F(t) F()

Trasformata di Fourier

The NMR ExperimentThe NMR Experiment After the pulse is After the pulse is switched off, the switched off, the magnetization magnetization

precesses in the xy precesses in the xy plane and relaxes plane and relaxes to equilibriumto equilibrium

The current induced in a coil The current induced in a coil by the magnetization by the magnetization precessing in the xy plane is precessing in the xy plane is recorded. It is called FID.recorded. It is called FID.

zz

yy

xx

zz

yy

xx

zz

yy

xx

MM

BB11

90°90° tt

II

II

tt

2T

t

e

)(

2

1I

To have a spin transition, a To have a spin transition, a magnetic field Bmagnetic field B11 , oscillating , oscillating

in the range of in the range of radiofrequencies and radiofrequencies and

perpendicular to z, is applied perpendicular to z, is applied ((perturbing pulseperturbing pulse) )

The BThe B11 field creates field creates

coherence among the coherence among the spins (they all have spins (they all have

the same phase) and the same phase) and net net magnetizationmagnetization in in

the x,y plane is the x,y plane is createdcreated

FTrelax.

x90

Preparation Detection

x

y

z

x90 t2

0

dte)t(f)(F ti

FOURIER TRANSFORMATIONS

F()=(0)

F()=A(sin)/ centered at 0

F()=T2/1+(2T2)2 -i 2(T2)2/1+(2T2)20

F()=T2/1+(2T2)2 -i 2(T2)2/1+(2T2)20

F(t)=exp(-t/T2)

F(t)=exp(-t/T2)exp(i2A)

Why bother with FT?

FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function(deconvolution).

In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the

radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum)

The FT allows to determine the frequency content of a squared function

A “real” F.I.D.

Pulse!-y -y

-y -y

-y -y

-y-y

-y

y

The rotation of magnetization under the effect of 90° pulses according to the convention

of Ernst et al..

=-1/t =1/tt

Signal to noise

Signal to noiseScans S/N1 1.00 80 8.94 8 2.83 800 28.28 16 4.00

I parametri NMR

Il chemical shift

Le costanti di accoppiamento

La intensità dei segnali

Il rilassamento

Lezione 4

• Le costanti di accoppiamento

• Il rilassamento

Costanti di accoppiamento

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

2J

3J

3J

Accoppiamento scalare

13C 1H

Accoppiamento scalare

13C 1H

Accoppiamento scalare

1H 13C

S I

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare omonucleare

3J HNH2J HH

N

N

Importante

3J dipendono dall’angolo

diedro

INFORMAZIONE

STRUTTURALE IMPORTANTE

PER RISOLVERE LE STRUTTURE

Costanti di accoppiamento in sistemi uniformemente arricchiti

in 13C ed in 15N

Costanti di accoppiamento

The scheme of 1J scalar couplings

Rilassamento

T1 and T2

T2 describes the time evolution of magnetization in the xy plane, where

acquisition takes place.It can be observed directly in the FID

(linewidth)

T1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. This can only be observed if a final 90° pulse is

applied to rotate the magnetization from the z axis to the xy plane.

The intensity of the overall magnetization on the z axis is

related to the overall energy of the system . i.e. the populations of

ground and excited states

The intensity of the magnetization on the xy axis is related to the rate of dephasing

of the magnetization.

x

-y

z

B0

A Pulse x

E E

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

E E

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse

E E

Rilassamento

Il sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio

Rilassamento T1

La constante di velocità con cui la magnetizzazione ritorna all’equilibrio

T1

T1 describes the time evolution of magnetization in the z axis.

Related to the overall energy of the system

The populations of ground and excited states

x

-y

z

B0

A Pulse x

E E

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

B1

x

-y

z

B0

A Pulse x

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

receiver

x

-y

z

B0

A Pulse x

RilassamentoIl sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio

Rilassamento T2

La constante di velocità con cui la magnetizzazione scompare dal piano xy

My=exp(-t/T2)

T2

T2 describes the time evolution of magnetization in the XY plane.

In addition to the exchange of energy with the environment, nuclei exchange energy one with another. This does NOT

affect the energy of the system but contributes to relaxation

It can be observed directly in the FID (linewidth)

T2 is alwayes shorter or equal to T1.

zz

yyxx

zz

yyxx

zz

yyxx

MM

BB11

90°90° tt

II

II

tt

2T

t

e

)(

2

1I

The NMR spectrum The NMR spectrum

The Fourier Transform of The Fourier Transform of the the FIDFID provides the provides the NMR NMR spectrumspectrum

II 11

½ F½ Fmaxmax(())

12 T

FIDFID

SpectruSpectrumm

2T

t

II e)tisint(cos)t(f

22

2I1

2

T)(1

T)(F

Da ricordare

• La larghezza di riga di un segnale dipende dal valore del tempo di rilassamento T2. Tanto piu’ T2 é lungo, ovvero tanto piu’ il sistema impiega tempo per tornare allo stato di equilibrio, tanto piu’ la riga NMR é stretta.

• Una riga stretta permette al segnale di essere osservato con maggiore accuratezza

• INOLTRE……

Da ricordare

• Se un segnale ha un T2 molto piccolo, sarà impossibile osservare gli accoppiamenti scalari perché il sistema rilassa “durante” la osservazione dell ‘effetto.

Costante di accoppiamento scalareAccoppiamento scalare

2 spin sono accoppiati per effetto di una interazione elettronica, ovvero per effetto di un legame chimicoQuesti effetto è generalmente osservabile per nuclei che distano fino a 3 legami sigma.Il fenomeno dell’accoppiamento scalare si esprime attrvaerso una constante di accoppiamento JEs HN-H 3J = 3-10 Hz

LA costante di accoppiamento scalare ha come effetto la formazione di un doppietto.Ovvero ogni spin non appare come un singolo picco ma come un doppietto, le cui componenti sono separate in Hertz, dalla costante di accoppiamento

3-10 Hz

Accoppiamento scalare e rilassamento T2

La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T2.

In prima approssimazione, il T2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata.Piu’ la molecola è grande, piu’ il T2 è corto e piu’ i segnali sono larghi

In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto.In queste condizioni, l’accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili

Accoppiamento scalare

Accoppiamento dipolare

Accoppiamento dipolare

Reference experiment

Saturation of signal S e

Difference experiment

Accoppiamento dipolare

A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia

L’accoppiamento DIPOLARE ha a che vedere con il rilassamento lungo l’asse z, quindi con il rilassamento T1

Accoppiamento dipolare

A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia

Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che

sono vicino nello spazio

Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare

L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND)E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendentiPorta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici

L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE)E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loroPuo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

Through space AND throuhg bonds

Through space

Through bond