MODELADO COMPUTACIONAL DEL COMPORTAMIENTO DE LAS CÉLULAS MADRE EN UN BIODISPOSITIVO IMPRESO EN 3D

DIANA VICTORIA RAMÍREZ LÓPEZ2131291

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE OCCIDENTEFACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE AUTOMÁTICA Y ELECTRÓNICAPROGRAMA INGENIERÍA MECATRÓNICA

SANTIAGO DE CALI2018

MODELADO COMPUTACIONAL DEL COMPORTAMIENTO DE LAS CÉLULAS MADRE EN UN BIODISPOSITIVO IMPRESO EN 3D

DIANA VICTORIA RAMÍREZ LÓPEZ

Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero Mecatrónico

Director ÁLVARO JOSÉ ROJAS, PhD.

Ingeniero Mecatrónico Magister en Ingeniería Industrial

PhD Imaging Science

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE OCCIDENTE FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE AUTOMÁTICA Y ELECTRÓNICA PROGRAMA INGENIERÍA MECATRÓNICA

SANTIAGO DE CALI 2018

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Nota de aceptación:

Aprobado por el Comité de Grado en cumplimiento de los requisitos exigidos por la Universidad Autónoma de Occidente para optar al título de Ingeniero Mecatrónico CARLOS ANDRES PEÑA Jurado PAOLA ANDREA NEUTA

Jurado

Santiago de Cali, 12 de Septiembre de 2018

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Este y cada uno de mis logros durante mi carrera y mi vida los dedico a mi mamá, mi abuela y mi hermana, quienes siempre serán mi mayor inspiración.

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AGRADECIMIENTOS

El desarrollo de este proyecto de grado no habría sido posible sin la participación de varias personas que me han acompañado no sólo durante el desarrollo de este sino durante mi carrera profesional.

Agradezco en primer lugar a mis amigos, con quienes compartí largos días y noches de estudio, creando el ambiente perfecto para que todos pudiésemos lograr nuestra meta. Entre ellos quiero agradecer especialmente a Manuela Cerón, por haber sido una gran compañera de estudio y trabajos, pero sobre todo una gran amiga. También agradezco a Camilo Amaya por haber creído en mis capacidades y haberme acompañado por tanto tiempo.

También quiero agradecer al Semillero de Tejidos y al Semillero de Manufactura Aditiva de la Universidad Autónoma de Occidente, pues fue aquí donde empezó a desarrollarse el proyecto que sería la base para mi proyecto de grado. De aquí quiero destacar la ayuda de María Isabel Melo y de la Doctora Paola Andrea Neuta Arciniegas, quien compartió conmigo su conocimiento y resolvió todas mis dudas relacionadas con la biología, que está fuera de mi formación profesional; gracias a ella, siempre optimista, mi proyecto de grado pudo tomar forma. Así mismo agradezco a mi director el Doctor Álvaro José Rojas, por aceptar la dirección de un proyecto que al principio pudo parecer un poco extraño y, en general, por ayudarme a sacarlo adelante.

Agradezco también al programa PILOS, que no sólo me permitió financiar mis estudios sino también aprender a través de las diferentes actividades que desempeñé en la universidad, como lo son mis trabajos en el Centro para la Excelencia Académica y el FabLab Cali, este último donde pasé una gran parte de mi vida académica y donde tuve la oportunidad de complementar mi formación como ingeniera mecatrónica, por lo cual quiero agradecer al Doctor Freddy Naranjo Pérez por haberme dado la oportunidad de trabajar en este lugar y haberme orientado desde el principio.

Quiero agradecer también a mi instructora de yoga, María del Carmen Rodríguez, porque ella me brindó también su conocimiento y considero lo aprendido en sus clases como uno de los más grandes aprendizajes durante mi vida académica, pues el yoga ha sido clave para haber podido dar lo mejor de mí como estudiante y en todas las actividades en donde debí desempeñarme.

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Finalmente quiero agradecer a la Haute École d’ingénierie et gestion du Canton de Vaud y de forma muy especial al Doctor Carlos Andrés Peña Reyes, quien me recibió como estudiante de intercambio en Suiza y fue quien me ayudó a orientar mi proyecto de grado desde su inicio. Agradezco todo el apoyo y el conocimiento compartido conmigo además de la oportunidad que me permitió vivir experiencias inolvidables durante mi intercambio, e igualmente la oportunidad de mostrar mi trabajo.

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CONTENIDO

pág.

GLOSARIO 17

RESUMEN 18

INTRODUCCIÓN 20

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 22

2. JUSTIFICACIÓN 24

3. OBJETIVOS 25

3.1 OBJETIVO GENERAL 25

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 25

4. ANTECEDENTES 26

4.1 INTELIGENCIA ARTIFICIAL Y CÉLULAS MADRE 26

4.1.1 Pattern synthesis in a 3D agent based model of stem cell differentiation (Briers, Haghighi, White, Kemp, y Belta, 2016) 26

4.1.2 Simple agarose micro-confinement array and machine-learning based classification for analyzing the patterned differentiation of mesenchymal stem cells (Tanaka, Yamashita, Sato, Vogel, y Tanaka, 2017) 26

4.1.3 Morphology-Based Prediction of Osteogenic Differentiation Potential of Human Mesenchymal Stem Cells (Matsuoka et al., 2013) 27

4.1.4 Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy (Zhao et al., 2017) 27

4.1.5 Agent-Based Modelling of Stem Cell Self-organisation in a Niche (Inverno y Saunders, 2005) 28

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4.2 MODELADO MEDIANTE INTELIGENCIA ARTIFICIAL 28

4.2.1 Prediction of Organic Reaction Outcomes Using Machine Learning (Coley, Barzilay, Jaakkola, Green, y Jensen, 2017) 28

4.2.2 Predicting Clinical Events by Combining Static and Dynamic Information Using Recurrent Neural Networks (Esteban Siemens et al., 2016) 28

4.2.3 A new method for dynamic modelling of bread dough kneading based on artificial neural network (Lamrini, Della Valle, Trelea, Perrot, y Trystram, 2012) 29

4.2.4 Modelling the dynamics of expiratory airflow to describe chronic obstructive pulmonary disease (Topalovic et al., 2014) 29

4.2.5 Development of a two dimentional agent-based model for chronic chagasic cardiomyopathy after stem cell transplantation (Galvão, Miranda, y Ribeiro-dos-Santos, 2008) 29

4.3 IMPRESIÓN 3D EN APLICACIONES BIOLÓGICAS (BIOIMPRESIÓN) (MURPHY Y ATALA, 2014) 30

4.3.1 Bioimpresión por inkjet 30

4.3.2 Bioimpresión por microextrusión 31

4.3.3 Bioimpresión asistida por láser 31

5. MARCO TEÓRICO 32

5.1 MACHINE LEARNING (TANTAWI PHD, 2013) 32

5.1.1 Redes neuronales artificiales (ANN) (Urbas, 2013) 32

5.1.2 Lógica difusa (Fuzzy Logic) (Sancho, 2017; Sheposh, 2016) 34

5.1.3 Máquinas de Soporte Vectorial (MSV) (Cano et al., 2017) 34

5.1.4 Algoritmos genéticos (Kanber, 2012) 35

5.1.5 Modelado basado en agentes (Macal y North, 2010) 36

5.2 CÉLULAS MADRE 36

5.2.1 Células madre mesenquimales (Kadle et al., 2018) 37

9

5.2.2 Diferenciación (Palomero, Vásquez, Vega, Naves, y Rodríguez, 2000) 37

5.2.3 Cardiomiocitos 37

5.2.4 Células Endoteliales (Gastón Fourcade, 2008) 37

6. PLANEACIÓN Y OBTENCIÓN DE DATOS PRIMARIOS 38

6.1 FABRICACIÓN DE BIODISPOSITIVOS 38

6.1.1 Impresión de bases en 3D 38

6.1.2 Bioimpresión con células 41

6.2 VARIABLES A EVALUAR 43

7. EXPLORACIÓN E IMPLEMENTACIÓN DE HERRAMIENTAS DE MODELADO 45

7.1 MODELADO CON ECUACIONES DIFERENCIALES ORDINARIAS (EDO) 45

7.1.1 Estimación de parámetros con software estadístico SAS 47

7.2 ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS CON ALGORITMO GENÉTICO (AG) (LÓPEZ, 2016) 53

7.3 MODELADO BASADO EN AGENTES (ABM) 57

7.3.1 NETLOGO: Software de modelado (Wilensky, 1999) 58

7.3.2 Caracterización de los agentes y el mundo 59

7.3.3 Interfaz 61

7.3.4 Reducción de la inflamación 62

7.3.5 Apoptosis 66

7.3.6 Diferenciación de MSC 67

7.3.7 Proliferación de MSC y células endoteliales 70

8. RESULTADOS 72

10

8.1 DISEÑO EXPERIMENTAL 72

8.2 EJECUCIÓN DEL PLAN EXPERIMENTAL 73

8.2.1 Creación de prueba en Behaviorspace 74

8.2.2 Obtención de resultados por conexión SSH 75

8.3 ANÁLISIS DE RESULTADOS 76

9. CONCLUSIONES 86

10. RECOMENDACIONES Y TRABAJO FUTURO 88

BIBLIOGRAFÍA 89

ANEXOS 95

11

LISTA DE FIGURAS

pág.

Figura 1. Proceso de impresión 3D con biomaterial. 22

Figura 2. Resultados obtenidos de la fabricación del biodispositivo por impresión 3D. 23

Figura 3. Implementación de biodispositivo en el quirófano. 23

Figura 4. Resultados de la aplicación de machine learning en observación de la diferenciación celular de células madre. De: Tanaka, N; Yamashita, T; Sato, A; Vogel, V; Tanaka, Y. Simple agarose micro-confinement array and machine-learning-based classification for analyzing the patterned differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS ONE, 12(4). 2017. p. 1-10. 27

Figura 5. “Components of inkjet, microextrusion and laser-assisted bioprinters.” De Murphy, S; Atala, A. “3D bioprinting of tissues and organs.” Nature biotechnology32(8), 2014. pp. 773-779. Murphy, S. V., y Atala, A. (2014). 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. https://doi.org/10.1038/nbt.2958 30

Figura 6. Estructura de una neurona artificial. De “Redes neuronales”, Monografías. Obtenido de http://www.monografias.com/trabajos12/redneuro/redneuro2.shtml. Reproducido con permiso de uso académico. 33

Figura 7. Estructura básica de una red neuronal artificial. De Sancho, F. (2017). En “Redes Neuronales: una visión superficial.” Obtenido de http://www.cs.us.es/~fsancho/?e=72. 33

Figura 8. Componentes de un sistema de lógica difusa. De Sancho, F. (2017). En “Introducción a la Lógica Difusa.” 2017 Obtenido de http://www.cs.us.es/~fsancho/?e=97 34

Figura 9. Hiperplanos de Máquina de Soporte Vectorial. De Abad, S. (s.f.). En “Detección de Anomalías Cardíacas con Aprendizaje Automático (Machine Learning): Análisis con Máquinas de Soporte Vectorial (Support Vector Machines SVMs).” Obtenido de 2017 http://samuelabad1991.blogspot.com.co/2014/02/analisis-con-maquinas-de-vectores.html 35

12

Figura 10. Estructura típica de un modelo basado en agentes. De Macal, C., y North, M. (2010). En: Tutorial on agent-based modelling and simulation. Journal of Simulation, 4, 151–162. https://doi.org/10.1057/jos.2010.3 36

Figura 11. Diseño de base a escala (cotas en mm) y ejemplo de impresión 3D de base sobre portaobjetos. 39

Figura 12. Pruebas de impresión y medición de bases impresas en 3D. 40

Figura 13. Prueba de impresión y medición después de proceso de esterilización en autoclave. 40

Figura 14. Pruebas de impresión de geometría "cruz" con dos cabezales de filamento fundido. 42

Figura 15. Características de los biodispositivos a escala que se planea fabricar para observación. 42

Figura 16. Cámara de Neubauer. De Bastidas, O. (s.f.). Technical Note-Neubauer Chamber Cell Counting. Obtenido de www.celeromics.com 43

Figura 17. Caja negra del modelo 44

Figura 18. Curva de crecimiento del modelo H3. De Tabatabai, M. A., Bursac, Z., Eby, W. M., y Singh, K. P. (2011). Mathematical modeling of stem cell proliferation. Medical & Biological Engineering & Computing, p. 9. 47

Figura 19. Datos de crecimiento celular BG01(1). 48

Figura 20. Resultado del modelo con los parámetros del software SAS. Azul=datos originales. Rojo=resultado del modelo. 50

Figura 21. Curvas de crecimiento de MSC adiposas (AD) y de médula ósea (BM). De “Human adipose-derived mesenchymal stem cells are resistant to HBV infection during differentiation into hepatocytes in vitro.” por Wang, Y., Wang, F., Zhao, H., Zhang, X., Chen, H., y Zhang, K. (2014). En International Journal of Molecular Sciences, 15(4), p. 6099. 51

Figura 22. Resultado del modelo con los parámetros del software SAS para datos de BM-MSC. Azul=datos BM-MSC. Rojo=resultado del modelo. 52

13

Figura 23. Codificación de los individuos del algoritmo genético. 53

Figura 24. Comportamiento del algoritmo genético. Azul=Mejor puntaje, Negro=puntaje promedio. 55

Figura 25. Resultado del modelo con parámetros estimados mediante AG. 56

Figura 26. Gráfica de cajas y bigotes de los resultados del AG. 57

Figura 27. Colores que identifican a cada tipo celular. 59

Figura 28. Patrón de vasos sanguíneos. Imagen original (Izquierda), copia del patrón en el modelo (Derecha). 60

Figura 29 Vecindad de una MSC. 61

Figura 30. Interfaz para modificación de parámetros de entrada. 62

Figura 31. Botones "Setup" y "Go". 62

Figura 32. Inicialización del tejido con cicatriz (color claro) con scar-size=75. Derecha, inflamación uniforme. Izquierda, inflamación decreciente. 64

Figura 33. Visualización del efecto antiinflamatorio de las MSC sobre el tejido afectado. (Distribución inicial de la inflamación = uniforme). 65

Figura 34. Gráfica de ‘Inflamación promedio vs. tiempo’. 65

Figura 35. Gráficas de 'Probabilidad de apoptosis promedio vs. tiempo'. 67

Figura 36.Ejemplo de probabilidad de diferenciación de MSC. 68

Figura 37. Distribución normal del tiempo de diferenciación. 69

Figura 38. Diferencia en el color asignado a células diferenciadas. 69

Figura 39. Comportamiento del porcentaje aportado por cada tipo celular a la decisión de diferenciación. 70

Figura 40. Configuración de parámetros en Behaviorsearch. 74

Figura 41. Ejecución del modelo en servidor mediante terminal por conexión SSH. 75

14

Figura 42. Resultados obtenidos de una simulación sin interfaz. 75

Figura 43. Resultados de conteo celular en los experimentos. 76

Figura 44. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 75000 células y distribución homogénea. 77

Figura 45. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 75000 células y distribución cruz. 78

Figura 46. Inflamación promedio en el tiempo para una población inicial de 75000 células. 78

Figura 47. Máxima concentración de MSC en cada experimento. 79

Figura 48. Gráfica de efectos principales para el máximo porcentaje de MSC. 79

Figura 49. Máxima concentración de cardiomiocitos en cada experimento. 80

Figura 50. Máxima concentración de células endoteliales en cada experimento. 81

Figura 51. Concentración final de MSC. 81

Figura 52. Concentración final de células endoteliales. 83

Figura 53. Gráfica de efectos principales para el porcentaje final de células endoteliales. 84

15

LISTA DE TABLAS

pág.

Tabla 1. 48

Tabla 2. 49

Tabla 3. 51

Tabla 4. 52

Tabla 5. 54

Tabla 6. 56

Tabla 7. 73

Tabla 8. 80

Tabla 9. 80

Tabla 10. 82

Tabla 11. 82

Tabla 12. 83

Tabla 13. 84

Tabla 14. 84

16

LISTA DE ANEXOS

pág.

Anexo A. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 225000 células y distribución homogénea. 95

Anexo B. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 225000 células y distribución cruz. 96

Anexo C. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 675000 células y distribución homogénea. 96

Anexo D. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 675000 células y distribución cruz. 97

Anexo E. Inflamación promedio en el tiempo. 97

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GLOSARIO

APOPTOSIS: tipo de muerte celular que usan los organismos multicelulares para eliminar células dañadas o no necesarias de una forma controlada que minimiza el daño de las células vecinas (Porras y Marzo, 2010).

BIODISPOSITIVO: dispositivo fabricado con componentes biológicos.

BIOMATERIAL: sustancia natural o sintética que resulta adecuada para su implante en contacto con tejidos vivos (Oxford Dictionaries Español, 2018).

BIOMODELO: modelo animal de experimentación.

MEDICINA REGENERATIVA: procedimientos que reemplazan tejidos u órganos que han resultado dañados por una enfermedad o herida o que tienen malfuncionamiento congénito. En su definición más amplia se refiere al reemplazo de órganos o tejidos con sustitutos trasplantados (Ungvarsky, 2017).

MIGRACIÓN CELULAR: proceso mediante el cual las células se mueven de una ubicación, como sucede con las células madre mesenquimales y amebas. Es esencial para respuestas inmunes. (GRABOWSKA, M., et al., 2018)

MIOCARDIO: Parte muscular del corazón.

SCAFFOLD: materiales altamente porosos basados en otros análogos a aquellos que forman la matriz extracelular y que inducen la síntesis de tejidos y órganos. Su actividad consiste en la inducción de procesos sintéticos complejos, generalmente en sitios de la anatomía donde una sección de tejido u órgano ha sido dañada o perdida debido a algún trauma (Ma y Elisseeff, 2006).

VIABILIDAD CELULAR: medición utilizada para relacionar el comportamiento celular al número de células. (Stoddart, 2011) Es útil para determinar las condiciones de crecimiento óptimas de poblaciones celulares en cultivo. Se define como el número de células sanas en una muestra y determina la cantidad de células que están vivas o muertas basada en la cantidad total de células en la muestra (“Determining Cell Vitality | Cayman Chemical,” n.d.).

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RESUMEN

A continuación se presenta el desarrollo de un modelo basado en agentes en el cual se simula el comportamiento de células madre mesenquimales (MSC), cardiomiocitos y células endoteliales en un biodispositivo impreso en 3D que se implantará en el miocardio infartado como parte de un potencial tratamiento el cual busca la regeneración del tejido afectado.

Se muestran ejemplos de modelado computacional aplicado al comportamiento de células y se explica el funcionamiento de algunas técnicas de bioimpresión 3D, como la microextrusión utilizada en la fabricación del biodispositivo. De igual manera, se describe el contexto para el cual se ha decidido realizar el modelo, teniendo en cuenta el uso de la impresión 3D como técnica de fabricación y las pruebas in vitro que validarían sus resultados.

Seguido a esto se presentan algunas técnicas de machine learning que fueron consideradas como alternativas para realizar el modelo. Después de la implementación de un modelo basado en ecuaciones diferenciales se decide optar por el modelado basado en agentes, considerando que es una herramienta que permitirá incluir en el modelo las características del microambiente celular. Por consiguiente, se describe paso a paso la realización del modelo en el software Netlogo, su funcionamiento y la visualización de los resultados.

Finalmente, se muestran algunos resultados obtenidos tras la realización de experimentos definidos mediante un diseño experimental y su análisis, el cual muestra que el modelo puede simular procesos del microambiente celular del miocardio infartado a través de las interacciones de las células y que permite observar comportamientos emergentes que pueden ayudar a determinar las características que favorecen la obtención del éxito esperado mediante el tratamiento con el biodispositivo impreso en 3D.

Palabras clave:

Bioimpresión, biodispositivo, infarto al miocardio, modelado basado en agentes, modelado computacional.

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ABSTRACT

The following document presents the development of an agent based model which simulates the behavior of mesenchymal stem cells (MSC), cardiomyocites and endothelial cells in a 3D-printed biodevice which is implanted on the infarcted myocardium as part of a potential treatment for the regeneration of the affected tissue.

Examples of computational modeling applied to the behavior of cells are shown and some 3D bioprinting techniques are explained, such as microextrusion, which is used for the fabrication of the biodevices. The context for which the model has been thought is also described, taking into account the use of 3D printing as fabrication technique and the in vitro tests that would validate the results.

After this, some machine learning techniques are presented, given that they were considered as alternatives to develop the model. Following the implementation of an ordinary differential equation-based model, the use of agent based modeling was considered as a tool that would better allow including the cellular microenvironment characteristics in the model. Thus, the development of the model with the software Netlogo, its functioning and the result’s visualization are explained step by step.

At last, some results are shown, which were obtained after running determined experiments defined through an experimental design and their analysis, which shows that the model can simulate processes that occur in the cellular microenvironment of the infarcted myocardium through the interactions of cells and that it allows the observation of emergent behaviors that can be helpful to determine the characteristics that favor the success that is expected the treatment with the 3D-printed biodevice.

Key words:

Agent based modeling, biodevice, bioprinting, computational modeling, myocardial infarction.

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INTRODUCCIÓN

Mediante un modelo matemático se logran expresar hechos, variables, parámetros, entidades y sus relaciones con el fin de estudiar el comportamiento de algún sistema en particular.

Según Álvarez (2013) “La modelización matemática es el arte de traducir problemas a un destino más aplicable a partir de funciones matemáticas tratables cuyo análisis numérico y teórico proporciona una visión, respuestas y orientaciones útiles para la aplicación de origen”. Esta permite una comprensión más profunda del sistema en cuestión, lo cual puede dar pie a pensar en posibles formas de mejorar algunas características deseadas en el comportamiento del sistema mediante la manipulación de los factores que intervienen en el mismo.

Los experimentos con células madre usan modelos para estudiar mecanismos de desarrollo a nivel celular, de tejido y del organismo. Las células madres se caracterizan por tres condiciones: son células no diferenciadas, poseen la capacidad de auto renovarse y pueden convertirse en células diferenciadas (Fagan, 2012).

Mediante la investigación con células madre, una de las principales metas es alcanzar el desarrollo de terapias exitosas. Debido a que los procesos celulares afectan a los organismos y sus tejidos en formas complejas, resulta de gran utilidad la comprensión del comportamiento de las células madre en una aplicación específica. Por lo tanto, los modelos matemáticos son fuentes que pueden describir la serie de cambios que ocurrirán en las células al estar bajo unas determinadas condiciones, permitiendo predecir el efecto que podrían tener las mismas en el organismo.

Dado que gran parte de la actividad de los sistemas biológicos suele ser desconocida, el modelado computacional puede jugar un rol importante en el descubrimiento de fenómenos latentes. Además, las observaciones de sistemas biológicos no siempre representan en el exterior lo que sucede en el interior, por esta razón, las técnicas de estimación son valiosas para modelar aquello que no puede ser fácilmente observado (Biba, Xhafa, Esposito, y Ferilli, 2011).

Algunas técnicas que más se han utilizado en el modelado de este tipo de sistemas son la lógica difusa (FL), redes neuronales (NN), máquinas de soporte vectorial (SVM), estimación de parámetros con algoritmos genéticos (AG) y modelado basado en agentes (ABM), las cuales permiten realizar un modelado a partir de una

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serie de datos y/o suposiciones y llegar a hacer predicciones del comportamiento futuro de los sistemas. Es por esta razón que se considera que la obtención de un modelo matemático a través de la aplicación de técnicas como las mencionadas puede ayudar a comprender el comportamiento de las células madre que se utilizan en la fabricación de un biodispositivo mediante impresión 3D; lo cual daría a conocer variables que pudieran ser manipuladas en el proceso de fabricación para obtener unos mejores resultados dentro del proyecto de investigación.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El semillero de investigación de tejidos junto con el de manufactura aditiva de la Universidad Autónoma de Occidente, han venido trabajando en el proyecto de investigación "Diseño y construcción de un scaffold a partir de un biomaterial que sirva como soporte para células madre mesenquimales (MSC) de médula ósea de cerdo, para su uso potencial en la regeneración del miocardio infartado de un biomodelo.". Durante este proceso se ha realizado la selección de un biomaterial que puede ser utilizado para impresión 3D y la selección del tipo de cabezal que garantiza unas características deseadas en el biodispositivo impreso con el biomaterial seleccionado y las células. Así mismo, se han realizado pruebas de diseño e impresión, con lo cual se ha podido comenzar a llevar a cabo el proceso de fabricación del biodispositivo con el biomaterial seleccionado, como se muestra en la Figura 1, y hacer pruebas en biomodelos para la observación y análisis de resultados.

En las pruebas de impresión realizadas se ha logrado obtener distintos modelos del biodispositivo en cuanto a forma, tamaño y consistencia, como se puede observar en la Figura 2; los cuales han sido llevados al quirófano e implantados en biomodelos -Figura 3- para posteriormente realizar observaciones del miocardio. Así mismo, las pruebas realizadas con biomodelos han permitido definir las prácticas más adecuadas tanto dentro del quirófano como fuera del mismo, de modo que el biodispositivo se pueda llevar desde el proceso de impresión hasta el momento del implante conservando su forma y demás características.

Figura 1. Proceso de impresión 3D con biomaterial.

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Figura 2. Resultados obtenidos de la fabricación del biodispositivo por impresión 3D.

Figura 3. Implementación de biodispositivo en el quirófano.

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2. JUSTIFICACIÓN

La aplicación de técnicas de modelado en la estimación de un modelo computacional asociado al comportamiento de las células madre utilizadas en la fabricación de un biodispositivo impreso en 3D, dentro del proyecto de investigación “Diseño y construcción de un scaffold a partir de un biomaterial que sirva como soporte para células madre mesenquimales (MSC) de médula ósea de cerdo, para su uso potencial en la regeneración del miocardio infartado de un biomodelo”, supone un aporte en la comprensión de la dinámica del biodispositivo a lo largo del tiempo y de la forma en la que ciertas variables pueden llegar a afectar los resultados obtenidos luego de un determinado periodo de observación.

Así mismo, el estudio del comportamiento de las células madre es un campo bastante amplio en el cual aún no se han logrado definir patrones de comportamiento exactos que modelen los cambios que pueden sufrir las células madre en el tiempo. Pese a que se han realizado trabajos con enfoques específicos, actualmente no existe un modelo que pueda describir completamente el crecimiento de las células madre o los tejidos en general, puesto que se desconocen muchos factores (Roy, Hsu, Wen, Lin, y Chakraborty, 2010). Aplicar un modelo obtenido mediante alguna técnica de modelado computacional, a partir de la experiencia y los datos tomados de la investigación que se ha adelantado permite analizar el comportamiento de las células en unas condiciones determinadas, lo cual es útil para la investigación puesto que se puede comparar el desarrollo de las células en cultivo in vitro donde, según Wikipedia (2011) citado por (Roeder, Loeffler, y Glauche, 2011), se omite información que es propia del entorno fisiológico en el que se desarrollarán las células tras ser implantadas, con el desarrollo de las células in vivo cuyo destino es regulado finalmente por este entorno.

Además, teniendo en cuenta que para la fabricación del biodispositivo se hace uso de la impresión 3D, al modelar el comportamiento de las células madre tras ser cultivadas con un patrón determinado se hace posible la observación del efecto que el uso de esta técnica de manufactura puede tener en la fabricación de biodispositivos con biomateriales, como es en este caso el colágeno.

Por otro lado, hoy en día la inteligencia artificial es un campo con mucho auge y sus usos son amplios, se extienden a campos como: seguridad de datos, seguridad personal, economía, salud, mercadeo, detección de fraudes, toma de decisiones, procesamiento de lenguaje, carros automáticos, entre otros (Marr, 2016). Por esta razón, la aplicación de inteligencia artificial en este tipo de investigaciones abre una oportunidad de explorar la efectividad de las mismas en la obtención de información útil para nuevos tratamientos de medicina regenerativa.

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Estimar, mediante técnicas de inteligencia artificial, un modelo que describa el comportamiento de las células madre mesenquimales utilizadas en la fabricación por impresión 3D de biodispositivos para tratamiento del miocardio infartado en biomodelos.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Definir métodos aplicables para la estimación del modelo a partir de la literatura reportada y las observaciones de pruebas in vivo. • Modelar el comportamiento de las células haciendo uso de los métodos seleccionados. • Determinar los tipos de simulación que permitan la visualización de los resultados del modelo. • Verificar los resultados obtenidos en las simulaciones al aplicar el modelo obtenido respecto a las observaciones reportadas en estudios in vivo.

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4. ANTECEDENTES

Se tiene en cuenta la aplicación de la inteligencia artificial directamente al campo de estudio de las células madre, al modelado matemático de otros sistemas mediante inteligencia artificial y la aplicación de la impresión 3D en medicina regenerativa.

4.1 INTELIGENCIA ARTIFICIAL Y CÉLULAS MADRE

4.1.1 Pattern synthesis in a 3D agent based model of stem cell differentiation (Briers, Haghighi, White, Kemp, y Belta, 2016)

En este artículo se desarrolla un método de clasificación paramétrica y optimización de parámetros para maximizar la ocurrencia de patrones morfogénicos (esferas), uno de los aspectos fundamentales en el desarrollo biológico que determinan la complejidad estructural y funcional de un organismo (Crumly, 2013), en cultivos in vitro conocidos como cuerpos embrionarios (EB) usados para estudiar la diferenciación celular en 3D. El método usa Optimización por Enjambre de Partículas (PSO) y un método de clasificación de patrones que realiza una caracterización cuantitativa de la formación de patrones.

Para definir la función objetivo a optimizar se tienen en cuenta agentes que describen las células madre como la división celular asíncrona y la vecindad celular, restricciones estructurales en 3D como colisiones e interacciones, reglas estocásticas para cambios de estado como realimentación negativa, diferenciación basal y realimentación positiva.

4.1.2 Simple agarose micro-confinement array and machine-learning based classification for analyzing the patterned differentiation of mesenchymal stem cells (Tanaka, Yamashita, Sato, Vogel, y Tanaka, 2017)

Se desarrolla un software de procesamiento de imágenes basado en machine learning para detectar patrones de diferenciación de una población de MSCs de forma automática. Dicho software clasifica automáticamente áreas adipogénicas, osteogénicas y no diferenciadas dentro de un cultivo, como se muestra en la Figura 4. Para el entrenamiento se usan imágenes que contienen áreas adipogénicas y osteogénicas.

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Figura 4. Resultados de la aplicación de machine learning en observación de la diferenciación celular de células madre. De: Simple agarose micro-confinement array and machine-learning-based classification for analyzing the patterned differentiation of mesenchymal stem cells. Por. Tanaka, N; Yamashita, T; Sato, A; Vogel, V; Tanaka, Y. PLoS ONE, 12(4). 2017. p. 1-10.

4.1.3 Morphology-Based Prediction of Osteogenic Differentiation Potential of Human Mesenchymal Stem Cells (Matsuoka et al., 2013)

En esta investigación se hace uso de la regresión de Ridge como método de modelado con machine learning para estudiar la aplicabilidad de características morfométricas para predecir cuantitativamente el potencial de osteogénesis de las células mediante el desarrollo de un modelo de predicción de diferenciación osteogénica. Se encuentra que el modelo obtenido tuvo una gran precisión al ser aplicado para la predicción del potencial de diferenciación en pacientes en tratamiento, al ser usado con imágenes de las células de dichos pacientes.

4.1.4 Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy (Zhao et al., 2017)

Mediante un microscopio de expansión los investigadores expanden una muestra de tejido a 100 veces el volumen original, permitiendo observar características que sólo podrían ser vistas con microscopios de electrónicos de barrido de alta resolución. Con las imágenes obtenidas después de la expansión, sabiendo que mediante una evaluación de la apariencia del núcleo es posible determinar si

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algunas lesiones benignas pueden convertirse en cáncer, se realizó un análisis con un algoritmo de machine learning que pudiera distinguir cuáles lesiones eran más propensas a volverse invasivas y cuáles no. Para esto, el algoritmo se basaba en características como orientación, diámetro y circularidad del núcleo; alcanzando una precisión de 93%.

4.1.5 Agent-Based Modelling of Stem Cell Self-organisation in a Niche (Inverno y Saunders, 2005)

Se presenta una propuesta de modelo basado en agentes en comparación a un modelo de autómata celular. Se analiza un modelo desarrollado previamente por otros autores y se muestran las ventajas del nuevo modelo propuesto. Se enumeran las que se consideran las razones principales para desarrollar modelos y simulaciones del comportamiento y la naturaleza de las células madre y así mismo los objetivos principales del modelo propuesto. En este trabajo se busca principalmente desarrollar un modelo que tenga validez biológica e involucre la presencia de condiciones químicas, biológicas y físicas del entorno celular así como las principales características que hacen a las células madre diferentes de cualquier otro tipo de células. Se concluye que el comportamiento completo de las células se puede modelar con agentes mediante reglas de comportamiento simples que ocultan la complejidad de las interacciones entre muchos componentes.

4.2 MODELADO MEDIANTE INTELIGENCIA ARTIFICIAL

4.2.1 Prediction of Organic Reaction Outcomes Using Machine Learning (Coley, Barzilay, Jaakkola, Green, y Jensen, 2017)

El resultado de una investigación llevada a cabo por profesores del MIT muestra que mediante la aplicación de técnicas de machine learning se pudo desarrollar un modelo que predice, un 71.8% de las veces, el principal resultado de una reacción química. Este se considera un avance valioso debido a que hasta ahora, determinar la forma más eficiente y económica de producir una molécula determinada es un proceso largo que se puede considerar tanto una ciencia como un arte.

4.2.2 Predicting Clinical Events by Combining Static and Dynamic Information Using Recurrent Neural Networks (Esteban Siemens et al., 2016)

Dado que las Redes Neuronales Recurrentes (RNNs) han demostrado ser exitosas para el modelado de secuencias de datos en muchas áreas, en este trabajo se

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presenta una aplicación en el dominio clínico. Se combina información estática y dinámica de pacientes del hospital Charité en Berlín que han pasado por un trasplante de riñón, con el fin de predecir si el paciente podría sufrir en un periodo de 6 a 12 meses uno de tres eventos negativos probables después de un trasplante: rechazo del riñón, pérdida del riñón o muerte. Se encontró que una RNN combinada con una red feedforward dio los mejores resultados en esta aplicación.

4.2.3 A new method for dynamic modelling of bread dough kneading based on artificial neural network (Lamrini, Della Valle, Trelea, Perrot, y Trystram, 2012)

Se presenta un modelo dinámico del proceso de amasado del pan, basado en redes neuronales artificiales. El modelo permite la predicción de la temperatura de la masa y la potencia suministrada necesaria para realizar trabajos mecánicos sobre ella. Este modelo se desarrolla debido a que se reconoce un desconocimiento de las variables que afectan la calidad final del pan, ya que actualmente se controlan las condiciones de la masa basándose en el conocimiento empírico de los operarios que lo fabrican. Finalmente, se logra predecir las dos variables de salida dependiendo de la mezcla de la masa, velocidad del rotor, temperatura de la harina y temperatura del agua con una tasa de 91%, de modo que se hace posible conocer si las condiciones en que se maneja una masa darán como resultado un buen producto.

4.2.4 Modelling the dynamics of expiratory airflow to describe chronic obstructive pulmonary disease (Topalovic et al., 2014)

Se selecciona un modelo de función de transferencia de segundo orden para modelar la dinámica del flujo espiratorio y sus dos parámetros (dos polos y ganancia de estado estable) se relacionaron con la presencia de enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Se exploraron 5 técnicas de machine learning y finalmente la combinación de tres parámetros de entrada en una máquina de soporte vectorial (MSV) arrojó los mejores resultados, con una sensibilidad de 85%, especificidad de 98.1% y precisión de 88.2%.

4.2.5 Development of a two dimentional agent-based model for chronic chagasic cardiomyopathy after stem cell transplantation (Galvão, Miranda, y Ribeiro-dos-Santos, 2008)

Con el fin de explicar el rol de las células madre en terapias se realiza un estudio experimental que muestra que el trasplante de células madre de médula ósea reduce algunos efectos de la enfermedad de Chagas en ratones. Con estos datos se realiza un modelo computacional basado en autómata celular para investigar la

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regeneración de la cardiomiopatía chagásica crónica después de trasplante de células madre. Se incluyen seis tipos de agentes: células inflamatorias, área de fibrosis, cardiomiocitos, citoquinas pro inflamatorias, parásitos Trypanosoma cruzi y células madre de médula ósea. Se comparan los resultados obtenidos con datos experimentales y a partir de esto se sugiere que el patrón de concentración es el factor más importante para caracterizar la cinética de la regeneración del tejido cardíaco después de un trasplante de células madre.

4.3 IMPRESIÓN 3D EN APLICACIONES BIOLÓGICAS (BIOIMPRESIÓN) (MURPHY Y ATALA, 2014)

Recientemente se ha logrado la impresión 3D de materiales biocompatibles, células y componentes de soporte en la creación de tejidos 3D vivos y funcionales. La bioimpresión está siendo aplicada a la medicina regenerativa para atacar la necesidad de tejidos y órganos aptos para trasplante. Las principales tecnologías usadas para la impresión de materiales biológicos se muestran en la Figura 5; estas son: inkjet, microextrusión e impresión asistida por láser.

Figura 5. “Components of inkjet, microextrusion and laser-assisted bioprinters.” De “3D bioprinting of tissues and organs.” Por. Murphy, S; Atala, A. Nature biotechnology32(8), 2014. pp. 773-779. Murphy, S. V., y Atala, A. 2014. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. Obtenido. https://doi.org/10.1038/nbt.2958

4.3.1 Bioimpresión por inkjet

Volúmenes controlados de un fluido se depositan en lugares predefinidos. Las impresoras inkjet térmicas funcionan calentando el cabezal de impresión para producir pulsos de presión que fuerzan a las gotas a salir. Las ventajas de estas impresoras es que son veloces, baratas y fáciles de encontrar; sin embargo, también se encuentran muchas desventajas al momento de usarlas en bioimpresión, como

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el riesgo de exponer las células y materiales a un estrés térmico y mecánico. Otra alternativa son las impresoras inkjet piezoeléctricas, que fuerzan la salida de las gotas a través de la creación de una onda acústica; sin embargo, también poseen desventajas en cuanto al efecto de la frecuencia de dicha onda sobre las células.

4.3.2 Bioimpresión por microextrusión

Las impresoras 3D más comunes y económicas, no biológicas, usan microextrusión. Las impresoras por microextrusión funcionan mediante el control robótico de la extrusión del material, haciendo uso de extrusión neumática o mecánica (pistón o tornillo). Estas producen hilos continuos de material, en vez de gotas. Pequeños hilos de material se depositan en dos dimensiones, se mueve el cabezal a lo largo del eje z y la capa depositada previamente sirve como soporte para la capa siguiente. Materiales como hidrogeles, copolímeros y esferoides celulares son compatibles con la microextrusión; la extrusión mecánica es preferible con materiales más viscosos.

4.3.3 Bioimpresión asistida por láser

Basada en los principios de transferencia directa inducida por láser. Un dispositivo de impresión por láser consiste en un haz de láser pulsante, un sistema de enfoque, una “cinta” generalmente hecha de vidrio y cubierta con una capa de material (titanio) para absorber energía, y una capa de material biológico. Este funciona usando los pulsos del láser sobre la capa absorbente de la cinta, para generar una burbuja de alta presión que libera el material biológico sobre un sustrato recolector.

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5. MARCO TEÓRICO

5.1 MACHINE LEARNING (TANTAWI PHD, 2013)

El Machine Learning (ML) o aprendizaje automático es una rama de las ciencias computacionales dirigida a permitir que los computadores aprendan nuevos comportamientos basados en datos empíricos. La meta es desarrollar algoritmos que muestren comportamientos aprendidos a partir de experiencias pasadas sin necesidad de recibir una instrucción humana. Algunos ejemplos son los filtros de spam del correo electrónico, reconocimiento de caracteres, y actualizaciones de noticias u ofertas en redes sociales que se alteran basadas en la actividad y preferencias previas del usuario.

Existen numerosos algoritmos de machine learning, los cuales se pueden clasificar teniendo en cuenta la forma en la que se realiza el entrenamiento. Entre estas categorías se encuentran los algoritmos de entrenamiento supervisado que son aquellos en los cuales la máquina analiza entradas que han sido mapeadas para unas salidas deseadas; el entrenamiento no supervisado donde la máquina analiza las entradas sin tener ningún conocimiento de la salida deseada; el entrenamiento semi-supervisado en el cual algunas entradas tienen una salida deseada y algunas no. Algunos de los algoritmos más utilizados son:

5.1.1 Redes neuronales artificiales (ANN) (Urbas, 2013)

Pretenden imitar las redes neuronales biológicas basándose en la organización de las neuronas en el cerebro, siendo capaces de adaptarse a cambios. Teniendo en cuenta las funciones principales de las neuronas biológicas, las neuronas artificiales poseen entradas de estímulo, las cuales se modifican con valores de pesos sinápticos. Una neurona artificial calcula su salida realizando una suma de la información recibida, afectada por el peso sináptico, y evalúa este resultado en una función de activación. En una red neuronal muchos de estos elementos simples, como el de la Figura 6, operan en paralelo y determinan una arquitectura de la red y el peso de las conexiones entre ellas.

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Figura 6. Estructura de una neurona artificial. De “Redes neuronales”, Monografías. Obtenido de http://www.monografias.com/trabajos12/redneuro/redneuro2.shtml.Reproducido con permiso de uso académico.

Una red neuronal, como la que se observa en la Figura 7, se organiza en niveles, si un conjunto de neuronas recibe la misma información se denomina capa, se identifican 3 tipos de capas: entrada, salida, oculta.

Figura 7. Estructura básica de una red neuronal artificial. De “Redes Neuronales: una visión superficial. Por.Sancho, F. (2017). Obtenido de http://www.cs.us.es/~fsancho/?e=72.

Biológicamente, la información en el cerebro está más relacionada con la sinapsis que con las neuronas como tal. Así mismo, en una RNA el aprendizaje depende de los pesos sinápticos, ya que estos representan el conocimiento.

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5.1.2 Lógica difusa (Fuzzy Logic) (Sancho, 2017; Sheposh, 2016)

Son sistemas cuyos resultados pueden variar en grados de veracidad en vez de ser respuestas binarias (verdadero-falso). Esto imita la forma en la que el cerebro humano toma decisiones, repartiendo la información en áreas de probabilidad. Un conjunto difuso permite a sus elementos tener un grado de pertenencia. Por ejemplo, si un vaso completamente lleno tiene un grado de pertenencia 1 y un vaso vacío un grado de pertenencia 0, al añadir unas gotas de agua al último, su grado de pertenencia será un poco mayor a 0.

Un concepto importante son los conjuntos difusos, que son conjuntos de datos sin un límite exacto, los cuales se definen mediante funciones de pertenencia. Así mismo, se involucra una entrada que pasa por sentencias if-else, llamadas reglas difusas, para producir una información de salida. Debido a su característica de replicar el proceso de pensamiento humano, la lógica difusa es usada con frecuencia en inteligencia artificial y robótica. Los componentes mencionados anteriormente y sus relaciones se pueden observar en la Figura 8.

Figura 8. Componentes de un sistema de lógica difusa. De Introducción a la Lógica Difusa. 2017 Por. Sancho, F. (2017). Obtenido de http://www.cs.us.es/~fsancho/?e=97

5.1.3 Máquinas de Soporte Vectorial (MSV) (Cano et al., 2017)

Son un grupo de métodos de aprendizaje que representan hiperplanos o fronteras de decisión en términos de un pequeño subconjunto de todos los ejemplos de entrenamiento que maximizan la separación entre conjuntos, como se ve en la Figura 9, y por tanto la capacidad de clasificación entre clases, denominados vectores de soporte.

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El hiperplano de separación buscado por el algoritmo es el que maximiza la distancia entre las clases. Este hiperplano se construye a partir del producto escalar de los vectores multidimensionales de las muestras y es generalmente de una dimensionalidad muy alta. La función que se usa para definir el producto escalar entre los vectores es denominada “kernel”.

Figura 9. Hiperplanos de Máquina de Soporte Vectorial. De “Detección de Anomalías Cardíacas con Aprendizaje Automático (Machine Learning): Análisis con Máquinas de Soporte Vectorial (Support Vector Machines SVMs).” Por. Abad, S. Obtenido de 2017 http://samuelabad1991.blogspot.com.co/2014/02/analisis-con-maquinas-de-vectores.html

5.1.4 Algoritmos genéticos (Kanber, 2012)

Son algoritmos inspirados por la naturaleza y la evolución. Su principal enfoque es la generación de “soluciones candidatas” (cromosomas) y mediante un tipo de realimentación determinar qué tan cerca al óptimo está el cromosoma. Las soluciones lejanas al óptimo mueren y desaparecen, mientras que las cercanas se combinan entre ellas y tal vez mutan un poco; esto es con el fin de modificar los cromosomas a lo largo del tiempo esperando que se vayan haciendo más cercanos al óptimo.

Los cromosomas se reproducen, producen descendencia y mutan. Mueren debido a la supervivencia del más apto o se les permite producir descendencia que pueda tener características más deseables.

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5.1.5 Modelado basado en agentes (Macal y North, 2010)

Es una forma de modelar sistemas complejos, la cual está compuesta por agentes autónomos que interactúan. Mediante el modelado de agentes individuales el efecto global de la diversidad que existe entre ellos puede ser observado, puesto que este da origen al comportamiento del sistema como un todo. Así, patrones, estructuras y comportamientos que no estaban programados pueden emerger a través de las interacciones entre agentes. Un ejemplo son los algoritmos de optimización basados en enjambres de partículas o en hormigas, los cuales han sido inspirados por el modelado basado en agentes.

En la Figura 10 se muestran los principales componentes de un modelo basado en agentes: los agentes, las interacciones y el ambiente.

Figura 10. Estructura típica de un modelo basado en agentes. En: Tutorial on agent-based modelling and simulation. Journal of Simulation, 4, 151–162. 2010Por. Macal, C., y North, M. Obtenido https://doi.org/10.1057/jos.2010.3

5.2 CÉLULAS MADRE

La principal característica de las células madre es que son células no especializadas con la habilidad de auto renovarse por largos periodos de tiempo, así como de diferenciarse en células especializadas con funciones específicas.

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5.2.1 Células madre mesenquimales (Kadle et al., 2018)

Las células madre mesenquimales (MSC), son aquellas que cuentan con características específicas como ser multipotentes (poder diferenciarse en cualquier tipo de célula de su mismo origen embrionario), expresar ciertos antígenos, ser capaces de adherirse al plástico estando en cultivo, y tener gran plasticidad para diferenciarse in vitro, bajo condiciones de cultivo específicas, en osteoblastos, adipocitos y condrocitos.

Las MSC pueden ser obtenidas de la médula ósea, tejido adiposo, sangre de cordón umbilical, pulpa dental, músculo esquelético y cardíaco, hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, páncreas, periostio, membrana sinovial, dermis, pericitos, hueso trabecular, pulmón, placenta, sangre periférica, ligamento periodontal y líquido amniótico (Pojda et al., 2013). Siendo las fuentes más importantes la médula ósea, tejido adiposo y sangre de cordón. Una vez las MSC han sido aisladas y cultivadas in vitro, bajo ciertas condiciones, pueden diferenciarse en linajes mesodérmicos como osteocitos, condrocitos, adipocitos, mioblastos y cardiomiocitos.

5.2.2 Diferenciación (Palomero, Vásquez, Vega, Naves, y Rodríguez, 2000)

Es el proceso responsable de que las células de un determinado tipo celular expresen características celulares propias. Una vez que la célula se ha diferenciado y expresa sus genes celulares específicos, estos se transmiten a las células hijas de forma constante; la célula ya no cambiará nunca a otro tipo celular.

5.2.3 Cardiomiocitos

Son las células musculares que forman el corazón y son responsables de su contracción.

5.2.4 Células Endoteliales (Gastón Fourcade, 2008)

Son aquellas células que revisten todo el sistema circulatorio (vasos sanguíneos), formando el epitelio plano. Tienen la capacidad de dividirse y permitir que surjan nuevos capilares a partir del endotelio existente.

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6. PLANEACIÓN Y OBTENCIÓN DE DATOS PRIMARIOS

Teniendo en cuenta los objetivos y el tipo de pruebas que se pueden realizar en el laboratorio de tejidos de la Universidad Autónoma de Occidente, se definen las pruebas que servirán para obtener los datos que permitan validar los resultados del modelo.

El cultivo de las células madre para la obtención de datos será realizado por una estudiante de Ingeniería Biomédica con experiencia en el campo como parte de su trabajo de grado, bajo los protocolos del proyecto de regalías mencionado anteriormente y en el laboratorio de Ingeniería de tejidos de la Universidad Autónoma de Occidente.

6.1 FABRICACIÓN DE BIODISPOSITIVOS

Para realizar la toma de datos, considerando que la cantidad de células que se puede utilizar es limitada, se planea la fabricación de biodispositivos a escala con cuatro concentraciones diferentes y en dos tipos de distribución.

Los biodispositivos que se han diseñado durante el proyecto de investigación con los semilleros de manufactura aditiva y tejidos contienen células madre, cardiomiocitos y células endoteliales; las cuales se suspenden en un biomaterial para permitir la deposición con jeringas al momento de realizar la fabricación por impresión 3D.

Las observaciones que se planean realizar sobre los biodispositivos fabricados son: viabilidad y migración celular. Se espera determinar si existe alguna variación en la viabilidad cuando la cantidad de células varía y observar si hay migración celular cuando se imprimen las células con distribuciones diferentes: homogénea o en cruz.

6.1.1 Impresión de bases en 3D

Debido a que la cantidad de células a utilizar en la experimentación es limitada se decide fabricar modelos de biodispositivos a escala. Los biodispositivos que han sido fabricados anteriormente durante la etapa de experimentación con biomodelos han tenido geometrías diferentes y el área del biodispositivo ha estado entre 416mm2 y 529mm2 aproximadamente; para los biodispositivos a escala se escogió un área de 100mm2 (cuadrado de 10mm*10mm).

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Para facilitar la toma de datos, las bases se diseñan para contener dos biodispositivos y sin una capa inferior, solamente paredes para conservar la geometría del biodispositivo impreso. Por la misma razón, se imprimen las bases directamente sobre portaobjetos de forma que lo único necesario al momento de tomar datos sea despegar la base, dejando los biodispositivos listos sobre el portaobjetos. Con las consideraciones anteriores se logra también reducir la cantidad de procesos de impresión que deben realizarse, reduciéndose a la mitad de la cantidad total de biodispositivos, ya que por cada impresión se fabricarán dos.

El material con el cual se realiza la impresión de las bases es PTEG reforzado con fibra de carbono. Se escoge puesto que además de ser capaz de contener el hidrogel es un material biocompatible, no poroso y resistente químicamente, pero principalmente gracias a que se adhiere al vidrio limpio al ser impreso (“3D Printering: XT-CF20 Carbon Fiber Filament Review | Hackaday,” n.d.), lo cual elimina la necesidad de implementar estrategias como el uso de laca o cinta azul y permite su impresión directamente sobre los portaobjetos. El diseño de las bases con las características mencionadas se puede ver con más claridad en la Figura 11.

Figura 11. Diseño de base a escala (cotas en mm) y ejemplo de impresión 3D de base sobre portaobjetos.

La fabricación de las bases se realiza en la impresora HYREL 30M con el cabezal MK1-250 con una resolución de 0.1mm por capa (máxima resolución). A continuación se muestra una prueba realizada para verificar las medidas de las bases impresas en 3D. Las medidas se toman en dos momentos; antes de someterlas a un proceso de esterilización en autoclave y después del proceso, el cual se realiza sometiendo las bases a 121°C y 15PSI durante 15 minutos. La prueba se realiza puesto que para poder realizar el cultivo celular en las bases impresas, estas deben pasar por el proceso de esterilización, y se conoce que la alta temperatura del proceso puede afectar las dimensiones de las bases impresas.

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En la Figura 12 se muestra que tras la impresión 3D las medidas de las bases no son exactas. Sin embargo, tras el proceso de esterilización las medidas se ven afectadas, ya que el material alcanza a fundirse un poco con la temperatura de la autoclave. Los resultados obtenidos después de la esterilización se muestran en la Figura 13 y se pudo observar una reducción del área del biodispositivo, debida a la acción del calor, al igual que un aumento en la profundidad. De esta prueba se pudo deducir que no es necesario ajustar las medidas del modelo CAD teniendo en cuenta la tolerancia en el proceso de impresión y la dilatación del material debida alproceso de esterilización, puesto que el cambio en las medidas es en realidad muy pequeño y finalmente, el aumento en la profundidad compensa la reducción del área y el volumen al final es de un valor muy cercano al deseado.

Figura 12. Pruebas de impresión y medición de bases impresas en 3D.

Figura 13. Prueba de impresión y medición después de proceso de esterilización en autoclave.

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6.1.2 Bioimpresión con células

Una vez se han impreso las bases el paso siguiente es realizar la impresión con células para la fabricación de los biodispositivos. Esto se hace dentro de las bases fabricadas para que una vez terminado el proceso se pueda introducir el portaobjetos con los biodispositivos en medio de cultivo y llevarlos a la incubadora.

Para los biodispositivos en cultivo se definen cantidades determinadas de células, teniendo en cuenta se represente a escala la misma concentración de células que sería utilizada en un biodispositivo fabricado para implante. Se escogen tres diferentes tipos de biodispositivos para la medición de viabilidad celular, los cuales serán impresos con las células distribuidas de forma homogénea debido a que esta observación no se ve afectada por la distribución de las células. Así, el mínimo número de células a imprimir en un biodispositivo es de 75000, con el fin de garantizar que no se encuentren demasiado separadas entre sí, lo cual podría afectar su supervivencia. A partir de la cantidad mínima de células, se definen las otras cantidades como tres veces la cantidad inicial (225000), y posteriormente tres veces este resultado (675000).

Como se mencionó antes, la impresión de las células en el biodispositivo se puede realizar de forma homogénea o realizando una cruz en la cual se depositan solamente células endoteliales, de los tres tipos que conforman el biodispositivo. Para realizar el proceso de impresión de los biodispositivos se adapta el código g generado por el software de la impresora para que este realice los movimientos necesarios de la jeringa en el eje z para entrar y salir del área donde se depositan las células y evitar que ésta choque con las paredes de la base al moverse del área de un biodispositivo al área del segundo en una misma capa.

Es importante destacar que para lograr adaptar el proceso de impresión a las características del biomaterial y la geometría de los biodispositivos se realizaron varias pruebas preliminares. Una de las pruebas realizadas consistió en adaptar el proceso de impresión con dos cabezales (jeringas); para lograrlo se empezó por realizar pruebas con los cabezales de impresión que se habían utilizado normalmente con la impresora 3D; es decir, cabezales de extrusión de filamento por deposición fundida. Se realizaron pruebas con la geometría de cruz, puesto que era esta la que representaba cierta dificultad. El resultado de algunas de las pruebas se muestra en la Figura 14.

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Figura 14. Pruebas de impresión de geometría "cruz" con dos cabezales de filamento fundido.

Una vez obtenidos los resultados deseados, donde se imprime la cruz de la mitad con un cabezal distinto al que se usa para las esquinas y esta queda totalmente centrada, se pasa a realizar pruebas con los cabezales con jeringas. Para lo anterior se hace uso de gelatina comestible de sabores diferentes con el fin de simular el proceso de impresión con el biomaterial, el cual tiene una contextura similar a una gelatina que se ha preparado con más agua de la recomendada.

En la Figura 15 se presenta la cantidad de biodispositivos a escala que se planea fabricar para obtener los datos mencionados durante un periodo de dos meses, teniendo en cuenta que en cada medición se descartan aquellos que son observados.

Figura 15. Características de los biodispositivos a escala que se planea fabricar para observación.

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6.2 VARIABLES A EVALUAR

• Viabilidad celular: porcentaje de células vivas

• Recuento celular: conteo de células vivas y muertas.

• Migración: observación de cambios de posición de las células en el área del biodispositivo.

• Distribución de las células: al realizar la impresión del biodispositivo, las células pueden ser depositadas de forma heterogénea o con las células endoteliales en cruz.

• Concentración inicial: cantidad de células de cada tipo por biodispositivo.

La prueba de viabilidad y recuento celular se realiza utilizando tinción con azul de tripán para conteo de células con cámara de Neubauer. Este último es una placa de cristal con forma de portaobjetos. En una cámara simple, la porción central, que es donde se realiza el conteo, está dividida en tres partes y en la parte central se encuentra grabada una retícula cuadrangular. Las cámaras dobles son las más comunes y cuentan con dos cámaras de medición, una superior y otra inferior al eje longitudinal en la porción central de la cámara (Figura 16) (Bastidas, n.d., pp. 1–2).

Figura 16. Cámara de Neubauer. De Bastidas, O. (s.f.). Technical Note-Neubauer Chamber Cell Counting. Obtenido de www.celeromics.com

La cámara de Neubauer permite el conteo celular mediante la introducción de una muestra en la cámara, la cual se observa al microscopio donde se hace visible la retícula que permite el conteo a través de la rejilla y mediante fórmulas que dependen de la concentración de la muestra. En este caso, la muestra será teñida con azul de tripán; así, al momento de realizar el conteo bajo el microscopio, se podrán identificar las células vivas de las muertas, ya que las células que han

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muerto se ven de color azul debido a que el colorante puede atravesar su membrana celular, y realizar la prueba de viabilidad al mismo tiempo.

La toma de datos de posición se realizará mediante microscopía de fluorescencia haciendo uso de tinción con fluorocromos. Se realiza una tinción de cada tipo celular con un color diferente y de esta manera, al observar a través del microscopio de fluorescencia, cada tipo celular se podrá distinguir del otro y se podrá observar la posición de las células en el biodispositivo.

Teniendo en cuenta lo anterior, en la Figura 17 se puede observar el modelo computacional como una caja negra de la cual se desea obtener datos relacionados con la cantidad de células de cada tipo y la manera en la que se encuentren distribuidas después de un tiempo determinado.

Figura 17. Caja negra del modelo

Los datos mencionados en este capítulo serían la base para confirmar los resultados obtenidos con el modelo a desarrollar. Así, un estudio experimental basado en los datos descritos anteriormente, obtenidos mediante los procedimientos descritos, podría validar los comportamientos que se modelen y también brindar información para realizar ajustes al modelo en caso de que los resultados obtenidos no se ajusten a lo observado en los experimentos.

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7. EXPLORACIÓN E IMPLEMENTACIÓN DE HERRAMIENTAS DE MODELADO

Con el fin de comprender dos de las herramientas que podrían ser útiles para el desarrollo del modelo, teniendo en cuenta la revisión de antecedentes realizada anteriormente y la opinión de la doctora Paola A. Neuta (Neuta, 2017) en el modelado de datos biológicos se exploran algunas de las características del modelado con ecuaciones diferenciales ordinarias y el modelado basado en agentes. Cualquiera de las dos técnicas puede ser usada para la realización del modelo; sin embargo, son herramientas muy diferentes y con la exploración realizada se busca determinar cómo y por qué el modelo que se desea obtener puede ser llevado a cabo mediante cualquiera de las dos y por qué escoger una sobre la otra.

7.1 MODELADO CON ECUACIONES DIFERENCIALES ORDINARIAS (EDO)

El modelado matemático de poblaciones, como lo son los conjuntos de células, puede ser muy útil y ha sido usado previamente en áreas de control de epidemias o tratamientos médicos (Howard, 2009). Además, la dinámica de poblaciones se ha analizado tradicionalmente usando modelos matemáticos, donde el interés está en encontrar el estado de equilibrio y una pregunta a responder puede ser, qué tan rápido se alcanza un estado de equilibrio, puesto que un modelo es una descripción matemática de los cambios en el tamaño de la población (Luo, Chairperson, Aluthge, y Drost, 2007).

Teniendo en cuenta que previamente se han realizado algunos modelos matemáticos para describir el comportamiento de las células en general, como se puede encontrar en varios artículos científicos (Deasy et al., 2003; Høyem, Måløy, Jakobsen, y Brandsdal, 2015; Roy et al., 2010; Stiehl y Marciniak-Czochra, 2011; Sundnes, Lines, y Tveito, n.d.; M. A. Tabatabai, Bursac, Eby, y Singh, 2011; M. Tabatabai, Williams, y Bursac, 2005), esta técnica puede ser útil para modelar el comportamiento dinámico de la población compuesta por las células madre, cardiomiocitos y células endoteliales partiendo de que los modelos de poblaciones en general pueden escribirse como ecuaciones estándar (Luo et al., 2007).

Con el fin de evaluar la utilidad de la implementación de un modelo basado en EDO se analizan en los cuales modelan el comportamiento del sistema tras un análisis matemático, teniendo en cuenta el comportamiento global del mismo y reflejando el efecto de diferentes propiedades y procesos que existen a nivel celular (Deasy et al., 2003; M. A. Tabatabai et al., 2011).

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Las propiedades que más se mencionan dentro de los modelos utilizados para el modelado de células madre son: la auto-renovación, la diferenciación, la proliferación y la apoptosis. Éstas, entre otras propiedades, deben ser cumplidas por una célula para ser definida como célula madre (Roeder y Loeffler, 2002, pp. 853–861).

Se encuentran diferentes modelos, los cuales resultan de enfocarse en una o varias de las propiedades mencionadas anteriormente. Sin embargo, teniendo en cuentalos datos que serán recolectados se seleccionó el modelo propuesto por M. A. Tabatabai et al. (2011b, pp. 254–255). Este es un modelo que los autores llaman “Modelo hiperbolástico III” (H3) debido a que posee 3 parámetros y describe de forma precisa el comportamiento de crecimiento auto-regulado que ocurre en algunos sistemas biológicos, como por ejemplo los tumores (Deasy et al., 2003, p. 537). En los artículos de Tabatabai et al. (M. A. Tabatabai et al., 2011, p. 35) se sugiere que el modelo H3, descrito por las ecuaciones que se muestran a continuación, es el más apropiado para modelar curvas de crecimiento celular.

• L = capacidad de carga• δ = tasa de crecimiento biológica intrínseca• θ = variabilidad de la tasa de crecimiento en el tiempo• γ = constante alométrica

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Figura 18. Curva de crecimiento del modelo H3. De Tabatabai, M. A., Bursac, Z., Eby, W. M., y Singh, K. P. (2011). Mathematical modeling of stem cell proliferation. Medical & Biological Engineering & Computing, p. 9.

El modelo describe una curva sigmoidea como la que se muestra en la Figura 18donde dP/dt representa la tasa (o velocidad) de crecimiento de la población P(t). La ecuación se puede separar en dos partes: a(t) y b(t), que contribuyen al crecimiento y a un retraso en el crecimiento de la población respectivamente. Como se dijo anteriormente, el modelo está conformado por tres parámetros que son δ, γ y θ, ypor L que es la capacidad de carga; es decir, la cantidad máxima de células que puede alcanzar la población. El parámetro δ representa la diferencia entre natalidad y mortalidad, y da información respecto a qué tan rápido podría estar creciendo la población por cada individuo que la compone.

7.1.1 Estimación de parámetros con software estadístico SAS

Para lograr una mejor comprensión del modelo se sigue el mismo procedimiento que usan los autores (M. A. Tabatabai et al., 2011, p. 35) para ajustar el modelo a curvas de crecimiento de células madre. Los datos (“Growth Curves | stemcells.nih.gov,” n.d.) que ellos utilizan se encuentran referenciados en el artículo y se hace uso de los mismos buscando obtener los mismos resultados que ellos presentan. Así mismo, se utiliza el mismo software de análisis estadístico (“SAS OnDemand for Academics | SAS,” n.d.) junto con el código que ellos proporcionan en adjunto.

Los datos se presentan en la Tabla 1 y corresponden a observaciones en la proliferación de células madre durante un período de 6 días. La curva de proliferación en el tiempo que se obtiene de dichos datos se muestra en la Figura 19.

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Tabla 1.

Datos de crecimiento celular de MSC del NIH.

Día Número de células1 1100002 1393753 1868754 3037505 6031256 760000

Nota: Datos del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos. Desde “NIH Stem Cell Information Home Page. In Stem Cell Information [World Wide Web site]. Bethesda, MD: National Institutes of Health, U.S.”, por Department of Health andHuman Services, 2016, (https://stemcells.nih.gov/research/nihresearch/scunit/growthcurves.htm#bg1). En el dominio público.

Figura 19. Datos de crecimiento celular BG01(1).

En el software SAS se utiliza la solución del modelo con ecuaciones diferencialespara realizar la estimación de parámetros:

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Para la estimación de parámetros con el software SAS se hace uso del procedimiento nlin que ajusta modelos de regresión no lineal y estima parámetros mediante mínimos cuadrados. Este procedimiento requiere que se definan unos límites y un valor inicial para cada parámetro puesto que es un procedimiento iterativo que parte de un valor dado, como se define en el manual de usuario (“SAS OnDemand for Academics | SAS,” n.d., p. 4267).

Los valores iniciales para cada parámetro se definen por ensayo y error hasta obtener los resultados deseados, que correspondan con los vistos en el trabajo de M. A. Tabatabai et. al. (2011, p. 35). Para el parámetro δ se definen los límites entre 0 y 1 puesto que este parámetro representa la pendiente de la curva, entonces un valor positivo significa una curva creciente con asíntota en L y el valor de δ sólo sería negativo para curvas decrecientes. En el caso de γ, siguiendo lo planteado en el artículo de M. A.Tabatabai et al. (2011, p. 35), se define que su valor debe ser positivo. El efecto de este parámetro está en el tiempo que transcurre antes de alcanzar el punto de estabilización; así, para valores entre 0 y 1 el tiempo será menor y para valores mayores que 1 el tiempo que trascurra será mayor. El parámetro θ determina la falta de simetría que es inherente en el crecimiento biológico, donde si su valor es más lejano de 0 representa una menor simetría, y permite ajustar la tasa de crecimiento en el tiempo.

En cuanto a los límites de L, es importante tener en cuenta los datos a los que se esté ajustando el modelo, más específicamente el valor mínimo. En el caso de los datos mostrados en la Figura 19, por ejemplo, el menor de los datos es 110000; por lo tanto, se define en los límites que el valor de L deberá ser mayor que este número.

Los valores iniciales se determinan mediante un ensayo y error, excepto para L,cuyo valor inicial se define como aproximadamente un 80% del valor máximo dentro de los datos.

Con lo anterior se realiza la estimación de parámetros usando el método de optimización Marquardt. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2 y laFigura 20.

Tabla 2.

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Resultados de estimación con software SAS.

Parámetro Estimación L 766545 δ 0.000016 γ 7.0096 θ 0.0236

Figura 20. Resultado del modelo con los parámetros del software SAS. Azul=datos originales. Rojo=resultado del modelo.

Algo que se percibe en los resultados es que en el modelo obtenido aplicando los parámetros estimados en el software SAS, el resultado del punto inicial no coincide con el dato original e P0(t). Esto quiere decir que, aunque este dato se suministra al momento de realizar la estimación, el algoritmo no lo está teniendo en cuenta. Para verificar que el modelo puede ajustarse a datos diferentes se realiza un experimento de ajuste del mismo a datos diferentes, los cuales se obtienen del trabajo de Ying Wang et al (Wang et al., 2014, p. 6099) y se muestran en la Tabla 3 y la Figura 21.

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Tabla 3.

Datos de crecimiento de MSC de médula ósea.

Día Número de células 1 149503 2 222664 3 318091 4 400795 5 531213 6 766600 7 976541 8 1106960 9 1148310 10 1211930

Nota: Desde “Human adipose-derived mesenchymal stem cells are resistant to HBV infection during differentiation into hepatocytes in vitro.” por Wang, Y., Wang, F., Zhao, H., Zhang, X., Chen, H., y Zhang, K., 2014. En International Journal of Molecular Sciences, 15(4), p. 6099. Los derechos de autor, 2014 MDPI, Basel, Suiza. Adaptado con permiso, bajo los términos y condiciones de la licencia Creative Commons Attribution.

Figura 21. Curvas de crecimiento de MSC adiposas (AD) y de médula ósea (BM). De “Human adipose-derived mesenchymal stem cells are resistant to HBV infection during differentiation into hepatocytes in vitro.” por Wang, Y., Wang, F., Zhao, H., Zhang, X., Chen, H., y Zhang, K. (2014). En International Journal of Molecular Sciences, 15(4), p. 6099.

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Para los datos anteriores se realiza la estimación de parámetros con el software SAS y se verifica que los resultados (Tabla 4) sean los esperados mediante una comparación con la curva original, como se muestra en la Figura 21.

Tabla 4.

Resultados obtenidos con software SAS para datos de BM-MSC.

Parámetro Estimación

L 1197286 δ 0.000453 γ 4.0752 θ 0.0346

Figura 22. Resultado del modelo con los parámetros del software SAS para datos de BM-MSC. Azul=datos BM-MSC. Rojo=resultado del modelo.

Como se puede observar en la Figura 22, el problema de la no coincidencia de los resultados en el punto inicial se vuelve a presentar. Teniendo en cuenta que la información de P0(t) se conoce, este error en el modelo sólo significa que el algoritmo no está considerando los datos iniciales que se le suministran. Por esta

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razón, y dado que no se conoce con exactitud el algoritmo utilizado por el software SAS para la estimación y sus resultados son siempre los mismos (determinístico), se decide realizar la búsqueda de parámetros aplicando un método del que se tenga mayor conocimiento, en este caso un algoritmo genético.

7.2 ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS CON ALGORITMO GENÉTICO (AG)(LÓPEZ, 2016)

Para realizar la implementación y configuración del algoritmo genético se hace uso de Matlab. Estos algoritmos operan transformando un set de objetos matemáticos de acuerdo con los principios darwinianos de evolución y están compuestos principalmente por:

• Cromosomas: valores separados que conforman un individuo.

• Individuos: información codificada soluciones parciales completas.

• Población: set de individuos generados sucesivamente por el algoritmo.

• Función objetivo: asigna un puntaje a un determinado individuo y guía la producción de nuevas poblaciones.

que se usan para realizar procesos de:

• Selección: selecciona individuos con el mejor puntaje para reproducción.

• Cruce: los individuos con mejor puntaje producen descendencia.

• Mutación: introduce diversidad en las poblaciones.

Para configurar el algoritmo el primer paso es definir la codificación de los individuos. En este caso, cada cromosoma de un individuo corresponderá a uno de los parámetros del modelo en el orden que se muestra en la Figura 23.

Figura 23. Codificación de los individuos del algoritmo genético.

Lo siguiente es configurar las principales opciones del algoritmo genético en Matlab(“Genetic Algorithm Options - MATLAB yamp; Simulink - MathWorks America Latina,” n.d.). En la Tabla 5 se muestran las opciones definidas para cada opción del algoritmo, las cuales se escogieron después de realizar varias iteraciones y

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analizar la evolución del algoritmo durante las mismas. Las características escogidas fueron aquellas que no sólo dieron mejores resultados, sino que permiten al algoritmo realizar una búsqueda adecuada, evitando restricciones innecesarias.

Tabla 5.

Configuración de las opciones del algoritmo genético en Matlab.

Creation function LinearfeasibleMax generations 2000Population 250Bounds Pmax<L<∞, 0<δ<1, 0<ϒ<∞, 0<θ<1Crossover fraction 0.8Crossover function heuristic (R=1.3)Function tolerance 1e-9Stall generations limit 800Fitness scalling function proportionalscalingSelection function remainderselectionMutation function uniformMutation fraction 0.02

La función objetivo que se utiliza es una función de error relativo, de modo que se compare la curva de los datos originales con la curva que resulte al utilizar los parámetros dados por cada nuevo individuo en cada nueva generación.

Al usar esta función se está configurando el algoritmo para minimizar el error entre los datos reales y los del modelo. La función linearfeasible define una población inicial aleatoria que esté dentro de los límites (bounds); así, no es necesario definir un valor inicial para cada parámetro, como lo era en el software SAS. La cantidad máxima de generaciones (max generations) y el tamaño de la población (population)se determinaron al observar que cantidades mayores no significaban ninguna mejora significativa en los resultados y lo harían más costoso computacionalmente. La fracción de cruce (crossover fraction) indica que un 80% de la población será producto de la operación de cruce que se realiza mediante la función de cruce (crossover fraction); el radio (R) indica qué tan lejos estarán los descendientes de su padre con mejor puntaje. La fracción de mutación (mutation fraction) determina

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que un 2% de la población será producto de la función de mutación (mutation function), lo cual permite más aleatoriedad en la población. Las opciones de límite de generaciones sin cambio (stall generations límit) y tolerancia de la función (function tolerance) determinan el criterio de parada del algoritmo; los valores definidos se configuran para hacer que el algoritmo continúe la búsqueda después de varias generaciones sin presentar una mejora significativa. Esto se hace al observar que la población continúa siendo muy variable, según el puntaje promedio (mean fitness), a medida que pasan las generaciones, y aunque el mejor puntaje (best fitness) se mantenga estable como se observa en la Figura 24, dadas las variaciones en el mean fitness puede que se llegue a encontrar un mejor individuo.

Figura 24. Comportamiento del algoritmo genético. Azul=Mejor puntaje, Negro=puntaje promedio.

Después de realizar varias iteraciones del algoritmo genético y recolectar diferentes resultados, el mejor individuo encontrado se muestra en la Tabla 6 y la curva que resulta de aplicar el modelo con estos parámetros se ajusta bien a los datos originales, como se observa en la Figura 25.

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Tabla 6.

Mejor individuo encontrado por el algoritmo genético.

L δ γ θ 1197600 0.00068367 3,8746 0,0312

Figura 25. Resultado del modelo con parámetros estimados mediante AG.

Se puede observar que el resultado obtenido al utilizar el algoritmo genético es bueno y el modelo se ajusta a la curva de los datos originales. La ventaja de usar el algoritmo es que se conoce la forma en que éste realiza el proceso de estimación de los parámetros, mediante la evaluación del error, y que no es un proceso determinístico; es decir, en cada iteración se obtienen resultados diferentes que resultan en un buen ajuste del modelo y esto permite analizar las diferencias entre resultados. Con el fin de realizar el análisis de los resultados obtenidos con el algoritmo genético se realizan 20 iteraciones del mismo y se recogen los resultados del mejor individuo encontrado y el fitness de dicho individuo. Se analiza el rango en el que se encuentran los valores encontrados por el algoritmo mediante una gráfica de cajas y bigotes, Figura 26. En la gráfica se puede observar que el rango del parámetro L es el más pequeño, de lo cual se puede decir que este parámetro tiene mayor importancia en el modelo

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y representa información importante, por lo que el algoritmo no puede variarlo tan fácilmente para ajustar la curva, lo que sí se puede hacer con otros parámetros como θ y δ, los cuales se encuentran en un rango más amplio.

Figura 26. Gráfica de cajas y bigotes de los resultados del AG.

Después de haber experimentado con el modelo matemático anterior, basado en EDO, se llegó a la conclusión de que este modelo podría no representar el comportamiento de las células durante todo el tratamiento, puesto que no considera los efectos del microambiente celular de las células tras el implante, sino solamente la fase de cultivo que es donde las células proliferan. Por esta razón y dado que con el modelo se quiere analizar el comportamiento de las células más allá de la fase de proliferación; es decir, una vez estas se utilizan como tratamiento mediante el implante del biodispositivo impreso en 3D, se decide explorar la implementación de un modelo diferente que permita tener en cuenta diferentes procesos que afectan a las células al entrar en contacto con el microambiente del miocardio infartado.

7.3 MODELADO BASADO EN AGENTES (ABM)

Modelar el comportamiento de las células madre como un sistema basado en agentes puede ser una forma muy apropiada de entender el proceso de autoorganización de las mismas. Algunos modelos computacionales de células madre se han vuelto a desarrollar usando el modelado basado en agentes, lo cual puede deberse a la posibilidad de desarrollar modelos que sean plausibles biológicamente (Inverno y Saunders, 2005, p. 52).

Con el ABM se tiene más flexibilidad que con otras técnicas, lo cual se traduce en gran potencial para modelar comportamientos más sofisticados y emergentes. La población de células debería ser modelada como un sistema de agentes interactivos y reactivos; donde las reacciones a nivel micro son causa del comportamiento emergente a nivel del sistema. Así mismo, el modelado basado en agentes es usado

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generalmente para modelar sistemas complejos; considerando el entorno físico, químico y biológico de las células y su presencia también física, química y biológica, el sistema es definitivamente complejo, por lo cual el ABM es una técnica apropiada (Inverno y Saunders, 2005, pp. 53–54).

En este caso, los agentes que se busca modelar son las células, con el fin de observar los efectos de sus interacciones entre ellas mismas y el medio que las rodea. 7.3.1 NETLOGO: Software de modelado (Wilensky, 1999)

Netlogo es un software gratuito open source que brinda un ambiente de modelado programable para la simulación de fenómenos naturales y sociales. Creado por Uri Wilenski en 1999, ha estado en constante desarrollo en el Center for Connected Learning and Computer-Based Modeling.

El software permite el modelado de sistemas complejos que se desarrollan en el tiempo, pues permite que el modelador dé instrucciones a cientos o miles de “agentes” que operan independientemente, lo cual hace posible la exploración de la conexión entre el comportamiento de cada individuo a nivel micro y los patrones que emergen de su interacción a nivel macro. Es una herramienta lo suficientemente simple para estudiantes pero suficientemente avanzada para ser poderosa para investigadores en muchos campos diferentes. El ambiente de NetLogo está conformado por agentes, estos son seres que pueden seguir instrucciones. Existen 4 tipos de agentes: tortugas, parcelas, ligas y el observador. • Tortugas: son agentes que se mueven en el mundo. • Parcelas: el mundo es bidimensional y está dividido en una matriz de parcelas. Cada parcela es un pedazo cuadrado del “suelo”, sobre el cual se pueden mover las tortugas. • Ligas: son agentes que conectan dos tortugas. • Observador: no posee una posición, se le puede imaginar observando sobre el mundo de tortugas y parcelas. El observador no es pasivo, da instrucciones a los otros agentes.

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7.3.2 Caracterización de los agentes y el mundo

El primer paso es definir quiénes serán los agentes y asumir sus interacciones más básicas con base en información encontrada en artículos científicos y lo sugerido por la doctora Paola A. Neuta (Neuta, 2017). El modelo resultante se usa como base para luego modelar otras interacciones y el efecto de diferentes condiciones que puedan presentarse en el entorno in vivo de las células.

Como se mencionó anteriormente en este tipo de modelo los agentes principalesson las células; sin embargo, se debe tener en cuenta que se están utilizando tres tipos de células para la fabricación del biodispositivo. Así, en el modelo se incluyen tres tipos diferentes de tortugas. Las células se representan con una forma circular y se diferencia el tipo al que pertenecen mediante el color, como se muestra en la Figura 27.

Figura 27. Colores que identifican a cada tipo celular.

Cada tipo celular posee unas variables diferentes:

• MSC

- Probabilidad de diferenciarse a cardiomiocito.- Probabilidad de diferenciarse a endotelial.- Contador de tiempo de diferenciación.- Duración del proceso de diferenciación.- Tipo celular siguiente.

• Cardiomiocitos

- Probabilidad de morir por apoptosis.- Influencia en la decisión de diferenciación.

• Endoteliales

- Probabilidad de morir por apoptosis.- Influencia en la decisión de diferenciación.

Los otros agentes que hacen parte del modelo son las parcelas. Las parcelas representan el tejido sobre el cual se implanta el biodispositivos con las células; es decir, el tejido del corazón. Como se sabe que el biodispositivo se implantará en la

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zona infartada del miocardio se añaden atributos a las parcelas para diferenciar si representan tejido sano o tejido afectado por el infarto.

• Tejido cardíaco

- Indicador de daño por infarto.

- Porcentaje de inflamación.

El color de las parcelas puede ser rojo o azul, el color rojo representa tejido cardiaco y el azul representa los vasos sanguíneos presentes en ese tejido. Para crear los vasos sanguíneos en el modelo se copia el patrón de una imagen, un ejemplo de esto se muestra en la Figura 28.

Figura 28. Patrón de vasos sanguíneos. Imagen original (Izquierda), copia del patrón en el modelo (Derecha).

Durante el proceso de impresión 3D no se garantiza que las células se ubiquen en una monocapa; por lo tanto, en el modelo también se define que un espacio podría estar ocupado por más de una célula, lo cual representaría que puede haber células que estén encima o debajo de otra. Como resultado se considera que el biodispositivo tendría hasta 3 células en cada posición del modelo (parcela) y se considera una vecindad circular de radio 3. La vecindad de cada posición estará conformada por hasta 86 células si todas las parcelas contienen su máxima cantidad, donde cada célula tiene un diámetro igual al acho de una parcela (Figura 29).

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Figura 29 Vecindad de una MSC.

7.3.3 Interfaz

Para inicializar el modelo es necesario inicializar algunos parámetros:

- Número inicial de células de cada tipo (25000-225000).

- Distribución de las células en el biodispositivo (homogénea/cruz)

- Probabilidades máximas y mínimas de diferenciación de una MSC a cada tipocelular.

- Simulación de cicatriz (on/off).

- Tamaño de la cicatriz (radio del círculo).

- Distribución de la inflamación (uniforme/decreciente)

Cada uno de los anteriores parámetros se inicializa mediante la interfaz del modelo, la cual está compuesta por los diferentes elementos que se muestran en la Figura 30.

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Figura 30. Interfaz para modificación de parámetros de entrada.

Además de los componentes mostrados en la Figura 30, la interfaz cuenta con otros dos botones que permiten comenzar una simulación (Figura 31). Con todos los parámetros indicados se puede inicializar el modelo haciendo uso del botón “Setup”en la interfaz, y para iniciar la simulación se presiona el botón “Go”, el cual puede volverse a presionar durante la simulación para detener la misma en cualquier momento.

Al presionar el botón “Go” se comienzan a simular una serie de procesos, los cuales en el código de programación del modelo se han escrito como métodos. En el modelo se simulan principalmente los procesos de diferenciación y apoptosis, y la forma en la que estos cambian en relación con la inflamación del tejido, la cual se ve afectada por la presencia de las MSC que se introducen en el biodispositivo.

Figura 31. Botones "Setup" y "Go".

7.3.4 Reducción de la inflamación

El infarto al miocardio se asocia con una reacción inflamatoria (Frangogiannis, Smith, y Entman, 2002, p. 32; Świątkiewicz et al., 2014, p. 7). Dado que actualmente

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el uso de MSC se concibe como un poderoso sistema para la reparación de tejidos, se ha expandido su uso como agentes terapéuticos y recientemente se ha centrado la atención en su potencial de liberación de factores que puedan modular procesos como la inflamación. Como resultado de esto se han podido probar las propiedades inmunomoduladoras de las MSC (Martire et al., 2016, p. 2).

Las propiedades descritas anteriormente se tienen en cuenta en el modelo mediante la modificación del atributo de ‘porcentaje de inflamación’ que se mencionó anteriormente. Al momento de inicializar el modelo, si el interruptor “scar” está en posición “on” se crea un círculo en el centro que simula el tejido afectado por la hipoxia que causa el infarto, cuyo radio se calcula teniendo en cuenta el valor seleccionado con el deslizador “scar-size” y el valor “max-pxcor”, que es la distancia desde el centro del mundo hasta uno de sus bordes.

Al tejido (parcelas) que se encuentra en éste radio se le asigna ‘1’ en el atributo “damage”, que indica si el tejido fue afectado por el infarto o no. De la misma manera, al tejido con “damage” = 1 se le asigna un valor de inflamación, el cual dependiendo del parámetro “inflammation-dist” puede ser igual a 1 (máximo valor de inflamación) en toda el área (uniforme) o depender de la distancia al centro, en cuyo caso el valor es 1 en el origen y disminuye hacia los bordes del área afectada(decreciente).

Así mismo, al tejido afectado se le asigna un tono más claro que el del color del tejido sano dependiendo del valor de inflamación, para hacerla observable en la simulación, como se muestra en la Figura 32

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Figura 32. Inicialización del tejido con cicatriz (color claro) con scar-size=75. Derecha, inflamación uniforme. Izquierda, inflamación decreciente.

Entonces, una MSC ejerce su acción antiinflamatoria realizando una disminución del parámetro “inflammation” en el tejido que se encuentra a su alrededor, en este caso en un radio de 6 parcelas y en un factor de 0.01 por cada día simulado. De la misma manera, a medida que se disminuye la inflamación en el tejido, se va cambiando el color del mismo para hacer observable el efecto de las células mesenquimales para lo cual se usa una ecuación lineal teniendo en cuenta los valores de color máximos y mínimos que se quieren tener en la visualización según la tabla de color que se presenta en el manual de usuario de Netlogo (Wilensky, 1999, p. 128). Las anteriores operaciones se hacen en cada parcela como se muestra a continuación:

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Figura 33. Visualización del efecto antiinflamatorio de las MSC sobre el tejido afectado. (Distribución inicial de la inflamación = uniforme).

Al mismo tiempo en que se puede visualizar la reducción de la inflamación como en la Figura 33, en la interfaz se puede observar el comportamiento de la inflamación debido al efecto de las MSC mediante una gráfica ‘inflamación promedio vs. tiempo’como la que se muestra en la Figura 34.

Figura 34. Gráfica de ‘Inflamación promedio vs. tiempo’.

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7.3.5 Apoptosis

Después del infarto al miocardio ocurre una apoptosis de cardiomiocitos (Cano et al., 2017; Frangogiannis et al., 2002, p. 34), la cual se ve afectada por la inflamación (Świątkiewicz et al., 2014, p. 13). La apoptosis juega un papel importante en la bioimpresión 3D, puesto que depende también del control de la proliferación. Poca proliferación puede causar una disminución en la viabilidad y mucha proliferación puede causar mayor apoptosis (Murphy y Atala, 2014, p. 780).

Por esta razón resulta importante la simulación de la apoptosis celular. Esto se hace mediante la evaluación de una ‘probabilidad de morir por apoptosis’, definida en el atributo “apop-prob”, para lo cual se usa un número entre 0 y 1 generado aleatoriamente para cada célula como se muestra a continuación.

Cada que una célula muere (true) se actualiza uno de los contadores que se muestran en la interfaz con las etiquetas “dead-cardio” o “dead-endo”, dependiendo del tipo celular de la célula que haya muerto.

La ‘probabilidad de morir por apoptosis’ de cada célula se inicializa en 0.01 (1%) y se actualiza cada día, disminuyendo en función de la inflamación, como se observa a continuación.

El comportamiento del atributo “apop-prob” para cada tipo celular se puede visualizar en la interfaz mediante las gráficas “Apoptosis probability cardiomyocytes vs. time” y “ “Apoptosis probability endotelial cells” como se muestra en la Figura 35.

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Figura 35. Gráficas de 'Probabilidad de apoptosis promedio vs. tiempo'.

7.3.6 Diferenciación de MSC

Dependiendo de la cantidad de células endoteliales y cardiomiocitos que se encuentren en la vecindad de una MSC, esta tomará la decisión de cuál será el tipo celular al cual se va a diferenciar. La vecindad de una célula está conformada por 28 posiciones; dado que, considerando que puede haber células sobre puestas se definen 3 capas de células, la vecindad se puede ver como se muestra en la Figura 29.

Cada célula endotelial aporta un pequeño porcentaje (“pc-per-endo”) a la probabilidad de diferenciación, al igual que cada cardiomiocito (“pc-per-cardio”). Al inicializar el modelo se define que el máximo porcentaje (“min-pc-endo”) que podrán aportar las células endoteliales si toda la vecindad estuviese ocupada por células de dicho tipo sería 5%(0.05) y si toda la vecindad estuviese ocupada sólo por cardiomiocitos (“min-pc-cardio”), juntos podrían aportar un 10%(0.1) a la decisión de diferenciación; esto quiere decir que la probabilidad de una MSC de diferenciarse a una célula cardíaca es el doble de la probabilidad de diferenciarse a célula endotelial si se tuviera el mismo número de vecinas de cada tipo, como se puede observar en la Figura 36, ya que la decisión de una MSC de diferenciarse a alguno de los tipos celulares se calcula como se muestra a continuación.

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Figura 36.Ejemplo de probabilidad de diferenciación de MSC.

La importancia de los cardiomiocitos se asume mayor a la de las células endoteliales puesto que en el corazón habrá una mayor necesidad de células cardíacas para reparar la zona lesionada tras el infarto.

Una vez la MSC ha tomado la decisión de diferenciarse o no a uno de los dos tipos celulares el proceso de diferenciación inicia. La diferenciación de una célula madre no es instantánea, esta consta de varias etapas y el tiempo que tome puede ser diferente para cada célula. Por esta razón se modela el tiempo de duración de la diferenciación como una distribución normal con μ=20 y σ=7; así, el tiempo que vaya a durar la diferenciación de cada MSC se asigna mediante dicha distribución, la cual se muestra en la Figura 37.

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Figura 37. Distribución normal del tiempo de diferenciación.

Cada vez que una MSC termina su proceso de diferenciación se actualiza uno de los contadores -“MSC-to-cardio” o “MSC-to-endo”- de la interfaz, los cuales indican el número de MSC que se han diferenciado a cardiomiocitos o a células endoteliales respectivamente; a cada célula endotelial o cardiomiocito que es producto de la diferenciación de una MSC se le asigna un color azul claro o rojo claro respectivamente, como se observa en la Figura 38.

Figura 38. Diferencia en el color asignado a células diferenciadas.

Finalmente, se actualiza el porcentaje aportado por cada célula en el vecindario, dependiendo de su tipo celular, a la decisión de diferenciación teniendo en cuenta los límites superiores definidos en la inicialización para cada tipo celular “max-pc-endo” y “max-pc-cardio”; como se muestra a continuación.

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Las ecuaciones anteriores modelan un comportamiento lineal decreciente; lo cual significa que el porcentaje aportado por cada célula en el vecindario aumentará cuando la inflamación disminuya y su valor máximo será igual al máximo porcentaje definido para su tipo celular dividido entre el tamaño del vecindario. Este comportamiento se muestra en la Figura 39, donde se utilizan los porcentajes máximos de la Figura 36 y se puede observar cómo los cardiomiocitos tienen una mayor probabilidad de diferenciación y su porcentaje máximo está representado por el corte con el eje vertical.

Figura 39. Comportamiento del porcentaje aportado por cada tipo celular a la decisión de diferenciación.

7.3.7 Proliferación de MSC y células endoteliales

Una de las principales características de las células madre es su alta capacidad proliferativa (Thrivikraman, Boda, y Basu, 2018, p. 64) y también se ha demostrado que promueven la angiogénesis, bien sea diferenciándose a células endoteliales, como se modeló anteriormente, o promoviendo la proliferación de las mismas (Martire et al., 2016, p. 11).

La proliferación de las MSC se modela igual que se ha hecho antes, definiendo aleatoriamente una ‘probabilidad de división’ global que se evalúa en el 10% del total de MSC que se encuentran en la zona afectada. Una célula del 10%

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seleccionado se dividirá dependiendo de la inflamación de la parcela en la que se encuentre y de si tiene o no espacio libre en las parcelas de su vecindario Moore, la decisión se toma mediante una operación AND.

De forma parecida se realiza el modelado de la división de células endoteliales, en este caso sólo un 2% del total de células endoteliales que se encuentran en la zona afectada y sobre tejido vascular (azul) tendrá la posibilidad de dividirse.

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8. RESULTADOS

8.1 DISEÑO EXPERIMENTAL

Con el fin de observar el comportamiento del modelo basado en agentes que se desarrolló, se determina que deben realizarse una serie de pruebas en las cuales las cantidades de células (agentes) correspondan a las que serán usadas en la fabricación de los biodispositivos a escala. De esta manera, teniendo en cuenta lo mostrado en la Figura 15 y haciendo uso del software Minitab, se obtienen las pruebas que se deben realizar y el orden en el que se deben implementar para evitar sesgos.

Para lo anterior, en el software Minitab se configura un diseño experimental tipo “Factorial de múltiples niveles” donde se definen como factores el número de células del biodispositivo y la configuración en la que se encuentren dichas células; es decir, un experimento con dos factores, que son las variables que se pueden controlar en la fabricación de los biodispositivos.

En el caso del factor “Concentración” se tienen tres niveles -o posibles valores-, que corresponden a 75000, 225000 y 675000. Para el factor “Configuración” hay dos niveles que corresponden a las distribuciones en las que se pueden imprimir las células: homogénea y cruz. Teniendo en cuenta el número de niveles (3 y 2) se obtiene un número de seis “Corridas base”, de las cuales se decide hacer dos réplicas, lo que quiere decir que habrá un total de 12 corridas.

Cada corrida es una combinación de niveles de los factores con la que se mide la respuesta del experimento; lo que quiere decir que cada corrida corresponde a una de las pruebas que se realizarán con el modelo variando en cada una los dos factores mencionados. El resultado obtenido una vez se configura el experimento con las especificaciones anteriores se muestra en la Tabla 7.

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Tabla 7.

Diseño experimental de múltiples niveles configurado en Minitab.

C1 C2 C3 C4 C5 C6-T OrdenEst OrdenCorrida TipoPt Bloques Concentración Distribución

3 1 1 1 225 hom 4 2 1 1 225 cruz 7 3 1 1 75 hom 9 4 1 1 225 hom

10 5 1 1 225 cruz 2 6 1 1 75 cruz 5 7 1 1 675 hom

11 8 1 1 675 hom 1 9 1 1 75 hom 6 10 1 1 675 cruz 8 11 1 1 75 cruz

12 12 1 1 675 cruz

8.2 EJECUCIÓN DEL PLAN EXPERIMENTAL

La implementación de cada una de las pruebas se hace mediante el software Behaviorsearch 6.0.2 que se instala junto con Netlogo, puesto que este permite correr el modelo sin necesidad de la interfaz, lo cual reduce el gasto de memoria del computador que hace que cada prueba sea muy lenta. Para esto, se hace uso de un servidor externo mediante conexión SSH con el fin de acortar el tiempo de simulación gracias a la capacidad de RAM con la cual cuenta dicho servidor, la cual es considerablemente mayor (50GB) a la de un computador de mesa (8G). Para comprobar que el tiempo de simulación fuera efectivamente menor al utilizar el servidor se realizó una prueba con una cantidad inicial de células de 225000 en distribución homogénea tanto en el computador de mesa como en el servidor. El tiempo se obtiene mediante el “timer” que incluye el software, el cual se ha programado para reiniciarse cada que el modelo empieza a simularse.

Se realiza una simulación de 60 “ticks” (días) y se obtiene que al hacer uso del servidor el tiempo en el que se ejecuta la simulación es de 159,625 segundos mientras que al realizar la simulación en el computador de escritorio el tiempo es de 950.96 segundos. Esto quiere decir que al tener más capacidad de memoria RAM se logra disminuir el tiempo de simulación. En este caso, se aumenta la capacidad de la RAM en un 600% al pasar del computador al servidor, y esto se traduce en una disminución del tiempo en un 83,214%.

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8.2.1 Creación de prueba en Behaviorspace

Para poder realizar las pruebas de simulación del modelo en el servidor se deben configurar todos los parámetros que se encuentran en la interfaz, teniendo en cuenta que esta no se puede manipular al realizar las simulaciones a través de la terminal (consola). En la Figura 40 se puede observar la forma en la que se asignan valores a todos los parámetros para después guardar el archivo en un formato .bsearch, el cual luego se ejecuta desde la terminal para obtener los datos deseados para el análisis en un archivo de texto e imágenes de cada día simulado.

En la ventana “Parameter Specification” se establecen valores fijos para todos los parámetros que afectan la simulación de los procesos modelados, teniendo en cuenta las ecuaciones planteadas durante el desarrollo del modelo, y los parámetros “num-cells” y “distribution” se varían para cada experimento de acuerdo a la Tabla 7. De la misma forma en que se varían estos dos últimos parámetros se podrían variar los que han sido fijados.

Figura 40. Configuración de parámetros en Behaviorsearch.

Así mismo se debe especificar la duración de la simulación en “ticks” y el nombre y dirección del archivo .nlogo con el que se ha guardado el modelo. Teniendo en cuenta que un “tick” representa un día en la simulación se define una duración (“Stop if” y “Step limit”) de 60 días, pues en este tiempo se esperaría tener efectos del biodispositivo implantado y por lo tanto estos efectos deberían ser observables en la simulación.

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8.2.2 Obtención de resultados por conexión SSH

Para realizar los experimentos en el servidor es necesario instalar Netlogo en el mismo y subir los archivos .nlogo y .bsearch. Al realizar la instalación se encuentra el archivo “behaviorsearch_headless.sh” que permite ejecutar modelos .nlogo sininterfaz. En la Figura 41 se observa el código necesario para realizar la ejecución en el servidor, y en la Figura 42 se muestra la forma en la que se obtienen los resultados en forma de archivo de texto y una serie imágenes en donde se captura el estado de los agentes en cada “tick”.

Figura 41. Ejecución del modelo en servidor mediante terminal por conexión SSH.

Figura 42. Resultados obtenidos de una simulación sin interfaz.

El archivo de texto contiene 5 columnas, las cuales son: cantidad de MSC, cantidad de células cardíacas, cantidad de células endoteliales, tiempo de simulación en segundos e inflamación promedio. La obtención de esta información se programa directamente en el modelo; así, podríamos obtener también otros datos si estos fueran de nuestro interés.

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8.3 ANÁLISIS DE RESULTADOS

Los resultados de cada experimento (Tabla 7) se analizaron mediante gráficas de los datos de cada columna vs. tiempo y para poder comparar las similitudes o diferencias que pudieran presentarse entre los experimentos se realizó una normalización de los datos respecto al máximo número de células en el biodispositivo durante la simulación. En la Figura 43 se muestran las gráficas obtenidas a partir de la normalización de los datos de cada simulación, el eje vertical representa el porcentaje de cada tipo celular en el biodispositivo con respecto al total de células de ese día.

Figura 43. Resultados de conteo celular en los experimentos.

1

para poder comparar las similitudes o diferencias que pudieran presentarse entre los experimentos se realizó una

1

2 2

3 3

77

La letra P indica el orden en el que fue realizado el experimento, de acuerdo con la Tabla 7. Resultados de conteo celular en los experimentos. El número indica la cantidad inicial de células, la letra H indica que la distribución es homogénea y la letra C indica que la distribución es en cruz. (1) Porcentaje de MSC vs. tiempo. (2) Porcentaje de cardiomiocitos vs. tiempo. (3) Porcentaje de endoteliales vs. tiempo.

De las anteriores gráficas se pueden realizar observaciones como que en los experimentos donde la concentración de células es menor, se puede observar la proliferación de MSC, mientras que en los casos con mayor concentración esto no se puede observar en la gráfica. Seguido a esto se observa una disminución en la cantidad de MSC, lo cual coincide con el aumento en las cantidades de cardiomiocitos y células endoteliales, lo cual se relaciona con el proceso de diferenciación.

En las gráficas de las células endoteliales con distribución cruz se puede notar cómo la población disminuye desde el principio. Esto puede deberse a que no hay una disminución de la inflamación en la zona donde ellas se encuentran debido a la ausencia de MSC.

Así mismo, se puede observar que en los experimentos con distribución en cruz los procesos de diferenciación pueden llegar a tardar mucho más en ocurrir, lo cual se asocia al hecho de que la inflamación no se reduce en el área donde sólo se encuentran células endoteliales, lo cual afecta la decisión de comenzar procesos de diferenciación de las MSC. El efecto de las MSC sobre la inflamación en dos experimentos con cantidad inicial de 75000 células se puede observar a continuación (Figura 44, Figura 45), ejemplos de los experimentos con las otras dos concentraciones iniciales se encuentran en anexos (Anexo A, Anexo B, Anexo C yAnexo D).

Figura 44. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 75000 células y distribución homogénea.

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Figura 45. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 75000 células y distribución cruz.

En la Figura 46 se observa el efecto de las MSC sobre la inflamación en los experimentos concentración inicial de 75000 células. Se observa que en las simulaciones con distribución cruz, indicada por la letra C, la inflamación se reduce sólo en aproximadamente 50%, lo cual se debe a que no hay presencia de MSC en la zona que forma la cruz. Así mismo, en las simulaciones con distribución homogénea, letra H, se puede ver que la inflamación disminuye hasta ser casi de 0% gracias a que hay presencia de MSC sobre toda el área afectada. Es por esta razón que anteriormente se menciona el efecto de la inflamación sobre el proceso de diferenciación. Las gráficas de inflamación en los experimentos con las otras dos concentraciones iniciales se encuentran en el Anexo E.

Figura 46. Inflamación promedio en el tiempo para una población inicial de 75000 células.

Al realizar una comparación de los resultados entre experimentos se encuentra que con la concentración inicial de 75000 células hay una mayor proliferación de MSC,lo cual se había notado anteriormente en la Figura 43. En la Figura 47 se observa

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que el porcentaje máximo de MSC que se alcanza con la menor concentración (75000) es mucho mayor respecto a las otras dos concentraciones (225000 y 675000), y que entre los porcentajes máximos de estas otras no hay una diferencia significativa aun cuando una concentración es el triple de la otra.

Figura 47. Máxima concentración de MSC en cada experimento.

Lo dicho anteriormente se puede confirmar en la Figura 48, donde se observa que con la menor concentración inicial se puede lograr un mayor porcentaje máximo de MSC (mayor proliferación) y que la diferencia de este resultado no es significativa entre una distribución y la otra.

Figura 48. Gráfica de efectos principales para el máximo porcentaje de MSC.

En el análisis de la Tabla 8, el valor p (α=0,05) indica que el modelo es significativo para el máximo porcentaje de MSC, al igual que lo es la concentración. Lo anterior confirma lo dicho anteriormente respecto a la Figura 48 y la Figura 47. Además, en la Tabla 9, el R-cuadrado indica que el modelo es altamente confiable para este resultado (98,22%). De lo anterior se puede decir que una concentración inicial de 75000 es más favorable para la proliferación de MSC en el biodispositivo.

80

Tabla 8.

Análisis de varianza del máximo porcentaje de MSC.

Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 5 0,005218 0,001044 66,13 0

Lineal 3 0,005146 0,001715 108,71 0Concentración 2 0,005119 0,002559 162,19 0Distribución 1 0,000028 0,000028 1,76 0,233

Interacciones de 2 términos 2 0,000071 0,000036 2,25 0,186concentración*Distribución 2 0,000071 0,000036 2,25 0,186

Error 6 0,000095 0,000016Total 11 0,005312

Nota: α = 0.05.

Tabla 9.

Resumen del modelo para máximo porcentaje de MSC.

S R-cuad. R-cuad. (ajustado) R-cuad. (pred)0,0039724 98,22% 96,73% 92,87%

En el caso de la máxima concentración de cardiomiocitos y células endoteliales(Figura 49 y Figura 50), los porcentajes máximos alcanzados convergen a valores cercanos (60% para C y 36% para E en promedio) independiente de la concentración inicial de células o la distribución.

Figura 49. Máxima concentración de cardiomiocitos en cada experimento.

81

Figura 50. Máxima concentración de células endoteliales en cada experimento.

De la misma forma en que se analiza la máxima concentración de cada tipo celular que se llega a alcanzar durante el tiempo simulado se observa la concentración final en cada experimento. Según la Figura 51, con excepción de dos experimentos con resultados atípicos, la cantidad de MSC al final es muy baja. Esto indica que la mayoría de las MSC pasan a ser cardiomiocitos o células endoteliales mediante el proceso de diferenciación, teniendo en cuenta lo observado en la Figura 43.

Figura 51. Concentración final de MSC.

En la Tabla 11, mediante el valor p, se puede determinar que ninguno de los dos factores es significativo para el porcentaje final de MSC, al igual que el modelo obtenido para este resultado. Esto significa que ni la concentración inicial ni la distribución de las células, tienen un efecto sobre el porcentaje final de MSC.

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Tabla 10.

Análisis de varianza del porcentaje final de MSC.

Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Modelo 5 0,03711 0,007421 0,86 0,554 Lineal 3 0,02532 0,00844 0,98 0,461 Concentración 2 0,01153 0,005766 0,67 0,546 Distribución 1 0,01379 0,01379 1,61 0,252 Interacciones de 2 términos 2 0,01178 0,005892 0,69 0,539 concentración*Distribución 2 0,01178 0,005892 0,69 0,539 Error 6 0,05153 0,008589 Total 11 0,08864

Nota: α = 0.05.

En cuanto a la concentración final de cardiomiocitos se encuentra que la gráfica de la concentración final es igual a la Figura 49, de donde se puede decir que la concentración de cardiomiocitos al final de cada experimento fue siempre la mayor entre los tres tipos celulares. Al realizar el análisis de varianza del porcentaje final de cardiomiocitos (Tabla 11), según el valor p (α=0,05) se obtiene que ni el modelo ni ninguno de los dos factores es significativo, soportando lo dicho anteriormente respecto a la Figura 49, donde no se observó relación entre los resultados y los factores. Además, por esta razón en la Tabla 12 se tiene que la confiabilidad del modelo para el porcentaje final de cardiomiocitos es baja (R-cuadrado=28,46%).

Tabla 11.

Análisis de varianza del porcentaje final de cardiomiocitos.

Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Modelo 5 0,025364 0,005073 0,48 0,783 Lineal 3 0,011591 0,003864 0,36 0,782 Concentración 2 0,011387 0,005693 0,54 0,611 Distribución 1 0,000204 0,000204 0,02 0,894 Interacciones de 2 términos 2 0,013773 0,006887 0,65 0,556 concentración*Distribución 2 0,013773 0,006887 0,65 0,556 Error 6 0,063773 0,010629 Total 11 0,089137

Nota: α = 0.05.

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Tabla 12.

Resumen del modelo para porcentaje final de cardiomiocitos.

S R-cuad. R-cuad. (ajustado) R-cuad. (pred)0,103097 28,46% 0,00% 0,00%

La concentración final de células endoteliales, según la Figura 52, se ve afectada por la distribución. De esta manera, comparando los experimentos de cada concentración, se observa que en los experimentos con distribución cruz se obtiene una menor concentración final de células endoteliales en comparación con los experimentos con concentración homogénea. Lo anterior se confirma realizando una gráfica de efectos principales (Figura 53), a partir de la cual se puede determinar el efecto de los factores sobre el porcentaje final de células endoteliales.

Figura 52. Concentración final de células endoteliales.

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Figura 53. Gráfica de efectos principales para el porcentaje final de células endoteliales.

En la Figura 53 y la Tabla 13, según el valor p (α=0.05), se observa que la distribución es un factor significativo para el porcentaje final de células endoteliales, mientras que la concentración no tiene un efecto considerable sobre este. Sin embargo, se puede ver que con la menor concentración inicial de células en el biodispositivo se logra un mayor porcentaje final de células endoteliales, al igual que con la distribución homogénea. Por lo tanto, para el crecimiento de células endoteliales las mejores condiciones son una distribución homogénea y una concentración inicial de 75000 células. Esto sugiere que no existe una verdadera ventaja en utilizar la distribución en cruz como un patrón concentrado de células endoteliales.

Tabla 13.

Análisis de varianza del porcentaje final de células endoteliales.

Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Modelo 5 0,04721 0,009442 5,62 0,029 Lineal 3 0,046467 0,015489 9,21 0,012 Concentración 2 0,005776 0,002888 1,72 0,257 Distribución 1 0,040691 0,040691 24,2 0,003 Interacciones de 2 términos 2 0,000743 0,000371 0,22 0,808 concentración*Distribución 2 0,000743 0,000371 0,22 0,808 Error 6 0,010088 0,001681 Total 11 0,057297

Nota: α = 0.05.

La Tabla 14 muestra que el modelo es confiable para los resultados del porcentaje final de células endoteliales (R-cuadrado=82,39%) y el valor p para el modelo en la Tabla 13 muestra también que el modelo es significativo para este resultado.

Tabla 14.

Resumen del modelo para porcentaje final de células endoteliales.

S R-cuadrado R-cuadrado (ajustado) R-cuadrado (pred) 0,0410036 82,39% 67,72% 29,58%

85

Se puede ver que los resultados obtenidos mediante la simulación de los diferentes experimentos permiten realizar un análisis de ciertos comportamientos que emergen de la simulación de las células como agentes que interactúan con un microambiente específico y que no se modelan específicamente durante el proceso de desarrollo del modelo.

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9. CONCLUSIONES

El proyecto desarrollado muestra los resultados obtenidos mediante la realización de un modelo basado en agentes que logra simular el comportamiento de células madre, cardiomiocitos y células endoteliales que hacen parte de un biodispositivo diseñado para ser utilizado como tratamiento para lograr la regeneración del miocardio infartado, el cual se fabrica haciendo uso de impresión 3D. Después de la experimentación con un modelo basado en ecuaciones diferenciales, se puede concluir que haber seleccionado el modelado basado en agentes fue una decisión acertada, puesto que permitió incluir de forma progresiva diferentes procesos e interacciones propias del microambiente celular.

El modelado de los procesos de diferenciación, apoptosis y proliferación hace que los resultados puedan ser comparados con el comportamiento de las células en el microambiente del miocardio infartado, puesto que estos son procesos que ocurren naturalmente a nivel celular (Thrivikraman et al., 2018, p. 61) y de los cuales se espera un efecto sobre el paciente tras la implementación del tratamiento. Además, las gráficas obtenidas de los experimentos muestran que el comportamiento de la población celular, el cual es afectado por dichos procesos, cumple con la característica de auto-regulación de las poblaciones celulares. Lo anterior se puede observar en lo reportado por Tanaka et al. (2017) y Høyem et al. (2015), donde se muestran gráficas del crecimiento de la población celular debido a procesos de diferenciación y se puede identificar un comportamiento similar al obtenido en la Figura 43.

Por otro lado, los estudios realizados previamente sobre el tema en la Universidad Autónoma de Occidente, los cuales han permitido evidenciar mediante la experimentación los efectos de las células madre sobre el miocardio infartado se consideran importante, puesto que fue una guía para determinar aquellos efectos que debían ser incluidos en el modelo y que serían significativos al momento de analizar el efecto de variables como la concentración inicial de células y el patrón utilizado para la fabricación por impresión 3D. Este es el caso de la inflamación, más específicamente del efecto antiinflamatorio de las células madre, que tiene influencia sobre los demás procesos simulados y corresponde a una característica específica del microambiente del miocardio infartado.

Simular el efecto antiinflamatorio de las células madre y su efecto sobre la diferenciación y apoptosis permitió observar las diferencias entre fabricar el biodispositivo con una distribución homogénea de los tres tipos celulares y aprovechar la tecnología de impresión 3D para diseñar un patrón al momento de la fabricación, lo que en este caso fue representado por una cruz en donde sólo se depositan células endoteliales. Es por esta razón, que el modelo es una herramienta

87

que permite crear hipótesis respecto a la fabricación del biodispositivo como tratamiento para el miocardio infartado mediante patrones realizados gracias a la impresión 3D.

Mediante los experimentos realizados se pudo observar que, con lo considerado dentro del modelo, la utilización de la distribución de células endoteliales en cruz no presentaba ninguna ventaja frente a la distribución homogénea de todos los tipos celulares, por lo tanto, para la fabricación de los biodispositivos que serán implementados en la experimentación in vivo con biomodelos, se reconsidera el uso de esta opción, aunque es posible el modelado de otras características propias del proceso de vascularización.

Así mismo, observar que existen diferencias entre la fabricación del biodispositivo con dos distribuciones diferentes muestra que el uso de la impresión 3D permite evaluar diferentes configuraciones en el proceso de fabricación de los biodispositivos, lo cual permite la experimentación.

De la misma manera, implementar el modelado basado en agentes a través del software Netlogo hizo posible el desarrollo de un modelo biológico sin la necesidad de conocimiento especializado, lo cual puede ser mucho más complejo si se desea desarrollar un modelo basado en ecuaciones diferenciales, puesto que esto requeriría no sólo un conocimiento más profundo acerca del funcionamiento de los sistemas que se desean modelar sino de habilidades matemáticas. Sin embargo, a través de esta implementación se pudo lograr el objetivo planteado a través de la aplicación del conocimiento adquirido dentro de la ingeniería mecatrónica y un trabajo multidisciplinar con biólogos, ingenieros biomédicos y bioinformáticos.

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10. RECOMENDACIONES Y TRABAJO FUTURO

El modelo resultante de este proyecto de grado puede ser la base de investigaciones futuras y así mismo permite ser modificado de forma sencilla para adaptarse a las condiciones reales del microambiente celular y servir de herramienta para analizar el potencial de tratamientos de medicina regenerativa como el que se ha propuesto. Es por esta razón que, teniendo en cuenta que durante el desarrollo del modelo se tuvo en cuenta el planteamiento de ciertos experimentos in vitro, mencionados en el capítulo 6, se sugiere que la realización de dichos experimentos y el análisis de sus resultados puede llevar a encontrar la necesidad de realizar ajustes al modelo desarrollado, o a determinar qué otros procesos que afectan el microambiente celular deberían ser tenidos en cuenta.

El modelo aquí desarrollado puede ser la base de un modelo tridimensional en el que se incluyan otros comportamientos, procesos o señales presentes en el corazón y donde los efectos del tratamiento puedan ser observados no sólo en el área afectada del miocardio sino en el funcionamiento del corazón como principal órgano afectado por el infarto al miocardio, puesto que uno de los principales efectos esperados del tratamiento es la recuperación de la función de eyección.

También puede ser pertinente la implementación del modelo en una plataforma diferente a Netlogo, ya que esta fue utilizada gracias a que es una herramienta orientada específicamente al modelado basado en agentes; sin embargo, esto hace que también requiera de mayores recursos de procesamiento. Por esta razón se puede considerar una optimización en el tiempo de ejecución de las simulaciones mediante la implementación del modelo basado en agentes haciendo uso de otras herramientas de programación.

Sin embargo, algunas características de Netlogo pueden también ser aprovechadas para realizar la comparación de los resultados del modelo al “personalizar” las simulaciones y acomodarlas en función de los datos que se puedan obtener de pacientes que hayan sufrido infarto al miocardio; se considera por ejemplo la posibilidad de reemplazar la geometría del área afectada por una imagen real de la cicatriz causada por el infarto, ya que en este caso se utilizó un círculo como aproximación.

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96

Anexo B. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con225000 células y distribución cruz.

ANEXOS Anexo A. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 225000 células y distribución homogénea.

97

Anexo D. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 675000 células y distribución cruz.

Anexo C. Imagen de las condiciones iniciales y finales del área simulada con 675000 células y distribución homogénea.

98

Anexo E. Inflamación promedio en el tiempo