Isolasi dan Identifikasi Bakteri Indigenus pada Tepung Jagung Bisi 16 selama Proses

Fermentasi Spontan

Isolation and Identification of Indigenous Bacteria on Corn Flour Bisi 16 during

Spontaneous Fermentation Process

Andi Sukainah1)*, Eva Johannes 2), Reski Praja Putra 1) 1) Program Studi Pendidikan Teknologi Pertanian, Fakultas Teknik, Universitas Negeri

Makassar, Makassar, Indonesia 2) Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar, Indonesia

*Email Korespondensi :andisukainah@yahoo.com

ABSTRACT

Indigenous microbes are a group of microbes that are involved and discovered during the

spontaneous fermentation process of Corn flour Bisi 16. One type of bacteria involved and is

found during the spontaneous fermentation process of corn flour Bisi 16 is lactic acid bacteria

(LAB). However, apart from LAB, during the spontaneous fermentation process of corn flour

Bisi 16 was also found another type of bacteria. The purpose of this study was to isolate and

identify indigenous bacteria other than BAL involved in the spontaneous fermentation process

of Corn flour Bisi 16. Isolate obtained from the isolation stage will be identified its

morphological properties. The observed morphological properties are cell shape, Gram

staining, catalase test, and endospora staining. Subsequently, pure isolates will be analyzed

their genotypes using Polymerase Chain Reaction (PCR) method and 16S rRNA sequencing

analysis. The results showed that ASN9 and ASN11 isolates obtained during the spontaneous

fermentation process of corn meal had a white and round coloni shape. The ASN9 isolate on

the edges of the colony is rather gummy. Both isolates have rod-shaped cells, Gram (-),

catalase (+), and endospores (-). Results of the 16S rRNA sequencing analysis, both ASN9 and

ASN11 isolates, showed both isolates were genotypically similar to the Enterobacter cloacae

subsp. cloacae with a similarity rate of 98% (ASN9 isolates) and ASN11 isolates, ie 99%.

Keywords : corn flour, spontaneous fermentation, isolation, identification, Enterobacter

cloacae subsp. cloacae

ABSTRAK

Mikroba indigenus adalah kelompok mikroba yang terlibat dan ditemukan selama proses

fermentasi spontan tepung jagung Bisi 16. Salah satu jenis bakteri yang terlibat dan ditemukan

selama proses fermentasi spontan tepung jagung Bisi 16 adalah bakteri asam laktat (BAL).

Namun, selain BAL, selama proses fermentasi spontan tepung jagung Bisi 16 juga ditemukan

jenis bakteri lain. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri

indigenus selain BAL yang terlibat dalam proses fermentasi spontan tepung jagung Bisi 16.

Isolat yang diperoleh dari tahap isolasi diidentifikasi sifat morfologinya.Sifat morfologi yang

diamati adalah bentuk sel, pewarnaan Gram, uji katalase, dan pewarnaan

endospora.Selanjutnya, isolat murni dianalisis sifat genotifnya menggunakan metode

Polymerase Chain Reaction (PCR) dan analisis sekuensing 16S rRNA. Hasil penelitian

menunjukkan isolat ASN9 dan ASN11 yang diperoleh selama proses fermentasi spontan tepung

jagung memiliki bentuk koloni bulat dan berwarna putih. Isolat ASN9 pada bagian tepi koloni

agak berlendir.Kedua isolat memiliki sel yang berbentuk batang, Gram (-), katalase (+), dan

endospora (-). Hasil analisis sekuensing 16S rRNA, baik isolat ASN9 maupun ASN11,

menunjukkan kedua isolat memiliki kemiripan genotif dengan Enterobacter cloacae subsp.

cloacae dengan tingkat kemiripan 98% (isolat ASN9) dan isolat ASN11, yaitu 99%.

Kata Kunci :tepung jagung, fermentasi spontan, isolasi, identifikasi, Enterobacter cloacae

subsp. cloacae

PENDAHULUAN

Pemanfaatan jagung menjadi produk

pangan masih sangat rendah. Kondisi biji

jagung yang keras dengan bentuk biji yang

besar menyebabkan proses pengolahan

memerlukan waktu yang lebih lama. Oleh

karena itu, pengolahan jagungmenjadi

produk tepung jagung diperlukan. Jika

dibandingkan dengan jagung berbentuk biji,

tepung jagung akan lebih mudah

diaplikasikan menjadi produk pangan,

meskipun aplikasi tepung jagung sangat

tergantung pada sifat fisiko kimianya.

Sifat fisikokimia adalah salah satu

sifat yang berhubungan dengan viskositas dan

gelatinisasi tepung jagung selama proses

pemanasan, yaitu viskositas puncak dan

viskositas pasta panas, dimana parameter ini

menggambarkan kemampuan suatu granula

mengalami pengembangan maksimal pada

saat pemanasan (Zhang et al., 2013).

Breakdown viscosity atau perubahan pasta

panas adalah sifat fisiko kimia yang

menggambarkan ketahanan suatu granula

terhadap proses pemanasan dan perlakuan

mekanis selama proses pengolahan,

sedangkan parameter viskositas pasta dingin

dan setback adalah sifat fisiko kimia yang

menggambarkan kemampuan granula

melakukan retrogradasi selama pendinginan

(Alvani et al.,2012).

Tepung jagung sebagai pati alami

masih memiliki viskositas gel yang tidak

seragam, tidak tahan terhadap suhu tinggi,

tidak tahan pada kondisi asam, tidak tahan

pada perlakuan mekanis, memiliki kelarutan

yang terbatas, dan masih mudah mengalami

siniresis. Hal ini menyebabkan aplikasi

tepung jagung menjadi produk pangan masih

sangat terbatas, sehingga diperlukan suatu

usaha memodifikasi tepung jagung yang di

harapkan dapat memodifikasi sifat fisik

tepung jagung agar potensi aplikasinya

menjadi lebih besar.

Modifikasi karakteristik tepung

jagung dapat dilakukan dengan

fermentasi.Modifikasi tepung dengan

fermentasi sangat berpotensi untuk

dikembangkan karena biaya operasional yang

murah. Proses fermentasi didefinisikan

sebagai penguraian pati oleh enzim yang

dihasilkan oleh mikrorganisme pada suatu

substrat, sehingga fermentasi pati jagung

adalah penguraian pati jagung yang dilakukan

oleh enzim amilase dan amiloglukooksidase

yang dihasilkan oleh mikroba indigenus.

Proses degradasi pati sangat tergantung pada

komposisi amilosa dan amilopektin tepung

jagung yang juga berpengaruh terhadap

kinerja enzim, enzim amilase akan

mendegradasi lebih banyak pati dengan

kandungan amilosa tinggi (Shrestha et al.,

2012). Proses fermentasi jagung telah diteliti

oleh Cui et al. (2012) yang melaporkan

bahwa fermentasi tepung jagung dapat

meningkatkan kandungan protein dan asam

amino lisin yang selama ini menjadi faktor

penghambat dari tepung jagung.Zeng et al.

(2011)juga menemukan bahwa fermentasi

jagung dapat menurunkan total asam dari

jagung sehingga kualitas tepung jagung

menjadi lebih baik. Demikian halnya dengan

penemuan Mohiedeen et al. (2010), yang

menunjukkan bahwa proses fermentasi dapat

meningkatkan globulin dan albumim dari

tepung jagung.

Sukainah (2014) melaporkan hasil

penelitian ketiga jenis tepung jagung (jagung

BISI-2, pop dan srikandi) yang dimodifikasi

menggunakan fermentasi spontan

menyebabkanpenurunan nilai viskositas

puncak, viskositas balik, suhu awal dan suhu

puncak serta nilai entalphi tepung jagung.

Namun demikian, modifikasi tepung jagung

menggunakan metode fermentasi secara

spontan dianggap masih memiliki kelemahan

yaitu jenis mikroba yang hidup dapat

bervariasi dan sangat tergantung pada kondisi

dan lingkungan sehingga sulit dikendalikan.

Beberapa penelitian telah melaporkan bakteri

dominan yang terlibat selama proses

fermentasi spontan tepung jagung adalah dari

golongan bakteri asam laktat (BAL). Bakteri

asam laktat adalah jenis bakteri yang bersifat

menguntungkan dalam proses fermentasi dan

selalu terlibat dalam fermentasi secara

spontan karena bersifat indigenus. Bakteri

asam laktat mampu menghambat

pertumbuhan bakteri-bakteri patogen dan

pembusuk disebabkan bakteri ini mampu

menghasilkan beberapa senyawa anti bakteri

seperti bakteriosin, hidrogen peroksida, asam

lemak, reuterin, diasetil dan asam laktat.

Kajian penelitian mengenai

keterlibatan bakteri indigenus lain, selain

BAL, selama proses fermentasi spontan

tepung jagung masih jarang dilaporkan. Oleh

karena itu, penelitian ini lebih fokus pada

kajian keterlibatan bakteri indigenus lain

yang mungkin terlibat selama proses

fermentasi spontan. Tujuan penelitian ini

adalah untuk mengisolasi dan

mengidentifikasi bakteri indigenus selain

BAL yang terlibat dalam proses fermentasi

spontan tepung jagung Bisi 16.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan utama adalah jagung hibrida

Bisi 16 yang diperoleh dari Kabupaten

Jeneponto, Sulawesi Selatan.Media

pertumbuhan mikroba yang digunakan adalah

media PCA, media NA, dan media MRSA.

Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis

adalah air dan akuades, NaCl, etanol 95%,

minyak imersi, larutan kristal violet, alkohol

70%, spirtus, kapas, aluminium foil dan

larutan safranin.

Peralatan yang digunakan untuk

analisis meliputi blender, tabung reaksi, rak

tabung sentrifus, vorteks, hot plate, beaker

glass, labu ukur, penjepit (gegep), timbangan

analitik, gelas ukur, pipet volumetric, pipet

tetes, PCR (polymerase chain reaction), pH

meter, waterbath, Erlenmeyer, cawan

petri,inkubator, autoklaf, buret, mesin disc

mill tipe 9FZ-23 dan mesin penyosoh biji

jagung tipe PPK N 70.

Metode Penelitian

Isolasi dan Identifikasi Bakteri Indigenus

Biji jagung yang telah dibersihkan dari

kotoran dan biji cacat direndam selama 1 jam

pada suhu ruangan dengan perbandingan

jagung dan jumlah air 1 : 2 (b/v).

Selanjutnya, penyosohan biji jagung

dilakukan dengan menggunakan mesin

penyosoh tipe PPK N 70.Beras jagung yang

telah disosoh ditambahkan air yang telah

dimasak dengan perbandingan 1 : 2 (b/v)

difermentasi secara spontan selama 48 jam

menggunakan metode mikroaerofilik. Selama

proses fermentasi, cairan fermentasi

diinokulasikan ke dalam media pertumbuhan

PCA, NA, dan MRSA. Inokulasi dan analisis

dilakukan pada waktu fermentasi 24dan 48

jam.

Bakteri indigenus pada media

PCA,NA, dan MRSA diisolasi menggunakan

teknik goresan kuadran.Setelah diperoleh

isolat dengan koloni terpisah dilakukan

identifikasi sederhana yang terdiri dari tipikal

koloni, bentuk morfologi (kokus atau batang),

uji pewarnaan Gram (+/-), uji katalase, dan

uji pewarnaan Endospora.Setelah itu, isolat

murni yang diperolehdengan karakteristik

bukan BAL diuji sifat genotipnya (analisis

urutan DNA pengkode 16sRNA, amplifikasi

DNA pengkode 16sRNA, sekuensing DNA

pengkode 16sRNA).

Identifikasi Genotif Menggunakan PCR

dan Analisis Urutan DNA Pengkode 16S

rRNA

Identifikasi genotif kultur bakteri

dilakukan dengan mengekstrak DNA

pengkode 16S rRNA yang selanjutnya

diamplifikasi dan disekuensing. Isolat yang

akan dianalisis tergolong dalam kelompok

bakteri Gram negatif (-). Oleh karena itu,

ekstraksi DNA menggunakan metode GenAid

untuk ekstraksi DNA bakteri Gram negatif (-)

dengan Protocol Geneaid Presto TM Mini

gDNA Bacteria Kit. Sel kultur sebanyak 109

sel/ml disentrifugasi dengan kecepatan 14-

16.000 g selama 1 menit. Supernatan yang

terbentuk dibuang. Selanjutnya, pelet

ditambahkan 180 µl buffer GT dan divortex

sesekali. Supernatan ditambahkan 20 µl

proteinase K, divortex kembali hingga

tercampur, dan diinkubasi pada suhu 60ºC

selama 10 menit. Setelah inkubasi, supernatan

ditambahkan 200 µl buffer GB, divortex

sesekali, dan diinkubasi pada suhu 70ºC

selama 10 menit. Setelah itu, etanol absolut

sebanyak 200 µl ditambahkan, divortex

selama 10 detik, dimasukkan ke dalam kolom

GD, dan disentrifugasi dengan kecepatan 14-

16000 g selama 2 menit. Penampung kolom

GD diganti dengan yang baru. Proses

selanjutnya, buffer W1 sebanyak 400 µl

ditambahkan, disentrifugasi dengan

kecepatan 14-16.000 g selama 30 detik,

cairan yang terdapat di penampung kolom

GD dibuang. Selanjutnya, sampel

ditambahkan buffer W1 sebanyak 600 µl,

disentrifugasi dengan kecepatan 14-16.000 g

selama 30 detik, kolom GD dipindahkan ke

eppendorf steril, cairan yang terdapat di

penampung kolom GD dibuang kembali.

Sentifugasi dilakukan kembali selama 3 menit

untuk mengeringkan kolom GD. Tahap

selanjutnya, larutan EB 100 µl ditambahkan,

dilakukan pemindahan dari kolom GD ke

eppendorf baru, lalu disentrifugasi kembali

selama 30 detik dengan kecepatan 14-16.000

g. sampel DNA dihasilkan.

Amplifikasi DNA Pengkode 16S rRNA

dengan PCR

Reaksi amplifikasi sampel DNA

dilakukan dalam 0.2 ml tabung PCR. Setiap

tabung reaksi PCR ditambahkan dengan RBC

Taq (5 unit/ml) sebanyak 0.25 µL, 10 x buffer

Taq (mengandung Mg2+) sebanyak 5 µl,

dNTP 2.5 mM sebanyak 4 µl. Primer yang

digunakan adalah primer universal, yaitu 63F

(5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’)

dan 1387R (5’-

GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’), masing-

masing sebanyak 1.25 µl (20 pmol). Ekstrak

genom sebanyak 2.5 µl (100 ng) dan

ditambah ddH2O sampai volume menjadi 50

µl. Amplifikasi PCR dilakukan pada suhu

denaturasi awal 95ºC selama 5 menit,

penempelan primer pada suhu 94ºC selama

30 detik sebanyak 30 siklus, dan

perpanjangan pada suhu 50ºC selama 1 menit,

72ºC selama 2 menit, dan tahap akhir 72ºC

selama 2 menit. Produk PCR diambil dan

disimpan pada suhu 4ºC. Selanjutnya, produk

PCR (amplifikasi DNA sebanyak 5 µl)

dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa

1.5% dan larutan buffer TAE yang terendam

dalam tangki.Gel agarosa 1.5% dan larutan

buffer TAE terdiri dari 1.5 g serbuk agarosa

dan 100 ml buffer TAE dan 8 µl ethidium

bromide. Elektroforesis dijalankan selama 1

jam dengan tegangan konstan 100 Volt. Pita

DNA (gel yang terbentuk) diamati di bawah

sinar UV.

Analisis Urutan DNA Pengkode 16S rRNA

Sekuensing DNA pengkode 16S

rRNA dilakukan di Singapura.Analisis hasil

sekuensing dilakukan dengan program

BLASTN 2.5.1+, yaitu dengan mencocokkan

urutan nukleotida dari hasil sekuensing 16S

rRNA dengan data base yang tersedia pada

situs www.ncbi.nlm.nih.gov.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi dan Identifikasi Bakteri Indigenus

Hasil penelitian menunjukkan bahwa

mikroba indigenus yang terlibat selama

proses fermentasi spontan tepung jagung Bisi

16adalah kapang, khamir, bakteri, dan BAL.

Mikroba indigenus dominan dalam

fermentasi spontan tepung jagung Bisi 16

adalah BAL, sehingga selama fermentasi

terjadi perubahan nilai pH(semakin

asam)akibat kadar total asam semakin

meningkat seiring dengan interval waktu

fermentasi. BAL menghasilkan asam laktat

dan asam organik lainnya sebagai produk

metabolit utama.Data identifikasi kapang dan

khamir tidak ditampilkan.

Hasil identifikasi sederhanaterhadap 6

isolat bakteri indigenus yang telah diisolasi

menunjukkan ada dua isolat bakteri non BAL,

yaitu isolat ASN9 dan ASN11. Kedua bakteri

ini ditemukan terlibat selama proses

fermentasi tepung jagung Bisi 16 secara

spontan. Hasil identifikasi sederhana isolat

disajikan pada Tabel 1.

Kedua isolat termasuk dalam bakteri

Gram (-) yang memiliki sifat katalase

(+).Kedua isolat ini tidak termasuk dalam

golongan BAL, karena BAL termasuk dalam

kelompok bakteri Gram (+) dan katalase (-).

Isolat ASN9 diperoleh setelah fermentasi

spontan tepung jagung Bisi 16 berjalan

selama 24 jam, sedangkan isolat ASN11

diperoleh di waktu akhir fermentasi, yaitu 48

jam. Secara tipikal, kedua isolat bakteri ini

memiliki kemiripan, yaitu koloni bakteri

berwarna putih.Namun, isolat ASN9

memiliki karakteristik tepi permukaan yang

agak berlendir (bergetah). Oleh karena itu,

kedua isolat ini (ASN9 dan ASN11),

dianalisis lebih lanjut karakterisasi sifat

genotifnya agar diketahui spesies kedua jenis

isolat yang ditemukan..

Tabel 1. Identifikasi Sederhana Isolat Bakteri Indigenus non BAL dalam Fermentasi Spontan

Tepung Jagung

No Isolat Bakteri

Karakteristik

Gram Katalase Endospora Bentuk

Sel

Tipikal Koloni

1 ASN3 + - - Batang

pendek

Bulat berwarna

krem

2 ASN4 + - - Batang Bulat berwarna

krem

3 ASN5 + - - Batang

Bulat, koloni

besar berwarna

krem

4 ASN9 - + - Batang

Bulat berwarna

putih, bagian tepi

permukaan

berlendir

5 ASN11 - + - Batang Bulat berwarna

putih

6 ASN12 + - - Batang

pendek

Bulat berwarna

krem

Karakterisasi Genotif Bakteri Indigenus

non BAL

Karakterisasi sifat genotif bakteri

indigenus non BAL dilakukan menggunakan

DNA pengkode 16S rRNA. Primer yang

digunakan dalam proses amplifikasi DNA

adalah 63F (5’-

CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan

1387R (5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-

3’). Spesifisitas primer 63F dan 1387R telah

diuji secara sistematis dengan berbagai jenis

bakteri dansampel lingkungan, primer ini

lebih baik digunakan untuk amplifikasi gen

16S rRNA, baik secara ekologi dan studi

sistematis dibandingkan amplitude PCR yang

lebih umum digunakan (Marchesi et al.

1998). Hasil analisis sekuensing alignment

(pensejajaran) urutan basa DNA pengkode

16S rRNA isolat ASN9 disajikan pada

Gambar 1, sedangkan isolat ASN11 dapat

dilihat pada Gambar 2.

E. cloacae 11 AGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATG 70

ASN9 1015837 AGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATG 1015896

E. cloacae 71 GAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGG 130

ASN9 1015897 GAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGG 1015956

E. cloacae 131 GGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT 190

ASN9 1015957 GGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT 1016016

E. cloacae 191 AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA 250

ASN9 1016017 AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA 1016076

E. cloacae 251 CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGC 310

ASN9 1016077 CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGC 1016136

E. cloacae 311 AAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCA 370

ASN9 1016137 AAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCA 1016196

E. cloacae 371 GCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC 430

ASN9 1016197 GCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC 1016256

E. cloacae 431 ACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAAT 490

ASN9 1016257 ACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAAT 1016316

E. cloacae 491 TACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCA 550

ASN9 1016317 TACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCA 1016376

E. cloacae 551 ACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA 610

ASN9 1016377 ACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA 1016436

E. cloacae 611 GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG 670

ASN9 1016437 GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG 1016496

E. cloacae 671 GACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT 730

ASN9 1016497 GACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT 1016556

E. cloacae 731 AGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAG 790

ASN9 1016557 AGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAG 1016616

E. cloacae 791 CTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATT 850

ASN9 1016617 CTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATT 1016676

E. cloacae 851 GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCT 910

ASN9 1016677 GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCT 1016736

E. cloacae 911 TACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTG 970

ASN9 1016737 TACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTG 1016796

E. cloacae 971 AGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA 1030

ASN9 1016797 AGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA 1016856

E. cloacae 1031 ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGC 1090

ASN9 1016857 ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGC 1016916

E. cloacae 1091 CAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGG 1150

ASN9 1016917 CAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGG 1016976

E. cloacae 1151 GCTACCCACGTGCTACAATGGCGCATACAAAAAGAAGCGACCTCCCGAGAGCAAGCGGAC 1210

ASN9 1016977 GCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGAC 1017036

E. cloacae 1211 CTCATAAAGTGGGTCCTAATCCGGATTGGAATCTGCAACTCGACTCCCTGAAGTCGGAAT 1270

ASN9 1017037 CTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAAT 1017096

E. cloacae 1271 CCCTTGTAATCCTAAATCAAAATGCTCCGG-GAAAACCTTCC 1311

ASN9 1017097 CGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCC 1017138

Gambar 1. Alignment Urutan Basa DNA Pengkode 16S rRNA Isolat ASN9

Hasil analisis sekuensing isolat

ASN9 dan isolat ASN11 menunjukkan

terdapat 8 tipe kecocokan urutan basa DNA

dengan bakteri Enterobacter cloacaesubsp.

cloacae ATCC 13047, panjang untaian basa

DNA kedua isolat sebanyak 5314581. Isolat

ASN9 memiliki kesamaan untai basa DNA

dengan E. cloacae subsp. cloacae ATCC

13047 maksimal sebesar 2292 bits dan

minimal sebesar 2265 bits, sedangkan isolat

ASN11 maksimal 2302 bits dan minimal

2274 bits.

E. cloacae 13 AGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATG 72

ASN11 1015837AGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATG 1015896

E. cloacae 73 GAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGG 132

ASN11 1015897 GAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGG 1015956

E. cloacae 133 GGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT 192

ASN11 1015957 GGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT 1016016

E. cloacae 193 AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA 252

ASN11 1016017 AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA 1016076

E. cloacae 253 CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGC 312

ASN11 1016077 CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGC 1016136

E. cloacae 313 AAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCA 372

ASN11 1016137 AAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCA 1016196

E. cloacae 373 GCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC 432

ASN11 1016197 GCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC 1016256

E. cloacae 433 ACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAAT 492

ASN11 1016257 ACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAAT 1016316

E. cloacae 493 TACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCA 552

ASN11 1016317 TACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCA 1016376

E. cloacae 553 ACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA 612

ASN11 1016377 ACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA 1016436

E. cloacae 613 GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG 672

ASN11 1016437 GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG 1016496

E. cloacae 673 GACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT 732

ASN11 1016497 GACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT 1016556

E. cloacae 733 AGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAG 792

ASN11 1016557 AGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAG 1016616

E. cloacae 793 CTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATT 852

ASN11 1016617 CTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATT 1016676

E. cloacae 853 GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCT 912

ASN11 1016677 GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCT 1016736

E. cloacae 913 TACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTG 972

ASN11 1016737 TACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTG 1016796

E. cloacae 973 AGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA 1032

ASN11 1016797 AGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA 1016856

E. cloacae 1033 ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGC 1092

ASN11 1016857 ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGC 1016916

E. cloacae 1093 CAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGG 1152

ASN11 1016917 CAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGG 1016976

E. cloacae 1153 GCTACCCACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAAAAGCGACCTCCCGAGAACAAGCGGAC 1212

ASN11 1016977 GCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGAC 1017036

E. cloacae 1213 CTCATAAAGTGCGTCCTAATTCCGGATTGGAATCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAA 1272

ASN11 1017037 CTCATAAAGTGCGTCGTAG-TCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAA 1017095

E. cloacae 1273 TCCCTAGTAATCGGAAATCAGAAGGCTCCGG-GAA-ACGT-CCCG 1314

ASN11 1017096 TCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCG 1017140

Gambar 2. Alignment Urutan Basa DNA Pengkode 16S rRNA Isolat ASN9

Hasil identifikasi analisis sekuen

DNA 16S rRNA menggunakan program

BLASTN 2.5.1 + disajikan pada Tabel 2.

Identifikasi sekuen untai DNA menunjukkan

isolat ASN9 memiliki tingkat kemiripan

dengan E. cloacae subsp. cloacae ATCC

13047, yaitu 98%, sedangkan isolat ASN11

memiliki tingkat kemiripan 99%.

Tabel 2. Hasil Analisis Sekuen DNA 16S rRNA Menggunakan Program BLASTN 2.5.1+

Isolat Deskripsi (Homolog) Skor

Maksimal

Skor

Total

Query

Cover

Nilai

E

Identifikasi Kode

Akses

ASN9

Enterobacter cloacae

subsp.cloacae ATCC

13047 kromosom,

genom

2292 18253 95% 0.0 98% NC

014121.1

ASN11

Enterobacter cloacae

subsp.cloacae ATCC

13047 kromosom,

2302 18325 95% 0.0 99% NC

014121.1

genom

Bakteri E. cloacae adalah bakteri

Gram (-) dan katalase (+), tergolong dalam

Enterobacteriaceae.BakteriE.

cloacaememiliki peranan hingga tahap akhir

waktu fermentasi, yaitu 48 jam. E. cloacae

adalah bakteri indigenus pada jagung Bisi 16

yang memiliki peranan penting. E.

cloacaediketahui sebagai salah satu bakteri

endofit pada jagung yang berfungsi untuk

menunjang pertumbuhan tanaman (Szilagyi-

Zecchin et al. 2015), karena Enterobacter,

khususnya E. cloacae, memiliki kemampuan

untuk menghambat pertumbuhan kapang

patogen dari genus Fusarium(Pereira et al.

2011), dan berpotensi sebagai inokulan

mikroba atau biofertilizer dalam produksi

tanaman jagung disebabkan bakteri ini

bersifat biosafety dan menguntungkan(Thanh

and Diep, 2014).

Keterlibatan E. cloacaedalam proses

fermentasi spontan juga telah dilaporkan

pada proses pengolahan produk Kenkey dan

Koko, yaitu suatu produk fermentasi spontan

berbahan dasar jagung di Ghana (Tamang et

al. 2016) dan Calugi yang merupakan salah

satu produk makanan tradisional di Brazil

yang terbuat dari jagung, singkong, dan

beras melalui proses fermentasi secara

spontan (Miguel et al. 2014).

Bakteri E. cloacae memiliki

ketahanan terhadap asam.Selama fermentasi

tepung jagung Bisi 16, nilai pH cairan

mengalami perubahan dari 5.88 menjadi 3.97

(akhir fermentasi). Fenomena ini

mengindikasikan E. cloacae dapat

berinteraksi dengan baik dengan BAL

(bakteri dominan)selama proses fermentasi

spontan tepung jagung Bisi 16. Menurut

Pérez-Díaz et al. (2013), E. cloacae tahan

terhadap lingkungan yang asam (pH rendah)

dan bergaram tinggi. Selain itu, Assohoun et

al. (2012), E. cloacae resisten terhadap

bakteriosin yang dihasilkan oleh beberapa

kultur bakteri asam laktat yang diisolasi

selama proses fermentasi doklu (produk

tradisional yang dihasilkan dari fermentasi

jagung di Afrika).

E. cloacae termasuk dalam golongan

Enterobacteriaceae. Umumnya,golongan

bakteri ini memiliki kemampuan

menghasilkan enterotoksin (bersifat patogen

pada manusia). Oleh karena itu, keamanan

bakteri ini perlu dipertimbangkan jika akan

dikembangkan sebagai kultur starter dalam

modifikasi tepung jagung.

E. cloacae yang telah dikembangkan

sebagai starter dalam proses pengolahan

makanan adalah E. cloacae GAO, bakteri ini

diisolasi dari cairan fermentasi spontan apel

(metode Laomien). Bakteri ini mampu

menghasilkan enzim β-galactosidase, enzim

yang berperan penting sebagai indikator

dalam pengawasan mutu makanan (Nagano

et al. 1992), meningkatkan produktivitas

hidrogen sehingga menghasilkan struktur

internal dan rasa produk yang lebih baik

(Tamura et al. 1995). Menurut Nagano et al.

(1994), E. cloacaeGAO dapat diaplikasikan

dan aman dimanfaatkan dalam pengolahan

produk makanan, karena E. cloacae yang

diisolasi dari tanaman tidak menghasilkan

enterotoksin yang tahan terhadap panas.

Nagano et al. (1988), E. cloacae tidak

menyebabkan terjadinya perubahan

pertumbuhan organ (hati, ginjal, dan limfa)

dan berat pada organ hewan uji, tidak

menyebabkan diare, dan tidak meningkatkan

respon imun (tidak bersifat infeksi).

Menurut Lokapirnasari et al. (2015),

bakteri E. cloacae WPL 214 menghasilkan

enzim selulase (endoglucanases,

exoglucanases, dan β-glucosidase). Enzim

selulase sangat berperan penting dalam

fermentasi tepung jagung, karena enzim ini

mampu menguraikan dinding sel pada

jagung, sehingga membantu proses

metabolisme mikroba indigenus lain dalam

memanfaatkan karbohidrat pada jagung Bisi

16 sebagai sumber energi. Oleh karena itu,

potensi E. cloacae sebagai starter dalam

modifikasi tepung jagung dengan metode

fermentasi sangat besar, sehingga kajian

lebih dalam mengenai karakteristik produk-

produk fermentasi yang dihasilkan oleh E.

cloacae yang diisolasi dari tepung jagung

fermentasi BISI 16 perlu ditingkatkan.

KESIMPULAN

Fermentasi tepung jagung BISI 16 secara

spontan tidak hanya melibatkan BAL,

namun juga melibatkan bakteri non BAL,

yaitu isolat ASN9 dan ASN11, dengan

karakteristik koloni berwarna putih, sel

berbentuk batang, Gram (-), katalase (+), dan

endospora (-). Sifat genotif berdasarkan

analisis sekuensing untaian DNA 16S rRNA

menunjukkan kedua isolat memiliki

kemiripan homolog dengan E. cloacae

subsp.cloacae ATCC 13047 yaitu 98%

(ASN9) dan 99% (ASN11).

DAFTAR PUSTAKA

Alvani, K., X. Qi., R.F Tester (2012).

Gelatinisation Properties of Native

and Annealed Potato Starches. Starch

- Stärke 64, 297-303.

Assohoun MCN, TN Djeni, FK N’Guessan,

M Koussemon. 2012. Preliminary

study on antimicrobial properties of

lactic acid bacteria involved in the

fermentation of corn dough during

doklu processing in Côte D’Ivoire.

Food, 6 : 65-70.

Cui, L., Li, D.-j., Liu, C.-q. (2012). Effect of

fermentation on the nutritive value of

maize. International Journal of Food

Science & Technology 47, 755-760.

Lokapirnasari WP, DS. Nazar, T. Nurhajati,

K. Supranianondo, AB. Yulianto.

2015. Production and assay of

cellulolytic enzyme activity of

Enterobacter cloacae WPL 214

isolated from bovine rumen fluid

waste of Surabaya abbatoir,

Indonesia. Veterinary World, Vol. 8 :

367-371.

Marchesi JR et al. 1998.Design and

evaluation of useful bacterium-

specificPCR primers that amplify

genes codingfor bacterial 16S rRNA.

Applied and Environmental

Microbiology, Vol. 64, No 2 : 795-

799

Miguel M.GdCP, CCAdA Santos, MRRM.

Santos, WF. Duarte, RF. Schwan.

2014. Bacterial dynamics and

chemical changes during the

spontaneous production of the

fermented porridge (Calugi) from

cassava and corn. African Journal of

Microbiology Research, Vol. 8(9) :

839-849.

Mohiedeen, I. E., A.H. El Tinay., A.E.O.

Elkhalifa., E.E. Babiker., L.O.

Mallasy. (2010). Effect of

fermentation and cooking on protein

quality of maize (Zea mays L.)

cultivars. International Journal of

Food Science & Technology 45 :

1284-1290.

Nagano H, M. Omori, Z. Shoji, S. Iibuchi,

M. Arai. 1994. Identification and

characteristics of microorganisms

isolated from traditional wheat flour

dough in Thailand. J.Home Econ.

Jpn, Vol. 45, No. 3 : 219-226.

Nagano H, M. Omori, Z. Shoji, T.

Kawaguchi, M. Arai. 1992.

Purification and characterization of

β-galactosidase from Enterobacter

cloacae GAO. Biosci. Biotech.

Biochem, 56 (4) : 674-675.

Nagano H, S. Kasuya, M. Omori, T. Yano,

Z. Shoji. 1988. The safety of

leavening bacterium (Enterobacter

cloacae GAO) in wheat flour food).

Agric. Biol. Chem, 52(5) : 1301-

1302.

Pereira P, F. Ibáňez, M. Rosenblueth, M.

Etcheverry, E. Martinez-Romero.

2011. Analysis of the bacterial

diversity associated with the roots of

maize (Zea mays L.) through culture-

dependent and culture-independent

methods. ISRN Ecology : 1-10.

Pérez-Díaz et al. 2013. Fermented and

Acidified Vegetables (Chapter 51) in

Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of

Food. APHA Press.

Shrestha, A.K., J. Blazek., B. M. Flanagan.,

S Dhital., O. Larroque., M. K.

Morelld., E. P. Gilbertc., M. J.

Gidleya. 2012. Molecular,

mesoscopic and microscopic

structure evolution during amylase

digestion of maize starch

granules.Carbohydrate Polymers 90 :

23–33

Sukainah A. 2014. Kajian Sifat Fisiko

Kimia Produk Antara Tepung

Jagung dan Potensi Aplikasinya.

Disertasi Ilmu Pertanian

Konsentrasi Teknologi Pangan,

Universitas Hasanuddin

Szilagyi-Zecchin et al. (2015). Potential

inoculant strains of Brazilian

endophytic bacteria for maize (Zea

mays L) growth promotion.

International Journal of Agronomy

and Agricultural Research (IJAAR),

Vol 7, No. 4 : 128-134.

Tamang JP, K. Watanabe, WH. Holzapfel.

2016. Review : diversity of

microorganisms in global fermented

foods and beverages. Front.

Microbiol, 7 : 377

Tamura A, H. Nagano, M. Omori, Z. Shoji,

S. Iibushi, M. Arai. 1995.

Improvement in hydrogen

productivity by a leavening

bacterium, Enterobacter cloacae

GAO, and its application to Mantou.

Biosci. Biotech. Biochem, 59 (11) :

2137-2139.

Thanh DTN, CN Diep. 2014. Isolation,

characterization and identification of

endophytic bacteria in maize (Zea

mays L) cultivated on acrisols of the

Southeast of Vietnam. American

Journal of Life Sciences, 2(4) : 224-

233.

Zeng, J., H. Gao., G. Li., X. Zhao (2011).

Characteristics of Corn Flour

Fermented by Some Lactobacillus

Species. In "Computing and

Intelligent Systems". Springer Berlin

Heidelberg Vol. 233 : 433-441..

Zhang, X., Q. Tong., W. Zhu., F. Ren

(2013). Pasting, rheological

properties and gelatinization kinetics

of tapioca starch with sucrose or

glucose. Journal of Food Engineering

114 : 255-261.