Micro SANITARIA Manual Practicas

7/17/2019 Micro SANITARIA Manual Practicas

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYA

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA SANITARIA

PLAN 2010

Celaya, Gto. Enero 2013




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CONTENIDO TEMATICO.Contenido temático 1

Curso de Microbiología Sanitaria 3

Introducción 6

Reglamento interno para el uso de los laboratorios del área de ingeniería bioquímica 9I.- Practica N°1 “Selección y preparación de materiales y soluciones para el análisis

microbiológico” 20

1.0 Introducción 31.1 Material y soluciones

41.2 Preparación del material para la toma de muestra

51.3 Procedimiento par ala toma, manejo y transporte de la muestra

61.4 Manejo de las muestras 9

1.5 Técnicas de muestreo para determinar la sanidad de una planta procesadora de alimentos. 141.6 Técnicas de muestreo para microorganismos anaerobios 201.7 Selección, preparación y medición de la alícuota 211.8 Preparación y dilución de muestras 22

II.- Practica N°2 27“Cuenta estándar de Microorganismos Mesofílicos Aerobios (CEMMA)” 2.0 Introducción 272.1 Materiales 272.2 Medios de cultivo 282.3 Procedimiento para análisis de alimentos congelados, enfriados,

precocinados o comida preparada 28

2.4 Guía para calcular y reportar CEMMA en casos no comunes 292.5 Reporte de colonias 302.6 Normas aplicadas 33

III.- Practica N°3 35“Determinación de bacterias del grupo coliforme”

3.0 Introducción 353.1 Material 363.2 Medios de cultivo y reactivos 363.3 Procedimiento para la determinación del numero mas probable {NMP}

de bacterias coliformes en agua potable, purificada y hielo. 373.4 Determinación de bacterias coliformes totales y coliformes fecales 43en alimentos3.5 Técnica de filtración por membrana para agua 483.6 Determinación de la actividad de la Beta-Glucuronidasa para detectar la presencia de Escherichia coli en alimentos 503.7 Normas aplicadas 52

IV.- Practica N°4 54“Determinación de Staphylococcus aureus ” 4.0 Introducción 54




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4.1 Material 554.2 Medios de cultivo y reactivos 554.3 Aislamiento y conteo 564.4 Pruebas de la coagulasa 57

4.5 Pruebas de la catalasa 574.6 Utilización anaerobia de glucosa 574.7 Utilización anaerobia de manitol 584.8 Producción de nucleasa termoestable 584.9 Características bioquímicas 594.10 Normas aplicadas 59

V.- Practica N°5 62“Determinación de hongos y levaduras (mohos)” 5.0 Introducción 625.1 Material 635.2 Medios de cultivo y reactivos 635.3 Procedimiento 63

5.4 Normas aplicadas 64

VI.- Practica N°6 66“Determinación de microorganismos proteolíticos y lipolíticos” 6.0 Introducción de microorganismos proteolíticos 666.1.2 Material 676.1.3 Medios de cultivo y reactivos 676.1 Determinación de la presencia de microorganismos proteoliticos 676.2 Determinación de la presencia de microorganismos lipiliticos 686.2.2 Material 696.2.3 Medios de cultivo y reactivos 69

VII.- Practica N°7 71“Determinación de Salmonella sp”7 Introducción 7171 Material 727.2 Medios de cultivo t reactivos 727.3 Preparación de las muestras 737.4 Diferenciación de las colonias de Salmonella 76

VIII.- Practica N°8 78“Determinación de Vibrio cholerae” 8.0 Introducción 788.1 Material 798.2 Medios de cultivo y reactivos 798.3 Procedimiento 798.4 Pruebas diferenciales 80

IX.- Practica N°9 82“Determinación de Listeria monocytogenes ” 9.0 Introducción 829.1 Material 839.2 Medios de cultivo y reactivos 849.3 Procedimiento 849.4 confirmación de la presencia de Listeria 86




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X.- Practica N°10 88“Determinación de bacterias anaerobias 10.0 Introducción 88

10.1 Determinación de la presencia de C. perfringens 8810.1.1 Material 8910.1.2 Medios de cultivo y reactivos 8910.2 Determinación de la presencia de c. botulinum 9210.2.1 Material 9210.2.2 Medios de cultivo y reactivos 92

XI.- Practica N°11 95“Efecto de los agentes desinfectantes sobre los microorganismos” 11.0 Introducción 9511.1 Soluciones 9611.2 Medios de cultivo y reactivos 9611.3 Procedimiento 96

Apéndice 1.Formulación y preparación de medios de cultivo para Microbiología Sanitaria

Apéndice 2 119Preparación de reactivos y soluciones para Microbiología SanitariaÍndice de tablas y figuras 123Índice de medios de cultivo, reactivos y soluciones12Bibliografía. 126




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Curso de Microbiología Sanitaria

Objetivo.Reconocer, cuantificar y controlar los agentes microbiológicos y los procesos de contaminación y descomposición

biológica de los alimentos dentro de un proceso productivo, para mantener su idoneidad y evitar enfermedades alconsumidor. Aplicar los conocimientos adquiridos en los procesos y/ o proyectos que involucren a losmicroorganismos en la mejora de la inocuidad de los alimentos; mediante la generación y aplicación innovadora deconocimiento sobre el manejo microbiológico de agua y alimentos.

Promover la adquisición de los conocimientos básicos relativos a la aplicación de los microorganismos en procesos biotecnológicos de producción de alimentos, control de la contaminación ambiental, de aplicaciónagrícola e industrial, así como los relacionados con los riesgos asociados a su presencia en instalaciones,

procesos y materiales propios de la industria biotecnológica. Adicionalmente, se deberá propiciar el desarrollo de las habilidades necesarias para el manejo y control de

los microorganismos en los aspectos antes mencionados.

TemarioTemas

SubtemasNo. Nombre

I. Introducción a laMicrobiologíasanitaria

1.1. La microbiología sanitaria del agua y alimentos.1.2. Saneamiento Ambiental, higiene de los alimentos, calidad-inocuidad.1.3. Situación en México y el resto del mundo.1.4. Factores propiciadores y determinantes de la calidad sanitaria de los alimentos.

II.

CadenaepidemiológicaFuentes y

mecanismos decontaminación delos alimentos.

2.1. Cadena epidemiológica. Introducción a las fuentes y mecanismos deContaminación.

2.2. Mecanismos de contaminación.2.3. Fuentes y mecanismos de contaminación de los microorganismos a los alimentos

Agua Tierra Aire.

Equipo y utensilios. Envases. Materias primas y aditivos. Fauna. Manipuladores. Contaminación de origen. Contaminación cruzada

III.

Gruposmicrobianos deinterés sanitario yfactores queafectan lasobrevivencia ydesarrollomicrobianos.

3.1. Indicadores de la calidad e inocuidad microbiológicas de los alimentos. Bacterias mesófilas aerobias. Enterococos, Psicrotrofos, Psicrófilos, Termófilos y Termodúricos en

alimentos. Osmotolerantes, halotolerantes, xenotolerantes, mucógenos, acidúricos,

esporulados y anaerobios.

Bacterias lácticas, amilolíticas, pectinolíticas, lipolíticas, proteolíticas, putrefactivas, hongos y levaduras.3.2. Introducción3.3. Factores intrínsecos3.4. Factores extrínsecos

IV. Enfermedadestransmitidas poralimentos

4.1. Enfermedades transmitidas por alimentos.4.2. Patógenos transmitidos por agua y alimentos4.3. Microbiología del agua y NOMs

Agua natural y procesada. Hielo.




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Bebidas no alcohólicas4.4. Microbiología de alimentos y NOMs4.5. Medidas para el control de la contaminación.

V.

Procesamiento

Sanitario de productos bióticos.

5.1. Fuentes de contaminación en el procesamiento de alimentos y otros productos.5.2. Planes y Programas de limpieza y desinfección en plantas de productos bióticos.5.3.

Buenas prácticas de manufactura.5.4. Programas de HACCP en plantas de productos bióticos.5.5. Confirmación de la calidad.




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Prácticas de Microbiología Sanitaria

1.- IntroducciónEl laboratorio de esta materia pretende generar conocimientos, habilidades y experiencias que permitan al estudianteestablecer los diferentes tipos de asociaciones simbióticas entre los microorganismos y los seres vivos superiores.Estudiar los mecanismos mediante los cuales las bacterias y otros microorganismos se adhieren e invaden las célulashospedadoras durante el establecimiento de distintos tipos de relación, así como comprender las bases molecularesque rigen dichos procesos.

Organismos pluricelulares como animales y vegetales en forma natural están en una constante interacción comomicroorganismos, los cuales en forma genérica van a construir lo que se denomina como su microflora natural onormal; los vegetales y animales guardan un equilibrio sobreviene el deterioro de los tejidos a la invasión de estos

por los microorganismos. En ocasiones en estas microfloras naturales pueden presentarse microorganismos que pueden ser potencialmente dañinos para el desarrollo de las plantas y los animales o bien para el hombre queconsume éstos.

Las fuentes de alimentación para el hombre son básicamente de origen animal y vegetal, siendo estos alimentos

consumidos tal como se encuentran en forma natural, o bien, después de haber sido sometidos a algún proceso detransformación.

Durante la obtención de los vegetales - cosecha – y de los productos animales – ordeña, pesca y sacrificio – estos pueden contaminarse con microorganismos de otras fuentes y llegar así contaminados al consumidor y/o a la plantade procesamiento, se consideran en este punto como materias primas contaminadas,

Actualmente, la sanidad de los procesos alimentarios, farmacéuticos y cosméticos es de primordial importancia parasu aceptación y competitividad en los mercados de distribución nacionales e internacionales. Dentro de las prácticasaplicadas que se deben establecer en todo proceso biotecnológico, están las de eliminar a los microorganismos quedeterioran estos productos y a los microorganismos que puedan ser dañinos para la salud de los consumidores, esdecir se deben de ofrecer productos inocuos microbiológicamente para le hombre.

El presente trabajo tiene como objetivo que el estudiante de la materia de Microbiología Sanitaria, cuente con unaguía de técnicas que pueden ser aplicadas, para determinar observar, cultivar e identificar la presencia de losmicroorganismos de importancia ecológica o que afecten la calidad microbiológica de productos de origen

biotecnológico, así como su presencia en los materiales y equipos empleados en estas industrias.

Todo lo anterior los capacitará para desarrollar actividades de investigación y profesionales en centros deinvestigación, empresas y entidades que tengan la Microbiología como finalidad o como instrumento de trabajo yque puedan insertarse en el mundo industrial, de servicios, en el sanitario o ambiental tanto en sus vertientes de

producción y analítica como en las de Investigación y Desarrollo.

Lo cual les permitirá:

Preparar, mejorar y controlar los microorganismos necesarios para la obtención de productos industriales,así como desarrollar procesos microbianos para su realización.

Seleccionar, mejorar genéticamente y controlar cepas de microorganismos para su utilización en biotecnología y producción agropecuaria.

Realizar análisis microbiológicos con finalidades diagnósticas, en materiales de origen humano, animal yvegetal

Realizar el control microbiológico de medicamentos, alimentos, y materias primas utilizadas en laelaboración de los mismos.

Realizar asesoramientos, peritajes y arbitrajes que requieran conocimientos de microbiología.

Realizar control microbiológico de los niveles de contaminación y de asepsia de cualquier ambiente.




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En cada práctica se plantea un objetivo general de aprendizaje, que puede ser planteado de otra manera por elestudiante, conforme logra diversos niveles de desarrollo, o puede ser dividido en aprendizajes teóricos, habilidadesy actitudes genéricas o específicas, para explicitar más la intención de aprendizaje en cada apartado. De igual manerase plantea una breve introducción a fin de ubicar al aprendiente en el tema.

Se incluyen Materiales y métodos propios de cada práctica, en el que se incluye el material biológico o algunosmateriales de consumo que debe traer el estudiante. De igual manera se incluyen varios experimentos entre los cualesalgunos serán realizados por el estudiante, de acuerdo a las instrucciones del Profesor titular de la Materia.

Se incluyen esquemas y figuras para facilitar la implementación experimental, de igual manera se proponenesquemas o formas de presentación de resultados, en los que se privilegia la discusión apoyada en conceptos teóricoso metodológicos, teniendo el enfoque de destacar las partes y la capacidad de integrarlas como un aprendizaje globalde cada experiencia. Para hacer un análisis más detallado de cada tema, se incluye un cuestionario que debe sercontestado previamente o durante la realización de la práctica, consultando los materiales disponibles o los sugeridos

por el profesor.

Este manual además incluye dos anexos, el primero consigna las indicaciones de composición y preparación dereactivos y colorantes. El segundo incluye lo mismo para medios de cultivo necesarios para estas prácticas.

Consideramos que esta material es de gran ayuda para el desarrollo de la parte experimental de este curso, tanto para

estudiantes, profesores y Responsables del Laboratorio de Microbiología.

Atentamente

IBQ Ana Florina Villagómez Torres

Jefe de Lab. de Microbiología

Departamento de Ing. Bioquímica

Celaya Gto. 01 de febrero de 2013.




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REGLAMENTO INTERNO PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DEL ÁREA DEINGENIERÍA BIOQUÍMICA

REGLAMENTO DE LOS LABORATORIOS DE DOCENCIA

MISION:

Tiene como misión principal proporcionar a los profesores y alumnos la garantía de que cuentan con equipo,manuales y herramientas, en forma precisa, oportuna y en óptimas condiciones de uso; y en el cual se desarrollen las

prácticas contempladas en los programas de las materias, así como la realización de proyectos de investigación.

CONSIDERANDO:

1. Que en el Departamento de Ingeniería Bioquímica se cuenta con infraestructura de laboratorios, los cualesson parte integral de los cursos teórico - prácticos en la parte demostrativa y de investigación de las cienciasexperimentales.

2. Que en el proceso educativo que incluye laboratorios se procura una formación de investigación,comprobación, así como conocimientos significativos; para lograr una formación más integral en el

estudiante propiciando en ellos un mejor desarrollo de aptitudes, hábitos, habilidades, destrezas y disciplina.

3. Que lo laboratorios son una representación muy similar a la realidad y que es necesario que cuenten con unaorganización y funcionamiento adecuado, que permita el mejoramiento continuo del proceso educativo queen ellos se imparte.

CAPÍTULO I D ISPOSICIONES GENERALES

1. El presente reglamento es de observancia obligatoria para todos los usuarios del laboratorio de Microbiología:

a) Todo el personal directivo y docente de la Licenciatura en Ingeniería Bioquímica.

b) Todos los estudiantes regulares.

c) Todas las demás personas que autoricen los directivos de área, para proyectos de investigación o

vinculación.

2. Sus objetivos son:

a) Lograr el adecuado y máximo aprovechamiento de equipo, manuales, herramientas, componentes einstalaciones con que cuenta el laboratorio para obtener los mejores resultados individuales y deconjunto en el aspecto educativo.

b) Fomentar en el usuario el desarrollo de sus facultades creativas, hábitos de investigación, organización yresponsabilidad.

c) Propiciar la disciplina entre los usuarios.

3. El laboratorio ofrece los siguientes servicios a los usuarios:

a)

Préstamo de equipo, manuales, y herramientas para el desarrollo de prácticas, proyectos finales einvestigaciones.

b) Orientación a todos los usuarios en cuanto a la utilización de los recursos del laboratorio.

4.- Son responsables de exigir la aplicación del presente reglamento, los directivos, Jefe de laboratorio, auxiliares delaboratorio y profesores que dentro de sus actividades requieran del servicio.

a) Existe un Jefe de Proyecto de Docencia a quien le corresponde:




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Supervisar los laboratorios periódicamente para verificar el óptimo aprovechamiento de losequipos y materiales existentes.

Supervisar que las prácticas programadas se lleven a cabo.

a) Vigilar el cumplimiento del presente.

b) Verificar la ejecución y el avance de prácticas de acuerdo al tiempo y al programamarcado.

c) Informar al Jefe de Deaprtamento de las anormalidades y necesidades que se presentenen el funcionamiento de los laboratorios.

b) Corresponde a la Dirección del Plantel:

Verificar el cumplimiento del presente reglamento.

Proveer de acuerdo con los recursos disponibles el equipo y materiales necesarios para el buenfuncionamiento del laboratorio.

Proporcionar los medios necesarios para el mantenimiento adecuado del laboratorio.

Proporcionar, vía el Departamento de Servicios Generales, el personal de intendencia, para que loslaboratorios se encuentren en condiciones óptimas de limpieza, para ésto se proveerá capacitación,un horario, recursos materiales y un programa de trabajo adecuado para tal fin.

c) Corresponde a al Jefe de Laboratorio:

Informar Jefe de Proyecto de Docencia los avances de prácticas, anomalías y necesidades dereactivos, medios y equipo en el laboratorio, así como de mantenimiento preventivo y correctivo delas instalaciones.

d) Corresponde a los Profesores:

Cumplir invariablemente con las prácticas programadas.

Permanecer en el laboratorio durante el tiempo que se desarrollen sus prácticas.

Dar a los alumnos las explicaciones e indicaciones necesarias para el desarrollo de sus prácticas. Difundir y vigilar que los alumnos cumplan con las medidas de disciplina, seguridad y operación,

indicados en el presente.

En coordinación con el Coordinador del área, determinar las necesidades en los laboratorios ysolicitar los equipos y materiales o buscar el medio para obtenerlos.

Organizar a los alumnos en equipos de trabajo de acuerdo con los recursos disponibles.

e) Corresponde al Laboratorista:

Distribuir y controlar los equipos y materiales que se requieran para el desarrollo de prácticas.

Vigilar que los alumnos cumplan con las medidas de disciplina, seguridad y operación indicadosen el presente.

Informar al Jefe de Laboratorio del avance de prácticas realizadas. Asesorar al usuario en las técnicas sobre el uso del material y equipo.

Procurar la utilización óptima de equipos, instrumentos e instalaciones del laboratorio.

Vigilar que el laboratorio este siempre en condiciones de operación.

f) Corresponde a los Alumnos:

No manejar o utilizar las instalaciones, equipo o materiales sin la autorización del laboratorista olos profesores correspondientes.




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Dejar su mochila y/o utensilios escolares en el lugar asignado.

Atender las instrucciones dadas por sus profesores.

Solicitar en caso de duda, las aclaraciones necesarias antes del desarrollo de sus prácticas.

Presentar antes de iniciar una práctica un reporte preliminar de las actividades a realizar, el cualincluye:

o Hoja de presentación (fecha, nombre de la facultad, nombre de la materia, nombre de la práctica, nombre del participante(s), nombre del profesor).

o Objetivo de la práctica previamente establecido por el profesor (describir brevemente qué problemas a resolver se plantean durante la sesión).

o Desarrollo de la práctica (Por medio de un diagrama de flujo o esquemas, explicar condetalle los pasos necesarios para resolver el problema planteado por el profesor como son:análisis del problema, cálculos, etc.).

Entregar al profesor de la materia un reporte con los siguientes puntos:

o Hoja de presentación (fecha, nombre de la facultad, nombre de la materia, nombre de la

práctica, nombre del participante(s), nombre del profesor).

o Objetivo de la práctica. (Dado por el profesor e indica lo que se pretende comprobar conla práctica).

o Introducción teórica (breve panorama sobre el tema, basado principalmente eninvestigación de artículos, manuales y libros).

o Desarrollo de la práctica (en esta sección se debe explicar con detalle los pasos necesarios para resolver el problema planteado por el profesor como son: análisis del problema,cálculos, resultados de simulación y diagramas de diseño).

o Resultados (se presentan los resultados obtenidos en el circuito práctico, comparando eldesempeño de los sistemas reales con los simulados).

o

Conclusiones (en esta sección el alumno debe proporcionar su punto de vista y conjeturascon respecto a las experiencias obtenidas durante los procesos anteriores).

o Bibliografía (esta sección presenta la literatura que fue utilizada en la solución del problema, el objetivo de esta sección es proporcionar al lector interesado, un punto de partida para profundizar en el mismo proyecto u otros proyectos similares).

Además el reporte de la práctica debe tener una buena redacción y no presentar faltas de ortografía.

Los trabajos que no presenten las observaciones anteriores serán penalizados de acuerdo al criteriodel profesor.

Observar en todo momento seriedad en su trabajo así como en el trato a sus compañeros.

Entregar limpio al término de la práctica tanto el equipo como su área de trabajo.

Informar cualquier desperfecto en los equipos e instalaciones.

CAPÍTULO II DE LA ORGANIZACIÓN

5.- En el laboratorio deberá haber un encargado (Jefe de laboratorio o auxiliar del mismo), quien es responsable delfuncionamiento del laboratorio.

6.- El encargado del laboratorio será responsable del control de los equipos, así como de su mantenimiento preventivo y correctivo.

7.- Es obligatorio para el encargado del laboratorio conocer el funcionamiento y manejo de las instalaciones y equipocon la finalidad de garantizar su operatividad.




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8.- Las sesiones de práctica deberán ser coordinadas, supervisadas y realizadas, por el profesor de materia.

9.- Deberán realizarse sesiones de prácticas de laboratorio de acuerdo con el tiempo indicado para las asignaturas enel plan de estudios de la carrera. En el tiempo no asignado del laboratorio, el usuario podrá trabajar por su cuenta

bajo la supervisión del encargado de laboratorio o del director del proyecto (Asesor interno).

CAPÍTULO III DE LA OPERACIÓN

I : DE LA DI SCIPLI NA

Artículo 1o. Por seguridad queda estrictamente prohibido:

a) Fumar, comer o beber dentro de los laboratorios.

b) Jugar dentro de los laboratorios.

c) Trabajar dentro de los laboratorios con zapatos abiertos, faldas cortas, pantalón corto.

d) El ingreso a personas ajenas o no autorizadas.

e) El ingreso a alumnos y personas ajenas al cubículo de reactivos y material de vidrio.

f)

La entrada de alumnos o visitas en horarios que no correspondan a los de su práctica.

g) Hacer uso del equipo de laboratorio sin autorización y cuando no se haya establecido en el protocolo de la práctica.

h) Retirar del laboratorio material biológico a menos que así lo indique el profesor.

Artículo 2o. Si el profesor no se presenta a la hora asignada, la práctica no podrá realizarse.

Artículo 3o. Los alumnos podrán ingresar a los laboratorios únicamente cuando el profesor titular se encuentre presente.

Artículo 4o. El profesor debe permanecer en todo momento con sus alumnos cuando estos estén realizandoactividades dentro del laboratorio.

Artículo 5o.- El alumno no podrá abandonar el laboratorio durante el desarrollo de su práctica, Los alumnos sólo podrán entrar y salir del laboratorio con autorización del profesor

Artículo 6o.- El laboratorio es un lugar de estudio y por tanto se debe propiciar el silencio y un ambiente adecuado para tal fin. El alumno deberá guardar en todo momento una actitud respetuosa hacia el profesor, el asistente técnico,y sus compañeros. Se expulsará del laboratorio a los alumnos que no guarden el comportamiento debido

Artículo 7o. El alumno y el profesor deberán utilizar el mobiliario y equipo en forma adecuada y siguiendo lasindicaciones del instructivo de uso del equipo que van a emplear.

I V: DE LA PLANEACIÓN DE LAS PRÁCTICAS

Artículo 8o. Los profesores deberán entregar al inicio del semestre la calendarización de las prácticasprogramadas para su materia al responsable del área, a fin de optimizar el uso de los laboratorios.

Artículo 9o.Los profesores deberán entregar durante la primera semana del semestre la información de los protocolosde las prácticas a realizar en los formatos que les proporcione el responsable del área.

Artículo 10o. En caso de que el profesor requiera emplear el laboratorio para ensayar prácticas o realizaractividades de investigación, deberá consultar con el responsable del área los horarios disponibles y hacer lasolicitud formal del espacio para trabajar.




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Artículo 11o. Los maestros y alumnos deben planear su trabajo de manera que la práctica se completepuntualmente y puedan salir del laboratorio 10 minutos antes de la siguiente clase o práctica, previendo eltiempo que utilizarán para recoger, ordenar el material y limpiar su mesa.

V: DEL DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS

Artículo 12o.Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes y el personal académico usen bata.El alumno que no tenga bata no podrá permanecer en el mismo.

Artículo 13o.Los alumnos serán asignados el primer día del curso a una mesa de trabajo para todo el semestre.

El maestro entregará una copia de su lista oficial con la relación de estudiantes por equipo, para llevar elcontrol de trabajo en el Laboratorio.

El alumno o equipo de alumnos deberá(n) llenar un vale de Lab. al solicitar el material y equipo necesariospara la práctica, mismo que deberá entregar en buen estado al concluir la sesión.

Para hacer uso de equipo, manuales, herramientas y componentes del laboratorio, se deberá llenar completamente elvale con la siguiente información:

a) Para alumnos:

Vale de préstamo para alumnos con los siguientes datos:

Nombre completo y número de control (de todos los integrantes del equipo, o el nombre de una persona que solicita el material en forma individual, si no cabe en el frente, por el reverso).

Fecha

Materia y nombre de la práctica

Descripción y cantidad de material a utilizar

b) Profesores: Vale de préstamo a profesores con los siguientes datos:

Nombre

Fecha

Descripción y cantidad de material a utilizar.

c) Es responsabilidad del usuario reportar cualquier desperfecto sufrido por el equipo antes de empezar atrabajar, de esta forma se le deslindará de toda responsabilidad. Por ningún motivo el usuario deberá tratarde resolver un mal funcionamiento en el equipo.

d) En caso de que el equipo presentará alguna descompostura durante la realización de la práctica y ésta sea por alguna causa ajena al alumno, como deterioro de los componentes, picos de voltaje en la línea, etc., elusuario deberá reportar este problema y pedir un reemplazo de equipo. En este caso no se hará cargo algunoal estudiante.

e) En caso de que el equipo sufra de algún desperfecto por causas directamente imputables al usuario, éste seráresponsable de liquidar el monto de su reparación e incluso su reposición total del equipo si éste no tuvierareparación. Para esto se realizará una investigación en la que participarían el encargado, el profesor

responsable y el alumno implicado con el fin de deslindar responsabilidades.

Artículo 14o. Al finalizar la práctica, todo material y/o equipo que se haya utilizado deberá entregarse limpio alencargado del laboratorio o se solicitará una inspección del estado del mismo, para equipos fijos, según sea el caso;las herramientas y los manuales que se hayan solicitado, deben devolverse con cancelación del vale correspondiente,además dejar limpia su área de trabajo. En el caso de que el equipo haya sido averiado, deberán reportarloinmediatamente a la persona responsable del laboratorio. Desde el momento en que es entregado el equipo y hastaque éste sea devuelto, queda bajo la responsabilidad del usuario. Si por algún motivo el equipo devuelto no es elmismo que solicito, el equipo solicitado quedará aún bajo la responsabilidad de quien lo solicitó.




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Artículo 15o. El material o equipo que sea destruido o perdido será restituido por el o los alumnos responsables en unherido máximo de 15 días. La persona que no cumpla con el tiempo especificado para su entrega, no podráreinscribirse. El Jefe de laboratorio expedirá una relación de adeudos de los alumnos y profesores al final de cadasemestre, aquellos que se encuentren en esta lista no se podrán inscribir en el siguiente semestre. Los profesores

podrán recibir un extrañamiento dirigido a su expediente.

Artículo 16o. El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los alumnos deben de cooperar en elmantenimiento de la limpieza de su mesa de trabajo y el material que así lo requiera. La basura debecolocarse en los recipientes correspondientes.

Artículo 17o. Las substancias corrosivas o contaminadas se dejarán en depósitos adecuados sobre las mesas. Porningún motivo deben desecharse residuos o desperdicios a los lavabos.

Artículo 18o. Antes de desechar cultivos de microorganismos o muestras biológicas, deberá proceder a suinactivación o destrucción, ver artículo 17º.

Artículo 19o. El material punzo-cortante y material de vidrio roto deberán colocarse en los recipientes especiales para ello. Está prohibido depositar este tipo de material en los cestos de basura.

Artículo 20o.Los alumnos deben abstenerse de colocar en las mesas de trabajo cualquier material que no sea el

requerido para la realización de la práctica (por ejemplo: ropa, bolsas de mano, libros, etc). Sólo podrán tener enla mesa su bitácora de trabajo y una pluma para hacer sus anotaciones.

VI: DEL M ANEJO DE MATERIAL , EQUIPO Y REACTIVOS

Artículo 21o. En caso de cualquier accidente personal, de equipo o material de trabajo debe notificarseinmediatamente al profesor o al auxiliar técnico. Después de atender al accidentado y de resolver la contingencia,debe levantarse un reporte de incidencia dirigido al Jefe de Departamento para notificar y que de seguimiento delcaso.

Artículo 22o. No almacenar material en el refrigerador sin ser etiquetado correctamente con nombre delalumno o profesor, Materia y fecha. Cualquier material no etiquetado será desechado al finalizar el semestre.

Artículo 23o. Para transferir líquidos con pipetas, deberá utilizarse la propipeta correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca.

Artículo 24o. Dejar siempre tapado el reactivo que se esté utilizando y tomar una cantidad ligeramente superior a lanecesaria en un vaso de precipitado limpio y seco; medir del vaso con pipeta o probeta, no regresar los remanentesa los frascos de origen.

Artículo 25o. Antes de usar un reactivo verificar los datos anotados en la etiqueta y consultar sus propiedades físicas,químicas y toxicológicas para manejarlos adecuadamente.

Artículo 26o. No tocar directamente con las manos los productos químicos sólidos, especialmente aquellos que,además de su toxicidad, pueden producir quemaduras graves. Todo manejo se hará mediante espátulas.

Artículo 27o. El manejo de ácidos se realizará en la campana de extracción o una mesa limpia y bien ventilada,utilizando guantes y lentes de seguridad o careta.

Artículo 28o. Todos los compuestos volátiles o que desprendan vapores tóxicos deberán manejarse en lascampanas o en un lugar ventilado.

VI I : DEL CONTROL DE EQUI POS Y REACTIVOS

Artículo 29o. Cada equipo y reactivo que se encuentre en el laboratorio tendrá asignada una bitácora de uso oregistro de descarga.

Artículo 30o. Las bitácoras de los equipos y las descargas de reactivos son útiles para la administración de losmismos, por lo que es necesario mantener actualizados estos registros. Todo usuario deberá asentar en ellos los datosde uso una vez concluida la práctica.




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Artículo 31o. Las bitácoras y descargas son consideradas material de laboratorio, por lo que, si son sustraídas dellaboratorio por algún usuario, se considerará como adeudo al laboratorio.

Artículo 32o. La persona a quien se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales o instalaciones de loslaboratorios, será sancionada según la gravedad de la falta cometida y conforme al Reglamento Interno

correspondiente.

VII I: HI GIENE Y SEGURIDAD

Artículo 33o. El laboratorio debe estar equipado con botiquín de primeros auxilios y extinguidores colocados enlugares accesibles.

Artículo 34o. Toda persona que se introduzca a las áreas de trabajo, deberá abstenerse de ingerir alimentos, bebidasy fumar durante su permanencia en éstas.

Artículo 35o. Se abstendrán de tirar papeles, colocar material o equipo en el piso del laboratorio que puedaobstaculizar la libre circulación o ser causa de accidente.

Artículo 36o. Todos los objetos de desperdicio, deberán depositarse en los recipientes destinados para tal fin.

Artículo 37o. Los frascos que contengan sustancias tóxicas, combustibles o corrosivas; deben identificarse con unsímbolo de peligro en una etiqueta visible.

Artículo 38o. El laboratorista dará instrucciones precisas para el manejo, cuidado y transporte de los equipos ymateriales.

Artículo 39o. No se permitirá la entrada al laboratorio, a personal ajeno al mismo.

Artículo 40o. En caso de accidentes graves, los profesores deberán controlar las causas del accidente, asegurarseque la atención médica del accidentado sea inmediata o reciba los primeros auxilios necesarios e informarinmediatamente a las autoridades del plantel.

VII : TRANSITORIOS

Artículo 41o. Este reglamento será vigente a partir de la fecha de su publicación.Artículo 42o. Los aspectos no contemplados en este reglamento serán resueltos en primer término por el responsabledel área, el jefe de Departamento y, si el estudiante requiere atención médica, por el Jefe del Departamento deServicios Escolares y el Jefe de la División de Estudios Superiores, según sea el caso.




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RECOMENDACIONES PARA UN BUEN DESEMPEÑO EN EL TRABAJODE LABORATORIO.

Las personas que trabajan con agentes infecciosos pueden adquirir infecciones en el laboratorio, como resultado deaccidentes o incidentes no reconocidos.El grado de riesgo depende sobre todo de la virulencia del agente biológico en cuestión y de la resistencia delhuésped. En el laboratorio, las infecciones se adquieren por ingestión, inhalación o introducción de microorganismosen los tejidos de manera inadvertida. Los laboratoristas que realizan pruebas con cepas de Haemophilus influenzae y

Streptococcus pneumoniae están relativamente a salvo. Sin embargo, los que trabajan con aerosoles de Neisseria

meningitidis tienen un riesgo mayor de adquirir una infección meningocóccica.El riesgo asociado con agentes patógenos entéricos, tales como Shigella, Vibrio o Salmonella, es la ingestiónaccidental, por ello es tan importante no tocarse el cuerpo y sobre todo la cara, no ingerir alimentos o bebidas y tenerla bata y utensilios de Lab. aislados de los materiales comunes de trabajo de otras materias.Las recomendaciones especiales de seguridad son apropiadas para el trabajo con estos agentes, que presentan un

peligro moderado para el personal y el ambiente. En relación con el personal de laboratorio que trabaja en estasinstalaciones, se han establecido las siguientes directrices:

1. El personal de laboratorio debe recibir adiestramiento específico en cuanto al manejo de los agentes

patógenos y estar dirigido por científicos competentes.

2. El acceso al laboratorio tiene que ser limitado en horas de trabajo.

3. Deben tomarse precauciones extremas con respecto a los objetos afilados contaminados.

4. El personal que realiza ciertos procedimientos que requieren la creación de aerosoles infecciosos osalpicaduras tiene que utilizar equipo y ropa de protección adecuados (Cubrebocas, mascarilla, guantesquirúrgicos, campana de flujo laminar).

Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben serobservadas para lograr un buen nivel de aprendizaje en el trabajo práctico.

1. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo,fundamento y técnica.

Es obligatorio preparar un diagrama de actividades, que debe ser conocido y discutido portodos los integrantes del equipo; puede hacer dibujos o esquemas cuando se considere necesario,

para aclarar dudas sobre manejo de material o equipo.

Revisar materiales biológicos y de consumo que deberá traer cada equipo para la realizaciónde cada práctica o sesión de laboratorio.

Cualquier duda sobre el trabajo de Lab. debe hacerse al maestro antes de iniciar la práctica.

2. Material personal Cada estudiante debe tener bata blanca de manga larga que cubra el frente, una Bitácora

de trabajo, lápices de colores, un rollo de cinta adhesivo, tijeras, pinzas de disección de punta roma, asa y porta-asa, botes de lamina (de los usados para conservas y alimentos enlatados de 300, 600mL. y 1L) ycerillos o encendedor.

3. El estudiante debe llevar una Bitácora de trabajo en donde cualquier observación relevante, para anotarcualquier cambio en las condiciones de la práctica y los resultados deben ser siempre anotadoscuidadosamente apenas se conozcan.

4. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia:




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El ingreso al laboratorio debe ser puntual para atender cualquier observación para el desarrollo dela práctica, con la bata puesta, limpia y abotonada, aquellas personas con cabello largo debenmantenerlo sujeto y el rostro despejado.

Todo material, mochilas y objetos ajenos al laboratorio deben quedar en anaqueles y mesas de

guardado, a la entrada del laboratorio. No comer, fumar, mascar chicle o tener ningún objeto en la boca durante el trabajo en el

laboratorio. No deben jugar, maquillarse, peinarse o realizar actividades ajenas al trabajo delaboratorio.

Al iniciar la práctica debe lavar su material y limpiar su área de trabajo. Para microbiologíaademás se requiere desinfectar mesas y utensilios con solución de cloro al 6% o con fenol – alcohol antes de iniciar el trabajo y al terminar cada práctica, se procederá a limpiar o lavarcuidadosamente el material que se ha utilizado.

Cuando maneje microscopios, procure sentarse frente al microscopio para evitar vibraciones.Para sembrar y otras actividades, busque la posición que le permita un trabajo prolongado y sinriesgo.

• Depositar en los botes para basura todo el material de desecho no contaminado, como papel,algodón, cerillos, etc.

Al finalizar cada sesión, deberá colocarse el material debidamente separado en los lugaresasignados para ello: material contaminado para esterilizar, en el refrigerador de materialcontaminado, se esteriliza sin etiquetas; material sucio para lavar, se lava, se seca y se guarda;material para incubar, se coloca en la incubadora correspondiente; y reactivos debidamentecerrados y ordenados.

Colocar los bancos debajo o sobre de la mesa al terminar la sesión y lavarse las manos, antes desalir del laboratorio.

5. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.

6. Es muy importante delimitar el área de trabajo en condiciones de esterilidad y:

Del lado izquierdo colocar las gradillas con tubos, los matraces, las cajas de Petri estériles y

toda clase de recipientes que se habrán de manipular.

Del lado derecho deben estar cerillos o encendedor, asa y portaasa, marcador, tijeras, pipetas

y un recipiente de dimensiones apropiadas para desechar los diferentes materiales que se

deberán esterilizar, principalmente pipetas y los tapones de algodón que se ponen al final de

estas.

7. Al frente, a unos 30 cm del borde de la mesa se coloca el mechero, cuya llama debe ser estable y de

unos 15 cm de altura. Para el trabajo en condiciones asépticas, si no se dispone de una campana deflujo laminar, se deben hacer las manipulaciones a una distancia horizontal no mayor de20 cm y a

una altura de 5 a 10 cm de la base de la llama. Este espacio constituye la zona de seguridad del

mechero.

Siempre debe esterilizarse el asa bacteriológica, antes y después de usarla. El procedimiento

consiste en introducir en la llama del mechero el alambre en posición inclinada a unos 45º y dejar




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que alcance el rojo vivo, después se flamea el porta asa hasta una distancia igual a la profundidad

de los recipientes que se utilicen, sean tubos o matraces.

La boca de tubos y matraces se debe flamear, con objeto de quemar los filamentos de algodón que

puedan adherirse provenientes del tapón, igualmente para destruir los contaminantes de la mano,

que se adhieren en el momento de retirar el tapón, esta operación se realiza inmediatamente antes

de volverlo a colocar.

No se debe exagerar esta operación sobrecalentando, ya que esto puede hacer que el tapón se

queme, o que cualquier manejo subsecuente del material ocasione una quemadura al operador.

8. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se

necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.

9. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con elprofesor. Existen frascos con ácidos o álcalis de reuso.

10. No tocar con las manos o con la boca los productos químicos. Use guantes o pipeteros cuando lo requiera.

11. Todo el material y equipo, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, debenmanejarse con cuidado, evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. El profesor y el personal delaboratorio asesorarán a los estudiantes en el correcto manejo de material y equipo. Cualquier duda,consúltenlos.

12. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de losmecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María, nuncadirectamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las

llaves de paso al apagar la llama, apague el mechero cuando no lo esté usando.

13. Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para evitarque salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los matraces, vasos o tubos deensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared.

14. Cuando se quiera diluir un ácido, siempre se debe echar ácido sobre agua, dejando resbalar

suavemente por la pared del recipiente. Nunca al contrario: agua sobre ellos.

15. Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la etiquetaquede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se deteriore dicha etiqueta y no se puedaidentificar el contenido del frasco.

16. Está estrictamente prohibido pipetear con la boca en el laboratorio. Deben utilizarse los bulbos degoma, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el laboratorio.

17. Las pipetas se tomarán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo superior para regular la caídade líquido.

18. Al enrasar un líquido con una determinada división de escala graduada en pipetas, frascosvolumétricos o probetas, debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a laaltura de los ojos para que el menisco de enrase sea horizontal. En el caso de buretas debe montarse




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el equipo de manera que la parte media de la bureta quede a la altura del rostro y bajar e subir el cuerpode manera que el menisco quede siempre en línea horizontal, a la altura de los ojos.

19. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen líquidos o materiales que pueden

proyectarse debe evitarse producir salpicaduras, ya sea por ebullición violenta o sobrecalentamiento brusco. El tubo de ensayo se acercará a la llama inclinado y procurando que ésta actúe sobre la mitadsuperior del contenido y agitando para distribuir el calor, cuando se observe que se inicia la ebulliciónrápida, se retirará, acercándolo nuevamente a los pocos segundos y retirándolo otra vez al producirse unanueva ebullición, realizando así un calentamiento intermitente. En todo momento, se evitará dirigir laboca del tubo hacia usted o hacia otra persona.

20. Ningún material de vidrio debe enfriarse bruscamente justo después de haberlos calentado con el fin deevitar roturas.

21. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen.

22. Las agujas o asas de inoculación se deben enfriar sosteniéndolas en el aire durante 5 – 10 segundosantes de que toquen las colonias o el material clínico. Las asas que contienen material infeccioso tienenque secarse en aire caliente sobre un mechero antes de flamearlas.

23. Cuando se lleven a cabo procedimientos con alto riesgo de generar aerosoles infecciosos, o cuando el procedimiento que se utiliza puede resultar en una salpicadura de la cara con material infeccioso u otromaterial peligroso, el trabajo de laboratorio debe realizarse en gabinetes de seguridad o porlaboratoristas que usen los equipos apropiados de protección de la cara ( por ejemplo, anteojos, máscara uotros protectores). Entre los procedimientos que pueden ser de riesgo tenemos la centrifugación,

pulverización, zarandeo, agitación o mezcla vigorosa, disrupción sónica, recipientes abiertos de materialesinfecciosos cuyas presiones internas puedan ser diferentes de las presiones del ambiente, inoculaciónintranasal de animales y cosecha de tejidos infectados de animales o huevos. Las máscaras protectoras

deben también utilizarse cuando se trabaja con altas concentraciones o grandes volúmenes de agentesinfecciosos.

24. El material para incubar debe llevar la siguiente identificación:

Materia-Grupo,

Equipo,

Nombre de un (o los) alumno (s),

fecha y nombre del microorganismo o experimento.




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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA SANITARIAPractica N°1: “Selección y preparación de los materiales y soluciones para un

análisis microbiológico”

Introducción

En el análisis microbiológico para determinar la calidad sanitaria de los procesos, áreas de trabajo,maquinaria, utensilios, materias primas, líneas de producción, productos terminados y personal involucrado en todoel proceso, la adecuada selección de la muestra, el muestreo correcto, el transporte al laboratorio y su conversaciónadecuada hasta el momento de su análisis, es de primordial importancia para obtener resultados confiables yreproducibles.

Una muestra idónea, es aquella que va a representar las características de todo un lote del producto.Los materiales utilizados para la recolección de las muestras, deberán ser los apropiados y cumplir con las

medidas de esterilidad para evitar emitir resultados falsos positivos.El análisis microbiológico de las muestras se debe de analizar lo más pronto posible a partir del momento

en que fue tomada la muestra. Cuando el muestreo se realiza en lugares distantes al laboratorio, es indispensablemantener las muestras a bajas temperaturas, bajas el momento en que van a ser analizadas, lo anterior es con fin de

inhibir el crecimiento de los microorganismos potencialmente presentes.Otro punto importante en un muestreo, es la rotulación de las muestras que nos indiquen las características

microscópicas el estado físico del producto, el número o clave asignada para su identificación en el laboratorio, ellugar, fecha y hora de muestreo.

2.1 Materiales y Soluciones. Abrelatas estériles. Algodón Bata, cubre bocas, cofia y guantes

estériles. Bolsas de plástico de 18 x 20 cm. tipo

Ziploc o estériles para muestreomicrobiológico.

Cajas de Petri con medio para muestreo por contacto.

Cerillos. Cinta testigo. Cucharitas y espátulas de acero

inoxidable estériles. Cuchillo estéril.

Esponjas estériles. Etiquetas. Frasco de 250 – 500mL. boca ancha

estériles. Hielera para el transporte de muestras. Hielo potable o bolsas refrigerantes. Hisopos estériles.

Mechero bunsen. Plantillas de 15 x 15cm de aluminio estériles. Plumón de tinta indeleble. Solución amortiguadora de fosfatos. Solución germicida. Solución sal - Glicerina. Solución de tiosulfato de sodio al 10%

2.2 Preparación del material para la toma de muestra

1. Todo material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de las muestras,que van a estar en contacto directo con los alimentos (frasco, cuchillo, espátulas, bolsas, pinzas) deben estar

limpios, estériles y libres de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.2. El material par ala toma de muestra que requiera esterilización, se envuelve en forma individual con papel

de estraza o aluminio y debidamente identificado. Los medios de cultivo y soluciones preparadas, seesterilizan en una autoclave. El material metálico y de cristal es más conveniente esterilizarse un horno auna temperatura de 170°c durante 2 horas. Para evitar agua condensada que pueda afectar la confiabilidaddel análisis.

3. Es conveniente colocar un pedazo de cinta testigo en los materiales para asegurar que la esterilización fueefectiva. Cuando se esterilizan frascos de boca ancha, su tapa se protege con papel aluminio para evitar quese contamine esta parte del frasco.




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4. Las pipetas y las cajas Petri, se pueden esterilizar en recipientes de acero inoxidable.

5. Una vez esterilizado el material debe ser guardado en gavetas o espacios donde no puedan contaminarse conel polvo o corrientes de aire del medio ambiente.

6. Algunos materiales como espátulas, varillas de vidrio, cuchillos y cucharillas, pueden reutilizarse, despuésde lavarlas, humedecerlas con etanol o isopropanol al 70% y flamearlas, utilizándolas en el momento o bien

pueden guardarse en recipientes estériles.

7. Cuando se muestrea agua de la red municipal la cual ha sido desinfectada con sales de cloro, en necesario,antes de esterilizar los frascos para muestreo, adicionar 0.8mL. de una solución al 10% de tío sulfato desodio por cada litro de agua muestreada.

2.3 Procedimiento para la toma. Manejo y transporte de las muestras.2.3.1 Obtención

1. La persona encargada de realizar un muestreo de alimento, deberá utilizar cofia, cubre bocas, guantescuando sean necesarios, no deberán tener puestos accesorios como anillos, aretes, pulseras, ni elementossueltos que en determinado momento puedan caer a los productos, inmediatamente antes del muestreodeberá lavar las manos con agua y jabón y enjuagárselas con un liquido germicida, secándoselas con toallasde papel desechables.

2. La toma de muestra de los productos envasados se llevan a cabo en forma aleatoria, tomándose del mismolote y en cantidad suficiente {25-500 g} para el análisis, enviándose al laboratorio tal como se presentan alconsumidor

3. tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir estos y extraer muestras encondiciones asépticas para evitar una contaminación extrema.

4. los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precaución estrictamenteaséptica.

5. cuando se requiere y tomar muestras asépticamente, estas no deben tomarse en áreas donde las condicionessanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las mismas.

6.

la toma de muestras deben hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma demuestra deben abrirse únicamente al momento de introducir esta y cerrarlos de inmediato, no tocando elinterior de los envases y evitando que la tapa se contamine.

7. cuando sea necesario, se toma la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deberán ser diferentes dela que se envía para el análisis microbiológico.

8. para los alimentos preparados sin envasar, de consumo inmediato, se recomienda que la persona que los prepara sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que empleanormalmente. Los alimentos que se muestrean estando calientes, se deben conservar y trasladar a latemperatura en que se muestrearon, estos únicamente se el traslado es menor de una hora, de lo contrariodeberá enfriarse a temperatura ambiente y trasladar en condiciones de refrigeración.

9. en el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta conseguir suhomogenización y después efectuar el muestreo en diferentes niveles {250-500mL.}

10.

en alimentos sólidos cuando sea necesario se corta el producto y se muestrea con ayuda de instrumentosestériles como sacabocados, cucharas y cuchillos.

11. en productos a granel se toma la muestra de varias fuentes del contenedor para obtener una muestrarepresentativa.

12. .-cuando la toma de muestra se realice en un ducto de salida o una compuerta, antes de obtener la muestra sedebe dejar paras las primeras fracciones del producto para limpiar la salida del flujo.

2.3.2 Identificación de la muestra.




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1. En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despuésde colocar en le muestra, mediante rotulo o etiqueta (Figura1)

2. La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, en forma tal que se evite que la muestra seaalterada o violada.

2.3.3 Conservación y transporte.

1. El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida se ruptura, alteracióno contaminación, evitando además se exposición a la luz solar directa.

2. Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los alimentos perecederos setransportan bajo condiciones de temperatura de 2 a 8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta elmomento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a surecolección. En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°c, empleado paraconservarla hielo seco, para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con hieloREFRIGERANTE O HIELO POTABLE contenido en bolsas de plástico impermeables, para evitar que elagua de hielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.

3. Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura

ambiente, siempre y cuando esta no exceda de 45°c

4. Para la conservación, durante el transporte de las muestras no esta permitido el empleo de sustanciasquímicas.

5. Las muestras que se entreguen al laboratorio, deberán acompañarse de un informe que además de contenerla identificación de la muestra, incluya los siguientes datos:

a. Número de unidades y/o cantidad.

b. Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante, representante y/odistribuidor.

c. Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca comercial y cualquierotra información que se considere importante.

6.

Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes deefectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisismicrobiológicos que sean necesarios.

Etiqueta de identificaciónMuestra de:

N° de muestra:Cantidad de muestra:Lote:Lugar de muestreo:Hora de muestreo:Muestreado por:Observaciones:

Figura 1 Etiquetado de muestras.

2.4 Manejo de las muestras. EQUIPO 1 2.4.1 Muestras líquidas

2.4.1.1 Agua de la red de distribución.

1. Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodón impregnada de solución de hipoclorito desodio con una concentración de 100mg/l, tallando hasta que no se desprenda más suciedad u oxido. Cuando




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se obténgase el material de salida esta limpio. Únicamente es necesario humedecer con una torundaimpregnada de alcohol y prenderle fuego hasta el consumo del alcohol.

2. Dejar correr el agua aproximadamente 1 a 3 minutos

3. Cerca del orificio de salida, deben quitarse simultáneamente el tapón del frasco y el papel de protección,manejando los como unidad, evitando que recontaminen el tapón, o el papel de protección, o el cuello delfrasco

4. DEBE MANTENERSE EL TAPON HACIA ABAJO PARA EVITAR CONTAMINACION y proceder atomar la muestra sin pérdida de tiempo y sin enjuagar el frasco; se debe dejar el espacio libre requerido parala agitación de la muestra previa al análisis {aproximadamente 10% de volumen del frasco}. Efectuada latoma de muestra, deben colocarse el tapón y el papel de protección al frasco. Trasladarlo al laboratorioinmediatamente, conservándolo a una temperatura de 4 a 10°c

5.- análisis solicitados:a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos.

b) NMP de bacterias coliformesc) Vibrio cholerae

2.4.1.1 Agua estancada (tanque de almacenamiento, lagos, cisternas.)1. Deberán lavarse las manos y antebrazos con agua y jabón, INMEDIATAMENTE ANTES DE LA TOMA

DE MUESTRA y después de acondicionar el área de muestreo y los materiales.

2. Quitar el papel de protección evitando que se contamine.

3. Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo sosteniendo por la base. Girar el frasco e impulsarlosuavemente hacia arriba, de manera tal que al salir a la superficie se haya yendo ¾ partes de volumen. (Entodos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superior o del fondo donde puede haber nata osedimento; en el caso de captación en cuerpos de aguas superficiales (no deben tomarse muestras muy

próximas a la orilla o muy distantes del punto de extracción). Si existe corriente en el cuerpo de agua, latoma de muestra debe, efectuarse con la boca del frasco en contracorriente.

4. Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapón, sacar el frasco del agua y colocar el papel de protección.

5. Análisis solicitados:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos.

b) NMP de bacterias coliformes.

c) Vibrio cholerae.

2.3.1.3 Agua de pozo.

1. Cuando no es posible tomar la muestra con la extensión del brazo. Debe atarse al frasco un sobrepesousando el extremo de un cordel limpio.

2. Debe quitarse simultáneamente el tapón y el papel de protección, manejándolos como unidad, evitando que

se contamine el tapón. O el papel de protección, o el cuello del frasco3. Con el cuello del frasco manteniendo hacia abajo, se procede a tomar la muestra, bajando el frasco dentro

del pozo, y desenrollando el cordel lentamente, evitando que el frasco toque las paredes del pozo.

4. Efectuada la toma de muestra, debe colocarse el tapón y el papel de protección al frasco.


a. Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos. b. NMP de bacterias coliformes.c. Vibrio cholerae.




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Figura 2: Botella de inmersión.

2.3.1.4 Agua y Bebidas embotelladas.

1. Tomar varios envases, de preferencia poco después de haber sido embotellado el producto.

2.

Limpiar la tapa con jabón bactericida, enjuagar con agua clorada y limpiar con alcohol.

3. Retirar l tapa e introducir una pipeta estéril al garrafón o envase, tomar la muestra y llevarla a un frascoestéril.

4. Cerrar el frasco inmediatamente después de tomar la muestra.


a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos. b) NMP de bacterias coliformes.c)

Vibrio cholerae.d) Hongos y levaduras.

2.4.1.5 Hielo.

1. La muestra de hielo en cubos, hielo frape o cualquier forma fraccionada, se toma con pinzas o cucharasestériles depositándola en frascos de boca ancha de 1 litro de capacidad. Es preferible tomar la muestra dehielo directamente de la maquina que lo esta produciendo.

2. En caso de hielo envasado, tomar el paquete cerrado.

3. Para hielo en bloque, lavar perfectamente la superficie exterior con agua estéril

4. Para eliminar la contaminación superior. Fraccionar con un picahielo estéril y transferir al frasco utilizando

instrumentos estériles como pinzas, cucharas, etc., procurando no volver a contaminar las fracciones, oenjuagarlas con agua estéril.

5.

Análisis solicitados:a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos.

b) NMP de bacterias coliformes.c) Vibrio cholerae.

2.4.2 Muestras sólidas. EQUIPO 2




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2.4.2.1 Embutidos, quesos, alimentos preparados.1. Para este tipo de alimentos, deben retirarse porciones de diferentes partes del alimento, cortando con un

cuchilllo estéril del centro, los extremos, de la superficie y del interior.2. Análisis solicitados:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos. b)

Coliformes totales.c) Coliformes fecales.d) Hongos y levaduras. e) Staphylococcus aureus.

f) Listeria monocytogenes.

g) Vibrio cholerae

2.4.2.2 Enlatados.

1. Limpiar la tapa de la lata con jabón bactericida, enjuagar con agua clorada, limpiar con alcohol y flamear.2. Abrir el recipiente con un abrelatas estéril.3. Análisis solicitados:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos. b) Coliformes totales.c)

Coliformes fecales.d) Hongos y levaduras.e)

Staphylococcus aureus.

f)

Listeria monocytogenes.

g) Vibrio cholerae.

h) Clostridium.

2.4.2.3 Deshidratados.1. Abrir el recipiente con asepsia y tomar la muestra con espátulas de acero inoxidable estériles e introducirla

en una boca estéril.2. Análisis solicitados:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos.

b) Coliformes totales.

c) Coliformes fecales.

d) Hongos y levaduras.

2.4.2.4 Helados.1. Tomar de los envases originales a granel, porciones representativas de 50g.2. Si el recipiente esta abierto, tomar 1 cm de espesor de la superficie y desecharla, después con una cucharilla

estéril, proceder a tomar la muestra.3. Si al muestra es muy viscosa se deja derretir a una temperatura ambiente durante 15 minutos4. Análisis solicitados:

a) Coliformes totales. b) Staphylococcus aureus

2.5 Técnicas de muestreo para determinar la sanidad en una planta procesadora de alimentos.

EQUIPO 32.5.1 Introducción.

Actualmente en la industria alimentaría se aplican programas de control de calidad apoyados en los análisis deriesgos y control de puntos críticos (HACCP). Estos sistemas completan la importancia que se debe tener en lainterrelación de todos los elementos del proceso: materias primas, equipo de procesamiento, personalinvolucrado y medio ambiente.El medio ambiente puede construir una fuente importante para la contaminación microbiana en los procesos delos alimentos, es por eso que hay que diseñar programas efectivos para su control. Los puntos críticos mascomúnmente encontrados como focos de contaminación microbiana, son las superficies de las mesas, los




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utensilios, la maquinaria, los pisos, techos y paredes, el aire, las manos y en general el personal portador demicroorganismos patógenos.

2.5.2 Procedimientos.

2.5.2.1 Muestra de aire.Para determinar si una fuente de contaminación proviene del aire, se utilizan cajas Petri con medios selectivos

para los microorganismos que se desee determinar, se dejan destapadas entre 15-20 minutos en lugares detrabajo, durante las horas que haya más movimiento, se cierran y se incuban. Se envían al laboratorio y se

procede hacer los siguientes análisis:a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos aeróbicos.

b) Coliformes totales.

2.5.2.2 Muestreos de superficies y utensilios

A. Método del hisopoEsta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas; consiste en frotar un aplicador de

madera u otro material con algodón (hisopo) estéril, humedecido con la solución diluyente en un áreadeterminada.

Área que se muestrea 15x15(cm, área limpia, o mm en áreacontaminada)

Figura 2 Plantilla de plástico o aluminio estéril y muestreo con torunda o hisopado.

a.1 Muestreo de superficies.

1. Colocar una plantilla estéril de aluminio o teflón (figura2) sobre la superficie que se va a muestrear ydestapar asépticamente un hisopo estéril.

15mm

15cm




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2. Si la superficie está seca, humedecer el hisopo en la solución amortiguadora y presionar contra la pareddel frasco para quitar el exceso de líquido, con un movimiento de rotación; si la superficie está húmeda,no es necesario hacer ésto.

3. Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30° frotar 3 veces la superficie delimitada por la plantilla, cada

una en dirección opuesta. Enjuagar el hisopo en la solución amortiguadora regresar el exceso delliquido y repetir la operación con el mismo hisopo sobre 3 superficies mas.

4. Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos.

5. Colocar el envase sobre el hielo picado o en una caja con refrigerante y enviar al laboratorio.

a.2 Muestreo de utensilios de comedor.1. Utilizar frascos de 50mL..2. Tomar una torunda con pinzas o un hisopo estéril (figura 3), sumergirla (o) en la solución amortiguadora,

exprimirla (o) contra las paredes del frasco.3. Limpiar bien con la torunda (o hisopo) la superficie del utensilio, enjuagar la torunda (o hisopo) y

exprimirla (o) contra las paredes del frasco {figura3}4. Limpiar 3 utensilios iguales o diferentes y agregar las muestras a la misma solución.5. Colocar la torunda dentro del frasco de la muestra, enviar el laboratorio para realizar los siguientes análisis:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos.

b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli

c) Staphylococcus aureus.

d)

Salmonella y Listeria.

Figura 3: Muestreo de utensilios, hisopado, torunda estéril.

B. Método de la esponja EQUIPO 4

Esta técnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en áreas grandes.

b.1 Toma de muestra.

1. Sacar la esponja con pinzas estériles o con guantes desechables (figura 4), o bien utilizar una bolsa nueva de polietileno invertida a manera de guante; humedecerla con solución amortiguadora de fosfatos estériles o bien con agua peptona al 0.1% estéril.

2. Frotar vigorosamente con la esponja el área en la que se va a tomar la muestra.3.

SI LA SUPERFICIE ES PLANA, se puede aplicar la solución directamente sobre la superficie y recogerlacon la esponja frotando.

4. Colocar la esponja en la bolsa de plástico con todo el líquido de muestreo. Cerrar la bolsa5. TRANSPORTAR AL LABORATORIO en refrigeración para realizar los siguientes análisis:




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a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos. b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli c) Staphylococcus aureus.d) Salmonella y Listeria.

Figura 4. Muestreo por el método de la esponja.

C. Método de la placa por contacto.

Este método se recomienda para obtener datos cuantitativos en superficies planas e impermeables. Idealmente la placa se debe utilizar sobre superficies que han sido previamente saneadas y desinfectadas. En lugares con altogrado de contaminación, resultará en un crecimiento masivo en la placa que dificultara los recuentos.En los casos de muestreo en superficies previamente tratadas con germicida, es necesario que se agregue almedio de cultivo un agente neutralizante adecuado.

1. Se prepara la placa Rodac con agar sobresaliendo en forma cóncava del borde de la base.2. Se toma de la base con guantes estériles, se invierte y se frota en un ocho sobre la superficie a muestrear, se

voltea y se cubre con la tapa.3. Se incuba sin invertir.

En superficies donde se sospeche que se encuentran un poco mas contaminadas, y que pueden originar mas de300 UFC por placa, se deben tomar suficientes muestras para obtener datos representativos, la selección del sitioal azar permitirá comparaciones adicionales y eliminara posibles interferencias.




29

Placa RODAC. Observe la base con

borde. La tapa queda sostenida sobreéste, permitiendo espacio entre el agar yla tapa

Muestreo de superficie

Figura 5: Placa RODAC y muestreo.

c.1 Toma de muestra.1. Quitar la tapa de plástico y presionar cuidadosamente el agar contra la superficie, mediante movimientos

rotatorios uniformé, presionar sobre la parte de atrás de la placa para efectuar el contacto.2. Colocar de nuevo la tapa e incubar en posición invertida a 34°c durante 24 – 48 horas.3. Transportar al laboratorio en refrigeración para realizar los siguientes análisis:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos.

b)

Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli c)


d)

Salmonella

e)

E. coli.

f) Listeria.

D. Método de enjuague.

Este método se emplea para tomar muestras de objetos pequeños como son cucharas, tenedores, mamilas de biberones, etc. O para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plástico, etc.

d.1 Muestreo de utensilios de comedor.

1. Sumergir la superficie de los utensilios que estén en contacto con la boca (cucharas, tenedores, etc.) en unfrasco de boca ancha con 40mL. de solución amortiguadora de fosfatos.

2. Agitar el utensilio en el líquido para que se enjuague perfectamente; repetir la operación con 3 utensiliosmás para obtener el lavado de 4 utensilios iguales por frasco. En caso de muestrear menor numero deutensilios indicarlo en la etiqueta.

3. Cuando se trate de mamilas, enjuagar cada una de ellas, introduciéndola en el frasco, tapándolo y agitándolofuertemente.

4. El número de mamilas enjuagadas debe ser 4 salvo que se desee muestrear una sola, y se debe especificar enel frasco.

d.2 Muestreo de superficies interiores. EQUIPO 5

1. Introducir en el envase o bolsa. 10-100mL. de solución amortiguadora estéril.

2.

Enjuagar haciendo correr el líquido por toda la superficie, agitar bien.3. Regresar el líquido de enjuague al recipiente original.4. Rotular el recipiente y enviarlo al laboratorio para realizar los siguientes análisis:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos. b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli c) Staphylococcus aureus.

d) Salmonella y Listeria.




30

Figura 6. Toma de muestra en manos.

d.3 Muestreo en superficie de manos.

d.3.1 Método del enjuague1. Vaciar el contenido del frasco, 50mL. de solución estéril de fosfato con triton x-100, en una bolsa

nueva de polietileno, donde se pueda introducir la mano que se va a muestrear y cerrar a la alturade la muñeca.

2. Frotar los dedos particularmente alrededor de las uñas y la palma de la mano a través de las paredesde la bolsa durante un minuto.

3. Regresar el contenido de la bolsa al frasco.4. Transportar al laboratorio en refrigeración para realizar los siguientes análisis:

a) Cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos.b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli

c)


d) Salmonella y Listeria.

d.3.2 Método del hisopo o la torunda1. Utilizar frascos de 50mL..

2.

Tomar una torunda con pinzas o un hisopo estéril, sumergirla (o) en la solución amortiguadora,exprimirla (o) contra las paredes del frasco.3. Limpiar bien con la torunda (o hisopo) la superficie interna de los dedos y el contorno de las uñas,

enjuagar la torunda. {no es necesario limpiar el dorso de la mano}.Se puede repetir la operación tomando la muestra de la otra mano, indicarlo en la etiqueta.

2.6 Técnicas de muestreo para microorganismos anaerobios.EQUIPO 6

2.6.1.1 Muestreos paraClostri dium perf ri ngens.1.

Tomar una porción representativa de 25g, del alimento a muestrear {pollo asado entero, salsas,vegetales crudos, sopas deshidratadas, etc.}

2. Transferir la muestra a bolsas estériles o frascos de 200mL.

2.6.1.2 transporte y almacenamiento.1. Si el transporte de la muestra es rápido, basta con conservarla a 10°c hasta su análisis.2. Si al muestra no es analizada en un lapso de 8 horas, adicionar 25mL. de solución sal-glicerina (ver

apéndice 2), y conservar inmediatamente a 20-32°C durante su transporte al laboratorio.3. Cuando las muestras son líquidas como salsa o jugo de carne, deberán mezclarse bien con un volumen

equivalente de doble concentración de solución sal-glicerina. Almacenar inmediatamente la muestra a20-32°c o en hielo para su transporte al laboratorio.

4. Transferir la muestra con l solución sal-glicerina a un frasco estéril y adicionar 200mL. de agua peptonada.

http://ceal.ulagos.cl/areas/muestreo/images/057.jpg




31

2.6.2 muestreo para Clostridium botulinum

1. Tomar una porción representativa de 25g del aliento a muestrear.2. Transferir la muestra a bolsas estériles o frascos y conservarla en refrigeración, excepto las conservas

las cuales no necesitan ser refrigeradas a menos que estén dañadas o quebradas.3. Asépticamente transferir la muestra a un homogenizador de alimentos adicionando igual volumen de

solución amortiguadora de fosfatos con gelatina.4. Conservar la muestra homogénea en refrigeración, hasta su análisis.

2.7 selección. Preparación y medición de la alícuota.

2.7.1 selección y toma de la alícuota.

1. La muestra colectada de un lote debe ser representativa de este. Esa muestra a su vez es objeto de unnuevo muestreo cuando se extrae de ella la alícuota que va a ser analizada. La muestra deberá estar

perfectamente homogeneizada, para que la alícuota tomada sea representativa y evitar que estarepresente únicamente un aparte especifica del producto. Deberá ser manejada de tal manera que se

eviten contaminaciones externas.

2.7.1.1 muestras líquidas.

1. Cuando el producto es líquido, se tiene más facilidad para homogenizarlo, ya que con agitación se puede lograr el objetivo. Únicamente hay que considerar los productos que contienen grasa, los cuales,deben emulsificarse completamente debido a que los glóbulos de grasa tienden a adsorber bacterias ensu superficie. Es conveniente tener u obtener muestras no menores a 1 litro, en alimentos y aguas

purificadas y de 250mL. en agua de red municipal.

2.7.1.2 muestras sólidas.

1. Algunas muestras {carne molida, leche en polvo, helado de crema} son fácilmente homogeneizables.

Otras que se presentan en únicamente empacadas {quesos, salchichas, etc.} requieren del retiro de porciones de diferentes partes de la pieza constituir la alícuota: del centro y los extremos, de lasuperficie y del interior.

2. Cuando el producto es sólido y muy heterogéneo {alimentos cocinados} macerar o dividir finamenteuna masa grande {100-500g} y a partir de esa obtener la alícuota por analizar. Eventualmente puederesultar mas conveniente examinar por separado cada componente del alimento. No es recomendablelicuar el alimento sólido sin diluyente para homogenizarlo; la temperatura se eleva rápidamente demanera que después de 5 minutos pasa de 25° a 55°c y después de 10 minutos a 75°c.

3. El tamaño de las muestras deberán ser entre 250- 500g.

2.8 preparación y dilución de muestras. EQUIPO 1-6

Debido a que los alimentos son ricos en elementos nutritivos para los microorganismos, en muchas ocasiones elnúmero de estos por gramo de producto es muy elevado, por lo cual es necesario realizar diluciones de lamuestra original para poder cuantificarlos.El método recomendado es el de las diluciones decimales, para lo cual se procede de la siguiente manera.Procedimiento

2.8.1 Preparación de la dilución primaria.

2.8.1.1 A partir de muestras líquidas:




32

Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución demicroorganismos es homogénea o fácilmente homogenizable por medios mecánicos (agitación, etc.).

Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en bañode agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.

Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativade la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

Forma de pesar la muestra sólida.

Figura 7 Diluciones.

1. Preparar frascos de dilución con 90mL. de líquido de dilución, estéril. Nota. El diluyente debe encontrarse auna temperatura similar a la muestra, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

2.

Medir 10 mL. de muestra liquida bien homogenizada.3. Mezclar asépticamente la muestra con los 90 mL. líquidos. Para ésto agitar el frasco con 25 movimientos de

lateralmente, en un arco de 30° efectuados en un tiempo de 7 segundos. En este primer frasco se tiene unadilución de la muestra de 1:10 o 10-1. Si la muestra contiene sólidos es necesario dejar en reposo por 5minutos para que sedimenten.

La preparación de las diluciones decimales adicionales posteriores, si son necesarias, tienen como objeto reducirel número de microorganismos para unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observaciónde la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.

10g

10-1

10-1 10-2 10-4 10-3 10-5 10-6

10mL10mL 10mL 10mL 10mL




33

4. Del sobrenadante de la primera dilución, tomar una alícuota de 1 mL para 10 mL totales. o 10 mL. pararealizar una segunda dilución en 90mL. de líquido diluyente estéril, para 100 mL. totales. Agitar el frascolateralmente para homogenizar. Esta constituye la segunda dilución de 1:100 o 10 -2. Se utiliza el mismo

procedimiento para las demás diluciones {ver figura5}.Agitar la muestra manualmente con 25 movimientosde laterales en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL.. de la muestra ydiluir con 9 mL...

5. Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de 10 u 11mL., diluidos con 90 o 99 mL., de la misma forma que se describió anteriormente

2.8.1.2 A partir de muestras sólidas o semisólidas.

Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis.

1. Pesar una cantidad de 10 - 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles detamaño adecuado (figura 5).

2. Adicionar un volumen de 90 mL. del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.3.

Mezclar de la forma ya descrita para homogenizar la muestra o bien utilizar una licuadora uhomogenizador Stomacher durante 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogéneasegún se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, estetiempo no debe exceder de 2,5 minutos.

4. Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capassuperiores de la suspensión.

Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.

El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo,aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo cuandoexista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren

significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.

2.8.2 Preparación de las diluciones decimales adicionales.

1. Transferir 1 mL. o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL. de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otrorecipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada,evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

2. Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe en2.8.1.1. (1).

3. La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen delnúmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y dela información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total deinformación, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

4.

Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayanseleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.

5. Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurriraplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido.

6. Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello delfrasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

Nota: En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en0,1 mL. o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.




34

El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es:

Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar elmicroorganismo en 10 mL. de la dilución más alta.

Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 coloniasen un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En elcaso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma OficialMexicana correspondiente.

2.8.3 Duración del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben serusadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES:

CUESTIONARIO1.- ¿ cómo puedes estar seguro de que el material para tomar la muestra, esta efectivamente estéril ?.2.- ¿qué función tiene el tío sulfato de sodio adicionado al envase para el muestreo de agua de la red municipal?3.- ¿por qué es necesario con algunas muestras hacer diluciones?4.- ¿qué función tiene un agente neutralizante agregado al medio de cultivo en un muestreo de superficie ¿5.- ¿Qué importancia tiene la transportación adecuada de las muestras del sitio muestreado al laboratorio?

Bibliografía.-Board R.G. 1989. Introducción a la microbiología moderna de los alimentos. Edit. Acribia. España.

-Peclzar M. J. Jr. Reid R.D. y chan E. C. S. 1996. MICROBIOLOGIA. Edit. Mc. Graw Hill. Mexico.

Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución

de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Diario oficial de la federación mexicana.

Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, Manejo yTransporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Diario oficial de la federación mexicana.

Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. 1992. Ley Federal sobre Metrología y Normalización. DiarioOficial de la Federación. México, D.F.

Secretaría de Salud. 1984. Ley General de Salud. Diario Oficial de la Federación. México, D.F.

Secretaría de Salud. 1988. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario deActividades, Establecimientos, Productos y Servicios. Diario Oficial de la Federación. México, D.F.

Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. NOM-008-SCFI-1993. Norma Oficial Mexicana. Sistema Generalde Unidades de Medida.

Norma ISO 6887-1983 (E). Microbiology General guidance for the preparation of dilutions for microbiologicalexamination. International Organization for Standardization.

NORMA-Z-013/02. 1981. Guía para la Redacción, Estructuración y Presentación de las Normas OficialesMexicanas. (Secretaría de Comercio y Fomento Industrial.)




35

Bacteriological Analitycal Manual. 1984. Food and Drugs Administration FDA. Bureau of Foods. Division ofMicrobiology. 6a. Ed. Washington, D.C.

Vanderzant F., Carland S., y Don F. 1992. Compendium of Methods for the Microbiological Examination ofFoods. American Public Health Association. Washington, D.C.




36

Instituto tecnológico de Celaya Practicas de Microbiología Sanitaria

Nombre: fecha:

III.- Practica N° 2“cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos” RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:Conocimientos / habilidades requeridos- Clasificación de las bacterias- Características de las bacterias- Alimentos que contaminan las bacterias.Competencias por adquirir- Conocimiento y habilidades para aplicar las metodologías adecuadas para aislar y cuantificar las bacteriascontenidas en un alimento.- Importancia del aislamiento y cuantificación de bacterias contaminantes de alimentos. Criterios de este grupomicrobiano como indicador sanitario. Límites máximos permisibles y criterios de aceptación y rechazo paramateriales biológicos con cargas elevadas.

3.0 introducción.Bacterias mesófilas. Estas bacterias son las de mayor abundancia en la naturaleza y también las que con mayorfrecuencia están presentes en forma natural o contaminando los alimentos. Su temperatura óptima decrecimiento es de 35°c aunque el rango de crecimiento es de 20°c a 40°C. Este tipo de bacterias pueden adaptarsu metabolismo a las temperaturas bajas de los psicrófilo y cuando se desarrollan se dicen que son bacterias

psicrotrofas. Su importancia en los alimentos reside en que son las responsables del deterioro de los alimentosconservados en refrigeración.

3.1 material.Frascos de dilución con 90 mL. delíquido de dilución estéril.Pipetas de 1.0 y 10 mL. estériles.Cajas de Petri estériles

Papel aluminio estéril {15x15 cm} ocontenedor estéril para pesar la muestra.

Espátula estéril.BalanzaAutoclave.Cuenta colonias.

Incubadora a 35°c.

3.2 medios de cultivo.Agar para métodos estándar.

La cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos {CEBMA} esta designada para indicarlos niveles de microorganismos en un producto.

3.3 procedimiento para análisis de alimentos congelados, enfriados, precocinados o comida preparada.

1.- preparar diluciones 10-2 10-3, 10-4, usando para cada dilución una pipeta estéril.2.- transferir 10 mL. de dilución previa para 90 mL. de diluyente. Evitando producción de espuma.3.- agitar todas las diluciones 25 veces en un arco de 30 cm en 7 segundos.4.- tomar 1.0 mL. de cada dilución separadamente y por duplicado en cajas de Petri marcadasapropiadamente.5.- agregar de 12-15 mL. de agar en cada placa enfriado a 44-46°C, antes de 15 minutos de haber hechola dilución original.6.- agregar agar inmediatamente a la caja Petri cuando la muestra diluida contenga material giroscópico,

por ejemplo: harina y almidón.7.- inmediatamente mezclar la muestra diluida y el agar uniformemente por rotación alternada, y conmovimientos de un lado a otro de las placas en superficie lisa.8.- dejar que solidifique el agar e incubar a 35°C durante 24.-48 horas.




37

3.4 guía para calcular y reportar la cuenta estándar de microorganismos mesofílicos areróbicos {CEBMA}en casos no comunes:

1.- placas normales de {25-250} colonias:Seleccione placas con colonias separadas. Cuente todas las unidades formadas de colonias{UFC}.incluyendo aquellas de tamaño pequeño, en las placas seleccionadas. Registre las dilucionesusadas y el número total de colonias contadas.

2.-placas con más de 250 colonias:Cuando un numero UFC por placa excede de 2501, cuente las UFC en las porciones de las placas queson representativas de la distribución de colonias. Marque las CEBMA calculadas con asteriscos, paraindicar que fueron estimadas en placas que tenían un rango fuera de 25-250 colonias por placa.

3.- bacterias que forman colonias que se expanden en al superficie del agar:Estas colonias son comúnmente de 3 tipos:

1} una de cadena de colonias, no muy separadas, que parecen ser causadas por desintegración de grupos

de bacterias.2} colonias que se distribuyen entre el agar y el fondo de la caja.3} colonias que se forman en la superficie del agar.

El reporte de estas placas se estima como colonias extendidas que cubrieron el 100%, 50% o 25% de lacaja.

Cuando sea necesario contar las placas con colonias extendidas, se cuenta cada uno de los tres distintostipo:

Para el primer tipo: solo si existe una cadena, cuéntela como una colonia simple. Si una o mas cadenasaparecen para originar fuentes separadas, cuente cada fuente como una colonia. No cuente cadacrecimiento individual como cadena sino como una colonia separada.

Para los tipos 2 y 3: usualmente resulta en distintas colonias y son contadas como totales. Conviene elconteo de colonias expandidas y el conteo de colonias para registrar la CEBMA.

4.- placas sin crecimiento:Cuando en las placas de todas las diluciones no hay crecimiento, se reporta la CEBMA o UFC de ladilución mas baja realizada. Cuando las placas de una muestra fueron contaminadas o no satisfactorias,registre el resultado {s} como un accidente del laboratorio {LA}.

3.5 reporte de colonias.Para evitar crear una impresión ficticia de precisión y exactitud cuando se cuentan CEBMA, reporte sololos 2 primeros dígitos significativos. Redondee el segundo digito al próximo numero superior; cuando eltercer digito es 6, 7, 8 o 9 y use ceros para cada digito sucesivo hacia la derecha del segundo digito.Redondee hacia abajo cuando el tercer digito es 1, 2, 3, o 4 cuando el tercer digito es 5, redondee haciaarriba, cuando el segundo digito es impar y redondee hacia abajo cuando el segundo digito es par.

Ejemplo:

ConteoCalculado

CEBMA/mL. o g




38

12, 700 13, 000

12, 400 12, 000

15, 500 16, 000

14, 500 14, 000

1.- placas con 25-250 UFC:a} calcule la CEBMA como sigue:

N= E c/ [{1 x n1} + {0.1 x n2}] x {d}

Donde.

N= numero de colonias por mL. o g de producto.Ec= sumatoria de todas las colonias en todo el conteo de placas.

N1= numero de placas en la primera dilución contada. N2= numero de placas en la segunda dilución contada.D= dilución para la cual la primera cuanta fue obtenida.

Ejemplo:1:100 1:1000

232,244 33,28 N= {232+244+33+28} / [{1 x 2} + {0.1 x 2}] 10-2

= 537/0.022= 24,409= 24,000 UFC/mL. o g.

2.- todas las placas con menos de 25 UFC:Cuando las placas de ambas diluciones son menores de 25 UFC cada una, registre la cantidad como

menor que 25 x 1/d, cuando d es el factor de dilución para la dilución del cual primera cantidad fueobtenida.

Ejemplo:1:100 1:1000 CBMA/mL. o g

18 2 <2,500

0 0 <2,500

3.- todas las placas con más de 250 UFC:Cuando las placas de varias diluciones son mayores de 250 UFC cada una, pero menores que 100/cm 2.Estime la CEBMA, cercana a 250 y multiplicada por la ultima dilución.

Ejemplo: Numero de colonias de la primera dilución {1:100} = 640Ultima dilución =1:1000

640 x 1000 = 640,000Resultado: 640,000 UFC/mL. o g




39

4.- todas las placas con colonias expandidas y/o accidentes de laboratorio:cuando el promedio del numero de colonias es aproximadamente a 100 UFC/cm2, se considera el tamañode la placa que puede ser de 59 o 65 cm2 y se estima la CEBMA mayor que 100 veces la ultima dilución.

Ejemplo: Numero de colonias x cm2 = 100 {promedio}Tamaño de la caja = 65 cm2 Ultima dilución = 1:1000 65 x 100 x 1000= 6,500 000Resultado = >6,500 000 UFC/mL. o g




40

3.6 especificaciones APLICADAs de mesofilos aerobios.

AlimentosLimite máximo per-misible

UFC/mL. o gAgua purificada <100

Agua potable <200Jugos y néctares pasteurizados 100

Leche pasteurizada 30 000Leche condensada azucarada 100

Leches deshidratadas 100crema 50 000

mantequilla 10 000Queso procesado 10 000

Mermeladas, purés, jaleas, ates 50Productos carnicos: curados, emulsio-nados ycocinados {salchichas, pasteles, mortadelas,

etc.}

100 000 en planta y/o frontera600 000 en el momento de venta

Aves frescas-refrigerados y congelados 10 000 000Pescados frescos-refrigerados y congelados 10 000 000Huevo fresco-refrigerado 100 000

Huevo liquido refrigerado o congelado 15 000Huevo, yema y clara congelados 15 000

Huevo, yema y clara deshidratados 25 000Huevo, yema y clara pasteurizadas y

envasadas asépticamente.1 000

FUENTE: diario de la federación mexicana. NOM-014-SSA1-1993

DIBUJOS Y OBSERVACIONES:

Cuestionario

1.- ¿A QUE TEMPERATURA SE DEBE mantener el agar para métodos estándares antes del vaciado enal caja con ls muestras?

2.- ¿porque se le llama agar para método estándar?

3.- defina el término microorganismo (bacteria) mesofílico(a) aerobico(a).

4.- en función de la temperatura de crecimiento, como se clasifican las bacterias?

5. ¿Por qué el método de las diluciones es cualitativo y cuantitativo?6. ¿Por qué es importante el método de la estría cruzada para verificar la pureza de un cultivo?7. Mencione dos técnicas físicas y dos químicas de enriquecimiento para microorganismos que estén en

baja concentración en una muestra.4. Si como se menciona en la introducción, el oxígeno molecular es un agente oxidante muy tóxico,¿cómo es que los microorganismos aerotolerantes lo soportan a concentraciones tan altas como laatmosférica del 21%?

BIBLIOGRAFIA

-Diario Oficial de la Federación Mexicana. NOM-014-ssa1-1993




41

-Eduardo Fernández escartin. Agua y alimentos. Microbiología Sanitaria. Volumen 1.

-James, T. Peeler., AND LARRY, MATURIN. 1992. AEROBIC PLATE COUNT. FDA BacteriologicalAnalitical Manual 7th Edition




42


PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA APLICADA

NOMBRE FECHA

IV.- PRACTICA N°. 3

“DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES Y COLIFORMES FECALES EN

AGUAS Y BEBIDAS”

4.0 INTRODUCCION

Las bacterias del grupo coliforme podemos encontrarlas formando parte de la Microflora natural de los vegetales yde los intestinos de los animales y el hombre.

Durante los últimos años estos microorganismos y específicamente Escherichia coli, Han sido considerados comomicroorganismos indicadores de cuando un alimentos ha sido contaminado directa o directamente por materialesfecales. La importancia De su determinación radica pues, en establecer si un alimento estuvo o no propenso A sucontaminación por este tipo de microorganismos. La mayoría de las bacterias De este grupo poseen el sistemaenzimático llamado beta- galactosidasa, por medio Del cual llevan acabo la fermentación de la lactosa. Con

producción de ácidos Orgánicos y gas. Para la determinación del número de bacterias coliformes totalesEn los alimentos se utilizara la capacidad de producción de ácidos orgánicos en Medio sólidos; y la producción degas la determinación de coliformes en General se realiza en medios líquidos para determinar el numero mas

probable de bacterias coliformes y coliformes fecales (NMP ).Un indicador específico de contaminación directa o indirecta de un alimento por Materias fecales es la determinaciónde la presencia de Escherichia coli, para lo cual Se utiliza sus capacidades tanto de fermentación de lactosa.Crecimiento a 44.5°C, y u actividad enzimática de beta – glucuronidasa (GUD).

4.1 MATERIAL.

Frascos de dilución con 90 mL. de solucióndiluyente estéril.Tubos con tapón de baquelita de 15 x 100.

Pipetas de 1. 0, 5. 0 y 10.0 mL.. estériles.Caja de Petri estériles.Papel aluminio estéril (15 x 15 cm.) ó contenedoresestériles para pesado de muestras.

Espátulas estériles.Balanza.Auto clave.

Incubadoras calibradas a 35 y 44. 5° C.Homogenizador de alimentos.Lámpara de luz UV (365 nm ).Lentes protectores de luz UV.

4.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.Agar Violeta- Rojo- Bilis (VRB).Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB).Caldo Lactosado (CL).Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST).Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (caldo BRILA2%).Caldo Escherichia coli (EC).Caldo Lauril Sulfato Triptosa + Metilumbeliferil-B-D-glucurónido (CLST- MUG ).Caldo Lactosado + MUG (CL - MUG).Caldo Escherichia coli + MUG (EC – MUG).Caldo Rojo de Metilo – Voges Proskauer (MR – VP).

Caldo Citrato de Koser (CK).Caldo – m – HD Endo

Solución diluyente de fosfatos.Solución de alfa – naftol.Solución de hidróxido de potasio al 40%.Solución de rojo de metilo.Reactivo de Kovac.Reactivo de Voges – Proskauer.

4.3 Procedimiento para la determinación del Número Más Probable (NMP) de bacterias coliformes en agua potable, purificada y hielo.




43

4.3.1 Prueba Presuntiva.

1.- La muestra se agita para homogenizarla bien.2.- Se adiciona volúmenes de 10 mL. de muestra a cada uno de cinco tubos con Tapón de baquelita y tubo defermentación, contenido 20 mL. de caldo lactosado 1.5 veces la concentración normal deacuerdo a la cantidadindicada en la etiqueta del frasco.3.- Se adicionan 1.0 y 0.1 mL.. de la muestra a respectivos tubos con tapón de baquelita y tubos de fermentación,conteniendo 15 mL.. de caldo lactosado de Concentración Normal (diagrama 6).4.- Una vez adicionada la muestra de la serie de los siete tubos, se revisan para asegurarse de que no presentan

burbujas de aire, si esto ocurre, se invierten los tubos ya cerrados para expulsarlas (todos los tubos se rotulan parasu identificación posterior en casa de que den una reacción positiva.)5.- Los tubos se incuban durante 24 – 48 hs. a una temperatura de 35° C. Si alas 24 hs. se observa la formación degas los tubos invertidos, se procede a realizar la prueba confirmativa (figura 7). Si a las 48 hs. de incubación, nohay la presencia de gas, se considera como una prueba negativa y se reporta la ausencia de bacterias coliformes.

4.3.2 Prueba Confirmativa

1 Se registran los tubos de la prueba presuntiva.

2.- Se agitan suavemente los tubos y mediante un asa estéril, se procede a inocularUna asada a igual numero de tubos con tapón de baquelita con tubo o campana de fermentación, conteniendo

15 mL.. de caldo bilis verde brillante al 2% (caldo BRILA AL 2%).3.- Una vez inoculados los tubos, se incuban durante 24 – 48 hs. a una temperatura de 35° C.4.- Si alas 24 hs. se observa una clara formación de gas, se registran los tubos positivos y con la combinación deestos, se determina el Numero Mas Probable (NMP) de bacterias coliformes de acuerdo a la tabla 8 (ver ejemplo).5.- A partir de cada uno de los tubos positivos en esta prueba, se procederá a determinar la presencia deEscherichia coli en el siguiente paso.6.- cuando después de transcurridas 48 hs. de incubación, no se observa la formación de gas en ninguno de lostubos inoculados, se considera negativa la prueba y se reporta la ausencia de bacterias coliformes.

10 mL.. De muestra

1 mL.. De muestra 0.1 mL.. De muestra

20 mL.. De CL

concentrado 15 mL.. CLnormalFIGURA 6: Diagrama de la prueba presuntiva para determinar el NMP de coliformes en agua purificada y hielo




44

FIGURA 7: El tubo del centro es positivo, indica una producción de gas dentro de la campana de Durham.

TABLA N0. 8

TUBOS INOCULADOS: 5 CON 10.0 ML.. 1 CON 0.1 ML.. N0. DE TUBOS POSITIVOS ( 95%) LIMITES DE CONFIANZA

5 – 10.0 mL.. 1 – 1.0 mL.. 1 – 0.1 mL.. NMP / 100 mL.. MINIMO MAXIMO0 0 0 <2 0 5.90 1 0 2 0.05 131 0 0 2.2 0.05 131 1 0 4.4 0.52 142 0 0 5 1.54 192 1 0 7.6 1.5 19

3 0 0 8.8 1.6 293 1 0 12 3.1 304 0 1 15 3.3 404 0 0 20 5.9 484 1 0 21 6.0 555 0 0 38 6.4 3305 0 1 96 12 3705 1 0 240 12 3700

FUENTE: Standard Methods for the Examination of Water and W. 11 th. Edition 1960 A.P. H.

Ejemplo:MUESTRA ( ML..) 10 1 0.1

TUBOS POSITIVOS 3 1 0

RESULTADOS= 12 NM / mL..RESULTADOS = 12 NMP/ML..

4.3.3 presencia de Escherichia coli.

1.- De cada uno de los tubos que resultado positivos de la prueba confirmativa paracoliformes, se toma una asada y se resiembran para tener colonias aisladas




45

En placas conteniendo agar eosina azul de metileno (EMB).2.- se incuban las placas en posición invertida durante 24 hrs. A una temperatura de 35° C.3.- El desarrollo de colonias oscuras con brillo verde metálico, nos indica laPresencia de Escherichia coli (figura 9).4.- A partir de estas colonias se realizan las pruebas bioquímicas para su confirmación.

FIGURA 9: características se E. coli en el agar EMB.

4.3.4 pruebas bioquímicas para presencia de E.coli. { se realiza esta serie de pruebas por cada colonia aconfirmar.}

4.3.4.1 producción de indol.

1.- inocular un tubo con 4.0 mL. de caldo triptosa e incubarlo 24 h a 35°C.2.- después de la incubación se adicionan 0.2-0.3 mL. de reactivo kovac.3.- el desarrollo de un color rojo en la superficie es considerada como prueba positiva.

4.3.4.2 prueba voges-proskauer {VP}

1.- inocular un tubo con 4.0 mL. de caldo MR-VP e incubarlo 48h a 35°C2.- después de la incubación se transfiere 1.0 mL. a un tubo de 13 x 100 mm.3.- se adiciona 0.6 mL. de una solución de alfa-naftol, y 0.2 mL. de una solución de hidróxido de potasio al 40%se agitan los tubos.4.- adicionar unos cristales de creatina, agitar y dejar reposar por 2h.5.- la prueba es positiva si se desarrolla un color rosado.

4.3.4.3 prueba de rojo de metilo.

1.- incubar un tubo con 4.0 mL. de medio MR-VP durante 48h a 35°C2.- adicionar 5 gotas de un solución de rojo de metilo al tubo.3.- el desarrollo de un color rojo se interpreta como prueba positiva. Un color amarillo nos indica un resultadonegativo.

4.3.4.4 crecimientos con citrato.

1.- se inocula un tubo con 4 mL. calco citrato koser, el cual de be de presentar un aspecto completamente claro.




46

2.- incubar el tubo inoculado durante 96h a 36°C3.- si hay crecimiento el tubo presentara un aspecto turbio considerándose la prueba como positiva.

4.3.4.5 interpretaciones de las pruebas bioquímicas.

Resultado: E. coli

INDOL Voges-proskauer rojo de metilo citrato.

+ + - - biotipo 1

- + - - biotipo 2

4.4 determinación de bacterias coliformes totales y coliformes fecales en alimentos.

4.4.1 introducción.

Las bacterias consideradas como del “grupo coliforme”, se encuentran ampliamente distribuidas en al naturaleza,de tal manera que los alimentos principalmente de origen vegetal, pueden contenerlos en numero considerableantes de su limpieza los productos alimenticios procesados y que después son distribuidos a granel, también

pueden presentar este tipo de microorganismos, de tal manera que , las normas APLICADAs y dependiendo deltipo de producto, concede cierta tolerancia el numero, siempre y cuando estén ausentes aquellas bacteriascoliformes de origen fecal. En general el “ grupo coliforme”, se determina cuando se hace un recuento de

bacterias coliformes totales.

4.4.2 determinación de bacterias coliformes totales.

1.- se inocula por duplicado en cajas de Petri estériles, 1.0 mL. de cada una de tres diluciones realizadas a lamuestra de alimentos a analizar. Las diluciones se hacen de acuerdo al grado de contaminación que se sospechetenga el alimento.2.- se vacía el medio de agar violeta-rojo-bilis, estéril y enfriando aproximadamente 45-50°C y se homogeniza

bien al muestra.3.- una vez solidificada la mezcla del medio y la muestra, se adiciona una capa delgada del medio y se dejasolidificar.4.- se incuban las cajas en posición invertida, durante 24 h a 35°C5.- después de este tiempo, se cuentan las colonias desarrolladas de un color rojo intenso; escogiendo para lalectura las cajas que presenten un número de colonias comprendidas entre 25-30 a 250-300.6.- se hace el reporte en UFC/g o mL. de producto.

4.4.3 determinación del numero mas probable {NMP} de bacterias coliformes fecales.

4.4.3 prueba presuntiva.

1.- se toman 10 g de la muestra previamente homogenizada y se hacen diluciones de 1:10, 1:100 y 1:1000.

2.- previamente, se prepara una serie de nueve tubos baquelita y tubos invertidos para fermentación, conteniendo15mL. de caldo laurel sulfato, esterilizando todo el sistema.3.- se inoculan tres tubos preparados de CLS con 1.0 mL. cada uno de la segunda y los otros tres tubos con 1.0mL. cada uno de la tercera dilución. ROTULACION cada uno de los tubos de acuerdo a la dilución adicionada

para identificarlos posteriormente4.- una vez realizadas las inoculaciones se incuban los tubos durante 24-48 h a una Temp. 35°C {figura 10}5.- transcurrido este tiempo, se revisan los tubos y se separan los positivos que presenten una producción de gas




47

15 mL.. Para c/tubocon caldo de laurel sulfato.

1mL. de la dilución 10-1



FIGURA 10: diagrama de la prueba presuntiva, para determinar el NMP de coliformes fecales en alimentos.

1.- se prepara un número similar a los tubos de la prueba anterior, de tubos con tapón de baquelita conteniendotunos para fermentación invertidos y 15mL. de caldo E-C esterilizado todo el sistema.2.- a partir de los tubos positivos con CLS y utilizando un asa, se inoculan los tubos con caldo E-CROTULADOS a que dilución de la muestra corresponde cada uno de los tubos inoculados.3.- una vez inoculados, se incuba en un baño de agua a una temperatura de 44.5°C durante 24 h.

4.- al término de Este tiempo se revisan los tubos y se registran a que dilución original corresponden los queresulten positivos con formación de gas.5.- la combinación de las diluciones de los tubos positivos, se leen en la tabla correspondiente del NMP decoliformes fecales por g o mL. de muestra (ver ejemplo).6.- de cada uno de los tubos positivos, se resiembran en cajas con agar EMB para separar colonias y a partir deestas se procede a realizar las pruebas bioquímicas para identificar los biotipos de E. coli presentes.

Ejemplo:




48

N° tubos 2 2 1

diluciones 10-1 10-2 10-3

Resultados = 28 NMP/g o mL.




49

4.5 Técnica de filtración por membrana para agua.


Esta técnica es apropiada para muestras líquidas quede antemano se consideren con un bajo numero o

ausencia de bacterias coliformes, debido a que es posible analizar en un solo paso hasta volúmenes de 100mL. dela muestra.

4.5.2 procedimiento.

3

con1mldilución1:10=0.1g

muestra

Tubosinoculados:

3


muestra

3


muestra

0000000000000000

0123012301230123

9

.1

1

4.0

2

0.0

2

6.0

1

5.0

2

0.0

2

7.0

3

4.0

2

1.0

2

8.0

3

5.0

4

2.0

2

9.0

3

6.0

4

4.0

5

3.0

9.1

14.0

20.0

26.0

15.0

20.0

27.0

34.0

21.0

28.0

35.0

42.0

29.0

36.0

44.0

53.0

0000111122223333

0000111122223333

2222222222222222

0000111122223333

0123012301230123

3.6

7.2

11.0

15.0

7.3

11.0

15.0

19.0

11.0

15.0

20.0

24.0

16.0

20.0

24.0

29.0

0000111122223333

0123012301230123

1111111111111111

0000111122223333

0123012301230123

3.0

3.0

6.0

9.0

3.0

6.1

9.2

12.0

6.2

9.3

12.0

16.0

9.4

13.0

16.0

3{0.1}

30.01

3(0.001)NMP/go

ml

3{0.1}

30.01

30.001

NMP/go

ml

3{

0.1}

30.01

30.001

NMP/go

ml

3{0.1}

30.01

0.001o

ml

Tubos

ositivos

Tubos

ositivos

Tubos

ositivos

Tubos

ositivos




50

1.- colocar el cojinete de papel filtro en la caja de Petri previamente identificada con el número de la muestra y lafecha de análisis.2.- depositar 2 mL. de medio (caldo-m-HD endo) con una pipeta estéril.3.- extraer el embudo porta-filtro esterilizando en autoclave, de su envoltura.4.- montar el embudo en un matraz kitasato conectado a una fuente de vació.5.- colocar la membrana, con la cuadricula hacia arriba, en el embudo porta-filtro, tomándola con una pinzaestéril, y teniendo la precaución de no dañarla.6.- medir con una probeta estéril 100mL. de agua y filtrarla aplicando vació.7.- retirar la membrana con una pinza y colocarla sobre el cojinete de papel filtro. La cuadricula de la membranadebe quedar hacia arriba.

En caso de tener que filtrar varias muestras con un solo embudo, este puede sumergirse en agua a ebullición conel fin de desinfectarlo. Una vez sanitizando, colocar el embudo en el matraz y enjuagarlo con agua estéril paraenfriarlo, haciendo uso de presión negativa. Cuando el embudo este frió puede procederse a filtrar la siguientemuestra. Hay que tener en cuidado en al manipulación del embudo, a fin de no tocar su interioro con las manos.Si no se dispone de medio liquido, una alternativa es utilizar medio sólido de endo, vaciando una capa de 5 mL. auna caja de Petri de 50x9mm, y una vez solidificada, depositar sobre su superficie la membrana.

8.- incubar a 35°C por 22 a 24 horas.9.- retirar la membrana y colocarla sobre un papel filtro; dejar secar al aire.10.- auxiliándose de una lupa o microscopio y con iluminación perpendicular, contar las colonias que presentenun color rojo oscuro, con brillo metálico verdoso, (que puede estar en toda la superficie de la colonia, en el centroo en la periferia de la misma)1..- informe: numero de colonias/ 100mL. de la muestra.

4.5.3 ventajas.

1.- los recursos se obtienen en 24 horas.2.- La cantidad de muestra probada es mayor y por lo tanto, mas significativa.}3.- la técnica tiene mayor precisión y responsabilidad.

4.- el volumen de medio de cultivo requerido es muy bajo.4.5.4 desventajas.

1.- el alto costo de las membranas y del equipo de filtración.2.- la interferencia en el crecimiento de los organismos coliformes, por bacterias de otro tipo, más abundantes enla muestra.3.- la producción de resultados falsos positivos debido a sinergismo bacteriano.4.- la dificultad de la lectura en muestras muy contaminadas que pueden dar origen a colonias confluentes osuceder que la calidad de medio de cultivo sea insuficiente para el desarrollo de todas ellas.

4.6 determinación de la actividad de la beta-glucuronidasa para detectar la presencia de E. coli en alimentos.


Esta prueba se basa en que la mayoría de las cepas de E. coli patógenas poseen una actividad de beta-glucuronidasa la cual en presencia de un beta-glucuronido es capas de hidrolizarlo y el resultado puedeobservarse en 24 horas. El sustrato utilizado para esta prueba es el 4-metilumbliferil-beta-glucuronido (MUG),cuando este compuesto es hidrolizado por la enzima se obtiene como uno de los subproductos la 4-metilumbiliferona, este compuesto es detectable por su fluorescencia cuando se observa con luz ultravioleta deuna longitud de onda de 356nm.

ADVERTENCIA: Lo más conveniente es utilizar una lámpara manual de 6 watts de potencia; cuando se usa Unfuente de mayor potencia el personal deberá utilizar anteojos protectores. Es conveniente una vez preparado el




51

medio con este sustrato revisar los tubos para determinar que no hay una fluorescencia previa y esto nos de unresultado felso positivo.

4.6.2 Prueba presuntiva

1.- Se preparan los tubos con caldo LST-MUG.2.- Preparar la muestra del alimento haciendo las 3 disoluciones de acuerdo a la técnica de MNP.3.- Inocular la serie de los 9 tubos.4.- Incubar los tubos 24+2 horas a 35°C.5.- En un espacio oscuro utilizando la lámpara de luz UV se observa la fluorescencia presentada en los tubos enque hubo desarrollo de E. coli

En este periodo de incubación se puede tener una confiabilidad de un 83-95% de pruebas positivas, aumentandoel tiempo de incubación a 48 horas se tiene una confiabilidad del 96-100%.

4.6.3 Prueba confirmativa.

1.- Tomar con una asa una muestra de cada uno de los tubos positivos resultantes de la prueba presuntiva, yresembrarlos en agar EMB .2.- Incubar las placas durante 24 horas a 35°C.3.- Observar si hubo desarrollo de colonias características de E. coli y realizar las pruebas IMVIC (pg. 42) paradeterminar su biotipo.

4.6.4 Interpretación.

Todos los cultivos que muestren fluorescencia, fermentan la lactosa con producción de gas en 48 horas a 35°C yden los patrones del biotipo 1 (++--) ó biotipo 2 (-+--) se consideran como E. coli . Se calculan también el NMPde acuerdo a la utilizada anteriormente (pg. 47).




52




53

4.7 Especificación APLICADA de coliformes en alimento

Alimentos Coliformes totales UFC/g o mL. Coliformes fecales NMP/g o mL.

Agua potable <100 No detectable NMP/100mL.

Mantequilla 100

Leche pasteurizada 10 en planta20 en el mercado

Crema 100

queso fresco 100

Quesos madurados 50

Quesos procesados 10

Pescados frescos-refrigerados ycongelados

400

Mermeladas, purés, ates y jaleas. <10

Productos carnicol maduros,cocidos, crudos

50

Huevo fresco-refrigerado 10

Huevo liquido refrigerado ocongelado

10

Huevo, yema y clara congelado 10

Huevo, yema y clara deshidratados 10

Huevo, yema y clara pasteurizados

y envasados asépticamente

100

Harina de: maíz, centeno, cedabaavena y de arroz

100

Fuente: diario oficial de la federación mexicana NOM-112-SSA1-94

Observaciones y dibujos:




54

Cuestionario

1.- Escriba los géneros del grupo Coliforme.2.- ¿Qué actividad enzimatica del grupo Coliforme se manifiesta en las pruebas presuntivas y confirmativa ¿3.- ¿Cual es la actividad enzimatica que diferencia a E. coli de las demás Coliformes?4.- Defina de los términos.

a) Coliformes totales. b) Coliformes fecales.

Bibliografía

-Borrad R.G. 1989. Introducción a la microbiología moderna de los alimentos. Edit. Acribia. España.

-Carl, Vanderzant, Phd,.Don F.Splittstoesser, Phd. 1992. Compendium of methods for the microbiological

examination of foods. 3th edition.

-David, A. Power., and Peggy, J. McCuen. 1988. Products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.United States of America.

-Diario Oficial de la Federación Mexicana. NOM-112-SSA1-1994.




55

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYAPracticas de Microbiología Sanitaria

Nombre: fecha:

V.- Practica No. 4

“Determinación de la presencia de Staphylococcus aureus”

5.0 Introducción

El género Staphylococcus está ampliamente distribuido en la naturaleza y forman parte algunas de sus especiesde la flora normal de la piel y mucosa del hombre y los animales. Staphylococcus aureus es la especie que conmás frecuencia ha sido relacionada con las intoxicaciones alimenticias debido a la producción de enterotoxinas.

En general los cocos gram positivos son relativamente resistentes a bajas actividades de agua, tolerantes a ladeshidratación y a concentraciones de hasta 6-7.5 % de NaCl.

Staphylococcus aureus a diferencia de otras especies de Staphylococcus produce un pigmento por lo cual se le haconocido comúnmente también como Staphylococcus “dorado” , la presencia de este pigmento de naturalezacarotenoide le permite cierta resistencia a la destrucción por parte de los elementos fagocitarios presentes en elhombre y animales.Desde el punto de vista de Microbiología Sanitaria, Staphylococcus aureus es vulnerable a su destrucción portratamientos térmicos y a los agentes sanitizantes, por lo tanto su presencia en una planta procesadora dealimentos nos indica que se están aplicando de una manera deficiente los sistemas de sanitizacion ó bien unamanipulación por personal con pobres prácticas de higiene.Este método es apropiado para el análisis de alimentos en los cuales se encuentran más de 100 bacterias deStaphylococcus aureus / g.

5.1 Material.

Frascos de dilución con 90 mL. de solucióndiluyente estéril.Tubos con tapón de baquelita estériles de 15x100.Cajas de Petri estériles.Espátula estéril.Balanza.

Autoclave.Un contador de colonias.Incubadora a 35°C.Varilla de vidrio doblada para sembrado ensuperficie.

5.2 Medios de cultivo y reactivos.

Agar Baird- Parker.Agar triptosa de soya ( TSA ).Agar de azul de toluidina-DNA.

Aceite de parafina estéril.Caldo infusión cerebro de corazón ( BHI ).Peróxido de hidrogeno al 30%.

5.3 Aislamiento y conteo.

1.- Para cada dilución en placa:

1.- Asépticamente transferir 1.0 mL. de muestra para 3 placas de agar Baird-Parker, distribuyendo 1.0 mL. deinoculo equivalente para 3 placas (0.4 mL., 0.3 mL. y 0.3 mL.).2.- Extender él inoculo sobre la superficie del agar baird-parker, usando una varilla de vidrio estéril ( figura 12 ).3.- Mantener las placas en posición vertical hasta que él inoculo es absorbido por el agar ( alrededor de 10minutos propiamente ).4.- Si él inoculo no es realmente absorbido; colocar las placas verticalmente en la incubadora alrededor de 1 hora.




56

5.- Invertir las placas e incubarlas de 45-48 horas a 35°C.6.- Seleccionar las placas que contengan de 20-200 colonias.

Las colonias de Staphylococcus aureus son circulares, planas, convexas, húmedas, de 2-3 mm de diámetro, degrises a negro rodeadas por una zona clara. Las colonias tienen consistencia pegajosa y grasosa.Cepas aisladas de alimentos congelados ó deshidratados que son almacenados por extensos periodos,frecuentemente desarrollan una coloración menos negra, con apariencia ápera y textura seca.

2.- Conteo de colonias:

Si varios tipos de colonias parecen ser S. aureus, contar el número de colonias de cada tipo. Cuente las placas de baja dilución, que contenga < 20 colonias. Si la placa contiene > 200 colonias típicas de S. aureus, y las placas dedilución más altas no contienen colonias típicas, use estas placas para enumerar S. aureus. Seleccione más de unacolonia de cada tipo y haga la prueba de la coagulasa. Sume el número de colonias en las tres placas que den

positivo la prueba de cuagulasa, y multiplique la muestra por el factor de la dilución. Reportar este número comonúmero de Staphylococcus aureus/g. de producto muestreado.

5.3 Prueba de coagulasa

1.- Transferir colonias sospechosas de S. aureus en un tubo pequeño conteniendo 0.2-0.3 mL. de caldo infusióncerebro de corazón ( BHI )y emulsionar cuidadosamente.2.- De esta suspensión inocular tubos con agar triptosa de soya inclinados.3.- Adicionar 0.5 mL. de plasma de conejo en los tubos con BHI, mezclar cuidadosamente.4.- Incubar la suspensión en BHI y los tubos con TSA de 18-24 horas a 35°C.5.- Observar periódicamente durante 6 horas se hay formación de coágulos. Un coagulo que permanezca estableen el tubo cuando este se inclina, es considerado positivo para S. aureus ( figura 13 ).

5.5 Prueba de la catalasa

1.- Adicionar 1.0 mL. de peróxido de hidrogeno al 30% sobre un cultivo en agar inclinado ( TSA ).2.- La producción de burbujas de gas se interpreta como una prueba positiva.

Alternativamente se puede emulsificar una colonia con una gota de peróxido de hidrogeno al 30% sobre un

portaobjetos (figura 14 ).

5.6 Utilización anaerobia de glucosa

1.- Inocular un tubo conteniendo medio con glucosa como fuente de carbono (0.5%).2.- si es medio sólido inocular hasta el fondo del tubo.3.- Cubrir la superficie de agar con una capa de aceite de parafina estéril de por lo menos 25 mm de espesor; eincubar 5 días a 37°C.

La producción de ácido anaerobicamente se ve por un cambio de color amarillo en el agar, indicando la presencia de S. aureus (figura 15).

5.7 Utilización anaerobia de manitol

Repetir el paso 2 usando manitol como fuente de carbono en el medio. S. aureus generalmente de una reacción positiva, aunque en ocasiones pueden presentarse variedades que dan la prueba negativa.

5.8 Producción de nucleasa termoestable

Esta prueba pretende ser específica como la prueba de coagulasa pero menos subjetiva porque involucra uncambio de color azul a rosa brillante. Esta no es un sustituto para la prueba de coagulasa, más bien es como una

prueba de apoyo para la reacción de coagulasa.




57

1.- Prepare en un portaobjetos extendiendo 3 mL. de agar azul de tolouidina-DNA en la superficie.2.- Cuando el agar ha solidificado, perfore el agar haciendo “pozos “de 2mm de diámetro (10-12 por placa).3.- Adicionar alrededor de 0.01 mL. de los cultivos crecidos en el caldo BHI (calentados 15 minutos en un bañode agua hirviendo).4.- Incubar la placa en una cámara por 4 horas a 35°C.

El desarrollo de un halo rosa brillante extendido por lo menos 1.0mm de periferia indica una reacción positiva.

5.9 Algunas características bioquímicas típicas de 2 especies de Staphylococcus y Micrococcus sonmostrados en la tabla 16.

Características S. aureu S. epidermidis S. micrococcii

Actividad de la catalasa + + +

Produccion de coagulasa + - -

Produccion de nucieasa termoestable + - -

Utilizacion anaerobia de glucosa + + -

Utilizacion anaerobia de manitol + - -

Fuente : FDA bacteriological analytical manual 7th edition/ 1992

5.10 Normas APLICADAs para Staphylococcus aureus.

Alimentos Limite maximo permisible UFC/mL. o g

Productos carnicol maduros, crudos, cocinados <100

Productos carnicol curados, emulsionados (salchichas,mortadelas etc.)

100 en al palnta y/0 frontera1000 en venta

Pescados frescos-refrigerados y congelados 1000

Leche pasteurizada en 25mL. Ausente

Queso fresco 1000

Quesos madurados 100

Quesos procesados <100

Huevo fresco-refrigerado <100

Huevo liquido refrigerado o congelado <100

Huevo, yema y clara congelados <100

Huevo, yema y clara deshidratados <100

Huevo, yema y clara pasteurizadas y envasadas

asépticamente.

<100

Fuente: diario oficial de la federación mexicana. NOM-115-SSA1-94




58

Observaciones y conclusiones:

Cuestionario

1.- ¿Que características de Staphylococcus aureus hace que este microorganismo se considere comoenteropatógeno?2.- ¿Cuál es la enzima involucrada en la actividad sobre el H2O2 ¿3.- ¿Qué función tiene el telurito de potasio adicionado al agar Bair- Parker ¿4.- ¿Cuál es la principal fuente de contaminación por S. aureus en una planta de productos lácteos ¿

Bibliografía

-Board R.G. 1989. Introducción a la microbiología moderna de los alimentos. Edit Acrabia. España.

-Carl, Vanderzant, Phd,. Don F. Splittstoesser, Phd. 1992. Compendium of methods for the mocrobiologicalexamination of toods. 3th edition.

-David, A. Power, and. Peggy, J. McCuen. 1988. Products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.United States of America.

-Diario Oficial de la Federación Mexicana. NOM-115.SSA1-94.

http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.scielo.org.co/img/revistas/bio/v27n1/1a03i1.jpg&imgrefurl=http://www.scielo.org.co/scielo.php%3Fscript%3Dsci_arttext%26pid%3DS0120-41572007000100003%26lng%3Des%26nrm%3Diso%26tlng%3Des&h=403&w=507&sz=64&hl=es&start=8&usg=__d0fcWEMsAkPcCzm2-0nOOSBCXBA=&tbnid=XCIeOp7nlbRISM:&tbnh=104&tbnw=131&prev=/images%3Fq%3Dcatalasa%26gbv%3D2%26hl%3Des




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NOMBRE FECHA

VI.- Practica N° 5“determinación de mohos y levaduras”

6.0 introducción.

Los hongos de interés en la industria alimenticia son aquellos que están involucrados tanto en el deterioro de losalimentos como en la producción de mico toxinas dañinas para la salud humana. Se desarrollo vegetativo mascomún en una forma levaduriforme a las que se les conoce con el nombre de levaduras o bien formadoestructuras ramificadas o micelios conociéndose como mohos. Estos microorganismos quimiorganotrofos tienenla característica de reproducirse en forma mas lenta que las bacterias, es necesario acondicionar el medio decultivo para inhibir inicialmente el crecimiento de estas y propiciar el crecimiento de los hongos.

6.1 Material

Cajas de Petri estériles.Frascos con 90 mL. de solución diluyente estéril.Pipetas de 10 y 1.0 mL. estériles

Contador de coloniasMicroscopio.

6.2 Medios de cultivo y reactivos.Agar papa y dextrosaÁcido tartárico al 10% estéril.

6.3 procedimiento.

1.- preparar y diluir la muestra2.- añadir el ácido tartarico estéril al medio de cultivo (por cada litro de medio adicionar 14mL. de ácido)3.- colocar 1.0 mL. de muestra diluida en una caja Petri, y adicionar 25 mL. de agar

4.- incubar las placas invertidas de 3-5 días a 22-25°C5.- contar el número total de mohos o levaduras y multiplicar por el factor de dilución.6.- se reporta numero de colonias/ g o mL. de alimento.

6.4 Especificación APLICADA de mohos y levaduras en alimentos.

alimentos Limite máximo permisible mohos ylevaduras UFC/g o mL.

Queso fresco 500

Quesos maduros 500Quesos procesados 100

Salchichas, pasteles mortadelas, salchichones, pates, etc. <10

Mermeladas, purés, jaleas y ates <10

Jugos y néctares pasteurizados 25

Harina de trigo 300




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Harina de maíz 1000

Harina de maíz nixtamalizada 1000

Harina de centeno 200

Harina de avena 100Harina de cednada 200

Harinas integrales 500

Harina de arroz 200

Pan blanco, pan de narinas integrales y productos de bollería,galletas.

20

Pan dulce 50

Pasteles, pays, panques, galletas con relleno. 50

Fuente: diario oficial de la federación mexicana. NOM-11-SSA1-94

Dibujos y observaciones:

Cuestionario.

1.-¿Cuál es la función del ácido tartarico al 10%, cuando se adiciona al agar de papa y dextrosa?

2.- ¿Cuál es la principal fuente de contaminación por mohos y levaduras en al producción de pasteles?

3.- En la sanitizacion de pisos y paredes se deben considerar los mohos y las levaduras? ¿Por qué?

Bibliografía.

-carl, vanderzant, phd,. Don F splittstoesser, phd. 1992. compendium of methods for the microbiologicalexamination of foods. 3th edition.

-david, A. Power., and peggy, j. Mccuen. 1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6 th edition.United states on america.

-diario oficial de la federación mexicana. NOM-111-SSA1-94

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PRACTICAS DE MICRO BIOLOGIO APLICADA

NOMBRE FECHA

VII.- Practica N°6“Determinación de microorganismos proteoliticos y lipoliticos”

7.1 Determinación de la presencia de microorganismos proteoliticos.


Los microorganismos proteoliticos son aquellos que son capaces de utilizar las proteínas como una fuente denitrógeno y carbono, debido a que sintetizan enzimas que van a hidrolizar los enlaces peptodicos presente. Los

productos finales de esta hidrólisis van hacer los aminoácidos, los cuales van hacer aprovechados como tales para la biosíntesis de sus proteínas o bien pueden ser desaminados para obtener los esqueletos de carbononecesarios para la biosíntesis de otros compuestos como los lípidos y carbohidratos.

El estudio de las bacterias proteoliticas en los alimentos es importante debido a la degradación que puedan sufrirestos (carnes rojas, pollos y pescado) bajando la calidad nutricional y organoléptica de los alimentos.

Los organismos proteoliticos constituyen un grupo muy heterogéneo, en el cual se pueden encontrar bacterias delos géneros: clostridium, bacillus, proteus, pseudomonas, como proteoliticos activos. LOSMICROORGANISMOS que efectúan hidrólisis de proteínas y fermentación se les conoce como ácido-

proteoliticos, por ejemplo: streptococcus faecalis, var licuefaciens y micrococcus casseolvticus.En los hongos encontramos proteoliticos activos entre ellos aspergillus, penicilium, mucor etc., que en algunoscasos se utilizan por su capacidad de formar proteasas en al industria.

7.1.2 material.

Pipetas estériles de 1.0 mL.

Homogenizador de alimentos estérilesFrasco con 90mL. de diluyente estérilEspátula estérilCajas de Petri estériles

Contador de colonias Québec

Varilla de vidrio estérilIncubadora a 32+ 1°C

7.1.3 medios de cultivo y reactivos.

Agar cuenta estándar adicionada de leche descremada en polvo (después de esterilizar). Colocar 1g de leche en polvo por cada 100mL. de medio solución de cloruro mercúrico.

7.1.1 procedimiento para detectar microorganismos proteoliticos

1.-PESAR 10G DE LA MUESTRA.2.- efectuar las siguientes diluciones decimales 10 -1,10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6

3.- inocular 0.1 mL. de cada dilución por duplicado en cajas de Petri conteniendo agar cuenta estándar adicionadode leche descremada en polvo.4.- sembrar por extensión en superficie utilizando varilla de vidrio.5.- incubar una serie de placas en refrigeración a 4-8°C por 10 días y la otra serie a 30°C por 24-72 hrs.6.- incubar las placas durante 1 min. de la solución de cloruro de mercurio y escurrir.7.- contar las colonias típicas con halo transparente que corresponde a los microorganismosProteoliticos.8.- multiplicar el recuento obtenido por 10 y por la inversa de la dilución correspondiente. Reportar como

proteoliticos psicrotroficos en el primer caso y de mesofilicos en el segundo caso por g 0 mL. demuestra.




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7.2 Determinación de la presencia de microorganismos lipoliticos.

7.2.1 Introducción.

Los alimentos que son ricos en grasas, están sujetos a un deterioro cuando estas sufren una alteración. Loscambios mas comunes son la oxidación química y enzimatica de los ácidos grasos que están presentes, lo cualviene a dar como resultado el llamado “enranciamiento” del alimento, con sus consecuencias de cambiosorganolépticos ya conocidos.

La degradación microbiana de las grasas la realizan una serie de microorganismos tanto bacterias como mohos ylevaduras, entre las que se encuentran especies de: pseudomonas, achromobacter, staphylococcus, rhizopus,geotrichum, aspergillus, penicillium, cándida, Rhodotorula y Hansenula entre otros. Estos géneros son capacesde biosintetizar una serie de enzimas lipoliticas o lipasas, causantes de la degradación de las grasas.

Una de las características comunes de estas enzimas lipoliticas es su estabilidad a temperatura de refrigeración, por lo que son las causales junto con ezimas proteoliticas de los microorganismos del deterioro de los alimentosalmacenados en refrigeración.

7.2.2 material.

Pipetas estériles de10.0 mL. y 1.0 mL.Homogenizador de alimentos estéril.Frasco con 90 mL. de diluyente estéril.Espátula estéril.

Cajas de Petri estérilesContador de coloniasVarilla de vidrio estéril.Incubadora a 30°C

7.2.3 medios de cultivo y reactivos

Medio baseTampón fosfatoSulfato de cobre a 0.2%

Solución amortiguadora.Mantequilla

7.2.4 procedimiento para microorganismos lipoliticos.(Método del sulfato de cobre)

1.- pesar 10g de muestra proveniente de un alimento que contenga grasa en abundancia, por ejemplo aderezo,mayonesa, mantequilla.2.- adicionar 90mL. de diluyente estéril.3.- licuar aproximadamente durante 30s a alta velocidad.4.- efectuar las diluciones siguientes: 10 -1,10-2, 10-3, 10-4 y 10-5 5.- mezclar a partes iguales el medio base y el tampón fosfato. Añadir 20g de mantequilla agitando fuertemente; ydistribuir la mezcla en cajas de Petri colocadas sobre un bloque de hielo.6.- sembrar 0.1mL. de las distintas diluciones por extensión en superficie.7.- incubar durante 3 días a 30°C8.- recubrir el medio con una solución saturada de sulfato de cobre.(20g de SO

4 CU 5 H

2O por litro de agua). Dejar 15min, retirar esta solución, y comprobar si en el agar han

aparecido o no manchas azules que son los precipitados de las sales de cobre de los asidos grasos libres formadosen la lipólisis microbiana.9.- contar las colonias con halo azul y multiplicar el recuento obtenido por 10 y por la inversa de la dilucióncorrespondiente.10.- reportar el numero de UFC lipoliticas por gramo de alimento.


Cuestionario.




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1.-¿Cuál es la actividad de enzimática detectada en las bacterias lipoliticas?2.- ¿Qué otros sustratos aparte de la mantequilla pueden utilizarse para al identificación de las bacterias lipoliticas?3.- ¿Qué tipo de alimentos son más susceptibles al ataque de las bacterias lipoliticas?4.- ¿escriba el género y especie de cuatro bacterias proteoliticas?

Biografía.- Eduardo Fernández escartin. Agua y alimentos. Microbiología Sanitaria. Vol1.- peclar M.J. JR., reid R.D. y chan E.C.S. 1996. Microbiología. Edit. Mc graw Hill.

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NOMBRE FECHA

VIII.- Practicas N°7“Determinación de Salmonella sp”

8.0 introducción.

El genero Salmonella pertenece a la familia etobacteriaceae. Es un bacilo Gram. negativo. Anaerobio facultativo,la mayoría de las especies son móviles mediante flagelos peritricos. Es un microorganismos quimiorganotroficoque puede llevar un metabolismo respiratorio y fermentativo, es oxidasa negativo y catalasa positivo, puedecrecer con citrato como fuente de carbono, descarboxila la alisina y la ornitina, no hidroliza la urea ygeneralmente produce ácido sulfhídrico. Produce ácido y gas a partir de glucosa en agar fierro triple azúcar (TSI),xilosa lisina desoxicolato (XLD), SALMONELLA-SHIGELLA (SS), hektoen y aquellos en los que tengan verde

brillante.En los últimos años se ha detectado una gran variedad y genética en Salmonella lo que ha hecho que estemicroorganismo se este adaptando a condiciones extremas del medio ambiente así sepas mutantes pueden crecer

en rangos de temperaturas de 4°C hasta 50°C y a PH de 4.5 A 9.5.

Las infecciones por especies de salmonera, producen en el humano las enfermedades conocidas como fiebretifoidea y paratifoidea. La presencia de estos microorganismos en los alimentos se debe a la contaminación deestos cuando son manipulados por personas con malos hábitos higiénicos. La contaminación puede ser directa oindirecta por medio del polvo y utensilios contaminados previamente. Su distribución en los alimentos es ampliaya que se han reportado en productos lácteos, derivados de carne, alimentos a base de huevo, hortalizas crudas ycosidas y bebidas preparadas.

8.1 material.Cajas de Petri estériles.Matraces erelenmeyer 500mL.Frascos de dilución con 90mL. de líquido de

solución estéril.BalazaEspátula estéril.

Tubos con tapón de baquelita estéril 15x100Papel aluminio estéril (15x15 cm.) o contenedor

estéril para pesar la muestra.Incubadora a 35°CPipetas de 10.0 y 1.0mL.

8.2 medios e cultivo y reactivos.Agar sulfito de bismuto (BS)Agar xilosa lisina desoxilato (XLD)Agar triple azúcar (TSI)Agar lisina hierro (LIA)Caldo tetrationato.Caldo selenito sextinaCaldo soya tripticasa.

Caldo lactosado (CL)Solución de yodo-yoduroReactivo de kovac.Solución rojo de metilo.

NaOH 1N o HCl 1NK 2SO3 Tergitol 7 o triton x -100

8.3 preparación de las muestras.

a)

huevo en polvo, leche y harinas preparadas, harinas de soya y caseína:

1.- pesar asépticamente 25gr de muestra y adicionarla aun recipiente de 500mL. conteniendo 225mL. de caldolactosado esteril.2.- mezclar bien y dejar reposar por 60min a temperatura ambiente.3.- ajustar el PH a6.8 con NaOH 1N o HCl 1N esteriles. Incubar a 35°C durante 24hrs




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b) leche en polvo:

1.- preparar en un recipiente de 500mL., 225mL. de una solucion acuosa de verde brillante (2mL. de una solucional 1% de verde brillante en 1lt de agua destilada esteril)2.- adicionar 25g de lamuestra. Incubar 24hrs a 25°C

c) pimienta blanca y negra, chile en polvo, ajonjolí, páprika, vegetales deshidratados:

1.- pesar asépticamente 25g d emuestra y depositarlos en 225mL. de caldo soya triplicasa esteril.2.- mezclar perfectamente y ajustra el PH 6.83.- incubar a 35°C durante 24hrs.

d) ajo y cebolla deshidratados.

1.- pesar asépticamente 25g de muestra y mezclarla con 225mL. de caldo soya tripticasa conteniendo 0.5%K 2SO3 2.- incubar a 35°C durante 24hrs.

e)

carnes y derivados:

1.- pesar asépticamente 25g de muestra y homogeneizarla con 225mL. de caldo lactosado estéril.2.- ajustar el PH a 6.83.- adicionar 2.25mL. de tergitol 7 aniomico o triton x-100 esterilizados con vapor.4.- incubar 24horas a 35°C

8.3.1 aislamiento

1.- después de la incubación anterior transferir 1mL. a un tubo con tapón conteniendo 10mL. de caldo selenitocistina y otro mL. a 10mL. de caldo tretationato2.- incubar los tubos 24hrs a 35°C3.- mezclar y resembrar del caldo tretrationato en placas de agar sulfito de bismuto (BS), agar xilosa desoxilato

(XLD). Repetir el mismo resembrado con la muestra del tubo con caldo selenito cistina.4.- incubar en placas 24hrs a 35°C (ver diagrama)

8.3.2 interpretación: las colonias típicas o sospechosas de ser Salmonella son de un color gris oscuro o negras enagar sulfito bismuto, puede también presentar un brillo metálico.En el agar XLD las colonias de Salmonella se presentan de un color rosa-rojo con o son centro negro (figura 17)

8.3.2 confirmación bioquímica.




67

a) resembrar 2-4 colonias típicas de las placas de BS y XLD en tubos con agar triple azúcar (TSI) y agar dehierro (LIA) inoculando la superficie y el fondo del tubo.

b) Incubar los tubos con TSI 254hrs a 35°C y los LIA a 35°C durante 48hrs.c) Interpretación: característicamente salmonellla forma un medio alcalino en la superficie (rojo) y ácido

en el fondo del tubo (amarillo) en TSI con o sin producción de H2S (figura 18)




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Añadir 1mL. de inoculo

.

10mL. 10mL.

Caldo selenito caldo tetrationato

8.4 Diferenciación de las colonias de Salmonella sp.

1.- agar verde brillante: este medio contiene lactosa y sacarosa, un indicador el rojo de fenol, el inhibidor es elverde brillante. Los microorganismos lactosa negativos como Salmonella y ocasionalmente proteus, formancolonias de color rosa pálido transparente y rodeadas de un halo rojo brillante. Las bacterias fermentadoras de lalactosa, producen colonias verde amarillentas, opacas y rodeadas de un halo amarillento.

2.- agar sulfito y bismuto: este medio contiene sulfito de bismuto como agente selectivo. La mayoría de lascepas de sallmonella son capaces de reducir sulfato y el sulfito a sulfuro, produciendo colonias negras con un

brillo metálico, rodeadas de un halo café, que posteriormente se torna negro. En ocasiones las colonias pueden serde color café o pardo.

3.- agar para Salmonella y shigelia (S.S): las colonias son traslucidas transparentes u opacas algunas veces concentro negro.

4.- agar de Mc conkey: las colonias son transparentes e incoloras o ambas.

5.- agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD): las colonias de Salmonella son rojas transparentes y bordes amarilloscon centro negro si producen H2S, sin centro negro si no son productoras de H2S.


Cuestionario1.- ¿Por qué se debe hacer un enriquecimiento previo al aislamiento e identificación de Salmonella sp?2.- ¿Cuál seria un foco de contaminación por Salmonella sp en una planta deshidratadora de productos vegetales?3.- ¿Cuál es la cantidad máxima de Salmonella sp. Permitida en un alimento?4.- ¿Por qué no se debe esterilizar en autoclave el caldo tetrationato?

XLDBS

TSIIncubar a 35°C x 24hrs.

LIAIncubar a 35°C x 48hrs

Incubar a 35°C x 24hrs




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Bibliografía

- david, A. powen, and pegy, J. M. 1998. products and laboratory procededures. Manual of BBL. 6 th edition. United states of america.

- Forrest, J. Etal, 1978. “fundamentos de ciencia de la carne”. Ed acribia, Zaragoza, España. - James, T. Peeler., and larry, J. Maturin. 1992. Aerobic Plate count. FDA, bacteriologica analitical

manual. 7th edition.- Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de México, S.A de C.V- Forrest, J. Etal, 1978. “fundamentos de ciencia de la carne”. Ed. Acribia, Zaragoza, España.

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NOMBRE FECHA

IX.- Practica N°8“Determinación de la presencia de vibrio cholerae”

9.0 Introducción.

El genero vibrio son bacilos Gram. Negativas que miden de 0.5 micras a 0.8 micrasDe diámetro por 1.4-2.6 micras de largo, las formas involucionadas usualmente se presentan en cultivos viejos( en fase estacionarias) o bajo condiciones adversas de cultivo, no forman endoesporas, ni micro quistes, enmedio liquido son móviles por flagelos polares, son anaerobias facultativos, poseen ambos metabolismos,respiratorio y fermentativo, no fijan ni desnitrifican el nitrógeno, todos son quimiorganotrofos, muchos soncapaces de crecer en medio mineral contenido D-glucosa y NH4Cl, solo unas cuantas capas necesitan factoresorgánicos de crecimiento. Los iones sodio estimulan el crecimiento de todas las especies y son un requerimiento

para la mayoría, la mínima concentración necesaria para un óptimo crecimiento es del orden de 5-700 mM;

muchas especies crecen bien en medio contenido una base de agua de mar.Fermentan la D-glucosa dando como resultado producción de ácido pero no de gas. Todos utilizan D-glucosa,D_fluctuosa, maltosa y gliserol. La mayoris de las especies son oxidasa positiva y todas crecen a 20°C y muchasa 30°C

El cólera es una infección intestinal aguda, grave que se caracteriza por al aparición brusca de diarrea acuosa yabundante vómitos, deshidratación rápida, acidosis, colapso circulatorio y el los casos no tratados se produce lamuestre dentro de las 24hrs de su aparición. Hoy se sabe que la infección también puede ser asintomático o solo

provoca una leve asintomatologia. La letalidad en los casos graves no tratados puede exceder el 50%, pero si seaplica l debido tratamiento, se reducen a menos del 1%

9.1 material.

Homogenizador de alimentos estériles.Balanza.Frasco de dilución con 90mL. de solución diligenteestéril.

Cuchillo estéril.Caja de Petri estéril.

9.2 medios de cultivo y reactivos.

Agua peptonada alcalina.Agar de tío sulfató citrato bilis sacarosa (TCBS)

9.3 procedimiento.

1.- las muestras de alimentos sospechosos se recolectan al azar y se trituran en agua paptonada alcalina en proporción de 1:10 utilizando un homogeneizador de alimentos estériles. También se pueden pesar 50grv delalimento que se desmenuza finamente con un cuchillo estéril en 500mL. de agua peptonada alcalina.2.- se recomienda el método de doble enriquecimiento en agua peptonada alcalina PH 9.0; con 1% de NaCl conresiembra a medio TCBS después de 6 horas de incubación a 37°C3.-después de homogeneizar la muestra en el agua peptonada se incuba durante 6-8hrs. A 37°C para despuéssembrar por estría el medio selectivo de agar TCBS.4.- incubar las placas a 37°C durante 18-24 hrs. Las colonias son planas de 2-3mm de diámetro y de coloramarillas.




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9.1 pruebas diferenciales de vibrio.

Prueba V. cholerae V. parahemolyticus Vibrio no cholereaFermentación de glucosa +, no gas +, no gas +, no gasFermentación de sacarosa +, (raro-) -, (raro-) +, (raro -)Rojo de metilo 37°C +, (raro-) + (requiere NaCl) -, (raro -)TSI: superficie A, (raro r) R R o ATSI: fondo A A ATSI: H2S - - -Crecimiento a 43°C - + -Caldo nutritivo sin NaCl Crece no crece creceCaldo nutritivo con 10% NaCl No crece crece no crece

+: Positivo -: negativo A: ácido R: alcalino


Cuestionario.1.- ¿Cuáles son los habitantes naturales de Vibrio cholerae?2.- ¿Qué característica le da la propiedad de ser toxico a Vibrio cholerae?3.- ¿Qué función tiene la incubación en agua peptonada alcalina previa a el aislamiento de Vibrio cholerae?Bibliografía

- Carl, vanderzant, phd,. Don F. splittstoesser, phd. 1992. compedium of methods for the microbiologicalexamination of foods. 3th edition.

- Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de México, S.A de C.V




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INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYA PRACTICAS DE MICRO BIOLOGIO APLICADA

NOMBRE FECHA

X.- Practica N°9“Determinación de la presencia de Listeria monocytogenes”

10.0 Introducción.

El genero Listeria lo constituyen bacilos cortos Gram., positivos, móviles, no formadores de esporas, anaerobiosfacultativos, catalasa positivos. Existen especies patógenas y no patógenas para el hombre, la mas importantedesde el punto de vista de salud publica y relacionada con infecciones por alimentos contaminados es Listeria monocytogenes. las incidencias de listeriosis han ocurrido principalmente en el verano. Existen portadores sanosque son individuos que están en contacto rutinario con animales en la granja o en rastros de sacrificios. Engeneral se ha observado que los vegetales, principalmente hortalizas que son regadas con aguas negras presentanuna alta incidencia de especies de Listeria. Entre los alimentos procesados se han reportado los quesos fabricadoscon leche no pasteurizada. La diferencinciación bioquímica de las diferentes especies de Listeria se muestra en la

tabla 19.

especies (beta) reducción manitol ramnosa xilosa virulenciahemoliticos de (ratón)

nitrato Listeria

monocytogenes

+ - - + - +

L. ivanovil + - - - + + L. innocua - - - variable - - L. welshimeri - - - variable + - L. seeligeri + - - - + - L. grayli - - + - - - L. murrayi - + + variable - -

Fuente: FDA bacteriological analytical manual 7th edition/1992

10.1 Material

Matraz erlenmeyer de 500mL.Pipetas de 1.0 y 5.0 mL. estérilesCajas de Petri estériles.Contenedor estéril para pesado de muestraBalanzaLámpara de luz blanca

TripleEspejoAutoclaveHomogenizador de alimentos.EspátulaIncubadora calibrada a 30 y 35°C

10.2 Medios de cultivo y reactivos.

Ácido sulfanilicoAgar Oxford (OXA)Agar cloruro de litio-feniletil-moxalactama (LPM)Agar soya tripticasa con 0.6% de extracto delevadura (ASTEL)Caldo carbohidratado.

Caldo de enriquecimiento para Listeria (CEL)EsculinaSolución bufferSolución salina estéril al 0.85%

N-(1-naftil) etilendiamina

10.3 Procedimiento para determinación de Listeria monocytogenes.




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1.- adicionar 25g o mL. de la muestra a un matraz erlenmeyer de 500 mL. conteniendo 225mL. de caldo deenriquecimiento (CEL) estéril. Agitar fuertemente para homogeneizar la mezcla, e incubar durante 2 días a 30°C.2.- a partir del matraz con caldo de enriquecimiento, resembrar a las 24 y 48 hrs en placas con agar Oxfordm(OXA) y agar cloruro de litio-feniletil-moxalactama (LPM). Incubar las placas a temperatura de 30 a 35°Cdurante 24-48 hrs respectivamente.3.- después del tiempo de incubación, se observan las placas dé agar LPM, habiendo incidir un haz de luz blancacon un Angulo de incidencia de 45° de acuerdo a la figura 20. De esta forma, las colonias de Listeria presentanun color blanco azulado brillante, dando la impresión de un cristal estrellado.4.- cuando no es posible utilizar el dispositivo de luz para la observación de las colonias de acuerdo a la figura 20,al medio de agar LPM s ele puede adicionar 1.0g de esculina y 0.5g de citrato ferrico de amonio.5.- las colonias características que Listeria forma tanto en agar OXA y LPM con sales de fierro y esculina, sonde un color negro, presentando también un halo oscuro.




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Observar perpendicularmenteAl plano de la caja

Fuente de luz blanca

Figura 20: observación de las placas por iluminación indirecta de colonias de Listeria.10.4 Confirmación de la presencia de Listeria.

1.- de las colonias aisladas en las placas de OXA y LPM, resembrar al menos 5 de cada una de ellas a placas conagar soya tipticasa con 0.6% de extracto de levadura (ASTEL).2.- incubar las placas de ASTEL a 30°C por 24-48hrs.3.- utilizando el dispositivo de la figura 9, las colonias típicas de Listeria se observan de un color azul o azul-

grisaseo.4.- hacer frotis de varias colonias y teñirlas con el medio de gram para confirmar que son bacilos cortos gram positivos.5.- realizar la prueba de catalasa, para confirmar su positividad.6.- resembrar en placas de agar-sangre. Las colonias formadas por las especies de Listeria monocytogenes y L.ivanovil presentan una zona de hemolisis.7.- las especies patógenas para el hombre no reducen los nitratos. para confirmar esto, se incuban tubos con 3-5mL. de caldo nitrato, incubándose a 35°C durante 5 días. Depuse de este tiempo se adiciona 0.2mL. del reactivode ácido sulfanilico y 0.2mL. de reactivo de N-(1-naftil) etilendiamina. El desarrollo de un color rojo nos indicauna prueba positiva.8.- pueden también realizarse pruebas de fermentación, inoculando tubos con 3-5mL. de caldo para fermentaciónconteniendo 0.5% de cada una de los carbohidratos probados. La producción de ácido se interpreta como una

prueba positiva.Comparar los resultados en al tabla 19, para identificar la especie presente.

Dibujos y observaciones

Cuestionario1.- ¿Cuáles son las características morfológicas de Listeria sp?2.- ¿Por qué es importante la detección de Listeria monocytogenes en una planta congeladora de vegetales?3.-¿ cuales serian las fuentes de contaminación por lsiteria monocytogenes en una planta de productos lácteos?4.- ¿Cuál es le ingrediente selectivo para Listeria en el medio de cultivo agar LPM?

Caja

Espejo

Tripie




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Bibliografía

- James, T. peeler., and Larry, J. M. 1992. aerobic plate count. FDA, bacteriological analitical manual. 7 th

edition.-

David, A. Power., and peggy, J. Mccuen.1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6 th edition. United states of america.

- Warburton, D.W., J. M. Farber. A. Armostrong, R. Caderia, NP. Tiwari, T. Babiuk, P. Lacasse & S.Read 1991. A canadian comparative study of modified version of the “EDA” & “USDA” methods forthe detection of Listeria monocytogenes. J. Food Prot.




76



NOMBRE FECHA

XI.- Practica No 10“Determinación de bacterias anaerobias”

11.0 Introducción.Las bacterias anaerobias de importancia en al Microbiología Sanitaria, son las especies del genero clostridiu. Estegenero se caracteriza por ser bacilos gram positivos, formadores de esporas que varían de tamaño desde 0.5-1micras de diámetro por 3.0-10.0 micras de largo, al mayoría de sus especies son niveles, reducen los nitratos anitritos, licuan la gelatina, producen ácido y gas. El hábitat natural de estos microorganismos es el suelo y los

productos vegetales, de ahí que los alimentos contaminados con polvo y agua contaminada, pueden conteneresporas las cuales posteriormente germinan para producir células vegetativas. Las dos especies más importantesen Microbiología Sanitaria, por sus capacidades de producir intoxicaciones son: clostridium perfringens yclostridium botulinum. Las características principales de estas dos especies es la formación de esporas termoresistentes y la síntesis de enteroroxinas y neorotoxinas.

11.1 Determinación de la presencia de clortridium perfringens.

11.1.1 Material.

Asa de platinoBolsas o frascos de boca ancha estérilesBaños Maria a 46°CCajas de Petri 100 x 15 mm estérilesContador de colonias Québec

Pipetas bacteriológicas de 1.0mL. 10.0mL. y 0.1mL.estérilesTubos de ensaye 15 x 100 mmIncubadora regular a 35°CJarra para anaerobiosis

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11.1.2 Medios de cultivo y reactivos

Agar TSC.Caldo tioglicolato.Medio de lactosa de gelatina.Medio de hierro-leche

Agua peptonada estéril.Emulsión de yema de huevo al 50% estéril.Polvo de zinc.Solución reguladora-glicerina estéril.

11.1.3 aislamiento (prueba presuntiva).

1.- Asépticamente colocado 25 g. de muestra en un frasco estéril.

2.- Adicionar 225 mL. de agua peptonada (dilución 1:10).

3.- Homogenizar lentamente de 1 a 2 minutos.

4.- preparar una serie de diluciones de 10 -1 hasta 10-6, mezclando cada dilución

5.- colocar 6-7 mL. de agar TSC sin emulsión de huevo dentro de cada caja de Petri yExtenderlo rápidamente.

6.- cuando el agar solidifique etiquetas, y asépticamente transferir 1 mL..

De cada dilución al centro de las placas con el agar y adicionar otros 10-15 mL..

De agar TSC sin emulsión de huevo, homogenizado bien el medio con el inóculo y




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Esperar a que se solidifique.

7.- colocar las placas verticalmente en una jarra para naerobiosis, incubarlas a 35°C durante

20-24 horas.

11.1.4 método alternativo:1.- preparar placas con 8-10 mL. de agar TSC con emulsión de yema de huevo al 50% estéril, dejar quesolidifique el agar. Depositar 0.1 mL. de cada una de las diluciones de la muestra en cada placa y extender elinóculo en toda su superficie con una varilla de vidrio estéril2.- después que el inoculo es adsorbido (alrededor de 5 minutos), adicionar a las placas 10 mL. de agar TSC sinemulsión de yema de huevo.3.- cuando el agar se solidifique colocar las placas verticalmente en una jarra para enerobiosis e incubarlas a 35°C

por 24 horas.4.- después de la incubación seleccionar las placas que contengan 20-200 colonias típicas. Las colonias de C.

perfringens en medio con yema de huevo son negras con diámetros de2-4 mm y una zona clara alrededor de ella como resultado de la actividad de la actividad de lecitinaza.

5.- usando un contador de colonias Québec, contar las colonias negras y calcularLas UFC/ g de alimento.

11.1.5 confirmación de la prueba presuntiva1.- seleccionar 10 colonias típicas de C. perfringens de agar TSC con y sin emulsión de yemas de huevo.2.- inocular las colonias seleccionadas en tubos con caldo tioglicolato, e incubarlos a 35°C durante 10-24 horas.

11.1.5.1 prueba presuntiva en medio de hierro-leche:1.- Inocular tubos conteniendo 11 mL. del medio de hierro y leche modificado con1mL. del cultivo desarrollado en caldo tioglicolato e incubarlo en un baño de agua a 46°C.2.- revisar los tubos caga dos horas, una prueba positiva es cuando se observa una fermentación intensa, que es elresultado de una rápida coagulación de la leche seguida de una cuajada en al superficie, agitar levemente lostubos positivos para prevenir un derrame en el baño de agua.

11.1.6 Prueba complementaria

1.- de los cultivos desarrollados en las placas con agar TSC y los tubos con caldo tioglicolato, inocular por picadura tubos con medio de nitrato para observar la movilidad y tubos con gelatina-lactosa.2.-incubar los tubos a 35°C durante 24hrs.3.- observar si existe movilidad en los tubos con el medio de nitrato. Determinar también si hubo la reducción denitratos a nitritos, para esto se adicionan 0.5mL. del reactivo ácido sulfanilico y 0.2mL. de N (-1-naftil)etilendiamina, el desarrollo de un color violeta en los siguientes 5min nos indica que la prueba es positiva.4.- observar si en los tubos con gelatina lactosa hay producción de gas y de ácido. El vire de un color rojo aamarillo nos indica la producción de ácido.5.- estos mismos tubos se enfría a 5°C durante 1hora, y se observa si hay licuefacción de la gelatina.

11.1.7 Calculo del número de clostridium perfringens:

Ejemplo: si el conteo en placa de la dilución 10 -4 es de 85 y de 8 a 10 colonias de esta prueba se confirman C. perfringens el numero de células de C. perfringens/g de alimento es:

85 x (8/10) x 10 000 = 680,000

11.2 Determinación de clostridium botulinum en alimentos.

11.2.1 Material.




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Asa de platinoBalazaCajas de Petri estérilesIncubadoras a 26 y a 35°C

Jarras para sistema de anaerobiosisMechero bunsenMicroscopioTubos de ensayo de 13 x 100mm

11.2.2 Medios de cultivo y reactivos.

Agar hígado de ternera yema de huevoCaldo tripticasa peptona glucosa extracto delevadura (TPGY)

Medio de carne cocida (MCC)Etanol al 50% o absoluto estéril.Solución reguladora de fosfatos con gelatina estéril.

11.2.3 Enriquecimiento.

1.- al medio de enriquecimiento se le remueve previamente el oxigeno disuelto, poniendo el medio en unacorriente de vapor durante 10-15min, enfriando rápidamente, procurando no agitarlo.2.- inocular 2 tubos conteniendo 15mL. del caldo de enriquecimiento (MCC) con 1-2g o mL. de muestra. Incubara 35°C.3.- inocular 2 tubos de caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY) como en el paso 2. Incubar

a 26°C4.- después de 7 días de incubación examinar los tubos y observar si hay turbidez, producción de gas y digestiónde las partículas de carne.5.- hacer una tincion de gram de cada cultivo y examinar los frotis al microscopio.6.- observe la morfología de los microorganismos. Las células típicas de clostridium botulinum, tienen unaestructura semejante a una raqueta de tenis.

11.2.4 Aislamiento de cultivo puro.

11.2.4.1 pretratamiento de las muestras.

1.- en un tubo con tapón de baquelita estéril, mezclar 1 o 2mL. del cultivo enriquecido o de la muestra originalcon igual volumen de alcohol absoluto estéril. Mezclar bien e incubarlo a temperatura ambiente durante 1 hora.

2.- alternativamente, el cultivo enriquecido se calienta a 80°C durante 10-15min para destruir las célulasvegetativas. Este tratamiento no se recomienda para tipos de C. botulinum no proteo líticos.3.- de los tubos con el tratamiento con alcohol y de los tratados térmicamente resembrar para obtener coloniasaisladas, en placas con agar hígado de ternera yema de huevo o agar yema de huevo para anaerobiosis. Incubarlasa 35°C durante 48 horas en condiciones de anaerobiosis.4.- las colonias típicas de C. botulinum tienden a extenderse con bordes irregulares rodeadas de una zona de

precipitado amarillo.


Cuestionario.1.- ¿Por qué la bacteria anaerobia no se reproduce en medio aeróbico?2.- ¿en que productos alimenticios procesados es probable el desarrollo de anaerobios?3.- ¿Qué características de clostridium perfringens le da el carácter de ser patógeno para el hombre?4.- ¿Qué previsión APLICADA deben tener las personas de una planta de alimentos que pudieran infectarse conclostridium taten?

Bibliografía.- David, A. Power., and peggy, J. Mccuen.1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6 th

edition. United states of america.




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- Forrest, J. Etal, 1978. “fundamentos de ciencia de la carne”. Ed. Acribia zaragoza, España. - James, T. Peeler., and larry, J. Maturin. 1992. Aerobic Plate Count. FDA, bacteriological Analitical

Manual. 7th edition.- - Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de México, S.A de C.V- Forrest, J. Etal, 1978. “fundamentos de ciencia de la carne”. Ed. Acribia zaragoza, España.




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NOMBRE FECHA

XII.- Practica No 12“Efecto de los agentes desinfectantes sobre los microorganismos”

12.0 Introducción.

Desde el inicio de la conservación de los alimentos por el hombre, se han empleado una serie de agentes físicos yquímicos para destruir y/o inhibir el crecimiento de los microorganismos sobre los alimentos y de esta manera

poder conservarlos por tiempos mas prolongados. Los agentes físicos mas ampliamente utilizados en laactualidad es la deshidratación y las radiaciones. Dentro de los agentes químicos se encuentran toda la ampliagama de conservadores utilizados hoy en día.Sin embargo no es únicamente el hecho de aplicar agentes físicos o químicos sobre los alimentos para el controlde los microorganismos; también hay que tener presente el medio ambiente en el que se están procesando losalimentos y que esta formado por la maquinaria, utensilios, superficies, aire y operadores de un sistema de

transformación de alimentos.Actualmente es de primordial importancia la implantación en la industria alimentaría de programas desanitizacion del equipo y materiales utilizados, así como programas de buenas practicas de manufactura y dehigiene dentro del personal involucrado en su manipulación.En la presente practica se observara el efecto de algunos desinfectantes comúnmente utilizados en programas desanitizacion en plantas procesadoras de alimentos, sobre microorganismos que con mas frecuencia determinan eldeterioro de los alimentos y aquellos causantes de infecciones e intoxicaciones alimenticias.

12.1 Soluciones

Solución de hipoclorito de calcio (200ppm de cloro activo)Solución de ácido dodecilbensulfonico (200ppm)Solución de yodo (25ppm de yodo libre titulable)

12.2 Medios de cultivo y microorganismos.

Agar de papa y dextrosa acidificado.Agar violeta rojo bilisAgar de baird-parkerAgar para métodos estándar

Inoculo de saccharomyces cereviceae.Inoculo de escherichia coliInoculo de staphylococcus aureus.

12.3 Procedimiento.

1.- en 100mL. de agua peptonada al 1%, ajustar los inóculos de los microorganismos hasta obtener una concentración decélulas aproximadas de 10-3/mL..2.- con un hisopo estéril, impregnar la superficie de tres mesas de acero inoxidable, cada una con uno de los

microorganismos.3.- después de 30min. Realizar un muestreo en un área de 20x20 cm. para determinar la cuenta estándar de microorganismosmesofílicos areróbicos, cuenta de coliformes totales y cuenta total de staphylococcus, para el caso de las mesas donde seinoculo E. coli y S. aureus y cuenta total de levaduras para la mesa que fue inoculada con S. cereviceae.4.- una vez realizado el muestreo, aplicar a cada una de las terceras partes de cada mesa cada uno de los sanitizantes enconcentración y tiempo de acción de acuerdo a las indicaciones del proveedor. Cada mesa representara la actividad de tresdiferentes sanitizantes sobre un solo microorganismo.5.- retirar de la mesa el sanitizante siguiendo las instrucciones del proveedor.6.- realizar nuevamente un muestreo en un área de 20x20cm para cada uno de los sanitizantes en las tres mesas, haciendo lasdeterminaciones como en el punto 3




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7.- después de un periodo de incubación de 24-48 horas a 35°C para las bacterias y de 3-5 días a 28°C para las levaduras,comparar la UFC/20 cm2 antes y después de aplicar los sanitizantes.8.- hacer el reporte de la actividad de cada sanitizante en función de la diferencia de UFC obtenidas en el segundo muestreo.

Dibujos y observaciones

Cuestionario1.- ¡que es un agente bacteriostático?2.- ¿Cuál es el mecanismo de acción de un detergente en un proceso de sanitizacion?3.- ¿Cómo se define una sanitizacion “IN SITU”? 4.- ¿Cómo determina la actividad de un sanitizante sobre el piso de un a rea de embutidos?5.- ¿Por qué se debe hacer un muestreo de superficie del equipo antes y después de sanitizar?

Bibliografía

- Zargo, G. 1993: “manual de aplicación del análisis de riesgos, identificación y control de puntos críticos”. Secretaria

de la salud, México, D.F.




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NOMBRE FECHA

XII.- Practica No 12

DESARROLLO DE UN ECOSISTEMA. COLUMNA DE WINOGRADSKY

http://faca.uncoma.edu.ar/academica/materias/microbiologia_agricola/Guia_Microbiologia_Agricola_2007.pdfObjetivo: Observar el desarrollo de un ecosistema utilizando como modelo diferentes columnas de Winogradsky.Una columna ideal de Winogradsky se podría representar con el siguiente esquema.

Los alumnos construirán una columna de Winogradski. En ella podrán comprender la importancia de los distintos tipos demetabolismos que caracterizan a los microorganismos del suelo (autotrófico, litotrófico, organotrófico y heterotrófico) y que

permiten, entre otras actividades microbianas, la transformación de la materia orgánica. La columna de Winogradsky es unmedio muy simple que le permitirá observar el desarrollo de distintos tipos de microbios del suelo.

La columna de Winogradsky es en esencia un pequeño estanque artificial donde se facilita la eutrofización. La capa de lodoestá formada por una fuente de carbono, que puede ser de distinto origen (papel, material vegetal, etc), una fuente de azufre ycarbonato de calcio como fuente de dióxido de carbono. Las bacterias que reducen el sulfato, a través de una respiraciónanaeróbica, producen sulfuro el cual en su momento sirve como donante de electrones para las bacterias púrpura y verdes delazufre. Simultáneamente, otras bacterias descomponen la celulosa, en forma fermentativa, liberando ácidos que reaccionancon el carbonato de calcio produciendo dióxido de carbono. Los otros productos de descomposición que se producen, talescomo acetato, piruvato, citrato, etc., son utilizados por algunos microorganismos fotótrofos que desarrollan en la columna.En la interfase aeróbica-anaeróbica, aparecen al cabo de los días manchas de distintos colores, que tienen su origen en

bacterias no sulfurosas. La capa acuosa aerobia permite el desarrollo de algas verdes y verde-azuladas (cianobacterias),hongos, bacterias aerobias y protozoos. En la naturaleza, bacterias fotosintéticas viven en el fondo de un estanque junto arestos orgánicos y sulfuros de distinto tipo. Aunque tenemos oscuridad en ese lugar, cierta cantidad de luz perteneciente alinfrarrojo cercano puede penetrar y ser utilizada por las bacterias púrpura y verdes del azufre o sea por miembros de lasfamilias Chromatiaceae y Chlorobiaceae, respectivamente. Estos organismos captan luz que no es absorbida por lascianobacterias que viven en las capas superiores de los estanques. Las bacterias usan donadores de electrones tales comosulfuro de hidrógeno y construyen carbohidratos a partir del CO2 y no utilizan O2. Una vez que el nivel de sulfuro disminuyó,

Esta columna permite el desarrollo de bacteriasdel tipo fotosintético. La columna provee ungradiente de oxígeno desde la superficie al fondo

de la misma que junto a una fuente de luz, creaun ambiente adecuado para organismos aerobiosy bacterias fotosintéticas (anaeróbicas). El tipode suelo y los nutrientes determinan lasvariedades de organismos que aparecen en lacolumna luego de un cierto tiempo. La capaacuosa de la parte superior soporta el desarrolloden una mezcla de protozoos, hongos y algas.Todos estos microorganismos son aerobios,teniendo estilos de vida y requerimientosnutritivos diferentes. En el fango anaeróbico seencuentran las bacterias fotosintéticas (Brock yMadi an 1991 .

LUZO2

SH2,CO2

PROCESOPRINCIPAL

Fotosíntesisoxigénica

Fotosíntesisanoxigenica

Quimiolitotrofismo




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el tercer grupo de bacterias fotesintéticas pueden aparecer en el ambiente o sea las Rhodospirillaceae o bacterias púrpuras nosulfurosas.En el fondo de la columna es posible encontrar fijadores libres de N2 (Ej. Clostridium pasteurianum), bacterias sulfatoreductoras y productoras de metano, entre otras.

1. PREPARACIÓN DE LA COLUMNA (Cátedra)Metodología de TrabajoMezclar 1 g de CaSO4 con 2 g de CaCO3 y 0,5 g de papel pulverizado por 2 mm. Se puede utilizar suelo de distinto origen(jardín, campo, fondo de estanque, etc). Colocar la mezcla preparada en un cilindro de vidrio (Pj. Una probeta) y mezclarsuavemente con el objeto de remover los poros de aire de mayor tamaño. Agregar agua para humedecer la mezcla de suelo ycon una varilla remover las burbujas de aire. Agregar suelo adicional, sin aditamentos, y volver a agregar agua hasta que lacolumna este llena n un 80% de su capacidad. Cubrir el cilindro con un plástico (se evita pérdida de agua) e incubar frente auna ventana o utilizando una luz incandescente de baja intensidad (60 wats; longitud de onda: 720-1000 nm). Es útil cubrir lacolumna con papel de aluminio los primeros 7- 8 días, para protegerla de la luz. Durante ese período comienzan a desarrollarorganismos heterotróficos con respiración anaeróbica, facilitando la formación de un flujo de H2S y CO2 y la creación de ungradiente de oxígeno hacia la superficie de la columna. Finalmente, se debe realizar una descripción completa de la actividadmicrobiana observada luego de incubar la columna durante 50-60 días.

2. DESCRIPCION DE LOS MICROORGANISMOS PRESENTES EN LA COLUMNAMetodología de trabajo- Se realizarán preparaciones en fresco de las columnas de Winogradsky de distintas edades provistas por la cátedra.- Se anotará la edad de las columnas y se realizarán esquemas de los distintos microorganismos detectados a diferentes alturas.Relacione la presencia de los microorganismos con su metabolismo y la localización en la columna. La observación tiene queser hecha desde la parte superior a la inferior de la misma.




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Apéndices




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Apéndice I“formulación y preparación de medios de cultivo para Microbiología Sanitaria”

Agar de baird-parker

Formulación y preparación.Formula aproximada en gramos por litroPeptona de caseina……………………………10.0 Extracto de carne……………………………...5.0Extracto de levadura…………………………..1.0 Cloruro de litio………………………………..5.0 Agar…………………………………………..17.0 Glicina………………………………………..12.0 Piruvato de sodio……………………………..10.0

pH final 6.8 + 0.2

Suspender 60g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 5 a 10min calentar agitando frecuentementey hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15min.

Enfriar a 45-50°C y agregar 10mL. de solución de telúrico de potasio al 1% y 50mL. de emulsión de yema de huevo.Homogenizar suavemente y vaciar en cajas de Petri. Refrigerar en recipientes sellados, o en frascos o tubos con tapones derosca cerrados. La base puede conservarse por periodos largos de tiempo. Puede fundirse y emplearse a medida que senecesite.

Agar de bilis y rojo violeta

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litroExtracto de levadura…………………………3.0 Peptona de gelatina…………………………. 7.0 Mezcla de sales biliares…………………….. 1.5 Lactosa………………………………………10.0

Cloruro de sodio……………………………..5.0 Agar…………………………………………15.0 Rojo neutro………………………………….0.03 Cristal violeta……………………………….0.002

pH final 7.4 + 0.2

Suspender 41.5g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15min. Calentar agitandofrecuentemente y hervir durante un minuto. Enfriar a 44-46°C, usar de inmediato, o esterilizar a 121°C (15lb presión) durante15min. Una vez esterilizado enfriar a unos 40-45°C y vaciar en cajas de Petri.

Agar de bilis verde brillante

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litroPeptona de gelatina………………………….8.250 g Lactosa……………………………………. 1.900 g Agar especial……………………………….10.150 g Sulfito de sodio……………………………. 0.205 g Fascina básica………………………………77.6 mg Erioglaucina……………………………….. 64.9 mg Cloruro ferrico……………………………... 29.5 mgFosfato monopotasico……………………... 15.3 mg




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bilis de buey…..……………………………2.95 mg Verde brillante……………………………. 29.5 mg

pH final 6.9 + 0.2

Suspender 20.6g de polvo deshidratado en un litro de agua destilada de buena calidad. Dejar en reposo de 5 a 10 min paraque el agar se hidrate correctamente. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto esterilizar en autoclave a15lb de presión durante 15min. Dejar enfriar entre 45-50°C y distribuir en cajas Petri.

Agar cloruro de litio-feniletil-moxalactama (LPM)

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litroAgar feniletanol (DIFCO)………………….35.5 g Anhídrido glicina…………………………...10 g Cloruro de liyio…………………………….. 5g Solucion de fosfatos 1% con pH 6.0……… 2 mL.Solucion de moxalactam

Agua destilada

Esterilizar el medio (sin moxalactam) a 121°C por 15min. Enfriar a 48-50°C y adicionar filtrada y esterilizada la solución demoxalactam.Solución de moxalactam: consiste en 1g de sales de moxalactam (amonio o sodio) en 100mL. y 0.1M de solución de fosfatode potasio. Filtrar y esterilizar, guardar la solución de moxalactam en refrigeración en alícuotas de 2mL..

Agar de dextrosa y papa (DPA)

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litro.Infusion de papa……………………………200.0 Dextrosa……………………………………..20.0

Agar…………………………………………. 15.0

pH final 5.6 + 0.2

SUSPENDER 39G Del medio deshidratdo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15min. Calentar agitandofrecuentemente y hervir un minuto. Esterilizar a 121°C (15lb de presión) durante 15min.una vez esterilizado enfriar a unos40-45°C y vaciar en cajas de Petri.

Agar de eosina y azul de metileno.

Formulación aproximada en gramos por litro.Peptona de gelatina……………………………………………10.000 Lactosa………………………………………………………...5.000 Sacarosa……………………………………………………….5.000 Fosfato dipotasico…………………………………………….2.000 Eosina y ………………………………………………………0.400 Azul de metileno………………………………………………0.065 Agar……………………………………………………………13.5

pH final 7.2 + 0.2

Suspender 36g de polvo en un litro de agua destilada de buena calidad. Mezclar y remojar unos 10min para que se hidratecorrectamente al agar. Calentar agitando con frecuencia. Hervir un minuto. Esterilizar en autoclave a 15lb de presión durante15min. Dejar que se enfrié la solución a unos 50°C. Agitar suavemente, enviando la formación de burbujas, para que la




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composición del medio se uniformice y vaciar en cajas de Petri estériles. Dejar que el medio se solidifique y luego invertir las placas para que no se deposite demasiada humedad sobre la superficie del mismo.

Agar hierro tres azucares (TSI)

Formulación y preparación:Composisicion gramos/litros.Peptona de caseína…………………………….15 Peptona de carne………………………………5 Extracto de carne…………………………….. 3 Extracto de levadura…………………………..3 Cloruro sodio………………………………… 5 Sacarosa………………………………………10 D(+) glucosa………………………………….1 Amonio de hierro (III) citrato………………...0.5 Tío sulfato sodico……………………………..0.3 Rojo de fenol………………………………….0.024 Agar-agar…………………………………….. 12

pH 7.4 + 0.1

Disolver 65 g/lt, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15min a 121°C. dejar solidificar en posición inclinada. El mediode cultivo es claro y de color rojo anaranjado.

Agar hígado de ternera yema de huevo.

Formulación y preparación:Infusión de hígado………………………..50g Infusión de temera………………………..500gProteosa peptona…………………………20g

Neopeptona………………………………1.3g

Tristona…………………………………. 1.3g Dextrosa………………………………….5g Almidon soluble………………………….10g Caseina isoelectrica………………………2g Cloruro de sodio………………………….5g

Nitrato de sodio…………………………..2g Gelatina…………………………………...20g Agar……………………………………….15g Agua destilada…………………………….1000mL.

Calentar con agitación constante hasta dilución completa. Esterilizar en autoclave por 15min a 121°C, pH final 7.3 + 0.2.Agregar por cada 500mL. del medio base fundido de 40mL. de la suspensión salina de yema de huevo, mezclar y vaciar acajas de Petri estériles de 15 x 100mm (aproximadamente 15-20mL.). Secar las placas a temperatura ambiente por 2 días o a35°C por 24horas. Almacenar en refrigeración.

EMULSION AL 50% de yema de huevo:LAVAR LOS HUEVOS CON UN CEPILLO suave y dejar escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro mercúricoal 0.1%, escurrir, ABRIR los huevos en condiciones asépticas y descartar las claras. Colocar las yemas en un recipienteestéril y mezclar con igual volumen de solución salina estéril al 85%. Guardar en refrigeración hasta su uso.




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Agar lisina hierro

Formulación y preparación:Composición gramos/litroPeptona de carne………………………....5 Extracto de levadura……………………..3 D (+) glucosa…………………………….1 L-lisina monoclorhidrato………………...10 Tiosulfato sodico……………………….. 0.04 Citrato de amonio y hiero (III)…………..0.5 Púrpura de promocresol…………………0.02 Agar-agar…………………….12.5

Ph 6.7 + 0.1

Disolver 32 g/lt, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave (15min a 12°C). dejar solidificar en posición inclinada deformaque, al solidificar, se produzca una columna de unos 3 cm. de altura, sobre ella, una superficie inclinada de, por lo menos, lamisma longitud. El medio de cultivo es claro y de color gris violeta.

Agar para métodos estándar

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litros.Peptona de caseína…………………………..5.0 Extracto de levadura…………………………2.5 Dextrosa……………………………………..1.0 Abr…………………………………………..15.0

Suspender 23.5g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar y mezclar bien de 5 a 10min. Calentaragitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo con tapón de rosca, o en un matraz si elmedio va a usarse poco después de esterilizarlo. Esterilizar a 121°C (15lb de presión) durante 15minutos. Puede volverse a

fundir, una sola vez cuando se necesite.

Agar Oxford (OXA)

Formulación y preparación:Composición en g/litro.Peptona……………………………23 Almidón……………………………1 Cloruro de sodio………………….. 5 Agar-agar………………………….13 Esculina……………………………1 Citrato de amonio y hierro (III)……0.5 Cloruro de litio…………………….15

pH 7.0 + 0.2

Disolver 29, 25 en 500mL. de agua desmineralizada, someter al autoclave durante 15minutos a 121°C disolver el contenidode un frasco de suplemento selectivo para Listeria Oxford, con 5mL. de etanol/agua estéril (1:1) y añadir al medio de cultivoestéril enfriado a 50°C. Mediante agitación cuidadosa por balanceo el suplemento selectivo se debe mezclar en formahomogénea en la solución del medio de cultivo. Verter el medio de cultivo estéril enfriado a 50°C. Mediante agitacióncuidadosa por balanceo el suplemento selectivo se debe mezclar en forma homogénea en la solución del medio de cultivo.Verter el medio de cultivo en placas y dejar solidificar. Listeria monocytogenes crece en colonias coloreadas de gris azuladocon una mancha negra (disgregación de esculina).




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Agar para Salmonella y shigella (agar SS)

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litroextracto de carne……………………………5.0 Mezcla de peptonas………………………...5.0Lactosa………………………………………10.0 Mezcla de sales biliares……………………..8.5 Citratos de sodio…………………………….8.5 Agar …………………………………………13.5 Tiosulfato de sodio………………………….8.5 Citrato ferrico……………………………….1.0 Rojo neutro………………………………….0.025 Verde brillante………………………………0.330mg

pH final 7.0 + 0.2

Suspender 60g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar unos 15min. Agitar para obtener unasuspensión homogénea, calentar con agitación frecuente y hervir durante un minuto. No deberá esterilizarse en autoclave.Verter en placas. Evítese la congelación.

Agar de soya tripticasa

Formulación y preparación:Formula aproximada en g/litro.Peptona de caseína………………………..15 Peptona de soya…………………………..5 Cloruro de sodio…………………………..5Agar……………………………………….15

pH final 7.3 + 0.2

Suspender y remojar de 10 a 15min 40g del medio deshidratado en 1 litro de agua destilada. Calentar agitandofrecuentemente durante un minuto para que se disuelva. Esterilizar en autoclave entre 118 y 121°C y a una presión no mayorde 15lb por 15min.

Agar sulfito-bismuto

Formulación y preparación:Composición gramos/litrosExtracto de carne………………………..5 Peptona de carne………………………..10 D (+) glucosa……………………………5 Hidrogenofosfato disodico……………....4 Sulfato ferroso…………………………..0.3 Verde brillante………………………….0.025 Indicador bismuto sulfito……………….8 Agar-agar……………………………….15

pH 7.6 + 0.2

Disolver 47.5 g/litro. Verter en placas, en capa gruesa, el precipitado obtenido después de haberlo distribuidohomogéneamente.




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¡No esterilizar en autoclave!

Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS)

Formulación y preparación:Composición gramos/litrosPeptona de caseína……………………….5 Peptona de carne…………………………5 Extracto de levadura……………………..5 Citrato sodico……………………………3 Sacarosa………………………………….20 Tiosulfato sodico………………………...10 Bilis de buey, desecada…………………..5 Cloruro sodico…………………………...10 Citrato de hierro (III)…………………….1 Azul de timol…………………………….0.04 Agar-agar………………………………...14

pH 8.6 + 0.2

Disolver 88g/litro y verter en placas. ¡no esterilizar en autoclave!. Las placas con meido son claras y de color azul verdoso.

Agar tripotas-sulfito-cicloseina (TSC)

Formulación y preparación:Composición gramos/litro.Triptosa………………………………..15 Peptona de harina de soya……………..5 Extracto de levadur a…………………...5 Bisulfito sodico………………………..1 Citrato de amonio y hiero (III)………...1

Agar-agar………………………………15 Cicloserina……………………………..0.5

Disolver 42 g/litro en lo posible en recipientes pequeños, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15min a 121°C.Incorporar la cicloderina, verter en placas.

Agar verde brillante

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litroExtracto de levadura………………………..3.0 Mezcla de peptonas………………………..10.0 Cloruro de sodio……………………………5.0 Lactosa……………………………………...10.0Sacarosa…………………………………….10.0 Rojo de fenol………………………………..0.08 Agar…………………………………………20.0 Verde brillante………………………………12.5 mg

pH final 6.9 + 0.2




91

Suspender 58g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar remojar unos 15min. Calentar agitandofrecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15lb de presión) durante 15min y distribuir encajas de Petri.

Agar de vogel Jonson

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litroPeptona de caseína………………………….10 Extracto de levadura…………………………5 Manitol………………………………………10 Fosfato di potásico……………………………5 cloruro de litio……………………………….5 Glicina……………………………………….10 Agar ………………………………………….16 Rojo de fenol…………………………………25 mg

PH final 7.2 + 0.2

Suspender 61g del medio deshidratado en in litro de agua destilada. Mezclar bien. Remojar de 5 a 10min. Calentar agitandofrecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C (15lb de presión) durante 15 min.

Enfriar a 45 – 50°C y agregar 20mL. de una solución de telurito de potasio al 1%. Agitar vigorosamente y vaciar en cajas dePetri.

Agar XLD

Formulación y preparación:

Formula aproximada en gramos por litro.Xilosa………………………………………3.50 L-lisina……………………………………..5.0 Lactosa……………………………………...7.50Sacarosa…………………………………….7.50 Cloruro de sodio…………………………….5.0 Extracto de levadura………………………..3.0 Rojo de fenol……………………………….0.08 Agar………………………………………...13.50 Desoxicolato de sodio………………………2.50 Tiosulfato de sodio………………………….6.80 Citrato de hierro y amonio………………….0.80 PH final 7.4 + 0.2109

Suspender 55g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar que se remoje durante 10 a 15min. Calentar contodo cuidado y agitando con frecuencia justamente hasta que el medio hierva. No sobrecalentar. Dejar de calentar en cuantose obtenga la dilución completa del polvo. Una vez disuelto, enfriar rápidamente en agua o en baño Maria a 50°C y verter encajas de Petri. El medio debe ser transparente o casi transparente y tener un color rojo rubí anaranjado.El calentamiento excesivo o el mantener el medio demasiado tiempo en baño Maria a 50°C puede ocasionar que se formen

precipitados. En este caso se corre el riesgo de que las colonias sean de menor tamaño y presenten reacciones menos nítidas.Sin embargo, el precipitado no perjudica el desarrollo bacteriano y puede eliminarse por filtración con papel filtro.




92

Caldo de cerebro-corazón (BHI)

Formulación y preparación:Formula aproximada g/litroSubstrato alimenticio (extracto de cerebro,Extracto de corazón y peptona)…………………….27.5 D (+) glucosa………………………………………..2.0 Cloruro Sódico………………………………………5.0 Hidrógeno fosfato disódico…………………………..2.5 Agar-agar……………………………………………15.0

PH 7.4 + 0.2

Disolver 52 g/litro (agar cerebro de corazón) y esterilizar en autoclave 15min a 21°C

Caldo citrato de koser


NaNH4HPO44H2O………………………………….1.5 g. K 2HPO4…………………………………………..…1.0 g. Citrato de sodio. 2H2O……………………………...3.0 g. MgSO47H2O………………………………………...0.2 g. Agua destilada…………………………………...….1000 mL..Distribuir en tubos con tapón de baquelita. Esterilizar en auto clave 15 minutos a 121 ° C.

Caldo de enriquecimiento para Listeria (cel)

Formulación preparación:Formula aproximada en g/litro.Peptona…………………………………………….23.0 Extracto de levadura………………………….……..5.0

Cloruro de lítio………………………...…………...10.0 Esculina……………………………………………...8.0 Citrato de amonio y hierro (111)……………………0.5 D (-)-manita………………………………………….5.0 Rojo de ferol………………………………………..0.08 Lecitina de soya……………………………………. 1.0

PH 7.4+0.1

Disolver 23.7 g en 500 mL. de agua desmineralizada, someter al autoclave (15 minutos a 121°C).Disolver el contenido de un frasco de suplemento selectivo para Listeria PALCAM. Con 1 mL. de agua destilada estéril yañadir al caldo base enfriando por debajo de 50°C mediante agitación cuidadosa por balanceo debe mezclarsehomogéneamente al suplemento selectivo en el caldo nutritivo.

Caldo de Escherichia coli

Formulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litros.Digestivo pancreático de caseína………………………….20.0 g Lactosa…………………………………………………...…5.0 Mezcla de sales biliares……………………………………..1.5 Fosfato hidrogeno dipotacio……………………………...…4.0 Fosfato dihidrogeno de potasio……………………………..1.5




93

Cloruro de sodio………………………………………...…..5.0 PH final 6.9+ 0.2

Suspender 37 g de polvo en 1 litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensayo con campanas de Dirham en porciones de10 mL.. Para muestra de 1 mL.. O menos.Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 12-15 minutos. Enfriar rápidamente el caldo como sea posible.

Caldo lactosadoFormulación y preparación:Formula aproximada en gramos por litros:Peptona de gelatina……………………………………5.0 Extracto de carne de res……………………………….3.0 Lactosa…………………………………………...……5.0 PH final 6.9+ 0.1

Suspender 13 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, o si es necesario prepararMas concentrado el medio. Disolver y distribuir en tubos de ensayo con campanas de dirham. Esterilizar a 121°C durante 15minutos, y enfriar lo mas rápidamente posible.

Caldo lauril sulfato de sodio

Formulación y preparación:Formula aproximada por litros.Laurilsulfato de sodio………………………….……….0.10 Peptona de caseína………………………………….…20.00 Lactosa………………………………………………..….5.0 Fosfato di potásico…………………………………..…..2.75 Fosfato monopotasico……………………………...…...2.75 Cloruro de sodio………………………………...………5.00 PH final 6.8+.0.2

Disolver 35.6 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensayo con tubo invertido ocampana de dirham en porciones de 10 mL.. Para muestra de un mL.. O menos. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15minutos. Es preferible almacenar el caldo a temperatura ambiente y utilizar frascos con tapón de rosca.

Caldo laurel sulfato + mug


Formula aproximada en gramos por litro.Triptosa………………………………………………... 20.0Lactosa………………………………………… ………..5.0Cloruro sádico……………………………………………5.0Laurel sulfato, sal sódica………………………..………..0.1Hidrogeno fosfato di potásico………….……………….2.75 Dihidrogeno fosfato potasico…………………………...2.75 L – triptófano…………………………………………….1.0 4 – metilumbeliferil – B – D – glucoronido………….…..0.1 PH 6.8+ 0.1

Disolver 36.5 g/litro y distribuir en tubos provistos eventualmente de campanas de dirham.Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C.La florescencia se provoca mediante una lámpara UV. Las colonias que muestran fluorescenciaAzul claro corresponden a las de E. coli.




94

Caldo lauril triptosa + mug (lst – mug)


Triptosa............................................................................20g.Lactosa..............................................................................5g.K 2HPO4 ............................................................................2.75 g.K 2HPO4 ............................................................................2.75 g.Lauril sulfato de sodio.......................................................0.1 g.

NaCI……………………………………………...……...5 g.4 – metilumbeliferil – B – D – glucoronido……………..50 mg. Agua destilada…………………………………………...1000 mL..PH 6.8+ 0.2

Preparar el caldo laurel sulfato y adicionar el MUG. Disolver calentando si es necesario. Esterilizar en autoclave a 121°Cdurante 15 minutos.

113

Caldo - m – HD endo.


Extracto de levadura…………………………………...3g.Casi tona……………………………………...……….10g. Thiopeptona………………………………………......10g. Lactosa……………………………………………......20 g. Desoxicolato de sodio………………………..…….…0.2 g. Cloruro de sodio………………………………………5g. Fosfato di potásico…………………………………….6 g.

Fucsina básica…………………………...…………….0.84 g. Sulfito de sodio……………………………...………...2.1 g. Agua destilada………………………………..……….1000 mL..PH final 7.5 + 0.2

Pasar los ingredientes, suspenderlos en agua destilada y calentar a ebullición, no esterilizar en autoclave. Enfriar el medio a35 – 50 °C para depositarlo en el cojinete de la caja de Petri en cantidades de 2.0 mL.. Se recomienda preparar pequeñosvolúmenes de medio.




95

Caldo rojo de metilo – voges y proskauer (mr – vp)


Peptona………………………………….7.0 g. Glucosa…………………………...……..5.0 g. K 2HPO4 ………………………...………5.0 g. Agua destilada ………………………....1000 mL..PH 6.9 + 0.2

C alentar hasta disolver los ingredientes en 800 mL.. De agua., filtrar. Esterilizar en auto clave 12 – 15 minutos a 121 °C.Enfriar a 20 °C.

Caldo selenito y cistins

Formulación y preparación:Formula aproximada g/litro.Mezcla de peptonas…………………………..5

Lactosa………………………………………..4 Fosfato de sodio………………………………10 Selenito ácido de sodio………………………..4 L – Cistina……………………………………..0.01 PH final 7.3 + 0.2

Suspender 23g. De polvo en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Mezclar bien y ligeramente hasta queel medio se disuelva. Envasar en tubos de ensaye,Preferiblemente con tapa de rosca, volúmenes entre 10 – 15 mL.. Por tubo. Esterilizar a vaporFluente durante 15 minutos.

Caldo tetrationato

Formulación y preparación:Composición gramos/litrosPeptona de caseína……………………………..2.5 Peptona de carne…………………………….....2.5 Mezcla de sales biliares………………………..1 Carbonato calcico……………………...………10 Tío sulfato sádico………………………..…….30 Aditivo: yoduro potasico 5.0, yodo 6.0, eventualmente verde brillante 0.01.PH 7.0 + 0.1

Disolver 46 g/litro y en caso necesario, calentar brevemente y enfriar rápidamente. Queda un sedimento de carbonato calcio.¡No esterilizar en autoclave!.Antes de su uso, añadir 20 mL. / litros de solución yodo – yoduro potásico, además eventualmente 10 mL. / litros de soluciónal0.1% de verde brillante y en caso necesario. 0.04 g/litro de Novobiociona. Evitar todo calentamiento posterior. Al distribuirel medio de cultivo, repartir homogéneamente el precipitado que eventualmente hubiera podido formase.

Preparación de la solución yodo – yoduro: yodo 6.0 g. yoduro de potasio 5g. Agua destilada 20mL..El caldo preparado y listo para el uso, debe ser preparado el mismo día de su preparación.

Caldo tioglicolato





96

Composición gramos / litroPeptona de caseína…………………….15 Extracto de levadura…………………….5 D (+) – glucosa………………………… 5.5 L (+) – cisterna…………………………..0.5 Cloruro sodico………………………......2.5 Tioglicolato sódico………………………0.5

PH 7.1 + 0.2Disolver 29 g/litros, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C:

Caldo tripticasa peptona extracto de levadura (tpgy)


Tripticasa……………………..50 g. Peptona………………………...5 g. Glucosa……………………...…4 g.

Extracto de levadura……...……20 g. Tioglicolato de sodio…………...1 g. Agua destilada…………………..1000 mL..Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a Ph 7.2. Distribuir en volúmenes de 21 mL.. En tubo de 20 x 150Mm. con tapón de rosca. Esterilizar por vapor fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a 4 C Hasta 6 semanas. Si sealmacena más de 12 horas tratarlos mediante calentamiento en baño de agua a ebullición por 10 minutos y enfriar antes deusarlo.

Caldo triptosa


Formula aproximada g/litro.

Triptosa…………………………….20.0 D (+) glucosa……………………….1.0 Cloruro sodico……………………...5.0 Tiamina bicloruro…………………..0.005 Agar-agar…………………………...13.0

pH 7.3 + 1

Disolver 26 g/litro y esterilizar en autoclave 15min a 121°C

Caldo verde brillante bilis al 2% (caldo brila)


Formula aproximada en gramos por litro.Bilis de buey deshidratada…………………………20.0 Lactosa……………………………………………..10.0 Peptona de gelatina…………………………………10.0 Verde brillante………………………………………0.0133

pH final 7.2 + 0.2

Suspender 40g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Agitando frecuentemente para disolver el producto.Distribuir volúmenes de 10mL. de tubos de ensayo con campanas de dirham e incubarlos por porciones de un mL. del




97

producto en estudio. para analizar porciones de 10mL. de producto, disolver 60g del medio deshidratado en un litro de aguadestilada y envasar en volúmenes de 20mL.. Esterilizar a 121°C durante 15min.

Medio base

Formulación y preparación:Peptona de caseína……………………………..10.0g Extracto de levadura……………………………5.0g Glucosa…………………………………………2.0g Agar……………………………………………..25.0g Agua destilada…………………………………..1000mL.117

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave 15min a 120°C.Medio de carne cocida (CMM)

Formulación y preparación:Corazón de res………………………………….454g

Proteosa peptona……………………………….20g Bactodextrosa…………………………………...2g Cloruro de sodio………………………………...5g Extracto de corazón de res……………………...1000mL.

Picar el corazón de res, sumergir en agua y calentar hasta ebullición durante 1 hora. Enfriar, ajustar el pH a 7.0 y hervir 10minutos. Filtrar a través de muselina y presionar para drenar el exceso de líquido de la carne. Guardar la carne cocida.Agregar los ingredientes al filtrado y ajustar a pH 7.0Agregar agua hasta hacer 1000mL. . Filtrar a través de un papel filtro poroso. Se puede conservar el caldo y la carne encongelación por separado. Agregar el corazón cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una alturade 1.2 a 2.5 cm. del tubo y adicionar de 10 a 12 mL. de caldo. Esterilizar en autoclave 15min a 121°C. Si este medio sealmacena por más de 12 horas después de su preparación debe calentarse a ebullición por 10 min. Y enfriar antes de su uso.

Medio lactosa gelatina.

Formulación y preparación:Triptosa………………………………….15g Extracto de levadura……………………..10g Lactosa…………………………………...10g Rojo fenol………………………………...0.05g Gelatina…………………………………..120g Agua destilada……………………………1000mL.

Calentar hasta disolver la triptosa, extracto de levadura y lactosa en 400mL. de agua. Suspender la gelatina en 600mL. deagua y calentar a 50-60 °C agitando para disolver. Mezclar las 2 soluciones. Ajustar a pH 7.5 + 0.2. Adicionar rojo fenol ymezclar. Transferir porciones de 10mL. dentro de tubos de 16 x 150 mm con un tapón de baquelita. Esterilizar en autoclave10min a 121°C

Medio nitrato-movilidad

Formulación y preparación:extracto de carne…………………………3g Peptona (DIFCO)………………………...5g KNO3..…………………………………...1g

Na2HPO4…………………………………2.5g Agar………………………………………3g




98

Galactosa…………………………............5g Glicerina………………………………….5mL.Agua destilada……………………………1000mL.

Disolver todos los ingredientes excepto el agar. Ajustar el pH a 7.3 + 0.1. Adicionar el agar hasta disolver. Suspender porciones de 11mL. dentro de tubos de 16 x 150mm. Esterilizar en autoclave 15min. A 121°C. si no se usa dentro de 4 horas,calentar 10min a ebullición y enfriar en agua antes de su uso.




99

Apéndice II“preparación de reactivos y soluciones para Microbiología Sanitaria”

Ácido sulfanilico

Ácido sulfanilico 1gÁcido acético 5N 125mL.

Ácido tartarico (para hongos)

Ácido tartarico 10.0gAgua destilada 100.0mL.Disolver y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Alfa naftol (prueba de voges proskauer)

Alfa naftol 5.0gAlcohol etilico absoluto 100.0mL.

Cloruro mercúrico (prueba de proteolisis)

Cloruro mercúrico 12.0gÁcido clorhídrico concentrado 16.0gAgua destilada 80,0 mL.

Hidróxido de potasio (reacción de voges proskauer)

Hidróxido de potasio 40.0gAgua destilada 100.0mL.

120

Hidróxido de sodio 1.0N

Hidróxido de sodio 4gAgua destilada 100mL.

Kovac (prueba del indol)

p-dimetilamino benzaldehido 5.0gAlcohol amilico 75.0mL.Ácido clorhídrico concentrado 25.0mL.

Disolver el aldehído en el alcohol y adicionar lentamente el HCl

N – (1-naftjil) entilendiamina

N – (1-naftjil) entilendiamina dihidroclorida 0.25gÁcido acético 5N -200mL.




100

Rojo de metilo

Rojo de metilo 0.1gAlcohol etilico 300.0mL.Agua destilada 500.0mL.

Disolver el indicador en el alcohol y adicionar el agua.

Solución sal-glicerinaGlicerina 100mL.K 2 HPO4 12.4gKH2PO4 4g

NaCl 4.2gAgua destilada 900mL.

Mezclar el cloruro de sodio y el agua destilada. Adicionar la glicerina y los fosfatos. Ajustar en pH a 7.2. Esterilizar enautoclave 15minutos a 121°C. Para una doble concentración utilizar 200mL. de glicerina y 800mL. de agua destilada.

121

Buffer oTampón fosfato

Fosfato monopostasico 6.0gFosfato dipotasico 16.0gAgua destilada 1000mL.

Tripsina (1:250)

a) solución al 1%

b)

disolver 200mg en 20mL. de agua destilada. No almacenar

Soluciones diluyentes

Agua destilada

Agua peptonada

Peptona 1gCloruro de sodio 8.5gAgua destilada 1000mL.

Preparación:1.- disolver los componentes en 1 litro de agua2.- ajustar el pH a 7 con hidróxido de sodio 1.0N3.- distribuir en porciones de 99,90 y 9 mL. según se requiera4.- esterilizar a 121°C durante 15min.5.- después de la esterilización. El pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo nomayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.




101

122Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)

KH2PO4 34gAgua destilada 1000mL.

Preparación:1.- disolver el fosfato en 500mL. de agua y ajustar el pH a 7.2 con solución de hidróxido de sodio 1.0N2.- aforar con agua en 1lt.3.- esterilizar durante 15min a 121°C.4.- conservar en refrigeración (solución concentrada)5.-tomar 1.25mL. de solución concentrada y llevar a 1lt con agua (solución de trabajo)6.- esterilizar a 121°C durante 15min.7.- después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

Solución amortiguadora de fosfatos con gelatina

Gelatina 2g Na2HPO4 4gAgua destilada 1000mL.

1.- ajustar a pH 6.2 con solución de ácido clorhídrico 4N2.- distribuir en frascos con tapón de rosca esterilizar por vapor, enfriar a temperatura ambiente.3.- almacenar a 4°C

Solución salina.Cloruro de sodio 8.5gAgua destilada 1000mL.

Preparación:1.- disolver y distribuir en tubos o frascos.2.- esterilizar a 121°C durante 20min.

123Índice de tablas y figuras

pgfig 1.- etiqueta de identicacion para muestras…………………………………...….8 fig 2.- plantilla estéril para muestreo de superficies……………………………….15 fig 3.- fotografías de muestreo de la superficie de manos……...……………….…17 fig 4.- fotografía donde se indica la manera de pesar una muestra………..…….…24 fig 5.- diagrama del método de las diluciones ………………………………….….25 normas APLICADAs de mesofilos aerobios…………………………………………...33Fig 6.- diagrama de la prueba presuntiva de la técnica del NNP de coliformes.en agua purificada y hielo………………………………………………………….39 fig 7.- confirmación de burbujas de gas en campanas de deurham………………39




102

Tabla 8.- combinación de los tubos positivos en el análisis de aguasY bebidas……………………..…………………………………………………….40Fig 9.- características E. coli en agar EMB…………………………………………41 Interpretación de de la prueba bioquímica de E. coli………………………………43 Fig 10.- diagrama de la prueba presuntiva de la técnica del NMPDe coliformes fecales en alimentos………………………………………………..45 Tabla 11.- combinación de los tubos positivos del análisis de alimentos.…………47 normas APLICADAs de coliformes…………………………………………………..52 Fig 12.- inoculación por extensión de superficie…………………………………..60 fig 13.- prueba de la cuagulasa…………………………………………………….60 Fig 15.- utilización anaerobia de glucosa…………………………………………..60 Tabla 16.- características bioquímicas ripicas de 2 especies S. aureusY micrococcus……………………………………………………………………59 normas APLICADAs para shapylococcus aureus…………………………………...…59 Fig 17.- características de Salmonella en agar XLD……………………………….74 Fig 18.- confirmación bioquímica de Salmonella…………………………………..75 Pruebas diferenciales de Vibrio cholerae…………………………………………..80 Fig 19.- diferenciación bioquímica de los diversos tipos de Listeria……………...83

Fig 20.- observaciones de las placas por iluminación indirecta deLas colonias de Listeria……………………………………………………………..85

Índice de medios de cultivo, reactivos y soluciones

Ácido sulfanilico…………………………………………................................................119 Ácido tartárico………………..…………………………………………………...119 Agarbairb- parker………………………………………………………………….. 98 Agar bilis y rojo violeta…………………………………………………………….99 Agar bilis verde brillante…………...………………………………………………99 Agar cloruro íenil moxalactama (LPM)………………..…………………………100 Agar dextrosa y papa……………………………...………………………………100 Agar EMB…………………………………………………………………...……101 Agar hierro tres azucares (TSI)………………………………………………...…101 Agar hígado de ternera yema de huevo………………………………………...…102 Agar lisina hierro (LIA)……………………………………………………..……103 Agar métodos estándar……………………………………………………………103 Agar Oxford (OXA)………………………………………………………………104 Agar Salmonella y shigella (SS)…………………………………………...……...105 Agar soya triplica………………………………………………………………....105 Agar sulfito bismuto (BS)…………………………...……………………………106 Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS)………………………………….....106Agar triptosa cicloserina (TSC)…………………………………………………..107 Agar verde brillante…………...…………………………………………………..107 Agar vogel-Johnson………………………….………………………………...…108 Agar XLD…………………………………………………………………………108




103

Agua peptonada……………………...……………………………………………121 Alfa naftol…..…………………………………………………………………….119 Caldo infusión cerebro de corazón (BHI)………………………...………………119 Caldo citrato de koser (CK)…………………...………………………………….119 Caldo de enriquecimiento para Listeria…………...……………………………...110 Caldo E. coli………………………………………………………………………110 Caldo lactosa (CL)………………......……………………………………………111 Caldo laurel sulfato de sodio……………………………………………………...111 Caldo laurel triptosa + MUG……………………………………………………...112 Caldo – m- HD ENDO…………………………………………………...………...113 Caldo rojo de metilo voges proskauer (MR-VP)…………………………………113 Caldo seenito cistina (SC)………………………………………...………………114Caldo TPGY………………………………………………………………………115 Caldo triptosa…………………...………………………………………………...116 Caldo verde brillante bilis al 2% (caldo brila)……………………………...…….116 Cloruro mercúrico…………………………………………………………...……119 Hidróxido de potasio………………...……………………………………………119Hidróxido de sodio 1N……………………………………………………………120

Kovac………………………………………………………...…………………...120 125

Medio base………………………………………………………..………………116 Medio de carne cocida (CMM)…………………………………………………...117 Medio lactosa gelatina…………...………………………………………………..117 Medio nitrato-movilidad………...………………………………………………..118

N-(1 – nafthil) etilendiamina……………………………………………………...120 Rojo de metilo…………………………………………………………….………120 Solución amortiguadora de fosfatos………………………………………………122 Solución amortiguadora de fosfato con gelatina…………………….…...……….122 Solución sal-glicerina……………………………………………..………………123Solución salina………………………...………………………………………….122

Tampón fosfato…………………………………………………………………...121 Tripsina………………………...…………………………………………………121




104




105

ANEXO II. DIFERENTES TIPOS DE OPERACIÓN CON CULTIVOS MICROBIANOS

1. Toma de una muestra de un tubo con líquido.

Se esteriliza el asa, se toma el tubo con la mano izquierda, con el dedo meñique y la palma de la mano

derecha se sostiene firmemente el tapón y se retira rotando el tubo suavemente y con firmeza.

Se flamea la boca del tubo. Con el tubo inclinado aproximadamente 30°, nunca en posición

horizontal, se introduce el asa, tocando la pared del tubo hasta entrar en el líquido A 1/3 de

profundidad, cuidadosamente se retira el asa con un movimiento que permita la adhesión de una gotita

en el circulo de alambre. No basta con que se forme una película.

Se saca el asa sin tocar la pared del tubo, seflamea la boca del tubo y se tapa.

2. Descarga de la gota acarreada en el asa.

La gota que se ha tornado asépticamente puede tener diferentes destinos:

a) El más simple es que se deposite en el centro de un portaobjetos limpio para hacer alguna

preparación. Inmediatamente después se debe esterilizar el asa.

b) A menudo, el destino de una gota tomada con el asa es servir de inóculo, para lo cual se deben

seguir los pasos siguientes:

Inóculo a otro medio liquido en tubo o matraz. La operación es similar a la toma

de la muestra, se sostiene firmemente el recipiente con la mano izquierda y el tapón

se retira con el dedo meñique de la mano derecha, se flamea la boca del recipiente y

se introduce el asa cuidadosamente sin tocar las paredes hasta romper la superficie

del liquido, ahí se hace un ligero movimiento de rotación y se retira el asa, se flamea

la boca del recipiente, se coloca su tapón y se esteriliza el asa.

Si es a un medio sólido, se hace una estría con el asa, observando que parte del

material tornado quede extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se

debe romper la superficie del medio sólido.

3. Toma de una muestra de un medio sólido.

Las operaciones son las mismas descritas anteriormente, excepto que con el asa se debe tocar y separar un

fragmento del material de interés, ya sea una colonia bacteriana, o parte de una pasta o material viscoso. El

destino de la muestra puede ser el mismo que en el párrafo anterior.

Si se va a hacer una preparación para observar al microscopio, el material se suspende en una pequeña

gota de agua destilada colocada previamente en el centro de un portaobjetos.




106

Si va a ser un inoculo, se trata igual como se describió si es a un medio liquido.

Si es a un medio sólido, se hace una estría con el asa, observando que parte del material tornado queda

extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se debe romper la superficie del medio

sólido.

4. Manipulación de cajas de Petri.

Estos recipientes generalmente contienen un medio de cultivo solidificado con agar, cuya firmeza depende

de la concentración del mismo, la cual regularmente es del 1.5 a 2.5 %. En la mayoría de los casos esta

sustancia es inerte y no interfiere con el desarrollo de los microorganismos. A menos que se indique lo

contrario, las cajas de Petri se mantienen como posición normal, con la tapa abajo y la base arriba,

con lo cual el agua de condensación que se forma en la tapa no cae sobre el medio de cultivo y la tapa

permite levantar la caja sin destaparla accidentalmente.

Con la mano izquierda se toma la caja y con un giro de la muñeca se tiene la caja en posición invertida, la

base abajo y la tapa arriba, se deja caer la base en la palma de la mano y se sostiene la tapa can la yema de

los dedos, se invierte el giro de la muñeca y se deja la tapa de la caja sobre la mesa junto al mechero.

Sosteniendo la base entre los dedos se vuelve a girar la muñeca y la superficie del medio de cultivo queda

expuesta al operador. En estas condiciones se puede observar la superficie del medio, tomar una muestra,

inocular con el asa, etc.

Cualquiera que sea la operación debe hacerse en un tiempo mínimo, ya que aunque se trabaje en la zona de

seguridad del mechero, la probabilidad de que los contaminantes lleguen aumenta al prolongar el tiempo de

exposición. En caso de tener que transferir un volumen de líquido con una pipeta, se recomienda un procedimiento diferente:

Se coloca la caja sobre la mesa, junto al mechero, con la tapa arriba y la base abajo, se destapa suavemente

con la mano izquierda al tiempo que se introduce la punta de una pipeta y se descarga el volumen deseado.

Inmediatamente después se retira la pipeta y se coloca la tapa.

Otra forma de manipular las cajas de Petri, que se recomienda sólo después de tener cierta habilidad y

confianza en el trabajo es el de tomar la caja de Petri con la mano izquierda, en posición invertida, la base

abajo y la tapa arriba, la base se apoya sobre los dedos meñique y anular, mientras que la tapa se sostiene

con los dedos índice y pulgar y haciendo un movimiento de tijeras se abre una rendija por la cual se hace laoperación deseada. Con cierta práctica se puede abrir la caja casi por completo.

5. Aislamiento de colonias.

Una vez que se ha depositado en la superficie del medio, en la caja de Petri, el material que en general sirve

de inóculo, debe extenderse éste, para lo cual se siguen diferentes procedimientos.




107

Para aislar colonias, se extiende el inóculo con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez

mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente una distancia de 1 a 2 cm de la orilla. Se esteriliza el asa,

se deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estrías.

Se gira la caja de Petri un quinto de vuelta y con el asa esterilizada se hace una nueva serie de estrías que

deben extender una pequeña porción de la primera serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla

hacia el centro. La operación se repite dos veces más y en la quinta se hace una serie de estrías abiertas.

6. Crecimiento uniforme o masivo en la superficie

En caso de requerir que ocurra un crecimiento uniforme del inóculo, éste se debe extender ya sea con el asa

o con un hisopo, haciendo numerosas estrías en todas direcciones o bien, con la ayuda de una varilla de

vidrio acodada, la cual se esteriliza flameándola después de introducirla en alcohol, se deja enfriar y se hace

un movimiento de vaivén sobre la superficie del medio al tiempo que se hace girar varias veces la caja de

Petri sobre la mesa, extendiendo el inóculo hasta cubrir toda la superficie.

7. Toma de muestras con pipeta.

Se rompe el papel de envoltura cerca de la boquilla. Se siguen los pasos correspondientes a la manipulación

de tubos y matraces, introduciendo en el liquido la punta de la pipeta, succionando el volumen deseado,

aforando a la marca correspondiente, se retira sin tocar las paredes, se flamea y tapa el recipiente,

manteniendo la punta de la pipeta dentro de la zona de seguridad del mechero.

Se toma el recipiente al que se va a transferir el líquido manipulándolo como se describió antes y se

descarga el volumen deseado del contenido de la pipeta en el recipiente.

Esta operación debe ser muy rápida, pues el calor del mechero hace que el aire dentro de la pipeta se

dilate y expulse el líquido, lo que causa derrames indeseables sobre la mesa, la bata u otros recipientes.

La pipeta se debe desechar introduciéndola en un recipiente con una solución desinfectante, después de lo

cual se puede lavar o si se quiere se puede esterilizar con todo el material sucio en el autoclave.

Alternativamente, se puede colocar nuevamente en la envoltura de papel en la que se esterilizó,

mientras se termina el trabajo y se dispone la esterilización de todo el material sucio.

8. Toma de muestras e inoculación con hisopo

Un hisopo consiste de un palillo de madera de unos 15 cm de largo, con un poco de algodón enredado en unextremo. Estos instrumentos se esterilizan en tubos gruesos o envuelto en papel.

Se saca un hisopo cuidadosamente de su contenedor con la mano derecha sin tocar el extremo con algodón,

que servirá para impregnarse del material que interesa., se introduce el extremo con algodón y se deja

humedecer o empapar, se retira el hisopo sin tocar las paredes y se lleva a su destino.




108

Si es un medio líquido basta con un movimiento de inmersión o extracción. Si es a un medio sólido se

descarga humedeciendo la superficie con un movimiento suave.

Si se quiere conservar la muestra tomada en el hisopo se introduce éste en un tubo estéril ya sea seco o con

un líquido conservador para su transporte y se sujeta con el propio tapón del tubo, dejando fuera la parte

que ha sido tocada con los dedos. Una vez que se ha utilizado el hisopo, para desecharlo hay varios caminos:

se le sumerge en una solución desinfectante o se le pone en un recipiente para su posterior esterilización o

se incinera.

9. Preparación de medios de cultivo.

En la mayoría de las ocasiones, los medios de cultivo se adquieren comercialmente de diversos proveedores

y marcas, son preparados deshidratados en polvo, cuya composición varía de acuerdo con las necesidades.

En general, el fabricante señala la cantidad de polvo que debe usarse por cada litro de medio de cultivo. En

un recipiente del doble del volumen que se desea preparar, se pone el polvo y agua destilada paradisolverlo.

Si el medio contiene agar se requiere primero dejar reposar en frío para que el agar se hidrate, después

requiere del calentamiento hasta ebullición para lograr la disolución del mismo, en el caso en que este

medio deba ser utilizado para preparar tubos inclinados. Cuando este agar se prepara para vaciar en cajas,

esta disolución no es necesaria, puesto que se alcanzará sin problemas durante la esterilización. Hay que

tener mucha precaución, ya que los medios con agar tienden a hervir abrupta y violentamente, lo cual

podría causar quemaduras graves del operador.

Por lo anterior, se recomienda que al realizar la ebullición del mismo, la boca del matraz nunca apunte en

dirección del operador o de otras personas o equipo, y que éste utilice guantes de asbesto para su protección

y esté atento en todo momento del matraz.

El paso siguiente consiste en envasar los volúmenes convenientes en los tubos de cultivo y esterilizarlos en

autoclave. Si el medio se va a utilizar en cajas de Petri, se tapa con algodón el recipiente en que se disolvió,

se cubre con papel y se esteriliza en autoclave.

10. Después de esterilizar.

a) Medios de cultivo líquidos

Los tubos y otros recipientes con medio de cultivo líquido se sacan del autoclave y se dejan enfriar a

temperatura ambiente.

b) Medios de cultivo sólidos




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Los recipientes con medio sólido se sacan del autoclave y se hace lo siguiente:

Si son tubos, se dejan enfriar en posición inclinada de tal modo que se forme el pico de flauta, una

superficie plana larga y que no alcance el límite del tapón de baquelita. Al enfriarse se solidifica el

medio de cultivo cuando alcanza una temperatura entre 40 y 45°C.

Si son recipientes cuyo contenido se va a utilizar en cajas Petri, se dejan enfriar hasta alcanzar una

temperatura de 45 a 50°C, y se procede a verter el medio todavía líquido en las cajas estériles, en

una operación aséptica cerca de la llama del mechero, evitando la formación de burbujas. En caso

de que se formen burbujas, se pueden romper flameando ligeramente la superficie con el mechero.

Cada caja puede contener de 12 a 15 mL. Se dejan enfriar sobre la mesa hasta que el medio

solidifique. Se invierten para que la tapa quede abajo y la base arriba. Si no se utilizan en ese

momento, las cajas pueden mantenerse en refrigeración, debidamente etiquetadas y selladas con

papel parafilm, con la tapa hacia abajo y la base de la caja en la parte superior.

11. Rotulado.

En todos los casos, se debe rotular cada portaobjetos, tubo, matraz, caja de Petri o cualquier otro recipiente

en el que se haga un cultivo, reactivo o prueba, con el fin de conocer sin lugar a dudas lo que se tiene entre

manos.

Nunca se debe depositar toda la confianza en la memoria. En caso de que no hubiera espacio suficiente para

poner todos los datos necesarios, se debe utilizar una clave simple y confiable, que contenga la iniciales del

operador, material, cultivo, cepa, muestra o prueba y fecha. Esto mismo debe registrarse en la bitácora de

trabajo en donde estarán explícitos todos los datos.




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