7/29/2019 maxam and gilbert DNA sequencing

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 7 4 , N o . 2 , p p . 5 6 0 - 5 6 4 , F e b r u a r y 1 9 7 7B i o c h e m i s t r y

A new m e t h o d f o r s e q u e n c i n g DNA( D N A c h e n i s t r y / d i m e t h y l s u l f a t e c l e a v a g e / h y d r a z i n e / p i p e r i d i n e )

ALLAN M . MAXAM AND WALTER GILBERTD e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y , H a r v a r d U n i v e r s i t y , C a m b r i d g e , M a s s a c h u s e t t s 0 2 1 3 8C o n t r i b u t e d b y W a l t e r G i l b e r t , D e c e m b e r 9 , 1 9 7 6ABSTRACT DN A c a n b e s e q u e n c e d b y a c h e m i c a l p r o c e -d u r e t h a t b r e a k s a t e r m i n a l l y l a l e l e d DNA m o l e c u l e p a r t i a l l ya t e a c h r e p e t i t i o n o f a b a s e . T h e l e n g t h s o f t h e l a b e l e d f r a g m e n t st h e n i d e n t i f y t h e p o s i t i o n s o f t h a t s e . We d e s c r i b e r e a c t i o n st h a t c l e a v e DNA P r e f e r e n t i a l l y a t g u a n i n e s , a t a d e n i n e s , a t c y -t o s i n e s a n d t h y m i n e s e q u a l l y , a n d a t c y t o s i n e s a l o n e . When t h ep r o d u c t s o f t h e s e f o u r r e a c t i o n s a r e r e s o l v e d b y s i z e , b y e l e c -tq i m w e s d s o n a p o l y a c i d e g e l , t h e DN A s e q u e n c e c a n b el _ _ d 4 . . r ~ e p a t t e r n o f r a d i o a c t i v e b a n d s . T h e t e c h n i q u e w i l lKi U ~ n c i m p o f a t l e a s t 1 0 0 b a s e s f r o m t h e p o i n t o f l a -We h a v e d e v e l o p e d a n e w t e c h n i q u e f o r s e q u e n c i n g DN AT h e p ure d e t e r m i n e s t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c eo f a i e r m a a l y l a b e l e d DN A m o l e c u l e b y b r e a k i n g i t a t a d e -.t, g u a d i n e , c y t o s i n e , o r t h y m i n e w i t h c h e m i c a l a g e n t s .P a t t i a l o l a v a g e a t e a c h b a s e p r o d u c e s a n e s t e d s e t o f r a d i o a c t i v ef r s i t s t e n d i n g f r o m t h e l a b e l e d e n d t o e a c h o f t h e p o s i -t 6 r s o f t a t b a s e . P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s r e s o l v e st h s s i n g l e - s t r a n d e d f r a g m e n t s ; t h e i r s i z e s r e v e a l i n o r d e r t h ep i a t s o f b r e a k a g e . T h e a u t o r a d i o g r a p h o f a g e l p r o d u c e d f r o mf o u r d i f f e r e n t c h e m i c a l c l e a v a g e s , e a c h s p e c i f i c f o r a b a s e i na s e n s e we w i l l d e s c r i b e , t h e n s h o w s a p a t t e r n o f b a n d s f r o mw ~ s b t h e s e q u e c a n b e r e a d d i r e c t l y . T h e m e t h o d i s l i m i t e do a n y b y t h e r e s o l v i n g p o w e r o f t h e p o l y a c r y l a m i d e g e l ; i n t h ec u r r e n t s t a t e o f d e v e l o p m e n t w e c a n s e q u e n c e i n w a r d a b o u t1 0 0 b a s e s f r o m t h e e n d o f a n y t e r m i n a l l y l a b e l e d DN A f r a g -m e n t .We a t t a c k DNA w i t h r e a g e n t s t h a t f i r s t d a m a g e a n d t h e nr e m o v e a b a s e f r o m i t s s u g a r . T h e e x p o s e d s u g a r i s t h e n a w e a kp o i n t i n t h e b a c k b o n e a n d e a s i l y b r e a k s ; a n a l k a l i - o r a m i n e -c a t a l y z e d s e r i e s o f # - e l m i n a t i o n r e a c t i o n s w i l l c l e a v e t h e s u g a rc o m p l e t e l y f r o m i t s 3 ' a n d 5 ' p h o s p h a t e s . T h e r e a c t i o n w i t h t h eb a s e s i s a l i m i t e d o n e , d a m a g i n g o n l y 1 r e s i d u e f o r e v e r y 5 0 t o1 0 0 b a s e s a l o n g t h e DNA. T h e s e c o n d r e a c t i o n t o c l e a v e t h eDNA s t r a n d m u s t g o t o c o m p l e t i o n , s o t h a t t h e m o l e c u l e s f i n a l l ya n a l y z e d d o n o t h a v e h i d d e n d a m a g e s . T h e p u r i n e - s p e c i f i cr e a g e n t i s d i m e t h y l s u l f a t e ; t h e p y r i m i d i n e - s p e c i f i c r e a g e n t i sh y d r a z i n e .T h e s e q u e n c i n g r e q u i r e s DNA m o l e c u l e s , e i t h e r d o u b l e -s t r a n d e d o r s i n g l e - s t r a n d e d , t h a t a r e l a b e l e d a t o n e e n d o f o n es t r a n d w i t h 3 2 p . T h i s c a n b e a 5 ' o r a 3 ' l a b e l . A r e s t r i c t i o nf r a g m e n t o f a n y l e n g t h i s l a b e l e d a t b o t h e n d s - f o r e x a m p l e ,b y b e i n g f i r s t t r e a t e d w i t h a l k a l i n e p h o w b a t a s e t o r e m o v et e r m i n a l p h o s p h a t e s a n d t h e n l a b e l e d W i t h a 2 P b y t r a n s f e r f r o m, y - l a b e l e d ATP w i t h p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e . T h e r e a r e t h e n t w os t r a t e g i e s : e i t h e r ( i ) t h e d o u b l e - s t r a n d e d m o l e c u l e i s c u t b y as e c o n d r e s t r i c t i o n e n z y m e a n d t h e t w o e n d s a r e r a e v e d o n ap o l y a c r y l a m i d e g e l a n d i s o l a t e d f o r s e q u e n c i n g o r ( i i ) t h ed o u b l y l a b e l e d m o l e c u l e i d e a t u r e d a n d t h e s t r a n d s a r e s e p -a r a t e d o n a g e l ( 1 ) , e x t r a c t e d , a n d s e q u e n c e d .

THE SPECIFIC CHEMISTRYA G u a n i n e / A d e n i n e C l e a v a g e ( 2 ) . D i m e t h y l s u l f a tm e t h y l a t e s t h e g u a n i n e s i n DN A a t t h e N 7 p o s i t i o n a n d t ha d e n i n e s a t t h e N 3 ( 3 ) . T h e g l y c o s i d i c b o n d o f a m e t h y l a t ep u r i n e i s u n s t a b l e ( 3 , 4 ) a n d b r e a k s e a s i l y o n h e a t i n g a t n e u t r ap H , l e a v i n g t h e s u g a r f r e e . T r e a t m e n t w i t h 0 . 1 M a l k a l i a t 9 0 t h e n w i l l c l e a v e t h e s u g a r f r o m t h e n e i g h b o r i n g p h o s p h a t

g r o u p s . W h e n t h e r e s u l t i n g e n d - l a b e l e d f r a g m e n t s a r e r e s o l v eo n a p o l y a c r y l a m i d e g e l , t h e a u t o r a d i o g r a p h c o n t a i n s a p a t t e ro f d a r k a n d l i g h t b a n d s . T h e d a r k b a n d s a r i s e f r o m b r e a k a ga t g u a n i n e s , w h i c h m e t h y l a t e 5 - f o l d f a s t e r t h a n a d e n i n e s ( 3 )T h i s s t r o n g g u a n i n e / w e a k a d e n i n e p a t t e r n c o n t a i n s a l m o sh a l f t h e i n f o r m a t i o n n e c e s s a r y f o r s e q u e n c i n g ; h o w e v e r , a m -b i g u i t i e s c a n a r i s e i n t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h i s p a t t e r n b e c a u st h e i n t e n s i t y o f i s o l a t e d b a n d s i s n o t e a s y t o a s s e s s . T o d e t e r m i nt h e b a s e s w e c o m p a r e t h e i n f o r m a t i o n c o n t a i n e d i n t h i s c o l u mo f t h e g e l w i t h t h a t i n a p a r a l l e l c o l u m n i n w h i c h t h e b r e a k a ga t t h e g u a n i n e s i s s u p p r e s s e d , l e a v i n g t h e a d e n i n e s a p p a r e n t le n h a n c e d .An A d e n i n e - E n h a n c e d C l e a v a g e . T h e g l y c o i d i c b o n d om e t h y l a t e d a d e n o s i n e i s l e s s s t a b l e t h a n t h a t o f m e t h y l a t eg u a n o s i n e ( 4 ) ; t h u s , g e n t l e t r e a t m e n t w i t h d i l u t e a c i d r e l e a s ea d e n i n e s p r e f e r e n t i a l l y . S u b s e q u e n t c l e a v a g e w i t h a l k a l i t h ep r o d u c e s a p a t t e r n o f d a r k b a n d s c o r r e s p o n d i n g t o a d e n i n ew i t h l i g h t b a n d s a t g u a n i n e s .C l e a v a g e a t C y t o s i n e s a n d T h y n i n e s . H y d r a z i n e r e a c tw i t h t h y m i n e a n d c y t o s i n e , c l e a v i n g t h e b a s e a n d l e a v i n g r ib o s y l u r e a ( 5 - 7 ) . H y d r a z i n e t h e n may r e a c t f u r t h e r t o p r o d u ca h y d r a z o n e ( 5 ) . A f t e r a p a r t i a l h y d r a z i n o l y s i s i n 1 5 - 1 8 Ma q u e o u s h y d r a z i n e a t 2 0 0 , t h e DNA i s c l e a v e d w i t h 0 . 5 M p ip e r i d i n e . T h i s c y c l i c s e c o n d a r y a m i n e , a s t h e f r e e b a s e , d i s p l a c ea l l t h e p r o d u c t s o f t h e h y d r a z i n e r e a c t i o n f r o m t h e s u g a r s a nc a t a l y z e s t h e f l - e l i m i n a t i o n o f t h e p h o L s a t e s . T h e f i n a l p a t t e rc o n t a i n s b a n d s o f s i m i l a r i n t e n s i t y f r o m t h e c l e a v a g e s a t c yt o s i n e s a n d t h y m i n e s .C l e a v a g e a t C y t o s i n e . T h e p r e s e n c e o f 2 M N a C l p r e f e re n t i a l l y s u p r e s s e s t h e r e a c t i o n o f t h y m i n e s w i t h h y d r a z i n eT h e n , t h e p i p e r i d i n e b r e a k a g e p r o d u c e s b a n d s o n l y f r o m c yt o s i n e .

A N EXAMPLEC o n s i d e r a 6 4 - b a s p a i r DNA f r a g m e n t c u t f r o m l a c o p e r oDN A b y t h e A l v s T e n z y m e f r o m A r t h r o t b a c r l u t e u s , w h i cc l e a v e s f l u s h # a AGCT s e q u e n c e b e t w e e n t h e G a n d t h e( 8 ) . A f t e r d e p b s p h o r y l a t i o n , t h e t w o 5 ' e n d s o f t h i s f r a g m e nw e r e l a b e l e d w i t h 3 2 p . T h e a u t o r a d i o g r a p h i n F i g . 1 s h o w s t h at h e t w o s t r a n d s s e p a r a t e d u r i n g e l e c t r p h o r e s i s , a f t e r d e n at u r a t i o n , o n a n e u t r a l p o l y a c r y l a m i d e g e } ) ; t h e y c a n b e e a s i le x c i s e d a n d e x t r a c t e d . F o r e a c h s t r a n d , a l i q u o t s o f t h e f o u5 6 0

7/29/2019 maxam and gilbert DNA sequencing

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B i o c h e m i s t r y : Maxam a n d G i l b e r tc l e a v a g e r e a c t i o n s ( s t r o n g G / w e a k A , s t r o n g A , s t r o n g C , a n dC + T ) w e r e e l e c t r o p h o r e s e d a t 6 0 0 - 1 0 0 0 V o n a 4 0 - c m 2 0 %p o l y a c r y l a m i d e / 7 M u r e a g e l . T w e l v e h o u r s l a t e r , a s e c o n dp o r t i o n o f e a c h s a m p l e w a s l o a d e d o n t h e g e l a n d e l e c t r o p h o -r e s i s w a s c o n t i n u e d . F i g . 2 d i s p l a y s a u t o r a d i o g r a p h s s h o w i n gt w o r e g i o n s o f t h e s e q u e n c e o f e a c h s t r a n d d e r i v e d f r o m t h i ss i n g l e g e l : o n e c l o s e t o t h e l a b e l e d e n d o f t h e m o l e c u l e i n t h o s es a m p l e s t h a t h a d b e e n e l e c t r o p h o r e s e d i n a s h o r t t i m e , a n d ar e g i o n f u r t h e r i n t o t h e m o l e c u l e e x p a n d e d b y e l e c t r o p h o r e s i sf o r a l o n g e r t i m e . T h e s e q u e n c e c a n e a s i l y b e r e a d f r o m t h ep a t t e r n o f b a n d s . T h e s p a c i n g b e t w e e n f r a g m e n t s d e c r e a s e s( r o u g h l y a s a n i n v e r s e s q u a r e ) f r o m t h e b o t t o m t o w a r d t h e t o po f t h e g e l . T h e s l i g h t v a r i a t i o n s i n t h e s p a c i n g a r e s e q u e n c e -s p e c i f i c a n d r e f l e c t t h e l a s t n u c l e o t i d e a d d e d , a T o r G d e -c r e a s i n g t h e m o b i l i t y more t h a n a n A o r C . T h e f r a g m e n t s o nt h e g e l e n d w i t h t h e b a s e j u s t b e f o r e t h e o n e d e s t r o y e d b y t h ec h e m i c a l a t t a c k ; t h e l a b e l s o n t h e b a n d s i n t h e f i g u r e r e p r e s e n tt h e a t t a c k e d b a s e s . I n F i g . 2 , 6 2 b a s e s c a n b e r e a d f o r b o t hs t r a n d s , t h e l a s t 2 b a s e s a t t h e t w o 5 ' e n d s n o t b e i n g d e t e r m i n e db y t h i s g e l . T h e s e q u e n c e o f e a c h s t r a n d i s c o n s i s t e n t w i t h a n dc o n f i r m s t h a t o f t h e o t h e r :

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 4 ( 1 9 7 7 )s t r a n d e d D N A . T h e r e a r e s e q u e n c e - s p e c i f i c e f f e c t s o n t h em e t h y l a t i o n r e a c t i o n w i t h d o u b l e - s t r a n d e d DN A t h a t d o n o ta p p e a r w i t h s i n g l e - s t r a n d e d DNA: i n t h e s e q u e n c e G G A t h er e a c t i v i t y o f t h e m i d d l e G i s s u p p r e s s e d ; i n t h e s e q u e n c e A A At h e r e a c t i v i t y o f t h e c e n t r a l A i s e n h a n c e d . S i n c e t h e s e e f f e c t sa r e a b s e n t w i t h s i n g l e - s t r a n d e d D N A , t h e y m u s t a r i s e t h r o u g hs t e r i c h i n d r a n c e o r s t a c k i n g i n t e r a c t i o n s ; h o w e v e r , t h e y d o n o ti n t e r f e r e w i t h s e q u e n c i n g b e c a u s e t h e y a p p e a r e q u i v a l e n t l yi n b o t h d i s p l a y s o f t h e b a s e . A l t h o u g h i n s i n g l e - s t r a n d e d DN At h e N i o f a d e n i n e i s e x p o s e d t o m e t h y l a t i o n a n d s h o u l d m e t h -y l a t e a s r e a d i l y a s t h e N 7 o f g u a n i n e , m e t h y l a t i o n a t t h i s p o s i t i o nd o e s n o t d e s t a b i l i z e a d e n i n e o n t h e s u g a r . U n d e r o u r c o n d i t i o n st h e m e t h y l g r o u p w i l l m i g r a t e t o t h e N 6 p o s i t i o n a n d t h e e x t r ac h a r g e w i l l d i s a p p e a r ( 3 ) .T h e s e q u e n c i n g m e t h o d i s l i m i t e d o n l y b y t h e r e s o l u t i o na t t a i n a b l e i n t h e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . On 4 0 - c m g e l s w e c a n ,w i t h o u t a m b i g u i t i e s , s e q u e n c e o u t t o 1 0 0 b a s e s f r o m t h e p o i n to f l a b e l i n g . I f t h e r e i s o t h e r i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e t o s u p p o r tt h e s e q u e n c i n g , s u c h a s a n a m i n o a c i d s e q u e n c e , o n e c a n o f t e nr e a d f u r t h e r . T h e a v a i l a b i l i t y o f r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s i s n o ws u c h t h a t a n y DNA m o l e c u l e , o b t a i n a b l e f r o m a p h a g e , v i r u s ,o r p l a s m i d , c a n b e s e q u e n c e d .

pXXGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGG A C C G T G C T G T C C A A A G G G C T G A C C T T T C G C C C G T C A C T C G C G T T G C G T T A A T T A C A C T C A A X X PF i g . 3 i s a n e x p a n s i o n o f o n e r e g i o n o f t h e s e q u e n c i n g g e l t os h o w t h e b a s e s p e c i f i c i t y o f t h e c l e a v a g e r e a c t i o n s .

DISCUSSIONT h e c h e m i c a l s e q u e n c i n g m e t h o d h a s c e r t a i n s p e c i f i c a d v a n -t a g e s . F i r s t , t h e c h e m i c a l t r e a t m e n t i s e a s y t o c o n t r o l ; t h e i d e a lc h e m i c a l a t t a c k , o n e b a s e h i t p e r s t r a n d , p r o d u c e s a r a t h e r e v e nd i s t r i b u t i o n o f l a b e l e d m a t e r i a l a c r o s s t h e s e q u e n c e . S e c o n d ,e a c h b a s e i s a t t a c k e d , s o t h a t i n a r u n o f a n y s i n g l e b a s e a l l t h o s ea r e d i s p l a y e d . T h e c h e m i c a l d i s t i n c t i o n b e t w e e n t h e d i f f e r e n tb a s e s i s c l e a r , a n d , a s i n o u r e x a m p l e , t h e s e q u e n c e o f b o t hs t r a n d s p r o v i d e s a m o r e - t h a n - a d e q u a t e c h e c k .We h a v e c h o s e n t h i s s p e c i f i c s e t o f c h e m i c a l r e a c t i o n s t op r o v i d e m o r e t h a n e n o u g h i n f o r m a t i o n f o r t h e s e q u e n c i n g . T h eT e c h n i q u e s s e c t i o n d e s c r i b e s a n o t h e r r e a c t i o n t h a t d i s p l a y s t h eG s a l o n e a s w e l l a s a n a l t e r n a t i v e r e a c t i o n f o r b r e a k i n g a t A s a n dC s . H o w e v e r , i t i s m o r e u s e f u l ' o - h a v e a s t r o n g G / w e a k A d i s -p l a y , i n w h i c h t h e r e i s g e n e r a l l y e n o u g h i n f o r m a t i o n t o d i s -t i n g u i s h b o t h t h e G s a n d t h e A s , t h a n j u s t a p u r e G p a t t e r n a l o n e ,b e c a u s e r e d u n d a n t i n f o r m a t i o n s e r v e s a s a c h e c k o n t h e i d e n -t i f i c a t i o n s . I n p r i n c i p l e , o n e c o u l d s e q u e n c e DN A w i t h t h r e ec h e m i c a l r e a c t i o n s , e a c h o f s i n g l e - b a s e s p e c i f i c i t y , u s i n g t h ea b s e n c e o f a b a n d t o i d e n t i f y t h e f o u r t h p o s i t i o n . T h i s w o u l db e a n o n r e d u n d a n t m e t h o d i n w h i c h e v e r y b i t o f i n f o r m a t i o nw a s r e q u i r e d . S u c h a n a p p r o a c h i s s u b j e c t t o c o n s i d e r a b l e e r r o r ,a n d a n y h e s i t a t i o n i n t h e c h e m i s t r y w o u l d b e m i s i n t e r p r e t e da s a d i f f e r e n t b a s e . F o r t h a t r e a s o n w e h a v e c h o s e n r e d u n d a n td i s p l a y s , w h i c h i n c r e a s e o n e ' s c o n f i d e n c e i n t h e s e q u e n c i n g .5 - M e t h y l c y t o s i n e a n d N 6 - m e t h y l a d e n i n e a r e o c c a s i o n a l l yf o u n d i n D N A . 5 - M e t h y l c y t o s i n e c a n b e r e c o g n i z e d b y o u rm e t h o d b e c a u s e t h e m e t h y l g r o u p i n t e r f e r e s w i t h t h e a c t i o n o fh y d r a z i n e [ t h y m i n e r e a c t s f a r m o r e s l o w l y t h a n d o e s u r a c i l ( 5 ) ] ;t h u s , a 5 - m e t h y l c y t o s i n e c l e a v a g e d o e s n o t a p p e a r i n t h e p a t -t e r n , p r o d u c i n g a g a p i n t h e s e q u e n c e o p p o s i t e a g u a n i n e ( o b -s e r v e d i n t h i s l a b o r a t o r y b y J . T o m i z a w a a n d H . O h m o r i ) .H o w e v e r , w e d o n o t e x p e c t t o r e c o g n i z e a n N 6 - m e t h y l a d e n i n e ;t h e g l y c o s i d i c b o n d s h o u l d n o t b e u n s t a b l e , a n d a n e a r l i e rm e t h y l a t i o n o f a d e n i n e a t t h e N 6 p o s i t i o n s h o u l d n o t p r e v e n tt h e l a t e r m e t h y l a t i o n a t N 3 .T h e s e m e t h o d s w o r k e q u a l l y w e l l o n d o u b l e - o r s i n g l e -

TECHNIQUES[ y - 3 2 P J A T P E x c h a n g e S y n t h e s i s ( 9 ) . T h e s p e c i f i c a c t i v i t yr o u t i n e l y a t t a i n s 1 2 0 0 C i / m m o l . D i a l y z e g l y c e r a l d e h y d e - 3 -p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e a g a i n s t 3 . 2 M a m m o n i u m s u l f a t e ,pH 8 / 5 0 mM T r i s - H C l , pH 8 / 1 0 mM m e r c a p t o e t h a n o l / 1 mME D T A / 0 . 1 mM N A D + ; a n d d i a l y z e 3 - p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e( A T P : 3 - p h o s p h o - D - g l y c e r a t e l - p h o s p h o t r a n s f e r a s e , EC 2 . 7 . 2 . 3 )a g a i n s t t h e s a m e s o l u t i o n m i n u s NAD+ ( e n z y m e s f r o m C a l -b i o c h e m ) . C o m b i n e 5 0 j A l o f t h e d i a l y z e d d e h y d r o g e n a s e a n d2 5 g l o f t h e d i a l y z e d k i n a s e , s e d i m e n t a t 1 2 , 0 0 0 X g , a n d r e -d i s s o l v e t h e p e l l e t i n 7 5 M l o f t w i c e - d i s t i l l e d w a t e r t o r e m o v ea m m o n i u m s u l f a t e . D i s s o l v e 2 5 m C i ( 2 . 7 n m o l ) o f H C l - f r e e ,

c a r r i e r - f r e e 3 2 p ; i n 5 0 , l o f 5 0 mM T r i s 1 H C l , pH 8 . 0 / 7 mMM g C l 2 / 0 . 1 mM EDTA/2 mM r e d u c e d g l u t a t h i o n e / l mMs o d i u m 3 - p h o s p h o g l y c e r a t e / 0 . 2 mM ATP ( 1 0 n m o l ) ; a d d 2 A lo f t h e d i a l y z e d , d e s a l t e d e n z y m e m i x t u r e , a n d a l l o w t o r e a c ta t 2 5 0 . F o l l o w t h e r e a c t i o n b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o nP E I c e l l u l o s e i n 0 . 7 5 M s o d i u m p h o s p h a t e , pH 3 . 5 , b y a u t o r a -d i o g r a p h y o f t h e p l a t e . At t h e p l a t e a u , u s u a l l y 3 0 m i n , a d d 2 5 0, u l o f t w i c e - d i s t i l l e d w a t e r a n d 5 , l o f 0 . 1 M E D T A , m i x , a n dh e a t a t 9 0 0 f o r S m i n t o i n a c t i v a t e t h e e n z y m e s . T h e n c h i l l , a d d7 0 0 M l o f 9 5 % e t h a n o l , m i x w e l l , a n d s t o r e a t - 2 0 . T h e t h e o -r e t i c a l l i m i t o f c o n v e r s i o n i s 7 9 % , a n d i f t h i s i s a c h i e v e d t h e[ k y - 3 2 P ] A T P w o u l d h a v e a s p e c i f i c a c t i v i t y n e a r 2 0 0 0 C i /m m o l .L a b e l i n g 5 ' E n d s . 5 ' - P h o s p h o r y l a t i o n ( 1 0 , 1 1 ) i n c l u d e s ah e a t - d e n a t u r a t i o n i n s p e r m i d i n e w h i c h i n c r e a s e s t h e y i e l d1 5 - f o l d w i t h f l u s h - e n d e d r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s . D i s s o l v e d e -p h o s p h o r y l a t e d DN A i n 7 5 , l o f 1 0 mM g l y c i n e . N a O H , pH9 . 5 / 1 mM s p e r m i d i n e / 0 . 1 mM E D T A ; h e a t a t 1 0 0 0 f o r 3 m i na n d c h i l l i n i c e w a t e r . T h e n a d d 1 0 A l o f 5 0 0 mM g l y c i n e -N a O H , pH 9 . 5 / 1 0 0 mM M g C l 2 / 5 0 mM d i t h i o t h r e i t o l , 1 0 m lo f [ , y - 3 2 P ] A T P ( 1 0 0 p m o l o r m o l a r e q u i v a l e n t o f DN A 5 ' e n d s ,1 0 0 0 C i / m m o l ) , a n d s e v e r a l u n i t s o f p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e t oa f i n a l v o l u m e o f 1 0 0 , l . H e a t a t 3 7 0 f o r 3 0 m i n ; a d d 1 0 0 M l o f4 M a m m o n i u m a c e t a t e , 2 0 , g o f t R N A , a n d 6 0 0 A l o f e t h a n o l ,m i x w e l l , c h i l l a t - 7 0 0 , c e n t r i f u g e a t 1 2 , 0 0 0 X g , r e m o v e t h es u p e r n a t a n t p h a s e , r i n s e t h e p e l l e t w i t h e t h a n o l , a n d d r y u n d e rv a c u u m .

5 6 1

7/29/2019 maxam and gilbert DNA sequencing

3/5

5 6 2 B i o c h e m i s t r y : Maxam a n d G i l b e r t

ORIGIN

* X C

SLOW

F A S T :J

F I G . 1 . S t r a n d s e p a r a t i o n o f a r e s t r i c t i o n f r a g m e n t : 1 . 5 j i g o f a6 4 - b a s e - p a i r DNA f r a g m e n t ( 7 5 p m o l o f 5 ' e n d s ) was p h o s p h o r y l a t e dw i t h [ y - 3 ' 2 P ] A T P ( 8 0 0 C i / m m o l ) a n d p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e , d e n a t u r e di n a l k a l i , l a y e r e d o n t o a 0 . 3 cmX3 cm s u r f a c e o f a n 8% p o l y a c r y l a m i d es l a b g e l ( s e e u n d e r T e c h n i q u e s ) , a n d e l e c t r o p h o r e s e d a t 2 0 0 V ( r e g -u l a t e d ) a n d 2 0 mA ( a v e r a g e ) , u n t i l t h e x y l e n e c y a n o l ( X C ) d y e moved9 cm . T h e g e l on o n e g l a s s p l a t e was t h e n t i g h t l y c o v e r e d w i t h S a r a nW r a p a n d e x p o s e d t o Kodak XR-5 x-ray f i l m f o r 1 0 m i n .L a b e l i n g 3 ' E n d s . To a d e n y l a t e w i t h [ a - 3 2 P J A T P a n d t e r -m i n a l t r a n s f e r a s e ( 1 2 ) , d i s s o l v e DNA i n 7 0 Ml o f 1 0 mM T r i s -H C I , pH 7 . 5 / 0 . 1 mM EDTA, h e a t a t 1 0 0 0 f o r 3 m i n , a n d c h i l la t 00 . T h e n a d d , i n o r d e r , 1 0 M l o f 1 . 0 M s o d i u m c a c o d y l a t e ( p H6 . 9 ) , 2 M l o f 5 0 mM C o C I 2 , m i x , 2 M i l o f 5 mM d i t h i o t h r e i t o l , 10

M l o f [ a - 3 2 P ] A T P ( 5 0 0 p m o l , 1 0 0 C i / m m o l ) , a n d s e v e r a l u n i t so f t e r m i n a l t r a n s f e r a s e t o a f i n a l v o l u m e o f 1 0 0 , M l . H e a t a t 3 7 0f o r s e v e r a l h o u r s , a d d 1 0 0 M l o f 4 M ammonium a c e t a t e , 2 0 , M go f t R N A , a n d 6 0 0 M l o f e t h a n o l , a n d p r e c i p i t a t e , c e n t r i f u g e ,r i n s e , a n d d r y t h e DN A as d e s c r i b e d a b o v e . D i s s o l v e t h e p e l l e ti n 4 0 A l o f 0 . 3 M NaOH/1 mM EDTA, h e a t a t 3 7 0 f o r 1 6 h r .a n d e i t h e r a d d g l y c e r o l a n d d y e s f o r s t r a n d s e p a r a t i o n o r neu-t r a l i z e , e t h a n o l p r e c i p i t a t e , a n d r e n a t u r e t h e DN A f o r secon-d a r y r e s t r i c t i o n c l e a v a g e .S t r a n d S e p a r a t i o n . D i s s o l v e t h e DN A i n 5 0 M l o f 0 . 3 MNaOH/10% g l y c e r o l / i mM E D T A / 0 . 0 5 % x y l e n e c y a n o l /0 . 0 5 % b r o m p h e n o l b l u e . L o a d on a 5 - 1 0 % a c r y l a m i d e /0 . 1 6 - 0 . 3 3 % b i s a c r y l a m i d e / 5 0 mM T r i s - b o r a t e , pH 8 . 3 / 1 mMEDTA g e l a n d e l e c t r o p h o r e s e . T h e c o n c e n t r a t i o n o f DN A en-t e r i n g t h e g e l i s c r i t i c a l a n d must b e m i n i m i z e d t o p r e v e n t re-n a t u r a t i o n . U s e t h i c k g e l s w i t h w i d e s l o t s ( 0 . 3 - t o 1 - c m - t h i c ks l a b s w i t h 3 - c m t o f u l l w i d t h s l o t s ) , a n d run c o o l ( a t 2 5 0 ) .G e l E l u t i o n . I n s e r t a n e x c i s e d s e g m e n t o f t h e g e l i n t o a 1 0 0 0M l ( b l u e ) E p p e n d o r f p i p e t t e t i p , p l u g g e d t i g h t l y w i t h s i l i c o n i z e d

g l a s s w o o l a n d h e a t - s e a l e d a t t h e p o i n t . G r i n d t h e g e l t o a p a s t ew i t h a s i l i c o n i z e d 5-mm g l a s s r o d , a d d 0 . 6 m l o f 0 . 5 M a m m o .n i u m a c e t a t e / 0 . 0 1 M m a g n e s i u m a c e t a t e / 0 . 1 % s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e / 0 . 1 mM EDTA ( a n d 5 0 g g o f t R N A c a r r i e r i f t h e DNAh a s a l r e a d y b e e n l a b e l e d ) ; s e a l w i t h P a r a f i l m a n d h o l d a t 3 7 Of o r 1 0 h r . C u t o f f t h e s e a l e d p o i n t , p u t t h e t i p i n a s i l i c o n i z e d1 0 X 7 5 mm t u b e , c e n t r i f u g e f o r a f e w m i n u t e s , r i n s e w i t h 0 . 2m l o f f r e s h g e l e l u t i o n s o l u t i o n , a n d a l c o h o l p r e c i p i t a t et w i c e .P a r t i a l M e t h y l a t i o n o f P u r i n e s . C o m b i n e 1 A l o f s o n i c a t e dc a r r i e r D N A , 1 0 m g / m l , w i t h 5 , A d o f 3 2 P - e n d - l a b e l e d DN A i n2 0 0 M l o f 5 0 mM s o d i u m c a c o d y l a t e , p H 8 . 0 / 1 0 mM M g C I 2 / 0 . 1mM E D T A . M i x a n d c h i l l i n i c e . A d d 1 g l o f 9 9 % ( 1 0 . 7 M ) d i -m e t h y l s u l f a t e , m i x , c a p , a n d h e a t a t 2 0 0 f o r 1 5 m i n . T o s t o pt h e r e a c t i o n , a d d 5 0 M l o f a s t o p s o l u t i o n ( 1 . 0 M m e r c a p t o e t h -a n o l / 1 . 0 M T r i s - a c e t a t e , pH 7 . 5 / 1 . 5 M s o d i u m a c e t a t e / 0 . 0 5 Mm a g n e s i u m a c e t a t e / 0 . 0 0 1 M E D T A ) , 1 m g / m l o f t R N A , a n dm i x . A d d 7 5 0 A l ( 3 v o l u m e s ) o f e t h a n o l , c h i l l , a n d s p i n .R e p r e c i p i t a t e f r o m 2 5 0 , u l o f 0 . 3 M s o d i u m a c e t a t e , r i n s e w i t ha l c o h o l , a n d d r y .S t r o n g G u a n i n e / W e a k A d e n i n e C l e a v a g e . D i s s o l v em e t h y l a t e d DN A i n 2 0 A l o f 1 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e , p H7 . 0 / 1 mM E D T A , a n d c o l l e c t t h e l i q u i d o n t h e b o t t o m o f t h e

t u b e w i t h a q u i c k l o w - s p e e d s p i n . C l o s e t h e t u b e a n d h e a t i n aw a t e r b a t h a t 9 0 0 f o r 1 5 m i n . C h i l l i n i c e a n d c o l l e c t t h e c o n -d e n s a t e w i t h a q u i c k l o w - s p e e d s p i n . A d d 2 , l o f 1 . 0 M N a O H ,m i x , a n d d r a w t h e l i q u i d u p i n t o t h e m i d d l e o f a p o i n t e d g l a s sc a p i l l a r y t u b e , s e a l w i t h a f l a m e , a n d h o l d a t 9 0 0 f o r 3 0 m i n .O p e n t h e c a p i l l a r y a n d e m p t y i n t o 2 0 A l o f u r e a - d y e m i x t u r e ,h e a t , a n d l a y e r o n t h e g e l .S t r o n g A d e n i n e / W e a k G u a n i n e C l e a v a g e . D i s s o l v em e t h y l a t e d DN A i n 2 0 , l o f d i s t i l l e d w a t e r . C h i l l t o 0 0 , a d d 5A l o f 0 . 5 M H C I , m i x , a n d k e e p t h e s a m p l e a t 0 0 i n i c e , m i x i n go c c a s i o n a l l y . A f t e r 2 h r . a d d 2 0 0 A l o f 0 . 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d7 5 0 , u l o f e t h a n o l , c h i l l , s p i n , r i n s e , a n d d r y . T h e n d i s s o l v e i n 1 0M l o f 0 . 1 M N a O H / l mM EDTA a n d h e a t a t 9 0 0 f o r 3 0 m i n i na s e a l e d c a p i l l a r y . A d d c o n t e n t s t o u r e a - d y e m i x t u r e , h e a t , a n d

l a y e r .An A l t e r n a t i v e G u a n i n e C l e a v a g e . D i s s o l v e m e t h y l a t e dDN A i n 2 0 g l o f f r e s h l y d i l u t e d 1 . 0 M p i p e r i d i n e . H e a t a t 9 0 0f o r 3 0 m i n i n a s e a l e d c a p i l l a r y . [ T h i s r e a c t i o n o p e n s 7 - M e Ga d j a c e n t t o t h e g l y c o s i d i c b o n d ( 1 3 ) , d i s p l a c e s t h e r i n g - o p e n e dp r o d u c t f r o m t h e s u g a r , a n d e l i m i n a t e s b o t h p h o s p h a t e s t oc l e a v e t h e DN A w h e r e v e r G w a s m e t h y l a t e d . ] R e t u r n t h ec o n t e n t s o f t h e c a p i l l a r y t o t h e r e a c t i o n t u b e , I y o p h i l i z e , w e tt h e r e s i d u e , a n d I y o p h i l i z e a g a i n . F i n a l l y , d i s s o l v e t h e l a s t r e s -i d u e i n 1 0 , M l o f 0 . 1 M N a O H / 1 mM EDTA a n d p r e p a r e f o r t h eg e l .A n A l t e r n a t i v e S t r o n g A d e n i n e / W e a k C y t o s i n e C l e a v a g e .C o m b i n e 2 0 , l o f 1 . 5 M N a O H / 1 mM EDTA w i t h 1 A l o f s o n -i c a t e d c a r r i e r DN A ( 1 0 m g / m l ) a n d 5 M o f . 3 2 P e n d - l a b e l e d

DNA, a n d h e a t a t 9 0 0 f o r 3 0 m i n i n a s e a l e d c a p i l l a r y . [ T h es t r o n g a l k a l i o p e n s t h e a d e n i n e a n d c y t o s i n e r i n g s ( 1 3 ) ; t h e n ,t h e r i n g - o p e n e d p r o d u c t s c a n b e d i s p l a c e d a n d p h o s p h a t e se l i m i n a t e d w i t h p i p e r i d i n e . ] R i n s e t h e c a p i l l a r y i n t o 1 0 0 , u l o f1 . 0 M s o d i u m a c e t a t e , a d d 5 , l o f tRNA ( 1 0 m g / m l ) , a d d 7 5 0M l o f e t h a n o l , c h i l l , s p i n , r i n s e , a n d d r y . D i s s o l v e t h e p e l l e t i n2 0 g l o f f r e s h l y d i l u t e d 1 . 0 M p i p e r i d i n e , a n d h e a t a t 9 0 0 f o r 3 0m i n i n a s e a l e d c a p i l l a r y . L y o p h i l i z e t w i c e , d i s s o l v e t h e l a s tr e s i d u e i n 1 0 M l o f 0 . 1 M NaOH/1 mM E D T A , a n d a d d u r e a -d y e m i x t u r e .C l e a v a g e a t T h y m i n e a n d C y t o s i n e . C o m b i n e 2 0 , u l o fd i s t i l l e d w a t e r , 1 M l o f s o n i c a t e d c a r r i e r DN A ( 1 0 m g / m l ) , a n d5 M l o f 3 2 P e n d - l a b e l e d D N A . M i x a n d c h i l l a t 0 0 . A d d 3 0 , M l o f

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 4 ( 1 9 7 7 )

7/29/2019 maxam and gilbert DNA sequencing

4/5

B i o c h e m i s t r y : Max am a n d G i l b e r tFAST STRAND

P r o c . N a t i . A c a d . S c i . US A 7 4 ( 1 9 7 7 )SLOW S T R A ND

A 'G G )A C C +T

- - .

A_. . . . _ C . . s s . . . .A'__ -O , ,, A

hN0G

A I G GA C C +T

GAGTGACGGCGAAAG

C

.--E h c - -T . . c F.T., dA. . . : ; : :A - .. T : - : . -T 3,

CAiC #Zal

- I - !"

C

A

A>GG'A C C+T-mT

-- -

C

C

AC

C*---G

A

F I G . 2 . A u t o r a d i o g r a p h o f a s e q u e n c i n g g e l o f t h e c o m p l e m e n t a r y s t r a n d s o f a 6 4 - b a s e - p a i r DN A f r a g m e n t . Tw o p a n e l s , e a c h w i t h f o u r r e -a c t i o n s , are s h o w n f o r e a c h s t r a n d ; c l e a v a g e s p r o x i m a l t o t h e 5 ' e n d are a t t h e b o t t o m on t h e l e f t . A s t r o n g b a n d i n t h e f i r s t c o l u m n w i t h a w e a k e rb a n d i n t h e s e c o n d a r i s e s f r o m an A; a s t r o n g b a n d i n t h e s e c o n d c o l u m n w i t h a w e a k e r b a n d i n t h e f i r s t i s a G ; a b a n d a p p e a r i n g i n b o t h t h e t h i r da n d f o u r t h c o l u m n s i s a C; a n d a b a n d o n l y i n t h e f o u r t h c o l u m n i s a T . To d e r i v e t h e sequence o f e a c h s t r a n d , b e g i n a t t h e b o t t o m o f t h e l e f tp a n e l a n d r e a d u p w a r d u n t i l t h e b a n d s a re n o t r e s o l v e d ; t h e n , p i c k up t h e p a t t e r n a t t h e b o t t o m o f t h e r i g h t p a n e l a n d c o n t i n u e u p w a r d . O n e - t e n t ho f e a c h s t r a n d , i s o l a t e d f r o m t h e g e l o f F i g . 1 , was u s e d f o r e a c h o f t h e b a s e - m o d i f i c a t i o n r e a c t i o n s . T h e d i m e t h y l s u l f a t e t r e a t m e n t was 5 0mMf o r 3 0 m i n t o r e a c t w i t h A a n d G ; h y d r a z i n e t r e a t m e n t was 1 8 M f o r 3 0 m i n t o r e a c t w i t h C a n d T a n d 1 8 M w i t h 2 M N a C l f o r 4 0 m i n t o c l e a v eC . A f t e r s t r a n d b r e a k a g e , h a l f o f t h e p r o d u c t s f r o m t h e f o u r r e a c t i o n s w ere l a y e r e d on a 1 . 5 X3 3 0 X4 0 0 mm e n a t u r i n g 20% p o l y a c r y l a m i d es l a b g e l , p r e - e l e c t r o p h o r e s e d a t 1 0 0 0 V f o r 2 h r . E l e c t r o p h o r e s i s a t 2 0 W ( c o n s t a n t p o w e r ) , 8 0 0 V ( a v e r a g e ) , a n d 2 5 m A ( a v e r a g e ) p r o c e e d e d u n t i lt h e x y l e n e c y a n o l d y e h a d m i g r a t e d h a l f w a y down t h e g e l . Then t h e r e s t o f t h e s a m p l e s were l a y e r e d a n d e l e c t r o p h o r e s i s was c o n t i n u e d u n t i lt h e new b r o m p h e n o l b l u e d y e m o v e d h a l f w a y d o w n . A u t o r a d i o g r a p h y o f t h e g e l f o r 8 h r p r o d u c e d t h e p a t t e r n s h o w n .9 5 % ( 3 0 M ) h y d r a z i n e * , m i x w e l l , a n d k e e p a t 00 f o r s e v e r a lm i n u t e s . C l o s e t h e t u b e a n d h e a t a t 2 0 0 f o r 1 5 m i n . A d d 2 0 0 A ]o f c o l d 0 . 3 M s o d i u m a c e t a t e / 0 . 0 1 M magnesium a c e t a t e / 0 . 1mM E D T A / 0 . 2 5 m g / m l t R N A , v o r t e x m i x , a d d 7 5 0 o f e t h -a n o l , c h i l l , s p i n , d i s s o l v e t h e p e l l e t i n 2 5 0 A l o f 0 . 3 M s o d i u ma c e t a t e , a d d 7 5 0 A l o f e t h a n o l , c h i l l , s p i n , r i n s e w i t h e t h a n o l , a n dd r y . D i s s o l v e t h e p e l l e t a n d r i n s e t h e w a l l s w i t h 2 0 ; A o f f r e s h l yd i l u t e d 0 . 5 M p i p e r i d i n e . H e a t f o r 3 0 m i n a t 9 0 0 i n a s e a l e dc a p i l l a r y . L y o p h i l i z e t w i c e , d i s s o l v e i n 10 M l o f 0 . 1 MNaOH/1mM EDTA, a d d u r e a - d y e m i x t u r e , h e a t , a n d l a y e r on g e l .C l e a v a g e a t C y t o s i n e . R e p l a c e t h e water i n t h e h y d r a z i n o -l y s i s r e a c t i o n m i x t u r e w i t h 2 0 M l o f 5 M N a C 1 , a n d i n c r e a s e t h er e a c t i o n t i m e t o 2 0 m i n . T h e f r e s h n e s s a n d th e c o n c e n t r a t i o no f t h e h y d r a z i n e are c r i t i c a l f o r b a s e - s p e c i f i c i t y .R e a c t i o n T i m e s . T h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s p r o v i d e a u n i -f o r m l y l a b e l e d s e t o f p a r t i a l p r o d u c t s o f c h a i n l e n g t h I t o 1 0 0 .T o d i s t r i b u t e t h e l a b e l over a s h o r t e r r e g i o n , i n c r e a s e t h e re -a c t i 6 n t i m e , a n d v i c e versa.* CA UTION: H y d r a z i n e i s a v o l a t i l e n e u r o t o x i n . D i s p e n s e w i t h care i n

a f u m e h o o d , a n d i n a c t i v a t e i t w i t h c o n c e n t r a t e d f e r r i c c h l o r i d e .

R e a c t i o n V e s s e l s . We us e 1 . 5 - m l E p p e n d o r f c o n i c a l p o l y -p r o p y l e n e t u b e s w i t h s n a p caps, t r e a t e d w i t h 5% ( v o l / v o l ) d i -m e t h y l d i c h l o r o s i l a n e i n C C 1 4 a n d r i n s e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r .A l c o h o l P r e c i p i t a t i o n , W a s h , a n d R i n s e . U n l e s s o t h e r w i s es p e c i f i e d , t h e i n i t i a l e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n i s f r o m 0 . 3 M s o d i u ma c e t a t e / 0 . 0 1 M m a g n e s i u m a c e t a t e / 0 . 1 mM E D T A , w i t h 5 0

j z g o f tRNA a s c a r r i e r . A d d 3 v o l u m e s o f e t h a n o l , ca p a n d i n v e r tt o m i x , c h i l l a t - 7 0 i n a D r y I c e - e t h a n o l b a t h f o r 5 m i n , a n d *s p i n i n t h e E p p e n d o r f 3 2 0 0 / 3 0 m i c r o c e n t r i f u g e a t 1 5 , 0 0 0 rpm( 1 2 , 0 0 0 X g ) f o r 5 m i n . R e p r e c i p i t a t e w i t h 0 . 3 M s o d i u m a c e t a t ea n d 3 v o l u m e s o f e t h a n o l , c h i l l , a n d s p i n . R i n s e t h e f i n a l p e l l e tw i t h 1 m l o f c o l d e t h a n o l , s p i n , a n d d r y i n a vacuum f o r s e v e r a lm i n u t e s .

G e l S a m p l e s . A l l s a m p l e s f o r s e q u e n c i n g g e l s are i n 1 0 or 2 0g l o f 0 . 1 M N a O H / 1 mM EDTA t o w h i c h i s a d d e d a n e q u a lv o l u m e o f 1 0 M u r e a / 0 . 0 5 % x y l e n e c y a n o l / 0 . 0 5 % b r o m p h e n o lb l u e . H e a t t h e s a m p l e a t 9 0 0 f o r 1 5 s e c , t h e n l a y e r on t h eg e l .S e q u e n c i n g G e l s . T h e s e a re c o m m o n l y s l a b s 1 . 5 mmX3 3 0mmX 4 0 0 mm i t h 1 8 s a m p l e w e l l s 1 0 mm e e p a n d 1 3 mm

5 6 3

7/29/2019 maxam and gilbert DNA sequencing

5/5

5 6 4 B i o c h e m i s t r y : Maxam a n d G i l b e r t- T _ i

TAATT

A

AC

CF I G . 3 . D e t a i l o f t h e sequence g e l . T h e f o u r l a n e s ar e ( f r o m l e f t

t o r i g h t ) A > G , G > A , C , C + T ; t he d o ts s h o w t h e p o s i t i o n o f t h eb r o m p h e n o l b l u e d y e m a r k e r , b e t w e e n f r a g m e n t s 9 a n d 1 0 l o n g .w i d e s e p a r a t e d b y 3 mm f i t t i n g on a 3 5 . 5 X 4 3 cmx - r a y f i l m ) .T h e y a re 2 0 % ( w t / v o l ) a c r y l a m i d e ( B i o - R a d ) / 0 . 6 7 % ( w t / v o l )m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e / 7 M u r e a / 5 0 mM T r i s - b o r a t e , pH8 . 3 / 1 mM EDTA/3 mM ammonium p e r s u l f a t e ; 3 0 0 m l o f g e ls o l u t i o n i s p o l y m e r i z e d w i t h TEMED w i t h i n 3 0 m i n ( g e n e r a l l y5 0 u l o f T E M E D ) . A g e t h e g e l a t l e a s t 1 0 h r b e f o r e u s i n g i t .E l e c t r o p h o r e s e w i t h some h e a t i n g ( 3 0 - 4 0 0 ) , t o h e l p k e e p t h eDNA d e n a t u r e d , b e t w e e n 8 0 0 a n d 1 2 0 0 V . L o a d s u c c e s s i v e l yw h e n e v e r t h e p r e v i o u s x y l e n e c y a n o l h a s m o v e d h a l f w a y d o w nt h e g e l . B r o m p h e n o l b l u e runs w i t h 1 0 - n u c l e o t i d e - l o n g f r a g -

m e n t s , x y l e n e c y a n o l w i t h 2 8 . W i t h t h r e e l o a d i n g s a t 0 , 1 2 , a n d2 4 h r , a 1 0 0 0 - V r u n f o r 3 6 h r p e r m i t s r e a d i n g more t h a n 1 0 0b a s e s . T o s e q u e n c e t h e f i r s t f e w b a s e s f r o m t h e l a b e l e d e n d , u s ea 2 5 % a c r y l a m i d e / 0 . 8 3 % b i s a c r y l a m i d e g e l i n t h e u s u a l u r e ab u f f e r a n d p r e - e l e c t r o p h o r e s e t h i s g e l f o r 2 h r a t 1 0 0 0 V .A u t o r a d i o g r a p h y . F r e e z e t h e g e l f o r a u t o r a d i o g r a p h y . R e -move o n e g l a s s p l a t e , w r a p t h e g e l a n d s u p p o r t i n g p l a t e w i t hS a r a n W r a p , a n d m a r k t h e p o s i t i o n s o f t h e d y e s w i t h 1 4 C - c o n _t a i n i n g i n k . P l a c e t h e g e l i n c o n t a c t w i t h f i l m i n a l i g h t - t i g h tx - r a y e x p o s u r e h o l d e r ( b a c k e d w i t h l e a d a n d a l u m i n u m ) a t- 2 0 u n d e r p r e s s u r e f r o m l e a d b r i c k s .S p e c i a l M a t e r i a l s . D i m e t h y l s u l f a t e ( 9 9 % ) w a s p u r c h a s e df r o m A l d r i c h C h e m i c a l C o . , h y d r a z i n e ( 9 5 % ) f r o m E a s t m a nO r g a n i c C h e m i c a l s , a n d p i p e r i d i n e ( 9 9 % ) f r o m F i s h e r S c i e n -t i f i c ; t h e s e were u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e o f G e n e r a l M e d i c a lS c i e n c e s , G r a n t GM 0 9 5 4 1 . W . G . i s a n A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y P r o -f e s s o r o f M o l e c u l a r B i o l o g y .1 . H a y w a r d , G . S . ( 1 9 7 2 ) V i r o l o g y 4 9 , 3 4 2 - 3 4 4 .2 . G i l b e r t , W . , M a x a m , A . & M i r z a b e k o v , A . ( 1 9 7 6 ) i n C o n t r o l o fR i b o s o m e S y n t h e s i s , e d s . K j e l d g a a r d , N . 0 . & M a a l o e , 0 .( M u n k s g a a r d , C o p e n h a g e n ) , p p . 1 3 9 - 1 4 8 .3 . L a w l e y , P . D . & B r o o k e s , P . ( 1 9 6 3 ) B i o c h e m . J . 8 9 , 1 2 7 - 1 2 84 . K r i e k , E . & E m m e l o t , P . ( 1 9 6 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 1 ,5 9 - 6 6 .5 . T e m p e r l i , A . , T u r l e r , H . , R u s t , P . , D a n o n , A . & C h a r g a f f , E .( 1 9 6 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 1 , 4 6 2 - 4 7 6 .6 . H a y e s , D . H . & H a y e s - B a r o n , F . ( 1 9 6 7 ) J . C h e m . S o c . , 1 5 2 8 -1 5 3 3 .7 . C a s h m o r e , A . R . & P e t e r s e n , G . B . ( 1 9 6 9 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a1 7 4 , 5 9 1 - 6 0 3 .8 . R o b e r t s , R . J . , M y e r s , P . A . , M o r r i s o n , A . & M u r r a y , K . ( 1 9 7 6 ) J .M o l . B i o l . 1 0 2 , 1 5 7 - 1 6 5 .9 . G l y n n , I . M . & C h a p p e l l , J . B . ( 1 9 6 4 ) B i o c h e m . J . 9 0 , 1 4 7 -1 4 9 .1 0 . v a n d e S a n d e , J . H . , K l e p p e , K . & K h o r a n a , H . G . ( 1 9 7 3 ) B i o -c h e m i s t r y 1 2 , 5 0 5 0 - 5 0 5 5 .1 1 . L i l l e h a u g , J . R . & K l e p p e , K . ( 1 9 7 5 ) B i o c h e m i s t r y 1 4 , 1 2 2 5 -1 2 2 9 .

1 2 . R o y c h o u d h u r y , R . , J a y , E . & W u , R . ( 1 9 7 6 ) N u c l e i c A c id s R e s .3 , 8 6 3 - 8 7 8 .1 3 . K o c h e t k o v , N . K . & B u d o v s k i i , E . I . ( 1 9 7 2 ) O r g a n i c C h e m i s t r yo f N u c l e i c A c i d s ( P l e n u m , New Y o r k ) , P a r t B , p p . 3 8 1 - 3 9 7 .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 4 ( 1 9 7 7 )