LAPORAN JURNAL

Possible Roles for Folic Acid in the Regulation of Trophoblast Invasion and Placental Development in Normal Early Human Pregnancy

SMF ILMU KEBIDANAN DAN PENYAKIT KANDUNGAN

RSUD PROF. DR. MARGONO SOEKARDJO

PURWOKERTO

2012

BAB I

Pendahuluan

A. Latar belakang

Salah satu kecacatan yang sering dijumpai pada bayi baru lahir adalah kecacatan dari

otak dan sumsum belakang yang dalam istilah kedokteran kita sebut sebagai anencephaly dan

spina bifida. Kedua kelainan/kecacatan tersebut terjadi karena tidak menutupnya tuba

neuralis (neural tube defect = NTD) yang salah satu penyebab utamanya adalah kekurangan

asam folat pada minggu-minggu pertama kehamilannya.

Asam folat merupakan bentuk sintesis dari folat, yang terlibat dalam beberapa fungsi

penting dalam tubuh, termasuk sintesis protein yang diperlukan untuk replikasi DNA dan

merupakan substrat penting untuk berbagai reaksi enzimatik yang diperlukan dalam sintesis

asam amino dan metabolisme vitamin, dengan demikian asam folat sangat penting dalam

proses pertumbuhan dan diferensiasi sel. Berkaitan dalam kehamilan, asam folat telah lama

diketahui berperan penting dalam mencegah defek pada neural tube. Asam folat juga

memiliki peran penting dalam beberapa fungsi fisiologis lainnya yang berkaitan pada

kehamilan yang normal, termasuk proliferasi sel, replikasi DNA, angiogenesis, dan

vaskulogenesis, perlindungan terhadap antioksidan, dan relaksasi endotel pembuluh darah.

Semua proses ini penting untuk sirkulasi fetoplasenta

Kekurangan asam folat pada ibu telah dikaitkan dengan keguguran, abrupsio plasenta,

gangguan pertumbuhan intrauterin. Pada wanita dengan preeklamsia juga ditemukan kadar

asam folat yg rendah pada sampel plasmanya. Meningkatkan asupan asam folat dan

memperpanjang periode pemberian suplemen asam folat, yang direkomendasikan pada

trimester pertama kehamilan, dapat berfungsi untuk mencegah preeklamsia dengan

mengoptimalkan perkembangan plasenta. Beberapa penelitian telah menunjukan pengaruh

pemberian suplemen asam folat pada sirkulasi uteroplasenta . Jika sirkulasi uteroplasenta

tidak adekuat, akan berkaitan dengan kecacatan perkembangan plasenta, baik dalam

penurunan jumlah spiral arteri di desidua dan miometrium yang menjadi

penyebab utama yang terjadi pada preeklampsia dan Intrauterine Growth Restriction

(IUGR). Pemberian suplemen asam folat jangka panjang juga dapat membantu memperbaiki

gejala sistemik sekunder dari preeklamsia karena efeknya terhadap fungsi endotel dan

perlindungan terhadap antioksidan.

B. Tujuan Penulisan

Tujuan penulisan ini adalah untuk mengetahui peran asam folat dalam kehamilan, khususnya

dalam regulasi perkembangan trofoblas plasenta.

BAB II

Tinjauan Pustaka

A. Asam Folat

Asam folat (bahasa Inggris: folic acid, folate, folacin, vitamin B9, vitamin BC, pteroyl-

L-glutamic acid, pteroyl-L-glutamate, pteroylmonoglutamic acid) adalah vitamin yang larut

air. Folat dan asam folat mendapatkan namanya dari kata latin folium (daun). Asam folat

sangat penting untuk berbagai fungsi tubuh mulai dari sintesis nukleotid ke remetilasi

homosistein. Vitamin ini terutama penting pada periode pembelahan dan pertumbuhan sel.

Anak-anak dan orang dewasa memerlukan asam folat untuk memproduksi sel darah merah

dan mencegah anemia.

Sayuran berdaun seperti bayam, lobak cina, kacang kering dan kacang polong, biji

bunga matahari serta buah-buahan dan sayuran tertentu seperti kentang, tomat, jeruk, adalah

sumber yang kaya akan folat. Telur, hati, dan produk-produk gandum juga termasuk bahan

makanan yang mengandung banyak asam folat. Asam folat sangat sensitif terhadap cahaya,

oksigen dan suhu tinggi. Karna itu disarankan untuk mengkonsumsi sayur yang mengandung

asam folat untuk dikonsumsi dalam bentuk mentah seperti di salad.

Asam folat, analog sintetis dari folat, terdapat diberbagai sel, dan terkait dengan

metabolisme dan regenerasi sel. Asam folat penting untuk pembentukan neuclic acid dan inti

sel. Kekurangan asam folat menyebabkan sintesa asam nukleat tidak adekuat sehingga

menyebabkan anemia megaloblastik (anemia pernisiosa). Hal ini disebabkan karena

kekurangan asam folat mengganggu sel yang mengalami proliferasi cepat. Asam Folat juga

sangat penting bagi wanita hamil. Asupan asam folat yang cukup sebelum dan selama

kehamilan akan mencegah timbulnya kecacatan tabung saraf (Neural Tube Defects) NTDs

pada bayi, yaitu spina bifida (kelainan pada tulang belakang) dan anencephaly (kelainan

dimana otak tidak terbentuk). Kebutuhan akan asam folat sampai 50-100 μg/hari pada wanita

normal dan 300-400 μg/hari pada wanita hamil sedangkan hamil kembar lebih besar lagi.

Hamil memerlukan pembelahan sel dalam perkembangan janin dan organ, ibu memerlukan

asam folat. Dengan asupan asam folat yang cukup pada masa sebelum dan selama kehamilan,

risiko timbulnya NTDs pada bayi dapat diturunkan hingga 80 %.

B. Fisiologi Trofoblas

Implantasi merupakan saat yang paling kritis untuk mendapatkan kehamilan. Proses

ini membutuhkan perkembangan yang sinkron antara hasil konsepsi, uterus, transformasi

endometrium menjadi desidua dan akhirnya pembentukan plasenta yang definitif. Aposisi

blastosis dengan endometrium terjadi pada hari ke 6 setelah fertilisasi. Sel-sel bagian luar

blastosis berproliforasi membentuk trofoblas primer. Trofoblas berproliferasi dan

berdiferensiasi menjadi 2 bentuk yaitu sitotrophoblas (sel mononuklear dengan batas sel yang

tegas) di bagian dalam dan sinsitiotrophoblas (sel multinuklear dengan batas sel yang tidak

tegas) di bagian luar. Proses yang terjadi pada sinsitiotrophoblas meluas melewati epitel

endometrium, untuk kemudian menginvasi stroma endometrium. Sel stroma di sekitar 

tempat implantasi, bentuknya berubah menjadi polihedral dan dikenal dengan sel desidua.

Sel desidua berdegenerasi pada daerah invasi dan memenuhi nutrisi untuk embrio yang

sedang berkembang. Sinsitiotrophoblas mengandung zat yang dapat menghancurkan jaringan

maternal dan memudahkan invasi ke endometrium dan miometrium, sehingga akhirnya

blastosis menancap secara sempurna dalam desidua. Proses implantasi sempurna pada hari ke

10 – 11 pasca ovulasi.

Pada hari ke 10-13 pasca ovulasi vakuola muncul dalam lapisan sinsitiotrophoblas.

Vakuola tumbuh dengan cepat dan bergabung membentuk satu lakuna, yang merupakan

prekursor pembentukan ruang intervili. Lakuna dipisahkan oleh pita trabekula, dimana dari

trabekula inilah nantinya villi berkembang. Pembentukan lakuna membagi trophoblas

kedalam 3 lapisan yaitu primary chorionic plate (sebelah dalam), sistim lakuna bersama 

trabekula dan trophoblastic shell (sebelah luar). Aktifitas invasif lapisan sinsitiotrophoblas

menyebabkan disintegrasi pembuluh darah endometrium (kapiler, arteriole dan arteria

spiralis). Kalau invasi terus berlanjut maka pembuluh darah – pembuluh darah ini dilubangi,

sehingga lakuna segera dipenuhi oleh darah ibu. Pada perkembangan selanjutnya lakuna yang

baru terbentuk bergabung dengan lakuna yang telah ada dan dengan demikian terjadi

sirkulasi intervillosa primitif. Peristiwa ini menandai terbentuknya “hemochorial” placenta,

dimana darah ibu secara langsung meliputi trophoblas.

Peningkatan proliferasi sinsitiotrophoblas diikuti dengan fusi sinsitium, akibatnya

trabekula yang tumbuh dan cabang-cabang sinsitium menonjol ke dalam lakuna

membentukvilli primer. Selain terjadi peningkatan dalam hal panjang dan diameter, villi

primer juga diinvasi oleh sitotrophoblas. Kedua proses ini menandai mulainya villous stage

dari perkembangan plasenta. Dengan proliferasi lebih lanjut  terbentuk percabangan villi

primer, yang merupakan awal pembentukan villi primitif dan pada saat yang bersamaan

sistem lakuna berubah menjadi ruang intervillus.

Sementara itu perkembangan jaringan mesenkim ektraembrional meluas sampai

kedalam villi sehingga terbentuk villi sekunder. Setelah angiogenesis terjadi dari inti

mesenkim in situ, villi yang terjadi dinamakan villi tertier. Bila pembuluh darah pada villi ini

telah berhubungan dengan pembuluh darah embrio, maka akan terciptalah sirkulasi

fetoplasenta yang komplit. Pada minggu-minggu selanjutnya terjadi maturasi dan

pertumbuhan lebih lanjut cabang-cabang villi dengan penanaman mesenkim pada cabang-

cabang baru yang diikuti oleh angiogenesis.

Invasi trofoblas diatur oleh pengaturan kadar hCG. Sinsiotrofoblas menghasilkan

hCG yang akan mengubah sitotrofoblas menyekresi hormon yang noninvasif. Trofoblas yang

semakin dekat dengan endometrium menghasilkan kadar hCG yang semakin rendah, dan

membuat trofoblas berdiferensiasi dalam sel-sel jangkar yang menghasilkan protein perekat

plasenta yaitu trophouteronectin. Trofoblas-trofoblas invasif lain yang melepas dan

bermigrasi ke dalam endometrium dan miometrium akan menghasilkan protease dan

inhibitor protease yang diduga memfasilitasi proses invasi ke dalam jaringan maternal.

Kelainan dalam optimalisasi aktivitas trofoblas dalam proses nidasi akan berlanjut

dengan berbagai penyakit dalam kehamilan. Apabila invasi trofoblas ke arteri spiralis

maternal lemah atau tedak terjadi, maka arus darah uteroplasenta rendah dan menimbulkan

sindrom preeklamsia. Kondisi ini juga akan menginduksi plasenta menyekresikan substansi

vasoaktif yang memicu hipertensi maternal. Kenaikan tekanan darah ibu dapat merusak arteri

spiralis dan tersumbat, sehingga menjadi infark plasenta. Sebaliknya, invasi trofoblas yang

tidak terkontrol akan menimbulkan penyakit trofoblas gestasional seperti mola hidatidosa dan

koriokarsinoma.

Pada perkembangan plasenta yang telah sempurna terdapat 2 sistim sirkulasi darah

yaitu sirkulasi uteroplasental (sirkulasi maternal) dan sirkulasi fetoplasental. Kedua sirkulasi

ini dipisahkan oleh membrana plasenta (placental berrier) yang terdiri dari lapisan

sinsitiotrophoblas, sitotrophoblas, membrana basalis, stroma villi dan endotel kapiler.

Sirkulasi uteroplasental yaitu sirkulasi darah ibu di ruang intervilus. Diperkirakan aliran

darah ini sebesar 500-600 ml permenit pada plasenta yang matur. Sirkulasi fetoplasental

adalah sirkulasi darah janin dalam villi-villi. Diperkirakan aliran darah ini sekitar 400 ml per

menit. Aliran darah ibu dan janin ini bersisian, tapi dalam arah yang berlawanan. Aliran

darah yang berlawanan ini (counter current flow) ini memudahkan pertukaran material antara

ibu dan janin.

C. METABOLISME METIONIN dan HOMOSISTEIN

Metionin adalah asam amino yang memiliki atom S. Asam amino ini penting dalam

sintesa protein (dalam proses transkripsi, yang menterjemahkan urutan basa Nitrogen di

DNA untuk membentuk RNA) karena kode untuk Metionin sama dengan kode awal untuk

satu rangkaian RNA. Asam amino ini bersifat esensial, sehingga harus dipasok dari bahan

pangan. Sumber utama Metionin adalah buah-buahan, daging (ikan), sayuran (Jagung,

kelapa), serta kacang-kacangan (kacang kedelai).

Homosistein (2 amino 4 mercaptobutanoic acid) merupakan asam amino yang

mengandung sulfur yang erat hubungannya dengan methionin dan sistein. Homosistein

dalam tubuh terutama berasal dari proses demetilasi methionin. Tahap pertama metabolisme

homosistein adalah pembentukan S adenosil metionin, yang merupakan donor metil

terpenting pada reaksi transmetilasi. Peningkatkan kadar SAMe  (S-adenosylmethionine),

mempunyai efek yang sangat kuat terhadap otak dengan cara yang berfungsi meningkatkan

kadar serotonin yang menenangkan. Untuk mengatasi depresi klinis dianjurkan mengonsumsi

0.8 mg sehari.

Dalam berbagai asupan methionin yang sangat bervariasi, kadar Homosistein dalam

tubuh dipertahankan dalam konsentrasi yang rendah sehingga tidak toksik terhadap sel.

Untuk menghindari penimbunan Homosistein dalam sel yang berakibat sitotoksik, tubuh

mengubah Homosistein menjadi metabolit yang tidak toksik dan mengeluarkan ke sirkulasi

darah untuk di oksidasi. Di dalam tubuh ada dua jalur metabolisme Homosistein yaitu

remetilasi dan transsulfurasi. Jalur remetilasi akan mengubah Homosistein kembali menjadi

methionin dengan bantuan asam folat dan vitamin B12 yang masing-masing sebagai koenzim

dan kosubstrat, sedangkan jalur transsulfurasi dengan bantuan vitamin B6 mengubah

Homosistein menjadi asam amino sistein yang tidak toksik untuk sel. Sistein yang terbentuk

dari homosistein ini akhirnya dirubah menjadi sulfat dan diekskresikan ke dalam urin. Jalur

remetilasi lebih aktif pada keadaan seseorang puasa, sedangkan jalur transsulfurasi lebih aktif

setelah penambahan methionin seperti makan tinggi protein. Untuk menurunkan kadar

Homosistein diperlukan asam folat, vitamin B12 dan Vitamin B 6. Menurut Homocysteine

Lowering Trialist Collaboration (HTLC) asam folat dapat menurunkan kadar homosistein

25%, B12 7% dan B6 tidak ada pengaruh yang signifikan.

Dalam keadaan normal homosistein dalam darah relatif sangat sedikit, dengan kadar

antara 5- 15 umol/L. Kadar homosistein di kompartemen ekstrasel ditentukan oleh beberapa

hal yaitu pembentukannya di dalam sel, metabolisme dan eksresinya. Bila produksi

homosistein intrasel melebihi kapasitas metabolisme, maka homosistein akan dilepaskan ke

ruang ekstrasel, sebaliknya bila produksi berkurang maka pelepasan dari sel akan berkurang.

Keadaan ini membantu mempertahankan agar kandungan homosistein intrasel tetap rendah.

Keseimbangan ini dapat terganggu pada keadaan gangguan aktivitas enzim atau akibat

jumlah kofaktor yang berperan dalam metabolismenya berkurang. Kekurangan asam folat

plasma menyebabkan tidak terjadi perubahan homosistein menjadi metionin yang

mengakibatkan terjadinya keadaan hiperhomosisteinemia.

Gambar 2.1. Siklus metionin dan jalur metabolisme homosistein.

D. ASAM FOLAT DALAM KEHAMILAN

Asam folat merupakan bentuk sintesis dari folat, yang terlibat dalam beberapa fungsi

penting dalam tubuh, termasuk sintesis protein yang diperlukan untuk replikasi DNA dan

merupakan substrat penting untuk berbagai reaksi enzimatik yang diperlukan dalam sintesis

asam amino dan metabolisme vitamin, dengan demikian asam folat sangat penting dalam

proses pertumbuhan dan diferensiasi sel. Berkaitan dalam kehamilan, asam folat telah lama

diketahui berperan penting dalam mencegah defek pada neural tube. Asam folat juga

memiliki peran penting dalam beberapa fungsi fisiologis lainnya yang berkaitan pada

kehamilan yang normal, termasuk angiogenesis, dan vaskulogenesis, metilasi dari

kontaminasi sulfur, perlindungan terhadap antioksidan, dan relaksasi endotel pembuluh

darah. Semua proses ini penting untuk sirkulasi fetoplasenta sehingga dapat mencegah

abrupsio plasenta, preeklamsia, dan IUGR.

Neural tube defect (NTD) merupakan kelainan bawaan pada otak, tulang kepala, dan

sumsum tulang belakang. Kelainan bawaan ini disebabkan oleh gangguan pembentukan

saluran saraf pusat pada periode organogenesis yaitu trisemester pertama kehamilan terutama

28 hari pascakonsepsi. Sepanjang kehamilan proliferasi sel tetap berlangsung dan kebutuhan

asam folat yang adekuat meningkat pada minggu-minggu pertama kehamilan setelah

konsepsi pada saat penutupan tabung saraf. Cacat tabung saraf (NTD) dapat muncul ketika

berbagai bagian dari tabung saraf gagal menutup yang mengakibatkan malformasi dalam

perkembangan otak dan tulang belakang. NTD yang dimaksud di sini adalah “isolated

NTD”, yaitu hanya NTD yang merupakan kelainan bawaan tanpa disertai kelainan lain.

Cacat penutupan tabung saraf terkait dengan kekurangan asam folat.

Tahap awal metabolisme homosistein melewati siklus metil aktif untuk menghasilkan

donor metil yang terpenting S-adenosylmethionine (SAMe). Donor ini penting dalam

berbagai proses kimia, seperti bahwa penghambatan transfer kelompok metil untuk DNA

telah terbukti menghasilkan cacat tabung saraf pada hewan model. Hal ini terbukti oleh fakta

bahwa penggunaan tertentu antagonis asam folat (FAA) selama kehamilan meningkatkan

risiko NTD itu. Ibu yang menggunakan FAA selama 2 bulan setelah periode menstruasi

terakhir, meliputi periode perkembangan neural tube, baik untuk pencegahan dan pengobatan

malaria selama kehamilan, memiliki risiko dua kali lipat lebih besar untuk menyebabkan

NTD.

Selain berperan dalam perkembangan tabung saraf janin, asam folat juga

berhubungan dengan kejadian preeklamsia. Pada wanita dengan preeklamsia juga ditemukan

kadar asam folat yg rendah pada sampel plasmanya. Meningkatkan asupan asam folat dan

memperpanjang periode pemberian suplemen asam folat, yang direkomendasikan pada

trimester pertama kehamilan, dapat berfungsi untuk mencegah preeklamsia dengan

mengoptimalkan perkembangan plasenta. Beberapa penelitian telah menunjukan pengaruh

pemberian suplemen asam folat pada trimester kedua kehamilan, dengan angka penurunan

kejadian preeklamsia. Pemberian suplemen asam folat jangka panjang juga dapat membantu

memperbaiki gejala sistemik sekunder dari preeklamsia karena efeknya terhadap fungsi

endotel dan perlindungan terhadap antioksidan.

Penyebab terjadinya preeklampsia sampai sekarang belum jelas, namun beberapa

teori disfungsi endotel telah terbukti merupakan titik telah diakui dapat menjelaskan

patogenesis presentral manifestasi klinik preeklampsia, di mana radikal bebas dan kerusakan

endotel, dan teori hiperhomosisteinemia merupakan salah satu penyebab keadaan tersebut.

Disfungsi endotel telah diakui sebagai titik sentral munculnya gejala dan tanda klinik

preeklampsia, yaitu hipertensi, edema dan proteinuria. Peningkatan radikal bebas dapat

menerangkan sebagian dari kerusakan tersebut di mana homosistein yang berlebihan dapat

menyebabkan meningkatnya radikal bebas. Nitric oxide (NO) merupakan salah satu petanda

penting pada kerusakan endotel, dimana kadarnya menurun pada preeklampsia. Pada wanita

preeklampsia kadar NO lebih rendah dan kadar homosisteinnya lebih tinggi dibandingkan

dengan wanita hamil normal. Sehingga dengan semakin tingginya kadar homosistein, yang

merupakan penyebab kerusakan endotel, maka akan terjadi penurunan NO yang merupakan

vasodilator yang kuat yang menyebabkan meningkatnya tekanan darah. Bukti-bukti

eksperimental menunjukkan adanya disfungsi endotel pada keadaan hiperhomosisteinemia,

diduga bahwa kelebihan homosistein tersebut juga menyebabkan terjadinya proses

otooksidasi yang menghasilkan gugus oksigen reaktif yaitu superoksida dan hidrogen

peroksida, di mana keadaan ini menyebabkan terjadinya kerusakan endotel.

Dalam sirkulasi fetoplasenta, asam folat juga berperan dalam proses invasi Ekstravili

Trofoblas (EVT). Plasenta membutuhkan invasi fetal yang berasal dari sel Ekstravili

Trofoblas (EVT) ke dalam arteri-arteri spiral pada uterus, mengubah arteri dari arteri dengan

resistensi tinggi dengan kapasitas rendah menjadi kapasitas tinggi yang dapat mengangkut

banyak darah menuju ruang intervilli. Proses invasi EVT membutuhkan degradasi dan

remodeling matriks ekstraseluler, yang terutama diperankan oleh Matriks Metaloproteinase

(MMPs), yang fungsinya diatur oleh inhibitor spesifik MMPs itu sendiri, yaitu Tissue

Inhibitors of MMPS (TIMPs). Antara umur kehamilan 8 sampai 12 minggu, penyambungan

trofoblas diakumulasi pada arteri spiral yang memungkinkan perfusi penuh antara trofoblas

dengan darah dari ibu dan pembentukan nutrisi hemotrofik. Perfusi mendadak vili plasenta

pada awal sirkulasi maternal-plasental telah dikaitkan dengan stress oksidatif, meskipun

plasenta dilindungi oleh beberapa enzim antioksidan. Asam folat juga memiliki aktivitas

antioksidan dan secara langsung mampu menangkap radikal bebas dan meningkatkan

bioavalibilitas dari nitrit oxide.

Untuk mendapatkan akses sirkulasi ke ibu, plasenta juga harus mengembangkan

sirkulasi sendiri. Sel endotel berdiferensiasi dari sel-sel mesenkim, membentuk kapiler

pertama dari kapiler pembuluh darah plasenta janin. Hal ini bertepatan dengan remodeling

vaskular ibu dan timbulnya aliran darah ibu ke dalam ruang plasenta intervili. Pengembangan

sirkulasi plasenta membutuhkan vaskulogenesis keduanya, perkembangan pembuluh darah

baru dari sel primitif dan angiogenesis, yang merupakan pengembangan dari pembuluh darah

yang sudah ada sebelumnya. Angiogenesis plasenta sangat penting untuk pengembangan

sirkulasi plasenta yang normal. Asam folat mampu menginduksi angiogenesis, dan sebagian

tergantung pada mekanisme nitrit oxide.

Gambar 2.2. mekasnisme asam folat dalam invasi EVT dan perkembangan plasenta

↑↑

induksiantioksidan

Tissue Inhibitors of MMPs (TIMPs)

Matrix Metalloproteinases(MMPs)

Degradasi & remodeling matriks ektraseluler

MMP2 &MMP3

(gelatinase)MMP9

(stromelysin)

Degradasi kolagen IV pada membran dasar

Degradasi proteoglikan, fibronektin, laminin,

kolagen IV

Invasi ekstravilli trofoblas (EVT)Plasenta ke desi duaa.spriralis

Pd minggu 8-12

Ubah arteri dgn resistensi tinggi kapasitas rendah resistensi rendah

kapasitas tinggi

Aliran darah menuju ruang intervilli

Perfusi penuh (mendadak)

Stress oksidatif

Vasculogenesis & angiogenesis

BAB III

METODOLOGI

A. BAHAN DAN METODE

Setelah mendapat persetujuan dari komite etik lokal dan dengan persetujuan

informasi yang sesuai, jaringan plasenta didapatkan dari wanita dengan usia kehamilan tujuh

minggu yang menjalani operasi elektif terminasi kehamilan. Usia kehamilan tujuh minggu

didapatkan dari hasil USG dengan cara pengukuran crown-rump length. Jaringan plasenta

diidentifikasi berdasarkan penampakan percabangannya serta bentuk bagian intinya

(fronded).

1. UJI INVASI

Pengaruh asam folat pada kemampuan EVT dari ekplan plasenta (usia kehamilan

minggu ke tujuh) untuk invasi melalui membran dasar Matrigel growth factor-reduced.

Vili korionik dipotong sekitar 0,5 mm dan di kultur pada media (Dulbecco modified Eage

medium (DMEM)):F12 ˂Biosource Camarillo CA˃ yang berisi 10% serum janin sapi

penisilin/streptomisin dan amphoterisin B (semua berasal dari Sigma Aldrich Dorset,

U.K.). Jaringan plasenta dibedah kemudian di kultur pada media 15 µl yang mengandung

10 mg jaringan. Menggunakan pipet 15 µl, diambil suspensi eksplan jaringan plasenta,

kemudian disebar pada permukaan kultur sel Matrigel-coated. Untuk menilai pengaruh

asam folat pada invasi EVT, asam folat eksogen ditambahkan pada media kultur

konsentrasi yang dipilih adalah konsentrasi dengan rentang fisiologis. Setiap ekperimen

dilakukan dengan duplikasi pada tiga plasenta terpisah. Tes diinkunbasi pada kondisi

standar kultur jaringan 37,8ºC, 5% CO2 (20% O2) pada inkubator. Pada hari keenam

inkubasi, Matrigel dan filter dipindahkan, dan bagian atas membran dibersihkan

menggunakan kapas. Untuk penilaian invasi sel, filter diwarnai dengan hematoxylin dan

eosin lalu dipasang pada slide kaca mikroskop dengan cairan mountain. Setiap slide

menjadi buta, dan jumlah total sel yang menginvasi bagian bawah filter dihitung dengan

P.J.W. pada perbesaran 100 kali untuk seluruh area filter.

Untuk menentukan apakah asam folat mengubah viabilitas sel trofoblas dan angka

(apoptosis dan proliferasi), pada akhir uji invasi, eksplan dipindahkan dan ditaruh pada

10% formalin selama 24 jam lalu diolah menjadi lilin paraffin. Seri 3 µm diberikan

immunolabeled menggunakan metode standar avidin-biotin peroxidase (Vector

Laboratories, Peterborough, U.K.) dengan anti-aktif kaspase 3 (pretreatment citrate

buffer, pH 6,0 dengan pemanasan pada microwave selama 10 menit, pengenceran 1:400

selama 45 menit; R D systems, Abingdon, Inggris), Mouse anti-MK167 (pretreatment

pressure cooking for 1 min in citrate buffer, pH 6,0, diencerkan 1:200 selama 30 menit;

Novocastra Laboratories, Newcastle-upon-tyne U.K.), dan anti CD31 (pretreatment

pressure cooking for 1 min in citrate buffer, pH 6,0, pengenceran 1:20 selama 60 menit;

Novocastra Laboratories). Pelabelan CD31 digunakan sebagai penanda angiogenesis.

Selain itu media dikumpulkan dari setiap ruang dan disimpan pada 80ºC sampai

diperlukan untuk dianalisis.

2. PROTEASE ARRAY

Konsentrasi MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP12,

MMP13 TIMP1, TIMP2, dan TIMP4 diuji pada media yang dikumpulkan setelah enam

hari dilakukan kultur eksplan, menggunakan Excel Array Human MMP/TIMP array kit

per the manufacturer’s instructions (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, U.K.) dan

seperti yang dijelaskan sebelumnya. Standar multipleks disiapkan sesuai instruksi pada

rentang 123 sampai 10000 pg/ml (MMPs 1, 3, , 8 9 10, 12, dan 13, dan TIMP4) dan 309

sampai 25000 pgml (MMP2, TIMP1, dan TIMP2). Sebanyak 100 µl sel kultur supernatan

diuji. Sampel dan kontrol diuji tiga kali. Microarray slide dilihat menggunakan Akson

GenePix slide scanner 4200AL (MDS Analitycal Technologies, Wokingham, English).

Data densitometry diimpor ke dalam Microsoft Excel.

3. QUANTIFICATION OF IMMUNOHISTOCHEMISTRY

Kuantifikasi MK167, aktif kaspase 3, dan CD31 immunostaining dilakukan

menggunakan perangkat lunak Algoritma Pixel Positif Aperio ImageScope. Perangkat

lunak ini mampu membedakan antara pixel positif dan negatif, fan menggabungkan

jumlah piksel positif, untuk menghasilkan pixel yang positif. Analisis eksplan plasenta

dilakukan pada semua uji. Untuk setiap konsentrasi asam folat, dihitung menggunakn

slide dan duplikasinya. Analisis dilakukan dengan perbesaran 200 kali dengan P.J.W.

dengan identitas sampel yang disamarkan.

B. STATISTICAL ANALYSIS

Semua analisa pada penelitian ini menggunakan SPSS versi 16,0. Uji Kolmogorov-

Smirnov digunakan untuk menilai distribusi data. Semuda data ditemukan tersdistribusi

secara normal. Oleh karena itu kelompok pembanding diuji dengan one-way ANOVA, jika

signifikan, lalu dilakukan uji Bonferronihoc post hoc. Konsentrasi efek yang berespon

ditentukan menggunakan Kendall s B Tes. Dianggap signifikan jika nilai P ¼ 0.005 pada uji

invasi dan immunohistokimia.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

1. Asam Folat Meningkatkan Invasi EVT

Kultur dalam asam folat menghasilkan peningkatan konsentrasi dependen dalam

rata-rata indeks invasi EVT (Gambar 4.1). Bila dibandingkan dengan kelompok kontrol,

inkubasi dengan asam folat pada konsentrasi 10-6 M meningkatkan invasi sebesar 83% (P

<0,0001), pada 10-8 M sebesar 51% (P <0,0001), dan pada 10-10 M sebesar 19 % (P =

0,01). Uji Kendall B menunjukkan peningkatan invasi EVT menjadi konsentrasi

tergantung (P = 0,005; Gambar 4.1).

Gambar 4.1. konsentrasi asam folat terhadap invasi EVT

2. Apoptosis sel Trofoblas dan Proliferasi kultur dalam Asam Folat

Seperti terlihat pada Gambar 4.2a, kultur eksplan plasenta dalam asam folat pada

10-6 M mengakibatkan peningkatan caspase 3 aktif dibandingkan dengan kelompok

kontrol, dengan pewarnaan yang terutama diamati pada sitotrofoblas vili dan sel stroma

vili (P = 0,028). Sebaliknya, kaspase 3 aktif menurun bila dibandingkan dengan kontrol

pada kultur dalam asam folat pada konsentrasi 10-8 M (P = 0,001) dan pada 10-10 M(P =

0,024).

Gambar 4.2. Gambaran Apoptosis sel Trofoblas dan Proliferasi kultur dalam Asam

Folat

Pewarnaan MKI67-positif ini terutama ditemukan dalam vili sitotrofoblas pada

eksplan plasenta. Bila dibandingkan dengan kontrol, MKI67 positif berkurang pada

eksplan plasenta pada kultur di 10-6 M asam folat (P = 0,012). Namun, kultur dalam asam

folat pada 10-8 M menghasilkan Peningkatan MKI67 positif dibandingkan dengan kontrol

(P = 0,001), dan peningkatan MKI67 positif ini juga ditemukan pada kultur dengan asam

folat 10-10 M (P = 0,039 vs kontrol; Gambar 4.2b).

3. Perubahan di Pewarnaan CD31 pada kultur dengan Asam folat

Kepadatan pembuluh darah, sebagaimana ditentukan oleh CD31 immunostaining,

meningkat pada kultur dengan asam folat (Gambar 4.3a). Bila dibandingkan dengan

kontrol, kadar CD31 lebih tinggi pada eksplan plasenta pada kultur dengan asam folat

pada konsentrasi 10-6 M (P = 0,001), 10-8 M (P = 0,002), dan 10-10 M (P = 0,02) .

Selanjutnya, peningkatan ekspresi CD31 pada kultur dengan asam folat ditemukan

sebagai respon konsentrasi dependen (P = 0,05; Gambar 4.3b).

Gambar 4.3. Gambaran Perubahan di Pewarnaan CD31 pada kultur dengan Asam folat

4. Variasi Sekresi MMP / TIMP pada kultur dengan Asam folat

Kurva standar yang dihasilkan untuk semua hasil analisis mempunyai nilai R2

sebesar 0,97 atau di atas nya. Koefisien variasi untuk mengulangi rangkap tiga semua

kurang dari 10%. Tingkat terdeteksi MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10,

MMP12, MMP13, TIMP1, TIMP2, dan TIMP4 ditemukan dalam kultur eksplan plasenta

supernatan setelah inkubasi 6 hari pada asam folat pada konsentrasi 10-6 M, 10-8 M, dan

10-10 M (Gambar 4.4).

Gambar 4.4. efek kultur dalam asam folat pada konsentrasi 10-6 M, 10-8 M, dan 10-10 M terhadap sekresi MMPs and TIMPs oleh eksplan plasenta

pada hari ke 6 kultur

Konsentrasi MMP2 yang disekresikan oleh plasenta eksplan meningkat setelah

pemberian asam folat pada 10-6 M, 10-8 M, dan 10-10 M dengan cara konsentrasi-responsif

(P = 0,01). Pengaruh terbesar pada kultur sekresi MMP dengan asam folat terlihat pada

MMP3, yang menunjukkan peningkatan konsentrasi-responsif (P = 0,01) pada sekresi

oleh eksplan plasenta mengikuti kultur dalam asam folat pada konsentrasi 10 -6 M, 10-8 M,

dan 10-10 M. Sekresi MMP9 juga meningkat dengan cara yang konsentrasi dependen

setelah kultur dalam asam folat pada konsentrasi 10-6 M, 10-8 M, dan 10-10 M (P = 0,02).

Tingkat MMP1 berada jauh di bawah kisaran deteksi kit ExcelArray. Konsentrasi

tidak berbeda antara kontrol dan mereka diperlakukan dengan asam folat untuk MMP7,

MMP8, MMP10, MMP12, MMP13, TIMP1, TIMP2, dan TIMP4.

B. Pembahasan

Studi ini menunjukkan bahwa asam folat pada konsentrasi rendah mampu

meningkatkan invasi EVT dan plasenta sekresi MMP2, MMP3, dan MMP9. Selain itu, asam

folat menampilkan efek bifasik pada proliferasi eksplan plasenta dan apoptosis pada awal

kehamilan. Asam folat memiliki peranan penting dalam pengaturan invasi EVT, dan invasi

EVT merupakan bagian penting dari perkembangan plasenta. Invasi EVT ke dalam desidua

maternal dan sepertiga bagian dalam miometrium sangat penting untuk konversi dari arteri

spiralis ibu, yang memungkinkan pembentukan sirkulasi uteroplasenta . Jika EVT invasi

tidak adekuat, akan berkaitan dengan kecacatan perkembangan plasenta, baik dalam

penurunan jumlah spiral arteri di desidua dan miometrium , dan hal remodelling, terutama

dalam miometrium, hal ini diusulkan menjadi penyebab utama yang terjadi pada

preeklampsia dan IUGR.

Penambahan asam folat selama tahap awal kehamilan  bermanfaat untuk

meningkatkan invasi EVT, yang dapat bermanfaat dalam mencegah terjadinya gangguan saat

kehamilan yang berkaitan dengan invasi EVT tidak memadai. Memang, studi observasional

terakhir mengidentifikasi bahwa kelanjutan dari penambahan asam folat ke

dalam trimester kedua kehamilan berkaitan penurunan kejadian preeklampsia. Paparan

antagonis asam folat akan meningkatkan risiko abrupsio plasenta , restriksi pertumbuhan

intrauterin, dan kematian janin. Selanjutnya, pengobatan dengan obat antifolat metotreksat

pada kehamilan ektopik telah terbukti mengurangi pertumbuhan plasenta  dan EVT trofoblas

EVT karena kurangnya proliferasi, meskipun penggunaan nya harus hati-hati digunakan

ketika membandingkan kehamilan ektopik dan perkembangan plasenta normal.

CD31 memperjelas bahwa kultur dengan asam folat meningkatkan angiogenesis pada

eksplan plasenta. Angiogenesis plasenta sangat penting untuk pengembangan sirkulasi

fetoplasenta, sehingga memaksimalkan aliran darah seluruh plasenta. Dengan demikian, nilai

gizi dan pertukaran gas antara ibu dan bayinya akan terlaksana dengan baik. Pengamatan dari

densitas vaskuler dengan asam folat juga memberikan penjelasan yang melaporkan

penurunan densitas pembuluh darah pada preeklamsia dan IUGR saat pasokan asam folat

terbatas.  Namun diakui bahwa studi lebih lanjut diperlukan untuk lebih menggambarkan

keterlibatan asam folat dalam angiogenesis plasenta.

Peningkatan invasi EVT berhubungan dengan penambahan asam folat suplementasi

dapat dijelaskan dengan peningkatan produksi dari MMP2, MMP3 dan MMP9. Pentingnya

aktivitas MMP dalam invasi trofoblas telah dijelaskan sebelumnya. Peningkatan

produksi gelatinases (MMP2 dan MMP9) berkaitan dengan invasi EVT karena peningkatan

degradasi kolagen IV pada membran dasar memungkinkan peningkatan jumlah

sel EVT untuk menginvasi melalui desidua ibu. MMP3, juga dikenal sebagai stromelysin-

1, mungkin juga terlibat dalam invasi peningkatan EVT melalui degradasi dari

berbagai komponen matriks ekstraseluler, termasuk proteoglikan, fibronektin, laminin, dan

kolagen tipe IV, dan telah terbukti untuk hadir di seluruh kehamilan.

Meskipun penelitian ini tidak mendeteksi aktivitas MMP, kami menyarankan bahwa

peningkatan produksi MMP2, MMP3, dan MMP9 juga akan dikaitkan dengan meningkatnya

aktivitas dari enzim metalloproteinase, karena asam folat tidak ditemukan untuk mengubah

produksi TIMPs, yang mengatur aktivitas MMPs. Penggunaan dari zymography untuk

menentukan aktivitas MMP2, MMP3, dan MMP9 akan memungkinkan penilaian yang

lebih lengkap dari pengaruh asam folat pada aktivitas MMP.

Konsentrasi bifasik dependen merespon hal yang tidak terduga tentang proliferasi dan

apoptosis EVT. Konsentrasi mikromolar berkaitan dengan peningkatan apoptosis meningkat

dan pengurangan proliferasi  sedangkan kultur nanomolar konsentrasi menyebabkan

penurunan apoptosis dan proliferasi meningkat. Respon bifasik ini telah mencerminkan 

apoptosis dan proliferasi, menunjukkan bahwa ada keterlibatan jalur lain dalam merespon hal

ini.  sebelumnya telah dilaporkan bahwa pengurangan penyediaan  asam folat berkaitan

dengan peningkatan apoptosis plasenta.

Namun, studi menggunakan sampel sitotrofoblas yang  diperoleh dari  plasenta, dan

7 bulan kemudian terdapat jaringan dilaporkan di sini. Respon terhadap asam folat juga 

berbeda di jaringan awal nya mengikuti proses kelahiran dan persalinan. Selain itu,

penyimpanan asam folat yang habis selama kehamilan dapat mengubah respon plasenta. Ada

peningkatan minat dalam penggunaan mikronutrien dan vitamin suplementasi selama

kehamilan untuk memaksimalkan manfaat kesehatan bagi ibu dan bayi. Meskipun kesehatan

masyarakat merekomendasikan penggunaan asam folat prakonseptual suplementasi,

asupan makanan asam folat masih memadai dalam sekitar 13 juta orang Inggris. Namun,

sifat bifasik dari respon terhadap asam folat menekankan pentingnya evaluasi seksama

terhadap konsentrasi asam folat sebelum melakukan rencana penambahan, sebuah

masalah yang disorot dalam tinjauan Cochrane baru-baru ini mengenai penambahan

mikronutrien pada kehamilan.

Pemakaian asam folat dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari rekomendasi harian

saat ini yaitu 400 lg mungkin berbahaya. Hal ini berkaitan dengan perkembangan plasenta.

Sebuah laporan terakhir menunjukkan tingkat rata-rata folat serum menjadi 23,5 nmol /L

selama trimester pertama kehamilan antara wanita yang mengambil 400-lg suplemen asam

folat. Dalam penelitian ini, konsentrasi folat serum rata-rata berada dalam  10,8 M pada

kelompok perlakuan, yang meningkatkan proliferasi sel dan menurunkan apoptosis sel EVT.

Ekstrapolasi data awal menghasilkan efek suplementasi  dosis tinggi, tapi ini dalam setiap

kasus dikontraindikasikan karena risiko dari efek masking dari setiap kekurangan vitamin

B12. Sejalan dengan ini, terdapat  kontras laporan mengenai suplementasi asam folat dan

pengobatan kanker. Laporan terbaru telah menyoroti bahwa kebutuhan untuk membatasi

penambahan asam folat tidak lebih dari 400 lg, dibandingkan 1000 lg lebih sering diresepkan

untuk pasien kanker untuk membatasi proliferasi sel tumor . Sebaliknya, penambahan folat

dapat bertindak sebagai terapi ajuvan antiglioma karena perannya dalam metilasi DNA, serta

meningkatkan apoptosis dan penurunan proliferasi.

Kemungkinan keterbatasan dari penelitian ini adalah penggunaan sampel plasenta

yang diambil dari satu titik waktu kehamilan (7 minggu). Namun demikian, penggunaan

plasenta dari titik waktu yang sama memungkinkan penilaian  dengan lebih sedikit faktor

perancu, karena menggabungkan hasil dari sampel plasenta dari jangkauan yang lebih luas

pada saat awal kehamilan menyebabkan penafsiran yang tidak baik, karena kapasitas invasif

EVT selama 20 minggu pertama kehamilan telah terbukti yang berbeda. 

Selain itu kelemahan dari penelitian ini mungkin penggunaan eksplan plasenta

sebagai sumber EVT dan tidak mengisolasi populasi murni EVT menggunakan percoll

gradien. EVT yang dimurnikan tidak digunakan di penelitian masa sekarang studi karena 

hasil sel yang relatif rendah  diperoleh dengan menggunakan metode ini, yang akan

mengurangi  konsentrasi asam folat yang seharusnya dapat dinilai dalam setiap percobaan.

Namun, penelitian sebelumnya telah menegaskan fenotip dari sel yang menginvasi dari

eksplan plasenta adalah konsisten dengan populasi EVT.  Penelitian mendatang akan

menggunakan sampel plasenta dari sekuensial poin usia kehamilan dalam trimester pertama 

yang akan berguna dalam menentukan apakah efek asam folat pada penggunaan EVT 

berlaku lebih luas usia kehamilan, atau apakah itu khusus untuk 7 minggu kehamilan saja.

Kesimpulannya, penelitian ini menyoroti lebih jauh mengenai manfaat

perikonseptual dan penambahan asam folat yang merangsang peningkatan EVT invasi

melalui peningkatan sekresi MMP2, MMP3, dan MMP9, sebagaimana mengubah proliferasi

plasenta/ trofoblas  dan apoptosis, dan dua kali lipat meningkatkan densitas vaskuler. Semua

aspek memerlukan penyelidikan lebih lanjut untuk memungkinkan potensi suplementasi

asam folat  jangka panjang selama kehamilan sebagai alat mencegah dan/ atau mengurangi

gejala preeklampsia. Selanjutnya, respon bifasik dari sel plasenta untuk folat asam

menekankan perlunya monitor studi fungsional yang akan dilakukan sebelum pelaksanaan

percobaan.

BAB V

Kesimpulan

Selain berperan dalam pencegahan kecacatan neural tube , asam folat memiliki banyak

fungsi fisiologis, diantaranya yaitu sebagai proliferasi sel, replikasi DNA, dan perlindungan

terhadap antioksidan. Penelitian ini membuktikan adanya peran lain asam folat dalam kehamilan

nyaitu meningkatakan invasi ektravilli trofoblas (EVT). Bahan metode yang digunakan dalam

penelitian ini adalah Kultur dengan eksplan plasenta dilakukan menggunakan plasenta pada

kehamilan usia 7 minggu yang kemudian dilakukan kultur dengan asam folat pada konsentrasi

10-6 M, 10-8 M, and 10-10 M. Invasi Ekstravili trofoblas dinilai pada hari keenam pasca kultur,

eksplan digunakan untuk evaluasi proliferasi histoimunokimiawi (MK167) dan apoptosis

(kaspase 3 aktif). Selain itu array digunakan pada sel kultur supernantans untuk memeriksa

berbagai Matriks Metaloproteinase (MMPs) dan Tissue Inhibitor of MMps (TIMPs).

Asam folat meningkatkan invasi EVT pada model eksplan penelitian ini antara 83% dan

19% (P=0,005), hal ini berhubungan positif dengan peningkatan MK167 dan menurunkan enzim

aktif kaspase 3. Efek ini bergantung pada konsetrasi dan menunjukan respon bifasik. Selain itu

kultur asam folat meningkatkan densitas pada pembuluh darah yang dipengaruhi oleh anti CD31

immunostaining (P=0,05). Peningkatan invasi EVT berkorelasi dengan peningkatan sekresi

eksplan plasenta MMP2 (P=0,01), MMP3 (P=0,01), dan MMP9 (P=0,02). Penelitian ini

menunjukan bahwa asam folat sangat penting dalam tahap awal perkembangan plasenta

termasuk invasi EVT, angiogenesis, dan sekresi MMPs.

Daftar Pustaka

Committee on Genetics. 1999. Folic Acid for the Prevention of Neural Tube Defects Pediatrics.

104 (2).

Darmaja, I., dan Ketut Suwitra. 2006. Perbandingan Efektifitas Asam Folat Dosis Standar

Dengan Dosis Tinggi Terhadap Hiperhomosisteinemia Pada Gagal Ginjal Dengan

Hemodialisis Reguler. J Peny Dala. 92 (7)

Díaz S H., Martha M W, Carol L, dan Allen A M. 2002. Risk of Gestational Hypertension in

Relation to Folic Acid Supplementation during Pregnancy. American Journal of

Epidemiology. 156 (9).

Hanafiah, T. M. 2006. Perawatan Antenatal Dan Peranan Asam Folat Dalam Upaya

Meningkatkan Kesejahteraan Ibu Hamil Dan Janin. Medan, Universitas Sumatera Utara.

Helga V. Toriello, PhD, for the Professional Practice and Guidelines Committee. 2005. Folic

acid and neural tube defects. ACMG. 7 (4).

Jayakusuma, A., M.K. Karkata, K. Darmayasa, K. Gunung. 2007. Perbandingan Kadar Asam

Folat Pada Kehamilan Dengan Preeklampsia dan Kehamilan Normal. Maj Obstet Ginekol

Indones. 31(2).

Lawrence M., Peter M C., Karen G., Jacques J G., dan Bassam A N. 2000. Effect of Folic Acid

and Antioxidant Vitamins on Endothelial Dysfunction in Patients With Coronary Artery

Disease. Journal of the American College of Cardiology. 36 (3),

Philippe De Wals, et al. 2007. Reduction in Neural-Tube Defects after Folic Acid Fortification in

Canada. N Engl J Med. 357:135-42.

Pusparini. 2002. Homosistein Faktor Risiko Baru (Non Tradisional) Penyakit Kardiovaskuler. J

Kedokter Trisakti. .21 (1)

Williams PJ., Judith N B., Barbara A i., dan Fiona B P. 2011. Possible Roles for Folic Acid in

the Regulation of Trophoblast Invasion and Placental Development in Normal Early

Human Pregnancy. Biology of Reproduction. Vol 84, 1148–1153.