FACULTEIT GENEESKUNDE EN

GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2015 - 2016

Farmacologische eigenschappen en klinisch effect van de nieuwe P2Y12-receptor

inhibitoren als anti-aggregantia

Célestin ROYON

Promotor: Prof. Dr. Lefebvre R.

Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Deze pagina is niet beschikbaar omdat ze persoonsgegevens bevat.Universiteitsbibliotheek Gent, 2021.

This page is not available because it contains personal information.Ghent University, Library, 2021.

Inhoudsopgave Abstract ................................................................................................................................................... 1

Inleiding en doelstelling .......................................................................................................................... 1

Methode .................................................................................................................................................. 2

Resultaten ............................................................................................................................................... 2

1 Activatie en inhibitie van bloedplaatjes ........................................................................................... 2

1.1 Adhesie als eerste stap tot aggregatie ...................................................................................... 2

1.2 Activatie van bloedplaatjes ....................................................................................................... 5

1.3 Agonisten voor activatie ............................................................................................................ 8

1.4 Effecten van activatie .............................................................................................................. 12

1.5 Fysiologische controle van de hemostase ............................................................................... 14

1.6 Pathologische activiteit van bloedplaatjes .............................................................................. 14

1.7 Farmacologische inhibitie van bloedplaatjes .......................................................................... 15

2 Clopidogrel, de tweede generatie thiënopyridines ........................................................................ 19

2.1 Farmacokinetiek ...................................................................................................................... 19

2.2 Farmacodynamiek ................................................................................................................... 19

2.3 Klinisch effect .......................................................................................................................... 22

2.4 Interacties ................................................................................................................................ 23

2.5 Ongewenste effecten .............................................................................................................. 24

3 Ticagrelor, de nieuwe generatie P2Y12-receptor inhibitoren ......................................................... 25

3.1 Farmacokinetisch profiel van ticagrelor, een nieuwe P2Y12-receptor inhibitor ..................... 25

3.2 Farmacodynamisch profiel van ticagrelor ............................................................................... 27

3.3 Klinisch effect van ticagrelor ................................................................................................... 28

3.4 Interacties ................................................................................................................................ 32

3.5 Ongewenste effecten .............................................................................................................. 32

Discussie ................................................................................................................................................ 33

Conclusie ............................................................................................................................................... 33

Lijst met afkortingen ............................................................................................................................. 34

Literatuurlijst ......................................................................................................................................... 36

1

Abstract Clopidogrel en ticagrelor zijn beiden P2Y12-receptor inhibitoren. Clopidogrel is sinds 1997 op de markt, en sinds 2011 is ticagrelor op de markt gekomen.

De farmacokinetische, farmacodynamische en klinische eigenschappen van beide geneesmiddelen werden vergeleken. Clopidogrel is een prodrug en vereist metabole activatie alvorens het zijn effect kan uitoefenen. De actieve metaboliet gaat een irreversibele binding aan met de P2Y12-receptor. De klinische respons op behandeling met clopidogrel is erg variabel en moeilijk te voorspellen. Ticagrelor vereist geen metabole activatie en inhibeert de P2Y12-receptor door transiënte binding op de receptor.

Klinische studies toonden aan dat de overleving in het voordeel was van ticagrelor, in vergelijking met clopidogrel. De mate van plaatjesinhibitie en snelheid waarmee deze intreedt, is beter voor ticagrelor en het bloedingsrisico is niet verhoogd.

Inleiding en doelstelling Anti-aggregantia zijn medicamenten die de werking van de bloedplaatjes inhiberen. Anti-aggregerende therapie wordt toegepast ter preventie van thrombotische events bij patiënten met voorgeschiedenis van acuut coronair syndroom (8). Thrombotische events ontstaan door activatie van bloedplaatjes met thrombusvorming tot gevolg. Thrombusvorming bestaat uit opeenvolgende processen: adhesie, activatie, aggregatie en plugvorming. De primaire functie van bloedplaatjes is thrombusvorming, een fysiologisch proces om bloedingen te stelpen (1). Bloedplaatjes zijn kleine, kernloze, afgesnoerde celfragmenten van de megakaryocyten. De megakaryocyten bevinden zich in het beenmerg en daar worden de bloedplaatjes in de circulatie gebracht (4). De bloedplaatjes overleven 8 tot 10 dagen in de circulatie (8). Hun cytoplasmatische structuren omvatten het dens tubular system (DTS), een cytoskelet opgebouwd uit actine, mitochondriën en verschillende granules, onder andere α-granules, dense granules, peroxisomen en lysosomen (8).

Door hun specifieke morfologie en de inhoud van hun granules, staan de bloedplaatjes in voor de lokale stelping van een bloeding. Onder normale omstandigheden vertonen de bloedplaatjes geen interactie met het endotheel van de bloedvaten. Bloedplaatjes worden pas geactiveerd door blootstelling aan sub-endotheliale componenten: collageen, Von Willebrand factor (VWF), lamiline, fibronectine en thrombospondine. Deze componenten initiëren de plaatjes-activatie, met als doel de bloeding te stelpen, en weefselherstel mogelijk te maken (1). Deze stoffen bevinden zich in de extracellulaire matrix. Blootstelling aan deze stoffen vindt bijvoorbeeld plaats bij een verwonding, waarbij de continuïteit van het endotheel onderbroken is. Na blootstelling gaan de plaatjes adheren aan deze sub-endotheliale weefselcomponenten, met activatie en interactie met de stollingscascade tot gevolg. Deze interactie wordt bekomen doordat de plaatjes, na activatie, factoren secreteren, die op hun beurt de stollingscascade gaan activeren. Dit proces waarbij de bloedplaatjes de stollingscascade activeren, heet primaire hemostase. De laatste stap in de stollingscascade is het vormen van fibrine uit fibrinogeen. Fibrine gaat door cross-linking van fibrinefilamenten de plaatjesplug stabiliseren, zodat een stevige plug gevormd wordt (1). Deze stevige plug is het eindresultaat van de complexe interactie tussen het endotheel, de bloedplaatjes, hun activatoren en de verwevenheid met de stollingscascade.

In bepaalde gevallen bestaat er echter een pathologisch verhoogde activatie van het stollingssysteem, hetgeen aanleiding kan geven tot thrombusvorming met occlusie van een bloedvat. Anti-aggregerende farmaca worden gebruikt voor primaire of secundaire preventie van dergelijke thrombotische events (4). Enkele klassieke perorale anti-aggregantia zijn acetylsalicylzuur (aspirine),

2

de thiënopyridines (i.e. clopidogrel) en dipyridamol. Thiënopyridines remmen de aggregatie door de binding van ADP aan de P2Y12 receptor op de bloedplaatjes te blokkeren. Recent zijn nieuwe P2Y12 receptor inhibitoren ter beschikking gekomen. Deze scriptie beoogt een grondige literatuurstudie van de farmacologische eigenschappen en het klinisch effect van deze nieuwe P2Y12 receptor inhibitoren. In een eerste deel zal de werking van de plaatjes uitgelegd worden. Daarbij bespreken we de agonisten die plaatjes activeren, de signaalwegen waarlangs de activatie verloopt, en finaal hoe farmacologische inhibitie van de bloedplaatjes bereikt kan worden. Daarna zal dieper worden ingegaan op het farmacologisch profiel van en de klinische resultaten met de nieuwe P2Y12 receptor inhibitoren. Ticagrelor wordt als modelmolecule gebruikt om de nieuwe generatie P2Y12 receptor inhibitoren te representeren. De vergelijking zal gemaakt worden met de oude generatie P2Y12 receptor inhibitoren, i.e. clopidogrel als vertegenwoordiger van deze generatie.

Methode Deze literatuurstudie werd opgemaakt op basis van de pubmed database. De relevante artikels werden op Pubmed gezocht tussen 11/2014 en 07/2016. De artikels werden gezocht door middel van zoektermen. De hits werden vervolgens doorgenomen op basis van de titel, en het abstract. Voor de resultatensectie werden enkel originele onderzoeksartikels geïncludeerd die niet ouder dan 5 jaar waren. Deze procedure leverde met de zoektermenen “pharmacodynamic pharmacokinetic ticagrelor” en “pharmacodynamic pharmacokinetic clopidogrel” reeds drie artikels op die werden opgenomen in de literatuurlijst. “Husted, S., et al. (2012). "Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Ticagrelor in Patients with Stable Coronary Artery Disease." Clinical Pharmacokinetics 51(6): 397-409.” Was één van die drie artikels. In dit artikel worden de gegevens van de PLATO, ONSET-OFFSET en RESPOND studies opnieuw geanalyseerd. De Originele studies werden opgezocht en in de literatuurlijst opgenomen.

Resultaten

1 Activatie en inhibitie van bloedplaatjes

1.1 Adhesie als eerste stap tot aggregatie Om hun functie van bloedstelping te kunnen uitvoeren, dienen de plaatjes aangetrokken te worden naar de plaats waar het bloedvat beschadigd is. Deze rekrutering wordt mogelijk gemaakt door adhesie. De plaatjes gaan namelijk vasthaken aan de endotheliale wand en de sub-endotheliale extracellulaire weefselcomponenten. Figuur 1 toont de receptoren die hiervoor verantwoordelijk zijn. Adhesie is de basis voor de plugvorming, met als doel bloedstelping te bekomen (1). In dit proces zijn voornamelijk Von Willebrand factor en collageen van belang. Collageen en Von Willebrand factor zijn primaire hemostatische agonisten (4). De term primaire hemostatische agonisten wordt gebruikt omdat de stoffen vrijkomen na endotheliale schade, en geen activatie van de bloedplaatjes vereisen. Thrombine, ADP, thromboxaan A2 (TxA2) zijn secundaire hemostatische agonisten. Deze stoffen worden gesecreteerd door geactiveerde bloedplaatjes en dragen bij tot amplificatie en het voortschrijden van het prothrombotische signaal (4).

3

1.1.1 Binding van collageen op GPVI en integrine α2β1

Figuur 1: Grafische voorstelling van de membraan receptoren betrokken bij het adhesie-proces en hun respectievelijke ligand. (8)

Collageen is een van de meest potente agonisten van adhesie en aggregatie die in de vaatwand te vinden is (1). De glycoproteïne (GP)VI collageenreceptoren hebben een specificiteit voor fibreus collageen, dat in natuurlijke vorm onoplosbaar is. In experimentele setting werd op artificiële wijze oplosbaar collageen vervaardigd om de bindingseigenschappen van de receptoren te onderzoeken (13). Dat onderzoek toonde aan dat het oplosbaar collageen geen interactie vertoont met de rustende thrombocyten. Oplosbaar collageen kan enkel interactie vertonen met de α2β1 receptor van de geactiveerde thrombocyt (9). Collageen is een sterke activator doordat ze de plaatjes activeren en interactie vertonen met VWF (1). Collageen bindt aan de GPVI en de integrine α2β1 receptoren.

GPVI (cfr. figuur 1) is een glycoproteïne transmembraan receptor die enkel op bloedplaatjes voorkomt (1). Deze receptor bestaat uit drie domeinen. De extracellulaire regio bestaat uit twee immunoglobuline-gelijkende domeinen, verbonden via een peptideketen met het transmembraan domein, waar een cytoplasmatische staart aan is verbonden. De cytoplasmatische staart vertoont een unieke sequentie waardoor het een selectieve binding aangaat met de Src tyrosine kinases Fyn en Lyn.

Door de morfologie van de extracellulaire domeinen wordt de receptor onderverdeeld bij de superfamilie van de immunoglobulines (9). GPVI is door middel van een zoutbrug tussen het transmembranair domein verbonden met de Fc receptor γ-keten (FcR-γ), zodat ze samen een complex vormen (9). FcR-γ is een transmembraan adapterproteïne dat een immuno-receptor tyrosine activatie motief (ITAM) bevat. Binding van collageen op de receptor zal er voor zorgen dat ITAM gefosforyleerd wordt. Deze fosforylatie zal leiden tot activatie van fosfolipase Cγ (PLCγ), dat een centrale rol speelt bij de activatie (cfr. 1.2.2). Zo zal dus binding van collageen op de GPVI receptor via het FcR-γ complex de thrombocyt in geactiveerde toestand brengen (8).

GPVI heeft slechts een lage affiniteit voor collageen, en binding met enkel deze receptor volstaat niet om adhesie te bekomen. De receptor speelt wel een belangrijke rol bij adhesie, omdat binding van collageen aan de receptor een sterk signaal is voor activatie van de thrombocyt met downstream een potentialisatie van de adhesie (1).

De tweede membraanreceptor voor collageen is de integrine α2β1-receptor. Deze receptoren presenteren zich in drie verschillende structurele conformaties: een geactiveerde, een geïnactiveerde en een intermediaire toestand. De geïnactiveerde toestand vertoont lage affiniteit voor collageen, en vice-versa voor de geactiveerde toestand. Na activatie van de thrombocyt zullen intra-cellulaire

4

signalen zorgen voor een structurele herschikking van α2β1 domeinen (8). Deze conformatieverandering verhoogt de affiniteit van de receptor voor collageen, resulterend in een sterkere interactie. Het precieze mechanisme waarmee de receptor in geactiveerde toestand wordt gebracht, is nog niet volledig gekend. Er wordt aangenomen dat GPVI stimulatie door collageen voor de verhoogde affiniteit van de α2β1-receptor zorgt (1). Binding van collageen op de receptor heeft als effect dat de interactie tussen collageen en GPVI toeneemt (10). Zo verhoogt de affiniteit van GPVI voor collageen en zal activatie van de thrombocyt op een indirecte wijze aangemoedigd worden. Daarnaast wordt ook de αIIbβ3-receptor geactiveerd, deze receptor bindt met fibrine om zo een stevige plug te vormen (1). De belangrijkste rol van integrine α2β1 is echter directe en permanente adhesie aan collageen (11).

Samengevat zorgt binding van collageen met GPVI voor activatie van de thrombocyt en potentialisatie van de integrine α2β1-receptoren. Het effect van de ligand-receptor binding van collageen met integrine α2β1 is adhesie aan het collageen en potentialisatie van de GPVI. We kunnen dus vaststellen dat beide receptoren agonistisch werken, waarbij ze elkaars effect versterken (1).

1.1.2 Von Willebrand factor en de GPIb-receptor Endotheliale cellen synthetiseren Von Willebrand factor (VWF) en brengen het in de bloedcirculatie. VWF zit ook opgeslagen in de α granules van de bloedplaatjes (1). Bij vasculaire schade bindt circulerend VWF aan het sub-endotheliale collageen en wordt zo op het collageen geïmmobiliseerd. VWF heeft daarvoor gespecialiseerde bindingsplaatsen waar binding op collageen kan plaatsvinden. Pas na immobilisatie is VWF in staat om interactie aan te gaan met de GPIb-receptor van de bloedplaatjes (1). De verklaring hiervoor ligt in de ruimtelijke structuur van VWF. In normale omstandigheden zit het bindingsdomein voor de GPIb-receptor afgeschermd. Binding op blootliggend collageen, of na zelf-associatie, zorgt voor een vormverandering van VWF. Hierdoor wordt het bindingsdomein toegankelijk voor interactie met de GPIb-receptor. Zelf-associatie van VWF betekent dat VWF binding gaat vertonen op andere VWF molecules. Dit gebeurt op plaatsen waar verhoogde shear-stress in het bloedvat aanwezig is. Door deze verhoogde shear-stress gaat circulerend VWF associëren met matrix- of plaatjes-gebonden VWF, ofwel met sub-endotheliaal VWF (1).

VWF, als agonist van adhesie, is voornamelijk van belang bij grotere stroomsnelheden (1) van het bloed. In die omstandigheden is de interactie tussen VWF en de GPIb-receptor van belang om de plaatjes af te remmen. Door de binding gaan de bloedplaatjes vertragen ten opzichte van de stroomsnelheid in de circulatie. Hierdoor is er een nauwer contact mogelijk tussen de plaatjes en het endotheel, en voornamelijk de sub-endotheliale matrix, op de plaats waar het bloedvat beschadigd is. Zo kunnen de thrombocyten naar de plaats van beschadiging geleid worden. De vertraging zorgt voor een verlengde contacttijd met de omgeving, zodat aanwezigheid van andere activerende factoren, zoals collageen bv., voldoende tijd hebben om de binding aan hun receptor tot stand te brengen. De bijkomende interacties met agonisten uit de omgeving zijn essentieel om adhesie te bekomen (1). Aangezien enkel binding van VWF met GPIb niet volstaat om adhesie te bekomen.

1.1.3 Stevige adhesie Om stevige adhesie te bekomen is voorafgaande activatie van de thrombocyt vereist (1). Activatie zorgt voor een hele reeks van effecten (cfr. 1.4). De effecten van activatie die betrekking hebben tot

5

adhesie zijn: een verhoogde expressie van β1 en β3 integrines en een shift van deze integrines naar een toestand met hoge affiniteit voor hun ligand (1).

Onder de noemer β1 en β3 integrines vervatten we de volgende receptoren: α5β1, α6β1, αIIbβ3 en αvβ3. Enkel de αIIbβ3-receptor zullen we verder bespreken. De αIIbβ3-receptor is de receptor die het meest abundant op de membraan van de thrombocyten tot expressie komt (1). Deze receptor kan binding aangaan met fibrinogeen, fibrine, VWF, vitronectine, fibronectine en thrombospondine (8). Vooraleer interactie met fibrinogeen mogelijk is, moet de receptor in de toestand met hoge affiniteit zijn. Dit kan enkel door voorafgaande activatie van de thrombocyt. Deze receptor is de belangrijkste voor in vivo adhesie en aggregatie van de thrombocyt (8). Daarnaast zal deze receptor via een G-proteïne gekoppelde signaaltransductie ook zorgen voor activatie na binding met fibrinogeen (1). Door hun hoge affiniteit voor VWF en geïmmobiliseerd fibrinogeen, zorgen deze receptoren voor zowel adhesie, als voor aggregatie (cfr. 1.4.4).

1.2 Activatie van bloedplaatjes Activatie van plaatjes verloopt als een cascade. Daarbij zijn verschillende agonisten, receptoren, second-messengers en effectoren bij betrokken, deze worden schematisch voorgesteld op figuur 2. Deze afbeelding is een goede leidraad om bij de verschillende stappen van activatie het overzicht te behouden.

Figuur 2: schematische voorstelling van agonisten, hun receptoren, en tussenstappen die leiden tot activatie van de thrombocyt (1)

Plaatjes worden geactiveerd door binding van een agonist op zijn respectievelijke receptor. Deze interactie, die plaatsvindt buiten de celmembraan, moet kunnen aanleiding geven tot een intracellulair signaal. Deze prikkeloverdracht over de celmembraan heen, heet transductie. Er zijn twee manieren waarop signaaltransductie plaatsvindt. Ofwel door middel van activatie van tyrosine-kinase, ofwel door middel van G proteïne gekoppelde receptoren. Na transductie kan activatie van de bloedplaatjes plaatsvinden (1).

6

Het proces van plaatjesactivatie kenmerkt zich in een afname in cyclisch AMP (cAMP) en een toename van inositoldifosfaat (IP3) en vrije Ca2+ ionen. Dit zal leiden tot activatie van de integrine αIIbβ3-receptoren en cytoskeletale reorganisatie. Er worden ook granules gesecreteerd; de vrijgestelde factoren amplificeren het prothrombotisch signaal en rekruteren extra plaatjes. Door de activatie van het αIIbβ3 kunnen de plaatjes zich door middel van fibrinogeen aan elkaar vasthechten. Het uiteindelijke resultaat van plaatjesactivatie is aggregatie en thrombusvorming (1).

1.2.1 De rustende thrombocyt De rustende thrombocyt behoudt zijn homeostase door een constante intracellulaire aanwezigheid van cAMP. Het enzym adenylyl cyclase (AC) produceert op continue wijze cAMP uit ATP (1). cAMP bepaalt de activiteit van het proteïne kinase A (PKA). In afwezigheid van cAMP is PKA niet actief. PKA is een kinase dat meerdere proteïnes gaat fosforyleren. We kunnen de targets van PKA arbitrair onder twee grote groepen indelen. Een eerste groep bestaat uit de eiwitten die invloed hebben op de cytosolische Ca2+ concentratie, met name de IP3-receptor en de plasma membraan Ca2+ ATPase (PMCA). De tweede groep betreft de verschillende eiwitten die tot expressie of activatie komen tijdens plaatjes activatie (1).

Door de cytosolische concentratie aan Ca2+ ionen laag te houden, wordt activatie van de thrombocyt verhinderd. Een toename van het intracellulair Ca2+ gaat allerlei processen aanschakelen welke de plaatjes activeren (1). Deze concentratie wordt laag gehouden op twee manieren. Ten eerst wordt Ca2+ actief uit het cytoplasma weg gepompt; dat gebeurt door twee ionenpompen door middel van actief transport. De SERCA pomp komt voor op de membraan van het dens tubulair systeem (DTS) en pompt de Ca2+ ionen het DTS binnen, waar het blijft opgeslagen. PMCA is een ionenpomp die op de plasmamembraan gelegen is, en pompt Ca2+ naar de extracellulaire ruimte. Deze PMCA pomp wordt aangeschakeld door PKA (1).

Naast het wegpompen van het calcium, is inhibitie van calciumvrijgave de tweede manier waarop de homeostase behouden blijft. De IP3-receptor bevindt zich ter hoogte van het DTS, en zorgt na stimulatie door IP3, voor een calciumflux van het dens tubulair systeem naar het cytosol. Fosforylatie van deze receptor door PKA, heeft een inhibitoir effect. Cytoplasmatische toename van Ca2+ ionen wordt op deze manier vermeden, en uiteindelijk ook activatie van plaatjes (1).

In de tweede groep worden het “vasodilator-stimulated phosphoprotein” (VASP) en myosine lichte keten kinase (MLCK) door PKA gefosforyleerd. Dit heeft een inhiberend effect op beide. VASP vervult een taak bij de cytoskeletale reorganisatie en de activatie van de integrine-receptoren, welke nodig zijn bij aggregatie. Het MLCK is ook betrokken bij de cytoskeletale reorganisatie (1).

1.2.2 De inwendige signaalcascade voor activatie verloopt via drie systemen Het eerste systeem start bij het geactiveerde PLCγ en PLCβ. Beide fosfolipases hebben dezelfde functie. Ze zorgen voor het hydrolyseren van fosfatidyl inositol bisfosfaat uit de celmembraan, waardoor twee nieuwe producten gevormd worden. Het eerste is het water oplosbare inositoldifosfaat (IP3), het tweede is het membraanverankerde diacylglycerol (DAG). Het is IP3 dat voor de toename van het cytosolisch calciumgehalte zal zorgen (1). De gezamenlijke cytosolische toename van DAG en Ca2+ stimuleert in belangrijke mate plaatjesactivatie en draagt bij tot vormverandering, secretie van granules en aggregatie (1).

7

Het tweede systeem heeft als kenmerk inhibitie van AC. Door het blokkeren van de tonische inhibitie die vanuit AC vertrekt, en verwezenlijkt wordt door cAMP, kan de thrombocyt in geactiveerde toestand worden gebracht. Gi zal het AC inhiberen (1). Als gevolg daarvan kan de IP3-receptor geactiveerd worden, waardoor Ca2+ kan vrijkomen uit het DTS. Ook VASP en MLCK kunnen hun functie opnieuw beoefenen, waardoor vormverandering en aggregatie mogelijk wordt (1).

Het derde systeem schakelt fosfoinositide 3-kinase (PI3K) aan. Het zet fosphatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) om tot fosfatidylinositol (3,4,5)-trisfosfaat (PIP3), welke op zijn beurt het proteïne kinase Akt aanschakelt. Rap1 is een GTP bindend proteïne, welke op zijn beurt de αIIbβ3-receptor in geactiveerde toestand gaat brengen. Deze activatie maakt de vorming van thrombocyten-aggregaten mogelijk. Een vrijstelling van Ca2+, wordt ook door PI3K bewerkstelligd (1).

1.2.3 De centrale rol van Ca2+ en het dens tubulair systeem Het dens tubulair systeem (DTS) is een celorganel dat is afgeleid van het glad endoplasmatisch reticulum van de megakaryocyt. In het DTS van de thrombocyt zit een grote hoeveelheid calcium opgeslagen(1). Op de membraan van het DTS bevinden zich IP3-receptoren. Binding van IP3 op de IP3-receptor zorgt voor het openen van het Ca2+ selectieve ionkanaal met efflux van Ca2+ naar het cytosol. Verder bevat de membraan van het DTS ook sarco/endoplasmatisch reticulum Ca2+ ATPases (SERCA’s); dit zijn ionenpompen die actief Ca2+ van het cytoplasma naar het DTS pompen. Zo wordt de cytosolische Ca2+ concentratie in de rustende thrombocyt laag gehouden.

De toename aan Ca2+ ionen is kenmerkend voor activatie van de thrombocyt. Deze concentratiestijging is een sterk signaal dat vijf verschillende systemen gaat aanschakelen (8, 1). DAG gaat samen met het vrijgekomen Ca2+ proteïne kinase c (PKC) capteren zodat PKC expressie op de celmembraan mogelijk wordt. PKC gaat meerdere cellulaire proteïnes fosforyleren. Het resultaat daarvan is activatie van de integrine-receptoren, secretie van de granules, en activatie van de plaatjes (8).

Daarnaast bevat het DTS de enzymen van het arachidonzuur-metabolisme, namelijk fosfolipase A2 (PLA2) en diglyceride lipase (4). Activatie van de IP3-receptor leidt naast de efflux van Ca2+ ook tot de vrijgave van deze enzymen. PLA2 gaat vetzuren verknippen waardoor arachidonzuur vrijkomt. Hierdoor kan de thrombocyt thromboxaan A2 synthetiseren, een secundaire activator van thrombocyten (1).

De stijging van het intracellulaire Ca2+ zorgt voor activatie van het myosine lichte keten kinase (4). Hierdoor gaat de structuur van het cytoskelet wijzigen en ondergaan de plaatjes een vormverandering (1).

Ca2+ gaat via fosfatidylserine (PtdSer) zorgen voor de inductie van een meer potent procoagulant oppervlak van de thrombocyt door incorporatie van fosfatidylserine in de celmembraan (4). Deze negatief geladen moleculen promoten activatie van de vitamine K afhankelijke stollingsfactoren, met versnelde coagulatie tot gevolg (1).

Als laatste gaat Ca2+ zorgen voor het aanschakelen van CalDAG-GEFI, een guanine nucleotide exchange factor. Deze molecule schakelt Rap1 aan, welke voor een activatie van de integrine receptoren zal zorgen. Door deze integrine receptoren in de geactiveerde toestand te brengen, kunnen de plaatjes door middel van cross-linking aan fibrine, zich aan elkaar vasthechten, waardoor we aggregatie bekomen (1).

8

1.2.4 Signaaltransductie Er zijn twee belangrijke mechanismen waarop het signaal van extracellulair wordt doorgegeven tot in de cel. Het eerste is via activatie van tyrosine kinase. Het tweede is via membraangebonden activatie van G-proteïnes. Daarna wordt het signaal via een gemeenschappelijk traject intracellulair verwerkt.

In het eerste geval gaat binding van het ligand met de receptor zorgen voor activatie van de receptorgebonden kinases. De werking van de GP VI-receptor berust op dit principe en wordt onder 1.3.1 besproken.

Figuur 3: Receptoren die via GPCR de thrombocyt activeren (adaptatie van 1).

Het tweede mechanisme dat voor plaatjes activatie zorgt, maakt gebruik van G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR’s). Het signaal gegenereerd door een GPCR, kan zowel een activerend, of inhiberend effect uitoefenen (4). Figuur 3 toont de receptoren die signaaltransductie bekomen via GPCR’s. Vier soorten G-proteïnes dragen elk op verschillende wijze bij tot de activatie van de bloedplaatjes, namelijk de G13, Gq, Gi en Gs proteïnes (8).

1.3 Agonisten voor activatie Er zijn heel wat agonisten gekend die de plaatjes activeren. Collageen, ADP, thromboxaan A2 en thrombine zullen besproken worden. Figuur 4 geeft een overzicht van de agonisten en de receptoren waarop ze binden.

9

Figuur 4: De agonisten voor plaatjesactivatie ATP, ADP, thrombine, TxA2, collageen en fibrinogeen met hun respectievelijke receptoren (8)

1.3.1 Collageen Zoals reeds besproken is collageen niet enkel betrokken in het proces van adhesie, maar is het tevens een sterkste activator van de bloedplaatjes. Er zijn vier collageenreceptoren op de plaatjes. Twee daarvan kunnen rechtstreeks binden met collageen (α2β1, GP VI), de andere twee binden aan collageen door middel van VWF (αIIbβ3, GP Ibα) (8).

De GP VI komt op de celmembraan voor in associatie met de FcR-γ keten. Figuur 5 toont de structuur van de receptor, alsook de componenten die zorgen voor de signaaltransductie. De associatie van GP VI met de FcR-γ keten is essentieel om signaaltransductie mogelijk te maken. Daardoor is de GP VI-receptor in staat om een sterk signaal voor activatie te genereren (1). Na binding van de receptor met collageen zullen de Src tyrosine kinases Fyn en Lyn, zorgen voor fosforylatie van het ITAM motief van de FcR-γ keten. Het gefosforyleerde ITAM krijgt door de fosfaatgroepen een andere ruimtelijke structuur en lading. Daardoor kunnen interacties worden aangegaan met kinases, in dit geval Syk (9). Mits enkele tussenstappen, die te zien zijn op figuur 5, zal uiteindelijk activatie van PLCγ, bekomen worden. PLCγ zorgt voor vrijstelling van Ca2+ en speelt daardoor een centrale rol bij activatie van de thrombocyt (9).

10

Figuur 5: De GP VI-receptor met de intracellulaire signaalcascade (9).

Signaaltransductie van de GPIb en α2β1-receptoren verloopt gelijkaardig, maar hun link met PLC en daaropvolgende activatie van de thrombocyt, is minder duidelijk aangetoond (1, 10, 11).

Interactie van collageen met de α2β1-receptor versterkt de reactie van GPVI op collageen en zorgt voor het activeren van de αIIbβ3-receptoren (1).

1.3.2 ADP ADP komt vrij door beschadiging van de endotheliale cellen. Na adhesie en activatie van de plaatjes op de plaats van verwonding, gaan ze ADP en andere producten secreteren om extra plaatjes te rekruteren. Stimulatie door ADP is een noodzakelijk element om maximale aggregatie te kunnen bekomen (8). Het ADP bindt op de purinerge receptoren, P2Y1 en P2Y12 (1). In vitro experimenten hebben aangetoond dat ADP aanleiding geeft tot productie van TxA2, fosforylatie van proteïnes, vormverandering, vrijstelling van Ca2+, aggregatie en secretie (8).

De P2Y1-receptor komt niet exclusief in plaatjes tot expressie, maar wordt ook in andere weefsels gevonden. De receptor werd aangetoond in de hartspier, het zenuwstelsel en het voortplantingsstelsel (2). Ter hoogte van de thrombocyten zorgt binding van ADP met de P2Y1-receptor voor activatie van de G-proteïne gekoppelde receptor. Hier zorgt excitatie van het G-proteïne “Gq” voor activatie van het PLCβ2. Net zoals reeds beschreven werd voor PLCγ2, gaat PLCβ2 zorgen voor het vrijmaken van IP3 en DAG (5). Uiteindelijk zal daardoor toename van het Ca2+ plaatsvinden in het cytosol (1). Als gevolg van de Ca2+-vrijstelling ondergaat de thrombocyt transiënte vormverandering en zwakke aggregatie (2).

De P2Y12-receptor is een GPCR, waarop het aminozuur cysteïne op vier verschillende posities voorkomt in het extracellulaire domein van de receptor. Die zijn belangrijk voor de functie en expressie van de receptor. De receptor wordt geactiveerd door ADP, terwijl ATP en andere verbindingen met drie fosfaatgroepen een antagonistische functie uitoefenen (2). Figuur 6 toont een grafische voorstelling van de receptor. Signaaltransductie verloopt via Gi. Deze secondaire boodschapper gaat twee effecten uitoefenen. Ten eerste gaat het AC inhiberen. Door inhibitie van AC, gaat de concentratie cAMP dalen. Hierdoor valt de tonische inhibitie op de calciumvrijgave weg. Daardoor kan de thrombocyt in geactiveerde toestand gebracht worden (1).

11

Ten tweede Gi er voor zorgen dat PI3K geactiveerd wordt. PIP2 wordt door PI3K omgezet tot PIP3, welke op zijn beurt het proteïne kinase Akt aanschakelt. Rap1 wordt door Akt aangeschakeld en staat rechtstreeks in voor het activeren van de integrine-receptoren (zoals αIIbβ3) (8).

Figuur 6: De P2Y12-receptor en Gi signalisatie in bloedplaatjes (adaptatie van 8)

Stimulatie van de P2Y12-receptor alleen, volstaat niet om tot plaatjesaggregatie te komen (2). De rol van deze receptor berust op amplificatie van het signaal. Het wegvallen van de tonische inhibitie is daarvoor verantwoordelijk. Stimulatie van de receptor zorgt voor een verhoogde expressie van fosfatidylserine in de celmembraan, en promoot zo de vorming van macroaggregaten (2).

De beide receptoren werken voornamelijk samen (8). Na stimulatie door ADP initieert de P2Y1-receptor plaatjesaggregatie. Terwijl de P2Y12-receptor verantwoordelijk is voor het behouden van de aggregaten en amplificatie van het signaal (2).

1.3.3 Thromboxaan A2 TxA2 is een krachtige secundaire activator van plaatjes. Het wordt door de geactiveerde thrombocyten geproduceerd en gesecreteerd. Op autocriene en paracriene wijze zorgt het voor amplificatie en verder schrijden van het prothrombotisch signaal, zo worden bijkomende thrombocyten gerekruteerd naar de plaats van vasculaire schade (1). Het heeft een kort halfleven waardoor het signaal beperkt blijft tot de plaats van verwonding (8).

TxA2 gaat binden op de thromboxaan/endoperoxide (TP)-receptor, een GPCR (4). Activatie van de receptor zorgt voor een toename van het intracellulaire GTP, dit zorgt ervoor dat PLC geactiveerd wordt. PLC zorgt voor een toename aan cytosolisch Ca2+, als gevolg gaan de plaatjes van vorm veranderen, aggregeren en secundaire thrombotica secreteren (8).

1.3.4 Thrombine Thrombine is de geactiveerde vorm van prothrombine, een stollingsfactor en wordt gevormd door activatie van het stollingsysteem. De bloedplaatjes hebben een bindingsplaats voor thrombine, namelijk de protease geactiveerde receptor (PAR) 1 en PAR 3. Beiden zijn GPCR en koppelen via G13 en Gi (8). Thrombine gaat op irreversibele wijze de PAR activeren door een stuk van de peptideketen af te klieven (1). Thrombine is de sterkste activator van PLC en zeer kleine concentraties van thrombine zorgen voor een enorme vrijstelling van Ca2+, daardoor wordt onder andere PLA2

12

geactiveerd. Rho wordt ook aangeschakeld, met als gevolg een herschikking van het cytoskelet wat resulteert in de vormverandering van de plaatjes (8). De PAR schakelen ook via Gi. Dit kan ofwel op directe wijze, ofwel indirect, via ADP. Door de activiteit van Gi daalt het cAMP en wordt PI3K geactiveerd (1, 8).

1.3.5 Andere agonisten Adrenaline bindt op de α2-adrenerge receptoren en schakelt via Gi. Dit zal voor inhibitie van AC en activatie van PI3K zorgen (1). Onrechtstreeks zal ook PLC gestimuleerd worden via synthese van thromboxaan A2 (8).

ATP zit opgeslagen in de dense granules van de plaatjes, waarvan de inhoud wordt gesecreteerd na activatie van de plaatjes (1). ATP gaat binden op de P2X1-receptor, die zich op de celmembraan van de bloedplaatjes bevindt (8). De P2X1-receptor is een ligand-gated Ca2+ ion kanaal. Stimulatie door ATP zorgt voor het openen van het kanaal met influx van Ca2+ in het cytosol (5). Activatie van de P2X1-receptor beoefent een additief effect met de andere agonisten voor activatie, met een amplificatie van de respons tot gevolg (8).

Fibrinogeen bindt op de integrine αIIbβ3-receptor. Deze receptor gaat via G13 de plaatjes activeren. Zo draagt fibrinogeen bij aan het stabiliseren van de aggregaten (1).

1.4 Effecten van activatie

1.4.1 Amplificatie van het signaal

1.4.1.1 Synthese en secretie van thromboxaan A2 TxA2 is een belangrijk element van de positieve feedbacklus. Het is een krachtige activator van de bloedplaatjes na binding op de GPCR (1). Het zorgt daarnaast, door binding op de TP-receptoren, voor contractie van de endotheliale gladde spiercellen met vasoconstrictie tot gevolg. TxA2 wordt cytosolisch gevormd uit arachidonzuur door enzymatische omzetting. PLA2 is verantwoordelijk voor het vrijmaken van arachidonzuur uit de membraanfosfolipiden (1).

Arachidonzuur is de precursor van thromboxaan A2 en wordt door prostaglandine H synthase (PGHS) omgezet tot prostaglandine cyclische endoperoxide (PG)G2 en PGH2. omzetting van arachidonzuur tot PGG2 wordt bekomen door de cyclo-oxigenase (COX) activiteit van PGHS. Daarom wordt het enzym ook COX genoemd. Er zijn twee varianten van het enzym, nl. COX-1 en COX2. PGG2 wordt vervolgens door het hydroperoxidase domein van PGHS tot PGH2 gereduceerd. PGH2 wordt opeenvolgend door thromboxaan synthase tot TxA2 omgevormd (5). TxA2 is een ligand voor de thromboxaan/endoperoxide (TP) receptor.

Binding van thromboxaan op de TP-receptor werkt in op PLC, AC en de ion-kanalen; dit zorgt zoals reeds besproken voor activatie van de naburige bloedplaatjes met amplificatie van het initiële signaal.

1.4.1.2 Secretie van granules In het cytoplasma van de bloedplaatjes kunnen drie soorten granules worden onderscheiden (4). Na activatie van de plaatjes zullen ze via exocytose de inhoud van deze granules in de omgeving

13

secreteren. De gesecreteerde producten zullen zorgen voor rekrutering van extra plaatjes, initiatie van het vasculair herstel regulatie van de immuunrespons.

De alfa-granules hebben een heterogene inhoud, rijk aan proteïnes. Ze bevatten VWF, fibrinogeen, stollingsfactoren V, XI, XIII, prothrombine, kininogeen, plasminogeen activator inhibitor 1 (1, 8). Deze stoffen zorgen voor rekrutering van plaatjes, en versterkte cross-linking tussen de plaatjes onderling (1). De α granules bevatten ook proteïnes die angiogenese reguleren (8).

Op de membraan van deze granules zitten αIIbβ3-, GP VI-, en GP IIbIIIa-receptoren. Bij secretie gaat de membraan van de granules fuseren met de celmembraan, waardoor de receptorexpressie op de wand toeneemt. Dit leidt tot een verhoogde gevoeligheid van de plaatjes voor de agonisten, en amplificatie van het signaal. (4)

De dense granules bevatten Ca2+, histamine, serotonine, ADP, ATP. Serotonine, calcium en ADP hebben als effect dat ze extra plaatjes rekruteren (1).

De lysosomale granules bevatten lysosomale enzymen en breken stoffen af die door fagocytose in de bloedplaatjes terechtkomen (8).

1.4.2 Vormverandering De rustende thrombocyt heeft de vorm van een discus. Als gevolg van de activatie van de plaatjes, zal er een reorganisatie van het cytoskelet plaatsvinden. Het cytoskelet bestaat uit het spectrine membraangeassocieerde skelet, het actine cytoskelet en de marginale microtubule-coil (8). Actine is het meest abundante eiwit in de plaatjes en suggereert dat de vormverandering een belangrijke rol speelt in de thrombogenese. Er werd opgemerkt dat de vormverandering plaats vindt voor dat aggregatie werd waargenomen (8). Door de vormverandering neemt het uitwendige oppervlak van de thrombocyt toe, waardoor er meer interacties met naburige cellen en moleculen, mogelijk zijn.

De vormverandering berust op het aanbrengen van fosfaatgroepen, door MLCK, op de lichte myosine ketens. Bijna alle agonisten zorgen voor de het activeren van het MLCK. Er zijn twee wegen te onderscheiden dewelke tot activatie van het MLCK leiden. De eerste is Ca2+ afhankelijk: daarbij speelt calmoduline een rol bij het activeren van het MLCK. De tweede verloopt via het G-proteïne G13. G13 activeert Rho/Rho-kinase welke op zijn beurt het MLCK gaat aanschakelen (8).

1.4.3 Activatie van de αIIbβ3 integrines Het ultieme doel van plaatjesactivatie is het bekomen van aggregatie. Bij aggregatie wordt fibrine op de membraangebonden integrines gebonden, waardoor de plaatjes op elkaar worden vastgehecht. Een voorwaarde voor aggregatie is echter de activatie van de integrines, want in geïnactiveerde toestand hebben ze slechts een lage affiniteit voor hun liganden (1). We hebben reeds beschreven dat activatie leidt tot een toenamen van het aantal αIIbβ3-receptoren. Ten tweede zal activatie dus ook zorgen voor het switchen naar een toestand van verhoogde affiniteit. Dit gebeurt door het zogenaamde inside-out signaal.

Activatie zal zorgen voor een inwendige cascade, met vorming van Ca2+ en DAG. Zoals beschreven gaan deze stoffen PKC, PI3K en CalDAG-GEFI aanschakelen. Deze gaan op hun beurt Rap1 activeren. Rap1 gaat op zijn beurt de αIIbβ3-receptor in geactiveerde toestand brengen (1).

14

1.4.4 Aggregatie Na activatie van de αIIbβ3-receptoren, zijn deze receptoren in staat fibrinogeen te binden. Fibrinogeen is een bivalent peptide, wat betekent dat het op elk uiteinde een bindingsplaats heeft voor de αIIbβ3-receptor. Door binding op twee receptoren worden de plaatjes aan elkaar vastgemaakt. Dit worden aggregaten genoemd. Hierdoor vormen de plaatjes een stevig netwerk, dat de bloeding afsluit en bovendien paracriene communicatie tussen de plaatjes faciliteert, door de dichte positionering van de plaatjes onderling (1).

1.5 Fysiologische controle van de hemostase Strikte regulatie van de hemostase is noodzakelijk om arteriële thrombi met ischemie en veneuze trombose en embolisatie te voorkomen. Het endotheel speelt een belangrijke rol bij het controleren van de hemostase.

Het endotheel is bedekt met heparansulfaat, een negatief geladen glycocalix. Daardoor vindt er elektrostatische afstoting plaats, zodat er geen interacties mogelijk zijn tussen de receptoren van de thrombocyten, en de bloedvatwand (8).

Ten tweede, produceren de endotheliale cellen ook allerlei stoffen die de thrombocyten in de rustende toestand houden. Prostacycline (PGI2) is veruit de best gekende en meest onderzochte fysiologische inhibitor van de plaatjes. Het wordt door de endotheelcellen uit arachidonzuur gesynthetiseerd door COX 1, COX 2 en prostacycline synthase. PGI2 gaat binden op de IP-receptor van de plaatjes, een GPCR met Gs als secundaire messenger. Gs zal zorgen dat de aanmaak van cAMP gestimuleerd wordt, door het aanschakelen van AC (1). Zoals reeds beschreven bij ‘de rustende thrombocyt’ speelt cAMP een centrale rol in het tegengaan van plaatjesactivatie.

1.6 Pathologische activiteit van bloedplaatjes

1.6.1 Endotheliale dysfunctie Zoals reeds beschreven, is een intact endotheel belangrijk om de plaatjes in de rustende toestand te houden. Endotheliale dysfunctie heeft een belangrijke negatieve invloed op de plaatjesfunctie en is de initiator van atherosclerose. Toegenomen LDL, hypertensie, diabetes mellitus, toegenomen vrije radicalen, verhoogde concentraties van homocysteïne, en infectieuze agentia zoals chlamydia hebben een aangetoond oorzakelijk verband met het ontstaan van endotheliale dysfunctie (4).

Door endotheliale dysfunctie gaat het endotheel zijn anticoagulatoire eigenschappen verliezen en een verhoogde adhesieve capaciteit vertonen voor de bloedplaatjes. Overmatige expressie van adhesiemolecules, chemokines en groeifactoren liggen hier aan de basis (4). Het inflammatoir proces stimuleert proliferatie van de gladde spiercellen, en trekt macrofagen aan, dit geeft aanleiding tot het ontstaan van atherosclerose.

1.6.2 Atherosclerose Atherosclerose is de meest frequente veroorzaker van ischemisch hartlijden en cerebrovasculaire accidenten. Beide ziekten komen met hoge frequentie voor in de westerse wereld, en hebben een belangrijke morbiditeit en mortaliteit (4). Atherosclerose is een combinatie van atheromatose, het neerslaan van lipiden de bloedvatwand, en arteriosclerose, het stijver worden van de bloedvaten door een verandering in het collageen van de extracellulaire matrix.

15

Atherosclerose kan voorgesteld worden als een plaque, bestaande uit lipiden en necrotisch weefsel, dat wordt overspannen door een fibreuze laag. Een hypothese die de link tussen atherosclerose en arteriële thrombose verklaart, stelt dat er een ruptuur van de plaque plaatsvindt. Deze ruptuur legt een thrombotisch oppervlak bloot (matrix proteïnes, VWF…) met activatie en rekrutering van de plaatjes, zoals eerder werd besproken.

Daarnaast zorgt de plaque voor een afname van de binnendiameter van het bloedvat, hierdoor zal het bloed lokaal sneller gaan stromen, en verhoogde shear-stress veroorzaken. Er werd waargenomen dat verhoogde shear-stress VWF gaat immobiliseren, welke zich stevig aan de plaatjes vasthecht, zonder dat deze zich in de geactiveerde toestand bevinden. Dit zou voor thrombusvorming kunnen zorgen op plaatsen met hoge shear-stress (1).

1.6.3 Acute arteriële occlusie Uit waarnemingen wordt een belangrijke rol voor de thrombocyten weerhouden bij acute arteriële occlusie. Zo worden verhoogde spiegels van TxA2 metabolieten gemeten bij patiënten die recent een ischemisch coronair syndroom hebben doorgemaakt. Bij deze patiënten kon men ook sterke reacties van de thrombocyten op stimulatie met ADP waarnemen. Er werden ook microaggregaten in het bloed teruggevonden (4).

Studies hebben aangetoond dat farmacologische onderdrukking van de plaatjesfunctie bij deze patiënten gunstige effecten heeft op het voorkomen van nieuwe events (4).

1.7 Farmacologische inhibitie van bloedplaatjes

1.7.1 Aspirine Aspirine (ASA) is het klassieke middel dat wordt gebruikt voor plaatjesinhibitie (4). Zijn werking berust op het onderbreken van arachidonzuur metabolisme. Aspirine blokkeert de synthese van TxA2 door op irreversibele wijze het COX-1 domein van PGH synthase te acetyleren (4, 5). Hierdoor kan er geen PGH2 meer gevormd worden, alsook alle producten die daaruit ontstaan, onder andere TxA2 (5). Thromboxaan A2 speelt een belangrijke rol in de positieve feedback lus, en deze wordt als gevolg onderbroken. Aangezien thrombocyten niet over een celkern beschikken, kan er geen nieuw PGHS gesynthetiseerd worden, waardoor het effect van aspirine gedurende de levensduur van de Thrombocyten behouden blijft (5).

16

Figuur 7: De metabolisatie van arachidonzuur tot TxA2 en het aangrijpingspunt voor aspirine therapie (5).

Zoals figuur 7 aangeeft, zal het blokkeren van COX-1, naast een inhibitie van TxA2, ook de synthese van andere producten inhiberen. Endotheliale cellen synthetiseren PGI2 uit arachidonzuur via omzetting door COX-1 (4). PGI2 is zoals aangehaald een belangrijke vasodilatator en inhibitor van plaatjesactivatie. Toediening van lage dosis aspirine (70-100 mg/d) inhibeert volledig de TxA2 productie in bloedplaatjes, zonder de endotheliale productie van PGI2 aan te tasten (7). Een dagelijkse inname van 1500 mg aspirine inhibeert zowel de productie van TxA2 door de thrombocyten, als PGI2 dat door het endotheel word geproduceerd. Men heeft echter geen klinische verschillen kunnen vaststellen wanneer men het effect van beide dosissen vergeleek. Er wordt aangenomen dat de inhibitie van COX-1 in de bloedplaatjes de neveneffecten op het endotheel overstijgt, waardoor de inhibitie van PGI2 klinisch verwaarloosbaar is (7).

Niet-steroïdale anti inflammatoire middelen (NSAID’s) hebben een gelijkaardige werking als aspirine. Maar in tegenstelling tot aspirine, gaan NSAID’s op een reversibele manier COX-1 inhiberen (4).

Doordat aspirine enkel interfereert met de synthese van TxA2, is het een zwakke inhibitor van plaatjesactiviteit (5). Dit komt doordat sterke agonisten zoals thrombine, ADP etc. niet door het medicament geïnhibeerd worden. Daardoor kan plaatjesactivatie nog steeds plaatsvinden. Aspirine is dus geen geschikt middel om pathologische plaatjesactivatie, die word veroorzaakt door verhoogde shear-stress, te onderdrukken (5).

1.7.2 Thiënopyridines Thiënopyridines zijn prodrugs die metabole activatie ter hoogte van de lever ondergaan, alvorens ze hun farmacotherapeutische werking kunnen bestendigen. Na metabole activatie door cytochroom P450 (CYP P450) gaan ze op irreversibele wijze de P2Y12-receptor blokkeren. Hierdoor verhinderen ze activatie van de thrombocyten door ADP gedurende de levensduur van de thrombocyt (4).

Ticlopidine, clopidogrel, prasugrel zijn respectievelijke stoffen van de eerste, tweede en derde generatie medicijnen die tot deze klasse behoren. Elke klasse heeft een verschillende specificiteit voor de CYP isoenzymen. Dit verklaart de grote variabiliteit tussen de verschillende klassen, en hun vatbaarheid voor interacties met andere geneesmiddelen. De eerste generatie kent gevaarlijke bijwerkingen onder andere neutropenie en thrombotische thrombocytopenische purpura worden aan deze klasse toegeschreven (21). Voor meer vergelijkende informatie tussen de verschillende klassen, verwijzen we naar tabel 1.

Doordat de thiënopyridines prodrugs zijn, zijn ze uitermate gevoelig aan factoren die de farmacokinetiek en farmacodynamiek beïnvloeden. We denken hierbij aan veranderde intestinale absorptie, enzymatische activatie geneesmiddeleninteracties (8). Genetische, klinische en persoonlijke factoren spelen daarbij een rol.

17

P2Y12 inhibitor Dose Intake Metabolism Mode of inhibition

Time to platelet inhibition

Completed phase III clinical studies

Thienopyridines Ticlopidine (1st generation)

250 mg twice daily (Picard-Fraire 1983)

Oral Prodrug CYP P450 dependent (multi-step)

Irreversible ~3–5 days STARS (Leon et al. 1998) ISAR (Schomig et al. 1996)

Clopidogrel (2nd generation)

300–600 mg LD 75 mg MD

Oral

Prodrug CYP P450 dependent (2 steps)

Irreversible ~2–4 h CAPRIE (Committee CS 1996) CURE (Yusuf et al. 2001) CREDO (Steinhubl et al.2002)

Prasugrel (3rd generation)

60 mg LD 5–10 mg MD

Oral Prodrug CYP P450 dependent (single step)

Irreversible ~1–2 h TRITON-TIMI 38 (Wiviott et al. 2007b)

Non-thienopyridines Ticagrelor 180 mg LD

90 mg MD twice daily

Oral

Direct-acting No biotransformation

Reversible ~1–2 h PLATO (Wallentin et al. 2009)

Cangrelor 30 mg/kg bolus, 4 mg/kg/min Infusion

i.v.

Direct-acting No biotransformation

Reversible ~15–30 min CHAMPION-PCI CHAMPION-PLATFORM (Bhatt et al. 2009; Harrington et al. 2009)

Elinogrel Oral: 50–150 mg Intravenous: 80 or 120 mg bolus twice daily

Oral or i.v.

Direct-acting No biotransformation

Reversible

Not well characterized dependent on oral or intravenous

Outstanding

Tabel 1: Farmacologische eigenschappen van P2Y12 inhibitors (8).

1.7.2.1 Clopidogrel Deze thiënopyridine van de tweede generatie, werd in 1997 door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd nadat de “A randomised, blinded, trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events (CAPRIE)” studie klinische superioriteit over aspirine kon bewijzen. Het heeft door zijn veiliger profiel het gebruik van ticlopidine zo goed als volledig obsoleet gemaakt. Het is tevens de meest voorgeschreven P2Y12-receptor inhibitor bij patiënten die percutane coronaire interventie (PCI) hebben ondergaan (8). Dit medicijn zal verder uitgebreid worden besproken onder sectie 2 van de resultaten.

1.7.2.2 Nieuwe generatie P2Y12-receptor inhibitoren De nieuwe generaties P2Y12-receptor inhibitoren zijn non-thiënopyridine derivaten en hoeven geen metabole activatie. Onder deze groep vallen ticagrelor, cangrelor en elinogrel. Deze drie medicijnen blokkeren de P2Y12-receptor op reversibele wijze. Ticagrelor is het enige medicijn dat momenteel commercieel beschikbaar is in België. Het werd in 2011 in Europa op de markt gebracht. Onder sectie 3 van de resultaten bespreken we verder de farmacologische eigenschappen en het klinisch effect van ticagrelor.

1.7.3 Dipyridamole Dipyridamole inhibeert plaatjes via twee mechanismen: ten eerste gaat het nucleotide fosfodiesterase inhiberen, waardoor de afbraak van cAMP verhinderd wordt. Ten tweede verhindert het de opname van adenosine, waardoor activatie wordt verhinderd. Dipyridamole heeft ook een

18

vasodilaterend effect doordat het de concentratie cyclisch guaninemonofosfaat (cGMP) hoog houdt (8).

1.7.4 Antagonisten van GP IIb/IIIa Deze middelen blokkeren de GP IIb/IIIa-receptoren, ook gekend onder de naam αIIbβ3 integrines. Deze receptoren zijn verantwoordelijk voor het vormen van aggregaten. Dit doen ze door stevige binding aan te gaan met fibrinogeen. Het blokkeren van deze receptoren is een efficiënte manier om aggregaatvorming tegen te gaan, en thrombose te vermijden. Er bestaan drie verschillende soorten, elk met hun eigen specifieke profiel. Deze middelen gebruikt worden in combinatie met andere therapie, zoals warfarine en aspirine. (8)

19

2 Clopidogrel, de tweede generatie thiënopyridines

2.1 Farmacokinetiek

2.1.1 Absorptie, metabolisatie en plasmaspiegels Clopidogrel wordt in het lumen van de dunne darm opgenomen door middel van transport doorheen de adenosinedifosfaat bindende cassette (ABC) (8).

Slechts 50 % van het ingenomen geneesmiddel wordt geabsorbeerd. Meteen na absorptie wordt 85 % opgenomen medicijn geïnactiveerd door esterases. Daardoor kan slechts 15 % worden omgezet tot de actieve metaboliet (AM) (20). De omzetting tot de AM gebeurt in twee stappen. Verschillende CYP isoenzymen katalyseren de omzetting tot de AM. In de eerste stap wordt clopidogrel tot een inactieve metaboliet gevormd door CYP1A2, CYP2B6, en CYP2C19. Tijdens de tweede stap wordt de AM gevormd na tussenkomst door CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19 en CYP3A4 (20). Doordat CYP2C19 beide stappen tot de omzetting naar de AM katalyseert, speelt dit enzym een belangrijke rol bij de bioactivatie (8).

Aangezien eerst een actieve metaboliet moet gevormd worden, is de tijd tot het bereiken van de plasma-piekconcentratie (tmax) een belangrijke parameter om het werkingsprofiel van clopidogrel te beschrijven. We kunnen verwachten dat de bioactivatie voor een verlenging van de tmax zal zorgen. In de literatuur werd gevonden dat de tmax tussen 0.5 tot 1 uur bedraagt volgens de ene bron (20) en 1 tot 2 uur bedraagt volgens de andere (8).

2.1.2 Eigenschappen, binding en distributie De pKa van de AM ligt tussen 3.0 en 3.4; hierdoor zal bij pH 7.4 de molecule zich volledig in de geïoniseerde vorm bevinden (17).

De prodrug is heel sterk lipofiel en onoplosbaar in water. De therapeutische toedieningsvorm wordt bereid met farmaceutische zouten, waardoor ze wel in het lichaam worden opgenomen. De AM heeft door de metabolisatie een hogere graad van wateroplosbaarheid. De AM is zeer reactief en instabiel en kon bijgevolg tot op heden nog niet op een staal worden aangetoond (17).

Clopidogrel is voor 98 % gebonden op plasma-proteïnen, en de AM is voor 94 % gebonden (20).

2.1.3 Eliminatie en excretie Het halfleven van de onderhoudsdosis van 75 mg clopidogrel bedraagt 6u (20). Aangezien de AM een permanente binding aan gaat met de P2Y12-receptor, is de plasmaspiegel geen betrouwbare parameter om het klinisch effect in te schatten. De inhibitie wordt aangehouden na het verdwijnen van clopidogrel uit het plasma. Het effect blijft gedurende de levensduur van de thrombocyt aanhouden.

Excretie van clopidogrel gebeurt voor 46 % via fecale weg, en voor 50 % via de urine. De AM wordt hoofdzakelijk urinair (60 %) en voor een deel fecaal (23 %) uit het lichaam verwijderd (20).

2.2 Farmacodynamiek Het therapeutische doelwit is de P2Y12-receptor. De AM van clopidogrel gaat de receptor op de bindingsplaats voor ADP blokkeren. Hierdoor kan de P2Y12-receptor niet meer door ADP in de geactiveerde toestand gebracht worden. We spreken van irreversibel antagonisme. De AM zal zich

20

permanent binden op de P2Y12-receptor door middel van disulfidebruggen, en vertoont geen enkele intrinsieke activiteit (20). Het antagonisme kan niet overwonnen worden door het toevoegen van een hoeveelheid agonist. Er wordt echter aangenomen dat deze permanente binding ervoor gaat zorgen dat enkel de receptoren op de celmembraan geïnactiveerd worden. De receptoren die zich in het cytoplasma bevinden, en externaliseren bij activatie, zouden dus geen inhibitie ondervinden, aangezien de plasmaconcentratie van de AM op dat ogenblik al laag is (26).

De maximale inhibitie van plaatjesaggregatie (IPA) is dosisafhankelijk, en bereikt zijn maximale waarde 2 uur na toediening van 600 mg prodrug, dit is de oplaaddosis (20, 21). De ONSET OFFSET studie vond echter dat de IPA, 8 uur na inname van de oplaaddosis, groter was dan na 2 uur (26). De concentratie waarbij de helft van de receptoren bezet worden door de AM van clopidogrel -half maximale inhiberende concentratie (IC50)-, bedraagt in vivo 1.8 µM (20).

De onderhoudsdosis bedraagt 75 mg éénmaal daags. Zonder inname van de oplaaddosis, wordt de steady-state pas bereikt na 3 tot 7 dagen (21).

Door het irreversibele karakter van de binding, houdt de inhibitie van de plaatjes lang aan. Volgens Prince et al. keert de plaatjesfunctie 3 tot 5 dagen na het stoppen met innemen volledig terug (14). Dat verklaart ook waarom, ondanks de halfwaardetijd van zes uur, 1 dosis per dag volstaat (20).

Hierbij moet vermeld worden dat er een zeer grote variabiliteit werd waargenomen in de dosis-responscurve na éénmalige toediening van 600 mg clopidogrel (cfr. 2.2.1)

Naast de werking op de P2Y12-receptoren, werd ook een down-regulatie van P-selectines op de thrombocyten waargenomen onder behandeling met clopidogrel. De concentratie van CRP in het serum werd ook lager tijdens de behandeling (20).

2.2.1 Variabiliteit van het klinisch antwoord Figuur 8 illustreert de verdeling van de plaatjesinhibitie onder patiënten die eenzelfde dosis clopidogrel kregen toegediend (8).

Zoals de afbeelding aantoont, hebben sommige patiënten weinig klinisch effect onder behandeling met clopidogrel. Dit fenomeen wordt beschreven als hoge residuele plaatjes hyperreactiviteit (HPR) en komt, afhankelijk van de bron, voor bij 8 % tot 21 % (21). Volgens ander onderzoek tussen 20 % en 30 % van de patiënten (8).

Wanneer drie verschillende meetmethoden, die de plaatjesfunctie evalueren, worden gecombineerd, zal in 45 % van de testpopulatie minstens één test positief zijn voor HPR (18).

21

Figuur 8: Variabiliteit in antwoord op clopidogrel. Verdeling van bloedplaatjesfunctie gemeten in een studie van PCI behandelde patiënten, na oplaaddosis van clopidogrel (600 mg). Verkregen waarden worden als ADP-geïnduceerde aggregatie units (AU)/ min. (8)

Het omgekeerde fenomeen werd ook waargenomen: een sterker klinisch antwoord op de therapeutische dosis clopidogrel. Deze worden aangeduid als ‘enhanced-responders’. Zij vertonen een sterke respons op clopidogrel en hebben vaker complicaties zoals ernstige bloedingen (8).

Er werden verschillende factoren geïdentificeerd die deze variabiliteit in klinisch antwoord verklaren. Daarbij spelen zowel factoren van niet-genetische oorsprong een rol, alsook factoren met een genetische achtergrond.

De niet-genetische factoren worden hieronder in tabel 2 samengevat. Vooral een hoge BMI, gestegen inflammatoire parameters en diabetes mellitus worden geassocieerd met een afgenomen klinisch effect van clopidogrel bij patiënten met acuut coronair syndroom (ACS), MI en cardiogene shock. Men vermoedt dat voorgenoemde factoren zorgen voor een verminderde absorptie, metababolisatie en bioactivatie van clopidogrel (8). Interacties met andere geneesmiddelen worden verder besproken onder 2.4.

Persoonlijke factoren Comorbiditeit Farmacologische interactie Leeftijd Geslacht Body mass index (BMI) Nierfunctie Ejectiefractie Rookgedrag

Diabetes mellitus Systemische inflammatie Acuut coronair syndroom (ACS) Cardiogene shock

Protonpomp inhibitoren (PPI) Calcium kanaal blokkers (CACB) Coumarines Statines

Tabel 2: Geïdentificeerde niet-genetische factoren die het klinisch antwoord op clopidogrel beïnvloeden (8).

Een verdere verklaring voor de variabiliteit werd gezocht in genetische polymorfismen. Aangezien clopidogrel een prodrug is, spelen heel wat enzymen een rol bij de opname en activatie van het medicijn. Denk maar aan de lange lijst met CYP isoenzymen die bij de bioactivatie betrokken zijn (8).

Single nucleotide polymorphism (SNP) zijn polymorfismen van eiwitten waarbij slechts één coderend nucleotide verschillend is. Dit is de meest voorkomende vorm van genetische variabiliteit. SNP’s in de enzymen betrokken bij de absorptie en metabolisatie van clopidogrel, zijn verantwoordelijk voor 5.2 % tot 12 % van de variabiliteit van het klinisch antwoord op de therapie (8).

22

Het CYP2C19 enzym komt bij de mens voor in verschillende polymorfismen. Er is een CYP2C19*17 ‘gain of function’ variant. Dit polymorfisme zorgt voor een snellere metabolisatie. Patiënten met dit polymorfisme zullen verhoogde IPA waarden vertonen, en lopen ook meer risico op bloedingen (8).

Er bestaat een CYP2C19*2 variant met een volledig functieverlies. Daarnaast zijn er nog zes varianten gekend met een verminderde enzymactiviteit (CYP2C19 *3, *4, *5, *6, *7 en *8). Deze patiënten zullen bijgevolg erg weinig reactie vertonen op behandeling met clopidogrel. Bijgevolg treden er onder therapie vaker ischemische complicaties op (8).

Desondanks heeft recent onderzoek aangetoond dat alle gekende ziekte, polymorfismen (CYP2C19, CYP3A5, ABCB1, PON1), slechte therapietrouw, co-medicatie, voeding, roken, alcohol, demografische persoonsfactoren en bloedplaatjes hyperreactiviteit, slechts verantwoordelijk zijn voor 18 % van de interpersoonlijke variatie waargenomen in de farmacokinetiek. 35 – 65 % van de variatie in het klinisch resultaat kon door deze factoren worden verklaard (18).

De farmacodynamische respons is dus erg variabel en moeilijk te voorspellen. Sommige patiënten vertonen zo goed als geen effect van het medicijn, een fenomeen dat wordt benoemd als “ clopidogrel non-responders”, HPR of “clopidogrel resistentie” (21).

2.3 Klinisch effect De studie “clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events” (CAPRIE) toonde aan dat clopidogrel, in vergelijking met ASA, een superieur effect had op het voorkomen van herseninfarct, myocard infarct (MI) of vasculaire sterfte, bij patiënten met recent herseninfarct, myocard infarct of symptomatisch perifeer arterieel lijden (PAD) (16).

Dit werd bevestigd door het “clopidogrel in unstable angina to prevent recurrent events” (CURE) onderzoek. Zij vonden dat additie van clopidogrel aan aspirine, de zogenaamde combinatietherapie, 20 % reductie gaf van cardiovasculaire sterfte, MI en beroerte (19).

Het klinisch effect is zeer individueel verschillend en werd hierboven omschreven met de term HPR. HPR is geassocieerd met een slechtere klinische uitkomst (8). Er werd aangetoond dat HPR geassocieerd is met een hogere frequentie van stent-thrombose na PCI met drug eluting stents (DES) (28). Ook het risico op overlijden en MI is groter bij patiënten met HPR (20). Er werd onderzocht of een hogere dosis clopidogrel betere resultaten levert, om zo het probleem van HPR op te lossen.

Een kleine studie vond dat een dagelijkse dosis van 150 mg, zorgde voor een betere IPA, zonder een verhoogd bloedingsrisico (21).

Het “CURRENT OASIS” onderzoek aan dat een patiënten met ACS baat hebben bij een dubbele onderhoudsdosis. Een groep in deze studie kreeg een dosis van 150 mg per dag, en vertoonden significant minder ischemische events dan de groep die 75 mg per dag kreeg, zonder verhoogd bloedingsrisico tijdens PCI (29).

Een ander onderzoek van Mehta et al. vergeleek de resultaten tussen twee groepen patiënten met ACS. De ene groep kreeg de dubbele dosis, een regime van 600 mg oplaad dosis gevolgd door 150 mg dagelijks gedurende zes dagen, gevolgd door een dagelijkse dosis van 75 mg. De andere groep kreeg de standaard behandeling van 300 mg clopidogrel gevolgd door 75 mg dagelijks. De bevindingen van dit onderzoek waren verrassend, aangezien geen significante (P=0.3) verbetering merkbaar was op primaire eindpunten; cardiovasculaire sterfte, MI en ischemische beroerte. Er werd wel een significante reductie vastgesteld in thrombose van de stent, na PCI. Wat opvalt is dat deze studie wel

23

een verhoogd risico op majeure bloedingen aantoonde in de groep die de dubbele dosis clopidogrel kreeg toegediend (30).

Er is dus geen eenduidige evidentie die pleit om de dubbele dosis als standaardtherapie te gaan toepassen. De voordelen zijn te beperkt, en het risico op majeure bloedingen te ernstig om op lange termijn hoge dosis clopidogrel toe te dienen.

Het testen van de plaatjesfunctie om de therapie te evalueren en het therapeutisch raam individueel te bepalen, is een denkpiste die werd bewandeld. Dit principe wordt reeds toegepast voor de dosistitratie van coumarines op geleide van de INR. De evaluatie van de plaatjesfunctie wordt bepaald door het meten van het aantal aggregatie units (AU) elke minuut worden gevormd. Figuur 9 toont de klinische gegevens die de relatie weergeven tussen AU/min en het optreden van ongewenste effecten, zoals bloedingen, en de effectiviteit van de therapie, uitgedrukt als de kans op stent-thrombose (8).

Figuur 9: Verhouding tussen AU/min en de incidentie van bijwerkingen. In het blauw: het therapeutisch raam waarbij de verhouding tussen de ongewenste effecten optimaal is (8).

Het gebruik van clopidogrel is gerechtvaardigd bij ACS. Clopidogrel in combinatie met ASA, zogenaamde dubbele plaatjesinhibitie, is aangewezen bij ACS zonder ST elevatie (NSTEMI). Clopidogrel kan ook gebruikt worden bij MI met ST elevatie (STEMI), als andere plaatjesremmers niet voor handen zijn, of het gebruik ervan niet aan te raden is wegens contra-indicaties (20).

2.4 Interacties Aangezien clopidogrel een prodrug is, zal concomitant gebruik met medicijnen, die een invloed hebben op de CYP enzymen, een belangrijke weerslag hebben op het werkingsprofiel van clopidogrel. Alle medicijnen die substraten, inductoren of inhibitoren zijn van de CYP enzymen zijn mogelijke kandidaten voor drug-drug interacties (DDI). Er werden 227 medicijnen geïdentificeerd die mogelijk kunnen interacties vertonen met clopidogrel (20). Tabel 3 toont de verschillende CYP enzymen die bij metabolisatie zijn betrokken, en de geneesmiddelen die interacties vertonen met deze CYP enzymen.

24

Tabel 3: CYP enzymen verantwoordelijk voor de metabolisatie van clopidogrel, en de medicaties die met de matabolisatie interfereren (20).

De interactie van clopidogrel met PPI’s; zoals omeprazole en lansoprazole, en het statine atorvastatine werden uitvoerig onderzocht.

PPI’s worden soms voorgeschreven om de gastro-intestinale bijwerkingen van clopidogrel te verlichten. PPI’s inhiberen CYP2C19. Onderzoek toonde aan dat zowel de plasmaconcentraties van de AM en de IPA verlaagd zijn, indien PPI’s samen met clopidogrel worden voorgeschreven (21). Het is echter geen reden om PPI’s van de medicatielijst te schrappen, als hun therapie is aangewezen. Pantoprazole vertoont minder interactie met clopidogrel en is in combinatietherapie boven omeprazole te verkiezen (8).

Atorvastatine, is een medicijn dat cholesterolverlagend werkt, en daardoor een beschermend effect heeft op het cardiovasculair stelsel. Atorvastatine wordt vaak voorgeschreven aan patiënten die onder behandeling met clopidogrel staan. Atorvastatine is een substraat van CYP3A4. In vitro studies bewijzen een inhibitie van de metabolisatie van clopidogrel door dit medicijn. In vivo blijkt dat de IPA niet significant verandert onder gelijktijdige behandeling van atorvastatine en clopidogrel (21).

2.5 Ongewenste effecten De genoteerde ongewenste effecten van het CAPRIE onderzoek bedragen huiduitslag, diarree, gastro-intestinale last, intracraniale- en gastro-intestinale bloedingen en neutropenie. Al deze bijwerkingen kwamen ook voor in de groep die werd behandeld met aspirine, en deze groep kende steeds een hogere prevalentie van de bijwerkingen dan de groep behandeld met clopidogrel (16).

Het CREDO onderzoek toont aan dat combinatietherapie van ASA met clopidogrel gedurende één jaar geen significant verhoogd bloedingsrisico geeft ten opzichte van patiënten die gedurende 4 weken combinatietherapie kregen. Wanneer enkel gastro-intestinale bloedingen in beschouwing worden genomen, dan is er wel een significante toename van deze bijwerking. (15).

25

3 Ticagrelor, de nieuwe generatie P2Y12-receptor inhibitoren

Clopidogrel kent een aantal belangrijke tekortkomingen. De lange tijdsduur tot het effect klinisch merkbaar is, de grote interpersoonlijke variatie, de genetische polymorfismen van de CYP enzymes, en de interacties met andere geneesmiddelen, maken deze geneesmiddelen minder geschikt voor therapie. De nieuwe generaties P2Y12-receptor inhibitoren werden recent ontwikkeld om deze tekorten op te vangen.

Ticagrelor is een P2Y12-receptor inhibitor die oraal wordt ingenomen. Het medicijn behoort niet tot de groep van de thiënopyridines, maar tot de cyclopentyltriazolopyrimidines. In 2011 gaf de FDA de toestemming om het medicijn op de markt te verspreiden (17).

Tijdens de metabolisatie van ticagrelor, wordt een metaboliet gevormd, die hetzelfde klinisch effect vertoont als ticagrelor. Deze metaboliet kreeg de naam “AR-C124910XX”. Om een duidelijk beeld van de farmacokinetiek (PK) en farmacodynamiek (PD) te kunnen schetsen van ticagrelor, moet ook steeds het profiel van deze metaboliet worden beschreven.

3.1 Farmacokinetisch profiel van ticagrelor, een nieuwe P2Y12-receptor inhibitor

3.1.1 Absorptie, metabolisatie en plasmaspiegels Ticagrelor wordt snel opgenomen, met een absorptieconstante (Ka) die 0.67/h bedraagt. De biologische beschikbaarheid bedraagt 0.36 (23).

Onderzoek heeft aangetoond dat ticagrelor en AR-C124910XX zich gedragen volgens het één compartiment model, met eerste orde kinetiek, dat wil zeggen dat de PK dosisafhankelijk is (23).

Ticagrelor wordt door CYP enzymes gemetaboliseerd tot meer dan tien verschillende molecules. Van die verschillende metabolieten, is AR-C124910XX de meest abundante. Deze metaboliet vertoont daarenboven dezelfde werking als ticagrelor, zorgt dus net als ticagrelor voor blokkade van de P2Y12 -receptor. De omzetting van ticagrelor naar AR-C124910XX wordt gekatalyseerd door de CYP3A4/5 isoenzymen (21).

Studies met radioactief gelabeld ticagrelor, heeft aangetoond dat ticagrelor erg onderhevig is aan metabole omzetting. Deze conclusie werd getrokken via de waarneming dat slecht een klein percentage onveranderd via de urine wordt uitgescheiden (24).

De oplaaddosis van ticagrelor bedraagt een éénmalige toediening van 180 mg. Uit klinische experimenten met deze dosis konden volgende kenmerken worden vastgesteld:

• de tijd totdat de maximale plasma concentratie van ticagrelor werd bereikt, bedraagt 2 uur • de tmax voor de AM, AR-C124910XX, bedraagt 2.0 tot 3.8 uur • het relatieve aandeel van AR-C124910XX was na éénmalige dosis ongeveer 21 % ten opzichte

van ticagrelor (22).

Een andere studie, met een kleinere bewijskracht, aangezien er maar zes testpersonen deelnamen, vond volgende PK waarden na toediening van een éénmalige dosis van 200 mg ticagrelor: de tmax voor clopidogrel werd bereikt na 1.5 uur. tmax van de metaboliet, AR-C124910XX werd bereikt na 3.0 uur (24).

26

Wanneer we de PK bekijken bij steady-state, dat wil zeggen na 14 dagen twee keer per dag 90 mg ticagrelor, dan vinden we volgende gegevens: het relatieve aandeel van AR-C124910XX is nu toegenomen tot één derde (22).

Figuur 10 toont de plasmaspiegels van ticagrelor en zijn actieve metaboliet, zowel voor éénmalige dosering als bij steady-state.

Figuur 10: links de plasmaspiegels in functie van de tijd. Links: de plasmaspiegels van de actieve metaboliet; rechts de plasmaspiegels van ticagrelor. a: na éénmalige inname; b: na steady-state (22).

3.1.2 Eigenschappen, binding en distributie Ticagrelor en de AM komen bij een fysiologische een pH van 7.4 in ongedissocieerde toestand voor. Ze zijn wateroplosbaar en worden daardoor snel opgenomen (17).

De metabolieten van ticagrelor werden bij staalname voornamelijk in het plasma teruggevonden. De verhouding van de concentraties voor plasma ten opzichte van vol bloed, doen besluiten dat ticagrelor en zijn metabolieten zich niet vasthechten op, of binnendringen in rode bloedcellen (24).

Het distributievolume van ticagrelor bedraagt 221 L. Als we daarbij de biologische beschikbaarheid in rekening brengen, komen we op een werkelijk distributievolume van 80 L. Dit is vier keer meer dan de hoeveelheid extracellulaire vloeistof. Daaruit kunnen we besluiten dat ticagrelor zich in belangrijke mate gaat bevinden in de weefsels (23).

Voor AR-C124910XX bedraagt het distributievolume 13.1 L (23).

27

3.1.3 Eliminatie en excretie De klaring van ticagrelor bedraagt 14.0 L/uur. Roken zorgt voor een afname van de klaring met 22 %. CYP3A4 inducers zorgen voor een toename van de klaring met 110 %. Terwijl CYP3A4 inhibitoren zorgen voor een inkrimping van de klaring met 64 % (23).

De halfwaardetijd voor ticagrelor bedraagt 8 uur, en voor AR-C124910XX 12 uur (24).

De relatief lange halfwaardetijd van ticagrelor kan verklaard worden door de grote mate waarin ticagrelor zich gaat binden in de weefels (23).

De klaring van AR-C124910XX bedraagt 9.06 L/uur. Roken zorgt voor een toename van 28 % op de klaring. Bij vrouwen ligt de klaring 31 % lager dan bij mannen. CYP3A4 inducers verhogen de klaring met 99 % (23).

3.2 Farmacodynamisch profiel van ticagrelor Van Giezen et al. onderzochten de PD van met radioactief gemerkt ticagrelor. Ze vonden dat ticagrelor krachtig, maar reversibel op de P2Y12-receptor bindt, met volgende kinetiek: Kon (1.1 ± 0.2) x 10-4 nM -1 s-1 en Koff (8.7 ± 1.4) x 10-4 s-1. Gemerkt ADP werd bij binding van ticagrelor met de receptor, niet verdrongen. Daaruit werd er besloten dat ticagrelor op een andere plaats de receptor inhibeert dan de ADP bindingsplaats. Clopidogrel oefent daarentegen wel zijn effect uit de oor de bindingsplaats van ADP te blokkeren. Voor ticagrelor is de binding van niet competitieve aard (33).

De mate van IPA is evenredig met de plasmaconcentratie van ticagrelor plus zijn AM, AR-C124910XX (22).

Dertig minuten na toediening van de oplaaddosis van 180 mg, is reeds een inhibitie van de plaatjes merkbaar. De IPA bedraagt op dat moment reeds 44 %. Figuur 11 toont de IPA van ticagrelor en clopidogrel in functie van de tijd. Daarop is te zien dat de IPA reeds maximaal is, 2 uur na toediening, en gedurende zes uur constant bleef. De IPA was in de eerste 24 uur steeds hoger voor ticagrelor dan voor clopidogrel. Acht uur na toediening van ticagrelor, nam de IPA weer snel af tot 48 uur na inname (26).

Op het tweede deel van de figuur is te zien hoe de IPA recupereert na 6 weken therapie. De pijl met de laatste onderhoudsdosis stelt de steady-state situatie voor. We merken dat tijdens de steady-state, ticagrelor een hogere mate van plaatjesinhibitie vertoont. Algemeen kan gesteld worden dat de IPA sneller bereikt wordt met ticagrelor, en de mate van inhibitie is ook groter dan bij clopidogrel (26).

28

Figuur 11: IPA voor ticagrelor, clopidogrel en placebo in functie van de tijd (26).

Bij stopzetten van de therapie gaat de plaatjesfunctie recupereren. Zoals te zien is op de figuur, is de IPA voor ticagrelor gedurende de eerste 24 tot 48 uur stabiel. Daarna zakt de IPA van ticagrelor snel, om 72 uur na het stopzetten een significant lagere waarde te hebben dan de IPA van clopidogrel. De IPA waarde die ticagrelor 3 dagen na het stoppen bereikt, wordt door clopidogrel pas op dag 5 gehaald (26).

De RESPOND studie toont aan dat ticagrelor een sterkere inhibitor is van de bloedplaatjes dan clopidogrel (27).

Het farmacodynamisch profiel van ticagrelor is robuuster en beter te voorspellen dan dat van clopidogrel.

3.3 Klinisch effect van ticagrelor De resultaten van de PLATO studie werden in 2009 gepubliceerd. Deze studie vergeleek de klinische resultaten bij 18.264 patiënten die werden gehospitaliseerd met ACS. De patiënten werden per toeval in twee studiegroepen verdeeld. De ene groep werd behandeld met clopidogrel en de andere groep met ticagrelor. De studie werd dubbel blind uitgevoerd. De patiënten werden 12 maanden opgevolgd. Door de design van de studie heeft dit onderzoek sterke bewijskracht. De primaire eindpunten waren sterfte door vasculaire oorzaken: MI en beroerte. Beroerte werd gedefinieerd als focaal verlies van neurologische functie, veroorzaakt door ischemie of bloeding, met residuele symptomen 24 uur na ontstaan, of met overlijden als gevolg. De secundaire eindpunten worden weergegeven in tabel 4.

De behandeling met ticagrelor bestond uit een éénmalige dosis van 180 mg gevolgd door twee maal daags 90 mg. De groep die met clopidogrel werd behandeld, kreeg een éénmalige dosis van 300 mg of 600 mg, gevolgd door 75 mg dagelijks. In de groep die met ticagrelor werd behandeld, waren 9.8 % van de patiënten een jaar later overleden aan een aandoening die onder de primaire eindpunten viel, daar waar bij de groep met clopidogrel het overlijden 11.7 % bedroeg. De P-waarde voor deze bevinding is < 0.001. De overleving van gehospitaliseerde patiënten met ACS is in het voordeel van ticagrelor, in vergelijking met clopidogrel (25). De opmerking moet hierbij gemaakt worden dat overlijden door fatale bloeding inbegrepen zit in de primaire eindpunten. Aangezien fatale bloedingen net een ongewenst effect kunnen zijn van anti-aggregerende therapie, wordt dit meegenomen in de parameters om het effect op de harde eindpunten te meten.

29

Figuur 12 toont aan dat ticagrelor reeds vanaf het starten met de therapie voordeel heeft op de primaire eindpunten, en dit gedurende de volledige duur van de studie aanhoudt.

Figuur 12: cumulatieve incidentie van de primaire eindpunten in functie van de tijd (25).

Ticagrelor geeft ook een betere overleving voor patiënten ongeacht of invasieve behandeling is aangewezen, of niet. En de incidentie van stent-thrombose was ook lager bij behandeling met ticagrelor.

Ook op de secundaire eindpunten scoorde ticagrelor beter dan clopidogrel, voor de lijst verwijzen we naar tabel 4. De incidentie van MI is ook lager onder behandeling met ticagrelor (25).

30

Tabel 4: Primaire en secundaire eindpunten van het PLATO onderzoek (25).

Het klinisch effect van ticagrelor is gerelateerd aan de IPA, zonder een additioneel risico op bloedingen. Voor clopidogrel is dit niet het geval, daar is een hogere IPA wel gerelateerd aan een hoger risico op bloedingen (cfr. figuur 9) (25).

De PLATO studie toont geen inter-individuele verschillen van het klinisch antwoord op de behandeling, zoals dat bij clopidogrel werd waargenomen. De studies met clopidogrel toonden aan dat er zogenaamde non-responders zijn, het fenomeen werd hierboven beschreven als HPR. De RESPOND studie werd opgezet om na te gaan in welke mate therapie met ticagrelor aanslaat bij clopidogrel responders en clopidogrel non-responders, met stabiele CAD.

De RESPOND studie werd dubbel blind uitgevoerd bij 98 testpersonen die lijden aan stabiele CAD. Deze cross-over studie categoriseerde de onderzoeksgroep in responders en non-responders. Beide groepen werden willekeurig therapie met clopidogrel + ASA 100 mg of ticagrelor + ASA 100 mg toegewezen. De therapie van ticagrelor bestond uit een oplaaddosis van 180 mg gevolgd door 90 mg tweemaal daags. De therapie met clopidogrel startte met een oplaaddosis van 600 mg gevolgd door 75 mg dagelijks. Na 14 dagen werd van therapie gewisseld (27).

De PLATO studie toonde aan dat ticagrelor betere klinische resultaten haalt dan clopidogrel. De resultaten van de RESPOND studie tonen aan dat ticagrelor een sterkere inhibitor is van plaatjesaggregatie, dan clopidogrel. De IPA waarden lagen voor ticagrelor significant hoger. En dit onafhankelijk de respons status op een behandeling met clopidogrel, zowel responders als non-responders hebben dus hogere IPA waarden onder behandeling met ticagrelor. De respons op ticagrelor wordt dus niet beïnvloed door responsiviteit op clopidogrel. Wisselen van clopidogrel naar ticagrelor zorgde voor een toename van de IPA, zowel bij responders, als non-responders. Omgekeerd zakte de IPA. Ticagrelor kon HPR overwinnen. Er kan dus besloten worden dat ticagrelor effectievere inhibitie geeft van de plaatjes, en kan aangewend worden om non-respons op clopidogrel te behandelen (27).

Figuur 13: IPA in functie van de tijd, cross over studie. links: IPA waarden voor clopidogrel non-respondenten; rechts IPA waarden voor clopidogrel respondenten (27).

31

Onderzoek heeft aangetoond dat ticagrelor kan aangewend worden tijdens milde therapeutische hypothermie (MTH). In de studie werd milde therapeutische hypothermie toegepast na PCI, bij patiënten die een hartstilstand hadden op basis van AMI. Ticagrelor werd via naso-gastrische sonde toegediend gedurende vier dagen. De plaatjesinhibitie werd met laboratoriumtechnieken geëvalueerd. Clopidogrel werd onder dezelfde omstandigheden getest, daar bleek 77 % van de patiënten niet te reageren op de therapie, voor ticagrelor was dat slechts 1 % (31). Dit kan verklaard worden doordat clopidogrel metabole activatie vereist, en deze enzymatische reacties verstoord zijn tijdens de hypothermie.

Het klinisch effect werd bewezen in klinische studies. Om een projectie te maken naar de reële voordelen van het medicijn, moeten we daar de therapietrouw bij in rekening nemen. Vrijens et al. berekende welke invloed het overslaan van één of meerdere dosissen heeft op de geschatte IPA (eIPA). Het is algemeen geweten dat de therapietrouw afneemt naarmate men meer medicijnen moet innemen.

Figuur 14 toont de frequenties van het overslaan van een dosis. Dit is afhankelijk van het doseringsinterval. De linkergrafiek toont de frequent van het missen van een dosis, indien die tweemaal daags moet worden genomen. De rechter grafiek toont de frequentie van een therapie met één enkel dosering per dag.

Zoals op de grafiek te zien is, wordt de therapiegetrouwheid lager naarmate de doseringsfrequentie hoger is. Aangezien ticagrelor tweemaal daags moet worden ingenomen, zal de therapietrouw dus lager zijn dan voor clopidogrel, dat slechts éénmaal daags dient ingenomen te worden.

Figuur 14: Frequentie het missen van een dosis. Van boven naar beneden: de kans op het overslaan van opeenvolgende dosissen. Bovenste lijn: het overslaan van één dosis, de twee lijn: het overslaan van twee opeenvolgende dosissen etc (32).

Vrijens et al. onderzocht wat daar de klinische implicaties van zijn. Met andere woorden; is ticagrelor, ondanks de slechtere therapietrouw, nog steeds superieur ten opzichte van clopidogrel? Wanneer we de farmacometrische equivalentie in rekening brengen, dan zien we op figuur 15 dat het missen van één enkele dosis ticagrelor de IPA niet lager doet zakken dan de IPA onder strikte clopidogrel behandeling.

32

Figuur 15: eIPA voor clopidogrel en ticagrelor; het effect op de IPA van het overslaan van dosissen (32).

Rekenkundig werden alle probabiliteiten voor het overslaan van een dosis(sen) verrekend met het werkingsprofiel van het medicijn. Daarbij werd zoals in figuur 14 staat weergegeven, rekening gehouden met de verschillende probabiliteiten per doseringsregime.

De berekening toonde aan dat de gemiddelde eIPA over 30 dagen 81.1 % ± 5.9 % bedraagt voor ticagrelor tweemaal daags en 55.0 % ± 8.1 % voor clopidogrel eenmaal daags P < 0.001 (32). Ondanks de lagere therapietrouw, zijn de eIPA waarden voor ticagrelor significant beter dan deze van clopidogrel.

3.4 Interacties Interacties worden verwacht bij geneesmiddelen die een invloed hebben op de CYP enzymen. CYP-inducers zullen de klaring van ticagrelor en de AM verhogen, terwijl CYP-inhibitoren de klaring doen afnemen. Roken zorgt voor een toename van de klaring.

Aangezien ticagrelor geen metabole activatie vereist zal het werkingsprofiel niet in bijzondere mate worden gewijzigd door geneesmiddelen interacties, zoals dat voor clopidogrel wel het geval is. Hier zullen CYP inhibitoren net zorgen voor een toename van de plasmaconcentratie, en IPA, waar voor clopidogrel het omgekeerde geldt.

3.5 Ongewenste effecten Dyspnoe werd bij 13.8 % van de patiënten vastgesteld, maar duurde gemiddeld niet langer dan een week. Het was voor 0.9 % reden om te stoppen met de therapie (25).

Tijdens de eerst week onder behandeling werd een holteronderzoek uitgevoerd. Daarbij werden ventriculaire pauzes vastgesteld. Dit kwam vaker voor bij de behandeling met ticagrelor ten opzichte van clopidogrel. Deze verliepen meestal symptoomloos en syncope of pacemakerimplantatie was voor beide groepen gelijk. Na 30 dagen behandeling werd er geen verschil meer vastgesteld tussen beide groepen (25).

Er werden meer intracraniale bloedingen (0.3 % vs. 0.2 % P=0.06) en meer intracraniale bloedingen met fatale afloop (0.1 % vs. 0.01 % P=0.02) vastgesteld voor ticagrelor, in vergelijking met clopidogrel. Anderzijds waren er minder episodes van andere fatale bloedingen voor ticagrelor [0.1%] vs. [0.3%] in de clopidogrel groep; P = 0.03 (25). Er werden ook meer gastro-intestinale bloedingen gerapporteerd (25).

33

Discussie De inclusiecriteria voor de voor de studies zorgt ervoor dat hier enkel de resultaten worden weergegeven van onderzoek bij patiënten met stabiele CAD (ONSET-OFFSET en RESPOND) of ACS (PLATO). Hierdoor ontbreek informatie over de werking en klinisch effect van ticagrelor bij andere aandoeningen.

De testpersonen van de studies waren voornamelijk blanke mannen. Het is onvoldoende beschreven in deze scriptie of andere etnische achtergrond, of andere persoonskenmerken invloed hebben op het werkingsprofiel van de medicijnen.

De exclusiecriteria zorgen er voor dat er weinig gekend is over ticagrelor in combinatie met andere medicijnen en comorbiditeit.

Er ontbreek informatie over de klinisch bewezen indicaties waarvoor ticagrelor kan worden voorgeschreven.

Conclusie Clopidogrel is een prodrug en vereist metabole activatie alvorens het zijn effect kan uitoefenen. De actieve metaboliet bindt permanent op de P2Y12-receptor van de bloedplaatjes en verhindert zo activatie van de receptor.

Door de obligate metabole activatie kent clopidogrel een traag werkingsprofiel met een variabele klinische respons. De enzymatische activatie van clopidogrel is onderhevig aan allerlei factoren en zal zorgen voor een variabele respons op de behandeling. Deze variabele respons is enerzijds geassocieerd is met bloedingen voor de patiënten die hoge plaatjesinhibitie vertonen, en anderzijds met stent-thrombose en MI voor de patiënten die HPR vertonen.

Factoren die een invloed hebben op de werking van clopidogrel zijn de volgende: genetische polymorfismen van de CYP enzymen, DDI, comorbiditeit, persoonlijke factoren zoals leeftijd, roken etc.

Ticagrelor is een P2Y12-receptor inhibitor van de nieuwe generatie en vereist geen metabole activatie. Ticagrelor gaat door reversiebele non-competitieve binding de P2Y12-receptor blokkeren. Doordat ticagrelor geen metabole activatie vereist, is het werkingsprofiel beter te voorspelen en minder onderhevig verstorende factoren. De RESPOND studie bevestigde dat ticagrelor werkzaam was bij patiënten met lage IPA wegens clopidogrel resistentie.

De PLATO studie toonde dat de overleving beter was met behandeling met ticagrelor dan met clopidogrel. Zonder een significante toename in het bloedingsrisico.

De ONSET-OFFSET studie bewees dat maximale IPA sneller wordt bereikt door ticagrelor en hogere waarden behaalt dan clopidogrel. De IPA keert voor ticagrelor sneller terug naar normale waarden, na stopzetting van de behandeling.

Ondanks de tweedagelijkse dosis, heeft het TWICE project aangetoond dat de eIPA onder therapie met ticagrelor superieur is aan deze met clopidogrel.

34

Lijst met afkortingen

ABC adenosine bindende cassette AC adenylyl cyclase ACS acuut coronair syndroom ADP adenosinedifosfaat AM actieve metaboliet AMI acuut myocard infarct AMP adenosinemonofosfaat ASA acetylsalicylzuur ATP adenosinetrifosfaat AU aggregatie units BMI body mass index CACB calcium kanaal blokkers CAD “coronary artery disease”; aantasting van de coronairen cAMP cyclisch adenosinemonofosfaat CAPRIE “clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events” cGMP cyclisch guaninemonofosfaat Cmax maximale plasmaconcentratie COX cyclo-oxigenase CREDO clopidogrel for the Reduction of Events During Observation CURRENT OASIS “Clopidogrel and Aspirin Optimal Dose Usage to Reduce Recurrent Events –

Seventh organization to Assess Strategies in Ischemic Symptoms” studie CYP P450 cytochroom P450 DAG diacylglycerol DDI drug - drug interacties DES drug eluting stent DTS dens tubulair systeem eIPA geschatte IPA FcR-γ Fc receptor gamma FDA food and drug administration GPCR G-proteïne gekoppelde receptor GP glycoproteïne HPR hoge residuele plaatjesactiviteit IC50 half maximale inhibitoire concentratie INR international normalized ratio IP3 inositoldifosfaat IPA inhibitie van plaatjesaggregatie IV intraveneus Ka absorptieconstante

35

MI myocard infarct MLCK myosine lichte keten kinase MTH milde therapeutische hypothermie NSTEMI non ST elevatie myocard infarct ONSET-OFFSET Randomized Double-Blind Assessment of the ONSET and OFFSET of the Antiplatelet

Effects of Ticagrelor Versus Clopidogrel in Patients With Stable Coronary Artery Disease

PAD perifeer arteriële ziekte PAR protease geactiveerde receptor PCI percutane coronaire interventie PD farmacodynamiek PGHS prostaglandine H synthase PI3K fosfoinositide 3-kinase PIP2 fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat PIP3 fosfatidylinositol (3,4,5)-trisfosfaat PK farmacokinetiek PKA proteïne kinase A PKC proteïne kinase C PLA2 fosfolipase A2 PLATO PLATelet inhibition and patient Outcomes PLC fosfolipase C PMCA plasma membraan Ca2+ ATPase PPI protonpomp-inhibitoren PtdSer fosfatidylserine RESPOND Response to Ticagrelor in Clopidogrel Non-responders and Responders and Effect of

Switching Therapies SERCA sarco/endoplasmatisch reticulum Ca2+ ATPases SNP single nucleotide polymorphism STEMI myocard infarct met ST-elevatie t1/2 halfwaardetijd tmax tijdsduur totdat de maximale plasma concentratie wordt bereikt TxA2 thromboxaan A2 VASP vasodilator-stimulated fosfoproteïne VWF von Willebrand factor

36

Literatuurlijst

1. Broos K, Feys HB, De Meyer SF, Vanhoorelbeke K, Deckmyn H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. Elsevier Ltd; 2011;25(4):155–67.

2. Gachet C. P2Y12 receptors in platelets and other hematopoietic and non-hematopoietic cells. Purinergic Signal. 2012;8(3):609–19.

3. Gachet C, Léon C, Hechler B. The platelet P2 receptors in arterial thrombosis. Blood Cells, Mol Dis. 2006;36(2):223–7.

4. McNicol A, Israels SJ. Platelets and anti-platelet therapy. J Pharmacol Sci. 2003;93(4):381–96.

5. Clutton P, Folts JD, Freedman JE. Pharmacological control of platelet function. Pharmacol Res. 2001;44(4):255–64.

6. Secco GG, Parisi R, Mirabella F, Fattori R, Genoni G, Agostoni P, et al. P2Y12 Inhibitors : Pharmacologic Mechanism and Clinical Relevance. 2013;101–5.

7. de Gaetano G, Donati MB, Cerletti C. Prevention of thrombosis and vascular inflammation:benefits and limitations of selective or combined COX-1, COX-2 and 5-LOX inhibitors. Trends Pharmacol Sci. 2003;24:245–252.

8. Paolo Gresele, Gustav V.R. Born, Carlo Patrono CPP. Handbook of Experimental Pharmacology: Antiplatelet Agents 2012. 1-616 p.

9. Moroi M, Jung SM. Platelet glycoprotein VI: Its structure and function. Thromb Res. 2004;114(4):221–33.

10. Atkinson BT, Jarvis GE, Watson SP. Activation of GPVI by collagen is regulated by alpha2beta1 and secondary mediators. J Thromb Haemost 2003; 1:1278–87

11. Alberio L, Dale GL. Review article: platelet-collagen interactions: membrane receptors and intracellular signalling pathways. Eur J Clin Invest. 1999; 29(12):1066–76.

12. Garcia A, Kim S, Bhavaraju K, Schoenwaelder SM, Kunapuli SP. Role of phosphoinositide 3-kinase β in platelet aggregation and thromboxane A 2 generation mediated by G i signalling pathways. 2010;377:369–77.

13. Jung SM, Moroi M. Platelets Interact with Soluble and Insoluble Collagens through Characteristically Different Reactions 1998;273(24):14827–37.

14. Price MJ, Walder JS, Baker BA, Harm PD, Heiselman DE, Jakubowski JA, et al. Recovery of Platelet Function After Discontinuation of Prasugrel or Clopidogrel Maintenance Dosing in Aspirin-Treated Patients With Stable Coronary Disease 2013;59(25).

15. Aronow HD, Steinhubl SR, Brennan DM, Berger PB, Topol EJ, Investigators C, et al. Interventional Cardiology Bleeding risk associated with 1 year of dual antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention : Insights from the Clopidogrel for the Reduction of Events During Observation (CREDO) trial. Am Heart J [Internet]. Mosby, Inc.; 157(2):369–74.

16. Committee CS. A randomised , blinded , trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events (CAPRIE). 1996;348:1329–39.

17. Remko M, Remková A, Broer R. A Comparative Study of Molecular Structure, pKa, Lipophilicity , Solubility , Absorption and Polar Surface Area of Some Antiplatelet Drugs. 2016;

18. Frelinger AL, Bhatt DL, Lee RD, Mulford DJ, Wu J, Nudurupati S, et al. Clopidogrel pharmacokinetics and pharmacodynamics vary widely despite exclusion or control of polymorphisms (CYP2C19, ABCB1, PON1), noncompliance, diet, smoking, co-medications (Including Proton Pump Inhibitors), and pre-existent variability in platelet f. J Am Coll Cardiol. 2013;61(8):872–9.

19. Design S, Patients S. The New England Journal of Medicine EFFECTS OF CLOPIDOGREL IN ADDITION TO ASPIRIN IN PATIENTS WITH ACUTE CORONARY SYNDROMES WITHOUT ST-SEGMENT ELEVATION. 2001;345(7):494–502.

20. Ferri N, Corsini A, Bellosta S. Pharmacology of the New P2Y 12 Receptor Inhibitors : Insights on Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Properties. 2013;1681–709.

37

21. Floyd CN, Passacquale G, Ferro A. Comparative Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Platelet Adenosine Diphosphate Receptor Antagonists and their Clinical Implications. 2012;51(7):429–42.

22. Husted SE, Storey RF, Bliden K, Tantry US, Høimark L, Butler K, et al. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Ticagrelor in Patients with Stable Coronary. 2012;51(6):397–409.

23. Li J, Tang W, Storey RF, Husted S, Teng R. Population pharmacokinetics of ticagrelor in patients with acute coronary syndromes. 2016;

24. Teng R, Oliver S, Hayes MA, Butler K. Absorption , Distribution , Metabolism , and Excretion of Ticagrelor in Healthy Subjects ABSTRACT : 2010;38(9):1514–21.

25. Wallentin L. ticagrelor versus clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. New Engl J. 2009;2213–24

26. Gurbel PA, Bliden KP, Butler K, Tantry US, Gesheff T, Wei C, et al. Randomized Double-Blind Assessment of the ONSET and OFFSET of the Antiplatelet Effects of Ticagrelor Versus Clopidogrel in Patients With Stable Coronary Artery Disease The ONSET / OFFSET Study. 2009;

27. Gurbel PA, Bliden KP, Butler K, Antonino MJ, Wei C, Teng R, et al. Response to Ticagrelor in Clopidogrel Nonresponders and Responders and Effect of Switching Therapies The RESPOND Study. 2010;

28. Price MJ, Endemann S, Gollapudi RR, Valencia R, Stinis CT, Levisay JP, et al. Prognostic significance of post-clopidogrel platelet reactivity assessed by a point-of-care assay on thrombotic events after drug-eluting stent implantation. Eur Heart J. 2008;29(8):992–1000.

29. Mehta SR, Tanguay JF, Eikelboom JW, Jolly SS, Joyner CD, Granger CB, et al. Double-dose versus standard-dose clopidogrel and high-dose versus low-dose aspirin in individuals undergoing percutaneous coronary intervention for acute coronary syndromes (CURRENT-OASIS 7): A randomised factorial trial. Lancet [Internet]. Elsevier Ltd; 2010;376(9748):1233–43.

30. Mehta SR, Bassand J-P, Chrolavicius S, Diaz R, Eikelboom JW, Fox K a a, et al. Dose comparisons of clopidogrel and aspirin in acute coronary syndromes. N Engl J Med. 2010;363(10):930–42.

31. Bednar F, Kroupa J, Ondrakova M, Osmancik P, Kopa M, Motovska Z. Antiplatelet efficacy of P2Y12 inhibitors (prasugrel, ticagrelor, clopidogrel) in patients treated with mild therapeutic hypothermia after cardiac arrest due to acute myocardial infarction. J Thromb Thrombolysis [Internet]. Springer US; 2016;41(4):549–55.

32. Vrijens B, Claeys MJ, Legrand V, Vandendriessche E, Van De Werf F. Projected inhibition of platelet aggregation with ticagrelor twice daily vs. clopidogrel once daily based on patient adherence data (the TWICE project). Br J Clin Pharmacol. 2014;77(5):746–55.

33. van Giezen JJJ, Nilsson L, Berntsson P, Wissing BM, Giordanetto F, Tomlinson W, et al. Ticagrelor binds to human P2Y12 independently from ADP but antagonizes ADP-induced receptor signaling and platelet aggregation. J Thromb Haemost. 2009;7(9):1556–65.