico que simu-la la deformacion de la membrana celular en presencia de un campo electricoexterior. El campo sobre el dominio de resolucion predice un potencial induci-do sobre la membrana que concuerda con el calculado analıticamente para unamembrana esferica. En base a dicho potencial inducido se determina la tensionsobre la membrana y la correspondiente deformacion suponiendo un comporta-miento elastico lineal y geometrıa esferica. El modelo fue comparado con datosexperimentales obteniendose resultados similares dentro de los rangos de va-lidez establecidos por la suposicion de elasticidad lineal. Cabe aclarar que enlos datos reportados en la literatura, se observa que la deformacion alcanza unlımite para ciertos valores de campo aplicado (o sea fuerza aplicada), en dondeel comportamiento claramente abandona el rango lineal. Es factible decir queese punto tambien establece el rango de aplicabilidad de nuestro modelo.

Teniendo en cuenta dicho rango de prediccion, el modelo reproduce un nume-ro considerable de experiencias reportadas en la literatura, por lo que podemosafirmar que en su estado actual resulta adecuado para predecir la deforma-cion de las membranas ante campos electricos aplicados. Por este motivo seraacoplado a otros modelos desarrollados en el grupo de Sistemas Complejos delDepartamento de Computacion de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturalesdestinados a describir el transporte de sustancias a traves de la apertura deporos en la membrana ante campos electricos aplicados, para lo cual se necesitaconocer el estado de tension y deformacion de la bicapa lıpida.

Como trabajo a futuro continuacion de esta tesis se propone:

a Comparar el modelo con resultados de otro tipo de celula, actualmentesolo se utilizo literatura que medıa la deformacion en globulos rojos.

b Determinar los parametros adecuados para los tipos de celula a los que seaplica electroporacion como tratamiento.

c Explorar el rango de no linealidades para estimar la deformacion en casosextremos.

d Acoplar este modelo con los ya desarrollados para la evolucion de la po-rosidad y transporte a traves de la membrana.

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A. Diagrama de flujo del codigo

En la Figura 43 se puede apreciar como es el flujo que realiza el programapara llevar al cabo sus tareas, los pasos son:

1. Carga de parametros: cada uno de los parametros necesarios para armarel modelo

2. Validacion de parametros: revisa si existe algun parametro inconsistente

3. Creacion de malla

4. Inicializacion solver: Arma el sistema de ecuaciones para resolver el modelopor el metodo de elementos finitos

5. Validacion del sistema: revisa si el sistema resultante es valido

6. Resolucion problema electrico

7. Guardado de resultados problema electrico

8. Resolucion problema mecanico

9. Guardado de resultados problema mecanico

10. Resolucion problema electrico para la malla deformada

11. Guardado de resultados problema electrico para la malla deformada

Figura 43: Diagrama de flujo del programa

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B. Instalacion del programa

El proyecto fue probado solamente en ambientes Linux, aunque no tiene nin-guna limitacion para correr en ambientes Windows siempre y cuando se tenganlos compiladores adecuados.

Para poder compilar y ejecutar el proyecto se requiere tener instalado lossiguientes programas:

git

build-essential

g++

gfortran

Cuando se posean las dependencias mencionadas antes el primer paso esclonar el proyecto:

$ git clone https://github.com/JuanMarchese/MeshAndSolver.git

Luego, hay que compilarlo ejecutando los siguientes comandos:

$ cd MeshAndSolver

$ make

Una vez hecho esto ya se puede ejecutar el programa, para ver cuales son lasformas de llamarlo hay que ejecutar lo siguiente:

$ ./MeshAndSolver -h

Esto nos mostrara un texto de ayuda donde se explica como pasar losparametros necesarios, en la siguiente seccion se detalla cada uno de ellos.

C. Parametros de entrada

Los parametros que recibe el programa se pueden ver en la Tabla 8. Estosparametros pueden ser pasados por lınea de comando o se le puede indicar alprograma un archivo de configuracion.

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Nombre parametro Tipo DescripcionRadio interior Numero decimal Distancia desde el centro de la

celula a la parte interior de lamembrana

Radio exterior Numero decimal Distancia desde el centro de lacelula a la parte exterior de lamembrana

Iteraciones celula Numero entero Cantidad de divisiones quetendra la celula alrededor delcontorno de la membrana

Capas de la membrana Numero entero Cantidad de capas que habra en-tre la parte exterior de la mem-brana y la interior

Potencial Numero decimal Diferencia de potencial entre elanodo y el catodo

Directorio de salida Texto Ruta del directorio donde seguardaran los archivos con los re-sultados

Sufijo de archivos Texto Sufijo que se le agregan a los ar-chivos de resultados

Sigma interior Numero decimal Valor del Sigma para el citoplas-ma

Sigma exterior Numero decimal Valor del Sigma para el medio ex-terior

Sigma membrana Numero decimal Valor del Sigma para el interiorde la membrana

Modulo Young interior Numero decimal Valor del modulo de Young parael citoplasma

Modulo Young exterior Numero decimal Valor del modulo de Young parael medio exterior

Modulo Young membrana Numero decimal Valor del modulo de Young parala membrana

Modulo Poisson interior Numero decimal Valor del modulo de Poisson parael citoplasma

Modulo Poisson exterior Numero decimal Valor del modulo de Poisson parael medio exterior

Modulo Poisson membrana Numero decimal Valor del modulo de Poisson parala membrana

Tabla 8: Parametros de entrada

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D. Archivos de salida

A continuacion se describen los distinto archivos de salida, tener en cuentaque como habıa mas de un archivo se parado por comas (csv) se agregaron letrasa algunas extensiones, de esta manera los archivos que pertenecen a una mismacorrida tienen el mismo nombre, solamente con la extension se puede conocercual es el contenido del archivo:

Estructura malla:

• Nombre archivo: [prefijo]-[nnn].vtk

• Formato: Visualization Toolkit

• Descripcion: Guarda la estructura de la malla y los valores del campoelectrico para cada nodo de la misma. [nnn] es el numero de iteracion,[000] es el estado inicial en reposo, [001] contiene la malla luego dela deformacion.

Campo electrico membrana:

• Nombre archivo: [prefijo]-[nnn].csv

• Formato: Archivo separado por comas

• Descripcion: Contiene el valor del campo electrico para cada nodode los elementos de la membrana celular menos el valor del campoelectrico en el centro de la celula, la primera columna indica el angu-lo del elemento con respecto a la circunferencia de la celula, luegohay tantas columnas como capas de la membrana, de esta forma laprimera columna tendra el valor del PMT.

Deformacion membrana:

• Nombre archivo: [prefijo]-[nnn].dcsv

• Formato: Archivo separado por comas

• Descripcion: Contiene el desplazamiento de cada nodo de los elemen-tos de la capa exterior de la membrana celular, la primera columnacontiene el angulo del elemento en la circunferencia de la membrana,las siguientes dos columnas son las coordenadas Z y R originales decada nodo, y las ultimas dos columnas son las coordenadas Z y Rdesplazadas de los nodos.

Tension membrana:

• Nombre archivo: [prefijo]-[nnn].tcsv

• Formato: Archivo separado por comas

• Descripcion: Contiene el valor de cada elemento del Tensor de Max-well para cada nodo de los elementos de la membrana celular, laprimera columna contiene el angulo del elemento en la membrana

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celular, las siguientes dos columnas son las coordenadas R y Z delcentro del elemento, las siguientes cuatro columnas son cada uno delos componentes del Tensor de Maxwell, la ultima columna tiene ellargo del elemento.

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