Embryo Implantation Possible Involvement of miRNA-23band...

האוניברסיטה העברית בירושלים

,פקולטה לרפואהה

בית הספר לרוקחות

:השרשת העובר

miRNA-145-ו miRNA-23bמעורבות אפשרית של

Embryo Implantation:

Possible Involvement of miRNA-23band miRNA-145

מלכה פורמנסקי

בהנחיית: פרופ' ראובן רייך

מודים לקבלת תואר מוסמך בביה"ס לרוקחותבמסגרת הלי

האוניברסיטה העברית בירושלים

3102אוקטובר חשון תשע"ד

2

תודות

לפרופ' ראובן רייך

הליווי המקצועי וההדרכה,על

על פיתוח חשיבה בקורתית

.וךוהכל במאור פנים ובחי

' אריאל רבללפרופ

במחקר לאורך הדרך. תמיכהעל ה

לד"ר חנה אשש

על שהורישה לי את מחקר חייה,

על ההדרכה במעבדה ועל העזרה והתמיכה בכל עת.

כונות לעזור בכל.ועל הנ ה במעבדהההדרכעל -לאולגה וקסמן

על התמיכה, על החשיבה המשותפת ועל החברות שנרקמה. -לנריה גוטגולד

על הזמנים היפים יחדיו. -יהלי ליבטאג, נאטי פדרמן וחני ברונר לצוות המעבדה:

בנוגע למחקר ועוד. על החברות והעזרה בכל -למעבדות של ד"ר בעז תירוש ופרופ' שלמה ששון

על השימוש במצלמה ובמיקרוסקופ השייכים למעבדה. -שפר-למעבדת פרופ' פרנצ'סקה לוי

בכלל לאורך חיי.לימודי התואר ועל התמיכה לאורך -להורי

על הכל. -לברק ברוך, אישי

ילדי היקרים. -לראשית, תפארת ואחיה אליסף

3

תקציר

השרשת העובר הינה תהליך מכריע בפוריות המין האנושי. להצלחת ההשרשה דרוש דיאלוג מתואם בין רירית

בפרק זמן מוגבל רחם רצפטיבית ועובר ברמת התפתחותית של בלסטוציסט. קליטת העובר יכולה להתרחש רק

במהלך מחזור הווסת, המכונה "חלון ההשרשה". תהליך השרשת העובר כולל שלושה שלבים: שלב האפוזיציה,

microRNAושלב החדירה. מחקר קודם שנעשה במעבדתנו גילה תבנית התבטאות שונה של היצמדותשלב ה

עותי ביותר נצפה עבור ביטוי של השוני המשמ בנשים עם כשלים חוזרים בהשרשה לבין זו שבנשים פוריות.

microRNA-23b (miR-23bו )-microRNA-145 (miR-145 .)

של השרשת העובר. in-vitroבמודל miR-145-ו miR-23bמחקר זה נעשה במטרה לבסס את תפקידם של

אשר נבדלות בתכונת הרצפטיביות שלהן, ובשורת ,השתמשנו בשלוש שורות תאים של אפיתל רירית הרחם

המדמה את תאי הטרופובלסט. JARתאים ה

הביא לירידה , המייצגים רקמת רירית רחם רצפטיבית, AN3-CA-ו RL-95בתאי miR-145ביטוי ביתר של

miR-23bעובר אל התאים. ירידה זו נצפתה גם עבור ביטוי ביתר של -של ספירואידים דמויי היצמדותבשיעור ה

-inבתאים. תהליך החדירה היצמדותעליה מזערית בשיעור ההביאה ל miR-145. השתקה של AN3-CAבתאי

vitro והתפשטות הספירואידים כמעט ולא התרחשו בחלק משורות התאים שעברו ביטוי ביתר שלmiR-23b ו-

miR-145 שורות התאים בעקבות ביטוי ביתר של המ. ירידה בביטוי של גני מטרה פוטנציאליים חלה בחלק-

microRNAל . רמות הביטוי שE-cadherin ו-β-catenin ירדו בתאיRL-95 שעברו טרנספקציה. ביטוי של

הביא להשפעה דומה , המייצגים רקמת רירית רחם שאינה רצפטיבית, HEC-1Aבתאי ERαלאסטרוגן הקולטן

. RL-95של הטרנספקציות לזו שנצפתה בתאי

שרשת ל ההליך החדירה במודל שות היצמדותמעורבים בתהליך ה miR-145-ו miR-23bלסיכום, המקטעים

אשר עשויים ההשפעה ברמה המולקולרית מערבת גני מטרה פוטנציאליים אך גם גנים נוספים .in-vitroהעובר

אלו עשויים לשמש microRNAישיר. מקטעי בלתי באופן miR-145-ו miR-23bידי-להיות מבוקרים על

רשה. מצב של כשלים חוזרים בהשבכמטרה עבור טיפול עתידי

4

Abstract

Embryo implantation is one of the most crucial events in human reproduction. Successful

implantation requires a synchronous interaction between a receptive endometrium and a

developed blastocyst which can occur only during a narrow time window, named the

‘window of implantation’. The process of implantation may be classified into three stages:

apposition, adhesion and invasion. Previous study revealed a different microRNA profile in

women with repeated implantation failure (RIF) as compared with fertile women. The most

significantly unregulated miRNA were miR-23b and miR-145.

This study was aimed to validate the role of miR-23b and miR-145 in in-vitro model of

embryo implantation. We used three endometrial epithelial cell lines (EEC) with different

receptive properties. JAR cell line was used as a model for trophoblast.

Adhesion rate was significantly decreased in miR-145 transfected RL-95 and AN3-CA

cells, which represent receptive endometrium, and miR-23b transfected AN3-CA cells.

Where silencing of miR-145 was performed, the adhesion rate exhibits a mild increase.

Invasion and spreadout of JAR spheroids were reduced almost completely in some of miR-

23b and miR-145 transfected cells. Predicted target genes of both of miRNA exhibit

downregulation in some of the cells. Reduced levels of E-cadherin and β-catenin were

shown in RL-95 cells. Expression of estrogen receptor α in HEC-1A cells, which represent

non-receptive endometrium, yields similar response to the transfection as was shown in

RL-95 cells. In conclusion, miR-23b and miR-145 interfere in both adhesion stage and

invasion stage in in-vitro model of embryo implantation. The molecular effects involve

predicted target genes, but may also influence ther gene by indirect effect. These

microRNAs are potential targets for treatment of repeated implantation failure.

5

תוכן עניינים

6 ............................................................................................................. רשימת קיצורים

7 ........................................................................................................................... מבוא

31 ............................................................................................................ העבודה מטרות

30 ............................................................................................................ חומרים ושיטות

23 ...................................................................................................................... תתוצאו

33 ........................................................................................................................... דיון

66 ............................................................................................................ סיכום ומסקנות

66 ................................................................................................................ ביבליוגרפיה

6

קיצורים

BSA- bovine serum albumin

DMEM- Dolbeco’s modified Eagle’s medium

DMSO- dimethyl sulfoxide

E-cadherin- epithelial cadherin

EMT- Epithelial–mesenchymal transition

ERα- estrogen receptor α

FZD7- frizzled-7

H2AFX- H2A Histone Family, Member X

IVF- in-vitro fertilization

LB media- Luria-Bertani media

miRNA, miR- microRNA

MTT- Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide

N-cadherin- neural cadherin

PBS- Phosphate buffered saline

qRT-PCR- quantitive reverse-transcription polymerase chain reaction

RIF- repeated implantation failure

RPM- rounds per minute

SDS- sodium dodecyl sulphate

TBS-T- Tris-buffered saline with Tween

TEMED- N,N,N’,N’-Tetra methyl ethylene diamine

7

מבוא

MicroRNA-מולקולות ה

נוקלאוטידים והאחראיות 33-קצרות המכילות כ RNA( הינן מולקולות miRNA) microRNA-מולקולות ה

Caenorhabditis elegans-ב 0662-התגלו לראשונה ב . הן(0) שעתוקלויסות ביטוי גנים בשלב שלאחר ה

miRNAמולקולה אחת של בהרחבה בקרה זוהי מערכת .רבים בצמחים וביונקים miRNA נחשפומאז ו (3)

miRNAים של רצפים שונ 0111-ל 611 בין מכיל האנושי הגינום כיואף מוערך (2)עשויה לבקר מאות גנים

יתן להסיק על תפקידם נ ומכאן, ורחוקים אבונצינלית קרובים מינים בקרב miRNA של ניכר שימור קיים. (0)

בקרב סוגים שונים של תאים וכן בקרב תהליכים משתנה התבטאותם תבנית .הביולוגי במערך חשובה

.(4) התפתחותיים, פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים

ק מגנים ידועים מה שמעיד על היותם בעלי בקרה נפרדת ממוקמים במרח miRNAרוב למבחינה גינומית,

ולאחר מכן הנושא אותומשועתק יחד עם גן miRNA-חלק ניכר מבין הועצמאית מבקרת גנים אלו. עם זאת,

. (4) של אותו הגן intron-נחתך מחלק ה

ומנגנון הפעולה ביוגנזה

הנקרא ראשוני תעתיקצירת לי RNA polymerase IIידי -משועתקות על miRNA-רוב מולקולות ה

primary-miRNA (pri-miRNA .)במבנה שניוני מסוג זה מאופיין תעתיקhairpin ועשוי להכיל מספר

-המורכב מ microprocessor complexנכנס לקומפלקס גרעיני הנקרא miRNA. Pri-miRNAמולקולות

Drosha (RNase III endonuclease) פקטור הנקרא -ומקוDGCR8 (Di George syndrome critical

region 8). בקומפלקס זה נוצר חיתוך של המולקולה לקבלתpre-miRNA 60-70שאורכו nt והתוצר מועבר

RNase IIIידי אנזים מסוג -. שם מתרחש חיתוך נוסף, גם הוא עלExportin-5 נשאאל הציטופלסמה דרך ה

endonuclease אך הפעם בשםDicerלקולת . חיתוך זה מניב מוdsRNA זוגות 22-שאורכה כ חיים-קצרת-

, שלרוב מיועד לפירוק*miRNAהמסומן ,יחד עם הרצף המשלים לו miRNA-והמכילה את רצף ה בסיסים

8

.microRNA (1): ביוגנזה ומנגנון הפעולה של 1איור

RISCנכנס אל הקומפלקס miRNAגדיל .(4)

(RNA-induced silencing complex ) ונקשר אל

-( שב3'-untranslated region) UTR'3הרצף

mRNA אותו רה שלהמהווה מטmiRNA כאשר .

או כמעט מושלמתבין השניים התאמת הבסיסים

אך . מיידי המיועד לפירוק dsRNAנוצר בעצם מושלמת

חלקית והאפקט העיקרי של בסיסים התאמת הרוב -פי-על

miRNA ה תרגוםדיכוי של הוא-mRNA .לחלבון

-ב שוניםזורים חקרים חדשים מצביעים על קשירה לאמ

mRNA הפקט של עליה בביטוי וכן על א-mRNA

.(0) (0)איור מצבים מסויימיםב

השרשת העובר

בני האדם. כוללמינים כל ההשרשת העובר מהווה תהליך ראשוני וחיוני ליצירת חיים חדשים ולקיומם של

עתידה אשר וחיבור זה יתפתח ליצירת השיליה ,במהלך תהליך זה נרקם החיבור בין העובר לבין רירית הרחם

עובר ברמה תהליך מורכב הדורש הינו זהתהליך בין העובר המתפתח לבין מחזור הדם האמהי. לקשר

, (receptive endometrium) לקליטת העובר נההמוכ רירית רחם(, blastocystהתפתחותית מתאימה )

ת העוברינת להשרשעובר. באופן כללי, רירית הרחם עווסינכרוניזציה נכונה של תהליכים מצד האם ומצד ה

במחזור רביה רגיל של 34-ליום ה 31-יום ההונפרשת בין להוציא תקופה קצרה הנקראת חלון ההשרשה

. תקופה זו מוגבלת הודות לשינויים מורפולוגיים ופונקציונאליים שעוברת רירית הרחם, שמקורם האישה

או נים מורפולוגייםממציאת סמ. ניסיונות רבים נעשו אחר בפעילות של הורמוני השחלה אסטרוגן ופרוגסטרון

הרחם בנשים בהן כנראה חלה סטיה של חלון ההשרשה מזמנו ריריתך ארומולקולריים שונים שיסייעו בת

.(3) הרגיל. ניסיונות אלו טרם נשאו פרי ומחקרים נוספים נדרשים בתחום

9

דומה לתהליך בו תהליך השרשת העובר

ומורכב חודר תא לויקוציט אל רקמה פגועה

אפוזיציה, היצמדות -משלושה שלבים

בתחילת התהליך נוצרת .וחדירה

פיתל אינטראקציה בין העובר לבין תאי הא

ECCל רירית הרחם המכונים בקיצור ש

((Endometrial epithelial cells ,

נדרשות אינטראקציות עם תאים ובהמשך

בכל . ברקמת רירית הרחםפנימיים יותר

נדרש ביטוי שלבי תהליך ההשרשהאחד מ

.(6) (3 איור) על מנת ששלב זה יצלח מתווכות מתאים של מולקולות

(Appositionאפוזיציה )

מנת -בשלב זה תאי הטרופובלסט של הבלסטוציסט יוצרים קישור ראשוני אל רירית הרחם באתר ההשרשה. על

שתהליך ההשרשה יצלח על העובר להיות ברמת התפתחות של בלאסטוציסט, בה הוא מורכב משני סוגי תאים.

השכבה ריפוטנטיים וממנה יתפתח העובר עצמו., מכילה תאים פלוinner cell mass (ICM)הפנימית, השכבה

, והיא זו שמספקת את הקשר הפיזי והפיסיולוגי trophectodermחיצונית מורכבת מתאי אפיתל ונקראת ה

על פני מאטים( leucocytלויקוציטים )דומה לתהליך בו תאים האפוזיציההראשוני בין העובר לאם.. תהליך

התגלה כי על פני העובר מבוטאים יוכלו לחדור אל הרקמה הפגועה. ואכןתאי האנדותל ומתמקמים באתר בו

. מצד הרחם, בעת חלון ההשרשה חלה עליה ויקוציטלתא , כפי שמבוטאים על פני L-selectinסלקטינים מסוג

, נפחיו חלבון מסוכרר של בביטוי עליה כי נראה .L-selectin (3)סוכריים המשמשים כליגנד עבור -בביטוי רב

מתאימים שאינם מאתרים הבלסטוציסט של לדחיה גורמת שרשההה חלון בזמן ,Mucin-1 (MUC-1) הקרוי

.(6) : שלושת השלבים בתהליך השרשת העובר ברירית הרחם2איור

מדים לשכבה של בתהליך האפוזיציה משתתפים כימוקינים הנצ

פני רירית הרחם ומצד הבלסטוציסט מבוטאים -גליקוזאמינוגליקנים שעל

לליגנד שלו. L-selectinים אל אותם כימוקינים. וכן נוצר קשר בין קולטנה

דוחות את העובר מאיזורים שאינם מתאימים mucin-1-מולקולות ה

יב של להשרשה. בשלב האדהזיה משתתפים אינטגרינים ליצירת קישור יצ

העובר. בשלב החדירה הבלסטוציסט פורץ את מחסום האפיתל דרך הגברת

תהליך האפופטוזיס בקרב תאי האפיתל שמתחתיו. בהמשך הטרופובלסט פועל

לפירוק שכבת הסטרומה והתקדמות בתוכה תוך ביטוי של מטאלופרוטאינזות

.MMP-9 (6)-ו MMP-2כמו

10

טוציסט לנקודה האופטימלית להשרשהציטוקינים וכימוקינים המופרשים מהרירית מכוונים את הבלס. להשרשה

(3).

(Attachment) היצמדות

הרחם. בפני התכווצויות ישאר יציב ואיתן כך שמתחזק בשלב ההיצמדות הקשר הראשוני בין העובר לאם

. מתוכם , טרופינין, אינטגרינים וקדהריניםL-selectin , וביניהן:בתהליך זה משתתפותשונות אדהזיה מולקולות

.(6, 7) ובו נתמקד במחקר זה E-cadherinבולט בחשיבותו

(Invasion)חדירה

מבוקר היטב את רקמת האפיתל של רירית הרחם. החדירה הבשלב זה תאי הטרופקטודרם חודרים בתהליך

צריכה להיות מספקת ליצירת אספקת דם לעובר ממחזור הדם האמהי, ומצד שני עליה להתרחש כך שלא תהווה

, בו היא decidualizationעברה תהליך אדפטציה להיריון הנקרא כבר הרחם ריריתסיכון לאם. בשלב זה

וישנה חדירה של לויקוציטים decidual cells-הופכת לרצפטיבית ווסקולרית, תאי הסטרומה מתמיינים ל

decidua-דרך רקמת ה( אשר חודרות Extravillous trophoblast) בליטותלרקמה. תאי הטרופובלסט יוצרים

בתהליך זה הדם האמהי. -צוות העורקים הספירליים ברקמה ליצירת החיבור אל מחזורוכן חודרות אל ק

( אשר מסייעות בפירוק של MMPsציטוקינים, מולקולות אדהזיה ופרוטאזות ), משתתפים פקטורי גידול

.(6)הרקמות השונות

כשלים בהשרשה

יעברו את השבוע 31%אלו רק הריונותעבור מחזור חודשי של האישה. מתוך 33-21%הסבירות להיריון הינה

ישנן ראיות . (01) כשל בהשרשה הינה שאבדו יונותרההמתוך 73%הסיבה להפסקתם של להיריון. 31-ה

קליני )לפני שיש סימן -פרה הריונותהמצביעות כי הסיבה לסבירות הנמוכה להיריון באדם היא בעיקר איבוד

אובדים בשלב מההריונות 33%-קליני להיריון כמו דופק עוברי( ולא כשל ביצירת ההיריון. בהיריון רגיל כ

11

31%ד על מספר זה אף עולה ועומ IVFכשל בהשרשה. במחזורי שלאובדים ב 21%קליני, כאשר -הפרה

(00) .

מוסיף אף זה שיעור. (03)בו מובילהכ ידועה ישראלבעולם נמצא במגמת עליה, כאשר -IVFשיעור טיפולי ה

עלה 3113-ב, גופית-חוץ הפריה מחזורי 31,303 בישראל בוצעו 3110 בשנת, לדוגמה. השנים עם ועולה

.(02) 20,676-ל הגיע הוא 3116 ובשנת 34,663-ל המספר

עבור מחזור 21%זה עומד על ערך שונים, נמצא כי IVFבהשוואה של שיעור ההשרשה לעובר בין מחזורי

עבור המחזור השלישי. ירידה דרמטית זו מעידה על 6%-עבור המחזור השני ו IVF ,06%ראשון של

ת האחראית לכשלים הטרוגניות בין הנשים ונראה כי אלו הנזקקות לטיפולים נוספים בעלות הפרעה ספציפי

.(04)החוזרים בטיפולים

(Implantation Failure edRepeat) כשלים חוזרים בהשרשה

מוחזרים במספר טיפולי העוברים מצב בו מספר הינה (RIF) כשלים חוזרים בהשרשהההגדרה הכללית עבור

-. יש לציין כי אי(03) לא הצליחו להשתרש ברירית הרחם in-vitro fertilization, IVF)) תגופי-חוץ-הפריה

ידי -שהוגדרה עלקלינית כיום משתמשים בהגדרה .(06)כמחלה ASRMידי האיגוד -פוריות הוגדרה על

החזרות עוברים עם עוברים בעלי שלושוהיא: היעדר היריון לאחר ביצוע מעל ל 3113-ב ESHREהאיגוד

ידי כל -מדויק יקבע עלאיכות גבוהה, או לאחר החזרה של עשרה עוברים ויותר במספר החזרות, כאשר המספר ה

ימים מספר כעבור המופיעה hCG ברמות עליה ידי-על קליני באופן נקבעעצמה ההשרשהקיום .מרכז רפואי

חוסר. שתי הגדרות אלו לוקות בחסר, דבר המביא לומספר הימים לכךמדויק ערך, וטרם נקבע מההשרשה

קושי בהתייחסות לבעיה. היעדר ההגדרה הקלינית מעיד והשונים הרפואיים המרכזים בין אלו בהגדרות אחידות

, שכן קל להגדיר מצב פתולוגי בתהליך פשוט, אך קשה להגדיר מצב פתולוגי RIFשל בות המצבעל מורכ

כשלעצמו בעל IVFביצוע ומושפע מפתולוגיות נוספות. פיסיולוגיים בתהליך הכולל מספר רב של תהליכים

קים בו הוכח פרוטוקולים שונים היכולים להשפיע על שיעור ההשרשה בו, וכן גם המרכיב האנושי של העוס

, ואכן מעטים ניסו לברר RIF של שכיחותהחוסר הגדרה מוחלטת מביא לבעייתיות בתיאור . (06) כמשמעותי

12

-המטופלות במתוך 01%עומדת על RIFהעריכו כי השכיחות של בשוויץ, Utrecht רפואיה מרכזב. אותה

IVF (07) .מתוך מחזורי ה 01%כי וצדק אמד-החולים שערי-ביתב, לעומת זאת-IVF המתבצעים בו הינם של

.RIF (06)נשים עם

האימהיבגורם העוברי או בגורם הסיבות לכשלי השרשה חוזרים הינן רבות ויכולות להיות מחולקות לפי תלותן

אסקור בקצרה את הגורמים, הטיפולים השונים הקיימים כיום ויעילותם.. (03)

סיבות מצד הגורם העוברי:

כן עובר יכול לכלול טרנסלוקציה כרומוזומאלית או אנאפלואידיות ונורמלי של ה-קריוטיפ לא -סיבות גנטיות

סקירה גנטית של העובר לפני החזרתו מתבצעתרים בהם יש חשד להפרעות אלו קבעיות גנטיות נוספות. במ

(PGD- preimplantation genetic diagnosis אך אין המלצה לבצע זאת באופן רוטיני במקרים של )RIF.

בתהליך הדחיסה של או בעיה DNAבעיות גנטיות בזרע אשר אינן נבדקות, כמו פרגמנטציה של בנוסף יתכנו

IMSI (intracytoplasmaticבשיטה כיום, ניתן לבחון את הזרע ורמות להפרעה גנטית בעובר. כרומטין, הג

morphologically selected sperm injection בה נעשה שימוש )( בהגדלה גבוההX6000 )פשרת המא

. בשימוש בשיטה זו במקרים של לפיהם ניתן לבחור את הזרע המובחר יותרמרכיבים ציטופלסמטיים, בחינה של

RIF אשר מתמקדת בתנועתיות הזרע בלבדביחס לשיטה המקובלת לבחינת הזרע ההריונותאחוז נמצאה עליה ב ,

(06).

ש ברחם. קיימות עדויות תהליך זה הינו חיוני על מנת שהעובר יוכל להשתר -zona pellucidaבקיעה של

. (03) סותרות לגבי יעילות ביצוע מלאכותי של תהליך זה ועל כן אין הוא מבוצע באופן רוטיני

משלב הזיגוטה ועד שלב החזרת העובר יכולה להיעשות כבר -ואופן החזרתו דרגת התפתחות העובר

כלל -בדרךנעשית והחזרה מוקדמת של העובר מקצרת את תקופת גדילתו בתנאים מלאכותיים . הבלסטוציסט

המתאימה ביותר בסביבה הטבעית, כך שהוא גדל (zygote intra fallopian transfer) ישירות לחצוצרה

נעשית מתוך הנחה כי העובר ימשיך לגדול ברחם עד ימים 3-2זה. החזרה בשלב גדילה של יהתפתחות לשלב

לשלב הבלסטוציסט ולאחר מכן יעבור השרשה, אך קיימים מקרים בהם התפתחות העובר נפסקת ברחם ואובד

13

חזרת העובר בשלב הבלסטוציסט, כך רמת התפתחותו ודאית וסלקציה נכונה יותר ניסיון זה. על כן ישנו יתרון לה

שיטת יותר. מדויקסיולוגיים של העובר ושל הרחם ישל התהליכים הפ הסנכרוןשל העובר נעשית, ובנוסף

בה מבוצעות ( sequential embryo transferהחזרה מדורגת ) נההחזרה נוספת המשפרת שיעורי השרשה הי

. נראה כי הצלחת שיטה זו (31)לשאיבת הביציות 3וביום 2חזרות עוקבות של עוברים, למשל ביום שתי ה

ת עקב שינוי חלון ההשרשה העשוי להשתנות בין המטופלונעוצה בכך שהיא מעלה את הסיכוי "לקלוע" ל

דיאליים.איבתגובתיות של רירית הרחם להורמונים הסטירו

ת יתכן כי מדיום התרבית בו גדל העובר אינו איכותי מספיק על מנת לאפשר התפתחו -הביצית המופרית תרבית

או העשרת מדיום הגידול ים הםאפשרי נותתרולעובר אשר מסוגל להשתרש ברחם. פ RIFהעובר של נשים עם

של משותפת תרבית בוצעה כאשר( של העובר עם שכבת תאים מזינים. co-cultureקיום של תרבית משותפת )

.RIF (30)עם נשיםקרב ב בהשרשה עליה עצמה נצפתה האם של הרחם מרירית שנלקחו תאים עם העובר

סיבות מצד הגורם האמהי:

קרני( או נרכש )פוליפים ברחם, סיביות -רחמית, רחם דו-עיוות זה יכול להיות מולד )מחיצה תוך -עיוות אנטומי

.(03) רחמיות(. במקרים אלו יש לתקן את העיוות ככל שניתן בדרך כירורגית-דופן הרחם, הידבקויות תוך של

בנוסף על היותה מקושרת עם הפלות חוזרות, מספר חוקרים דיווחו על קשר -(thrombophiliaיתר )-קרישיות

רירית. המנגנון לכשל השרשה שכזה דומה למנגנון המביא לאותן הפלות והוא ירידה בזרימת הדם אל RIF-ל

RIFלירידה ברצפטיביות של הרחם. כאשר אישה עם ואל השיליה. יתכן ופגיעה בזרימת הדם מביאה הרחם

זה אינו מומלץ כאשר לא (, אך טיפולheparinיתר מומלץ מתן של הפרין )-מאובחנת גם כבעלת קרישיות

.(03)אובחנה בעיה זו

על מנת שהעובר יוכל להשתרש דרוש ויסות של המערכת האימונית בגוף האם כך שתפתח -גורם אימונולוגי

החיסונית מערכתידי ה-עצמי על-כלפי העובר ולא תדחה אותו. לצורך כך על העובר להיות מזוהה כלא עמידות

התערבות פרמקולוגית בפעילות מערכת החיסון. והתגובה מצד האם צריכה להיות מבוקרת היטב של האם

.(03) אלומעין שאובחנו עם הפרעות RIFעליה בשיעור ההריונות בקרב נשים עם תההרא

14

תיתכן הפרעה ברמה המורפולוגית או ברמה המולקולרית: -ברירית הרחםהפרעות

6-6ו מקובל כי העובי המינימאלי של רירית הרחם המאפשר השרשת עובר הינ -רחם דקה-רירית

בעיה קשה תגובתיות, במיוחד לאחר התערבות כירורגית, הינה -מילימטר. רירית רחם דקה או חסרת

לטיפול. טיפולים אפשריים הינם מתן פומי של אסטרוגן במינון גבוה, מתן וגינאלי של אסטרדיול,

אלו בכדי להניב אך עדין אין בטיפולים. sildenafil המכיליםאספירין במינון נמוך או נרות וגינאליים

-G-CSF (granulocyte colonyטיפול ניסויי נוסף הינו מתן מקומי של תוצאה משביעת רצון.

stimulating factorידי שטיפה של הרחם בתמיסה. טיפול זה הראה עליה בעובי רירית -( המתבצע על

ישה אחרת היא גבנשים בהם מתן אסטרוגן וואזודילטורים לא הצליחו. הרחם וכן בשיעורי ההשרשה

רמות גבוהות ות הקפאת העוברים וביצוע החזרתם אל הרחם במחזור טבעי או במחזור מלאכותי בו ניתנ

. (03) של אסטרדיול לפני הוספת הפרוגסטרון

כפי שהזכרנו מקודם, תהליך ההשרשה הינו -חיוניות לתהליך ההשרשהשיבוש בביטוי מולקולות ה

יתכן כי ביטוי לא תקין של מתווכים שונים תהליך מורכב המערב מולקולות מתווכות שונות ומגוונות.

מחקרים קודמים במעבדתנו גילו רשה הוא המקור לבעיה של כשלי ההשרשה החוזרים. בעת חלון ההש

הן מבחינת ביטוי של לבין זו של נשים פוריות RIFפרופיל גנטי שונה בין רירית הרחם של נשים עם

mRNA (33) והן מבחינת ביטוי שלmiRNA (32) ( על הביטוי השונה של פירוטmiRNA מופיע

גנים 366-, כאשר ירידה בביטוי חלה בRIFגנים הדגימו ביטוי שונה בנשים עם 202 בפרק הבא(.

משתתפים במסלולים הידועים בחשיבותם לתהליך ההשרשה, בין גנים אלו נמצאו גנים רבים ה מתוכם.

-עלמבין הגנים שנמצאו הינם מבוקרים 6% בנוסף, .Wnt-מסלול הואדהזיה תאית : מחזור התא, גוןכ

ואכן נמצא כי גם בביטויו חלה ירידה Slug-ו cyclin-E2 ביניהם, α (ERα)לאסטרוגן קולטןידי ה

-. מכאן ניתן להסיק כי יתכן שתגובתיות מופחתת לאסטרוגן הינה הגורם לRIFשמעותית בנשים עם מ

RIF נוספות החיוניות להשרשת רמה נמוכה של מולקולות צאו . מחקרים אחרים מ(33) בנשים אלה

(, מולקולות המשתתפות ביצירה LIFוהתוצר שלו IL-1 ,IL-6, כגון: ציטוקינים )העובר

15

בהשוואה לנשים פוריות. RIFבנשים עם נה שו microRNA: פרופיל ביטוי של 3איור

.RIF (32)בנשים עם miR-145-ו miR-23bביטוי גבוה ביותר נצפה עבור

חלוקות לגבי דעות( ואחרות. קיימות αVβ3מולקולות אדהזיה )(, cPLA2α, COX-2פרוסטגלנדינים )

.RIF (07)בנשים עם MUC1 ביטוי שונה של

וכשלים חוזרים בהשרשה microRNA קטעימ

שליםם עם כנשיבפאזה הסקרטורית ב miRNAשל הביטוי במחקר שנעשה במעבדתנו, נמצא שוני בפרופיל

ירידה בביטוי, ביטויים של חלה miRNAנשים פוריות. בעוד שרק בשלושה מקטעי ל חוזרים בהשרשה מזה ש

נצפתהעליה המשמעותית ביותר ה .RIF (32)-בנשים המאובחנות כבאופן משמעותי עשרה מקטעים עלה

2611-באופן פוטנציאלי כ יםמבקר miRNA קטעימ 02אותם . (2)איור miR-145-ו miR-23bבביטוי של

מטרה גני 32, התגלו RIFבנשים עם mRNAביטוי של הבהצלבה של מידע ביואינפורמטיבי עם פרופיל גנים.

miR-145-ו miR-23b . כאשרRIFשים עם בנ ויהמראים ירידה בביט miRNAאותם שלפוטנציאליים

. גנים אלו מעורבים במסלולים שונים הידועים )61%) גנים מתוכם 06לירידה בביטוי של ת אחראים פוטנציאלי

. מחזור התאו p53, מסלול Wntהצמדה, מולקולות אדהזיה, מסלול -בחשיבותם לתהליך ההשרשה, כגון: צמתי

. עם RIFכי אכן חלה ירידה בביטוי של גנים אלו בנשים עם אגנים מצ 32מתוך אותם ה גניםשל ארבע אימות

-miRכגן מטרה של sfrp-4-, וmiR-145כגני מטרה של N-cadherin-ו H2AFX ,netrin-4גנים אלו נמנו

23b (32).

מחקרים שונים מעידים על

-ו miR-23bמעורבותם של

miR-145 .בסרטנים שונים

עולה בסרטן miR-23bביטוי

(33), בסרטן הפה (34) הקיבה

. יחד עם (36)וסרטן הכליות

זאת חלה ירידה בביטוי של

16

miR-23b (36) ובסרטן הפרוסטטה (36), בסרטן המעי הגס (37) הרחם ריריתבסרקומה של. miR-145

הנוגד פעילות סרטנית ונמצא כי רמותיו יורדות בסרטנים שונים, ביניהם: סרטן הריאות microRNA-נחשב כ

. (36)וסרטן הפרוסטטה (23), סרטן המעי הגס (20)סרטן השד , (21)

לבין מצבים פתולוגיים של הרחם כגון אנדומטריוזיס miR-145אדם נמצא קשר בין ביטוי ביתר של -בבני

הקולטן כגורם לירידה בביטוי in-vitroנקשר לסרטן השד התלוי באסטרוגן והוכח miR-145. בנוסף, (22)

והיות והוא חיוני ביותר RIF (33)נמצאה גם בקרב נשים עם ERα-. היות וירידה בERα (24)אסטרוגן מסוג ל

.miR-145לתיפקוד של רירית הרחם, במחקרנו הושם דגש על

שרשת העוברתהליך התאית ב-תאחיזה בין

בתאי האפיתל, ומכאן ממברנת התאים ני הצד הלאטרלי של פ מבוטאת על E-cadherinמולקולות האדהזיה

החוצה את , kDa 120שקל מולקולרי של מסוכרר בעל מ-זהו חלבון .epithelial cadherin -מקור שמה

. קישור זה משתתף ביצירת צמתי האדהזיה שבין סידן-הממברנה הציטופלסמטית ויוצר קישור הומופילי תלוי

מעוגן ה α-catenin, היוצר קומפלקס עם β-catenin-תאי ל-בחלקו התוךמקושר E-cadherin .(6) התאים

בהיעדר קישור זה .(26)תאית -קישור זה חיוני ליצירת האדהזיה הבין .(23)(4)איור בסיבי האקטין שבתא

המביא epithelial mesenchymal-transition (EMT) שכבת האפיתל מאבדת פולריות ומושרה תהליך של

מנגנונים שונים אחראים לירידה התקדמות הגידול ויצירת מטאסטאזות. -לנדידה של תאים, ובהקשר לסרטן

הינו מבניהם, כאשר הבולט E-cadherinבביטוי

ידי חלבונים כמו:-עלשל הגן שעתוקדיכוי ה

Snail, Slug, SIP1 ו-Twist (6). עליו בקרה ב

ידוע בחשיבותו, אשר Wnt-מסלול ה ף גםמשתת

אל Wntתהליך ההשרשה. קשירה של ליגנד ל

β-cateninמביאה לכניסתו של FZD קולטןה

Wnt (35.): תאחיזה בין תאית ומסלול העברת האותות 4איור

17

. Wnt-ה מסלול גני המטרה של שעתוקומביא ל TCF/LEF שעתוקאל פקטורי ה נקשרלגרעין התא, שם הוא

-Eהמביאים בסופו של דבר לירידה בביטוי (,MMP-7ופרוטאזות שונות ) Slug, Twistבין גני המטרה נמנים

cadherin (26).

ועל חשיבותה רירית הרחםאל העובר ל ש היצמדותבתהליך הממצאים רבים מעידים על קיום אדהזיה שכזו גם

בעכברה אינו מוגבל לצד הלאטרלי של ממברנת תאי פני רירית הרחם -על E-cadherin הביטוי של .לתהליך

E-cadherinבנוסף, .(27) חלון ההשרשה פני הצד האפיקלי שלהם בעת-, אלא הוא מתבטא ביתר עלהאפיתל

בעת הפאזה E-cadherinשל mRNA-באדם נמצאה עליה ב. (26)אנושי טרופובלסט פני על מתבטא

נראה כי עליה זו מאפשרת את יצירת הקישור בין העובר לאם, אך בהמשך לצורך שלב החדירה . (6) הלוטאלית

יתכן כי בצמתי האדהזיה שבין תאי האפיתל של רירית הרחם. E-cadherinדרושה דווקא ירידה בביטוי של

והיא המביאה בסופו של דברתאי -לעליה בריכוז הסידן התוך גורמתסטרון בתחילת ההיריון העליה בריכוז הפרוג

. (3)ולירידה בביטויו E-cadherinפירוק של ל

והשרשת העובר αERלאסטרוגן קולטןה

FSHידי ההורמון -הורמון האסטרוגן מופרש מתאי הגרנולוזה של הזקיקים השחלתיים בעקבות גירוי על

(follicular stimulating hormone). וגן בדם עולות במשך הפאזה הפרוליפרטיבית, הן מגיעות רמות האסטר

רוב -פי-הפעילות התאית של אסטרוגן מתווכת עלשעות לפני הביוץ, ויורדות בפאזה הסקרטורית. 34-לשיא כ

הוא ERαכאשר קולטןעתוק גנים שונים. קיימים שני איזופורמים של הים גרעיניים המבקרים שקולטנע"י

רירית הרחםפרוליפרציה של רקמת ה לות האסטרוגן ברחם. אסטרוגן מניע את תהליךהמתווך העיקרי של פעי

. ברקמה זו וברקמות נוספות דם ומעורב בתהליכים נוספים-, מקדם חדירות של כליבפאזה הפרוליפרטיבית

מהווה תהליך מקדים והכרחי כי היא משוער, ו"estrogen priming"מכונה שחלה לפני הביוץ העליה ברמתו

ים קולטנים לאסטרוגן והנקולטעם פעילות זו הוא מעלה ביטוי של ה. (7) הרחם להשרשת העוברהמכין את

מחקרים בעכברים הראו כי אסטרוגן חיוני עבור תהליך להתפתחות תקינה של . (26) לפרוגסטרון ברירית הרחם

18

.E-cadherin (44)על ERα: מנגנון משוער לבקרה של 5איור

מבקר Snail .ERα-ו Slugי השיעתוק ידי פקטור-מדוכא על E-cadherin ביטוי של

MTA3 (metastatic tumor antigen 3.)ישיר את הביטוי של -באופן בלתי

MTA3 הוא חלק מהקומפלקסMi-2/NuRD המדכא שיעתוק של גנים. קומפלקס זה

דרך קישור ישיר לפרומוטור שלו. דיכוי זה מביא לעליה בביטוי Snailמדכא שיעתוק של

.E-cadherin (41)של

יחד עם זאת, רמות גבוהות של אסטרוגן הביאו ל"סגירה" של חלון עובר ולהיצמדות של העובר אל הרחם.ה

.(7)ההשרשה

ERαממצאים שונים מעידים כי

ישיר את הביטוי -מעלה באופן בלתי

in-vitro. מחקר E-cadherinשל

מצא כי בתאי סרטן השד ובתאי

שפעול של , RL-95 ריריתאפיתל ה

ERα גורם בצורה עקיפה לירידה

ובעקבות כך snailביטוי של ב

E-cadherinלעליה בביטוי של

.(41) (3)איור

במחקר שנעשה לאחרונה בנוסף,

מגביר ERαבמעבדתנו, מצאנו כי

in-vitroומגביר תהליך של השרשה הרחם ריריתספירואידים דמויי בלסטוציסט לתאי אפיתל של אדהזיה של

ומדכא ביטוי שלו, דבר המביא לעליה Slugנקשר ישירות לפרומוטור של ERαבמודל זה. בנוסף, נמצא כי

על תהליכי האדהזיה ERαצמצמה את ההשפעה של E-cadherin. השתקה של E-cadherinבביטוי של

.in-vitro (6)והחדירה

שימוש במודלים להשרשת העובר

מחקר בביצוע ואפילו קיים קושי in-vivoשאינו יכול להיחקר עובר אנושי ברירית הרחם הינו תהליך השרשת

ex-vivo. ושל תאי טרופובלסט בכמות מספקת הרחם ריריתכבת של ש של תאי אפיתל אנושית מרקמההפקה

נעשים במודלים של חיות אך לא ניתן להשליך in-vivoמחקריאפשרית. -למחקר הינה מורכבת ואפילו בלתי

in-vitroכן שימוש במודל -מהן ישירות על התהליך בבני האדם מחמת הבדלים גנטיים הקיימים בין המינים. על

19

ה מתאימה של חירתוך שימת לב לב ממקור אנושי מהווה אפשרות מחקרית טובה בתחום זההכולל שורות תאים

, RL-95זה בשורות התאים עבור המודל לתאי האפיתל של רירית הרחם, השתמשנו במחקר .שורות התאים

HEC-1A ו-AN3-CA תאי אשר מקורם באדנוקרצינומה .RL-95 לתאים רצפטיביים רווחכמודל משמשים

בנוסף הם נוטים ליצור. ERαלאסטרוגן קולטןוביטוי של ה פולריות, חוסר ים בדרגת התמיינות נמוכהומאופיינ

, הם בעלי דרגת שאינם רצפטיביים לתאיםרווח כמודל משמשים HEC-1Aצברים דמויי בלוטות. תאי בתרבית

הינם בעלי רצפטיביות AN3-CAתאי . ERα (41 ,40)אינם מבטאים פולריות מובהקתהתמיינות גבוהה,

, הם הופקו ממטאסטאזה לימפתית של קרצינומה של רירית הרחם ומאופיינים בחוסר RL-95פחותה מזו של

צמדות ספירואידים דמויי טרופובלסט י. נראה כי פגם גנטי זה מביא לירידה בהE-cadherin (43 ,42)ביטוי של

אל תאים אלו.

choriocarcinomaמודל לתאי העובר. מקור תאים אלו הוא בגידוללשמש כנבחרה JARשורת התאים

extravillous -ו villous cytotrophoblast. תאים אלו מבטאים פנוטיפ של ))גידול מרקמת הטרופובלסט

trophoblast (42)ומאופיינים בחודרניות.

20

מטרות המחקר

לוגיה. נראה כי לבעיה זו אחראים בעית כשלים חוזרים בהשרשה הינה בעיה שטרם נמצא לה מענה בענף הגניקו

מספר גורמים. התערבויות רפואיות שונות הביאו רק למענה חלקי לבעיה. מהשוני הגנטי בין רירית הרחם של

. עבור גורם RIFלבין רירית הרחם של נשים פוריות, עולה גורם גנטי המעורב בהתפתחות של RIFנשים עם

נטית טרת מחקר זה הינה לקדם את המידע הקיים אודות הלקות הגזה טרם נמצאה התערבות רפואית כלשהיא. מ

. RIFברירית הרחם שאינה רצפטיבית, אל עבר המטרה של מציאת טיפול הולם לבעיה של

מטרות מחקר זה הינן:

I. תפקידם של ביסוסmicroRNA-23b ו-microRNA-145 בתהליך השרשת העובר במודל השרשה

in-vitro.

II. השפעת אותם בדיקתmicroRNA בתאי HEC-1A לאסטרוגן קולטןהמבטאים את הαER.

III. תבנית ההתבטאות של איפיון microRNA-23b ו-microRNA-145 במהלך מחזור ה-estrous של

העכברה.

עשויה להביא ההשרשה חלון בעת RIF עם נשים של הרחם ברירית miR-145-ו miR-23bשל בביטוי ירידה

יש לשקול miR-145-ו miR-23bעם ביסוס תפקידם של .שים אלההצלחה של תהליך השרשת העובר בנל

ידי מקטע שיקשר אל -. השפעה כזו יכולה להיעשות עלin-vivoכיצד ניתן להשפיע על רמות הביטוי שלהם

ידי התערבות במנגנון המבקר את ביטויים בתאים. אנו תקוה כי מחקר זה יהווה אבן -אלו או על miRNAמקטעי

ל הולם לבעיה של כשלים חוזרים בהשרשה. דרך בפיתוח טיפו

21

חומרים ושיטות

חומרים

2-mercaptoethanol (Sigma Chemicals Co., St. Louis, Mo. USA)

Acrylamide (Sigma Chemicals, Co., St. Louis, Mo. USA)

Ammonium sulphate ( J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA)

Ampicillin (Sigma Chemicals, Co., St. Louis, Mo. USA)

Blasticidin S HCl (Invitrogen, carlsbad, CA)

Bradford reagent (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)

BSA (Sigma Chemicals, Co., St. Louis, Mo. USA)

Chloroform (Frutarom LTD. Haifa, Israel)

DMEM, FCS, Sodium Bicarbonate sol-n 7.5%, Basal medium, ME medium, non essential

amino acids sol-n, L-glutamine sol-n, Pen-strep-ampho, and sodium pyruvate, LB media

(Biological Industries, Beit Haemek, Israel)

DMSO (Frutarom, Haifa, Israel)

EDTA (Mallinckrodt Baker Inc., USA)

Ethanol absolute; dehydrated, AR-b (Bio-Lab, Jerusalem, Israel)

22

EZ-ECL (Beit-Haemek, Israel)

GeneJET™

Plasmid Miniprep Kit (Fermenats, Thermo Scientific, (EU) Lithuania)

Immobilon®-P (Merck Millipore, Billerica, MA)

Isopropanol, analytical (Frutarom LTD. Haifa, Israel)

Kapa Syber Fast (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA)

Laemmli sample buffer (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)

Lipofectamine™

2000 (Invitrogen, carlsbad, CA)

miRCURY LNA™

microRNA Power Inhibitor (Exiqon, A/S, Vedbaek, Denmark)

miRNASelect™

pEGP-miR Null Control Vector (Cell Biolabs, San Diego, CA)

miRNAselect™

pEP-has-mir-145 expression vector (Cell Biolabs, San Diego, CA)

miRNAselect™

pEP-has-mir-23b expression vector (Cell Biolabs, San Diego, CA)

miRNeasy®

(Qiagen, Hilden, Germany)

mirVana™

(Invitrogen, carlsbad, CA)

miScript RT kit (Qiagen, Hilden, Germany)

miscript SYBER® Green PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany)

MTT (EMD Chimicals, San Diego, California)

23

Nonidet-40 (Pierce, Rockford, IL,USA)

Opti-MEM® (Invitrogen, carlsbad, CA)

PageRuler™

Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific, (EU) Lithuania)

PBS (Biological Industries, Beit Hemek, Israel)

PKH26 red fluorescent cell linker kit (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)

PKH67 green fluorescent cell linker kit (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)

Prestained Protein Ladder 10-180 Kda (Fermentas, Vilnius, Lithuania)

Protease inhibitor complex (Sigma Chemicals Co., St. Louis, Mo. USA)

Puromycin (A.G. Scientific, San Diego, CA)

RevertAid H Minus first strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific, (EU) Lithuania)

SDS (Biological Industries, Beit Hemek, Israel)

Sodium Orthovanadate (Sigma Chemicals Co., St. Louis, Mo. USA)

TEMED (Merck, Darmstadt, Germany)

TRI-Reagent® RNA isolation agent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

Tween 20 (J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA)

Ultra-pure water (biological Industries, Beit-Haemek, Israel)

24

.ישראל ,סיגמהחברת מ נרכשו גן לכל ספציפיים DNA רצפי

נוגדנים:

Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat anti Rabbit IgG (Jackson Immunoresearch, West

Grove, PA, USA)

αE-cadherin (Enzo, Lausen, Switzerland)

αGAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)

αN-cadherin (Invitrogen, Camarillo, CA, USA)

αC-myc (D84C12) XP™ Rabbit mAb (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)

αCyclin-D2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)

αERα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)

α-β-catenin (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)

α-α-tubulin (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel)

25

שיטות

עוברשל תאי ו הרחם ריריתשל םות תאיגידול שור

בפרופיל , והן נבדלות זו מזו הרחם ריריתשמקורן בתאי האפיתל של שורות תאים במחקר נעשה שימוש בשלוש

שמקורה בשיליה. כל JARם בתכונת הרצפיטיביות. עבור מודל לתאי העובר נבחרה שורת התאיגנטי וכן

גודלו JARותאי RL-95 ,AN3-CA. תאי CO2 5%באויר שהכיל ºC 27 -ב באינקובטורהתאים גודלו

,L-glutamine 1%, ואמפותריצין סטרפטומיצין, פניצליןתמיסת 0%שהכיל DMEMבמדיום

sodium-pyruvate 0%, 0% ,סרום עובר 01%-חיוניות ותמיסת חומצות אמינו שאינן 0%תמיסת ויטמינים

עם תוספים באותה המתכונת שתוארה. התאים פוצלו McCoy'sגודלו במדיום HEC-1A. תאי (FCS) פרה

פעמיים בשבוע.

מבחן האדהזיה

מנת -באריות על 34תאים בפלטות המכילות 411,111-כ HEC-1A-ו AN3-CAנזרעו משורות התאים

תאים כדי 311,111-נדרשה זריעה של כ RL-95עות. עבור תאי ש 46כבה רציפה לאחר שיגיעו ליצירת ש

שעות 46בצלחות תרבית וגודלו למשך JARתאי 0,111,111-כבה שכזו. במקביל נזרעו כלהגיע ליצירת ש

1.5%למדיום גידול המכיל ריריתשעות הוחלף המדיום של תאי ה 34נדנדה. לאחר גבי מטלטל -באינקובטור על

FCS ה""הרעב הכנה של ושלב זה מהווה ((starvation שעות מהזריעה תאי 46לקראת מבחן האדהזיה. לאחר

ספירואידים הועברו אל תרבית תאי רירית . הדים המדמים את העובר בשלב ההשרשהיצרו ספירואי JAR-ה

דקות. 43של התרבית המשותפת נעשתה למשך הדגרהונספרו תחת המיקרוסקופ בכל אחת מהבאריות. הרחם

מנת לאפשר -על שעות 3נמשכה הדגרהה ,AN3-CAהאדהזיה בתאי שיעור ר היה צורך למדוד את כאש

דקות על גבי מטלטל 01נעשה טלטול של הפלטות למשך הדגרה. בתום ההידבקות מספקת של ספירואידים

ים . הספירואידPBS. לאחר מכן המדיום נשאב ונעשו שתי שטיפות בתמיסת RPM 211אורביטלי במהירות של

.ריריתהנותרים בכל בארית נספרו ובוצעה אנליזה של רמת האדהזיה של הספירואידים אל תאי ה

26

מבחן החדירה

עם ספירואידים של תאי הדגרהאופן זהה למבחן האדהזיה. הבעבור מבחן החדירה שורות התאים גודלו וטופלו

JAR שעות. בפרק זמן זה הספירואידים של תאי ה 46עד 34-נמשכה כ-JAR ים מעין תהליך מתפשטים ומבצע

. במקרה זה חיקה של תאי הרירית ממרכז ההדבקותתוך ד ,רצפטיביים רירית רחם, שהינםשל חדירה דרך תאי

שהיו בו מקודם. תופעה זו כונתה רירית הרחםניתן להבחין בשטח טבעתי סביב הספירואידים בו לא נראים תאי

מידת החדירה להערכתאובייקטיבי אשר משמש אותנו כמותי . זהו מדד "endometrial clearance"בשם

Olympusתחת מיקרוסקופ בעזרת מצלמה מתאימה )תמונות צולמו ידי תאי הרירית השונים. -המתאפשרת על

E-330) אנליזה בוצעה בתוכנת .Image-J.

מיקרוסקופיה פלורסנטית

ת בצבעים שונים על מנת להקל את ההבחנה סנטיונצבעו בצביעה ממברנלית פלור JARותאי הרחם ריריתתאי

נצבעו בעת JARהמבחן נעשה כמתואר מקודם ושולבו בו שתי צביעות התאים. תאי ביניהם במבחן החדירה.

לפי PKH67 green fluorescent cell linker kitבעזרת ממברנלית בגוון ירוק פלורוסנטית העיזריעתם בצב

46לאחר בגוון אדום ת ממברנליתסנטיופלור העינצבעו בצב ריריתההוראות היצרן. תאי שורות התאים של

פעמיים, PBS. הבאריות נשטפו בתמיסת PKH26 red fluorescent cell linker kitבעזרת שעות מזריעתם

תחתדקות 6עם הצבע נמשכה הדגרהחולקו בכל בארית. 200µl-היצרן ותמיסת הצבע דוללה לפי הוראות

למשך דקה ותמיסה זו נשאבה מהבאריות. לנפח הצבעשווה הנפח ב FCS . הצבע נוטרל עםטלטול קל מדי דקה

תרבית דקות. 3של מדיום מלא כאשר כל שטיפה נמשכה 500µl-שאריות הצבע נשטפו שלוש פעמים עם כ

פלורסנטי קונפוקליבמיקרוסקופ התאים צולמושעות. 34-46 התבצעה במשךמשותפת של שני סוגי התאים

(Olympus FV300אנליזה לתמונות נעשתה .) באמצעות התוכנה Olympus FV10-ASW 3.1 Viewer.

-נעשו בשלוש שורות התאים של רירית הרחם. נזרעו כ in-vitroסרטים המתעדים את תהליך ההשרשה

. צביעה פלורסנטית נעשתה כמתואר לעיל. התיעודס"מ 2תאים בצלחות תרבית בעלות קוטר של 0,731,111

27

. Zeiss LSM710בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסנטי סמוך להעברת הספירואידים לתאי הרירית, נעשה

שעות. עיבוד עבור סרטים 06-דקות במשך כ 01 מדי צולמהבמהלך הצילום התאים שהו באינקובטור ותמונה

. Zen 2009 light editionאלו נעשה בעזרת התוכנה

Assay TMT

-Methylthiazolyldiphenyl (MTT) חומר. הורמת הפרוליפרציה בדיקת חיות התאים שיטה זו מאפשרת

tetrazolium bromide אשר ,עובר חיזור על ידי אנזימים מיטוכונדריאליים הוא אשר. כהינו בעל צבע צהוב

ת ובבארינזרעו תאים 011,111-כאשר צבעו סגול. MTT formazan-הופך ל ,הואפעילים בתאים חיים בלבד

חולקו שעות מהזריעה, 46שעות או 34חולק בכל בארית. לאחר 500μlומדיום בנפח של well-24של פלטת

50 µl תמיסת של MTT (5mg/ml PBS) הריאקציה נעצרה . ותדק 31-21למשך בכל בארית ובוצעה הדגרה

קריאה של כקריאת רקע נלקחה . הגורם לפיצוץ התאים DMSOשל 200μl ע"י שאיבת הנוזל והוספת

DMSO . 50מתוך הדוגמאות הועברוμl 96לפלטת-well ב ונקראו-ELISA reader 570באורך גל שלnm .

. מידת הפרוליפרציה של התאיםהתוצאות כומתו לקביעת

mRNAהפקת

פי להוראות -על Tri-reagentבאמצעות total RNAוהופק PBSצלחות התרבית נשטפו פעמיים בתמיסת

-השקעה של ה .סירכוזה בין פאזה מימית לפאזה אורגנית בוצעה באמצעות הוספת כלורופורם והפרדהיצרן.

RNA נעשתה באמצעות הוספתisopropanol המשקע נשטף באתנול והומס במים. הריכוז ומידת הניקיון של .

,NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DEנמדדו בעזרת ספקטרופוטומטר RNA-ה

USA.)

(mRNA) PCR-Quantitive RT

. םספציפיי ברצפים שימוש באמצעות גנים של mRNA רמות לבדוק היא השיטה מטרת

28

0.5g של total RNA הפוך שעתוק עברו לעיל, תואר ש כפי שהופק reverse transcription)) ליצירת

cDNA תוך שימוש בערכהRevertAid H Minus first strand cDNA synthesis kit ההרצה נעשתה לפי .

הריאקציה כללה הדגרה . RNAנטורציה של -וביצוע שלב דהrandom primer -פרוטוקול היצרן תוך שימוש ב

דקות. 3למשך 70°C-ידי חימום ל-הופסקה עלולמשך שעה 42°C-בהדגרה ,דקות 3למשך 25°C-ב

הספרות או נלקחו מPrimer express (Applied Biosystems ) הפריימרים תוכננו בתוכנתזוגות רצפי

(. הריאקציה 0בה יש להשתמש )טבלה cDNA-פריימרים נעשה כיול לכמות הזוג (. עבור כל 0)טבלה המדעית

של cDNA ,10μlשל תבנית 2μl ( כללה20μlתערובת הריאקציה )ו Kapa Syber Fastבוצעה בעזרת קיט

kapa mix , 200פריימרים בריכוז סופי שלnM 7.2-ול פריימר עבור כμl של מים נקיים מ-RNAse עבור .

תכנית ההרצה נבנתה .cDNAו מים נוספים במקום שמש( NTC, no template control) שלילית ביקורת

טמפרטורת בחינת( וכללה 3בהתאם להוראות היצרנים של תערובת ההרצה ומכשיר ההרצה )טבלה

-CFX Connect™ (Bio מכשירבוצעה בעזרת הצה ההר. 65-95°Cדיסוציאציה של התוצרים בטווח של ה

Rad) והאנליזה בוצעה בתוכנהCFX Manager 3.0 (Bio-Rad).

microRNAהפקת

, כמו שאר ההפקות במחקר זה, נעשתה כאשר התאים היו בצפיפות גבוהה מפני שבמצב זה miRNA תהפק

, וההפקה נעשתה בעזרת הקיט PBS. צלחות התרבית נשטפו פעמיים עם miRNAמתבצע שיפעול של יצירת

mirVana™

נמדד כמפורט לעיל. RNA-לפי הוראות היצרן. ריכוז ה

29

.RT-PCR -ב ששימשו antisense primers ושל sense primers של רצפים :1 טבלה

Reference cDNA per reaction (ngr)

Tm (°C) Primers pairs mRNA

- 1.25 60 Sense: 5'-ACTGCCCATCCACTGAGACAT-3' TGFβ-R2

var1 60 Antisense: 5'-TGCACTTTGGAGAAGCAGCAT-3'

[23] 1.25 66.7 Sense: 5'-CCTGCTTCAGGCGTCTGTAGA-3'

N-cadherin 67.1 Antisense: 5'-CTGCAGGCTCACTGCTCTCAT-3'

[23] 1.25 66.1 Sense: 5'-CCATTTCCCTTCCAGCAAACT-3'

H2AFX 65.2 Antisense: 5'-CTCCCCAATGCCTAAGGTTCT-3'

[23] 1.25 66.2 Sense: 5'-AGATGCTTGCAAACCGTGTTC-3'

Netrin-4 66.2 Antisense: 5'-TCTCCGGTGATAGGGTCACAG-3'

[8] 1.25 65.1 Sense: 5'-CCAACTACTTCCTTAAGATCATCCAACTA-3'

RPLP0 67.1 Antisense: 5'-ACATGCGGATCTGCTGCA -3'

[28] 12.5 70.1 Sense: 5'-GCTCTAGAGTGATTCTGGAGTTCTTTGAAATGT-3'

FZD7 73 Antisense: 5'-TGGAATTCGTGATCTGTACATGTGATAAAGTGG-3'

[8] 1.25 65.9 Sense: 5'-CGGCATTCTACAGGCCAAA-3'

ERα 67.3 Antisense: 5'-GCGAGTCTCCTTGGCAGATTC-3'

[23] 12.5 65.8 Sense: 5'-CACCGACTTTAAGTTTGCCATGT-3'

Cyclin-D2 66.2 Antisense: 5'-ACCGCCTCAATCAATCTGCTCCT-3'

[8] 1.25 66.1 Sense: 5'-GCCATCGCTTACACCATCCT-3'

E-cadherin 66.2 Antisense: 5'-GGCACCTGACCCTTGTACGT-3'

- 1.25 67.1 Sense: 5'-TCGAAATCTTGCCCTTTG-3'

β-catenin 67.2 Antisense: 5'-GACCCCCTCCACAAATTG-3'

.mRNAשל qRT-PCRתכנית ההרצה עבור :2טבלה

Step Temperature (°C) Duration cycles

Enzyme

activation 95 3 min Hold

Denaturation 95 3 sec

40 Annealing/

extension 60 30 sec

Inactivation 63 10 sec

30

RNA)icroPCR (m-Quantitive RT

י ולפ miScript RT kitבאמצעות מכל דוגמא. הריאקציה נעשתה 1μgור ריאקצית שיעתוק הפוך נלקח עב

. הוראות היצרן

miR-145-ו miR-23bפריימרים עבור . qPCRשמשו בריאקצית cDNAשל ng 0.4-1כמות של

miScript SYBERנעשתה באמצעות הקיט הריאקציהנרכשו. miScript primer assayמהסדרה® Green

PCR kit שלילית ביקורת עבור. לפי הוראות היצרן (NTC, no template control) מים נקיים מ שמשו-

RNAse . ( 2תכנית ההרצה נבנתה בהתאם להוראות היצרנים של תערובת ההרצה ומכשיר ההרצה )טבלה

וכללה בחינת טמפרטורת הדיסוציאציה

.65-95°Cשל התוצרים בטווח של

CFX ההרצה בוצעה בעזרת המכשיר

Connect™ (Bio-Rad) והאנליזה

CFX Manager 3.0בוצעה בתוכנה

(Bio-Rad).

Western Blotאנליזת

ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים -שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של רמת חלבון מסוים במיצוי מתאים על

גודלו עד לצפיפות מלאה בצלחות תרבית. התאים נשטפו עם הרחם ריריתתאים משורות התאים של לחלבון.

,RIPA (1% nonidet-40, 20mM Tris pH 7.5של בופר 1mlועברו פירוק עם PBSתמיסת

0.1% SDS, 0.5mM EDTA, 137mM sodium chloride, 10% glycerol,

1mM sodium orthovanadate 5 -וmM Protease Inhibitor Complex.) דקות 21 במשךלאחר הדגרה

Bradfordבקרח וסירכוז, הופרד מיצוי החלבון משאריות התאים. קביעת ריכוז החלבון נעשתה באמצעות

assay 2.5 כאשרμl 1 עם עורבבו דגימה מכלml ריאגנט של Bradford מסחרי שנמהל על פי הוראות היצרן .

.microRNAשל qRT-PCR: תכנית ההרצה עבור 3טבלה

Step Temperature (°C) Duration cycles

Enzyme

activation 95 15 min Hold

Denaturation 94 15 sec

40 Annealing 55 30 sec

Extension 70 30 sec

31

עקומתקביעת החלבון נעשתה בעזרת .nm 595 של גל באורך ספקטרופוטומטר במכשיר נמדדה הצבע עוצמת

. BSA שהוכנה עם החלבון כיול

Laemmliבופרב β-mercaptoethanol 3%) הטענה רבופ עם ועורבבו 25-40μg נלקחו התאים מתמציות

sample buffer .) 95°דקות בטמפ' של 3הדוגמאות הורתחו למשךC אלקטרופורזה בשיטת. ההרצה נעשתה

את לזהות מנת-לע Prestained Protein Ladder הסמן הורץ במקביל. אקרילאמיד SDS-PAGE 01%בג'ל

Immobilon לממברנת בוניםהחל הועברו, ההרצה בתום .התוצר גודל®-P באמצעות electrobloting ,ולאחר

שהכילה blocking solution-ב שעה למשך הדגרה ידי על הבממברנ ספציפיים לא קישור אתרי נחסמו מכן

הדגרה עם נוגדן . T-BST (10mM Tris PH=8, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)-ב רזה חלב 3%

מידע אודות הנוגדנים השונים בהם נעשה שימוש במחקר ואופן השימוש למשך לילה. 4°C-ראשוני נעשתה ב

הודגרו . בשלב הבא הממברנותT-BST-ב פעמים 3 נשטפו הממברנותמכן אחר(. ל4מפורטים בטבלה )טבלה

ומצומד בהתאמה לנוגדן הראשוניניוני ש נוגדן המכיל blocking solution-ב החדר בטמפרטורת שעה למשך

enhanced (ECL)ת הממברנו עברו, T-BST-ב נוספות שטיפות 2 לאחר .peroxidase-ל

chemiluminescence בעזרת הקיטEZ-ECLלמחשב נסרקו סרטי הצילום. היצרן הוראות פי, ל Epson

ואופן השימוש בהם. : מידע אודות הנוגדנים4טבלה

Antibody Isotype Dilution MW (kDa) Manufacture Cat. number

αERα mouse 1:200 66 Santa Cruz (F-10): sc-8002

αE-cadherin mouse 1:1000 135 Enzo ALX-804-201

αβ-catenin rabbit 1:1000 92 Cell Signaling 9587

αCyclin-D2 rabbit 1:1000 34 Santa Cruz (M-20): sc-593

αC-myc rabbit 1:1000 57-65 Cell Signaling 5605

αN-cadherin mouse 1:1000 130 Invitrogen 33-3900

αGAPDH rabbit 1:1000 34 Cell Signaling 2118

Αα-tubulin 1:10000 50 Sigma Aldrich

32

Perfection 3200 Photo)) התוכנה באמצעות נעשתה שהתקבלו קריאותה תעוצממדידת וImageJ 1.46r

(NIH) .ערך שלנורמלו ל התוצאותGAPDH בכל ממברנה ומבוטאות ככפולות הערך של דוגמת הביקורת

בכל ממברנה.

יציבה טרנספקציה

המקודדים לחלבון או שאינם מקודדים ומאפשרת mRNAשמשת ליצירת ביטוי ביתר של מקטעי שיטה זו מ

בחינה של תפקידם בתאים.

miR-145 precursor-ו miR-23b precursorרקומביננטי של DNAנרכשו שני פלסמידים המכילים מקטעי

(™miRNAselect .ומקטעי עמידות עבור אמפיצילין ופורומיצין ) הפלסמידmiRNASelect™ pEGP-miR

Null Control Vector .המוצרים הגיעו כתמיסת שימש כביקורתglycerol stock של חיידקיE. coli אליהם

המכיל אמפיצילין LBו במבחנות המיועדות לכך עם מדיום הפלסמידים עברו טרנספורמציה. החיידקים גודל

(100μgr/ml) 37°בטמפ' שלC 200במהירות וטלטול RPM שעות. הפקה של הפלסמידים 06-למשך כ

ספקטרופוטומטרוהריכוז נמדד בעזרת ™plasmid miniprep kit GeneJETנעשתה בעזרת

NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

ידי ד"ר חנה אשש והופק כמתואר מקודם. -במעבדתנו על הוכן αERלאסטרוגן קולטןהפלסמיד עבור ה

שעות מזריעת 34-46באריות. לאחר 24נזרעו בפלטות של ריריתתאים של שלוש שורות תאי ה 211,111-כ

אגנט הטרנספקציה רישל 1.8μlשל הפלסמיד עם 300ngהדגרה של התאים מדיום הגידול הוחלף.

Lipofectamine™

opti-MEMשל מדיום 100μl-נעשתה ב 2000 ®

דקות. לאחר מכן תכולה זו 31למשך

-של פלסמיד ו 1.5μgr-נעשה שימוש ב ERαהועברה אל התאים שיועדו לטרנספקציה. עבור הטרנספקציה של

3μl שלLipofectamine™

2000.

נעשה miR-145-ו miR-23b הטרנספקציה עםם סלקציה. עבור שעות מדיום התאים הוחלף למדיו 34לאחר

ובריכוז HEC-1A-ו RL-95בתאי 0.8μgr/mlשל בריכוז( puromycin)באנטיביוטיקה פורומיצין שימוש

גודלו במדיום המכיל HEC-1Aתאי ERα. עבור הטרנספקציה עם AN3-CAבתאי 0.5μgr/mlשל

33

קציה כפולה גודלו פבהם נעשתה טרנס HEC-1Aתאי .10μgr/mlשל בריכוז (blasticidin) בלסטיצידין

במדיום המכיל את שתי סוגי האנטיביוטיקות.

miR-145השתקה של

יופיעו במגמה הפוכה miR-145מנת לבחון האם ההשפעות בהן צפינו בביטוי ביתר של -שיטה זו בוצעה על

ביטויו הטבעי בשורות התאים של רירית הרחם.יפגע כאשר

miRCURY LNAבשם miR-145רצף אוליגונוקלאוטידים המשלים לרצף של נרכש™

microRNA

Power Inhibitor .ידי המודיפיקציות -מוצר זה נבחר הודות ליציבות המוגברת שלו המושגת עלlocked

nucleic acid ו- phosphorothioate backboneתאים של 300,000-. עבור ביצוע מבחן האדהזיה נזרעו כ

כך miR-145-inhibitorשעות התבצעה הטרנספקציה עם 34באריות. לאחר 34רות השונות בפלטה של השו

)ריכוז המהווה ריכוז גבוה יחסית ומספק לפי הוראות היצרן. לא 50nMשהריכוז הסופי בבאריות התאים יהיה

-miR. הדגרה של ם(נעשה כיול של ריכוז זה בשל יוקר החומר, כמותו המועטה והדרישה הרבה לו בניסויי

145-inhibitor 1עםμL שלLipofectamine™

opti-MEMשל מדיום 100μl-נעשתה ב 2000 ®

לפי

שעות הוחלף המדיום של התאים למדיום 34הוראות היצרן. לאחר מכן תמיסה זו הועברה אל הבאריות. בתום

.ואר מקודםכמת שעות נוספות נעשה מבחן האדהזיה 34. ולאחר FCS 1.5%גידול המכיל

השונות. הפקה הרחם ריריתתאים של שורות תאי 311,111-עו כ, נזרתמולקולריה רמהעבור בדיקת ההשפעה ב

של תמיסת 250μl, והמיצוי של החלבון נעשה עם Tri-reagentשל הריאגנט 0.5mlנעשתה עם mRNAשל

RIPA את השפעתחון מנת לב-, עלקביםעו )המתוארת מקודם(. שתי ההפקות נעשו מדי יום במשך שלושה ימים

פני הזמן וקביעת העיתוי הנכון לביצוע מבחן האדהזיה.-על miR-145-inhibitor קציה עםפהטרנס

מרחם של עכברות microRNAהפקה של

estrous-ברחם העכברה במחזור ה miR-145-ו miR-23bשיטה זו מאפשרת בחינה של תבנית הביטוי של

50μlהספר לרוקחות. שטיפה ואגינלית עם -ע עכברות גודלו בבית החיות של ביתשהוא בן ארבעה ימים. ארב

34

תאים בשטיפה וקביעה של יום גבי זכוכית נושאת. בחינה של אוכלוסיית ה-ה עלנחנעשתה והו PBSשל תמיסת

DETERMINATION OF THE ESTROUS המתואר במאמר פי-העכברה נעשו עלר בו נמצאת המחזו

CYCLE PHASES OF RATS: SOME HELPFUL CONSIDERATIONS (44) הקרבה של .

עד 80°C--ם הופרד ונשמר ב, הרחestrous-ייצוג עבור כל יום מימי מחזור ה באופן שהניבהעכברות נעשתה

miRNeasy הקיט נעשתה בעזרת microRNAלהפקה. ההפקה של ®

מדידת ריכוז לפי הוראות היצרן.

התבצעו כמתואר מקודם. qRT-PCRריאקצית השיעתוק ההפוך וכן ההרצה של , RNA-ה

35

תוצאות

איפיון שלוש שורות התאים של רירית הרחם

-ו RL-95 ,AN3-CA -רירית הרחםאפיתל ם של לוש שורות תאישנבחרו מודל להשרשת העובר עבור

HEC-1A . ואיפיון רמות ןשל תכונת הרצפטיביות שלה הכוללת איפיון ןההתחלתי נדרשה השוואה ביניהבשלב

כולת תאי הרירית לאפשר היצמדותתכונת הרצפטיביות כוללת את י. miR-145של ו miR-23b של ביטויה

אליהם ויכולת לאפשר בהמשך חדירה של ספירואידים אלו. JARספירואידים של תאי

השיעור הגבוה ביותר של היצמדות הינם תאי הרירית בעלי RL-95מבחן אדהזיה שנעשה בתאים הראה כי תאי

בעלי שיעור היצמדות מופחת HEC-1Aכביקורת עבור הניסוי. תאי תאים אלו לשמש הספירואידים ולכן נבחרו

כלל לא נצמדים ספירואידים כאשר ההדגרה AN3-CA. לתאי RL-95ר שנצפה בתאי מהשיעו 41%העומד על

שעות. 3לאחר הדגרה שאורכה רק , ונמצא כי שיעור היצמדות סביר מתרחש (A6)איור דקות 43נמשכת

סנטית ממברנלית ונעשה כאשר תאי הרירית ותאי הספירואידים נצבעו בצביעה פלור in-vitroמבחן חדירה

06-כה כשנמש JARשל תאי רירית הרחם עם ספירואידים של תאי הדגרהשונים. המבחן תועד לאורך בצבעים

חיקת תאי הרירית דתהליכים של התפשטות הספירואידים ושל RL-95בתאי שעות. ניתן לראות בבירור

endometrial"גדול משטח הספירואיד שאין גדלים בו תאי הרירית והוא מכונה המפניהם המניבה שטח

clearance" בתאי יותר מצומצם בהיקף מתרחש. לעומת זאת, תהליך השרשה מעין זהAN3-CA וכמעט ואינו ,

פני תאי הרירית השונים נמדד -כימות של שיעור גדילת הספירואיד על .(6B)איור HEC-1Aמתרחש בתאי

(.6Cוהושווה )איור

-ו AN3-CAבתאי גבוה יותר miR-23b יביטובתאים הראתה כי miR-145-ו miR-23bבחינה של רמות

HEC-1A ביחס לביטוי בתאיRL-95 ( איור , בהתאמה0.32-ו 0.36שנבחר לשמש ביקורת ,D6.) הרמה של

miR-145 בתאיAN3-CA מזו שבתאי 1.32עומדת עלRL-95 והרמה בתאיHEC-1A מזו 0.32עומדת על

.)E6)איור RL-95שבתאי

36

Monolayer Spheroids Nomarski Merge

RL-95

t=0

t=8h

t=16h

AN3-CA

t=0

t=8h

t=16h

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

RL-95 AN3-CA HEC-1A

Re

lati

va

ad

he

sio

n r

ate

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

RL-95 AN3-CA HEC-1A HEC-1A-ERα

Rela

tive

miR

-23

b E

xp

ressio

n

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


Rela

tive

miR

-14

5 E

xp

ressio

n

(A) (B)

(C)

.HEC-1A-ERαוכן של התאים HEC-1A-ו RL-95 ,AN3-CA -הרחם רירית: איפיון של שלוש שורות התאים של אפיתל 6איור

(A )עם ספירואידים של תאי הדגרהדקות של 43וש שורות התאים כפי שנמדד במבחן האדהזיה לאחר שיעור האדהזיה היחסי בין שלJAR .RL-95 הינם

של השרשת in-vitroתיעוד של שלב החדירה במודל (B)ונבחרו לשמש כביקורת. מבין שורות התאים בניסוי התאים בעלי יכולת האדהזיה הגבוהה ביותר

endometrial"תהליך התפשטות העובר ויצירת RL-95נצבעו בצביעה פלורוסנטית ממברנלית בצבעים שונים. בתאי JARהעובר. תאי הרירית ותאי

clearance הינם המשמעותיים ביותר. תהליכים אלו נראים בהיקף מצומצם בתאי "AN3-CA וכמעט ואינם נראים בתאיHEC-1A התמונות נלקחו מתוך .

התפשטות RL-95שעות של הסרטים. ניתן לראות כי בתאי 03שטח הספירואידים נמדד מדי שעה במשך (C)ת. שעו 06סרט המתעד את התהליך במשך

. אין שינוי משמעותי HEC-1A-ERαבשלוש שורות התאים ובתאי miR-23bרמת ביטוי יחסית של (D)הספירואיד גדולה יותר מאשר בתאים האחרים.

ובתאי התאים שורות בשלוש miR-145 של יחסית ביטוי רמת HEC-1A-ERα .(E)בתאי ביטוי גבוהה מצויה רמתבביטוי זה בין שלוש שורות התאים אך

HEC-1A-ERα . רמת הביטוי הגבוהה ביותר מצויה בתאיHEC-1A והרמה הנמוכה ביותר מצויה בתאיAN3-CA.

HEC-1A

t=0

t=8h

t=16h

(D)

(E)

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Are

a (μ

m²)

x 1

00

00

TIME (hr)

RL-95 AN3-CA HEC-1A

37

αERלאסטרוגן קולטןעם ביטוי של ה 1A-HECפיון של שורת התאים אי

שה על מנת לחקור אחר השפעת שאינם מבטאים אותו נע HEC-1Aבתאי αERלאסטרוגן קולטןביטוי של ה

. בהמשך נעשתה בתאים אלו טרנספקציה HEC-1A-ERα-תאים אלו מצויינים כבתאים אלו. ביטוי הקולטן

אלו בתאים. miRNAבכדי להעריך את השפעת miR-145 או miR-23bנוספת לביטוי

עולה HEC-1A-ERαנמצא כי שיעור ההיצמדות של ספירואידים בתאי קודמת שנעשתה במעבדתנובעבודה

. 0-שנקבע כ RL-95בתאי שיעור ההיצמדותמ 1.6ערך של עומד על ( ו1.4) HEC-1Aמזה שנמצא בתאי

ליה בהתפשטות הספירואידים ודחיקת תאי הרירית ביחס לאלה , חלה עin-vitroבנוסף, בניסוי חדירה

. HEC-1A (6)המתקיימות בתאי

בכל שלוש ביחס לביטוי miR-23bמעלה את הביטוי של ERα, הביטוי של microRNAמבחינת ביטוי של

מעותית מש. לעומת זאת, חלה ירידה (D6)איור RL-95מהערך שנמצא בתאי 3.43לערך של פי שורות התאים

לערך , RL-95בתאי ביחס לערך HEC-1Aכפי שנמצא בתאי 0.32מערך של בתאים, miR-145בביטוי של

(. E6)איור 1.76של

miR-145-ו 23b-miRביטוי ביתר של בחינת השפעות

בתאי האפיתל של רירית הרחם התבצעה טרנספקציה יציבה miR-145-ו miR-23bלצורך בחינת תפקידם של

. HEC-1A-ERαאלו בשלוש שורות התאים של תאי האפיתל של רירית הרחם וכן בתאי miRNAשל

ביחס 6עד פי 3בתאים השונים בטווח של פי miR-23bהטרנספקציה הצליחה להביא לעליה בביטוי של

שיעור miR-145(. עבור 7A( )איור null) בקורתפלסמיד הוג תאים בו התבצעה טרנספקציה עם לאותו ס

. (7B)איור 63לבין פי 31יה בביטוי אף מגיע לערכים גבוהים יותר ונע בין פי העל

בחינה של הפונקציונאליות של הטרנספקציה בתאים. לצורך כך נבחנו ההשפעות הבאות: השפעה כעת, נדרשה

הרחם ריריתאל תאי JARשל ספירואידים של תאי היצמדותעל פרוליפרציה של התאים, השפעה על ה

.החלבון ברמת והן mRNA ברמת הןה על חדירתם, וכן השפעה ברמה המולקולארית על ביטוי גנים והשפע

הקשורים לתהליך ההשרשה ו miRNA-הגנים שנבדקו הינם גני מטרה פוטנציאליים או מוכחים של שני ה

38

ם עליהם משפיעי miRNAהחיוניים לתהליך ההיצמדות ושיתכן כי אותם β-catenin-ו E-cadherinהגנים ו

בעקיפין.

פרוליפרציהרמת

והשוותה בין MTT-נעשתה באמצעות מבחן השעברו טרנספקציה בדיקת רמת הפרוליפרציה של התאים

ביטוי כי (. נמצאnull) בקורתלבין טרנספקציה עם פלסמיד miRNAטרנספקציה עם פלסמיד המכיל מקטע

בכל שורות התאים באופן שנמצא משמעותי פרציההפרולי מוריד את רמת miR-145 שלו miR-23bביתר של

RL-95 ,HEC-1Aבתאי miR-145עיכוב הפרוליפרציה שנוצר כתוצאה מביטוי ביתר (. A6)איור סטטיסטי

-HECבתאים אלו. בתאי miR-23bגדול יותר מהעיכוב שנוצר כתוצאה מביטוי ביתר של הינו AN3-CA-ו

1A ובתאיAN3-CA המבטאים ביתר אתmiR-145 31%-רמת הפרוליפרציה של התאים קטנה לערך של כ .

ללא ,שעברו טרנספקציהבתאים 61%-רמת הפרוליפרציה ירדה לכ RL-95ובתאי HEC-1A-ERαבתאי

הבדל משמעותי בין הטרנספקציות השונות.

.בשורות התאים של רירית הרחם miR-145-ו miR-23b: שיעור ההצלחה של ביצוע טקנספקציה יציבה של 7איור

(A) העליה בביטויmiR-23b ביחס לתאי הביקורת. 6לבין פי 2נעה בין פי

(B) העליה בביטויmiR-145 ביחס לתאי הביקורת. 61לפי 31נעה בטווח של פי

0123456789

1011


Re

lative

miR

-23

b le

ve

ls

null miR-23b

0

20

40

60

80

100

120


Rela

tive

miR

-14

5 leve

ls

null miR-145

(A) (B)

39

היצמדותשיעור

ל מידת ההידבקות של ע התאים נספקציות השונות בקרבשל הטר המצא שוני בהשפע היצמדותמבחן ה

התוצאות מיוחסות בכל שורת תאים אל תאים של אותה שורה בהם בוטא . (B6)איור JARספירואידים של תאי

של תאים אלו. היצמדותלא השפיע על יכולת ה RL-95אי בת miR-23bביטוי ביתר של פלסמיד הביקורת.

, בהתאמה(, והוריד 0.42-ו 0.73) HEC-1A-ERαובתאי HEC-1Aלעומת זאת, הוא העלה יכולת זו בתאי

-RLבתאי היצמדותהוריד את יכולת ה miR-145ביטוי ביתר של .1.26לערך של AN3-CAיכולת זו בתאי

ביכולת ה, וכן חלה ירידה מועט), בהתאמה1.43-ו 1.26(במידה רבה ומשמעותית AN3-CAובתאי 95

miR-145-וית. באופן הפוך, ביטוי ביתר של אך היא לא נמצאה משמעות HEC-1A-ERαבתאי היצמדותה

. )0.60ספירואידים )עליה משמעותית בהיצמדות הלהביא HEC-1Aבתאי

תהליך החדירהבחינת

חיקת דה של הספירואיד והערכ התפשטותכוללת הערכה של שיעור in-vitroבחינה של תהליך החדירה במודל

ממברנליתהתבצע הניסוי עם צביעה פלורוסנטית HEC-1A-ERαובתאי AN3-CA. בתאי מפניו ריריתתאי ה

.הטרנספקציות בעקבות המתרחש in-vitro ההשרשה תהליך עיכוב את להבליט מנת-על התאים שורות של

על שיעור ההיצמדות אל תאי הרירית ועל פרוליפציה של התאים. miR-145 -ו miR-23bהשפעת ביטוי ביתר של : 8איור

(A) של ביתר בות ביטויהפרוליפרציה היחסית ירדה בעק miR-23b ו- miR-145 ( בכל שורות התאים באופן משמעותי סטטיסטיתP<0.05 .)

.miR-145הירידה המשמעותית יותר חלה בתאים המבטאים ביתר את HEC-1A-ו RL-95 ,AN3-CAבתאים

(B) תאי של ספירואידים של ההיצמדות שיעור JAR בתאי ירד הרירית תאי אל RL-95 ביתר המבטאים miR-145 ובתאי AN3-CA

-HEC-1A ובתאי miRNA-סוגי ה שני אתביתר המבטאים HEC-1A בתאי עלה זה שיעור. miRNA-סוגי ה שני את ביתר המבטאים

ERα את ביתר המבטאים miR-23b.

0

0.5

1

1.5

2

2.5


Re

lati

ve

ad

hes

ion

ra

te

null miR-23b miR-145

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2


Rela

tive p

roli

fera

tio

nn


(A) (B)

40

התפשטות שיעור על המועט במידה משפיע RL-95 בתאי miR-145שלו miR-23b של ביתר יטויב

הערך של במדד עליה חלה יחד עם זאת,. שעות 46 לאחר והן שעות 34 לאחר הן התאים פני-על הספירואיד

"endometrial clearance" איור המשותפת התרבית מביצוע שעות 34 לאחר כבר(A6) .שני בין ההפרש

(.P<0.05סטטיסטית ) משמעותית בצורהגם הוא הלע, הספירואיד שסביב הטבעת שטח שהינו, אלו ערכים

שעות 34 לאחר הן הספירואיד התפשטות על השפיע ולא כמעט AN3-CA בתאי miR-23b של ביתר ביטוי

לאחר סטטיסטית משמעותית שנמצאה "endometrial clearance" בערך לירידה גרם אך, שעות 46 לאחר והן

ביטוי. (B6)איור (P<0.05) הזמנים בשני הטבעתי בשטחחלה ירידה משמעותית סטטיסטית . בנוסףשעות 46

את ומעכב שעות 46 לאחר הספירואיד התפשטות שיעורב משמעותית מביא לירידה miR-145 של ביתר

. "endometrial clearance"-ב כלל להבחין ניתן שלא כך הרירית תאי חיקתד תהליך

הספירואיד התפשטות שיעורב משמעותי לשינוי הביא לא HEC-1A בתאי miRNA-ה שני של ביתר ביטוי

תרבית של שעות 46 לאחר אלו בתאים לראותו ניתן עיתיםשל" )endometrial clearance" ובגודל השטח

.)C6)איור (משותפת

שתי של השפעות לראות ניתן, ERα לאסטרוגן קולטןה את מבטאים אלו תאים כאשר ,זאת לעומת

בתאים ERα של ביטוי, בהקדמה שהזכרנו כפי. (A6)איור משותפת תרבית של שעות 46 לאחר הטרנספקציות

JAR תאי של ספירואיד של התפשטות לאפשר התאים ביכולת גם המתבטאת ברצפטיביות לעליה גורם אלו

. כאן המובאות בתמונות HEC-1A תאי לבין HEC-1A-ERα בין מההבדלים להתרשם ניתן. מפניו ולהידחק

ירואידהספ בהתפשטות לירידה מביא HEC-1A-ERα בתאי miR-145 של והן miR-23b של הן ביתר ביטוי

endometrial“ ות בגודל השטח שליריד גם המקרים בשני חלו אך, סטטיסטית מובהקת נמצאה שלא

clearance "של ביתר ביטוי של במקרה סטטיסטית משמעותיות שנמצאו הטבעתי ובשטח miR-145

(P<0.05).

41

0

5

10

15

20

null miR-23b miR-145 null miR-23b miR-145

24hr 48 hrA

rea

(pix

el)

x 1

00

00

0

spheroid

clearance

ring area

02468

101214


24hr 48 hr

Are

a (μ

m²)

x 1

00

00

spheroid

clearance

ring area

02468

10


24hr 48 hr

Are

a (p

ixe

l)

x 1

00

00

0

spheroid

clearance

ring area

-miR-ו miR-23b: תיעוד שיעור החדירה בעקבות ביטוי ביתר של 9איור

שעות של 48-ו 24של השרשת העובר בזמנים לאחר in-vitroבמודל 145

.JARהדגרה עם ספירואידים של תאי

(A) תאיRL-95 השפעה מזערית על גדילת הספירואיד אך חלה הגדלה :

."endometrial clearance"בערך של

(B) תאיAN3-CA חל עיכוב של תהליך התפשטות הספירואיד ושל :

miR-23b. עיכוב זה מתקיים בביטוי ביתר של ריריתחיקת תאי הד

.miR-145ובהיקף נרחב יותר בביטוי ביתר של

(C) תאיHEC-1A.לא חל שינוי ניכר במדדי מבחן החדירה :

(D) תאיHEC-1A-ERα חל שינוי בביטוי ביתר של :miR-145

. שינוי זה ניכר "endometrial clearance" ה שליצירהמפחית את ה

שעות אינו מובא כאן( 34שעות )תיעוד לאחר 46לאחר

(A)

(B)

(C)

(D)

RL-95

AN3-CA

HEC-1A

HEC-1A-ERα

42

miR-514-ו 23b-miRביטוי ביתר של בהשפעת ycM-cביטוי של

ולכן עניין miR-23bעם םונמצא ביחסי גומלין כלשה miR-145מהווה גן מטרה מוכח של c-mycהחלבון

השפעות אלו בשורות התאים של רירית הרחם. miRNAאותנו אם חלה השפעה על ביטויו בטרנספקציות של

c-mycוי החלבון ירידה משמעותית בביט. )A01נמצאו בשורות התאים )איור c-mycשונות ברמות החלבון

, 1.30-ו 1.06)הביקורת בתאי הביטוי עומתל miR-145-ו miR-23bהמבטאים את AN3-CAחלה בתאי

עד לערך miR-23b את המבטאים RL-95בהתאמה(. לעומת זאת, עליה משמעותית בביטוי החלבון חלה בתאי

-HEC. בתאי 2.34רך של פי עד לע miR-145ובתאים המבטאים את RL-95-nullמהערך בתאי 2.34של פי

1A את המבטאים miR-23b ו-miR-145 חלה עליה בביטויc-myc ו 0.33) הביקורת בתאי הביטוי לעומת-

כאשר נעשה ביטוי ביתר של c-mycלא חל שינוי משמעותי בביטוי HEC-1A-ERα. בתאי (בהתאמה, 0.33

miR-23b ו-miR-145.

23b-miR שלגני מטרה ביטוי

-TGF -ו FZD7הגנים בתאים ברמה המולקולרית נבחרו miR-23bנת ההשפעה של ביטוי ביתר של עבור בחי

β-R2 מהווים גני מטרה מוכחים של . גנים אלוmiR-23b ומשתתפים במסלולים הידועים בחשיבותם לתהליך

miR-23bטרנספקציה עבור . TGF-βמשתתף במסלול העברת האותות TGF-β-R2 קולטןההשרשת העובר.

זה גן ולעליה בביטוי 1.33לערך של RL-95בתאי TGF-β-R2 קולטןשל ה mRNAביטוי הביאה לירידה ב

הינוFZD7 (Frizzled-7 ) .(B01)איור , בהתאמה(0.06-ו 3.61) HEC-1A-ERαובתאי HEC-1Aבתאי

ביתר יביטו בעקבות ירד FZD7 של mRNA ביטוי. Wnt האותות העברת במסלול המשתתף ממברנלי קולטן

(. C01 איור( )בהתאמה, 1.36-ו 0.28, 0.71) HEC-1A-ERα-ו RL-95, AN3-CA בתאי miR-23b של

.0.74 של לערך עלה זה ביטוי HEC-1A בתאי

43

miR-145 של מטרה גני ביטוי

נעשתה באמצעות בדיקת רמת המולקולרית ברמה בתאים miR-145 של ביתר ביטוי של ההשפעה חינתב

הידועים במסלולים משתתפיםו miR-145 של פוטנציאליים מטרה גני ארבעה גנים המהווים של הביטוי

0

1

2

3

4

RL-95 HEC-1A HEC-1A-ERα

Re

lati

ve

TG

Fβ

-R2

exp

ressio

n

null miR-23b

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3


Re

lati

ve

FZ

D7 e

xp

ress

ion

null miR-23b

(A)

(B) (C)

של mRNAעל רמות miR-23bביתר של והשפעת ביטוי c-mycעל ביטוי החלבון miR-145-ו miR-23b: השפעת ביטוי ביתר של 14איור

טרה מוכחים.גני מ

(A) השפעה דומה בין ביטוי ביתר שלmiR-23b לביטוי ביתר שלmiR-145 על ביטוי שלc-myc בתאי .AN3-CA חלה ירידה משמעותית בביטוי

לא חל שינוי ניכר בביטוי החלבון. HEC-1A-ERαחלה עליה משמעותית בביטוי החלבון ובתאי HEC-1A-ו RL-95החלבון, בתאי

(B) ביטוי ביתר שלmiR-23b בתאי האפיתל של רירית הרחם מביא לירידה ברמותmRNA שלFZD7 בתאיRL-95 ולעליה ברמות בקרב תאי

HEC-1A בתאי .HEC-1A-ERα כמעט ולא חל שינוי בביטויFZD7.

(C) ביטוי ביתר שלmiR-23b ברמות לירידה מביא mRNA של TGF-β-R2 בתאי RL-95 ,AN3-CA ו-HEC-1A-ERα ומביא לעליה ברמות

.HEC-1Aבתאי

c-MycE-

GAPDH

HEC-1ARL-95 HEC-ERαAN3 CA

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2


Rela

tive p

roli

fera

tio

nn


0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Re

lati

ve e

xpre

ssio

n

(fo

ld o

f co

ntr

ol)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Rel

ativ

e ex

pres

sion

(f

old

of c

ontr

ol)

44

רמת ביטוי הראו במחקר קודם H2AFX-ו N-cadherin ,netrin-4. הגנים העובר השרשת לתהליך בחשיבותם

. (32)בנשים פוריות הביטוי ביחס לרמת RIFבנשים עם נמוכה

ביחס 1.3לערך של miR-145ירדה בעקבות עליה בביטוי של RL-95בתאי N-cadherinרמת הביטוי של

חלה עליה ברמת HEC-1A-ERαבתאי .)A00)איור 1.76לערך של HEC-1Aובתאי לתאי הביקורת

בנוסף, רמות החלבון נבדקו . AN3-CAגן זה אינו מבוטא בתאי ביחס לתאי הביקורת. 0.73הביטוי לערך של

( )איור null (P<0.05-ביחס לתאי ה 1.22ירדה לערך םהחלבון בתאיביטוי ונמצא כי רמת RL-95 בתאי

E00 עבור תאי .)HEC-1A נמצאה תמונה שונה ברמת החלבון מאשר זו שנראתה ברמת ה-mRNA ורמת ,

מזו שבתאי הביקורת. בתאי 4.43לערך של פי miR-145בעת ביטוי ביתר של משמעותית ון עלתה החלב

HEC-1A-ERα מהערך הנמצא בתאי הביקורת. 0.03רמת החלבון עלתה בצורה לא משמעותית לערך של

miR-145בעקבות ביטוי ביתר של HEC-1A-ו AN3-CAירדה בתאים netrin-4של mRNAביטוי רמת

, 2.03-ו HEC-1A-ERα(2.1 -ו RL-95(. רמת ביטוי זו עלתה בתאים B00, בהתאמה( )איור 1.73-ו 1.0)

בהתאמה(.

miR-145 של ביתר ביטוי בעקבות HEC-1A-ו AN3-CA בתאים ירדה H2AFX של mRNA ביטוי רמת

-ו HEC-1A-ERα (30.2 -ו RL-95 בתאים עלתה זו ביטוי רמת(. C00 איור( )בהתאמה, 0.45-ו 0.83)

(.בהתאמה, 0.30

ביטוי בעקבות HEC-1A-ERα -ו RL-95, AN3-CA בתאים ירדה cyclin-D2 של mRNA ביטוי רמת

פי HEC-1A בתאים עלתה זו ביטוי רמת(. D00 איור( )בהתאמה, 0.19-ו 0.4 ,1.16) miR-145 של ביתר

miR-145המבטאים ביתר RL-95נקבעו בתאי cyclin-D2רמות החלבון של ביחס תאי הביקורת. 3.34

(.F00)איור ביחס לתאי הבקורת 0.16לערך של ניכרת והראו ירידה

ERα-ו cadherin-E ,catenin-βביטוי

בתאי β-catenin -ו E-cadherinעל רמות החלבון של miR-145-ו miR-23bנבחנה השפעת ביטוי ביתר של

-βוכנראה שביטוי E-cadherinטאים אינם מב AN3-CAהרירית המבטאים אותם ברמה מספקת. תאי

catenin בהם אינו מספק על מנת לבדוק את רמת החלבון שלו אך נבדקה רמת הביטוי שלmRNA של הגן.

45

Cyclin D2

α-tubulin

RL-95

null miR-145

0

1

2

RL-95 HEC-1A HEC-1A-ERαN-c

ad

heri

n r

ela

tive e

xp

ressio

n

null miR-145

0

1

2

3

4


Ne

trin

-4 r

ela

tive

ex

pre

ss

ion

null miR-145

0

1

2

RL-95 AN3-CA HEC-1A HEC-1A-ERαH2A

FX

re

lati

ve

exp

ress

ion

null miR-145

0

1

2

3

4

5

6


Cyc

lin

-D2

rela

tive

exp

ress

ion

null miR-145

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

על ביטוי גני מטרה פוטנציאלים שלו. miR-145: השפעת ביטוי ביתר של 11איור

(A-D ) השפעת ביטוי ביתר שלmiR-145 על רמותmRNA :של גני מטרה פוטנציאליםN-cadherin ,netrin-4 ,H2AFX

.miR-145ובה לביטוי ביתר של . יש שוני בין התאים בתגcyclin-D2-ו

(E) השפעת ביטוי ביתר שלmiR-145 על רמות החלבון שלN-cadherin .בתאי רירית הרחם

(F ) השפעת ביטוי ביתר שלmiR-145 על רמות החלבון שלcyclin-D2 בתאיRL-95.

N-cadherin

GAPDH

RL-95

null miR-145 null miR-145 null miR-145

HEC-1A HEC-1A-ERα

0

1

2

3

4

5

6

RL-95 HEC-1A HEC-ER

Re

lative

exp

ressio

n

null miR-145

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Rela

tive e

xp

ressio

n

0

1

2

RL-95 AN3-CA HEC-1A HEC-1A-ERαH2A

FX

re

lati

ve

exp

ress

ion

null miR-145

46

miR-145אך ביטוי ביתר של RL-95בתאי E-cadherinלא השפיע על ביטוי miR-23bביטוי ביתר של

, HEC-1A. בתאי (A03)איור RL-95-null (P<0.05)ביחס לתאי 1.64ה לערך של הביא לירידה בביטוי ז

, 3.3-ו 0.33לערכים E-cadherinהניב עליה משמעותית בביטוי miR-145-ו miR-23bביטוי ביתר של

בביטוי ביתר של 1.70לערך של E-cadherinחלה ירידה משמעותית בביטוי HEC-1A-ERαבהתאמה. בתאי

miR-23b בביטוי ביתר של 1.33לערך וmiR-145.

, 1.70-ו RL-95 (1.64בתאי miR-145-ו miR-23bירדו בעקבות ביטוי ביתר של β-cateninרמות החלבון

(. באופן דומה חלו B03( )איור P<0.05משמעותית סטטיסטית ) miR-145בהתאמה( אך רק הירידה עבור

(A) (B)

(C)

.על ביטוי חלבונים החיוניים להשרשת העובר miR-145-ו miR-23bהשפעת ביטוי ביתר של :12איור

(A) רמת החלבוןE-cadherin באופן שונה בין שורות התאים בתגובה להעלאת הביטוי של הושפעהmiR-23b ו-miR-145.

(B) רמת החלבוןβ-catenin עה רמת החלבון הושפעה באופן שונה בין התאים בעקבות הטרנספקציות כאשר השפעה זו דומה לאופן בו הושפ

E-cadherin .בשורות התאים

(C) ביטויERα יורד באופן משמעותי בעקבות ביטוי ביתר שלmiR-23b ו-miR-145 בתאיםHEC-1A-ERα.

HEC-1ARL-95 HEC-ERα

-E-cadherin

E-GAPDH

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Rela

tive e

xpre

ssio

n

β-catenin

GAPDH

HEC-1ARL-95 HEC-ERα

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Rela

tive e

xpre

ssio

n

ERα

GAPDH

0

0.5

1

1.5

Rela

tive e

xpre

ssio

n

+++-ERα

-+--miR-23b

+---miR-145

47

חלו HEC-1A, בהתאמה(. בתאי 1.73-ו 1.77) HEC-1A-ERαירידות משמעותיות בביטוי החלבון בתאים

, בהתאמה(.3.06-ו 3.24עליות משמעותיות סטטיסטית בביטוי החלבון בעקבות הטרנספקציות )

-ו miR-23bביטוי ביתר של . HEC-1A-ERαנמדדה בתאי ERα החלבון השפעת הטרנספקציות על ביטוי

miR-145 בתאים הביא לירידה רבה בביטויERα (1.16 בהתאמה( )איור 1.00-ו ,C03 הירידות נמצאו .)

בהפקות שונות )לא מובא כאן(. mRNA-(. ירידות אלו הודגמו גם ברמת הP<0.05משמעותיות סטטיסטית )

בתאים miR-145בחינת השפעת השתקת

in-vitro (24)במודל ERαומחקר שמצא כי הוא מבקר את miR-145בעקבות ההשפעות של ביטוי ביתר של

שהוא רצף miR-145-inhibitor. לצורך כך נרכש miR-145המשכנו לחקור אחר השפעות ההשתקה של

רצף בו נעשו וכך מונע ממנו להיקשר אל גני המטרה. הרצף הנרכש הינו miR-145משלים אשר נקשר אל

שעות. 73-מנת לשפר את יציבותו עד ל-מודיפיקציות על

שעות לאחר הטרנספקציה 73-ו 46, 34לאחר HEC-1A-ו RL-95בדקנו רמות של גני מטרה בשורות התאים

קבוצת הביקורת .מירביתואת הזמן בו ההשפעה הינה miR-145-inhibitor-מנת להעריך את השפעת ה-על

זמן. במשך אותו פרק Lipofectamine 2000תאים זהים שטופלו רק בריאגנט הטרנספקציה בניסוי זה הינם

34ביטוי בתאי הביקורת לאחר הביטוי בקבוצת הניסוי ובקבוצת הביקורת בשלוש נקודות הזמן נמדדו ביחס ל

שעות מהטיפול בריאגנט הטרנספקציה.

N-cadherinשל mRNAידה ברמת ליר RL-95הביאה בתאי miR-145-inhibitorטרנספקציה עם

ביקורת, כאשר הירידה המשמעותית ביותר חלה ביום קבוצת הביטוי ברמות הבשלושת זמני הניסוי ביחס ל

. (A02)איור עבור היום השלישי( 1.46-עבור היום שני ו 1.6עבור היום הראשון, 1.6השלישי לניסוי )

שעות מביצוע 34. לאחר miR-145עת השתקת בהשפ N-cadherinחלו תנודות בביטוי HEC-1Aבתאי

. ביום השני חלה עליה (B02)איור לעומת הביקורת 1.37הטרנספקציה חלה ירידה בביטוי הגן לערך של

ביחס לביקורת ביום הראשון. בנוסף, בקבוצת הביקורת בזמן זה חלה ירידה בביטוי 0.34בביטוי הגן לערך של

48

1.66טוי הגן התייצב בשתי הקבוצות ורמתו חזרה לרמת הביטוי בביקורת )ביום השלישי בי .1.7הגן לערך של

עבור קבוצת הניסוי(. 1.66-עבור קבוצת הביקורת ו

בקבוצת הביקורת חלה עליה מועטה RL-95. בתאי cyclin-D2גן מטרה נוסף בו נבדקה השפעת ההשתקה הוא

. בקבוצת הניסוי חלה עליה (C02)איור (עבור היום השלישי 0.36עבור היום השני, 0.32)בביטוי הגן

1.66-עבור היום הראשון ו 1.62) 3.36שעות מביצוע הטרנספקציה לערך של 46משמעותית בביטוי הגן לאחר

(.לישיעבור היום הש

של הגן בקבוצת הביקורת ובקבוצת הניסוי. mRNA-, חלו תנודות ברמת הE-cadherinביטוי הגן מבחינת

(1.66שעות מהטרנספקציה ביחס לקבוצת הביקורת )לערך 34רידה בביטוי הגן לאחר חלה י RL-95בתאי

בביטוי הגן בשתי הקבוצות כאשר העליה בקבוצת הניסוי גדולה שעות חלה עליה 46. לאחר (D02)איור

שעות חלה עליה נוספת בביטוי אצל קבוצת 73, בהתאמה(. לאחר 0.26-ו 3.6מהעליה בקבוצת הביקורת )

.0.23בקבוצת הניסוי לערך E-cadherinוירידה בביטוי )2.33רת )הביקו

בקבוצת הניסוי ביחס E-cadherinשעות מהטרנספקציה חלה ירידה בביטוי 34, לאחר HEC-1Aבתאי

שעות חלו ירידות ביטוי הגן בשתי הקבוצות, כאשר 46. לאחר (E02)איור 1.4לקבוצת הביקורת לערך

73, בהתאמה(. לאחר 1.33-ו 1.20ניסוי גדולה מהירידה שנצפתה בקבוצת הביקורת )הירידה בביטוי בקבוצת ה

ורמת הביטוי בקבוצת הניסוי 0.12שעות מביצוע הטרנספקציה, רמת הביטוי בקבוצת הביקורת עלתה לערך

.1.60עלתה לערך

mRNAביטוי לאור העובדה כי ההשפעה העיקרית על הפעילות התאית באה כתוצאה מביטוי חלבון ולא מ

כחלבון מטרה c-mycבמשך אותם מרווחי הזמן על רמות החלבון של miR-145-inhibitorבדקנו השפעה של

.E-cadherinועל רמות החלבון miR-145מוכח של

שעות 46-ו 34בעיקר לאחר c-mycהביאה לירידה מזערית בביטוי miR-145השתקה של RL-95בתאי

מהביטוי 1.67שעות בקבוצת הניסוי הביטוי היחסי עמד על 34. לאחר (A04)איור מביצוע הטרנספקציה

49

0

0.5

1

1.5

d1 d2 d3Rela

tive e

xpre

ssio

n

HEC-1A-control HEC-1A (-miR-145)

0

1

2

3

d1 d2 d3

Re

lative

expre

ssio

n

RL-95-control RL-95 (-miR-145)

0

1

2

3

4

d1 d2 d3

Rela

tive e

xpre

ssio

n


0

0.5

1

1.5

d1 d2 d3

Rela

tive e

xpre

ssio

n

HEC-1A-control HEC-1A (-miR-145)

0

0.5

1

1.5

d1 d2 d3Rela

tive e

xpre

ssio

n


(C)

(A) (B)

(D) (E)

RL-95בתאי E-cadherinשל גני מטרה פוטנציאליים וביטוי mRNAעל ביטוי miR-145השתקת השפעת :13איור

שעות מביצוע הטרנספקציה. 72-ו 48, 24לאחר HEC-1A-ו

קבוצת הביקורת הינה תאים שנחשפו לריאגנט הטרנספקציה.

(A-B) ביטויN-cadherin בתאים בהשפעת השתקתmiR-145.

(C-D) ביטוי cyclin-D2 בתאי RL-95 השתקת בהשפעת miR-145.

(E) ביטוי E-cadherin השתקת בהשפעת איםבת miR-145.

Control miR-145-inhibitionmiR-145-inhibitionControl

0

0.5

1

1.5

2

day 1 day 2 day 3 day 1 day 2 day 3

Rela

tive e

xpre

ssio

n

0

0.5

1

1.5

2


Rela

tive

expre

ssio

n

E-cadherin

GAPDH

E-cadherin

GAPDH

HEC-1ARL-95(B)

(A)

miR-145-inhibitionControlmiR-145-inhibitionControl

0

0.5

1

1.5


Rela

tive e

xpre

ssio

n

0

0.5

1

1.5


Rela

tive e

xpre

ssio

n

HEC-1A

c-Myc

GAPDH

c-Myc

GAPDH

RL-95

שעות מביצוע הטרנספקציה. 72-ו 48, 24לאחר HEC-1A-ו RL-95על ביטוי חלבונים בתאי miR-145השתקת השפעת :14איור


(A) ביטוי החלבוןc-myc בתאים בהשפעת השתקתmiR-145.

(B) החלבון ביטוי E-cadherin השתקת השפעתם בבתאי miR-145.

50

-ו 1.66) הביקורת ובקבוצת הניסוי בקבוצת ונשמר כמעט c-myc ביטוי שעות 46 לאחר. הביקורת בקבוצת

(.אמהבהת, 1.77-ו 1.63) הקבוצות שתי את אפיינה בביטוי הירידה שעות 73 לאחר(. בהתאמה, 1.67

משמעותית יותר. miR-145-inhibitorבעקבות הטרנספקציה עם c-mycהירידה בביטוי HEC-1Aבתאי

לאחר 1.62-שעות ו 46לאחר 1.67הביטוי בקבוצת הביקורת נשמר יחסית לאורך שלושת הזמנים ועומד על

ת מביצוע הטרנספקציה שעו 46-ו 34ירד בעיקר לאחר c-myc. בקבוצת הניסוי ביטוי (A04)איור שעות 73

.1.6הערך שעות עמד על 73, בהתאמה( ולאחר 1.36-ו 1.33)

, השינויים שחלו בביטוי החלבון miR-145 של בעת השתקה RL-95בתאי E-cadherinמבחינת ביטוי של

שעות 34משווים בין הנתונים עולה כי לאחר בקבוצת הניסוי לוו בשינויים גם בקבוצת הביקורת. כאשר

. לאחר (B04)איור בקבוצת הביקורת 0ביחס לערך 1.64נספקציה חלה ירידה מועטה בביטוי לערך של מהטר

ביחס לערך ביום הראשון, אך בקבוצת הניסוי העליה 0.33שעות הביטוי בקבוצת הביקורת עלה לערך 46

שעות 73אחר גם בזמן זה. ל c-mycהכל חלה ירידה מועטה בביטוי -, כך שבסך0.16שחלה הינה רק לערך

.0.30ובקבוצת הניסוי 0.22הערך בקבוצת הביקורת הינו

E-cadherinלשינויים מזעריים ושוליים בביטוי הביאה miR-145 תהשתקההשפעה של HEC-1Aבתאי

. הערכים בקבוצת הביקורת (B04)איור ובעצם ניתן לראות כי השינויים שחלו בשתי הקבוצות כמעט וזהים

השוואה .0.47-ו 0.60, 1.62. בקבוצת הניסוי הערכים בהתאם היו: 0.36-ו 0.16, 0ן הינם: בשלוש נקודות הזמ

שעות מהטרנספקציה. 46לאחר E-cadherinהכל עליה קטנה בביטוי -בין נתונים אלו מראה סך

התבצע היצמדות.מבחן הin-vitroבמודל השרשת העובר miR-145-inhibitorבשלב הבא בדקנו את השפעת

46עות לאחר ביצוע הטרנספקציה ומבחן החדירה התבצע כך שההדגרה עם הספירואידים נעשתה בין ש 46

היצמדותמעלה את שיעור ה miR-145העלה כי השתקה של היצמדותמבחן ה שעות לאחר הטרנספקציה. 73-ל

ו לא ביחס לקבוצת הביקורת, בהתאמה, אם כי ערכים אל 0.7-ו 0.2פי HEC-1A-ו RL-95בעיקר בתאי

אך גם הוא לא 0.3חלה עליה דומה לערך של פי AN3-CA. בתאי (03)איור נמצאו משמעותיים סטטיסטית

חלה ירידה בשיעור HEC-1A-ERα. בתאי )1.77נמצא משמעותית סטטיסטית ואף בעל שונות גבוהה )

51

(B)

0

0.5

1

1.5

2

2.5


Rela

tive A

dhesio

n

(+lipofec.) (-mir145)

(A)

.של העכברה estrous-פני ארבעת ימי מחזור ה-על miR-145-ו miR-23bי של : איפיון תבנית הביטו16איור

(A) תבנית הביטוי שלmiR-23b במחזור ה-estrous.

(B) של הביטוי תבנית miR-145 במחזור ה-estrous.

וה בערך שונות גבוה , אך גם במקרה זה אין משמעות סטטיסטית לירידה זו וכן היא מלו 1.46לערך היצמדותה

על אופן חדירת הספירואידים את שכבת תאי הרירית לא miR-145(. מבחינת השפעת ההשתקה של 1.26)

)לא מובא כאן(. in-vitroבבחינת מראה החדירה במבחן נמצאה השפעה כלשהיא

של העכברה estrousבמהלך מחזור miR-145-ו 23b-miRאיפיון ביטוי

של אחר יום מייצגת עכברה כל כאשר, עכברות בארבע miR-145-ו miR-23b של יטויהב רמות של בחינה

הראשון היום. המחזור ימי פני-על אלו ביטוי ברמות שינוי חל כי מראה, ימים ארבעה הנמשך estrous-ה מחזור

-ה שני בין דומה שנמצאה הביטוי תבנית.0-כ נקבעה בו miRNA-ה ורמת כביקורת שימש, proestrus, למחזור

miRNA הנקרא ביום בביטויים ירידה ומראה estrus (איורים A06 ,B06.) של היחסיות הביטוי רמות miR-

23b בימים estrus, metestrus ו-diestrus של היחסיות הביטוי רמות. בהתאמה, 0.16-ו 1.66, 1.26 ןהינ

miR-23b בהתאמה, 0.16-ו 1.62, 1.3 הינן אלו בימים .

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Proestrus Estrus Metestrus Diestrus

Rela

tive e

xp

ressio

n

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Proestrus Estrus Metestrus Diestrus

Rela

tive e

xp

ressio

n בתאי הרירית. miR-145השתקת השפעת לתאי רירית הרחם ב JARשיעור ההיצמדות של ספירואידים מתאי :15איור


52

דיון

בהן נעשה שנה 23ומאז כבר חלפו 0676-הגניקולוגיה עבר תפנית עם לידת תינוק המבחנה הראשון ב ענף

למרות הידע הרב שנצבר טרם נמצא מענה לבעיה של כשלים חוזרים בהשרשה . חוץ גופית-שימוש בהפריה

(RIF .)ן נשים עם כשלים מחקרים קודמים שנעשו במעבדתנו גילו כי קיים פרופיל גנטי שונה ברירית הרחם בי

miRNA-. מולקולות הmiRNA (33 ,32)וביטוי mRNAחוזרים בהשרשה לבין נשים פוריות מבחינת ביטוי

. יתכן כי קיימת לקות בבקרת הביטוי של miR-145-ו miR-23bהינן RIFו בולטות בעלייתן בנשים עם שהי

miRNA המביאה לעליה בביטוי שלmiR-23b ו-miR-145 ולבסוף לירידה בביטוי גני המטרה שלהם. עבודת

תל של בתאי האפי miR-145-ו miR-23bמנת לבדוק מה היא השפעתם של -המחקר שלפניכם נעשתה על

תבנית in-vivoנבדקה ,. בנוסףבתאים והשפעה על ביטוי גנים in-vitroרירית הרחם במודל השרשת העובר

בעכברה. estrous-פני מחזור ה-אלו על miRNAההתבטאות של

. (43-47, 6), בו נעשה שימוש בעבודה זו, הינו מודל רווח במחקר השרשת העובר in-vitroמודל ההשרשה

תאי האפיתל של רירית הרחם הינם התאים איתם נוצר הקשר הראשוני של תאי הטרופובלסט של הבלסטוציסט

הינם תאים ממקור של תאי JARשימוש בשורות תאים המייצגות את תאים אלו. תאי ולכן במודל נעשה

טרופובלסט של הבלסטוציסט שהם התאים היוצרים את הקשר הראשוני אל תאי הרירית וכן את החדירה דרכה.

מודל השרשת העובר מאפשר כימות של שלב ההיצמדות תוך בחינת היקף ההיצמדות של ספירואידים של תאי

JAR אל תאי הרירית. בנוסף, הוא מאפשר כימות של שלב ההשרשה תוך מדידה של היקף התפשטות

HEC-1A-ו RL-95 ,AN3-CAהספירואיד ומידת הדחיקה של תאי הרירית מפניו. שורות התאים שנבחרו,

דל. נבדלות זו מזו בשיעור ההיצמדות של הספירואידים אליהן ובמידה בה הן מאפשרות חדירה של העובר במו

. ביטוי של אינם מבטאים קולטן זה HEC-1Aבעוד שתאי ERαמבטאים RL-95כפי שציינתי בהקדמה תאי

ERα בתאיHEC-1A הביא לעליה בשיעור ההיצמדות של ספירואידים של תאיJAR אל התאים ולעליה

בספרות סותרות עדויות קיימות AN3-CA בתאי ERα נוכחות . לגבי(6)בהתפשטות הספירואידים על פניהם

עבור knockoutמחקר שערך ניסיונות השרשה של עוברים שמקורם בזן הבר בעכברות שעברו . (46, 46)

כמעט ולא נמצאו קשריות המעידות על השרשת העובר וגם KO-ברות הכברחם מצא כי בע ERαיטוי של ב

53

התקיים בעכברות decidualization-באלו שנמצאו לא נמצאה עדות לרקמת עובר בפועל. מכאן כי תהליך ה

למתן ERα ידי-אלו בהיקף פחות, אך תהליך ההשרשה כלל אינו יכול להתקיים מבלי תגובה המתווכת על

מעלה את רצפטיביות התאים הן HEC-1Aבתאי ERα. במחקר קודם מצאנו כי ביטוי של (31)אסטרוגן

. כפי שרואים (6)ת חדירת הספירואידים מבחינת היצמדות הספירואידים והן מבחינת יכולת התאים לאפשר א

-אך התפשטות הספירואידים על HEC-1Aהספירואידים מתקיימת בהיקף מצומצם בתאי היצמדותבמחקר זה,

צרך בהכרח ר תהליך החדירה של העובר, ואינו נחיוני ביותר עבו ERαפניהם כמעט ואינה מתרחשת. מכאן כי

. היצמדותעבור תהליך ה

, אך אינה מתבטאת HEC-1A-ו RL-95נמצא כי היא מתבטאת בתאי ,E-cadherinלת האדהזיה מבחינת מולקו

בעיקר RL-95נבדלים מתאי AN3-CAניכר כי תאי in-vitro. במודל ההשרשה AN3-CA (6 ,47)בתאים

-Eאליהם. עובדה זו עולה בקנה אחד עם תפקידו של JARביכולת לאפשר הידבקות של ספירואידים של תאי

cadherin כמולקולת אדהזיה. ביטוי שלE-cadherin בתאיAN3-CA הביא לעליה בהידבקות של

. להפתעתי לא מצאתי מחקרים שבחנו אם אכן מתקיימת הידבקות (47)בלסטוציסט אליהם -וייספירואידים דמ

ומחקרנו , AN3-CAבתאי in-vitroתהליך החדירה את או שבחנו AN3-CAמאוחרת של ספירואידים לתאי

. יתכן כי הדבר נובע מכך שאין אלו תאי רירית רחם שהופקו התאים של שורת זה הוא ראשוני מבחינת איפיון

ישירות מהרירית ולכן מועדפות שורות תאים אחרות לבחינת אפיתל של רירית הרחם. בחינת תהליך החדירה

in-vitro בתאיAN3-CA ף מופחת מזה שמתרחש בתאי מראה כי תהליך זה מתרחש בתאים, אם כי בהיקRL-

תקינה של העובר אל תאי היצמדותהכרחי ליצירת E-cadherinכי אני משערתפי ממצאים אלו -. על95

הרירית, אך אינו הכרחי לתהליך החדירה שבה בעקבות ההיצמדות.

הגדלים בתרבית HEC-1Aתאי .ת הפולריות שלהןהבדל בסיסי נוסף בשלוש שורות התאים הינו בתכונ

י שורות תאים אלה בעלות פנוטיפ ת. שגדלים ללא פולריותRL-95 מאופיינים בפולריות, בעוד שתאי

גדלים ללא פולריות והם אינם AN3-CA. תאי E-cadherinאפיתליאלי ומבטאות את מולקולת האדהזיה

. בתהליך ההשרשה חלה טרנספורמציה של ממברנת E-cadherin (30)מבטאים את הסמן האפיתליאלי

. יש הטוענים, כי מעבר לאיבוד הפולריות גם מעורב תהליך (30) קף מסוייםהפלסמה הכולל איבוד פולריות בהי

( בו תאי האפיתל מאבדים מאפיינים אפיתליאליים ורוכשים epithelial-mesenchymal transition) EMT-ה

54

מאופיין בעיקר בעליה בביטוי של EMT-מאפיינים מזנכימאליים הכוללים תנועתיות וחודרניות. תהליך ה

vimentinה בביטוי , וכולל ירידE-cadherin ועליה בביטויN-cadherin ניסויים שנעשו בשורת תאי רירית .

, דבר המעיד על מעורבות תהליך EMT-הראו כי אסטרוגן ופרוגסטרון משרים את תהליך ה Ishikawaהרחם

כך שהוא EMTמשרים JAR(. בנוסף, ספירואידים של תאי peri-implantationזה בשלב שלפני ההשרשה )

מתרחש גם בעת השרשת העובר. ניסויים EMT-רחש ביתר בתאים הסובבים אותם, ומכאן כי תהליך המת

מגדיל את מספר הספירואידים שנצמדים אל תאי EMT-נוספים שנעשו מחזקים את ההשערה כי תהליך ה

. לפי הדעה שהזכרתי מקודם הטוענת כי in-vitro (46)הרירית ואת התפשטות הספירואידים בתהליך החדירה

מתרחש בתאי אפיתל הרירית באופן מוגבל כך שאין הם מאבדים לגמרי את המאפיינים EMT-תהליך ה

א נעשה בצורה מבוקרת ולכן מייצגים במודל את התהליך כפי שהו RL-95האפיתליאליים שלהם, יתכן כי תאי

, בהם תאי האפיתל שומרים על פולריות, מייצגים תאים בהם HEC-1Aהינם התאים הרצפטיבים ביותר. תאי

הינם תאים בהם מדומה AN3-CAבהיקף המאפשר את ההשרשה. ואילו תאי EMT-לא התרחש תהליך ה

ינם מבטאים גם את מולקולת האדהזיה )יש לציין כי מצאתי שתאים אלו א EMT-התרחשות ביתר של תהליך ה

N-cadherin המאפיינת תאי אפיתל שעברו את תהליך ה-EMT .)

מבחינה גנטית, קיימים הבדלים רבים בביטוי גנים שונים המעורבים בתהליך ההשרשה בשלוש שורות התאים.

פרוטאזות, -מטאלו-, מטריקסmucinעם גנים אלו נמנים מולקולות אדהזיה )כגון קדהרינים ואינטגרינים(,

(.23ים המתאימים להם )קולטנציטוקינים, כימוקינים ופקטורי גידול שונים וה

בשלוש שורות התאים, העלתה כי קיים שוני ניכר בביטוי miR-145-ו miR-23bבחינה של רמת הביטוי של

-RLקורת הינה כמחצית מזו שנמצאה בתאי הבי AN3-CAבתאי miR-145. רמת הביטוי של miR-145של

מזו שבתאי הביקורת. יתכן כי גם הבדל גנטי זה הינו בין 0.3הינה פי HEC-1A, ואילו רמת הביטוי בתאי 95

הגורמים לפגימת תכונת הרצפטיביות בתאים, וכי לצורך רצפטיביות תקינה דרושה רמת ביטוי מדויקת של

miR-145לעומת זאת, לא נמצאו הבדלים משמעותיים ברמת הביטוי של . miR-23b .בתאים

miR-145-ו 23b-miRוביטוי של ERαיחסי הגומלין בין ביטוי

והוריד משמעותית את miR-23bהעלה משמעותית את רמת הביטוי של HEC-1Aבתאי ERαביטוי ביתר של

רחבה הינה miRNA-ה מקטעי של ביוסינטזה על בבקרה ERα קולטןה . מעורבותmiR-145רמת הביטוי של

55

Dicer-ו Exportin 5 כולל, בתהליך המשתתפים אנזימים פעה בלתי ספציפית דרך בקרה שלו עלוקיימת הש

גרם הרחם ריתרי של ראשוניים לתאים אסטרוגן תואמת את הממצא כי מתן miR-23b. העליה בביטוי (33)

.(32) סטרומה תאי בקרב miR-23b של בביטוי ולירידה בלוטיים תאים בקרב miR-23b של בביטוי לעליה

אשר MCF-7 (33 ,34)בתאי miR-23bלעומת זאת, קיימים דיווחים סותרים לגבי השפעת אסטרוגן על ביטוי

(. יש לציין כי מתן האסטרוגן לתאים הראשוניים של 64נובעים משוני במשך מתן האסטרוגן )נראה כי הם

שעות( שלא נראה כי הוא מתאים לבחינה נכונה של ההשפעה מפני 6רירית הרחם היה למשך זמן קצר )

השד שעות, ויתכן כי גם זו סיבת השוני בין התוצאות לגבי סרטן 06-הינם יציבים למשך כ miRNAשמקטעי

יכולה בעקיפין לבקר את תגובתיות הרקמה לפרוגסטרון, שכן miR-23b. השפעה של אסטרוגן על (33)

. ובהקשר זה יש לציין כי למרות המקובל miR-23b (32)מטרה פוטנציאלי עבור -לפרוגסטרון מהווה גן קולטןה

, כפי שעולה (33)ים לפרוגסטרון, קיימות עדויות למצב ההפוך קולטנכי מתן אסטרוגן גורם לעליה בביטוי של ה

. יש לתת את הדעת לכך כי בעת מתן אסטרוגן לתאים, פעילותו miR-23bמעלה ביטוי של ERα-מהממצא ש

. נמצא כי שפעול של ERα, ולכן אין זו בדיקה אמינה לגבי פעולתו של ERβידי -עשויה להיות מתווכת גם על

ERβ מביא לעליה ברמות הביטוי שלmiR-23b בתאי רירית הרחם כי מעין זופעילות בתאי סרטן השד, ותתכן

. (33)זה מתבטא גם ברירית הרחם קולטן

עולה בקנה אחד עם הממצא כי מתן אסטרוגן ERαבעקבות ביטוי ביתר של miR-145הירידה בביטוי של

ברירית הרחם. ירידה זו חלה בגלל עיכוב בתהליך הביוסינטזה של miR-145לעכברות הביא לירידה בביטוי

miR-145 ממולקולת ה-pri-miRNA (36) בנוסף, מתן ממושך של אסטרוגן לתאי סרטן השד גורם לירידה .

בחלק הרגולטורי של estrogen-responsive-element. במחקר זה נמצא מקטע miR-145 (37)בביטוי של

שעות 34אשר נראה כי הוא מעורב בבקרה השלילית שנמצאה. במחקר אחר תואר כי לאחר miR-145המקטע

miRNAומקטעי miR-145ממתן אסטרוגן לעכברות שעברו כריתה של השחלות, חלה ירידה בביטוי של

ברות. במאמר זה נמצא כי ירידה זו חלה בעקבות דיכוי של תהליך הביוסינטזה של אותם נוספים ברחם העכ

miRNA ידי -עלERα (36)ולא בעקבות בקרה ישירה על שעתוק המקטעים, כפי שתואר מקודם .

השפיע על תכונות התאים, כפי HEC-1A-ERαבתאי miR-145-ו miR-23bבהמשך, ביטוי ביתר של

עקב עליה ERαעצמו. חלה ירידה משמעותית ביותר בביטוי של ERαשנסקור בהמשך, אך השפיע גם על ביטוי

56

הביטוי של . יש להתייחס לתוצאות אלה במשנה זהירות מפני שירידה ברמתmiR-145-ו miR-23bבביטוי של

ERα הטרנספקציות העקביות נעשו רק פעם אחת ולכן (36)מצויה בשורות תאים גם ללא ביצוע טרנספקציות .

כדי לאמת את התוצאות יש לחזור בשנית על ביצוען.

בתאי סטרומה של אנדומטריוזיס שחלתי נקשרה לדומיננטיות של מסלול העברת miR-23bירידה בביטוי של

לבין miR-23b. מכאן עולה כי קיים מתאם הפוך בין רמת הביטוי של (36)האותות של אסטרוגן ברקמה זו

עצמו כתוצאה ERαהדומיננטיות של מסלול זה. לפי הממצאים כאן יתכן כי קשר זה נובע מירידה בביטוי של

הינו גן מטרה ישיר שלו. ERαבתאי סרטן השד כי , נמצא miR-145. לגבי miR-23bמעליה בביטוי של

miR-145 נקשר לשני אזורים בעלי התאמת בסיסים הממוקמים דווקא בחלק המקודד של מקטע ה-mRNA

.(24)שלו

ביטויו על miR-145-ו 23b-iRm והשפעת ycM-c החלבון

של בהאצה ובמעורבותו שונים תאיים תהליכים בבקרת בחשיבותו הידוע שעתוק פקטור הינו c-myc החלבון

פרוליפרציה של להאצה נקשרה c-myc של פעילות .(61-63) שונים סרטן סוגי בקרב סרטניים תהליכים

של במטבוליזם ופגיעה DNA (63)-ב הנזקים יצירת תהליך של האצה, האפופטוזיס בתהליך פגיעה, תאית

במשך המחזור החודשי, אך בפאזה הפרוליפרטיבית מיקומו הוא בעיקר c-mycת אין שינוי ברמו(. 73) סוכרים

. בנוסף, נראה כי ישנה התאמה (62)בגרעין בעוד שבעת הפאזה הסקרטורית מיקומו הוא בעיקר בציטופלסמה

. (62)בגרעין התא c-mycמעלה את הריכוז של in-vivoוכי מתן אסטרוגן ERαבין ביטויו לבין ביטוי של

הינה עבורו חיובית גרעינית וצביעה, הסרטני בתהליך משתתף הוא כי נמצא הרחם רירית של בקרצינומה

מביטויו משמעותית גבוה אנדומטריוזיס של ברקמה c-myc ביטוי, בנוסף. (63) נמוך שרידות לשיעור בהתאמה

המתבטאת בפוריות פגיעה נמצאה c-myc עבור הטרוזיגוטיות בעכברות. (64) תקינה רחם רירית ברקמת

מתים בטרם c-mycעכברים הומוזיגוטים עבור .(63) השרשה שעברו עוברים של מוקדמות הפלות בהגברת

. (63)סיום ההיריון

ולאור miR-145-ו miR-23b של ביתר ביטוי בעקבות התאית בפרוליפרציה שחלה המשמעותית הירידה לאור

ביטוי על הטרנספקציות בהשפעת התעניינו ,miR-145 (66)של מוכח מטרה גן מהווה c-myc כי העובדה

בביטוי ירידה חלה AN3-CA בתאי רק התאים שורות מבין. שברשותנו הרחם רירית תאי בשורות החלבון

57

הגבוהה העליה כאשר, החלבון בביטוי עליה חלה התאים בשאר ואילו השונות הטרנספקציות בעקבות החלבון

בתאי שנצפתה בפרוליפרציה ירידה כי להסיק ניתן מכאן. ציותהטרנספק את שעברו RL-95 בתאי נצפתה ביותר

AN3-CA החלבון בביטוי ירידה ידי-על מתווכת להיות עשויה c-myc ולציין לשוב יש. הטרנספקציות בעקבות

הירידה, זאת לעומת. שלהם המתקדם הסרטני באיפיון ידועים וכן הופקו ממנו במקור שונים AN3-CA כי

.אחרים מסלולים ידי-על אלא c-myc ידי-על מתווכת אינה התאים שורות בשאר שחלה התאית בפרוליפרציה

של נורמליים אפיתל בתאי. מגוון תאים בקרב יםשונ נמצאו miR-23b לבין ביטוי של c-myc יחסי הגומלין בין

ימיםמתא מטרה גני של לירידה ובהמשך miR-23b של בביטוי לעליה מביא c-myc של ביטוי כי נמצא השד

בביטוי עליה כי נמצא שונים סרטנים של תאים בשורות, זאת לעומת. (61) התאית הפרוליפרציה ברמת ולירידה

c-myc של טויבבי לירידה מביאה miR-23b ,כי ההשערה עלתה מכאן c-myc את שונה באופן מבקר miR-

23b של שונה בקרה מוצאים אנו הרחם רירית בתאי. (60) פיזיולוגי מצב לעומת פתולוגי במצב miR-23b על

.התאים בין הפתולוגית ברמה בשוני וכן התאים שורות בין גנטי משוני נובע זה שוני כי יתכן. c-myc ביטוי

הוכחה בסרטן הריאות, סרטן המעי הגס c-mycשל החלבון mRNA-על מקטע ה miR-145בקרה ישירה של

בביטוי לעליה מביא p53 הסרטן-מדכא הגן בו זהה בקרה . בשני האחרונים נמצא מנגנון(67, 66)וסרטן השד

.c-myc (66) של בביטוי לירידה ישיר באופן מביא אשר, miR-145 של

23b-miR 145-ו-miR הרחם-מעכבים פרוליפרציה בתאי אפיתל של רירית

בתהליכים סרטניים התבססה במחקרים רבים, וחלקם בחנו את miR-145-ו miR-23bמעורבותם של

השפעתם על פרוליפרציה של תאים שונים )פירוט בהמשך(. בעקבות זאת, התעניינו לבחון את השפעת ביטוי

-HEC-1Aאי אפיתל של רירית הרחם משלוש שורות התאים וכן על תאי ביתר שלהם על פרוליפרציה של ת

ERα מצאנו כי בכל שורות התאים הללו .miR-23b ו-miR-145 מביאים לירידה משמעותית בפרוליפרציה

שעות של תרבית. ממצא זה מעיד על כך שהטרנספקציות בעלות משמעות פונקציונלית. בתאי 46התאית לאחר

RL-95 ,AN3-CA ו-HEC-1A הירידה המשמעותית יותר נצפתה בביטוי ביתר שלmiR-145 לעומת ביטוי

פועל בצורה שונה .בנוסף גם יעילות הטרנספקציות היתה שונה miRNA. כמובן שכל miR-23bביתר של

. הירידה בפרוליפרציה של תאי miR-23bהיה גבוה יותר מזה שהושג עבור miR-145כאשר הביטוי ביתר של

58

HEC-1A-ERα המבטאים ביתר אתmiR-145 היתה נמוכה מזו שנצפתה עבור ביטוי ביתר שלmiR זה בתאי

HEC-1A יתכן כי השוני נובע מיצירת הביטוי של ,ERα (31)שהוא עצמו פועל לפרוליפרציה תאית .

הווסת, כאשר תהליך מחזור פרוליפרציה ואפופטוזיס הינם תהליכים מנוגדים המתרחשים ברירית הרחם לאורך

הפרוליפרציה מאפיין את הפאזה הפרוליפרטיבית ותהליך האפופטוזיס מאפיין את הפאזה הסקרטורית כאשר הוא

ים בשכבת האפיתל של רירית הרחם לעומת שכבת מגיע לשיאו במחזור הווסת. רוב התאים האפופטוטיים נמצא

-. קיימות ראיות כי בקרה מקומית של תהליכים אלו חיונית עבור השרשת העובר באדם ובבעלי(66)הסטרומה

אפיתל ראשוניים שהופקו מרירית הרחם של נשים נמצא כי בשלב -חקר שנערך בתאי. במ(66, 31)חיים

אפופטוטית בתאי -ידי הפרשה פאראקרינית תהליך השפעה אנטי-האפוזיציה בלסטוציסט הומני משרה על

הרירית. נראה כי מטרת השפעה זו היא הגדלת מספר תאי האפיתל של הרירית שיהיו זמינים ליצירת הקישור

ובשלב החדירה, הבלסטוציסט משרה אפופטוזיס בתאי היצמדותי לבלסטוציסט. בהמשך, בשלב ההראשונ

. תאי (66)הרירית בכדי לפרוץ את מחסום תאי האפיתל של הרירית ובהמשך לחדור אל שכבת הסטרומה

האפיתל של רירית הרחם מהווים מחסום פיזי ואימונולוגי חשוב בהגנה על האם אשר באופן פיסיולוגי נפרץ בעת

השרשת העובר. לכן בקרה הדוקה על תהליכים של פרוליפרציה ואפופטוזיס בתאים אלו חשובה להגנת האם.

פרציה של תאי האפיתל ובכך חלה מביאה לירידה בפרולי miR-145-ו miR-23bיתכן כי העליה בביטוי של

או פגיעה נרחבת במחסום תאי היצמדותירידה במספר התאים הזמינים עבור קישור של הבלסטוציסט בשלב ה

האפיתל בעת שלב החדירה המביאה לתגובה הגנתית מצד האם אשר לבסוף מביאה לדחיית העובר.

והשרשת העובר 23b-miRמקטע

בסוגי סרטן שונים כבעל פעילות התומכת בתהליך miR-23bורבותו של קיימות עדויות חלוקות לגבי מע

ברקמת משמעותית עולה miR-23b ביטוי כי נמצא עצמה הרחם רירית רקמת הסרטני או המדכאת אותו. לגבי

חלה אך, בריאות זו שבנשים לעומת( eutopic endometrium) אנדומטריוזיס עם בנשים שברחם הרירית

של במצב (ectopic endometrium) לרחם מחוץ הגדלה הרירית רקמת בקרב ביטויוב משמעותית ירידה

וכי miR-23b של בביטוי ירידה חלה האנדומטריוזיס התפתחות עם כי מכאן. הביקורת לעומת אנדומטריוזיס

איפיון מולקולרי של .(32)הרחם רירית בתאי סרטנית-ואנטי פרוליפרטיבית-אנטי פעילות בעל שהוא יתכן

(, מצא כי חלה endometrial carcinosarcomaבסרטן קרצינוסרקומה של רירית הרחם ) EMT-תהליך ה

59

נוספים במרכיב miRNAומקטעי miR-23bוירידה בביטוי של EMT-עליה בביטוי של סממנים של תהליך ה

.לאור מחקרים אלו ובעקבות הירידה (71)המזנכימאלי של הגידול לעומת המרכיב האפיתליאלי שלו

בפרוליפרציה של תאי האפיתל של רירית הרחם שנמצאה במחקר זה יש להתייחס ביתר אל המחקרים שייחסו

יים.פעילות המדכאת התפתחות תהליכים סרטנ miR-23b-ל

בשורות תאים של שלפוחית השתן פגע ביכולות הפרוליפרציה, הנדידה והחדירה miR-23bביטוי ביתר של

של התאים. הפרוליפרציה של התאים עוכבה הן מבחינת עצירת מחזור התא והן מבחינת השראת תהליך

לבון אונקוגני , חZeb1מדכא ישירות את התרגום של miR-23bאפופטוטי בתאים. בתאים אלו נמצא כי

-miRם של סרטן המעי הגס הודגם גם כן כי ביטוי ביתר של . בשורות תאיEMT (70)-המשרה את תהליך ה

23b מביא לעליה בביטוי שלE-cadherin ולירידה בביטוי של הסממן המזנכימאליvimentin (36) יתכן כי .

miR-23b ידי פעולה זו לירידה בהיקף תהליך ה-למביא ע-EMT הנדרש עבור השרשת העובר ברירית הרחם

תאים המעכבים נדידה של miRNAהינו הבולט ברשימה של miR-23b. לגבי סרטן המעי הגס, נמצא כי (46)

ביכולת in-vivoמביא לירידה miR-23bותהליכים גרורתיים ומקדמים אפופטוזיס של תאים. ביטוי ביתר של

הפרוליפרציה של הגידול, ביכולת החדירה שלו וביכולתיו להניע תהליך של יצירת מטאסטאזות ואנגיוגנזה.

TGFβ-R2-ו FZD7 ,MAP3K1 ,PAK2מטאסטאזיים, כגון: -בנוסף, הוא מבקר ישירות ביטוי של גנים פרו

מביא לירידה בפרוליפרציה התאית ולירידה miR-23bבשורות תאים של סרטנים שונים נמצא כי . (36)

.(73-74)ביכולת הנדידה והחודרנות של התאים

שיתכן כי הינם מעורבים גם miR-23bידי -ממחקרים אלו עולים מספר מסלולים סרטניים המבוקרים על

חל בשל ירידה בשיעור בעיכוב הפרוליפרציה אשר נצפה במחקר זה. במחקרנו לא נבדק אם עיכוב הפרוליפרציה

עיכוב זה נובע משני הדברים כפי שנמצא כי חלוקת התאים או מהשראה מוגברת של תהליך האפופטוזיס. יתכן

. (72, 70)לגבי סרטן שלפוחית השתן וסרטן הפרוסטטה

. in-vitroבשורות התאים השפיע באופן שונה בשורות התאים על תהליך החדירה miR-23bביטוי ביתר של

ואילו שטח הספירואידים הושפע במידה מועטת יחסית. endometrial clearanceהמדד העיקרי שהושפע הינו

המדד RL-95חלו השפעות מנוגדות, כאשר בתאי in-vitroיביים מבחינת תהליך החדירה בשני התאים הרצפט

endometrial clearance עלה, ובתאיAN3-CA הוא ירד. בתאיHEC-1A לא חל שינוי ניכר במדדים. יתכן

60

י בשורות התאים וכ EMT-מבקר באופן שונה תהליכים כמו פרוליפרציה ואפופטוזיס, נדידה ו miR-23bכי

מאזן בין תהליכים אלו הוא הקובע את שיעור הדחיקה של תאי הרירית מפני הספירואידים.

משמעות .endometrial clearance-הביא לירידה במדד ה HEC-1A-ERαבתאי miR-23bביטוי ביתר של

.ERαירידה זו הינה פגיעה בתכונת הרצפטיביות אותה רכשו התאים בעזרת הביטוי של

לא ניכר שינוי, RL-95, בתאי miR-23bההיצמדות של הספירואידים בהשפעת ביטוי ביתר של מבחינת מידת

שיעור זה עלה. שלב ההיצמדות של HEC-1Aחלה ירידה בשיעור ההיצמדות ובתאי AN3-CAאך בתאי

E-cadherinידי מולקולות אדהזיה שונות, כאשר הבולטת בהן הינה -העובר אל רירית הרחם מאופיין בעיקר על

בתאי הרירית, הינה β-catenin-ו E-cadherinעל ביטוי miR-23bתר של . מעניין כי השפעת ביטוי בי(3)

לא RL-95בהתאמה להשפעת הביטוי ביתר על שיעור ההיצמדות של הספירואידים אל התאים. לדוגמא, בתאי

בהשפעת הטרנספקציה וכן גם לא חל שינוי לגבי שיעור ההיצמדות של E-cadherinחל שינוי בביטוי של

מבקר miR-23bחלה ירידה בשני מדדים אלו. בתאי שלפוחית השתן נמצא כי HEC-1A, ובתאי הספירואידים

זה מנגנון שאם מצפים היינו לפיכך .E-cadherin (70) ביטוי החלבון אשר גורם לדיכוי של Zeb1שלילית את

בתאי רק שכזו עליה צפינו אך, E-cadherin של בביטוי עליה תחול, הרחם רירית של האפיתל בתאי גם מתקיים

HEC-1A את ביתר המבטאים miR-23b בתאי .HEC-1A-ERα חלה ירידה מועטה בביטוי שלE-cadherin

מביא לכך שתגובת התאים לביטוי ERαם. שוב נראה כי של הספירואידי היצמדותובשיעור ה β-catenin -ו

ובכך יש ביטוי RL-95תואמת יותר את התגובה שנצפתה בשורת התאים הרצפטיבית miR-23bביתר של

miR-23bלבין תאים אלו. נמצא כי בסרטן הפרוסטטה ירידה בביטוי של HEC-1A-ERαלדימיון בין תאי

ר של הגן ובכך מביאה להשתקתו. בתאים של סרטן זה ביטוי ביתר של ידי מתילציה של הפרומוטו-מתווכת על

miR-23b מביא לעליה בביטוי שלE-cadherin (72) (36)וכן נמצא לגבי תאים של סרטן המעי הגס .

אשר TGFβ-R2-ו FZD7על רמת הביטוי של החלבונים miR-23bבחרנו לבדוק את השפעת ביטוי ביתר של

המעורבים בהשרשת העובר TGF-β-ו Wntומשתייכים למסלולים miR-23bהינם גני מטרה מוכחים של

שאינו קנוני. נראה כי Wntהקנוני ואת מסלול Wntהמפעיל את מסלול קולטןהינו FZD7 קולטן. ה(76, 73)

. (77)רך המסלול הקנוני מביאה להתפתחות סרטן וליצירת מטאסטאזות בסוגי סרטן שונים פעילותו בעיקר ד

61

. בניגוד למספר (76)מתבטא בפאזה הפרוליפרטיבית ובפאזה הסקרטורית FZD7לגבי רירית הרחם נמצא כי

. (73)שתפקידם ברירית הרחם נחקר, תפקידו ברירית ובהשרשת העובר טרם נחקר Wnt-מתווכים במסלול ה

-RL-95 ,AN3בתאים המאופיינים ברצפטיביות FZD7הביא לירידה בביטוי של miR-23bביטוי ביתר של

CA ו-HEC1A-ERα .

מעורב בתהליכים המתרחשים ברירית הרחם לאורך מחזור הווסת, בקליטת העובר ובביסוס TGFβ-מסלול ה

ידי תאי אפיתל בלוטיים ברירית מביאים להכנה של -על TGFβרשה של ההיריון. בפאזה הסקרטורית ייצור והפ

הרחם לקראת השרשת העובר. בעת השרשת העובר, המסלול משתתף בשלב ההיצמדות של העובר ומבקר את

מתבטא ברירית הרחם כאשר TGFβ-R2 קולטן. ה(76)שלב החדירה, ויסות המערכת החיסונית ויצירת השיליה

נוכחותו בולטת בעיקר באפיתל הבלוטי מבין תאי הרירית, ובעיקר במשך הפאזה הפרוליפרטיבית המאוחרת ועד

miR-23b של ביתר , ביטויFZD7. באופן דומה לזה שנצפה לגבי הביטוי של (76)לאמצע הפאזה הסקרטורית

בתאי .HEC-1A-ERα-ו RL-95 ברצפטיביות המאופיינים בתאים TGFβ-R2 של בביטוי לירידה הביא

HEC-1A בעקבות הטרנספקציה ואילו בתאי קולטןחלה עליה בביטוי הAN3-CA לא מצאנו כלל ביטוי של

על גני מטרה שלו miR-23bמנגנון בקרה שונה של HEC-1Aעולה כי יתכן וקיים בתאי . ממצאים אלוקולטןה

או כי ישנם מנגנוני בקרה נוספים המעורבים במערכת בקרה זו.

העובר והשרשת miR-145 מקטע

-יורד ברירית שהופקה מ miR-145ידוע בפעילותו הנוגדת התפתחות סרטנית. ביטוי של miR-145המקטע

endometriosis לעומת רירית רחם תקינה וביטויו גבוה יותר במרכיב של האפיתל הבלוטי של הרירית מאשר

הביא לירידה Ishikawaבשורת תאי אפיתל של רירית הרחם miR-145. ביטוי ביתר של (61)בתאי הסטרומה

, שהינו פקטור שיעתוק המעורב בתהליכים סרטניים. השפעה זו גררה הגברה של תהליך OCT4בביטוי של

מביא לצמצום תהליך הפרוליפרציה miR-145. יחד עם הממצאים במחקר זה, עולה כי (60)ההתמיינות בתאים

התאית בתאי אפיתל של רירית הרחם.

פרוליפרציה התאית ולפגיעה גורם לירידה ב miR-145 ידם-ו מנגנונים שונים אשר עלבתאי סרטן שונים הוכח

. בתאי סרטן המעי הגס ובתאי סרטן השד ירידה (63-63, 24, 36)של התאים יכולת הנדידה והחודרניות ב

. c-myc (66)נקשרה לבקרה הישירה שלו על ביטוי miR-145בעקבות ביטוי ביתר של בפרוליפרציה התאית

62

אשר אחראי על catenin δ-1על miR-145בקרה נוספת בתאי סרטן המעי הגס הינה השפעה ישירה של

β-cateninבסרטן זה. טרנסלוקציה זו מביאה להגברת הנוכחות של β-cateninטרנסלוקציה לא תקינה של

. cyclin-D1 (66)-ו c-mycשבין גני המטרה שלו נמנים Wntבגרעין וכך להפעלה של מסלול העברת האותות

עשויה להיות מנגנון miR-145המתרחשת בעקבות ביטוי ביתר של ERαכמובן כי גם הירידה בביטוי של

. (24) המשתתף בהאטת תהליך הפרוליפרציה בתאים

של mRNAידי קשירה ישירה שלו אל -מדכא נדידה וחודרניות של התאים על miR-145בתאי סרטן הקיבה

N-cadherin אשר מביאה בעקיפין גם לירידה בביטוי שלMMP-9 (67) בשורות תאים של סרטן השד .miR-

וירידה זו אחראית גם לירידה בביטוי של MUC1ירידה בביטוי של דרך לירידה בחודרניות התאיםגורם 145

β-catenin (66) בנוסף, הראו בתאי סרטן השד כי ירידה בנדידת התאים ובחודרניות שלהם מערבת דיכוי של .

מביא לירידה בביטוי של פקטור miR-145. במחקר זה נמצא כי miR-145ידי -שנעשה על EMT-תהליך ה

ידי -תווכת עלהמ ZEB2-ו Snail ,ZEB1, אשר מביאה לירידה בביטוי של פקטורי השיעתוק Oct4השעתוק

β-catenin בקרה זו מביאה לירידה בביטוי הסממן המזנכימאלי .N-cadherin ולעליה בביטוי של מולקולת

. E-cadherin (66)האדהזיה

-inשונות בין שורות התאים של אפיתל הרירית עבור תהליך החדירה הניב תגובות miR-145ביטוי ביתר של

vitro בתאי .RL-95 חלה עליה במדדendometrial clearance ללא שינוי ניכר בהתפשטות הספירואידים

חלה ירידה משמעותית במדד HEC-1A-ERα-ו AN3-CAדמויי העובר. לעומת זאת בשורות התאים

endometrial clearanceי , ובתאAN3-CA ירידה משמעותית בהיקף התפשטות הספירואידים. בנוסף חלה

מערב endometrial clearanceכי תהליך היצירה של לא חל שינוי משמעותי. נראה HEC-1Aבתאי

תהליכים של ירידה בפרוליפרציה של תאי רירית הרחם, אפופטוזיס של התאים ויכולת נדידה של תאי הרירית

בעל פעילות miR-145ל הספירואידים. מתוך המחקרים שהובאו לעיל עולה כי דווקא המאפשרת התפשטות ש

. פעולות אלה עשויות להסביר את EMTיש ביכולתו למנוע התפתחות של התהליך כי פרוליפרטיבית ו-אנטי

-RL. מעניין כי בתאי HEC-1A-ERα -ו AN3-CAשנצפה בתאי endometrial clearance-עיכוב יצירת ה

מביא לירידה בפרוליפרציה, אך בניסוי החדירה מצאנו דווקא הגברה miR-145נו כי ביטוי ביתר של מצא 95

-HECהינם פחות פולריים מתאי RL-95של תהליך הדחיקה של התאים מפני הספירואידים. כפי שציינו תאי

63

1A ויתכן כי במקרה זה באה לידי ביטוי העובדה כי תאים אלו יותר מדמים מצב שלEMT תקין הדרוש

על הפרוליפרציה בתאים משתנה בעקבות נוכחות miR-145להשרשת העובר. בנוסף יתכן כי השפעת

הספירואידים דמויי העובר.

AN3-CA-ו RL-95 בתאים, miR-145 של ביתר ביטוי בהשפעת הספירואידים של ההיצמדות מידת מבחינת

שוב נציין כי . ההיצמדות עלה באופן משמעותי רשיעו HEC-1A בתאי אך חלה ירידה משמעותית של מדד זה.

הינה, הרירית בתאי β-catenin-ו E-cadherin ביטוי על miR-145 של ביתר ביטוי להבחין שהשפעת מעניין

כפי שציינו בתאי סרטן השד .התאים אל הספירואידים של ההיצמדות שיעור על ביתר הביטוי להשפעת בהתאמה

miR-145 של מביא לעליה בביטויE-cadherin דרך בקרה ישירה על פקטור השעתוקOct4 (66) מנגנון .

. MUC1על miR-145מבוקר בתאים אלו הוא דרך הבקרה הישירה של E-cadherinנוסף בו יתכן כי

MUC1 ומקדם את תהליך ה (66)ת וחודרניות של תאי סרטן נקשר לתנועתיו-EMT דרך קישור ל-β-catenin

miR-145. לכן בקרה זו של EMT (61)-ויצירת קומפלקס האחראי לשעתוק גנים המשתתפים בתהליך ה

-E-ו β-cateninעל ביטוי miR-145. לפיכך עולה כי השפעת E-cadherin-מביאה בעקיפין גם לעליה ב

cadherin הינה הופכית, אך ראינו כי בתאים ביטוי של חלבונים אלו נמצא בהתאמה בתאים שעברו ביטוי ביתר

. ניתן להסביר זאת כי הדרך הנכונה לבחון את המסלול כוללת מעקב לא רק אחר רמות הביטוי miR-145של

, וזאת לא בדקנו במחקר זה. מסלול בקרה נוסף שנחקר אף (66)א בעיקר מעקב אחר מיקומו אל β-cateninשל

וי של אשר מביא בסופו של דבר לדיכ ERα קולטןל miR-145הוא בתאי סרטן השד הינו קישור ישיר של

אשר מעורב בקומפלקס השתקה אשר MTA3-נקשר ל ERα קולטן. ה(24) לחלבון mRNA-תרגום מקטע ה

שהינו מבוקר E-cadherinל . דיכוי זה מביא לעליה בביטוי שSnailמביא לדיכוי הביטוי של פקטור השעתוק

בעקבות ביטוי ביתר E-cadherin. בתאי סרטן המעי הגס חלה ירידה בביטוי של Snail (41)ידי -שלילית על

. למרות E-cadherinבתאים עשוי להעלות את הביטוי של ERα.מכאן כי ביטוי של miR-145 (66)של

β-catenin-ו E-cadherinחלו עליות בביטוי של HEC-1Aהמנגנונים המתוארים כאן, אנו רואים כי רק בתאי

הירידות בשיעור ההיצמדות של הספירואידים .HEC-1Aשל הספירואידים חלה רק בתאי היצמדותובשיעור ה

מבוטא miR-145בתאים הרצפטיביים עולות בקנה אחד עם הממצאים כי E-cadherinבתאים ובביטוי של

ם גם את המתואר בנשים אלה. ממצאים אלו תואמי E-cadherinוכן חלה ירידה בביטוי RIFביתר בנשים עם

64

. לאור E-cadherin (60)הביא לירידה בביטוי של miR-145בתאי סרטן המעי הגס בהם ביטוי ביתר של

-HEC-1A בתאי. דווקא היינו מניחים כי ביטוי ביתר שלו יביא RIFבנשים עם miR-145הביטוי ביתר של

ERα של בביטוי ירידה מועטה אך משמעותית חלה E-cadherin ו-β-catenin ולא חל שינוי בשיעור

-miR של ביתר ביטויל התאים שתגובת לכך מביא ERα כי ביטוי גם כאן נמצא. הספירואידים של היצמדותה

23b הרצפטיבית התאים בשורת שנצפתה התגובה את יותר תואמת RL-95 תאי בין לדמיון ביטוי יש ובכך

HEC-1A-ERα אלו. אמנם לפי המנגנון שתיארנו ביטוי ביתר של תאים לביןERα עשוי היה להעלות את

. HEC-1Aלבין HEC-1A-ERαבין , אך לא השווינו במחקר זה ביטוי של החלבון E-cadherinהביטוי של

ובנוסף E-cadherinיתכן כי חל שינוי במערכת הבקרה של HEC-1Aבתאי miR-145לאחר ביטוי ביתר של

. miR-145ידי -עצמו אשר הינו מבוקר על ERαחלה ירידה משמעותית בביטוי של

, N-cadherin ,netrin-4 החלבונים של הביטוי רמת על miR-145 של ביתר ביטוי השפעת את לבדוק בחרנו

H2AFX ו-cyclin D2 של פוטנציאליים מטרה גני אשר הינם miR-145 של אדהזיה למסלולים ומשתייכים

נמצאה ירידה H2AFX-ו N-cadherin ,netrin-4תאית, מחזור התא ובקרת ביטוי של גנים. לגבי הגנים

.RIF (32)בביטוי שלהם בנשים עם

. התאים בין האדהזיה צמתי ביצירת ומשתתפת הקדהרינים לקבוצת משתייכת N-cadherin האדהזיה מולקולת

בתאי N-cadherin ביטוי האישה ברחם. רבות ברקמות מתבטאת היא אך נוירונים בתאים בתחילה התגלתה היא

אינו הוא. ובסופה הסקרטורית הפאזה בתחילת ונמוך הפרוליפרטיבית הפאזה בעת גבוה הינו הבלוטיים יתלאפ

ביטוי. (63) המנופאוזה משלב ברחם כלל מבוטא אינו וכן הרחם של הפנים שטח שעל אפיתל בתאי כלל מבוטא

N-cadherin כי הראו in-vitro השרשה במודל .EMT-ה תהליך של התפתחות מאפיין N-cadherin של ביתר

השד סרטן בתאי (46) שלהם היצמדותה לשלב חיוני אינו אך הספירואידים של החדירה תהליך עבור נצרך

Oct4ידי -על מתווכת שכנראה N-cadherin של בביטוי לירידה מביא miR-145 של ביתר ביטוי כי הראו

(66).

חלבונים שהינם ההיסטונים למשפחת שייך H2AFX (H2A histone family, member X) ההיסטון

פוספורילציה מתרחשת DNA-ל נזק נגרם כאשר. הנוקלאוזום ליצירת סביבם נכרך DNA-ה אשר גרעיניים

65

אודות המחקרים עיקר. הנזק לתיקון עליםהפו חלבונים של גיוס מאפשר אשר γH2AFX ליצירת H2AFX של

במחקר שבצענו כפי, (62) החלבון של הביטוי לרמת משמעות קיימת גם אך המזורחנת בצורתו עוסקים החלבון

בביטוי הפרעות נמצאו השד בסרטן. בעכברים גנטית יציבות לחוסר נקשרה H2AFX של ביטויב ירידה .זה

כי נראה הרחם ברירית. (64) סטרוןלפרוג קולטןוה לאסטרוגן קולטןה של תקין לא לביטוי נקשרו אשר החלבון

הרחם של נכונה להכנה חשוב הוא כי ויתכן הפרוליפרטיבית בפאזה בעיקר הבולט תהליך הינו DNA תיקון

.(64) העובר קליטת לקראת

מרכיב הינו אשר למינין לחלבון מסויימת הומולוגיה בעל אשר מופרש כמותרופי חלבון הינו netrin-4 החלבון

נכון לקישור האקסונים והובלת העצבים מערכת של תקינה בהתפתחות מעורב הוא. ומת תאי-החוץ החומר של

, שונים תהליכים של כמווסת העצבים למערכת מחוץ גם תפקידו התבסס לאחרונה. (axon guidance) ביניהם

של מורפוגנזה, הדם-כלי מערכת התפתחות, תאי החוץ החומר עם התא של תאחיזה, תא-תא תאחיזת: כגון

נמצא netrin-4 החלבון. העובר השרשת בתהליך מעורבים אלו תהליכים. (63) תאים בין ואינטרקציות הרקמה

ההיריון בהתבססות תפקידו על שמעיד מה, באם שמקורו במרכיב והן בעובר שמקורו במרכיב הן בשיליה

.(66) ובתחזוקו

ובתאי האפיתל בתאי שלו הביטוי .S לפאזה G1 פאזה בין התא במחזור למעבר חשוב cyclin-D2 החלבון

השרשת בזמן משתנה אינו ביטויו כי אף על. (67) הפרוליפרטיבית הפאזה בעת עולה הרחם רירית של הסטרומה

הרירית של פרוליפרציה מווסת אסטרוגן .RIFשל במצב מעורב שלו לקוי ביטוי כי יתכן, (67) בעכברה העובר

.(66) לגרעין cyclin-D2 של טרנסלוקציה על משפיע וכן, D הציקלינים משפחת את המערבת

צפי. התאים בשורות אלו פוטנציאליים מטרה גני של בביטוי לירידה יביא miR-145 של ביתר ביטוי כי ציפינו

הבקרה כי עולה הניסויים מתוצאות. התאים משורות בחלק רק היה היקפו אך מטרה גן כל עבור התרחש אכן זה

בתאי miR-145 של ביתר ילביטו התאים תגובת בין דימיון חל. התאים שורות בין אחידה אינה אלו גנים על

HEC-1A-ERα הרצפטיביים בתאים שמופיעה זו לבין RL-95 לגבי ביטוי שנבדקו הגנים עבור .N-

cadherin דימיון זה נצפה בתוצאות לגבי ביטוי החלבון ולא לגבי ביטוי ה-mRNA .שוני בין הנצפה ברמת ה-

mRNA הפעילות של ידי -לבין מה שנצפה ברמת החלבון יכול להיות מוסבר עלmiRNA כמדכאי תרגום של

mRNA .

66

בשורות התאים miR- 145הביטוי של השתקת

.miR-145 של השתקה ביצענו הרחם רירית של אפיתל בתאי miR-145 תפקיד של הבחינה השלמת עבור

phosphorothiate-ו O-methyl-’2) של כימיות מודיפיקציות שעבר antimiR הינו שנבחר המשתיק החומר

(PS) backbone )נדרשה ממושכת יציבות. היצרן לפי שעות 73-כ עד, מוגברת יציבות בעל שיהיה מנת על

יקר זה שחומר בגלל. ממושכים ניסויים שהינם ,in-vitro ההשרשה תהליך של ניסויים ביצוע לאפשר מנת-על

. היצרן הוראות לפי תיחסי גבוה ריכוז נבחר אלא בתאים החומר של הרצוי הריכוז לקביעת כיול נעשה לא

מוערכת האפקטיביות ולכן מדוייקת ולא מורכבת הינה miRNA של ההשתקה אפקטיביות של ישירה הערכה

.(66) ההשתקה של הפונקציונלית של בחינה ידי-על

בעקבות. ההשתקה ציונאליותפונק את לבחון מנת-על מטרה גני מספר של הביטוי רמות את בתאים בדקנו

-c כי ציינו אמנם. HEC-1A-ו RL-95 בתאים c-myc החלבון בביטוי ירידה חלה miR-145 של ההשתקה

myc של מוכח מטרה גן הינו miR-145 של בהשתקהלפיכך ו miR-145 של בביטוי עליה לראות מצפים היינו

c-myc .ביתר ביטוי בעת אלו בתאים שנצפתה החלבון ויבביט העליה את תואמת זה בניסוי שנצפתה הירידה אך

miR-145 השתקת של שונה השפעה מצאה בתאים פוטנציאליים מטרה גני של רמות של בחינה .miR-145 של

אך miR-145 של ביתר ביטוי עבור שנצפתה להשפעה הופכית היתה לעתים זאת השפעה. אלו מטרה גני על

מביצוע שעות 46 לאחר נצפתה miR-145 השתקת של המיטבית ההשפעה. דומה היתה דווקא ההשפעה לעתים

.הטרנספקציה

RL-95 ,AN3-CA בתאים. בתאים ההשתקה של מצומצמת השפעה נמצאה in-vitro היצמדותה מבחן מבחינת

שאינה הספירואידים של ההיצמדות שיעורה כלשהיא בלהגבר הביאה ההשתקה כי להבחין ניתן HEC-1A-ו

העלאת בעת שנצפו לתוצאות הופכיות הינן אלה תוצאות HEC-1A-ו RL-95 תאי עבור. משמעותית סטטיסטית

הספירואידים של ההיצמדות בשיעור ירידה חלה HEC-1A-ERα תאי עבור. בתאים miR-145 של הביטוי

ההשתקהבעקבות ביצוע שינויב הבחנו לא in-vitro החדירה שלב מבחינת. miR-145 של ההשתקה בעקבות

(.כאן מובאות לא אלה תוצאות)

67

בעכברה estrous-ה מחזור במשך-miR- 145ו 23b -miRשל הביטוי פרופיל איפיון

מתוך נעשתה בעכברה estrous-ה מחזור של השונים בימים miR-145-ו miR-23b של הביטוי רמות בחינת

רמות תיאור. שרשההה חלון במהלך הרחם של הרצפטיביות את מאפשר מסויימים גנים ברמות שינוי כי ההנחה

הרחם ברירית miRNA ביטויל יעשוש מניפולציות של השפעות שיבחנו עתידיים ניסויים בתכנון מסייע גם אלה

עשויה זה ביום. המחזור של estrus ביום נמצאו miR-145-ו miR-23b של נמוכות ביטוי רמות. בעכברה

זה ממצא. העובר השרשת להצלחת חיונית הביטוי ברמות הירידה כי יתכן. (44) בעכברה ההשרשה להתרחש

. (32) פוריות נשים לעומת RIF עם בנשים miR-145-ו miR-23b של בביטוי שנצפתה העליה את תואם

ומתן השחלות כריתת ידי-על, (delayed implantation) העובר של דחויה השרשה התבצעה בהן בעכברות

את מאפשר אשר לפרוגסטרון בנוסף אסטרוגן של פעמי-חד מתן ידי-על) ההשרשה של שפעול או( פרוגסטרון

. miR-145 (011)-ו miR-23b של בביטוי ירידה חלה העכברות של השניה בקבוצה כי נראה( העובר השרשת

בעכברה הרחם ברירית ההשרשה אתר בין miRNA של הביטוי פרופיל נבדק קבוצה אותה של אחר במחקר

ההשרשה באתר miR-145-ו miR-23b של הביטוי ברמות שינוי נמצא לא זה במחקר. רגילה רירית לבין

של בביטוי הווסת מחזור של השונות הפאזות בין הבדל מצא לא אנושיות רחם בדגימות מחקר. (010, 011)

miR-23b ו-miR-145 (013) .ה של הסקירה שיטת של מוגבלות בעקבות במחקר הטיה תתכן לפעמים-

miRNA ,של ביטוי עבור ספציפית בדיקה נדרשת ולכן miR-23b ו-miR-145 באישה הווסת מחזור פני על .

ביתר ביטויים אך, ההשרשה חלון עתב miR-145-ו miR-23b של בביטוי שינוי קיים לא כי יתכן, שני מצד

רירית של ייצוגיות דגימות נבחנו בעכברות שערכנו בניסוי. העובר השרשת להצלחת מפריע RIF עם בנשים

. היום במשך שונים מזמנים וכן השונים מהימים נוספות דגימות של בחינה תוך עליו לחזור יש ולכן הרחם

68

סיכום ומסקנות

נמצא ברירית הרחם של נשים עם כשלים חוזרים בהשרשה miR-145-ו miR-23bביטוי גבוה של

(Repeated Implantation Failure בהשוואה לביטוי בנשים פוריות. בעבודה זו נבחן תפקידם של )miR-

23b ו-miR-145 במודלin-vitro של השרשת העובר ונבחנהin-vivo תבנית התבטאותם ברחם העכברה

פרוליפרטיבית בשורות התאים של אפיתל -הינם בעלי פעילות אנטי microRNA-. שני הestrous-במחזור ה

הביא miR-145-ו miR-23bם ומבקרים גנים המעורבים בתהליך השרשת העובר. ביטוי ביתר של רירית הרח

ותהליך החדירה של ספירואידים דמויי עובר אל שורות התאים היצמדותלשינויים משמעותיים בהיקף תהליך ה

ב לירידה פי רו-בשורות התאים הביא על miR-145-ו miR-23bשל רירית הרחם. בנוסף, ביטוי ביתר של

בביטוי של גני מטרה פוטנציאליים אשר מעורבים במסלולים החשובים לתהליך השרשת העובר. נראה כי

microRNA ישיר את רמות הביטוי של -אלו מבקרים באופן לאE-cadherin ו-β-catenin אשר הינם ,

miR-145-ו miR-23bשל העובר ובתהליך החדירה. בנוסף, ביטוי ביתר של היצמדותמעורבים בתהליך ה

-miRבעכברה נמצא כי ביטוי estrous-. במחזור הERα לאסטרוגן קולטןותית בביטוי של ההניב ירידה משמע

23b ו-miR-145 .הינו נמוך ביום בו צפויה להתרחש השרשת העובר

מפריע להתנהלות תקינה של תהליך השרשת העובר. לכן miR-145-ו miR-23bממצאים אלו עולה כי ביטוי

יתכן כי השתקת הביטוי שלהם ברירית הרחם בעת חלון ההשרשה עשויה להועיל לקיום השרשה בנשים עם

אשר יקשר microRNAידי רצף משלים לאותם -כשלים חוזרים השרשה. השתקה זו יכולה להיעשות על

מצאים מנת לבסס מ-. עלmicroRNAידי התערבות פרמקולוגית אחרת בבקרת הביטוי של אותם -אליהם או על

של דרכי in-vivoאלו דרושים ניסויים נוספים בתרבית של תאים ראשוניים שמקורם ברירית הרחם וכן בחינה

טיפול אפשריות במודל של חיות.

69

ביביליוגרפיה

1. M.V. Iorioand C.M. Croce. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4:143-159 (2012).

2. R.C. Lee, R.L. Feinbaum, and V. Ambros. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75:843-854 (1993).

3. L.P. Lim, N.C. Lau, P. Garrett-Engele, A. Grimson, J.M. Schelter, J. Castle, D.P. Bartel, P.S. Linsley, and J.M. Johnson. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433:769-773 (2005).

4. D.P. Bartel. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116:281-297 (2004).

5. H. Achacheand A. Revel. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation. Hum Reprod Update. 12:731-746 (2006).

6. F. Dominguez, M. Yanez-Mo, F. Sanchez-Madrid, and C. Simon. Embryonic implantation and leukocyte transendothelial migration: different processes with similar players? FASEB J. 19:1056-1060 (2005).

7. S.K. Dey, H. Lim, S.K. Das, J. Reese, B.C. Paria, T. Daikoku, and H. Wang. Molecular cues to implantation. Endocr Rev. 25:341-373 (2004).

8. H. Achache, M. Formanski, M. Koler, S. Shteingart, A. Tsafrir, B. Tirosh, R. Reich, and A. Revel. Regulation of E-cadherin expression by estrogen receptor α (ERα) controls 1 endometrial carcinoma cell adhesiveness to JAR cell spheroids. (2013, submitted).

9. M. Plaisier. Decidualisation and angiogenesis. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25:259-271 (2011).

10. N. Lauferand A. Simon. Recurrent implantation failure: current update and clinical approach to an ongoing challenge. Fertil Steril. 97:1019-1020 (2012).

11. M.A. Santos, E.W. Kuijk, and N.S. Macklon. The impact of ovarian stimulation for IVF on the developing embryo. Reproduction. 139:23-34 (2010).

12. F. Simonstein. IVF policies with emphasis on Israeli practices. Health Policy. 97:202-208 (2010).

פרסום של מרכז המחקר והמידע של הכנסת: "מידע ונתונים בנושא פריון ומודעות לפוריות בישראל", .13

3103יוני 14. B.S. Shapiro, K.S. Richter, D.C. Harris, and S.T. Daneshmand. Dramatic declines in

implantation and pregnancy rates in patients who undergo repeated cycles of in vitro fertilization with blastocyst transfer after one or more failed attempts. Fertil Steril. 76:538-542 (2001).

15. A. Simonand N. Laufer. Assessment and treatment of repeated implantation failure (RIF). J Assist Reprod Genet. 29:1227-1239 (2012).

16. J. Rinehart. Recurrent implantation failure: definition. J Assist Reprod Genet. 24:284-287 (2007).

17. Y.E. Koot, G. Teklenburg, M.S. Salker, J.J. Brosens, and N.S. Macklon. Molecular aspects of implantation failure. Biochim Biophys Acta. 1822:1943-1950 (2012).

18. E.J. Margalioth, A. Ben-Chetrit, M. Gal, and T. Eldar-Geva. Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET. Hum Reprod. 21:3036-3043 (2006).

70

19. B. Bartoov, A. Berkovitz, F. Eltes, A. Kogosowski, Y. Menezo, and Y. Barak. Real-time fine morphology of motile human sperm cells is associated with IVF-ICSI outcome. J Androl. 23:1-8 (2002).

20. B. Almog, I. Levin, I. Wagman, R. Kapustiansky, T. Schwartz, N. Mey-Raz, A. Amit, and F. Azem. Interval double transfer improves treatment success in patients with repeated IVF/ET failures. J Assist Reprod Genet. 25:353-357 (2008).

21. V. Eyheremendy, F.G. Raffo, M. Papayannis, J. Barnes, C. Granados, and J. Blaquier. Beneficial effect of autologous endometrial cell coculture in patients with repeated implantation failure. Fertil Steril. 93:769-773 (2010).

22. M. Koler, H. Achache, A. Tsafrir, Y. Smith, A. Revel, and R. Reich. Disrupted gene pattern in patients with repeated in vitro fertilization (IVF) failure. Hum Reprod. 24:2541-2548 (2009).

23. A. Revel, H. Achache, J. Stevens, Y. Smith, and R. Reich. MicroRNAs are associated with human embryo implantation defects. Hum Reprod. 26:2830-2840 (2011).

24. X. Li, Y. Zhang, H. Zhang, X. Liu, T. Gong, M. Li, L. Sun, G. Ji, Y. Shi, Z. Han, S. Han, Y. Nie, X. Chen, Q. Zhao, J. Ding, K. Wu, and F. Daiming. miRNA-223 promotes gastric cancer invasion and metastasis by targeting tumor suppressor EPB41L3. Mol Cancer Res. 9:824-833 (2011).

25. L. Scapoli, A. Palmieri, L. Lo Muzio, F. Pezzetti, C. Rubini, A. Girardi, F. Farinella, M. Mazzotta, and F. Carinci. MicroRNA expression profiling of oral carcinoma identifies new markers of tumor progression. Int J Immunopathol Pharmacol. 23:1229-1234 (2010).

26. M.S. Zaman, S. Thamminana, V. Shahryari, T. Chiyomaru, G. Deng, S. Saini, S. Majid, S. Fukuhara, I. Chang, S. Arora, H. Hirata, K. Ueno, K. Singh, Y. Tanaka, and R. Dahiya. Inhibition of PTEN gene expression by oncogenic miR-23b-3p in renal cancer. PLoS One. 7:e50203 (2012).

27. M. Kowalewska, E. Bakula-Zalewska, M. Chechlinska, K. Goryca, A. Nasierowska-Guttmejer, A. Danska-Bidzinska, and M. Bidzinski. microRNAs in uterine sarcomas and mixed epithelial-mesenchymal uterine tumors: a preliminary report. Tumour Biol. 34:2153-2160 (2013).

28. H. Zhang, Y. Hao, J. Yang, Y. Zhou, J. Li, S. Yin, C. Sun, M. Ma, Y. Huang, and J.J. Xi. Genome-wide functional screening of miR-23b as a pleiotropic modulator suppressing cancer metastasis. Nat Commun. 2:554 (2011).

29. A.W. Tong, P. Fulgham, C. Jay, P. Chen, I. Khalil, S. Liu, N. Senzer, A.C. Eklund, J. Han, and J. Nemunaitis. MicroRNA profile analysis of human prostate cancers. Cancer Gene Ther. 16:206-216 (2009).

30. N. Yanaihara, N. Caplen, E. Bowman, M. Seike, K. Kumamoto, M. Yi, R.M. Stephens, A. Okamoto, J. Yokota, T. Tanaka, G.A. Calin, C.G. Liu, C.M. Croce, and C.C. Harris. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis. Cancer Cell. 9:189-198 (2006).

31. M.V. Iorio, M. Ferracin, C.G. Liu, A. Veronese, R. Spizzo, S. Sabbioni, E. Magri, M. Pedriali, M. Fabbri, M. Campiglio, S. Menard, J.P. Palazzo, A. Rosenberg, P. Musiani, S. Volinia, I. Nenci, G.A. Calin, P. Querzoli, M. Negrini, and C.M. Croce. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res. 65:7065-7070 (2005).

32. M.Z. Michael, O.C. SM, N.G. van Holst Pellekaan, G.P. Young, and R.J. James. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia. Mol Cancer Res. 1:882-891 (2003).

71

33. E.M. Ohlsson Teague, K.H. Van der Hoek, M.B. Van der Hoek, N. Perry, P. Wagaarachchi, S.A. Robertson, C.G. Print, and L.M. Hull. MicroRNA-regulated pathways associated with endometriosis. Mol Endocrinol. 23:265-275 (2009).

34. R. Spizzo, M.S. Nicoloso, L. Lupini, Y. Lu, J. Fogarty, S. Rossi, B. Zagatti, M. Fabbri, A. Veronese, X. Liu, R. Davuluri, C.M. Croce, G. Mills, M. Negrini, and G.A. Calin. miR-145 participates with TP53 in a death-promoting regulatory loop and targets estrogen receptor-alpha in human breast cancer cells. Cell Death Differ. 17:246-254 (2010).

35. T. Reyaand H. Clevers. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434:843-850 (2005).

36. J. Heubergerand W. Birchmeier. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2:a002915 (2010).

37. R.K. Jha, S. Titus, D. Saxena, P.G. Kumar, and M. Laloraya. Profiling of E-cadherin, beta-catenin and Ca(2+) in embryo-uterine interactions at implantation. FEBS Lett. 580:5653-5660 (2006).

38. C. Coutifaris, L.C. Kao, H.M. Sehdev, U. Chin, G.O. Babalola, O.W. Blaschuk, and J.F. Strauss, 3rd. E-cadherin expression during the differentiation of human trophoblasts. Development. 113:767-777 (1991).

39. N.H. Ingand M.B. Tornesi. Estradiol up-regulates estrogen receptor and progesterone receptor gene expression in specific ovine uterine cells. Biol Reprod. 56:1205-1215 (1997).

40. E.R. Fearon. Connecting estrogen receptor function, transcriptional repression, and E-cadherin expression in breast cancer. Cancer Cell. 3:307-310 (2003).

41. H. Kuramoto, S. Tamura, and Y. Notake. Establishment of a cell line of human endometrial adenocarcinoma in vitro. Am J Obstet Gynecol. 114:1012-1019 (1972).

42. C.J. Dawe, W.G. Banfield, W.D. Morgan, M.S. Slatick, and H.O. Curth. Growth in Continuous Culture, and in Hamsters, of Cells from a Neoplasm Associated with Acanthosis Nigricans. J Natl Cancer Inst. 33:441-456 (1964).

43. N.J. John, M. Linke, and H.W. Denker. Quantitation of human choriocarcinoma spheroid attachment to uterine epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 29A:461-468 (1993).

44. F.K. Marcondes, F.J. Bianchi, and A.P. Tanno. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Braz J Biol. 62:609-614 (2002).

45. N.J. Hannan, P. Paiva, E. Dimitriadis, and L.A. Salamonsen. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines? Biol Reprod. 82:235-245 (2010).

46. H. Uchida, T. Maruyama, S. Nishikawa-Uchida, H. Oda, K. Miyazaki, A. Yamasaki, and Y. Yoshimura. Studies using an in vitro model show evidence of involvement of epithelial-mesenchymal transition of human endometrial epithelial cells in human embryo implantation. J Biol Chem. 287:4441-4450 (2012).

47. F. Rahnama, B. Thompson, M. Steiner, F. Shafiei, P.E. Lobie, and M.D. Mitchell. Epigenetic regulation of E-cadherin controls endometrial receptivity. Endocrinology. 150:1466-1472 (2009).

48. E.N. Howe, D.R. Cochrane, and J.K. Richer. Targets of miR-200c mediate suppression of cell motility and anoikis resistance. Breast Cancer Res. 13:R45 (2011).

49. M.J. Lesmeister, R.L. Jorgenson, S.L. Young, and M.L. Misfeldt. 17Beta-estradiol suppresses TLR3-induced cytokine and chemokine production in endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol. 3:74 (2005).

72

50. S. Curtis Hewitt, E.H. Goulding, E.M. Eddy, and K.S. Korach. Studies using the estrogen receptor alpha knockout uterus demonstrate that implantation but not decidualization-associated signaling is estrogen dependent. Biol Reprod. 67:1268-1277 (2002).

51. M. Thieand H.W. Denker. In vitro studies on endometrial adhesiveness for trophoblast: cellular dynamics in uterine epithelial cells. Cells Tissues Organs. 172:237-252 (2002).

52. G. Maillot, M. Lacroix-Triki, S. Pierredon, L. Gratadou, S. Schmidt, V. Benes, H. Roche, F. Dalenc, D. Auboeuf, S. Millevoi, and S. Vagner. Widespread estrogen-dependent repression of micrornas involved in breast tumor cell growth. Cancer Res. 69:8332-8340 (2009).

53. T. Toloubeydokhti, Q. Pan, X. Luo, O. Bukulmez, and N. Chegini. The expression and ovarian steroid regulation of endometrial micro-RNAs. Reprod Sci. 15:993-1001 (2008).

54. M. Masuda, Y. Miki, S. Hata, K. Takagi, M. Sakurai, K. Ono, K. Suzuki, Y. Yang, E. Abe, H. Hirakawa, T. Ishida, T. Suzuki, N. Ohuchi, and H. Sasano. An induction of microRNA, miR-7 through estrogen treatment in breast carcinoma. J Transl Med. 10 Suppl 1:S2 (2012).

55. I. Mylonas, U. Jeschke, N. Shabani, C. Kuhn, A. Balle, S. Kriegel, M.S. Kupka, and K. Friese. Immunohistochemical analysis of estrogen receptor alpha, estrogen receptor beta and progesterone receptor in normal human endometrium. Acta Histochem. 106:245-252 (2004).

56. K. Yamagata, S. Fujiyama, S. Ito, T. Ueda, T. Murata, M. Naitou, K. Takeyama, Y. Minami, B.W. O'Malley, and S. Kato. Maturation of microRNA is hormonally regulated by a nuclear receptor. Mol Cell. 36:340-347 (2009).

57. X.Z.a.C.-W.W.B.-T.a.M. Jianzhen Xu, Dr.and M.A.M. (Ed.). Genome-Wide Identification of Estrogen Receptor Alpha Regulated miRNAs Using Transcription Factor Binding Data, Bioinformatics - Trends and Methodologies, Dr.Mahmood A. Mahdavi (Ed.)2011.

58. P. Sundareshanand M.J. Hendrix. Growth, morphologic, and invasive characteristics of early and late passages of a human endometrial carcinoma cell line (RL95-2). In Vitro Cell Dev Biol. 28A:544-552 (1992).

59. L. Shen, S. Yang, W. Huang, W. Xu, Q. Wang, Y. Song, and Y. Liu. MicroRNA23a and microRNA23b deregulation derepresses SF-1 and upregulates estrogen signaling in ovarian endometriosis. J Clin Endocrinol Metab. 98:1575-1582 (2013).

60. J.W. Kim, S. Mori, and J.R. Nevins. Myc-induced microRNAs integrate Myc-mediated cell proliferation and cell fate. Cancer Res. 70:4820-4828 (2010).

61. P. Gao, I. Tchernyshyov, T.C. Chang, Y.S. Lee, K. Kita, T. Ochi, K.I. Zeller, A.M. De Marzo, J.E. Van Eyk, J.T. Mendell, and C.V. Dang. c-Myc suppression of miR-23a/b enhances mitochondrial glutaminase expression and glutamine metabolism. Nature. 458:762-765 (2009).

62. J.P. Geisler, H.E. Geisler, K.J. Manahan, G.A. Miller, M.C. Wiemann, Z. Zhou, and W. Crabtree. Nuclear and cytoplasmic c-myc staining in endometrial carcinoma and their relationship to survival. Int J Gynecol Cancer. 14:133-137 (2004).

63. L.D. Odom, J.M. Barrett, C.G. Pantazis, L.D. Stoddard, and P.G. McDonough. Immunocytochemical study of ras and myc proto-oncogene polypeptide expression in the human menstrual cycle. Am J Obstet Gynecol. 161:1663-1668 (1989).

64. M.C. Johnson, M. Torres, A. Alves, K. Bacallao, A. Fuentes, M. Vega, and M.A. Boric. Augmented cell survival in eutopic endometrium from women with endometriosis: expression of c-myc, TGF-beta1 and bax genes. Reprod Biol Endocrinol. 3:45 (2005).

73

65. A.C. Davis, M. Wims, G.D. Spotts, S.R. Hann, and A. Bradley. A null c-myc mutation causes lethality before 10.5 days of gestation in homozygotes and reduced fertility in heterozygous female mice. Genes Dev. 7:671-682 (1993).

66. M. Sachdeva, S. Zhu, F. Wu, H. Wu, V. Walia, S. Kumar, R. Elble, K. Watabe, and Y.Y. Mo. p53 represses c-Myc through induction of the tumor suppressor miR-145. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:3207-3212 (2009).

67. Z. Chen, H. Zeng, Y. Guo, P. Liu, H. Pan, A. Deng, and J. Hu. miRNA-145 inhibits non-small cell lung cancer cell proliferation by targeting c-Myc. J Exp Clin Cancer Res. 29:151 (2010).

68. A. Galan, J.E. O'Connor, D. Valbuena, R. Herrer, J. Remohi, S. Pampfer, A. Pellicer, and C. Simon. The human blastocyst regulates endometrial epithelial apoptosis in embryonic adhesion. Biol Reprod. 63:430-439 (2000).

69. S. Pampferand I. Donnay. Apoptosis at the time of embryo implantation in mouse and rat. Cell Death Differ. 6:533-545 (1999).

70. M.A. Castilla, G. Moreno-Bueno, L. Romero-Perez, K. Van De Vijver, M. Biscuola, M.A. Lopez-Garcia, J. Prat, X. Matias-Guiu, A. Cano, E. Oliva, and J. Palacios. Micro-RNA signature of the epithelial-mesenchymal transition in endometrial carcinosarcoma. J Pathol. 223:72-80 (2011).

71. S. Majid, A.A. Dar, S. Saini, G. Deng, I. Chang, K. Greene, Y. Tanaka, R. Dahiya, and S. Yamamura. MicroRNA-23b functions as a tumor suppressor by regulating Zeb1 in bladder cancer. PLoS One. 8:e67686 (2013).

72. L. Pellegrino, J. Stebbing, V.M. Braga, A.E. Frampton, J. Jacob, L. Buluwela, L.R. Jiao, M. Periyasamy, C.D. Madsen, M.P. Caley, S. Ottaviani, L. Roca-Alonso, M. El-Bahrawy, R.C. Coombes, J. Krell, and L. Castellano. miR-23b regulates cytoskeletal remodeling, motility and metastasis by directly targeting multiple transcripts. Nucleic Acids Res. 41:5400-5412 (2013).

73. S. Majid, A.A. Dar, S. Saini, S. Arora, V. Shahryari, M.S. Zaman, I. Chang, S. Yamamura, Y. Tanaka, G. Deng, and R. Dahiya. miR-23b represses proto-oncogene Src kinase and functions as methylation-silenced tumor suppressor with diagnostic and prognostic significance in prostate cancer. Cancer Res. 72:6435-6446 (2012).

74. A. Salvi, C. Sabelli, S. Moncini, M. Venturin, B. Arici, P. Riva, N. Portolani, S.M. Giulini, G. De Petro, and S. Barlati. MicroRNA-23b mediates urokinase and c-met downmodulation and a decreased migration of human hepatocellular carcinoma cells. FEBS J. 276:2966-2982 (2009).

75. S. Tulac, N.R. Nayak, L.C. Kao, M. Van Waes, J. Huang, S. Lobo, A. Germeyer, B.A. Lessey, R.N. Taylor, E. Suchanek, and L.C. Giudice. Identification, characterization, and regulation of the canonical Wnt signaling pathway in human endometrium. J Clin Endocrinol Metab. 88:3860-3866 (2003).

76. R.L. Jones, C. Stoikos, J.K. Findlay, and L.A. Salamonsen. TGF-beta superfamily expression and actions in the endometrium and placenta. Reproduction. 132:217-232 (2006).

77. T.D. King, W. Zhang, M.J. Suto, and Y. Li. Frizzled7 as an emerging target for cancer therapy. Cell Signal. 24:846-851 (2012).

78. C.W. Cheng, S.K. Smith, and D.S. Charnock-Jones. Transcript profile and localization of Wnt signaling-related molecules in human endometrium. Fertil Steril. 90:201-204 (2008).

79. N. Chegini, Y. Zhao, R.S. Williams, and K.C. Flanders. Human uterine tissue throughout the menstrual cycle expresses transforming growth factor-beta 1 (TGF beta 1), TGF beta 2, TGF

74

beta 3, and TGF beta type II receptor messenger ribonucleic acid and protein and contains [125I]TGF beta 1-binding sites. Endocrinology. 135:439-449 (1994).

80. Q. Pan, X. Luo, T. Toloubeydokhti, and N. Chegini. The expression profile of micro-RNA in endometrium and endometriosis and the influence of ovarian steroids on their expression. Mol Hum Reprod. 13:797-806 (2007).

81. Y. Wu, S. Liu, H. Xin, J. Jiang, E. Younglai, S. Sun, and H. Wang. Up-regulation of microRNA-145 promotes differentiation by repressing OCT4 in human endometrial adenocarcinoma cells. Cancer. 117:3989-3998 (2011).

82. G. La Rocca, M. Badin, B. Shi, S.Q. Xu, T. Deangelis, L. Sepp-Lorenzinoi, and R. Baserga. Mechanism of growth inhibition by MicroRNA 145: the role of the IGF-I receptor signaling pathway. J Cell Physiol. 220:485-491 (2009).

83. W.C. Cho, A.S. Chow, and J.S. Au. MiR-145 inhibits cell proliferation of human lung adenocarcinoma by targeting EGFR and NUDT1. RNA Biol. 8:125-131 (2011).

84. M. Fuse, N. Nohata, S. Kojima, S. Sakamoto, T. Chiyomaru, K. Kawakami, H. Enokida, M. Nakagawa, Y. Naya, T. Ichikawa, and N. Seki. Restoration of miR-145 expression suppresses cell proliferation, migration and invasion in prostate cancer by targeting FSCN1. Int J Oncol. 38:1093-1101 (2011).

85. M. Gotte, C. Mohr, C.Y. Koo, C. Stock, A.K. Vaske, M. Viola, S.A. Ibrahim, S. Peddibhotla, Y.H. Teng, J.Y. Low, K. Ebnet, L. Kiesel, and G.W. Yip. miR-145-dependent targeting of junctional adhesion molecule A and modulation of fascin expression are associated with reduced breast cancer cell motility and invasiveness. Oncogene. 29:6569-6580 (2010).

86. N. Yamada, S. Noguchi, T. Mori, T. Naoe, K. Maruo, and Y. Akao. Tumor-suppressive microRNA-145 targets catenin delta-1 to regulate Wnt/beta-catenin signaling in human colon cancer cells. Cancer Lett. 335:332-342 (2013).

87. P. Gao, A.Y. Xing, G.Y. Zhou, T.G. Zhang, J.P. Zhang, C. Gao, H. Li, and D.B. Shi. The molecular mechanism of microRNA-145 to suppress invasion-metastasis cascade in gastric cancer. Oncogene. 32:491-501 (2013).

88. M. Sachdevaand Y.Y. Mo. MicroRNA-145 suppresses cell invasion and metastasis by directly targeting mucin 1. Cancer Res. 70:378-387 (2010).

89. J. Hu, H. Guo, H. Li, Y. Liu, J. Liu, L. Chen, J. Zhang, and N. Zhang. MiR-145 regulates epithelial to mesenchymal transition of breast cancer cells by targeting Oct4. PLoS One. 7:e45965 (2012).

90. L.D. Roy, M. Sahraei, D.B. Subramani, D. Besmer, S. Nath, T.L. Tinder, E. Bajaj, K. Shanmugam, Y.Y. Lee, S.I. Hwang, S.J. Gendler, and P. Mukherjee. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30:1449-1459 (2011).

91. G.M. Arndt, L. Dossey, L.M. Cullen, A. Lai, R. Druker, M. Eisbacher, C. Zhang, N. Tran, H. Fan, K. Retzlaff, A. Bittner, and M. Raponi. Characterization of global microRNA expression reveals oncogenic potential of miR-145 in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 9:374 (2009).

92. B. Tsuchiya, Y. Sato, T. Kameya, I. Okayasu, and K. Mukai. Differential expression of N-cadherin and E-cadherin in normal human tissues. Arch Histol Cytol. 69:135-145 (2006).

93. J.S. Dickey, C.E. Redon, A.J. Nakamura, B.J. Baird, O.A. Sedelnikova, and W.M. Bonner. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118:683-692 (2009).

75

94. N. Srivastava, S. Gochhait, P. Gupta, and R.N. Bamezai. Copy number alterations of the H2AFX gene in sporadic breast cancer patients. Cancer Genet Cytogenet. 180:121-128 (2008).

95. K. Lai Wing Sun, J.P. Correia, and T.E. Kennedy. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138:2153-2169 (2011).

96. M. Dakouane-Giudicelli, C. Duboucher, J. Fortemps, S. Salama, A. Brule, P. Rozenberg, and P. de Mazancourt. Identification and localization of netrin-4 and neogenin in human first trimester and term placenta. Placenta. 33:677-681 (2012).

97. S.K. Das. Cell cycle regulatory control for uterine stromal cell decidualization in implantation. Reproduction. 137:889-899 (2009).

98. B. Chenand J.W. Pollard. Cyclin D2 compensates for the loss of cyclin D1 in estrogen-induced mouse uterine epithelial cell proliferation. Mol Endocrinol. 17:1368-1381 (2003).

99. J. Stenvang, A. Petri, M. Lindow, S. Obad, and S. Kauppinen. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3:1 (2012).

100. R.W. Su, W. Lei, J.L. Liu, Z.R. Zhang, B. Jia, X.H. Feng, G. Ren, S.J. Hu, and Z.M. Yang. The integrative analysis of microRNA and mRNA expression in mouse uterus under delayed implantation and activation. PLoS One. 5:e15513 (2010).

101. S.J. Hu, G. Ren, J.L. Liu, Z.A. Zhao, Y.S. Yu, R.W. Su, X.H. Ma, H. Ni, W. Lei, and Z.M. Yang. MicroRNA expression and regulation in mouse uterus during embryo implantation. J Biol Chem. 283:23473-23484 (2008).

102. S. Kuokkanen, B. Chen, L. Ojalvo, L. Benard, N. Santoro, and J.W. Pollard. Genomic profiling of microRNAs and messenger RNAs reveals hormonal regulation in microRNA expression in human endometrium. Biol Reprod. 82:791-801 (2010).

Embryo Implantation Possible Involvement of miRNA-23band...

Documents

Transcript of Embryo Implantation Possible Involvement of miRNA-23band...