ESTUDIO DE LA FRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS EN FÓRMULAS …

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TRABAJO FIN DE GRADO:

ESTUDIO DE LA FRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS EN

FÓRMULAS INFANTILES

Carlos Sabater Sánchez

Tutores: Dra. Antonia Montilla Dr. Marín Pródanov

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ABSTRACT

Human milk oligosaccharides have shown to have a wide range of biological activities including

their prebiotic effect. Since breastfeeding is not always possible, infant formulae are supplemented

with prebiotic oligosaccharides. Numerous studies point out the benefits of mixtures of galacto-

oligosaccharides (GOS) and fructo-oligosaccharides, (FOS) ratio 9/1 to exert similar effects to

breastfeed on children Nowadays, a great number of infant formula with prebiotics are disposal in

market, however not data have been reported on their composition. Therefore, the determination of

mono-, di- and oligosaccharide content of different commercial infant formulas, special infant

formula and dairy drinks has been carried out. Initially a precipitation with Carrez as clarifying

agent was selected for sample pre-treatment and two complementary chromatographic methods

have been applied (GC-FID and HPLC-RID) for the separation and quantification of carbohydrates,

showing their advantages, disadvantages and applications. According to the results obtained, GC-

FID is a more adequate technique which allows a better qualitative and quantitative determination

of carbohydrates of polymerization degree up to 7. Nevertheless, the GC-FID profiles allowed the

identification of the specific GOS and FOS commercial mixture that was added during the formulas

elaboration. For HPLC analysis, four ratio acetonitrile/water as mobile phase were tested, being

55:45 the best option. HPLC-RID analysis allowed the detection of polymers formed by 16

monomers. However, the individual quantification of single compounds was not possible.. The

utilization of both techniques allows an overall characterization of the carbohydrate fraction,

including prebiotic oligosaccharides in commercial infant formulae.

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ÍNDICE Página

1. INTRODUCCIÓN

1.1. La lactancia materna y las fórmulas infantiles 4

1.2. La leche materna 4

1.2.1. Composición de la leche materna 4

1.2.2. La flora intestinal en relación con la leche materna 5

1.3. Las fórmulas infantiles 6

1.3.1. Leche materna y fórmulas infantiles: Diferencias en la flora intestinal 6

1.3.2. Fórmulas infantiles: marco legal 6

1.3.3. Fórmulas infantiles con la fracción de carbohidratos modificada 7

1.3.3.1. Las fórmulas especiales: concepto y finalidad 8

1.3.3.2. Fórmulas infantiles enriquecidas en prebióticos 8

1.4. Los compuestos prebióticos 9

1.4.1. Los fructo-oligosacáridos (FOS) 9

1.4.2. Los galacto-oligosacáridos (GOS) 9

1.4.3. Mezclas de prebióticos comerciales 11

1.4.4. Fuentes alternativas de prebióticos 11

1.4.5. Regulación del uso de prebióticos en fórmulas infantiles 12

1.5. Análisis de la fracción de carbohidratos de Fórmulas Infantiles 12

1.5.1. Cromatografía en fase Líquida de Alta Eficacia (HPLC) 12

1.5.2. Cromatografía en fase Gaseosa (GC) 13

1.5.2.1. Reacciones que tienen lugar durante la derivatización 13

2. OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO 14

3. MATERIALES Y MÉTODOS 15

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 20

5. CONCLUSIONES 33

6. BIBLIOGRAFÍA 33

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1. INTRODUCCIÓN

1.1. La lactancia materna y las fórmulas infantiles

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) la leche materna constituye el

alimento más adecuado para los recién nacidos sanos a término, ya que aporta todos los nutrientes

necesarios durante el primer semestre de vida, a excepción de algunos micronutrientes como el

hierro en caso de bajo peso al nacer [1]. Además, se aconseja la lactancia materna complementada

con otros alimentos hasta los 2 años de vida. Por otro lado, conlleva una mejor regulación

metabólica y mayor protección inmunológica, disminuye el riesgo de sensibilidad alérgica y muerte

súbita y reduce la incidencia de enfermedades infecciosas y crónicas [2]. A pesar de estas

recomendaciones, no siempre es posible la lactancia materna siendo necesario el uso de fórmulas

infantiles que la sustituyen total o parcialmente, existiendo en la actualidad una gran demanda de

estos productos en el mercado. Su elaboración y contenido en nutrientes deben cumplir una serie de

requisitos y adaptarse a la legislación vigente. A medida que se van conociendo las diferentes

funciones que la leche humana tiene en el organismo de los recién nacidos se han ido desarrollando

ingredientes funcionales encaminados a la obtención de fórmulas infantiles capaces de simularlas.

En este sentido, tiene un gran interés el conocimiento de todo el proceso de colonización

microbiana [3], poniendo de manifiesto el beneficio potencial derivado de la adición de

microorganismos probióticos o de compuestos prebióticos a las fórmulas infantiles [4].

1.2. La leche materna

1.2.1. Composición de la leche humana

Es conocido el hecho de que la leche humana ejerce funciones de gran importancia además de la

nutritiva como la contribución al buen desarrollo de la flora intestinal. Posee diversos componentes

en capaces de modular el crecimiento de determinados tipos de bacterias. Se ha visto que el efecto

bifidogénico de la leche materna es debido al bajo contenido en proteínas y fósforo [5, 6], al alto

contenido en nucleótidos, a la presencia de la lactoferrina, (proteína capaz de quelar cationes hierro

e inhibir in vitro el crecimiento de algunos microorganismos patógenos [7]) y, especialmente a la

elevada concentración de oligosacáridos [8]. Estos últimos se encuentran en cantidades de 8 a 12

g/L, siendo el tercer componente mayoritario en su composición después de la lactosa (60 g/L) y los

lípidos (40 g/L). Estas concentraciones son considerablemente mayores en el calostro: de 15 a 23

g/L. En comparación, las leches del resto de mamíferos tienen contenidos en oligosacáridos muy

inferiores [9]. Actualmente se conocen casi 200 tipos de oligosacáridos diferentes, de los cuales 80

están caracterizados [10]. Difieren en composición monomérica, tamaño, carga eléctrica y

abundancia. Los 5 monosacáridos que los componen (glucosa, galactosa, N-acetil-glucosamina,

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fucosa y ácido N-acetil-neuramínico o siálico) son capaces de establecer hasta un total de 12 tipos

de enlaces glicosídicos α y β. Estos oligosacáridos son producidos por las glándulas mamarias,

donde los monosacáridos son unidos a una molécula de lactosa mediante la acción específica de

enzimas glicosil-transferasas [10]. También es necesario considerar que, dada su enorme variedad y

complejidad estructural, no es posible replicarlos y añadirlos a las fórmulas infantiles [11].

Se ha comprobado que los oligosacáridos de la leche humana son resistentes a la digestión en los

primeros tramos del tracto gastrointestinal y sirven como sustrato para el crecimiento de

microorganismos en el colon como las bifidobacterias [12]. Hay constancia de que la gran cantidad

y diversidad de oligosacáridos que posee la leche humana facilita el desarrollo de una microbiota

beneficiosa para el hospedador [3]. La sialización y la fucosilación en los extremos terminales los

vuelven inaccesibles a aquellas bacterias intestinales que no poseen las enzimas glicosil-hidrolasas

necesarias para cortar los enlaces y utilizar los monosacáridos liberados [12, 13]. Es importante

destacar que las bifidobacterias sí son capaces de producir las enzimas fucosidasas y sialidasas que

les permiten metabolizar estos compuestos para su crecimiento [3]. Se ha visto en estudios que el

metabolismo de determinadas cepas de las especies Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium

bifidum era diferente en presencia de distintos tipos de oligosacáridos [14]. Además, los

oligosacáridos que contienen fucosa y ácido siálico comparten similitudes estructurales con los

glicanos del epitelio intestinal, que actúan como receptores de membrana para los microorganismos

patógenos [15, 16]. Por ello, algunos patógenos pueden adherirse a esos oligosacáridos evitando su

adhesión a la superficie de la mucosa del intestino [12].

1.2.2. La flora intestinal en relación con la leche materna

Como ya se ha comentado, los niños amamantados son menos susceptibles a padecer enfermedades

infecciosas. Este hecho podría estar relacionado con la presencia temprana de bifidobacterias y

lactobacilos en sus tractos gastrointestinales capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos

patógenos mediante la producción de ácidos grasos de cadena corta y ácido láctico. Esto conlleva

un descenso del pH en el medio que impide el desarrollo de patógenos [17-19]. Por el contrario, las

fórmulas infantiles favorecen el desarrollo de una flora que favorece un pH neutro en el colon.

Además, bifidobacterias y lactobacilos compiten con patógenos tanto por la captación de nutrientes

como por la adhesión al epitelio intestinal. La microflora también contribuye a la regulación del

sistema inmune y la respuesta inflamatoria [20].

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1.3. Las fórmulas infantiles

1.3.1. Leche materna y fórmulas infantiles: Diferencias en la flora intestinal

El desarrollo de la flora intestinal en los seres humanos es un proceso gradual. Antes del nacimiento

el tracto gastrointestinal permanece estéril, pero al cabo de las horas es colonizado por diferentes

tipos de bacterias, fundamentalmente coliformes y estreptococos [21] cuyo origen puede ser

materno o ambiental [22-24], que consumen de manera progresiva el oxígeno del medio. Los niños

nacidos por la vía vaginal desarrollan rápidamente una flora intestinal en la que predominan las

bacterias anaerobias, Bifidobacterium, Bacteroides y Clostridium, [25] mientras que los niños

nacidos mediante cesárea tardan más tiempo en desarrollar este tipo de flora [22]. Generalmente, en

los niños amamantados las especies del género Bifidobacterium se convierten rápidamente en las

predominantes [21]. Existen estudios que no encuentran diferencias significativas entre la

alimentación con leche materna o fórmulas infantiles [26], aunque la mayoría sugieren que la

primera induce el crecimiento de lactobacilos y bifidobacterias [27-29] mientras que una

alimentación a base de fórmulas infantiles favorece el desarrollo de una flora rica en enterobacterias

y otros microorganismos Gram-negativos [30]. La introducción de alimentos complementarios

durante el destete es un punto crítico en este proceso de colonización ya que conduce a un patrón

adulto en la composición de la flora al reducirse el número de bacterias como Escherichia coli y

Clostridium spp y aumentarse el de cocos anaerobios Gram-positivos y el de bacterias del género

Bacteroides [31, 32]. Finalmente, a los 18 meses de vida se considera que la microflora se ha

desarrollado completamente [33]. En un estudio relativamente reciente se ha visto que la flora

intestinal de un individuo adulto contiene entre 1000 y 1500 especies bacterianas diferentes [34].

Teniendo en cuenta los beneficios que conlleva una flora intestinal rica en bifidobacterias se han

desarrollado diferentes estrategias para el control de la colonización bacteriana en aquellos bebés

alimentados con fórmulas infantiles, ya sea mediante la administración de probióticos, prebióticos o

la combinación de ambos (simbióticos) [4].

1.3.2. Fórmulas infantiles: marco legal

Las fórmulas infantiles han evolucionado mucho a lo largo del tiempo. En la Unión Europea la

nomenclatura utilizada es: “fórmula o preparado de inicio” para designar al producto que sustituye

la alimentación del lactante hasta los 4-6 meses de vida y “fórmula o preparado de continuación”

para los productos de este tipo administrados a partir de esta edad [35]. Por el contrario, el Comité

de Nutrición de la Academia Americana de Pediatría no realiza distinción entre ambos términos y

habla solamente de “fórmulas infantiles”, Cuando se elaboran utilizando leche de vaca como

materia prima a la que se añade una serie de ingredientes también se puede denominar “leche para

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lactantes” y “leche de continuación”, atendiendo a las edades a las que esté destinado [35], este tipo

de productos son los mayoritariamente elaborados.

Existen diversos organismos internacionales encargados de elaborar las recomendaciones y

normativas que deben cumplir estos productos. El “American Academy of Pediatric Committee on

Nutrition” (AAPCON) y el Comité de Nutrición de la ”European Society for Paediatric

Gastroenterology, Hepatology and Nutrition” (ESPGHAN) son los dos organismos principales que

se ocupan de redactar listados con recomendaciones de carácter orientativo, siendo otras

organizaciones como el “Scientific Committee on Food” (SCF) de la Comisión Europea los que

dictan la normativa de obligado cumplimiento. Todo ello ha sido elaborado teniendo en cuenta las

consideraciones previas realizadas por la Comisión del Codex Alimentarius de la “Food and

Agriculture Organization” (FAO), la OMS y la “United Nations International Children´s

Emergency Fundation” (UNICEF) [36].

En cuanto al contenido en carbohidratos, la Legislación Europea de 1991 estableció que los únicos

permitidos eran la lactosa, maltosa, sacarosa, maltodextrinas y almidón pretostado o gelatinizado.

En las leches de continuación la cantidad de sacarosa, fructosa o miel añadida no debía superar el

20% de los hidratos de carbono totales para evitar sabores dulces. Y, en todos los casos, los

ingredientes que contenían gluten se excluían de la composición de ambas [37]. Esta legislación ha

cambiado y en Europa la adición de compuestos prebióticos a las fórmulas infantiles está regulada

según la Directiva 2006/141/CE, que ha sido transpuesta a la legislación española mediante el Real

Decreto 867/2008 [38]. El marco legal de estos productos condiciona su comercialización.

1.3.3. Fórmulas infantiles con la fracción de carbohidratos modificada

Existe en el mercado un número importante de fórmulas infantiles en la que se ha modificado su

composición en carbohidratos. Uno de los compuestos más ampliamente utilizados son las

maltodextrinas, que son polímeros de α-glucosa unidos mediante enlaces α-glicosídicos. Se

clasifican dentro del grupo de los α-glucanos y su papel en la nutrición humana es,

fundamentalmente, servir como sustrato de energía fácilmente asimilable. Además, presentan

algunas ventajas respecto a otros α-glucanos como el almidón como su mayor solubilidad en agua,

su menor carga osmótica y su rápida digestión en el intestino. No obstante, se ha visto que las

también tienen un importante papel fisiológico ya que podrían ayudar a tratar algunos trastornos

digestivos como la intolerancia a la lactosa o el reflujo gastroesofágico y prevenir el estreñimiento,

el cáncer colorrectal y la diabetes [39].

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1.3.3.1. Las fórmulas especiales: concepto y finalidad

Las fórmulas especiales son aquellas que han sido diseñadas para el tratamiento nutricional de

problemas asociados con la intolerancia y/o alergia a algunos componentes de las fórmulas

convencionales que, a su vez, están relacionados con el desarrollo de enfermedades tanto congénitas

como adquiridas a lo largo de la infancia [39]. Se caracterizan por estar modificadas en uno o varios

de sus principios inmediatos: hidratos de carbono, proteína y grasa. Algunos de los productos

incluidos dentro de esta clasificación son las fórmulas sin lactosa y de soja [40].

La intolerancia a la lactosa es debida a un déficit en la producción de la enzima lactasa y entre sus

síntomas más frecuentes se encuentran la diarrea, el vómito y los dolores abdominales [39]. La

galactosemia es producida por un déficit en la enzima galactosa-1-fosfato uridil transferasa y entre

sus síntomas más conocidos destacan la ictericia, hepatomegalia, vómitos, hipoglucemia e incluso

convulsiones [41]. En caso de intolerancia a la lactosa pueden utilizarse fórmulas sin lactosa que

utilizan como fuente de hidratos de carbono las maltodextrinas u otros polímeros de glucosa cuya

digestión depende de otras enzimas diferentes a la lactasa, como la sacarasa-isomaltasa y maltasa-

glucoamilasa [39]. Este tipo de fórmulas suele utilizarse de forma transitoria (4 ó 6 semanas) ya que

la malabsorción de lactosa más frecuente es debida a una lesión en la mucosa intestinal y pasajera

en el tiempo. En un ensayo clínico de 2009 se vio que la alimentación con fórmulas sin lactosa

favorecía la remisión de la diarrea de manera significativa, además de reducir la posible alteración

de la flora intestinal en comparación con las fórmulas convencionales [42]. El tratamiento de la

galactosemia consiste en la eliminación de la galactosa de la dieta, siendo necesario utilizar leches

de soja que carecen de lactosa (y por tanto de galactosa) [40].

1.3.3.2. Fórmulas infantiles enriquecidas en prebióticos

Existe otro tipo de fórmulas infantiles cuya fracción de carbohidratos ha sido enriquecida en

oligosacáridos prebióticos. Los prebióticos se definieron originalmente como “ingredientes

alimentarios no digeribles que estimulan el crecimiento y/o actividad de un número limitado de

bacterias en el colon y como consecuencia se produce una mejora en el estado de salud del

hospedador” [43]. Como indica su definición un compuesto prebiótico debe ser resistente a la

digestión y absorción, alcanzar el intestino grueso y ser fermentado selectivamente por una serie de

microorganismos promotores de la salud como las bifidobacterias y los lactobacilos [44]. Existen

tres tipos de oligosacáridos no digeribles que cumplen plenamente estos criterios: la inulina y los

fructo-oligosacáridos (FOS), los galacto-oligosacáridos (GOS) y la lactulosa [45], aunque hay

numerosos oligosacáridos con claras evidencias de ejercer efecto prebiótico [46]. En general, se

puede considerar que la adición de prebióticos es una manera más natural de modificar la flora

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intestinal que la adición de microorganismos probióticos [47]. Muchos de los estudios con

prebióticos se han centrado en las bifidobacterias como principales especies de interés aunque,

atendiendo a la propia definición de prebiótico, no se especifica el tipo de microorganismos

beneficiosos cuyo crecimiento se debe promover [12]. No obstante, los prebióticos pueden ser

fermentados por gran variedad de microorganismos. Se sabe que cuando se utilizan fructanos

derivados de la inulina aumenta la producción de acetato y butirato, y dado que las bifidobacterias

no son grandes productoras de este último compuesto, se pone de manifiesto el crecimiento de otras

especies bacterianas [48]. La producción de ácido butírico es muy positiva ya que neutraliza la

actividad de algunos compuestos carcinógenos como las nitrosaminas [49]. Además del efecto

bifidogénico, se ha sugerido que la utilización de prebióticos podría incrementar la

biodisponibilidad de calcio y mejorar la mineralización ósea, incrementar la resistencia a patógenos

gastrointestinales, modular la respuesta inmune y alérgica, mejorar la función intestinal, reducir el

colesterol y el riesgo a padecer cáncer de colon [44]. En Europa y Estados Unidos los principales

prebióticos añadidos a los alimentos son los fructanos, (inulina y FOS), y los GOS. En Japón

también se utilizan compuestos como los isomaltooligosacáridos, α-galactósidos,

gentioligosacáridos y xilooligosacáridos [50].

1.4. Los compuestos prebióticos

1.4.1. Los fructo-oligosacáridos (FOS)

Tradicionalmente la investigación en el campo de los prebióticos se ha centrado, en buena parte, en

la inulina [51]. Los FOS son polímeros lineales que se producen mediante la transfructosilación de

la sacarosa mediada por enzimas β-fructosidasas e invertasas, [52]. Estos compuestos carecen de

extremo reductor y contienen un residuo de glucosa y dos o más de fructosa [53]. Los FOS también

se obtienen por hidrólisis enzimática de la inulina, presente en numerosos vegetales, y están

compuestos mayoritariamente por moléculas de fructosa unidas por enlace β(2→1). Hay numerosos

estudios en humanos sobre diversos efectos fisiológicos beneficiosos, como efecto prebiótico,

mejora de la absorción de minerales, disminución del nivel de colesterol y triglicéridos en sangre

[8] [54].

1.4.2. Los galacto-oligosacáridos (GOS)

Recientemente, se ha prestado un mayor interés en los GOS a la hora de elaborar fórmulas

alimentarias enriquecidas en compuestos prebióticos. Los GOS son polímeros que se sintetizan a

partir de la lactosa utilizando enzimas β-galactosidasas, que hidrolizan una molécula de lactosa para

transferir la galactosa a otra molécula de lactosa en una reacción de transgalactosilación. Se

obtienen mezclas complejas, difíciles de caracterizar [55], en las que están presentes los enlaces

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β(1→2), β(1→3), β(1→4) y β(1→6) y los grados de polimerización (GP) están comprendidos entre

2 y 8, aunque en estudios recientes se han detectado GOS con GP 15 [56]. Una característica

importante de estos compuestos es que las estructuras formadas dependen de la fuente de la que se

obtiene la enzima [55]. En general, las distintas β-galactosidasas favorecen un tipo particular de

enlaces, así el enzima de Bacillus circulans favorece el enlace β(1→4), el de B. infantis β(1→3) y

Kluyveromyces lactis y Aspergillus oryzae enlaces β(1→6) [12]. Este hecho permite sintetizar

mezclas de GOS con distintas propiedades fermentativas y así potenciar la selectividad que se exige

a los prebióticos [12]. Los GOS están presentes, aunque en muy pequeñas cantidades, de manera

natural en la leche humana, por lo que han sido considerados como GRAS (Generally Regarded As

Safe) en EEUU y FOSHU (Food For Special Health Use) en Japón [57]. Los GOS han mostrado

ser unos componentes muy interesantes para su adición a fórmulas infantiles [21, 58] al poder ser

metabolizados selectivamente por distintas especies de bifidobacterias [3].

En estudios previos in vitro se han apreciado diferencias en el efecto bifidogénico dependiendo del

preparado comercial de GOS. Utilizando un simulador gastrointestinal los preparados Vivinal® y

Bimuno® ejercían su efecto en diferentes regiones del colon [59, 60]. Ambos, al ser suministrados a

individuos voluntarios producían un incremento significativo de las bifidobacterias en comparación

con un placebo de maltodextrinas [61]. En una revisión reciente de 2014 se han recopilado los

efectos in vivo de diferentes mezclas de GOS comerciales como el Vivinal, Bimuno, Purimuno y

mezclas de GOS con otros compuestos como FOS, apreciándose diferencias entre ellos, aunque, en

general, todos ejercían efecto prebiótico [62]. En otros estudios se ha visto que los GOS mejoran la

absorción de minerales [63] y estimulan el sistema inmune, aunque no se ha podido determinar su

impacto en la susceptibilidad a padecer enfermedades atópicas [64]. También disminuyen la

incidencia de la diarrea del viajero [65] y mejoran los síntomas del síndrome del colon irritable

[66]. A la vista de su potencial interés para la salud humana se ha registrado un gran número de

patentes fruto de la investigación en este campo. Se ha consultado la base de datos online de la

Oficina de Patentes Europea (EPO) [67] utilizando como criterio de búsqueda la palabra clave

“galactooligosaccharide” y, tras comprobar la existencia de un número importante de patentes

recientes, se han clasificado en función de su diferente finalidad como muestra la Figura 1.

Destacan aquellas relacionadas con la obtención de GOS (que suponen un 29% del total), la

elaboración de fórmulas alimentarias (siendo un 22%) y la mejora en el estado de salud (19%).

Cabe señalar que solamente dos de las patentes encontradas hacen referencia a una separación

cromatográfica para la purificación de estos compuestos y una indica expresamente el uso de

lactosuero como fuente de estos compuestos.

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Figura 1. Clasificación de un total de 187 patentes registradas en la Oficina de Patentes Europea (EPO) relativas a GOS

en función de sus diferentes usos (última vez accedido 30 enero de 2014). En la elaboración de fórmulas alimentarias se

han distinguido aquellas que contienen solamente GOS añadidos, las que contienen GOS junto a otros componentes

como FOS, y las fórmulas alimentarias en las que se declara explícitamente una contribución a la mejora de la salud

intestinal. A su vez los métodos de obtención de GOS se han dividido en métodos fermentativos utilizando

microorganismos vivos, uso de enzimas aisladas y aislamiento y purificación por métodos instrumentales.

1.4.3. Mezclas de prebióticos comerciales

Como ya se ha comentado, los GOS y los FOS son estructuras más simples que los oligosacáridos

presentes en la leche humana y sus características funcionales se complementan. Una de las mezclas

más estudiada está compuesta por GOS y FOS en una proporción 9:1, y ha demostrado incrementar

el número de bifidobacterias en las heces de los bebés y reducir la incidencia de patógenos [68], así

como reducir la consistencia de las heces y el tiempo de tránsito intestinal [69]. También se ha

demostrado que los efectos de esta mezcla son mayores cuanto menor sea el tiempo de vida del

bebé [70]. Algunos de los preparados comerciales más conocidos son el Vivinal® y la Raftilosa®,

los cuales han demostrado estimular el crecimiento de bifidobacterias y lactobacilos [71].

1.4.4. Fuentes alternativas de prebióticos

Una fuente alternativa a partir de la cual obtener oligosacáridos con actividad biológica potencial,

son los subproductos de la industria láctea. El permeado obtenido del suero de quesería es de

especial interés dadas las enormes cantidades en que se genera y permitiría obtener oligosacáridos

que se parecen más a los de la leche humana. Se ha sugerido que su producción a gran escala podría

Prevención/tratamiento de enfermedades

8% Mejora de una función

corporal 2%

Uso específico como prebiótico

9% Mejora de la acción de otro prebiótico

1%

Fórmulas alimentarias para mejora de salud intestinal

(GOS + Otros) 12%

Fórmulas alimentarias en general (GOS + Otros)

7%

Fórmulas alimentarias (sólo GOS) 3%

Fórmulas alimentarias (GOS obtenidos a partir de

lactosuero) 1%

Métodos instrumentales de purificación de GOS

2%

Métodos de obtención de GOS a partir de lactosuero

2%

Métodos de obtención de GOS mediante fermentación

16%

Métodos de obtención de GOS cone enzimas aisladas

11%

Aditivo en medios de cultivo

1%

Aditivo en fórmulas alimentarias

6%

Aditivo para la mejora de propiedades tecnológicas

3%

Reducción de patógenos en animales

1%

Aditivo en piensos 7%

Cosmética 2%

Otros 8%

Patentes de la EPO relativas a GOS

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realizarse empleando tecnologías de membrana [72]. Numerosas líneas de investigación están

dedicadas a mejorar los prebióticos actuales, siendo la búsqueda de fuentes alternativas uno de los

puntos clave [12]. Los oligosacáridos presentes en la leche de animales domésticos tienen

estructuras menos complejas, con menos isómeros y menor proporción de fucosa y ácido siálico que

los de la leche humana [73]. Estas diferencias y similitudes deben ser tenidas en cuenta a la hora de

desarrollar productos destinados a mimetizar a la leche humana.

1.4.5. Regulación del uso de prebióticos en fórmulas infantiles

El SCF de la Comisión Europea declaró que la adición de una mezcla de GOS/FOS en una

proporción 9/1 y a una concentración de 0,8 g/100 ml a las fórmulas infantiles no implicaba riesgos

graves y destacó las limitaciones de los ensayos clínicos realizados hasta la fecha [74]. Por otro

lado, en una revisión realizada por el Comité de Nutrición de la ESPGHAN se llegó a la conclusión

de que los datos publicados en cuanto a actividad prebiótica son limitados y no se puede

recomendar de manera su uso generalizado con fines preventivos o terapéuticos [4]. En general, las

distintas revisiones concluyen que son necesarios más ensayos clínicos correctamente diseñados

[75]. También se debe estandarizar las cantidades suplementadas [64]. A pesar de ello, la constancia

de su seguridad y la presencia de compuestos similares en la leche materna (GOS) y en vegetales

(FOS) avalan la tendencia actual a incluirlos en las fórmulas infantiles [76].

1.5. Análisis de la fracción de carbohidratos de Fórmulas Infantiles

Aunque la variedad y complejidad estructural de los carbohidratos que se encuentran en las

fórmulas infantiles es mucho menor que la de los oligosacáridos de leche humana se requieren

técnicas de alto poder de resolución para su análisis, como son las técnicas cromatográficas.

1.5.1. Cromatografía en fase Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

La cromatografía en fase líquida de alta eficacia (HPLC) con detector de índice de refracción (RID)

es una de las técnicas más utilizadas para la determinación cuantitativa de carbohidratos en

alimentos. Sus principales ventajas son la sencillez y rapidez de la preparación de muestras y la

suficiente resolución para analizar los azúcares más comunes. Como inconveniente cabe destacar

que los materiales de la fase estacionaria que se utilizan (grupos amino ligados y de intercambio

iónico) pueden reaccionar con compuestos de la matriz alimentaria y reducir su vida útil. También

la sensibilidad y selectividad en la detección es baja y por ello, si el carbohidrato de interés se

encuentra en pequeña cantidad, es posible que no sea determinado [77] [78].

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1.5.2. Cromatografía en fase Gaseosa (GC)

La cromatografía en fase gaseosa con detector de ionización de llama (GC-FID) ofrece grandes

ventajas en cuanto a resolución, sensibilidad y selectividad, pero su principal inconveniente radica

en la necesidad de transformar los analitos en sus derivados volátiles antes de su separación

cromatográfica [79]. No obstante, esta técnica está limitada al análisis de azúcares de baja masa

molecular principalmente, mono di y trisacáridos, aunque si se forman los derivados apropiados y

se utilizan fases estacionarias que soportan altas temperaturas pueden detectarse carbohidratos de un

GP de hasta 12 [80]. El tiempo necesario para preparar los derivados volátiles es un inconveniente

aunque, en ocasiones, la extracción y purificación previos necesarios para las determinaciones por

HPLC pueden ser igual de laboriosas que la preparación de muestra en GC [81]. La mayor venya de

la GC con columnas capilares es su gran resolución, sensibilidad y selectividad, necesarias cuando

se quieren estudiar muestras complejas de carbohidratos [82, 83].

1.5.2.1.Reacciones que tienen lugar durante la derivatización

El análisis por GC requiere una preparación para formar derivados volátiles [80, 84]. Los

carbohidratos se caracterizan por una escasa volatilidad y elevada reactividad química [85]. Esto

facilita reacciones de sustitución de los grupos polares por otros apolares más volátiles

(derivatización) [80]. El alto número de grupos funcionales presentes en los azúcares y la presencia

de formas tautoméricas pueden dar lugar a cromatogramas muy complejos. Pora simplificarlos, se

lleva a cabo una derivatización en dos etapas, oximación y sililación:

La reacción de oximación tiene como finalidad el bloqueo del centro anomérico del azúcar a

analizar, por medio de la condensación de un aminoalcohol como la hidroxilamina con un grupo

aldehído o cetona. Como resultado de esta reacción, los azúcares reductores forman dos isómeros

diferentes (denominados E y Z), que presentan una relación isomérica fija, y que dan lugar a dos

picos en el cromatograma, mientras que los azúcares no reductores dan un solo pico.

La reacción de sililación tiene como objetivo disminuir la temperatura de vaporización de los

azúcares a analizar y en ella que hacen reaccionar los grupos hidroxilo de los azúcares con un

agente sililante, sustituyéndose cada hidrógeno de dichos grupos por un grupo metil-silil. Los

derivados formados se pueden aplicar tanto a aldosas como cetosas y dan cromatogramas

relativamente simples [80]. Sin la reacción de oximación previa el centro anomérico permanecería

libre, pudiendo un mismo azúcar generar hasta 5 anómeros diferentes y, por tanto, 5 picos diferentes

en el cromatograma. Esto supondría un enorme problema a la hora de analizar muestras complejas

como son las fórmulas infantiles.

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2. OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO

Dada la importancia que tienen los carbohidratos prebióticos en la modulación de la microbiota

intestinal y la relación que tiene ésta con un gran número de funciones del huésped, así como la

falta de datos experimentales en cuanto a la composición cualitativa y cuantitativa en prebióticos de

las fórmulas infantiles comercializadas en España, el objetivo de este trabajo se centra

fundamentalmente en: “la evaluación cualitativa y cuantitativa de la fracción de carbohidratos

presente en fórmulas infantiles que, según el etiquetado, contienen prebióticos y fórmulas con la

fracción de carbohidratos modificada, tomando como referencia las fórmulas infantiles clásicas”.

Para alcanzar este objetivo, se desarrollará el siguiente plan de trabajo dividido en los siguientes

apartados:

1. Caracterización básica de las fórmulas infantiles: pH y extracto seco total.

2. Puesta a punto de los métodos de análisis de carbohidratos. Optimización de las condiciones

de extracción de la fracción de carbohidratos, así como las de análisis por cromatografía de

gases (GC) y cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

3. Cuantificación de la fracción de carbohidratos utilizando dos técnicas cromatográficas

complementarias:

GC, que permite una mejor separación de los carbohidratos de menor peso molecular.

HPLC, que permite cuantificar carbohidratos de mayor grado de polimerización.

Este plan de trabajo logró cumplirse satisfactoriamente en el plazo establecido, habiéndose podido

obtener datos cuantitativos y cualitativos de todas las muestras estudiadas suficientes como para

permitir una caracterización detallada de la fracción de carbohidratos presente así como establecer

una comparativa entre las diferentes categorías de productos a fin de sacar conclusiones. No

obstante, durante el transcurso de su realización surgieron una serie de dificultades en su mayoría

relacionadas con la puesta a punto del método: desde la necesidad de escoger entre diferentes

procedimientos de preparación de muestra, con el fin de eliminar compuestos interferentes, a la

elección de las condiciones de análisis que, si bien pueden no ser óptimas, sí son apropiadas para

alcanzar el principal objetivo de este trabajo. Todas las alternativas consideradas a la hora de

realizar este proyecto serán explicadas en detalle en los siguientes apartados así como los motivos

que han llevado a su aceptación o su descarte.

de 35

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Muestras estudiadas

En este trabajo se han analizado hasta un total de 28 fórmulas infantiles diferentes disponibles en el

mercado, 24 de ellas en forma de leche en polvo. Estas muestras comprenden fórmulas de inicio y

continuación convencionales, fórmulas de inicio y continuación con prebióticos añadidos, fórmulas

de inicio y continuación sin lactosa y fórmulas de soja, dos fórmulas líquidas (una de ellas con

lactosa hidrolizada) y dos complementos lácteos a base de yogur. Todos estos productos han sido

clasificados en la Tabla 1 junto a las características más relevantes relacionadas con los

carbohidratos que aparecen en la etiqueta.

3.2. Medición del pH

Para la medición del pH los productos en polvo fueron previamente reconstituidos al 10% en agua.

Las fórmulas líquidas y complementos lácteos se midieron directamente. Se utilizó un pHmetro

Metler Toledo, modelo Five Easy Plus, previamente calibrado con dos soluciones estándar de pH 7

y 4. Todo el agua utilizada para preparar soluciones era de calidad ultra—pura (18.2 MΩ cm) y fue

producida mediante un sistema Milli-Q Synthesis A10 system de Millipore (Billerica, MA, USA).

3.3. Cálculo del Extracto Seco Total

Para la determinación del Extracto Seco Total (EST) se pesaron aproximadamente 100 mg de

muestra en el caso de los productos sólidos y de 150 a 300 mg para los productos líquidos o

semilíquidos, en viales previamente desecados. En el caso de las muestras líquidas fue necesario

pesar una cantidad mayor para asegurar un mínimo valor de extracto seco, ya que si la cantidad de

muestra seca obtenida fuese excesivamente baja (inferior a 15 mg) el resultado podría no ser

significativo. Los viales con las muestras se introdujeron en una estufa a una temperatura de 102 ⁰C

durante un periodo de tiempo mínimo de 48 h hasta peso constante. El EST se determinó por

diferencia de pesada

de 35

Tabla 1. Relación de fórmulas infantiles analizadas, características relacionadas con la fracción de carbohidratos que aparecen en la etiqueta y fecha de consumo

preferente (FCP).

Abreviaturas utilizadas: Fórmula de Inicio (FI), Fórmulas de Continuación (FC), Fórmulas de Soja (FS), Fórmulas con Lactosa Hidrolizada (LH) y

Complementos Lácteos (LC) que se han analizado en este trabajo. Las abreviaturas utilizadas según los carbohidratos adicionados son: mdx, maltodextrinas; preb,

compuestos prebióticos, SL, si carece de lactosa. Otras abreviaturas utilizadas: HC (hidratos de carbono), la (lactosa), almd (almidón), GOS (galacto-

oligosacáridos), FOS (fructo-oligosacáridos), glu (glucosa), ma (maltosa), fru (fructosa), sac (sacarosa), Bf (Bifidobacterias), Lb (Lactobacilos).

Clave HC Lactosa Azúcares Prebióticos Maltodextrinas Fibra Inositol (mg/100g) Componentes FCP

(g/100g)

Fórmulas de inicio y continuación convencionales (n=2)

FI_1 57,8 57,8 - - - - 80,0 la 01/03/2015

FC_mdx_1 61,7 - 35,1 - - - - la,mdx 01/03/2015

FC_mdx_2 60,0 - 47,7 - 12,3 0,5 - la,almd,mdx,Bf 01/06/2015

FC_mdx_3 55,6 - 25,6 - - - 9,9 la,mdx 22/02/2016

FC_mdx_Lq_4 7,3 3,1 - - 4,3 - 3,3 la,mdx,Lb 14/04/2014

Fórmulas de inicio y continuación disponibles en el mercado con prebióticos (n=16)

FC_mdx,preb_1 59,3 41,9 44,9 3,8 - - 24,7 la,mdx,GOS/FOS 25/07/2014



FI_mdx,preb_1 53,3 - - 5,7 - - 45,0 la,FOS/inulina,mdx 01/05/2015

FC_mdx,preb_4 56,0 - - 3,0 - - 45,0 la,mdx,FOS/inulina,Lb,Bf 01/02/2015

FI_SL,mdx,preb_1 50,8 SL - 5,7 50,8 - 25,0 mdx,FOS 01/07/2015

FI_mdx,preb_2 -

55,0 1,5 1,5 3,1 51,0 la,GOS,mdx 25/06/2015

FC_mdx,preb_5 62,9 - 41,3 2,2 - - 25,0 la,mdx,GOS 01/08/2014

FI_preb_1 50,1 46,0 46,0 3,5 2,5 - 32,0 la,GOS,glu,ma 19/03/2015

FC_preb_1 59,0 56,5 58,3 3,9 - - 25,0 la,GOS/FOS 14/05/2014

FC_mdx,preb_6 55,7 19,7 23,9 3,8 - - 23,0 mdx/almd,GOS/FOS,la 19/10/2014

FC_mdx,preb_7 53,6 - - 2,9 - 2,0 - mdx,la,GOS/FOS,Lb,Bf 01/11/2014

FI_mdx,preb_3 56,4 - - 1,9 - 1,3 30,0 la,GOS,mdx 01/05/2015

FC_mdx,preb_8 61,7 - - 2,6 - 1,7 26,0 la,mdx,GOS 05/01/2015

FC_mdx,preb_9 55,6 35,6 38,1 2,5 19,4 1,7 24,4 la,mdx,GOS 01/09/2015

FI_mdx,preb_4 50,9 45,3 - 2,8 5,0 1,9 27,2 la,mdx,GOS 03/07/2015

de 35

Clave HC Lactosa Azúcares Prebióticos Maltodextrinas Fibra Inositol (mg/100g) Componentes FCP

(g/100g)

Fórmulas de inicio y continuación sin lactosa (n=2)

FI_SL,mdx_1 58,6 SL - - - - 36,0 mdx 01/07/2015

FC_SL,mdx_1 60,8 SL - - 60,8 - 9,9 mdx,Lb 01/03/2015

Fórmulas de soja (n=2)

FS_mdx_1 57,6 - - 20,3 36,1 - 47,0 mdx,glu 31/10/2014

FS_mdx_2 55,0 - - - - - 30,0 mdx 14/06/2015

Fórmulas con lactosa hidrolizada (n=1)

LH_1 3,2 < 0,01 - - - - 36,0 LH,fru 19/04/2014

Complementos lácteos (n=2)

CL_mdx,preb_Lq_1 13,0 5,0 - 0,8 - 1,1 - la,almd,FOS,sac 21/05/2014

CL_mdx_Lq_1 11,0 - 8,5 - - 0,5 - la,sac,almd 01/07/2014

de 35

3.4. Preparación de muestra para el análisis cromatográfico. Extracción de la fracción de

carbohidratos

Se realizaron dos tipos diferentes de precipitaciones durante la preparación de muestra:

Precipitación con metanol: Se pesaron 100 mg de una muestra en polvo que fue disuelta en 1 mL

de agua y en un matraz aforado se completó hasta 10 mL con metanol.

Precipitación con agente clarificante (Carrez): Se pesaron 400 mg de muestras en polvo que

fueron reconstituidas en 5 mL de agua mientras que para el resto de fórmulas se diluyeron 3g de

producto líquido en 3 mL de agua. Se añadieron 200 µL del reactivo Carrez I [K4Fe(CN)6.3H20

7,2% (m/v)], se agitó y se añadieron 200 µL del reactivo Carrez II [ZnSO4.7H20 14% (m/v)]. Una

vez se enrasaron las muestras a 10 mL, se dejó precipitar durante un total de 30 minutos y se

centrifugó durante 3 minutos a 10.000 revoluciones por minuto (rpm). Cada muestra fue preparada

por duplicado.

3.5. Análisis de carbohidratos por GC

Se tomaron 500 µL del sobrenadante resultante de la precipitación con metanol ó 150 µL del

sobrenadante resultante de la precipitación con Carrez y se llevaron a un matraz de corazón junto a

200 µL de β-fenilglucósido, utilizado como patrón interno (PI), preparado a una concentración de

0,5 mg/mL. Se llevó a sequedad en un rotavapor a 40 ºC y posteriormente se derivatizó en dos

etapas:

1. Adición de 250 µL de cloruro de hidroxilamina al 2,5% en piridina seguido de dos etapas de

15 min de incubación en estufa a 70 ⁰C.

2. Adición de 250 µL de hexametildisilaxano (HMDS) y 25 µL de ácido trifluoroacético

seguidos de un periodo de incubación en estufa a 50 ⁰C.

Estas etapas se realizaron con pasos de agitación intensa para garantizar una correcta formación de

los derivados. Una vez se formaron los derivados se centrifugó la muestra a 10.000 rpm durante 2

minutos y se recogió el sobrenadante en un vial para ser inyectado en el cromatógrafo.

El análisis se llevó a cabo utilizando un cromatógrafo Agilent Technologies 7890A gas

chromatograph (Agilent Technologies, Wilmington, DE, EEUU) equipado con un detector de

ionización de llama (FID) y empleando nitrógeno como gas portador a un flujo de 1 mL/min. Se

utilizó una columna capilar SGE HT5 Aluminum Clad Fused Silica Capillary Column de

dimensiones 12 m x 0,32 mm x 0,10 µm (North Harrison Road, Bellefonte, EEUU). La temperatura

del inyector fue de 280 °C y la del detector 385 °C. La temperatura inicial de análisis fue 150 ºC y

de 35

la final 380 ºC con una rampa de temperatura de 3 ºC/min. La adquisición y el tratamiento de los

datos se llevaron a cabo utilizando el software Agilent ChemStation (Wilmington, DE, EEUU).

Para la cuantificación de los carbohidratos presentes en las muestras se prepararon patrones de

Galactosa (Ga), Glucosa (Glu), myo-inositol (Myo), lactosa (La), kestosa (Kes) y nistosa (Nis) en

un rango de concentraciones de 2,5 a 0,004 mg/mL. Todos ellos fueron obtenidos de la casa

comercial Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EEUU). Se calcularon los factores de respuesta (FR)

frente al P.I. β-fenilglucósido. Las desviaciones estándar relativas de los FR calculados no

superaron el 10 %. Para los azúcares de GP superior a 4 se utilizó el factor de respuesta de la

nistosa.

3.6. Análisis de carbohidratos por HPLC

Para este análisis la preparación posterior de la muestra fue una simple dilución y filtración [84]. Se

tomaron 0,7 mL del sobrenadante obtenido en el paso anterior y se mezclaron con otros 0,7 mL de

acetonitrilo. Se dejó reposar durante toda la noche y al día siguiente se filtró con filtros de PVDF de

0,22 µm de tamaño de poro, eliminando así una posible precipitación de la muestra [84].

El análisis de los carbohidratos se llevó a cabo en un equipo de HPLC-RID Agilent Technologies

1220 Infinity LC System – 1260 RID (Boeblingen, Alemania) utilizando una columna Kromasil

100-5NH2 de dimensiones 25 cm x 4,6 mm x 5 µm. (Akzo Nobel, Brewster,NY, EEUU), a 30 ⁰C.

Como parte de la puesta a punto del equipo se ensayaron como fase móvil diferentes proporciones

de acetonitrilo/agua: 70:30; 60:40; 55:45; 50:50. La adquisición y el procesamiento de datos se

llevaron a cabo utilizando el software Agilent ChemStation (Agilent Technologies, Boeblingen,

Alemania). Para la cuantificación se prepararon patrones de Fructosa (Fru), Galactosa (Ga), Lactosa

(La), Kestosa (Kes) y Nistosa (Nis) (Sigma-Aldrich) en un rango de concentraciones comprendido

entre 5,0 y 0,05 mg/mL para el análisis por HPLC. Los valores de R2 obtenidos para las distintas

rectas de calibrado fueron superiores a 0,999.

3.7. Preparación de muestra tipo y patrones comunes a ambas técnicas

Además, con fines identificativos, se prepararon otros patrones de lactulosa (Lu), maltosa (Ma),

maltulosa (Mu) y maltodextrinas (Mdx) (GP 2-5), (Sigma-Aldrich), y como muestras tipo

Raftilosa®

(RFT), FOS®

, Vivinal®

(Vi) y lactosa tratada con enzima β-galactosidasa de

Kluyveromyces lactis (Lactozym, Novozyme).

de 35

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Caracterización de las muestras

4.1.1. Medida de pH

Los valores de pH obtenidos para cada una de las fórmulas se muestran en la Tabla 2. Como se

puede observar la gran mayoría de ellos se halla cercano a la neutralidad con unos valores

comprendidos entre 6,5 y 7,5 tal y como cabría esperar de un producto infantil cuya base es, en

numerosos casos, la leche de vaca. Los valores más bajos se encuentran en los dos complementos

lácteos analizados ya que ambos productos tienen como base una leche fermentada. Ambos

productos han sido pasteurizados después de la fermentación, posiblemente para permitir su

conservación a temperatura ambiente, ampliando así el mercado al que va destinado. Este hecho

podría explicar en parte que su pH, aun adaptándose a la legislación (según la cual el valor de pH de

los yogures deben ser igual o inferior 4,6 [86]) sea ligeramente inferior al que cabría esperar en un

yogur convencional. En un yogur común los valores de pH continúan disminuyendo aún más

durante el almacenamiento como consecuencia de la acción de las bacterias lácticas que

permanecen viables, y que por el contrario son eliminadas durante la pasteurización de estos

productos. Este resultado sugiere que puede haberse alargado la etapa fermentativa disminuyendo el

pH por debajo de 4,6 para contrarrestar el no poder seguir descendiendo durante el almacenamiento.

4.1.2. Cálculo del Extracto Seco Total (EST)

Los valores de Extracto Seco Total (EST) obtenidos para cada una de las muestras analizadas se

recogen en la Tabla 2 junto a los valores de pH. Las fórmulas en polvo presentan unos valores de

EST comprendidos entre 94 y 98% y las muestras líquidas y semilíquidas tienen unos valores

claramente inferiores, de 7,4 a 19%.

En el caso de las fórmulas infantiles en polvo era de esperar valores de EST (cercano al 95%), ya

que la legislación establece un contenido de agua igual o inferior al 5% para las leches totalmente

deshidratadas [87], como consecuencia de haber sido procesadas exclusivamente para este fin:

eliminar la máxima cantidad de agua y así aumentar su vida útil y reducir los costes de transporte y

almacenamiento. Igualmente los yogures, presentan valores esperables, entre el 18 y 20% ya que se

elaboran con leche enriquecida, normalmente con leche en polvo, para facilitar que se forme un gel

consistente o en el caso de yogures batidos que tengan una consistencia cremosa. La fórmula

infantil líquida tiene el EST equivalente a una leche normal y únicamente el resultado que no

concuerda totalmente con lo esperado corresponde a la muestra del producto líquido con lactosa

hidrolizada, que presenta un valor excesivamente bajo, 7,4%. Este dato posiblemente se deba a que,

según se especifica en la etiqueta parte de la lactosa es hidrolizada enzimáticamente y parte retirada,

de 35

lo cual lleva a una disminución del EST. Contrastando esta información con la etiqueta del

producto, y sumando las cantidades de los componentes mayoritarios (hidratos de carbono, grasa y

proteínas) se esperaría un valor mínimo del 8,5%.

Tabla 2. Caracterización básica de los 28 productos analizados: valores de Extracto Seco Total (EST) y pH.

Clave EST pH (disol 10%)

FI_1a 95,41 ± 0,51b 6,74

FC_mdx_1 99,16 ± 0,03 6,93

FC_mdx_2 96,12 ± 0,00 6,83

FC_mdx_3 98,28 ± 0,03 6,70

FC_mdx_Lq_4 12,21 ± 0,34 7,21

FC_mdx,preb_1 98,47 ± 0,13 7,12

FC_mdx,preb_2 94,96 ± 0,53 6,80

FC_mdx,preb_3 95,63 ± 0,19 6,68

FI_mdx,preb_1 96,81 ± 0,02 6,89

FC_mdx,preb_4 96,55 ± 0,23 6,80

FI_SL,mdx,preb_1 97,73 ± 0,43 6,96

FI_mdx,preb_2 97,82 ± 0,20 7,22

FC_mdx,preb_5 96,47 ± 0,21 7,00

FI_preb_1 98,00 ± 0,07 7,04

FC_preb_1 96,54 ± 0,17 6,91

FC_mdx,preb_6 98,35 ± 0,22 6,99

FC_mdx,preb_7 97,47 ± 0,75 7,23

FI_mdx,preb_3 98,52 ± 0,41 6,92

FC_mdx,preb_8 94,54 ± 0,59 6,83

FC_mdx,preb_9 96,65 ± 0,38 7,13

FI_mdx,preb_4 96,60 ± 0,40 7,16

FI_SL,mdx_1 96,84 ± 0,04 6,67

FC_SL,mdx_1 97,89 ± 0,17 6,74

FS_mdx_1 98,94 ± 0,02 7,12

FS_mdx_2 97,27 ± 0,13 6,83

LH_1 7,44 ± 0,01 6,83

CL_mdx,preb_Lq_1 19,64 ± 0,04 4,41

CL_mdx_Lq_1 18,10 ± 0,43 4,18 aLas claves de cada muestra han sido asignadas conforme a los criterios de la Tabla 1. bCada muestra fue

preparada por duplicado (media ± desviación estándar).

4.2. Precipitación de la muestras

Una parte muy importante a la hora de analizar los carbohidratos de un alimento es la extracción de

los mismos que debe ser completa y lo más selectiva posible, para evitar interferencias en el

posterior análisis. De los dos tipos diferentes de precipitación ensayados, la precipitación mediante

los reactivos de Carrez resultó ser la más adecuada ya que el cromatograma obtenido en GC al tratar

la muestra con metanol presentaba un gran número de picos no identificados que correspondían a

de 35

otros compuestos diferentes a los carbohidratos y que, por tanto, interferían con los analitos de

interés. Estas interferencias podrían ser debidas a ácidos grasos libres que no son precipitados con el

metanol y sí con los reactivos de Carrez. La adición de ácidos grasos de cadena larga es frecuente

en productos como fórmulas infantiles ya que contribuyen a un correcto desarrollo del recién nacido

[88] y, comprobando con el etiquetado, se observa que varias de las muestras contienen ácidos

grasos poliinsaturados de cadena larga como el DHA. Por el contrario, tal y como se muestra en la

Figura 3, el cromatograma obtenido con los reactivos de Carrez se hallaba libre de estas impurezas

y permitía una mejor identificación y cuantificación de los hidratos de carbono.

Figura 3. Comparación de los dos cromatogramas obtenidos en GC según la preparación de muestra: precipitación con

metanol (rojo) y precipitación con los reactivos de Carrez (azul).

4.3. Caracterización de la Fracción de Carbohidratos por GC

Los resultados de la caracterización de la fracción de carbohidratos presente en cada una de las

fórmulas infantiles se recogen en la Tabla 3. El máximo grado de polimerización (GP) que se ha

podido detectar en las muestras con esta técnica es 7. Hay que considerar que la respuesta va

disminuyendo al aumentar el GP por lo que aunque haya carbohidratos mayores pueden no ser

detectados.

La lactosa es el carbohidrato mayoritario en la mayoría de las muestras a excepción de,

lógicamente, las fórmulas sin lactosa (SL), las fórmulas de soja (FS) y la fórmula con lactosa

hidrolizada (LH). Los mayores valores de lactosa se encuentran en la fórmula infantil convencional

FI_1, aproximadamente 730 mg/g EST en cuyo etiquetado se indica un contenido prácticamente

exclusivo de este azúcar, concordando con los resultados obtenidos analíticamente. En el resto de

min10 20 30 40 50 60 70 80

pA

20

40

60

80

100

120

FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\106F0901.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\102F0201.D)

min35 37.5 40 42.5 45 47.5 50 52.5 55 57.5

pA

16

18

20

22

24

26

FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\106F0901.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\102F0201.D)

tiempo (min)

tiempo (min)

de 35

fórmulas en polvo los valores de lactosa oscilan entre 200 y 500 mg/g EST, indicando una

importante variabilidad según el producto, y en los complementos lácteos su contenido es

notablemente inferior (100-160 mg/g EST) debido a que este azúcar ha sido metabolizado por las

bacterias lácticas.

En el producto con lactosa hidrolizada este disacárido ha dado lugar a un elevado contenido en los

dos monosacáridos que lo componen: glucosa y galactosa, obteniéndose unos valores de 62 y 57

mg/g EST respectivamente, muy por encima del resto de muestras aunque estos valores ponen de

manifiesto que gran cantidad de lactosa ha sido retirada. Por otra parte el menor contenido en

galactosa indica que ese monosacárido podría estar formando parte de otros compuestos como los

GOS. Los contenidos de glucosa en el resto de muestras oscilan entre 2 y 40 mg/g EST y los de

galactosa en torno a 0,1 y 2 mg/g EST, salvo el complemento lácteo CL_mdx_Lq_1, con un contenido

de 45 mg/g EST, probablemente debido a que la galactosa debe ser más difícil de metabolizar por

las bacterias lácticas que la glucosa. En cuanto a la fructosa, que a diferencia de los otros azúcares

mencionados no se encuentra de manera natural en la leche y por tanto ha sido añadida durante la

elaboración, se encontró en todas las muestras pero generalmente permanece a bajas

concentraciones (inferiores a 1 mg/g EST), destacando el producto líquido con lactosa hidrolizada

donde se ha añadido en mayor cantidad (11 mg/g EST) y el complemento lácteo CL_mdx_2.

El polialcohol myo-inositol también se encuentra presente de forma natural en la leche de vaca (0,1-

0,3mg/g EST), aunque su contenido es mayor en la leche humana (0.5-4 mg/g EST, [89]), siendo

frecuente su enriquecimiento en esta clase de productos infantiles, ya que se ha visto que ayuda al

desarrollo del bebé. Los mayores valores se encontraron en el producto de yogur CL_mdx_1 (1,5

mg/g EST) y en la fórmula infantil control FI_1 (1,3 mg/g EST) a la que según la etiqueta le ha

adicionado 0,8 mg/g de myo-inositol mientras que en la mayoría de leches en polvo sus valores

oscilan entre 0,3 y 0,6 mg/g EST.

En cuanto a los disacáridos distintos a la lactosa, la sacarosa permanece a bajas concentraciones

(inferiores a 1 mg/g EST en muchos casos) con dos notables excepciones: en los dos complementos

lácteos su contenido es muy elevado (150 y 330 mg/g EST), al tratarse de productos azucarados,

superior al de las muestras que contienen FOS (con valores comprendidos entre 1,3 y 2 mg/g EST),

apreciándose un ligero incremento en aquellas en que se especifica la presencia de inulina.

Como consecuencia del tratamiento térmico de estos productos se forma lactulosa por

isomerización de la lactosa y maltulosa a partir de la maltosa, ambos disacáridos se han utilizado

como indicadores del tratamiento térmico [90]. Como se observa la lactulosa, se encuentra a bajas

concentraciones (iguales o inferiores a 1 mg/g EST), destacando su bajo contenido en el

de 35

complemento lácteo CL_mdx,preb_1 (inferior a 0,1mg/g EST) que corresponde a un yogur

líquido, aunque la cuantificación es aproximada ya que el método analítico no es el óptimo [91]. La

maltulosa se ha podido determinar en algunas fórmulas (FC_mdx_4 FI_SL, FI_SL_mdx_1,

FC_SL-mdx_1, CL_mdx-preb_1, FS_mdx_2, FS_ mdx_3) y sus cantidades oscilan entre 0,5 y

2,5 mg/g EST, encontrándose estos valores dentro del rango de los obtenidos por Morales y col.

(0,1-8,4 mg/g producto) en fórmulas infantiles convencionales [90].

Analizando los compuestos de mayor peso molecular, los contenidos en maltodextrinas fueron

variables pudiéndose encontrar en concentraciones de 210 mg/g EST en la fórmula convencional

FC_mdx_3. No obstante, los mayores valores se encontraron en las fórmulas de soja donde estos

compuestos aparecen en concentraciones de hasta 360 mg/g EST (FS_mdx_2). También se apreció

que el GP predominante en las fórmulas de soja es 5 mientras que es variable en el resto de

productos, siendo los grados 5 y 6 los predominantes en la mayoría de casos. Pero se debe tener

presente que con esta técnica no es posible determinar maltodextrinas con GP superior a 6.

Entre las muestras enriquecidas con GOS es interesante observar que en su mayoría (FI_preb_1,

FC_preb_1, FC_mdx,preb_1, FC_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_3, FI_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_5,

FC_mdx,preb_6, FC_mdx,preb_7, FI_mdx,preb_3, FC_mdx,preb_8, FC_mdx,preb_9, FI_mdx,preb_4),

según el perfil cromatográfico, estaban enriquecidas con Vivinal® o un producto similar, cuyo

compuesto mayoritario es el trisacárido 4’galactosil-lactosa. Este tipo de GOS se puede obtener

gracias a la β-galactosidasa de Bacillus circulans [92]. Sin embargo, sólo se pudieron cuantificar en

2 muestras (FI_preb_1 y FC_preb_1 con valores en torno a 32 y 40 mg/g EST).

Solamente en dos de las muestras, el preparado con lactosa hidrolizada (LH_1) y el complemento

lácteo (CL_mdx,preb_1) que contienen GOS se encontró un perfil similar al de la muestra de

referencia de lactosa transgalactosilada con β-galactosidasa de K. lactis, en el que predominan los

derivados de lactosa con enlace β(1→6), allolactosa, 6-galactobiosa y 6’galactosil-lactosa,

deduciéndose la procedencia del enzima utilizada en el producto hidrolizado. Según los datos de

lactosa de este producto (0,1 mg/g EST, ó 7.5 mg/L de producto) podemos observar, en

comparación con los obtenidos por Ruiz-Matute y col. [93], para preparados lácteos sin lactosa, que

la hidrólisis está muy avanzada y por tanto gran cantidad de GOS han sido hidrolizados presentando

contenidos muy inferiores (2,7 mg/g EST ó 201 mg/L de producto) al valor mínimo determinado

por dichos autores (602 mg/L). Este hecho pone de manifiesto la importancia de controlar el

proceso de hidrólisis durante la elaboración de estos productos bajos en lactosa ya que de lo

contrario se originaría una enorme pérdida de compuestos con carácter prebiótico como ocurre en la

muestra analizada en este estudio cuyo contenido en GOS es inferior a 0,5 mg/g EST.

de 35

Cabe destacar que en aquellas fórmulas que contienen tanto GOS como Maltodextrinas añadidas

(FC_mdx,preb_1, FC_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_3, FI_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_5, FC_mdx,preb_6,

FC_mdx,preb_7, FI_mdx,preb_3, FC_mdx,preb_8, FC_mdx,preb_9, FI_mdx,preb_4) y en los

complementos lácteos, no se pudieron diferenciar los perfiles correspondientes a cada uno de los

compuestos, a partir del GP 3, ya que se superponían tal y como se muestra en la Figura 4. Por ello,

en estas muestras se cuantificaron los hidratos de carbono exclusivamente por GP incluyéndose en

la categoría “otros”. En estas muestras resultaría necesario utilizar otro tipo de columna con mayor

poder de resolución.

Figura 4. Perfiles cromatográficos obtenidos al superponer una muestra de referencia de Vivinal (en verde), un patrón

de Maltodextrinas (en azul) y una muestra que contiene tanto GOS como maltodextrinas añadidos (en rojo).

En las muestras que contienen FOS también se distinguieron dos tipos de perfiles: las fórmulas

FI_mdx,preb_1 y FC_mdx,preb_4 poseen un perfil correspondiente a la Raftilosa®

, que proviene

de la hidrólisis enzimática de la inulina. Los compuestos mayoritarios son moléculas de fructosa

con enlace β(2→1), de inulobiosa (2 moléculas de fructosa F2) a inuloheptosa (F7), siendo

minoritarios aquellos con moléculas de glucosa en el extremo terminal como kestosa, nistosa y los

derivados mono, di y trifructosilados de la nistosa [94]. Por el contrario, los productos

FI_SL,mdx,preb_1, FC_preb_1 y CL_mdx,preb_1 tienen un perfil correspondiente a FOS

obtenidos mediante síntesis enzimática a partir de sacarosa, kestosa, nistosa, etc. Los contenidos en

FOS fueron variables, pudiéndose encontrar hasta 30 mg/g EST.

En las fórmulas de soja se pensaba que podrían encontrarse α-GOS, unos derivados galactosilados

de la sacarosa unidos mediante enlaces α(1→6) presentes en las plantas de la familia de las

min10 20 30 40 50 60 70

pA

0

200

400

600

800

1000

FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\270214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-27 20-41-56\106F0601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\280214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-28 14-18-45\116F1601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COL...14 CARREZ Y REFERENCIAS CARLOS 2014-02-11 17-41-40\108F0801.D)

min32 34 36 38 40 42

pA

0

50

100

150

200

250

300

350

400

FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\270214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-27 20-41-56\106F0601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\280214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-28 14-18-45\116F1601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COL...14 CARREZ Y REFERENCIAS CARLOS 2014-02-11 17-41-40\108F0801.D)

tiempo (min)

tiempo (min)

de 35

leguminosas. No obstante, no se detectó rafinosa (un α-GOS de GP 3) en ninguna de las fórmulas

descartándose la presencia de compuestos de este tipo como posibles impurezas de las proteínas de

soja utilizadas en la elaboración. Este tipo de fórmulas es adecuado para niños con alergia a las

proteínas lácteas y/o intolerancia a la lactosa, si bien deben ser cuidadosamente testadas a la hora de

utilizarlos para niños con galactosemia ya que podría presentar pequeñas cantidades de galactosa

como es el caso de la muestra FS_mdx_2.

Tabla 3. Caracterización de la fracción de carbohidratos por GC-FID de los 28 productos analizados. Los

carbohidratos han sido agrupados en función de su grado de polimerización (GP). Abreviaturas utilizadas:

Fru (Fructosa), Ga (Galactosa), Glu (Glucosa), Myo (Myo-inositol), Sac (Sacarosa), Lu (Lactulosa), La

(Lactosa), Mu (Maltulosa), Ma (Maltosa), Di-GOS (Di-Galacto-oligosacáridos), Kes (Kestosa), RFT

(Raftilosa), Mdx (Maltodextrinas), Vi (Vivinal) Nis (Nistosa), FNis (Fructosil-Nistosa), DFNis (Di-

Fructosil.Nistosa).

Clave FI_1 FC_mdx_1 FC_mdx_2 FC_mdx_3 FC_mdx_Lq_4

GP

= 1

Fru 0,12 ± 0,07 0,22 ± 0,01 0,13 ± 0,01 0,54 ± 0,02 0,03 ± 0,01

Ga 2,27 ± 0,24 2,55 ± 0,11 2,66 ± 0,01 0,49 ± 0,03 0,13 ± 0,01

Glu 2,88 ± 0,29 3,90 ± 0,22 1,56 ± 0,03 16,22 ± 0,40 0,27 ± 0,06

Myo 1,31 ± 0,62 0,30 ± 0,01 0,49 ± 0,01 0,79 ± 0,06 0,13 ± 0,03

GP

= 2

Sac - - - - -

Lu 0,67 ± 0,32 0,48 ± 0,03 0,74 ± 0,02 0,41 ± 0,03 0,04 ± 0,00

La 729,90 ± 61,11 310,01 ± 17,19 472,82 ± 2,89 226,13 ± 5,99 67,93 ± 1,38

Mu - - - - 0,41 ± 0,00

Ma - 14,40 ± 0,58 2,09 ± 0,03 50,64 ± 1,13 4,32 ± 0,14

Di-GOS - - - - -

Otros 8,66 ± 2,69 4,91 ± 0,17 6,33 ± 0,02 5,54 ± 0,00 0,87 ± 0,17

GP

= 3

Kes - - - - -

RFT - - - - -

Mdx - 18,93 ± 0,78 0,87 ± 0,03 50,64 ± 1,03 7,19 ± 0,02

Vi - - - - -

Otros 4,76 ± 0,90 3,28 ± 0,50 2,02 ± 0,17 3,39 ± 0,10 0,80 ± 0,04

GP

= 4

Nis - - - - -

RFT - - - - -

Mdx - 20,04 ± 0,04 0,40 ± 0,07 38,73 ± 0,10 6,81 ± 0,21

Vi - - - - -

Otros - 6,79 ± 0,14 1,29 ± 0,41 6,33 ± 1,13 2,08 ± 0,30

GP

= 5

FNis - - - - -

RFT - - - - -

Mdx - 18,87 ± 1,21 0,49 ± 0,08 49,82 ± 0,12 6,24 ± 0,37

Vi - - - - -

Otros - 6,46 ± 0,33 0,72 ± 0,33 4,94 ± 0,13 1,25 ± 0,11

GP

= 6

DFNis - - - - -

Mdx - 18,45 ± 0,63 - 71,02 ± 1,10 5,82 ± 0,30

Otros - 5,14 ± 0,46 - 9,63 ± 0,30 1,98 ± 0,10

GP = 7 - 0,39 - 0,42 ± 0,26 0,12 ± 0,04

aLas claves de cada muestra han sido asignadas de acuerdo a los criterios establecidos por la Tabla 1. bCada muestra fue

preparada por duplicado (media ± desviación estándar).

de 35

Clave FC_mdx,preb_1 FC_mdx,preb_2 FC_mdx,preb_3 FI_mdx,preb_1 FC_mdx,preb_4 FI_SL,mdx,preb_1 FI_mdx,preb_2 FC_mdx,preb_5 G

P =

1 Fru 0,45 ± 0,00 1,64 ± 2,11 0,33 ± 0,03 3,48 ± 1,67 1,35 ± 0,08 0,48 ± 0,03 0,51 ± 0,01 0,38 ± 0,01

Ga 2,00 ± 0,44 1,82 ± 0,11 1,25 ± 0,14 0,22 ± 0,01 0,80 ± 0,04 1,36 ± 0,06 2,30 ± 0,07 1,30 ± 0,02

Glu 18,59 ± 1,57 6,78 ± 1,45 16,71 ± 1,61 1,97 ± 1,02 1,73 ± 0,08 7,11 ± 0,27 9,36 ± 0,16 12,03 ± 0,01

Myo 0,39 ± 0,02 0,36 ± 0,05 0,31 ± 0,05 0,52 ± 0,04 0,65 ± 0,02 0,32 ± 0,00 0,56 ± 0,01 0,45 ± 0,00

GP

= 2

Sac 0,09 ± 0,01 0,49 ± 0,47 0,07 ± 0,01 1,74 ± 0,62 1,31 ± 0,07 1,92 ± 0,09 - -

Lu 0,69 ± 0,08 1,00 ± 0,06 0,60 ± 0,07 0,14 ± 0,02 0,99 ± 0,10 - 0,73 ± 0,16 0,87 ± 0,08

La 405,21 ± 37,62 405,75 ± 19,61 354,50 ± 31,03 429,99 ± 16,87 492,22 ± 27,00 - 461,82 ± 8,83 399,30 ± 0,09

Mu - - - - - 0,63 ± 0,03 - -

Ma 12,98 ± 2,44 12,00 ± 1,20 12,74 ± 0,86 3,07 ± 0,35 3,80 ± 0,01 29,38 ± 1,30 3,27 ± 0,13 16,29 ± 0,21

Di-GOS - - - - - - - -

Otros 19,14 ± 1,31 20,70 ± 2,03 16,88 ± 0,97 4,37 ± 0,48 3,50 ± 0,10 2,48 ± 0,44 11,26 ± 0,02 11,80 ± 0,62

GP

= 3

Kes NS NS NS 0,92 ± 0,03 0,84 ± 0,05 18,65 ± 0,93 - -

RFT NS NS NS 4,07 ± 0,17 3,95 ± 0,23 - - -

Mdx NS NS NS 3,43 ± 0,48 4,32 ± 0,01 45,89 ± 2,01 NS NS

Vi NS NS NS - - - NS NS

Otros 30,14 ± 1,62 31,65 ± 3,20 28,96 ± 3,50 1,59 ± 0,45 1,62 ± 0,12 3,60 ± 0,01 13,74 ± 0,60 32,82 ± 0,64

GP

= 4

Nis NS NS NS 2,65 ± 0,13 2,15 ± 0,10 0,01 ± 0,00 - -

RFT NS NS NS 4,17 ± 0,13 4,72 ± 0,08 - - -

Mdx NS NS NS 7,44 ± 0,85 5,34 ± 0,07 38,09 ± 1,58 NS NS


Otros 22,70 ± 1,03 28,69 ± 2,29 28,93 ± 1,10 5,95 ± 1,18 10,12 ± 0,00 12,29 ± 0,66 10,91 ± 1,97 34,66 ± 1,47

GP

= 5

FNis NS NS NS 2,95 ± 0,07 1,77 ± 0,09 6,18 ± 0,38 - -

RFT NS NS NS 1,01 ± 0,08 2,44 ± 0,05 - - -

Mdx NS NS NS 3,95 ± 0,28 0,92 ± 0,01 45,97 ± 3,11 NS NS


Otros 13,21 ± 1,04 21,27 ± 2,23 26,23 ± 1,43 2,43 ± 0,31 0,58 ± 0,04 7,03 ± 0,92 8,60 ± 2,14 25,10 ± 1,09

GP

= 6

DFNis NS NS NS 2,33 ± 0,10 0,40 ± 0,01 0,46 ± 0,05 - -

Mdx NS NS NS 2,60 ± 0,48 - 54,42 ± 2,27 NS NS

Otros 8,83 ± 0,25 13,15 ± 2,25 30,45 ± 13,46 7,36 ± 2,75 1,03 ± 0,08 12,28 ± 1,03 3,67 ± 1,91 24,34 ± 2,40

GP = 7 - 0,41 ± 0,06 2,58 ± 0,11 - - 2,80 ± 0,20 0,31 ± 0,17 0,98 ± 0,14

de 35

Clave FI_preb_1 FC_preb_1 FC_mdx,preb_6 FC_mdx,preb_7 FI_mdx,preb_3 FC_mdx,preb_8 FC_mdx,preb_9 FI_mdx,preb_4

GP

= 1

Fru 0,30 ± 0,06 0,35 ± 0,04 0,76 ± 0,07 0,41 ± 0,01 0,28 ± 0,03 0,33 ± 0,04 0,47 ± 0,02 0,49 ± 0,00

Ga 1,62 ± 0,08 1,28 ± 0,10 1,82 ± 0,07 1,11 ± 0,04 1,26 ± 0,17 1,62 ± 0,15 1,33 ± 0,10 1,67 ± 0,00

Glu 13,16 ± 0,37 16,51 ± 1,37 20,92 ± 0,97 12,49 ± 0,20 8,22 ± 0,90 13,59 ± 1,34 11,26 ± 0,94 13,91 ± 0,25

Myo 0,47 ± 0,01 0,33 ± 0,08 0,33 ± 0,00 0,70 ± 0,05 0,45 ± 0,02 0,43 ± 0,02 0,24 ± 0,01 0,53 ± 0,02

GP

= 2

Sac - 0,07 ± 0,00 0,06 ± 0,00 0,38 ± 0,03 - - - -

Lu 0,62 ± 0,01 0,62 ± 0,03 0,38 ± 0,03 0,34 ± 0,08 0,89 ± 0,03 0,60 ± 0,01 0,64 ± 0,09 0,32 ± 0,03

La 454,03 ± 10,20 529,41 ± 39,78 194,89 ± 8,76 302,89 ± 5,59 498,06 384,79 ± 34,58 362,25 ± 31,19 478,87 ± 32,22

Mu - - - - - - - -

Ma 4,02 ± 0,07 - 21,90 ± 1,11 17,39 ± 0,28 5,48 ± 0,74 16,64 ± 1,67 8,47 ± 0,94 7,48 ± 0,20

Di-GOS 14,59 ± 0,15 21,76 ± 1,69 - - - - - -

Otros - - 16,74 ± 0,91 12,10 ± 0,19 10,11 ± 2,69 11,70 ± 0,47 12,12 ± 1,50 14,14 ± 0,64

GP

= 3

Kes - 0,04 ± 0,00 NS NS - - - -

RFT - - NS NS - - - -

Mdx - - NS NS NS NS NS NS

Vi 12,16 ± 0,35 13,21 ± 1,13 NS NS NS NS NS NS

Otros 3,42 ± 0,21 3,56 ± 0,27 39,76 ± 1,78 35,79 ± 2,05 12,61 ± 1,50 30,26 ± 3,31 23,80 ± 1,67 18,90 ± 0,20

GP

= 4

Nis - 0,04 ± 0,00 NS NS - - - -

RFT - - NS NS - - - -


Vi 3,91 ± 0,19 4,06 ± 0,40 NS NS NS NS NS NS

Otros 6,80 ± 0,32 5,71 ± 0,10 29,60 ± 1,26 42,82 ± 0,99 8,47 ± 1,37 29,21 ± 3,21 22,24 ± 0,27 22,60 ± 0,34

GP

= 5

FNis - - NS NS - - - -

RFT - - NS NS - - - -


Vi 1,17 ± 0,07 1,16 ± 0,11 NS NS NS NS NS NS

Otros 1,59 ± 0,01 1,45 ± 0,16 24,51 ± 2,55 24,79 ± 0,71 4,31 ± 0,64 26,40 ± 2,66 16,80 ± 0,13 3,11 ± 0,26

GP

= 6

DFNis - - NS NS - - - -


Otros 0,35 ± 0,26 - 17,09 ± 4,77 21,82 ± 3,90 0,87 ± 0,33 19,18 ± 4,54 12,93 ± 0,72 1,98 ± 0,05

GP = 7 0,13 ± 0,01 - - - - 0,43 ± 0,15 0,20 ± 0,05 -

de 35

Clave FI_SL,mdx_1 FC_SL,mdx_1 FS_mdx_1 FS_mdx_2 LH_1 CL_mdx,preb_Lq_1 CL_mdx_Lq_1

GP

= 1

Fru 0,56 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,26 ± 0,03 0,32 ± 0,03 11,31 ± 0,20 3,07 ± 0,02 7,50 ± 0,20

Ga 0,10 ± 0,02 0,73 ± 0,02 - 0,09 ± 0,03 56,83 ± 0,85 1,06 ± 0,01 44,97 ± 0,06

Glu 13,10 ± 0,39 10,07 ± 0,05 40,07 ± 0,40 15,70 ± 0,06 61,85 ± 1,39 3,61 ± 0,05 10,72 ± 0,05

Myo 0,15 ± 0,00 0,11 ± 0,03 0,32 ± 0,03 0,31 ± 0,01 0,23 ± 0,01 0,14 ± 0,11 1,48 ± 0,25

GP

= 2

Sac - - - - 4,14 ± 0,05 153,02 ± 1,47 329,30 ± 6,86

Lu - - - - - 0,07 ± 0,03 0,52 ± 0,07

La - - - - 0,10 ± 0,01 91,23 ± 1,51 167,84 ± 0,02

Mu 2,35 ± 0,05 0,53 ± 0,03 0,83 ± 0,00 0,55 ± 0,02 - - -

Ma 59,21 ± 1,99 30,74 ± 0,15 70,96 ± 0,50 52,54 ± 0,14 - - -

Di-GOS - - - - 0,40 ± 0,01 0,07 ± 0,01 -

Otros 2,14 ± 0,19 2,26 ± 0,23 2,32 ± 0,58 1,96 ± 0,58 0,99 ± 0,01 1,22 ± 0,14 484,85 ± 36,14

GP

= 3

Kes - - - - - 0,09 ± 0,00 -

RFT - - - - - - -

Mdx 72,10 ± 2,36 47,16 ± 0,22 81,54 ± 0,70 60,22 ± 0,19 - 0,52 ± 0,00 -

Vi - - - - - - -

Otros 4,07 ± 0,13 2,82 ± 0,65 4,03 ± 0,18 3,11 ± 0,48 1,19 ± 0,07 0,78 ± 0,22 15,12 ± 0,15

GP

= 4

Nis - - - - - 0,08 ± 0,03 -

RFT - - - - - - -

Mdx 47,16 ± 2,24 39,16 ± 0,27 51,75 ± 0,67 55,58 ± 1,41 - 0,73 ± 0,47 -

Vi - - - - - - -

Otros 10,37 ± 0,01 9,88 ± 0,48 8,18 ± 0,49 8,33 ± 1,25 - 1,15 ± 0,87 -

GP

= 5

FNis - - - - - 0,08 ± 0,00 -

RFT - - - - - - -

Mdx 107,67 ± 5,14 44,29 ± 1,43 140,46 ± 2,31 83,70 ± 1,81 - 0,21 ± 0,03 -

Vi - - - - - - -

Otros 8,68 ± 0,85 5,86 ± 0,09 9,58 ± 0,09 9,31 ± 1,12 - 0,45 ± 0,20 -

GP

= 6

DFNis - - - - - - -

Mdx 61,53 ± 11,88 54,91 ± 1,29 92,08 ± 2,07 77,15 ± 7,87 - - -

Otros 12,66 ± 2,11 10,77 ± 0,44 11,89 ± 0,49 16,50 ± 2,33 - 0,91 ± 0,68 -

GP = 7 1,32 ± 0,21 1,49 ± 0,27 0,52 ± 0,19 3,16 ± 0,30 - - -

de 35

4.4. Caracterización de la Fracción de Carbohidratos por HPLC

Puesta a punto del método

Se ensayaron hasta un total de 4 fases móviles utilizando diferentes proporciones de acetonitrilo

(AcN)/agua: 70:30; 60:40; 55:45; 50:50. La mejor resolución de los carbohidratos de bajo peso

molecular se produjo utilizando una fase móvil de AcN/Agua 70:30, con ella era posible separar los

monosacáridos Fructosa y Galactosa, sin embargo, tras un tiempo de análisis de 50 minutos sólo se

podían detectar compuestos hasta un GP 7. Por otra parte la separación y sensibilidad conseguida

para compuestos con un GP entre 1 y 6 era muy inferior a la alcanzada con GC y con la técnica de

HPLC la fracción que más nos interesaba era la de alto peso molecular. Al aumentar la proporción

de agua en la fase móvil 50:50 el tiempo de análisis era muy breve los monosacáridos eluían con el

frente impidiendo su distinción (dado su fuerte carácter hidrofílico), y el GP máximo detectado era

14indicando que había compuestos que coeluían. Según se pudo comprobar la mejor separación de

los carbohidratos, para el fin de este trabajo, se produjo utilizando una fase móvil AcN/agua 55:45

ya que los compuestos se separaban de forma adecuada según su GP y se detectaban compuestos

hasta un GP máximo de 17.

Caracterización

En esta técnica los carbohidratos presentes en las muestras solamente pudieron separarse en función

de su GP. El mayor GP encontrado fue 17 en la muestra FI_SL,mdx,preb_1, que carece de lactosa

y ha sido enriquecida en maltodextrinas, lo cual explica la presencia de polímeros de elevado peso

molecular. En la mayoría de muestras se encontraron GP de 11-12, siendo la fórmula convencional

FI_1 y las muestras de lactosa hidrolizada LH_1 las que menores GP presentaban, 3 y 4

respectivamente a concentraciones mínimas, inferiores a 0,7 mg/g EST. Como ya se ha

comentado, el gran avance de la hidrólisis de la lactosa en la muestra LH_1 ha supuesto la

degradación de la casi totalidad de los GOS que se forman en las primeras etapas del proceso.

Mientras que en la fórmula convencional parece haber una cantidad ínfima de trisacáridos. Como

cabía esperar, las muestras en las que se ha encontrado un mayor GP son aquellas enriquecidas en

maltodextrinas en muchas de las cuales se podía apreciar fácilmente GP de 11 a 13. También en las

fórmulas de soja se observaron GP elevados. Estas fórmulas junto a la muestra sin lactosa

enriquecida en prebióticos (FI_SL,mdx,preb_1) presentaban las mayores concentraciones de

polímeros de GP 10 y superior (de 17 a 34 mg/100g). En las muestras con maltodextrinas también

se puede ver que, en general, los compuestos derivados de la maltosa más abundantes son los de GP

de 35

entre 3 a 7, a partir de este GP la tendencia general indica que la concentración de los compuestos

disminuye al aumentar dicho GP.

Comparación entre los valores del etiquetado y los obtenidos por HPLC y GC:

Finalmente, para concluir este trabajo se realiza un análisis comparativo de los resultados obtenidos

por las dos técnicas cromatográficas utilizadas comparándolos entre sí y contrastándolos con la

información disponible en el etiquetado. Para ello se tendrán en cuenta los contenidos en Hidratos

de Carbono totales, azúcares, lactosa y prebióticos:

Hidratos de Carbono totales: En líneas generales, como era de esperar, los valores de

carbohidratos cuantificados por GC son menores que los que figuran en la etiqueta, estas diferencias

son especialmente reseñables para las muestras sin lactosa, incluidas las fórmulas de soja, así como

las muestras con alto contenido en maltodextrinas como FI_SL,mdx,preb_1, FS_mdx_1 o

FI_SL,mdx_1. La única excepción destacable es la fórmula infantil convencional FI_1, en la que

se obtiene un valor de lactosa muy elevado, aunque comparable con valores de una leche humana.

En cuanto a los valores de carbohidratos obtenidos por HPLC son, en general más parecidos a los

de la etiqueta, e incluso algunos más altos. Hay que tener en cuenta que se desconoce la técnica

utilizada por los laboratorios de análisis en el control de calidad de estos productos y, dada la

compleja preparación de muestra que hay que seguir para el análisis por GC, es poco probable que

esta técnica haya sido empleada de manera rutinaria en la industria, siendo un equipo de HPLC la

opción más probable. Además, dependiendo del método seguido y la fase móvil escogida pueden

detectarse compuestos de distinto peso molecular. También puede ocurrir que el análisis de haya,

centrado solamente en los compuestos mayoritarios, como la lactosa, dependiendo del criterio

escogido.

En la determinación de carbohidratos por HPLC únicamente se obtienen valores mucho más bajos

que los que aparecen en la etiqueta para las fórmulas a base de maltodextrinas, sin lactosa,

pudiéndose esto deber en parte al uso de una técnica que permita detectar compuestos de mayor

grado de polimerización a las aquí utilizadas, más específica para este tipo de productos.

Por otro lado hay que considerar que no todos los lotes de productos son iguales, como se puede

observar en el análisis realizado de las muestras FI_mdx,preb_1, 2 y 3 en las que se aprecia una

variación importante especialmente en el contenido en lactosa de la muestra 3, a pesar de que en la

etiqueta aparecen los mismos valores.

de 35

Lactosa: En el análisis de la lactosa los valores más fiables son los obtenidos por GC, ya que en

HPLC no se pueden dar valores de lactosa aislada, correspondiendo estos valores realmente al total

de disacáridos presentes en la muestra, y dependiendo del porcentaje que suponga la lactosa en la

composición (generalmente mayoritaria) podría dar lugar a grandes diferencias entre unos valores y

otros. En los productos en los que aparece el valor de lactosa en el etiquetado se puede observar una

muy buena correlación con los valores obtenidos por GC, siendo mayor la diferencia en la muestra

FC_mdx,preb_3, posiblemente debido a la variabilidad de los lotes, y la muestra FI_1 que, como

ya se ha comentado presenta un contenido en lactosa muy elevado.

En todos los casos hay que tener en cuenta que no todos los laboratorios de análisis utilizan la

misma técnica para la determinación de carbohidratos y que los criterios a la hora de elaborar el

etiquetado no son exactamente iguales en todas las empresas, siendo frecuente dar el valor de un

azúcar mayoritario como la lactosa como el valor total de azúcares o incluso de hidratos de carbono,

lo cual puede generar grandes diferencias a la hora de comparar unos productos y otros.

5. CONCLUSIONES

- Para analizar fórmulas infantiles con la fracción de carbohidratos modificada es necesario la

utilización de 2 técnicas cromatográficas complementarias: CG-FID y HPLC-RID

- GC-FID es una técnica más exacta que aporta una mejor resolución y mayor información

cualitativa aunque solo se pueden cuantificar compuestos de GP ≤ 7.

- Es posible diferenciar el tipo de compuesto prebiótico añadido (GOS y FOS) y su origen

enzimático.

- La técnica HPLC-RID con una fase móvil AcN/agua 55:45 posibilita la separación de los

carbohidratos por su GP detectándose y cuantificándose compuestos con 17 monómeros.

- En líneas generales, los resultados obtenidos concuerdan con los que aparecen en el

etiquetado, aunque existen discrepancias debidas probablemente a la técnica utilizada en los

laboratorios y no existir un mismo criterio unificador en el etiquetado de todos los

productos.

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ESTUDIO DE LA FRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS EN FÓRMULAS …

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