TEMA 5 LOS LEUCOCITOS II LOS LEUCOCITOS II 4. LINFOCITOS 4.1 LINFOPOYESIS 4.2 ESTRUCTURA 4.3 FUNCIÓN: POBLACIONES LINFOCITARIAS 4.3.1 LINFOCITOS B 4.3.2 LINFOCITOS T.

� SUBPOBLACIONES de LINFOCITOS T 4.3.3 LINFOCITOS NULOS Ó DE TERCERA POBLACIÓN 5. MONOCITOS 5.1 MONOPOYESIS 5.2 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN

4. LINFOCITOS Representan un 20-40% de los leucocitos totales, en valores absolutos unos 1000-3000/mm3, 1- 3x 103/mm3 ó 1- 3x 109/ L 4.1. LINFOPOYESIS: A partir de la célula madre linfoide de la M.O, CFU-L, se van a formar células comprometidas o linfoides, PRE-T y PRE-B, que pueden denominarse también, pro/pre linfocitos. Estos tienen que diferenciarse para dar linfocitos maduros con capacidad funcional, es decir, con inmunocompetencia.

A lo largo de la vida de los linfocitos se producen dos procesos de maduración o diferenciación, estos son:

1º.- Maduración ó diferenciación en los órganos linfoides primarios o centrales, que son el Timo y la Medula ósea. Esta diferenciación es antígeno independiente, y se produce preferentemente en las primeras etapas de la vida.

En esta maduración, los linfocitos adquieren sus características estructurales y funcionales, siendo muy importante la aparición de moléculas en la membrana linfocitaria que se denominan <<marcadores de membrana>>, fundamentales para la función celular y utilizadas para la identificación celular. La tendencia es llamar a estos marcadores con una nomenclatura internacional que es “CD” que significa grupo de diferenciación, (Cluster of Differentiation), seguida de un número que identifica a un marcador concreto; entre éstos marcadores están los receptores para el Ag y muchas otras moléculas. 2º.- Maduración ó diferenciación en los órganos linfoides secundarios o periféricos, en los cuales tiene lugar una diferenciación antígeno dependiente. Los linfocitos T y B maduros se distribuyen por las áreas T y B de los órganos secundarios. Estos órganos son el bazo, los ganglios linfáticos, y el tejido linfoide disperso asociado a mucosas (MALT).

Los linfocitos recirculan entre las áreas de estos órganos, la linfa, la sangre y

los tejidos. Esta recirculación es mayor en los linfocitos T, ya que estos realizan una vigilancia inmunológica.

Podemos ver representada la “recirculación linfocitaria” en el siguiente esquema:

Al contacto con el Ag puede ocurrir que: ^ Los linfocitos B se diferencien para producir células plasmáticas que sintetizan las Inmunoglobulinas ó Anticuerpos. Realizan una Respuesta inmune humoral (RIH) mediada por Anticuerpos. ^ Los linfocitos T al contacto con al Ag proliferan y se diferencian en linfocitos T efectores que ejercen una función diferente según la subpoblación a la que pertenezcan (ver más adelante), así tendremos: linfocitos T citotóxicos (Tc), linfocitos T supresores (Ts) y linfocitos T helper (Th). Realizan una Respuesta inmune celular (RIC) mediada por células

4.2 ESTRUCTURA: El linfocito se puede encontrar en sangre periférica con distintos tamaños: Linfocitos pequeños ----------------------7-10 micras de diámetro Linfocitos medianos---------------------- 11-14 micras de “ Linfocitos grandes ------------------------15-18 micras de “ En cualquier caso su tamaño puede estar comprendido entre 7 y 15 micras, llegando incluso a 18 micras, en el caso de los linfocitos granulares grandes o linfocitos activados. ● Núcleo: Es redondeado, de cromatina densa y homogénea, y en general voluminoso en relación al tamaño de la célula. Nunca tiene nucleolos ( sólo podrían verse en linfocitos activados o atípicos) ● Citoplasma: Es escaso, en los linfocitos pequeños es prácticamente un anillo alrededor del núcleo, y algo más abundante en los linfocitos grandes.

Es ligeramente basófilo y en ocasiones puede contener escasas y finas granulaciones azurófilas pero poco evidentes a microscopía óptica.

Si hay una forma de linfocitos, los denominados “linfocitos granulares grandes” (LGL), que tienen la granulación azurófila evidente al microscopio óptico. Suele ser células que pertenecen a la población de linfocitos no B y no T, es decir linfocitos nulos o linfocitos de tercera población.

Los gránulos linfocitarios, en cualquier caso, no poseen enzima peroxidasa por lo que se considera a los linfocitos en general como células “peroxidasa negativas”. Esto es interesante porque se usa en la identificación de las células y de leucemias, para distinguirlas de las células mieloides que son peroxidasa positivas. Existe otra forma de linfocito que es el linfocito activado, el cual ha establecido contacto con un Ag y sufre un cambio de estructura y morfología, con aspecto más inmaduro, un aspecto linfoblastoide o linfoblástico. El tamaño se hace mayor, su morfología se hace irregular, con impactaciones de células próximas, el núcleo es grande, de cromatina laxa y puede tener nucleolos. Los autoanalizadores agrupan a estas células en una misma categoría, junto a blastos, linfoblastos y otros leucocitos no identificables. Esta categoría es denominada por los autoanalizadotes como células LUC (large unstained cells) y están incluidos: _ Linfocitos activados _ Otras células grandes sin actividad peroxidasa como grandes linfoblastos (de tipo leucémico), linfocitos de la mononucleosis infecciosa, incluso mieloblastos y tricoleucocitos (trico=pelo). Esta situación obliga a hacer un diagnostico diferencial para interpretar que el paciente tenga linfocitos activados o bien sufra una patología con linfoblastos o linfocitos atípicos. ● Membrana del linfocito: Posee una gran variedad de moléculas del tipo marcadores de membrana CD, estos marcadores se estudian en los linfocitos porque tienen una doble importancia, funcional para la célula: reconocimento del Ag, activación celular… y de identificación: para identificar y hacer recuento de poblaciones celulares . Para la identificación de estos marcadores se utilizan Ac altamente específicos, que en general, se denominan “Ac monoclonales” y van dirigidos contra el marcador a identificar. Estos Ac a su vez hay que marcarlos con alguna sustancia que los haga identificables, que puede ser por ejemplo fluorescente, como la fluoresceína y eso se hace empleando Ac anti-Ig marcados con fluoresceína y es lo que se utiliza para analizar las células con aparatos llamados CITÓMETROS DE FLUJO que utilizan los anticuerpos monoclonales por ejemplo para:

- Identificar y hacer recuento de poblaciones y subpoblaciones de linfocitos. - Identificar tipos de marcadores y por tanto de células hematológicas (linfoides

ó mieloides) que se presentan en las Leucemias, determinando a qué tipo pertenecen.

4.3. FUNCIÓN: POBLACIONES LINFOCITARIAS y SUBPOBLACIONES Los linfocitos son las células que realizan la Respuesta Inmune (RI), que es el mecanismo de defensa específico del organismo, aunque con ellos colaboran otras células como polinucleares, monocitos y macrófagos. Los linfocitos realizan una función u otra en la RI, según la población a la que pertenezcan. 4.3.1 # LINFOCITOS B # Representan del 15 al 20% de los linfocitos circulantes en sangre periférica. Poseen marcadores muy variados, entre los que destacan: _ Complejo receptor para el Ag de células B ó BCR: Incluye la Inmunoglobulina de superficie IgS que es la Ig que está en la membrana del linfocito B para unirse al antígeno y junto a ella, próximas en la membrana, otras moléculas accesorias que corresponden con los marcadores CD79 a y CD79 b ó alfa y beta, que colaboran en la transmisión de la señal antigénica al interior de la célula para que el linfocito se active. _ Marcadores de identificación: El CD19, CD20 y CD22, son los principales marcadores utilizados para identificar y hacer recuento de población B, pero principalmente el CD19. _ Otros marcadores….

La función de los linfocitos B es realizar la Respuesta Inmune Humoral (RIH) mediante la producción de Ac, se llama humoral porque los Ac son moléculas solubles en los “humores” del organismo entendiendo como Humores = las secreciones orgánicas como la sangre, la linfa, el líquido intersticial. Esta respuesta inmune es importante en: 1.-Producir reacción Antígeno-Anticuerpo en forma de Neutralización, precipitación ó aglutinación de Antígenos, para hacerlos mas fácilmente detectables por fagocitos para su destrucción. Es uno de los mecanismos de destrucción del Ag, por fagocitosis, en el que intervienen los Ac. 2.- En el marcaje de células ó de Ag para ser atacados por otros leucocitos, como linfocitos NK, ó por el complemento. Son los otros dos mecanismos de destrucción del Ag en que intervienen los Ac 3.- En la defensa, en general, contra antígenos extracelulares como es el caso de microorganismos extracelulares por ejemplo bacterias.

Ver en el esquema la intervención de Linfocitos ó Células B contra Ag extracelulares

como bacterias. Ver en el esquema la acción de los Ac activando a Fagocitos, Complemento y Células NK (más adelante las veremos) para destruir al Ag.

^^ Mecanismo de la RIH ^^ Al contacto de un Ag extraño con el receptor del linfocito B, se produce la activación del linfocito, el cual se transforma en un inmunoblasto B, esta célula entra en proliferación y diferenciación hasta formar células plasmáticas, que son los elementos diferenciados finales del linfocito B, especializados en la síntesis de inmunoglobulinas ó anticuerpos específicos para el antígeno. Como resultado de la proliferación, también se forman linfocitos B memoria, que son iguales al linfocito del que proceden, guardan memoria del Ag estimulante, y permanecen en la población linfocitaria ampliando el clon de linfocitos específicos para ese Ag. Por tanto los dos tipos de elementos finales producidos en cada respuesta son

� las células plasmáticas productoras de Anticuerpos específicos. � los linfocitos B memoria que amplían el clon de linfocitos.

Células plasmáticas: también denominados plasmocitos ó linfoplasmocitos. No se encuentran normalmente en sangre periférica, están en los órganos linfoides. Pueden salir a la periferia en las patologías, como el Mieloma múltiple que es un tumor de células plasmáticas, o en la leucemia de células plasmáticas. Su núcleo es de cromatina densa, (a veces distribuida en rueda de carro), es excéntrico y sin nucleolos.

El citoplasma es muy basófilo y con frecuencia tiene una zona clara junto al núcleo que corresponde al aparato de golgi y que también se denomina “arcoplasma”. El citoplasma posee una gran cantidad de retículo endoplasmico rugoso para el elevado ritmo de síntesis proteica que supone la producción de lo anticuerpos. A veces presenta vacuolas.

“VACUOLA” POR DILATACIÓN NÚCLEO EXCÉNTRICO DE CROMATINA DENSA DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO

ARCOPLASMA

MIELOMA MÚLTIPLE: PLASMOCITO CIRCULANTE 4.3.2 # LINFOCITOS T #

Representan un 60 -80 % de los linfocitos circulantes en sangre periférica. De los marcadores comunes a todos los linfocitos T, vamos a destacar los siguientes: *TCR: Que es el receptor para el Ag de células T y esta formado por dos cadenas polipeptídicas .Existe en dos formas llamadas TCR1 y TCR2, el primero es abundante y tiene cadenas polipeptídicas � y β , y el segundo es menos abundante y tiene cadenas � y ζ. *CD3: Es un complejo de 5 cadenas polipeptídicas, situadas muy cerca del TCR y asociadas a él para funcionar como transmisor de la señal antígena al interior celular. Es el marcador utilizando para identificar a la población de linfocitos T totales. *CD2: Es un receptor para hematíes de carnero. Clásicamente ha servido para identificar linfocitos T, porque forman rosetas con hematíes de carnero, identificables a microscopia óptica, aunque ésta propiedad ya no se utiliza en el laboratorio de análisis clínicos. Interviene en la activación celular

En el esquema, a la izquierda se representan los principales marcadores presentes en

todos los linfocitos T, son comunes a toda la población de células T. A la derecha se representan los que presentan de forma característica las subpoblaciones que más adelante se van a detallar. Cada subpoblación tiene el marcador característico añadido a los que son comunes.

La función de los Linfocitos T de forma global es realizar la Respuesta Inmune

Celular, RIC. Esta respuesta es muy importante es los siguientes procesos: 1.- Defensa contra Antígenos intracelulares como los microorganismos intracelulares: virus, parásitos intracelulares y determinados tipos de bacterias como la Brucella y Mycobacterium (M.Tuberculosis). Los linfocitos destruyen directamente células infectadas por virus ó este tipo bacterias u otros microorganismos intracelulares. 2.-Defensa o lucha contra células tumorales: estas células expresan Antígenos-tumor-específicos en su superficie que pueden ser reconocidos por los linfocitos produciendo una respuesta inmune con la finalidad de destruir las células evitando el desarrollo del tumor. Son parte importante del control ó vigilancia antitumoral en el organismo. 3.- Reacciones frente a células trasplantadas: Interviniendo de forma importante en la reacción de rechazo de trasplantes. 4.- Reacciones de hipersensibilidad retardada o de tipo IV: es una reacción inmunológica de desarrollo lento que interviene en la producción de patologías como las alergias de contacto y los granulomas (lesiones nodulares inflamatorias)

^^ Mecanismo de la RIC ^^ En cada contacto con un Ag, los linfocitos T se transforman en inmunoblastos T, que

entran en proliferación y diferenciación hasta formar los dos tipos de elementos diferenciados finales de ésta respuesta : LinfocitosT efectores y Linfocitos T memoria,

Los efectores realizan cada uno su función, contra el antígeno ó reguladora, y los de memoria son aquellos que permanecen en la población linfocitaria ampliando el clon para ese Ag. Esto se produce en todos los linfocitos T que responden al Ag, en cada subpoblación.

*Ver esquemas anteriores de Respuesta inmune.

� ### SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T ###

Los linfocitos T no son una población homogénea sino que podemos distinguir subpoblaciones con marcadores, características y actividad funcional diferente. Se distinguen dos subpoblaciones básicas: *CD4+ (T4, CD4)���� Se denominan así porque poseen el marcador CD4 en su membrana. Funcionan como LINFOCITOS T AUXILIARES ó TH ó T HELPER, ó linf. cooperadores ó colaboradores. Realizan una función de regulación positiva de la respuesta inmune porque su función es favorecer la RI colaborando con los linfocitos B y T.

Tienen una importante actividad productora de interleucinas (linfoquinas o linfocinas), con actividad muy variada, como activación linfocitaria, reguladora de la hematopoyesis, de la inflamación, etc.… A veces se dividen en TH1 o TH2 según las interleucinas que producen y su especialización funcional. Ej.: Interleucina 2 ó IL-2 produce la activación de células T Interleucinas 4, 5, 6 ó IL-4, IL-5,IL-6 producen la activación de células B

En cada contacto con un Ag, los linfocitos TH se transforman en inmunoblastos T, que entran en proliferación y diferenciación hasta formar TH efectores y TH memoria; los de memoria son aquellos que permanecen en la población linfocitaria ampliando el clon para ese Ag.

Por ejemplo, en el SIDA existe una inmunodeficiencia que está en relación con la disminución de la subpoblación de linfocitos CD4. Ésta disminución en los CD4 es un criterio diagnóstico y además marca la evolución de la enfermedad. En estos pacientes es fundamental el recuento de ésta subpoblación (citometría de flujo) ya que marca criterios diagnósticos y terapéuticos.

*CD8+ (T8, CD 8)���� Se denominan así porque poseen el marcador CD8 en su membrana. Se incluyen en esta subpoblación dos clases de células:

_ LINFOCITOS Tc ó T CITOTOXICOS: Son efectores directos contra el Ag, células antigénicas por ejemplo células infectadas por virus, células tumorales, células trasplantadas. Destruyen estas células antigénicas por contacto y citotoxicidad _ LINFOCITOS Ts ó T SUPRESORES: Hacen una regulación negativa de la Respuesta Inmune, frenan la RI , tanto humoral como celular, y esto es importante para mantener un equilibrio en la respuesta.

Por ejemplo: el Lupus es una enfermedad Autoinmune en la que el paciente produce una gran cantidad de autoanticuerpos (contra las articulaciones, los vasos sanguíneos, el riñón, la piel etc...). En la base de la enfermedad está la disminución de linfocitos Tsupresores. Al no existir el control ó “freno” de la Respuesta inmune se produce un desequilibrio con un exceso de RI que lleva a producir exceso de anticuerpos, incluso ante estructuras propias, que conocemos como Autoinmunidad. En las respuestas de los CD8 al Ag también se forman inmunoblastos T y proliferación y diferenciación para formar CD8 efectores Tc y Ts y CD8 memoria Tc y Ts 4.3.3 # LINFOCITOS NULOS O DE TERCERA POBLACIÓN # Representan un 10-15%de linfocitos en SP, no presentan marcadores de superficie de células T ni B. Son linfocitos CD3 negativos (CD3 -) ya que no poseen ese marcador y para su identificación se utiliza generalmente el marcador CD16 o CD56 *CD56: en relación a la función celular son Moléculas de adherencia *CD16: en relación a la función celular. Participa en la activación del linfocito. A esta población pertenecen células NK (agresora natural o Natural killer) Tienen una función citotóxica y son efectores importantes: _ Contra células tumorales _ Contra células hematopoyéticas inmaduras _ Contra células infectadas por virus Su acción es mas inespecífica que la de los linfocitos Tc y reconocen el Ag en las células, pero el reconocimiento a diferencia del Tc no se realiza en asociación con moléculas del complejo mayor histocompatibilidad o Ag HLA Las células de esta población también realizan una función denominada Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA, ADCC) , que consiste en lisar ó destruir células diana

que están recubiertas de Anticuerpos. Estas células poseen receptores para el fragmento Fc de Ig. Algunos autores denominan a estas células que realizan esta actividad, células K (Killer) No se deben confundir con los Linfocitos Tc. La actividad CCDA es una de las tres formas que utilizan los anticuerpos para destruir los antígenos al final de la RIH. Fagocito --- Fagocitosis Ac + Complemento --- Lisis por C5-C9 ó Complejo de ataque a membranas(MAC) Células K ó NK --- Lisis por CCDA

� Resumen POBLACIONES y SUBPOBLACIONES de las células linfocitarias: � “FÓRMULA LINFOCITARIA”:

Marcador Célula % en SP CD3 T totales 60-80 % linfocitos CD4 · TH · 60-70 % de los T CD8 · T C/S · 25-30 % de los T CD19 B 15-20 % linfocitos CD16 No B y No T 10-15 % linfocitos

5. MONOCITOS 5.1. MONOPOYESIS:

Los monocitos comparten la misma célula comprometida que los neutrófilos, CFU-GM. A partir de esta célula se forma otra célula monopotencial monocítica. Dentro de esta línea, los elementos precursores son: CFU-GM � CFU-M � Monoblasto � Promonocito � Monocito En cuanto al monoblasto, no puede distinguirse morfológicamente del mieloblasto, sus características son muy similares. El promonocito es la primera célula con características verdaderamente reconocibles de la estirpe monocítica. Es grande, de 15 a 20 micras de diámetro, su núcleo es ovalado o indentado, a veces con una hendidura con forma de riñón y en ocasiones irregular. La cromatina es laxa y con nucleolos entre 2 y 5 visibles. Su citoplasma es abundante y basófilo, y pude contener finas granulaciones azurofilas, equivalentes a lisosomas. Esta célula experimenta dos mitosis, y madura dando lugar al monocito. 5.2 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN: ESTRUCTURA. Es la célula de mayor tamaño de sangre periférica, su diámetro varía entre 14 y 20 micras. _ Núcleo ���� Es voluminoso, redondeado u ovalado y con frecuencia tiene indentaciones, a veces hendiduras, y es muy característico el aspecto de la cromatina a modo de circunvoluciones cerebrales, aspecto similar al de un cerebro. Su cromatina es ligeramente condensada y no contiene nucleolos.

_ Citoplasma ���� Es abundante, de color basófilo claro (azul grisáceo) y contiene finas granulaciones azurófilas poco evidentes a microscopia óptica, que funcionan como lisosomas y contiene numerosas enzimas oxidativas e hidrolíticas, las cuales son empleadas en la fagocitosis. Es frecuente la presencia de vacuolas en el citoplasma, que se corresponden con fagosomas, fagolisosomas, característica de estas células fagocíticas. _ Membrana ���� Hay numeroso receptores y marcadores para opsoninas como receptores para el fragmento Fc y receptores para el C3b. También presentan otras numerosas moléculas. Es importante la presencia de Ag del tipo Ag HLA, que denominamos de “clase II” que son fundamentales para la respuesta inmune y en la actividad de ésta célula como presentadora de Ag a los linfocitos. FUNCIÓN Los monocitos en sangre periférica se distribuyen en un sector o “pool” circulante y otro marginal. Los monocitos circulantes constituyen de un 3 a un 10 % de todos los leucocitos, en cifras absolutas, unos 700/mm3 ó 0,7 x 109 /L En la circulación permanecen poco tiempo un promedio de 8 horas y luego pasan a los tejidos donde adoptan la forma de macrófagos o histiocitos. Esta fase hística dura largo tiempo, varios meses o incluso años.

Al conjunto de los monocitos sanguíneos y los macrófagos de los tejidos, se le denomina SMF ó SISTEMA MONONUCLEAR FAGOCÍTICO. (Otras denominaciones: SRE ó Sistema Retículo- Endotelial; SRH ó Sistema Retículo- Histiocitario)

La ACTIVIDAD FUNCIONAL de estas células es de defensa del organismo interviniendo mediante:

. el mecanismo de la Fagocitosis, la realiza con las mismas fases que en el caso del neutrófilo. . la Función secretora: La actividad funcional defensiva es importante en dos aspectos en los que el

monocito-macrófago participa:

A) DEFENSA INESPECIFICA DEL ORGANISMO: En la cual fagocita en general sustancias extrañas, de desecho, de reserva (hierro, vitaminas…), etc. En los mecanismos generales ó inespecíficos de defensa interviene en el proceso de Inflamación, de dos formas como refuerzo en el mecanismo de la inflamación aguda (con interleucinas, con leucotrienos….) y como células importantes en los focos de inflamación crónica. De la misma forma que el neutrófilo es típico de la inflamación aguda, el monocito macrófago es de la inflamación crónica. B) DEFENSA ESPECÍFICA DEL ORGANISMO: Colaboran con los linfocitos en la RI. Hay 3 formas importantes de colaborar: 1.- Como células que procesan y presentan Ag (CPA ó APC) 2.- Colaborando con los Ac en la destrucción de Ag, mediante la opsonización y fagocitosis. 3.- En la producción de interleucinas, muy importantes en la regulación de la respuesta inmune, como por ejemplo la IL-1 fundamental para la activación linfocitaria.