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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
YGOR RAPHAEL GOMES ELOY
PAPEL DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO NA INTERAÇÃO DO FEIJÃO-DE-CORDA [Vigna unguiculata (L.) Walp.] COM O FUNGO Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [TELEOMORFO: Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. & von Schrenk]
FORTALEZA – CEARÁ 2007
YGOR RAPHAEL GOMES ELOY
PAPEL DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO NA INTERAÇÃO DO FEIJÃO-DE-CORDA [Vigna unguiculata (L.) Walp.] COM O FUNGO Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [TELEOMORFO: Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. & von Schrenk]
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira
FORTALEZA – CEARÁ 2007
E42p Eloy, Ygor Raphael Gomes Papel do peróxido de hidrogênio na interação do feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] com o fungo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [teleomorfo: Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. & von Schrenk] [manuscrito] / Ygor Raphael Gomes Eloy
137 f. : il. color. ; enc.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007 Orientador: José Tadeu Abreu de Oliveira Área de concentração: Bioquímica
1. Vigna unguiculata 2. Colletotrichum gloeosporioides 3. ITS 4. Explosão oxidativa 5. H2O2 I. Oliveira, José Tadeu Abreu de (orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Mestrado em Bioquímica III. Título
CDD 574.192
YGOR RAPHAEL GOMES ELOY
PAPEL DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO NA INTERAÇÃO DO FEIJÃO-DE-CORDA [Vigna unguiculata (L.) Walp.] COM O FUNGO Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [TELEOMORFO: Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. & von Schrenk]
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em bioquímica.
Aprovada em 04 de maio de 2007.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira Universidade Federal do Ceará
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (Orientador da Dissertação)
________________________________________ Dr. Enéas Gomes Filho
Universidade Federal do Ceará Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
(Examinadora)
________________________________________ Dra. Ana Lúcia Horta Barreto
Centro Nacional de Pesquisa do Meio-Norte EMBRAPA Meio-Norte
(Examinadora)
Em muitos momentos de minha vida,
busquei pelas coisas que realmente achei que valia a pena.
Nessa jornada,
muitas pessoas ajudaram-me,
acolheram-me.
Hoje,
dedico este trabalho
a estas pessoas,
que sempre acreditaram
no que eu ia contar
no livro da Vida.
AGRADECIMENTOS
De forma especial ao professor Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira, pela sua
orientação, amizade, dedicação e, além de tudo, por ter acreditado sempre em
meu potencial.
À Dra. Ana Lúcia Horta Barreto, pelos inesquecíveis ensinamentos e
dedicação a minha formação, assim como, pela nossa grande amizade e
participação na avaliação deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Enéas Gomes Filho, pela disponibilidade, pelo apoio e
participação na avaliação deste trabalho.
À professora Ilka Maria Vasconcelos, pela amizade, colaboração e
disponibilidade sempre demonstradas.
Ao Dr. Francisco Rodrigues Freire Filho, por ter doado as sementes de
feijão-de-corda para fins experimentais.
À professora Dra. Vânia Maria Maciel Melo, pelos consideráveis
ensinamentos de Microbiologia e por ter despertado a paixão que tenho pela área.
Além disso, agradeço por ter disponibilizado o fungo (hoje identificado)
Colletotrichum gloeosporioides para o estudo.
Ao professor Dr. Talles Grangeiro Barbosa, pelos ensinamentos de Biologia
Molecular e por ter disponibilizado seu laboratório e equipamentos para a
identificação do fungo.
À Aparecida Simone, por ter participado como peça fundamental no meu
aprendizado, desde como lavar uma vidraria até como elaborar um experimento.
Ao José Edvar e Thiago Matos, pelo apoio e companheirismo nas horas
intermináveis de nossos afazeres científicos.
À Hévila e Betânia, por estar sempre de prontidão em apoiar e dar
sugestões importantes para o trabalho.
Ao Silvio e ao Hélio, pelo companheirismo descontraído, alegre e
conveniente, nos momentos empolgantes da vida acadêmica.
À Gabriela, pela amizade, companheirismo, cooperação e contribuição
notável para este trabalho.
À Mayra, pela amizade, pelo carinho e pelos momentos fervorosos de
discussão sobre pesquisa.
Ao Fredy e Fernando, pela amizade e companheirismo sempre
manifestados.
Aos demais amigos do Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa
(ausentes e presentes), Adem, Alethéia, Aline, Eduardo, Ana Maria, Antoniella,
Cléberson, Djane, Gina, Ivna, Júlio, Lara, Mayra, Magalline, Neílza, Raíssa,
Vadjah Cristine e Waneska.
Aos estudantes e amigos do Laboratório de Toxinas Vegetais (presentes e
ausentes), Andréa, Cláudio, Daniele, Elisângela, Fernanda, Geórgia, Henrique,
Isabel, Janne Keila, Juliana, Ricristhi, Silvinha e Hermógenes.
Ao Abdul, pela condizente amizade e companheirismo por ele
demonstrado.
Aos amigos do Laboratório de Fisiologia Vegetal, chefiado pelo Prof. Dr.
Enéas Gomes. Em especial ao Carlos Eduardo (Sagat), pela amizade,
companheirismo e pela imensa contribuição que por ele foi manifestada ao meu
trabalho.
Ao Prof. Dr. Joaquim Enéas, pelos imprescindíveis ensinamentos de
Fisiologia Vegetal.
Aos amigos do Bioplant, sob coordenação do Prof. Dr. Francisco Campos,
em especial ao Fábio, Emanuel, Emanuele, Tiago, Camila, Juliana Vaz e Juliana
Brasil.
Aos integrantes do Laboratório de Metabolismo de Plantas, chefiado pelo
prof. Albenísio, em especial ao Sérgio, Luis, Cristine e Eduardo.
Aos integrantes do Laboratório coordenado pelo Prof. Dr. Márcio Viana, em
especial ao Cléverson e Jefferson.
Aos integrantes do Laboratório coordenado pela Prof. Dra. Norma
Benevides, em especial à Luana.
Aos professores e amigos, Fábio Rossi e Cristina.
Aos demais professores, funcionários e colegas do DBBM
De maneira muita especial, à Ana Lúcia da Silva de Almeida e Wagner
Barbosa de Almeida pelo inesquecível apoio e amizade, que sempre foi a mim
concedido. A estas pessoas, dedico este trabalho como forma simbólica dos
frutos que estou colhendo graças a eles.
Aos meus pais, Francisco Carlos Eloy e Francisca Gomes Eloy, pela
maravilhosa educação que recebi e pelo crédito que a mim sempre foi depositado.
Apesar da distância Quixeramobim-Fortaleza foi possível que fizessem parte do
meu aprendizado e amadurecimento profissional.
À minha irmã, Karla Patrícia Gomes Eloy, pela confiança em conseguir
conquistar os meus ideais.
As minhas avós, Maria Eloy e Maria Medeiros, pelas orações, pelo amor e
carinho que foram a mim concedidos.
As minhas tias, tios, primos, primas e demais familiares por sempre
acreditar na minha força.
À Cecília Araújo da Silva, pela paciência, carinho e companheirismo que a
mim foram atribuídos durante o período em que estive realizando os meus
trabalhos acadêmicos no mestrado.
Aos meus amigos, Elton, Irla, Iramisto, Juliana, Baiano, Carmelita, Manoel
(Comparsa), Tia Celma, Fabiano, Paula Andréia, Joice, Daniel Vasconcelos,
Liduína, Jeferson Almeida, Júnior Almeida, Vicente, Leopoldo, Zilah, Domingos,
Anísia, Robson, Rui, Rubens, Sávio, Lucivanda, Aline, Karine, Dalva, Bosco,
Alenilda, Tia Lúcia, Igor Banholi, Gregório Banholi e todos os que neste momento
não recordo, mas com toda convicção, participaram na minha vida como peças
importantes para a lapidação e o polimento de minha pessoa.
Aos meus afilhados Samuel e Otávio, que este trabalho seja para vocês um
exemplo de atitude, força e perseverança. Assim, estudem para conquistar um
lugar ao sol.
Aos meus amigos, Geovane, Valdé, Fábio, Paulo, Thalita, Fátima, Paula,
Francisco, Rejane, Roseane, Maria Luíza, Marquinho, Marcão, pela grande
amizade que conquistei logo quando cheguei à cidade de Fortaleza.
Aos meus amigos e companheiros, Xavier e Catarina Riveiro, pela
amizade, confiança e ensinamentos.
Aos demais amigos, familiares, colegas e condiscípulos que contribuíram
direta e indiretamente para a execução deste trabalho.
MUITO OBRIGADO !!!!!!
Este trabalho foi possível graças ao auxílio das seguintes instituições:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES/PICD).
Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP).
Banco do Nordeste do Brasil (BNB).
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências,
Universidade federal do Ceará, Fortaleza – CE.
Departamento de Biologia, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará,
Fortaleza – CE.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................... xii
RESUMO..................................................................................................... xvii
ABSTRACT................................................................................................. xviii
1. INTRODUÇÃO.............................................................................. 1
1.1. Plantas, Agricultura e Crescimento Populacional......................... 1
1.2. O Feijão-de-corda......................................................................... 4
1.3. Colletotrichum............................................................................... 6
1.4. Estratégias de Infecção de Espécies de Colletotrichum............... 9
1.5. Respostas de Defesa de Plantas a Patógenos............................ 14
1.5.1. Compostos de Defesa Pré-Formados.......................................... 15
1.5.2. Percepção, Transdução de Sinal e Indução de Defesa............... 16
1.5.3. Produção de ROS e Explosão Oxidativa...................................... 19
1.5.4. H2O2.............................................................................................. 21
1.5.5. Mecanismos Antioxidantes Não-Enzimáticos............................... 25
1.5.6. Mecanismos Antioxidantes Enzimáticos....................................... 26
1.5.6.1. Dismutase do Superóxido (SOD; EC 1.15.1.1.)............................ 26
1.5.6.2. Peroxidase do Ascorbato (APX; EC 1.11.1.11)........................... 27
1.5.6.3. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6.)....................................................... 28
2. OBJETIVOS................................................................................. 29
2.1. Objetivo Geral.............................................................................. 29
2.2. Objetivos Específicos................................................................... 30
3. MATERIAIS.................................................................................. 31
3.1. Sementes...................................................................................... 31
3.2. Fungo............................................................................................ 31
3.3. Materiais para Certificação do Fungo........................................... 31
3.4. Reagentes Químicos.................................................................... 32
4. MÉTODOS.................................................................................... 33
4.1. Identificação do Fungo.................................................................. 33
4.1.1. Purificação do DNA genômico...................................................... 33
4.1.2. Reação em cadeia da DNA polimerase e Seqüenciamento dos
Fragmentos Amplificados............................................................. 34
4.1.3. Montagem dos Fragmentos Obtidos, Alinhamento e Edição da
Seqüência.....................................................................................
36
4.2. Obtenção dos Esporos................................................................. 37
4.3. Tratamento e Germinação das Sementes.................................... 37
4.4. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com
Substâncias Farmacológicas........................................................
40
4.5. Determinação do Teor de Peróxido de Hidrogênio....................... 42
4.5.1. Determinação Quantitativa........................................................... 42
4.5.2. Determinação Qualitativa.............................................................. 43
4.6. Peroxidação de Lipídios (Formação do Complexo MDA-TBA)..... 44
4.7. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com
Substâncias Farmacológicas e Inoculação com o Fungo C.
gloeosporiodes..............................................................................
45
4.8. Análises Macroscópicas................................................................ 45
4.9. Análises Microscópicas................................................................. 45
4.9. Delineamento Experimental.......................................................... 47
5. RESULTADOS.............................................................................. 48
5.1. Identificação do Fungo.................................................................. 48
5.2. Tratamento com AS...................................................................... 48
5.2.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e
Peroxidação de Lipídios................................................................
48
5.2.2. Análises Macroscópicas................................................................ 55
5.2.3. Análises Microscópicas................................................................. 58
5.3. Tratamento com Oxidase da Glucose (GO) + Glucose
(G).................................................................................................
64
5.3.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e
Peroxidação de Lipídios................................................................
64
5.3.2. Análises Macroscópicas................................................................ 67
5.3.3. Análises Microscópicas................................................................. 71
5.4. Tratamento com CAT.................................................................... 74
5.4.1.
Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e
Peroxidação de Lipídios................................................................ 74
5.4.2. Análises Macroscópicas................................................................ 75
5.4.3. Análises Microscópicas................................................................. 80
5.5. Tratamento com Cloreto de Difenilenoiodônio (DPI) ................... 82
5.5.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e
Peroxidação de Lipídios................................................................
82
5.5.2. Análises Macroscópicas................................................................ 83
5.5.3. Análises Microscópicas................................................................ 89
6. DISCUSSÃO................................................................................ 91
7. CONCLUSÃO.............................................................................. 101
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................. 102
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁG.
1.1 Estratégias de infecção adotadas por espécies de
Colletotrichum.
13
4.1 Representação esquemática da organização dos genes de
rDNA, em eucariontes, e do anelamento dos
oligonucleotídeos ITS-4 e ITS-5 nas suas respectivas
regiões.
35
4.2 Tratamento e germinação das sementes de feijão-de-corda,
genótipo BR-3.
39
4.3 Folhas primárias de feijão-de-corda infiltradas com
substâncias farmacológicas, atingindo uma área de 1 – 2
cm2 de infiltração.
41
5.1 Seqüência consenso completa da região ITS-1, 5,8S, ITS-2
do fungo C. gloeosporioides com um comprimento total de
558 pb.
49
5.2 Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-
corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas
em diferentes tempos após tratamentos com H2O e com
soluções de ácido salicílico (AS) em diferentes
concentrações. Valores basais de H2O2 em folhas que não
receberam tratamento nenhum são, também, apresentados.
50
5.3 Detalhe do acúmulo de H2O2 em folhas primárias
destacadas de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.],
genótipo BR-3, visualizado através da polimerização de
DAB, depois de tratadas com: (A) - H2O, 2 horas após
tratamento (hat); (B) - H2O, 12 hat; (C) – 5,0 mM de ácido
salicílico (AS), 2 hat; e (D) – 5,0 mM de AS, 12 hat.
52
5.4 Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-
de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
visualizado através da polimerização de DAB.
53
5.5 Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
analisadas em diferentes tempos, após tratamentos com
H2O e 5,0 mM de ácido salicílico (AS).
54
5.6 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0
mM de ácido salicílico (AS) e inoculadas com esporos de C.
gloeosporioides.
56
5.7 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com H2O e
inoculadas com esporos de C. gloeosporioides.
57
5.8 Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
observado por microscopia de luz.
60
5.9 Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
tratadas com H2O, observado por microscopia de luz.
61
5.10 Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
tratadas com H2O, observado por microscopia de luz.
62
5.11 Desenvolvimento do fungo C. gloeosporioides nas folhas
primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.],
genótipo BR-3, tratadas com 5,0 mM de ácido salicílico (AS),
observado por microscopia de luz.
63
5.12 Teores de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas em
diferentes tempos, após tratamentos com tampão fosfato e
com diferentes concentrações de GO + 2,0 mM de G.
65
5.13 Detalhe do acúmulo de H2O2 através da visualização da
polimerização de DAB em folhas primárias de feijão-de-
corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após
tratamento com: (A) – Tampão fosfato 50 mM, pH 6,5, 2
horas após tratamento (hat); (B) – Tampão fosfato 50 mM,
pH 6,5, 12 hat; (C) – 200,0 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 2
hat; (D) – 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 12 hat.
66
5.14 Concentrações de Malonaldeído (MDA) de extratos de folhas
primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.],
genótipo BR-3, coletadas em diferentes tempos após
tratamentos com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e 200 U
mL-1 de GO + 2,0 mM de G.
68
5.15 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 200 U
mL-1 de GO + 2,0 mM de G e inoculadas com esporos de C.
gloeosporioides.
69
5.16 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com tampa
fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e inoculadas com esporos de C.
gloeosporioides.
70
5.17 Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
infiltradas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, observado
por microscopia de luz.
73
5.18 Teores de H2O2 em folhas primárias destacadas de feijão-
de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
analisadas em diferentes tempos após tratamentos com
tampão fosfato e com soluções de diferentes concentrações
de CAT. Valores basais de H2O2 em plantas que não
receberam tratamento nenhum são, também, apresentados.
76
5.19 Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-
de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após
tratamento com 2000 U mL-1 de CAT, através da
visualização da polimerização de DAB.
77
5.20 Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
analisadas em diferentes tempos após tratamento com
tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5, e 2000 U mL-1 de CAT.
78
5.21 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 2000
U mL-1 de CAT e inoculadas com esporos de C.
gloeosporioides.
79
5.22 Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
infiltradas com 2000 U mL-1 de CAT, observado por
microscopia de luz.
81
5.23 Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-
corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas
em diferentes tempos após tratamento com soluções de
diferentes concentrações de DMSO e de DPI. Valores basais
de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum
são, também, apresentados.
84
5.24 Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-
de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após
tratamento com 0,050% (v/v) de DMSO, 2 (A) e 12 (B) horas
após tratamento (hat) e 5,0 µM de DPI, 2 hat (C) e 12 hat
(D), através da visualização da polimerização de DAB.
85
5.25 Concentrações de malonaldeído (MDA) de extratos de folhas
primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.],
genótipo BR-3, analisadas em diferentes tempos após
tratamentos com 0,050 % (v/v) de DMSO e 5,0 µM de DPI.
86
5.26 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0
µM de DPI e inoculadas com esporos de C. gloeosporioides.
87
5.27 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 0,050
% (v/v) de DMSO e inoculadas com esporos de C.
gloeosporioides.
88
5.28 Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,
infiltradas com 5,0 µM de DPI, observadas por microscopia
de luz.
90
RESUMO
Feijão-de-corda é um importante legume presente na região Nordeste do Brasil e
sua produção é afetada por fungos do gênero Colletotrichum. Estes fungos são
conhecidos por causar antracnose em uma grande variedade de plantas. Além
disso, o acúmulo rápido e transiente de espécies reativas de oxigênio, nomeado
de ‘explosão oxidativa’, é uma das primeiras reações observáveis em células de
plantas diante infecção microbiana. Como H2O2 produzido por plantas é
conhecido por apresentar efeitos antimicrobianos diretos, foi levantada a hipótese
de que alterações em suas concentrações induzidas por substâncias
farmacológicas poderiam conferir resistência do genótipo de feijão-de-corda, BR-
3-Tracuateua, ao ataque do fungo C. gloeosporioides. Deste modo, sementes
foram semeadas em papéis Germistest® umedecidos e, depois de 4 dias,
plântulas foram transferidas para solução hidropônica. Passados oito dias, as
folhas primárias foram cortadas, infiltradas com glucose oxidase (GO+G), ácido
salicílico (AS), catalase (CAT) e cloreto de difenilenoiodônio (DPI), transferidas
para placas de Petri e inoculadas com suspensão do fungo ajustada para
concentração de 2,0 x 105 esporos mL-1. Em seguida, as folhas foram mantidas
no escuro e foram coletadas em 2, 12 e 24 horas para análise de peróxido de
hidrogênio e peroxidação de lipídios. Outros grupos de folhas também foram
infiltrados com as mesmas substâncias para análises macroscópicas e
microscópicas do desenvolvimento do fungo sendo, no entanto, coletadas em 12,
24, 48 e 72 horas. Folhas tratadas com GO+G e AS mostraram 144,96 e 186,05
nmol H2O2 g-1 de massa fresca (MF), respectivamente, e o fungo apresentou
estratégia subcuticular, intramural necrotrófica, formando hifas secundárias
associadas com ágil crescimento e rápida morte das células hospedeiras. Nas
folhas tratadas com AS, foi observada peroxidação de lipídios e ausência de
apressórios melanizados. Contudo, folhas tratadas com CAT e DPI apresentaram
55,50 nmol H2O2 g-1 MF e, o fungo, mostrou modo de infecção hemibiotrófico,
com vesículas globulares e formação de hifas primárias e secundárias. Todos os
resultados sugerem que, apesar do H2O2 tenha influenciado diretamente o modo
de infecção do fungo, este não conferiu resistência no feijão-de-corda ao C.
gloeosporioides.
Palavras-chave: Vigna unguiculata, Colletotrichum gloeosporioides, ITS, explosão
oxidativa, H2O2.
ABSTRACT
Cowpea is an important legume of the Northeast of Brazil and its yield is affected
by Colletotrichum fungi. These fungi are known to occur on and cause disease
anthracnose on the broad range of plants. In addition, the rapid and transient
accumulation of reactive oxygen species, termed ‘oxidative burst’, is one of the
earliest observable reaction of plant cells to microbial infection. As plant H2O2 is
believed to have direct antimicrobial effects on pathogens it was raised the
hypothesis that alteration of H2O2 concentrations by pharmacological compounds
could confer differences in susceptibility of the cowpea genotype BR-3-Tracuateua
to C. gloeosporioides attack. Thus, seeds were germinated on humid Germitest®
paper and after four days seedlings were transferred to hydroponic solution. Eight
days later, the primary leaves were excised, infiltrated with glucose oxidase
(GO+G), salicylic acid (AS), catalase (CAT) and diphenyleneiodonium chloride
(DPI) transferred to Petri dishes and inoculated with 2.0 x 105 spores mL-1 fungal
suspension on the adaxial surface. After, leaves were placed in darkness and
collected at 2, 12 and 24 hours for hydrogen peroxide and lipid peroxidation
analysis. Infiltration with pharmacological compounds were carried out on the
another leaves to observe the macroscopic and microscopic alterations during the
infection process. The leaves were collected at 12, 24, 48 and 72 hours. By GO+G
and SA leaf treatments showed 144.96 and 186.05 nmol H2O2 g-1 fresh mass (FM),
respectively, and the fungus presented a subcuticular, intramural necrotrophic
strategy, forming secondary hyphae associated with a quick spread and a rapid
killing of the host cells. On the leaves treated with SA, it was observed lipid
peroxidation and the absence of melanized appresoria. However, CAT and DPI
treatment leaves presented 55.50 nmol H2O2 g-1 FM and the fungus showed
hemibiotrophic infection-type, with globular vesicles and primary and secondary
hyphae formation. All results suggest that despite H2O2 influenced directly the
fungal infection process-type it does not confer resistance of cowpea to C.
gloeosporioides.
Key words: Vigna unguiculata, Colletotrichum gloeosporioides, ITS, oxidative
burst, H2O2.
1 - INTRODUÇÃO
1.1. Plantas, Agricultura e Crescimento Populacional
Quando se fala sobre plantas pode-se pensar em uma infinidade de itens
relacionados: materiais de construção, fibras têxteis, perfumes, drogas,
combustíveis, cosméticos e, principalmente, alimento. Isto porque a história da
humanidade pode ser contada através de uma estreita interação do homem com
as plantas (NORSTOG e LONG, 1976).
Os antigos representantes do gênero Homo provavelmente subsistiram
basicamente da coleta de alimentos (apanhando frutos e sementes; coletando
ramos e folhas comestíveis; e cavando para a coleta de raízes), da alimentação a
partir de animais mortos e, ocasionalmente, da caça. Intempéries ambientais
como as glaciações era um bom motivo para que ocorressem migrações entre os
povos à procura de alimento. Porém, as migrações diminuíram drasticamente com
o advento da agricultura (RAVEN et al., 1992).
Estudos evidenciam que a agricultura teve sua origem a cerca de 12000
anos antes de Cristo, nas regiões montanhosas de clima semi-árido da Antiga
Mesopotâmia, atual Iraque (SANTANA, 2005). Por essa época, aquela região era
conhecida como Crescente Fértil. Desde então, as plantas têm influenciado a vida
de nossa espécie tanto nos aspectos sociais, como políticos e econômicos. Os
cereais, por exemplo, foram as primeiras plantas cultivadas desde o início da
agricultura. Essas plantas são ricas fontes de carboidratos, enquanto que as
leguminosas são abundantes fontes protéicas (NORSTOG e LONG, 1976;
RAVEN et al., 1992).
No entanto, um surto de aceleração na população mundial aconteceu no
começo da idade neolítica. Uma vez que a maioria dos grupos humanos se tornou
sedentária devido à agricultura, não mais havia a necessidade urgente de limitar o
número de nascimentos; as crianças devem ter-se tornado um componente mais
ativo para as suas famílias do que anteriormente, colaborando nas atividades
agrícolas e outros afazeres (SANTANA, 2005). Isto difere de populações que
sobrevivem da caça, pois apresentam uma característica notável que é de limitar
rigorosamente o seu próprio número (RAVEN et al., 1992).
A humanidade desenvolveu a agricultura, novas tecnologias apareceram e
a humanidade continuou a crescer. Enquanto que na época pleistocênica a
população mundial não ultrapassava os 5 milhões, hoje somos 6.576.343.311 de
habitantes. Dentre estes, 188.203.316 vivem no Brasil e, aproximadamente
8.097.000, vivem no Estado do Ceará (IBGE, 2007a).
No Brasil, o aumento no ritmo de crescimento deveu-se exclusivamente ao
declínio da mortalidade, com a esperança de vida ao nascer passando de 44 para
54 anos entre as décadas quarenta e sessenta. Neste intervalo, a fecundidade
manteve-se em níveis altos, tendo a taxa de fecundidade total decrescido apenas
de 6,3 para 5,8 filhos por mulher. A evolução diferenciada da mortalidade e
fecundidade fez com que a taxa bruta de mortalidade caísse muito mais
rapidamente do que a taxa bruta de natalidade, o que proporcionou, como
conseqüência, ampliação significativa da taxa de crescimento corrente da
população (CARVALHO, 2004).
No Estado do Ceará, enquanto nos anos cinqüenta o Estado apresentava
taxa de crescimento populacional da ordem de 2,6% anual, ao passar dos anos,
essa taxa declinou para 1,70% na década 1982/1991. Estes valores mantiveram-
se praticamente no mesmo nível na década seguinte, haja vista que no período
1991-2000 essa taxa foi de 1,73%, revelando nítida tendência de crescimento
moderado da população do Estado. A densidade demográfica tem apresentado
comportamento ascendente, passando de 14,2 habs./km², em 1940, para 50,9
habs./km², em 2000 e 53,74 habs/km2, em 2004 (IPECE, 2005).
Embora a humanidade tenha construído grande parte de sua história
através da agricultura, atualmente a maioria das pessoas que tenta sobreviver a
partir deste processo enfrenta muitas dificuldades. As condições de vida e bem-
estar de agricultores brasileiros ainda são tratadas com descaso, sendo que
muitos habitam precários assentamentos e ficam esperando pela desapropriação
e desconcentração fundiária, ou seja, a reforma agrária (SOTO, 2002). Em
adição, as terras disponíveis ao povo para a agricultura geralmente apresentam
baixa produtividade devido ao não aproveitamento completo da terra e, também,
pelo fornecimento de terras improdutivas para estes agricultores. Estas terras, por
sua vez, só podem se tornar produtivas com elevados investimentos financeiros
(TEIXEIRA, 2005).
De qualquer forma, essa grande massa populacional deve ser alimentada.
Muitos esforços estão sendo feitos para se conseguir melhorias na produtividade
agrícola, na proteção das culturas contra pragas e patógenos e na eficiência do
uso da água nas lavouras. O cultivo de leguminosas tem sido amplamente
executado, visto que suas sementes situam-se entre as mais ricas em proteínas
entre todas as plantas, compensando aminoácidos que são mal representados
nos cereais (GEPTS et al., 2005).
1.2. O Feijão-de-corda
O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.], também conhecido como
feijão caupi, feijão macassar, feijão miúdo e feijão fradinho, é uma planta
dicotiledônea que ocorre em muitos países tropicais e subtropicais, com ampla
distribuição mundial (FREIRE FILHO, et al., 1983; ALI et al, 2002). Pertence à
ordem Fabales, família Fabaceae, subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae,
subtribo Phaseolinae e gênero Vigna, que compreende cerca de 160 espécies
(FREIRE FILHO, 1988; PADULOSI e NG, 1997). Sua origem e domesticação
estão associadas ao cultivo conjunto de milheto (Pennisetum glaucum) e sorgo
(Sorghum spp.) no continente africano (QUINN e MYERES, 2002; ALI et al, 2002;
VALENZUELA e SMITH, 2002). Há evidências que esta cultura foi implantada no
continente americano no século XVI, durante o tráfico de escravos realizados por
colonizadores espanhóis e portugueses. Primeiro, possivelmente, nas colônias
espanholas e, em seguida, no Brasil, provavelmente no Estado da Bahia
(ARAÚJO e WATT, 1988).
A produção mundial de feijão vem crescendo progressivamente desde os
anos 60, devido ao fato de ser considerado uma cultura de subsistência com
elevado conteúdo protéico, energético e vitamínico. Superior em termos
nutricionais ao feijão comum, Phaseolus vulgaris L., é considerado de grande
importância na alimentação humana em regiões tropicais e subtropicais (LIMA et
al., 2001; MARINHO et al., 2001). O grande valor econômico se deve ao fato de
ser possuidor de ampla variabilidade genética, ampla capacidade de adaptação, e
alto potencial produtivo. Além disso, essa cultura é uma das poucas espécies
escolhidas pela National Aeronautical and Space Administration (NASA) para ser
cultivada e estudada nas estações espaciais (EHLERS e HALL, 1997).
A área ocupada com feijão-de-corda, no mundo, está em torno de 12,5
milhões de ha, com 8 milhões (64% da área mundial) na parte oeste e central da
África. A outra parte da área está localizada na América do Sul, América Central e
Ásia, com pequenas áreas espalhadas pelo sudoeste da Europa, sudoeste dos
Estados Unidos e da Oceania. Entre todos os países, os principais produtores
mundiais são Nigéria, Niger e Brasil (QUIN, 1997). No Brasil, aguarda-se para
2007 uma produção de 2,2 milhões de toneladas, superior a 37,5% da obtida em
2006 (1,6 milhão de toneladas). Numa área a ser colhida de 2,5 milhões de
hectares, a produtividade poderá alcançar 869 kg/ha (IBGE, 2007b).
A grande produção de feijão-de-corda no Brasil encontra-se na Região
Nordeste e em pequenas áreas na Amazônia. Os maiores produtores são os
Estados do Ceará, Piauí, Bahia e Maranhão, nessa ordem, os quais também
apresentam as maiores áreas plantadas (EMBRAPA INFORMÁTICA
AGROPECUÁRIA, 2007).
Com relação aos aspectos socioeconômicos, a cultura do feijão-de-corda é
responsável pela geração de 1.451.587 empregos/ano no Brasil, sendo que as
cultivares da Embrapa produzem 140.318 toneladas e geram 435.473 empregos,
movimentando US$ 75 milhões ao ano (EMBRAPA, 2007).
Diante do reconhecimento da importância dessa cultura, o estudo das doenças
que a afetam vem recebendo crescente prioridade, já que estas têm respondido
por perdas expressivas no processo de produção, sendo um dos principais fatores
limitantes do cultivo do feijão-de-corda. Os principais agentes causadores das
doenças que afetam o feijão-de-corda são vírus, bactérias, fungos e nematóides
(OLIVEIRA, 2006). Existem ainda, danos causados por insetos que se alimentam
de tecidos vivos de plantas e de grãos armazenados. Estes últimos apresentam-
se como um sério problema à conservação em armazéns (WATT e ARAÚJO,
1988).
Cerca de 40 espécies de fungos foram identificadas como patogênicas ao
feijão-de-corda, sendo 20 destas, identificadas no Brasil (ALLEN, 1982). Doenças
como a cercosporiose (Cercospora crunta e Cercospora canescens), a mela ou
murcha da teia micélia (Rhizoctonia solani), a sarna (Sphaceloma sp.), a murcha
do fusário (Fusarium oxysporum), a ferrugem (Uromyces vignae), a podridão das
raízes (Fusarium solani) e a antracnose (Colletotrichum sp.) são doenças
causadas por fungos fitopatogênicos que merecem destaque do ponto de vista
sócio-econômico (RIOS, 1988).
1.3. Colletotrichum
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. é um organismo
eucarioto pertencente a ordem Melanconiales, classe Coelomycetes e subdivisão
Deuteromycotina (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001). Sua fase sexual
(teleomórfica) corresponde à espécie Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. &
von Schrenk, pertencente a família Phyllachoraceae da divisão Ascomycota
(HAWKSWORTH et al., 2005). Esse fungo apresenta um grau de diversidade
morfológica e biológica muito grande, quando comparado com outros fungos e,
dentre as espécies de Colletotrichum, é a que apresenta patogenicidade a um
maior número de hospedeiros (AGOSTINI et al, 1992; BEEVER et al, 1995; DU et
al., 2005; LIYANAGE et al, 1992).
O gênero Colletotrichum foi descrito em 1790 por Tode com o nome
Vermicularia, o qual foi validado por Fries em 1825 (BAXTER et al., 2005).
Penzig, em 1882, descreveu o Vermicularia gloeosporioides, hoje conhecido
como C. gloeosporioides, quando foi isolado de folhas de um cítrico, na Itália
(ALAMEDA, 2005). Mais tarde, Saccardo, em 1884, transferiu o gênero
Vermicularia ao gênero Colletotrichum e este gênero foi estabelecido por Corda,
em 1831 (BAXTER et al., 2005).
Colletotrichum tem sido reescrito como diferentes gêneros, sendo os mais
comuns Vermicularia e Gloeosporium Desm. & Mont. (AKINWUNMI e LATUNDE-
DADA, 2001; WHARTON, 2005). Von Arx (1957, 1970) reduziu a confusão entre
gêneros ao escrever monografias sobre Colletotrichum, no que reduziu centenas
de táxons a 13 espécies aceitáveis. Além disso, agrupou 600 sinônimos em 8
formas de C. gloeosporioides, baseado na variabilidade do cultivo e na
especificidade do hospedeiro. Hoje em dia, ainda existem problemas taxonômicos
para C. gloeosporioides (ALAMEDA, 2005; JEFFRIES et al., 1990).
O número de espécies aceitas de Colletotrichum tem agora aumentado
para 39, baseado em outros estudos como características morfológicas, culturais
e patogênicas (SUTTON, 1992, 2005). Muitos táxons considerados como formas
hospedeiro-específicas por von Arx (1957) foram reconhecidos como espécies
íntegras por Sutton (1992). Por exemplo, Sutton (1992) considerou C. circinans
como distinto de C. coccodes e outras espécies de Colletotrichum, enquanto von
Arx (1957) reconheceu C. circinans como uma forma especiales de C. dematium
(C. dematium f.sp. circinans) (FAGBOLA e ABANG, 2004). A variação de
hospedeiro de muitas espécies de Colletotrichum não é muito bem conhecida e o
tratamento do gênero, com bases em Sutton, foi criticado por ser baseado na
suposição que espécies de Colletotrichum são hospedeiro-específicas (CANNON
et al., 2000).
Um dos problemas com a taxonomia com bases morfológicas de
Colletotrichum spp. reside na produção de conídios secundários que geralmente
são variáveis em tamanho e forma, dificultando assim a identificação da espécie
(BUDDIE et al., 1999). Devido a estes problemas, vários métodos moleculares
são usados para discriminar espécies de Colletotrichum, já que os critérios
morfotaxonômicos não são precisos (FREEMAN et al., 1996). A ocorrência
comum de características morfológicas similares entre as espécies e a variação
na especificidade a hospedeiros têm levado ao uso de marcadores bioquímicos e
moleculares para a identificação de espécies de Colletotrichum (ABANG et al.,
2002; CANNON et al., 2000).
Recentemente, o método de reação em cadeia de polimerase (PCR) tem
sido usado para amplificar fragmentos de DNA genômico com o emprego de
iniciadores específicos (primers) gerando cópias de regiões específicas da cadeia
de DNA (STARR e TAGGART, 1998) que permitem a classificação taxonômica.
De fato, análises das regiões ITS (Internal Transcribed Spacer), além dos
domínios D1 e D2 do rDNA nuclear, têm sido usados extensivamente para
resolver questões taxonômicas entre espécies de Colletotrichum (BAILEY et al.
1996; BARRETO et al., 2007; FREEMAN et al., 2000; LATUNDE-DADA et al.,
1996; SHERRIFF et al. 1994; SREENIVASAPRASAD et al., 1996). Acredita-se
que esses espaçadores, muito provavelmente, sejam íntrons do grupo I de auto-
emenda (splicing) que repetem unidades que evoluíram rapidamente e que
variam entre espécies e gênero (BALDWIN et al., 1995; WHITE et al., 1990).
1.4. Estratégias de Infecção de Espécies de Colletotrichum
Muitos fungos fitopatogênicos desenvolvem células especializadas
(estruturas de infecção) que são requeridas para o processo de penetração e
colonização de tecidos hospedeiros (HOCH e STAPLES, 1991; MENDGEN e
DEISING, 1993).
Os primeiros estágios do desenvolvimento fúngico do processo de infecção
são essencialmente os mesmos para todas as espécies de Colletotrichum. Os
estágios iniciais podem ser separados em: 1) deposição do conídio na superfície
do tecido vegetal; 2) aderência do conídio; 3) germinação e emissão de tubo
germinativo; 4) desenvolvimento de apressório; e 5) penetração da epiderme por
uma hifa de penetração (JEFFRIES et al., 1990). As diferenças cruciais entre um
modo de infecção e outro se dá depois da penetração (PRUSKY et al., 2000),
onde diferentes estruturas possuem características e funções distintas. Assim,
várias funções estão relacionadas à adesão (BRAUN e HOWARD, 1994;
NICHOLSON e EPSTEIN, 1991), reconhecimento (VIRET et al., 1994),
sinalização celular (READ et al., 1992), nutrição (SMITH e SMITH, 1990) e
proteção contra condições adversas do ambiente (NICHOLSON e EPSTEIN,
1991). Todas essas estruturas são cruciais para o sucesso da infecção.
Os conídios de fungos biotróficos geralmente produzem um tubo
germinativo e apressório que aderem na superfície do tecido vegetal. Outros
fungos podem infectar a planta através de uma porta de entrada natural, como um
estômato, por exemplo, ou por injúrias acometidas no órgão da planta
(BARRETO, 2005). Na maioria das espécies de Colletotrichum, a diferenciação de
um apressório é essencial para a penetração do hospedeiro (KUO, 1999). O
apressório se desenvolve quando a extremidade do tubo germinativo começa a
intumescer, sendo delimitado por um septo. Este septo não ocorre em fungos
pertencentes ao complexo C. orbiculare (C. lagenarium, C. malvarum, C. trifolii e
C. lindemuthianum) (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001). Em seguida, o
amadurecimento do apressório envolve a formação de uma hifa de penetração na
base da célula (identificada como uma mancha circular observável ao
microscópio), deposição de novas camadas da parede celular e a secreção de
uma matriz extracelular. Esse último processo, provavelmente, tem papel chave
para o estabelecimento do apressório na superfície do hospedeiro (PRUSKY et
al., 2000). Subsequentemente, melanina é depositada em uma camada da parede
celular e glicerol é gerado pelo metabolismo de glicogênio, trealose e lipídios
estocados (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001; DE JONG et al., 1997). Como
o glicerol é impermeável à camada de melanina, há uma combinação de uma
força mecânica, na forma de alta pressão de turgescência, e degradação
enzimática da cutícula e da parede da célula hospedeira (HOWARD e VALENT,
1996; MENDGEN e DEISING, 1993).
Durante o processo de melanização, três genes estruturais (PKS1, SCD1 e
THR1) e um regulador (CMR1) estão envolvidos. Durante sua síntese, duas
etapas subseqüentes de desidratação e redução são requeridas. Além disso, para
que este processo aconteça, a interação com estruturas lipídicas presentes na
camada de cera da célula vegetal deve ocorrer (PRUSKY et al., 2000).
Em relação ao modo de infecção, algumas espécies como as pertencentes
ao agregado C. orbiculare, C. graminicola, C. sublineolum, C. destructivum, C.
truncatum, C. linicola e muitos isolados de C. gloeosporioides são hemibiotróficos
(BAILEY et al., 1992; BAILEY, 1997; LATUNDE-DADA et al., 1996; SKIPP et al.,
1995). Esta estratégia hemibiotrófica começa com uma fase biotrófica transiente
que rapidamente evolui para uma fase necrotrófica destrutiva (Figura 1.1)
(AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001).
Durante a fase biotrófica, a membrana plasmática do hospedeiro expande-
se e invagina-se ao redor do desenvolvimento da vesícula de infecção e das hifas
primárias, e uma camada de matriz interfacial é depositada entre a parede celular
do fungo e a membrana plasmática do hospedeiro (MENDGEN e HAHN, 2002).
Contudo, a membrana plasmática perde sua integridade funcional e a célula
começa a degenerar e morre (O’CONNELL et al., 1985). Embora a hifa
intracelular, presumivelmente, obtenha nutrientes da célula hospedeira morta, a
morte celular é gradual e confinada a células de infecção e não é associada com
a dissolução extensa da parede celular do hospedeiro (PRUSKY et al, 2000).
O uso de anticorpos monoclonais UB25 pôde identificar uma proteína
sintetizada nas estruturas biotróficas, vesículas e hifas primárias (O’CONNELL et
al., 1996). A glicoproteína CIH1, reconhecida pelo UB25, é uma proteína rica em
prolina, que forma uma estrutura multimérica na matriz interfacial entre a hifa
intracelular e a membrana plasmática (PERFECT et al., 1998, 2001). CIH1 tem
algumas similaridades com proteínas ricas em prolina (PRPs) e glicoproteínas
ricas em hidroxiprolina (HRGPs), que são importantes componentes estruturais da
parede celular de plantas (CORBIN et al., 1987; SHOWALTER et al., 1985;
TEMPLETON et al., 1990). As PRPs e HRGPs podem, também, formar estruturas
ligadas por interações cruzadas, quando sob estresse oxidativo (HAMMOND-
KOSACK e JONES, 2000).
Depois da fase biotrófica, a fase necrotrófica é desenvolvida, estando
associada com a formação e ramificação de hifas secundárias estreitas no tecido
vegetal. Estas hifas têm a capacidade de infectar células vizinhas, produzindo
lesões nas superfícies de folhas infectadas. As hifas secundárias, juntamente com
hifas primárias, formam agregados em forma de nó iniciando o processo de
formação de acérvulo (DUFRESNE et al., 2000).
Com a formação de acérvulos, a cutícula é rompida mecanicamente,
ocorrendo a expansão de conídios, conidióforos e setas, se existirem, entre a
parede celular e cutículas. Este tipo de acérvulo é denominado como
hipostromático, sendo encontrado em todas as espécies de Colletotrichum
infectando gramíneas. Em contraste, a maioria das espécies de Colletotrichum
apresenta acérvulos pulviniformes, em que a parede epidérmica e a cutícula são
rompidas simultaneamente (WHARTON et al., 2001).
Diferente de espécies que realizam a hemibiotrofia, espécies como C.
circinans e C. capsici são exclusivamente necrotróficas (AKINWUNMI e
LATUNDE-DADA, 2001). Após penetração na cutícula, estes patógenos não
entram imediatamente dentro do lúmen da célula, mas se desenvolvem abaixo da
cutícula, dentro das paredes periclinais e anticlinais das células epidérmicas,
utilizando estratégia de infecção subcuticular, intramural necrotrófica (Figura 1.1)
(PRING et al., 1995).
No estágio mais inicial da penetração, o desenvolvimento intramural está
associado a um extensivo intumescimento e dissolução da parede celular
hospedeira, podendo ocorrer uma fase biotrófica curta ou apenas uma fase
necrotrófica destrutiva (PRUSKY et al., 2000). Como no hemibiotrofismo
intracelular, os mecanismos de defesa da planta não são induzidos e o fungo
continua a se ramificar e crescer intramuralmente, penetrando na célula apenas
posteriormente (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001).
Figura 1.1 – Estratégias de infecção adotadas por espécies de Colletotrichum. Acima, estratégia
hemibiotrófica intracelular e, abaixo, estratégia subcuticular, intramural necrotrófica. Conídio
binucleado (C), apressório (A), mancha interna observável por microscopia de luz (ILS), hifa de
penetração (PP), vesícula de infecção e hifa primária (PH), hifa secundária (SH), hifa secundária
intramural (ScH), cutícula (Cu), célula epidérmica (E), célula do mesófilo (M) e fase necrotrófica
subseqüente (N).
Fonte: Wharton e Diéguez-Uribeondo (2004).
Subseqüentemente, estes fungos difundem-se rapidamente intra e
intercelularmente, dissolvendo as paredes celulares e matando as células durante
o processo de infecção (WHARTON et al., 2001; WHARTON e DIÉGUEZ-
URIBEONDO, 2004).
Outras espécies de Colletotrichum combinam os dois tipos de estratégias,
produzindo hifa intracelular e hifa subcuticular com os mesmos tecidos. C. magna
em melancia (Citrullus vulgaris) e formas de C. gloeosporioides que infectam
abacate (Persea americana) e citrus (Citrus sp.) podem utilizar ambas as
estratégias (PRUSKY et al., 2000). Além disso, outras formas de infecção podem
ser observadas. C. gloeosporioides e C. acutatum podem penetrar em estômatos
abertos e se ramificar intercelularmente no mesófilo da folha (BARRETO, 2005;
MARTÍN e GARCÍA-FIGUERES, 1999).
1.5. Respostas de Defesa de Plantas a Patógenos
Como foi descrito, durante a patogênese, os microorganismos patogênicos
lançam mão de muitas estratégias para infectar as plantas. Contudo, a maioria
delas exibe resistência natural ao ataque dos fitopatógenos, pois desenvolvem
reação incompatível, na qual não há desenvolvimento da doença (KOMBRINK e
SOMSSICH, 1995). Sendo assim, a seleção natural, a geração de cultivares
resistentes e a co-evolução de raças de patógenos propiciaram, durante a
evolução, um quadro em que a doença é tida como exceção e não como regra.
Assim, poucos microorganismos especializados interagem compativelmente com
as plantas, isto é, desenvolvendo doença (HEATH, 1997).
De acordo com a hipótese de Flor (1955), estas interações são usualmente
mediadas pela relação gene-a-gene, ou seja, entre genes dominantes de
resistência da planta (R) e genes dominantes de avirulência do patógeno (Avr). A
resistência descreve a capacidade de prevenção, restrição ou retardamento que
as plantas têm à penetração do patógeno no tecido hospedeiro (BELL, 1981). No
entanto, genes recessivos de resistência foram descritos por Hammond-Kosack e
Jones (2000) em interações envolvendo patógenos que liberam substâncias
tóxicas no hospedeiro, sendo estas toxinas essenciais na compatibilidade da
interação.
O sistema de defesa das plantas inclui fatores de resistência pré-formados
(passivos, constitutivos) e pós-formados (ativos, induzíveis). Os primeiros
correspondem àqueles que estão presentes na planta mesmo antes dela ser
atacada por algum patógeno. Diferentemente, os pós-formados estão ausentes ou
em baixas concentrações antes da infecção, porém elevam seus níveis em
resposta a algum estresse imposto à planta (JEANDET et al., 2002; ODJAKOVA e
HADJIIVANOVA, 2001).
1.5.1. Compostos de Defesa Pré-Formados
As barreiras estruturais, como a cutícula e a parede celular, constituem os
principais constituintes pré-formados relacionados com a defesa vegetal.
Geralmente, estas defesas físicas são fortificadas pela deposição de suberina e
lignina durante o processo de invasão do patógeno (ODJAKOVA e
HADJIIVANOVA, 2001).
A cutícula consiste de ácidos graxos esterificados, juntamente com
compostos fenólicos (cutina) e álcoois graxos primários (cera). É encontrada na
parte aérea de plantas e sua estrutura é bastante relacionada com a suberina,
matriz de compostos fenólicos insolúveis similar à lignina (KOMBRINK e
SOMSSICHI, 1995; ODJAKOVA e HADJIIVANOVA, 2001). A camada de cera é
uma importante barreira para patógenos, mas controversa. A presença de
determinados compostos de natureza lipídica em sua estrutura estimula a
formação de apressório de fungos. Entretanto, outras substâncias de mesma
natureza podem inibir este processo de desenvolvimento fúngico (PRUSKY et al.,
2000).
Abaixo da cutícula fica a parede celular. Essa estrutura é bastante
importante como barreira física, dificultando a entrada de fitopatógenos. Consiste
de polímeros de carboidratos (celulose, hemicelulose e pectinas), aminoácidos,
HRGPs, PRPs, glicoproteínas ricas em glicina e compostos fenólicos (lignina)
(KOMBRINK e SOMSSICHI, 1995).
1.5.2. Percepção, Transdução de Sinal e Indução de Defesa
Uma diferença chave entre plantas resistentes e susceptíveis é o tempo de
reconhecimento do patógeno invasor e a ativação rápida e efetiva de mecanismos
de defesa. Uma planta resistente é capaz de desenvolver, rapidamente, ampla
variedade de respostas de defesa. No entanto, uma planta susceptível, quando
responde ao ataque do patógeno, o faz tardiamente (YANG et al., 1997).
A ativação da resposta de defesa na planta é iniciada pelo reconhecimento
de moléculas sinalizadoras, chamadas elicitores (MYSORE e RYU, 2004; NIKI et
al., 1998; NURNBERGER e BRUNNER, 2002). A interação destas moléculas com
os receptores do hospedeiro pode ativar uma cascata de transdução de sinal que
pode envolver fluxos de íons, produção de ácido salicílico (AS), produção de
espécies reativas de oxigênio (ROS), fosforilação de proteínas e outros eventos
de sinalização (ZHU et al, 1996).
A molécula elicitora é reconhecida por um receptor apropriado localizado
na membrana plasmática da célula hospedeira. Rapidamente, a interação do
elicitor com o receptor ativa canais de H+, K+, Cl- e Ca2+, interferindo no fluxo
destes íons. O efluxo de K+ e Cl-, e o influxo de H+ e Ca2+, causam mudanças no
pH dos espaços intra e extracelular ativando uma oxidase do NAD(P)H presente
na membrana plasmática, cujo sítio ativo se volta para a região extracelular.
Dessa forma, a enzima oxidase do NAD(P)H converte oxigênio molecular (O2) em
radicais superóxidos (�O2-) (YANG et al., 1997; WOJTASZEK, 1997). Estes
radicais superóxidos são produzidos e convertidos em outras ROS iniciando um
fenômeno chamado de explosão oxidativa, a qual será descrita mais adiante.
Além do fluxo de íons, a amplificação de muitos sinais durante a interação
planta-patógeno é devido, também, à produção de AS. Desde a descoberta de
que esse composto é produzido sob infecção em pepino (Cucumis sativus)
(MÉTRAUX et al., 1990) e fumo (Nicotiana tabacum) (MALAMY et al., 1990), o AS
é tido como um suposto sinalizador químico que está relacionado à ativação de
mecanismos de defesa das plantas.
Estudos mostram que o AS é produzido a partir da via do
shikimato/arogenato (ZENK e MULLER, 1964). Nesta rota metabólica, o
aminoácido fenilalanina é convertido em ácido cinâmico (AC) pela enzima
fenilalanina amônio-liase (PAL). Essa é uma enzima chave para a via do
shikimato visto que através dela são produzidos muitos compostos de defesa,
dentre os quais lignina e fitoalexinas (HORVATH e CHUA, 1994). Em seguida, o
AC pode seguir duas vias para a produção de AS. Primeiro, o AC é transformado
em ácido benzóico para, assim, ser convertido em AS pela enzima hidroxilase do
ácido benzóico. Segundo, o AC é convertido em ácido 2-cumárico e, então,
oxidado a AS (COQUOZ et al., 1998). Após sua síntese, AS pode ser encontrado
dentro da célula na forma conjugada com grupos glicosídios, ésteres e amido. Da
mesma forma, o ácido benzóico também pode estar conjugado com grupos
hidroxilas (COQUOZ et al., 1998; EDWARDS, 1994).
Durante o processo de interação entre a planta e o patógeno, a produção
de AS é, geralmente, seguida por aumento na produção e acúmulo de H2O2
(KLESSIG et al., 2000). Isto acontece pelo fato do AS inativar as enzimas
peroxidase do ascorbato (APX) e catalase (CAT), que são enzimas que
participam, também, no controle dos teores de H2O2. O aumento de AS está
também relacionado à fosforilação e desfosforilação de proteínas, assim como na
expressão de genes que codificam para Proteínas Relacionadas à Patogênese
(PR-Proteínas) (DING et al., 2002).
Embora a expressão de genes de defesa no local da infecção esteja
relacionada ao aumento de AS, existem dúvidas se esta molécula é responsável
pela indução da expressão de genes de defesa em células distantes do local de
infecção (resposta sistêmica adquirida – SAR) (GODIARD et al., 1994), sendo
sugerida a participação de um mensageiro secundário na ativação deste
processo, provavelmente, o H2O2 (YANG et al., 1997).
1.5.3. Produção de ROS e Explosão Oxidativa
Um dos mais peculiares eventos que acontece nos primeiros estágios da
interação entre a planta e o patógeno é a rápida e transiente produção de ROS
pela planta, chamado de explosão oxidativa (LOW e MERIDA, 1996). Essa
resposta foi observada em muitos sistemas planta-patógeno envolvendo fungos
(VERA-ESTRELA et al., 1992), bactérias (KEPPLER et al., 1989), vírus (DOKE e
OHASHI, 1988) ou elicitores (ZHANG et al., 2004). ROS, como o próprio nome
diz, são espécies de O2 ativadas por algum processo de oxi-redução. Dessa
forma, a produção de ROS a partir de O2 tem sido considerada como um dos
grandes paradoxos da vida aeróbica, já que o O2 funciona como molécula
essencial para a vida destes organismos (MARX, 1985).
As formas predominantes de ROS, porém não as únicas, encontradas em
plantas incluem �O2-, H2O2 e radicais hidroxil (�OH), e muitas enzimas têm sido
envolvidas na sua produção. Assim como em neutrófilos de mamíferos, a
participação da enzima oxidase do NAD(P)H tem sido relacionada com a
formação de ROS (APEL e HIRT, 2004). Como mencionado anteriormente, essa
enzima catalisa a produção de �O2- pela adição de um elétron à molécula de O2
usando NAD(P)H como doador de elétrons. Assim, o �O2- produzido serve como
material inicial para a produção de uma variedade de outras ROS. Além disso,
outros modelos alternativos têm sido propostos para a produção de ROS. Por
exemplo, peroxidases do apoplasto que estão ligadas ionicamente ou
covalentemente a polímeros da parede celular atuam em dois diferentes modos
catalíticos (WOJTASZEK, 1997). Na presença de H2O2 e substratos fenólicos elas
operam na síntese de lignina e outros polímeros fenólicos que servem como
barreira estrutural para deter a invasão da planta pelo patógeno. Porém, se o
substrato for substituído por NAD(P)H, ou outro composto redutor relacionado, há
formação de uma reação em cadeia com produção de H2O2 (APEL e HIRT, 2004).
Estas peroxidases diferem das oxidases do NAD(P)H por diferentes valores de Km
para O2 e por diferentes sensibilidades ao cianeto, azida e cloreto de
difenilenoiodônio (DPI) (BAKER et al., 1998; VERA-ESTRELLA et al, 1992).
Embora haja poucos relatos, outras enzimas estão relacionadas com a produção
de ROS no apoplasto. Entre elas estão diamino, poliamino e oxalato oxidases.
Estas enzimas produzem diretamente H2O2 a partir de O2 (LANGEBARTELS et
al., 2002).
Em relação ao radical �OH, este pode ser gerado quando há reação
espontânea entre o H2O2 e �O2-. Este processo é conhecido como reação de
Haber-Weiss, na qual, além da produção de �OH, há formação de íons hidroxila
(OH-) e H2O. �OH pode, ainda, ser produzido a partir de uma reação de oxi-
redução entre H2O2 e um íon divalente, que, geralmente, é Fe2+ ou Cu+. Este
evento químico é conhecido como reação de Fenton (WOJTASZEK, 1997).
Além de estresses causados por microorganismos patogênicos, estresses
abióticos podem levar ao aumento de ROS. Em plantas, em condições fisiológicas
normais, ROS são continuamente produzidas pelas mitocôndrias, cloroplastos e
peroxissomos, sendo suas concentrações controladas. Diferente dos mamíferos,
a contribuição das mitocôndrias para a produção de ROS em plantas é bem
pequena (PURVIS, 1997). A produção de ROS pelas mitocôndrias de plantas só
não é maior devido à participação de uma oxidase alternativa (AOX), que
compete pelos elétrons do citocromo bc1 para produzir água a partir de O2.
Embora esta enzima seja também encontrada nos cloroplastos, a produção de
ROS nas plantas se deve mais a esta organela do que a qualquer outra
(MITLLER, 2002). Nos cloroplastos, três eventos estão relacionados com a
produção de ROS: 1) a reação oxigenase da Rubisco, na qual há participação dos
peroxissomos; 2) a redução direta de oxigênio molecular pelo fotossistema I (PSI);
e 3) a respiração feita por estas próprias organelas (APEL e HIRT, 2004).
A geração de ROS diante de estresses bióticos e abióticos é regulada de
maneira diferente (MITTLER, 2002). Geralmente, a planta responde a um ataque
feito por patógenos aumentando os teores de ROS, para que, dessa forma, estes
compostos possam causar danos ao invasor e sinalizar respostas de defesa no
hospedeiro, como a resposta de hipersensibilidade (HR) e a resposta sistêmica
adquirida (SAR). Entretanto, diante de um estresse causado por intempéries
ambientais, a planta produz, descontroladamente, uma grande quantidade de
ROS, sendo necessário degradar estes compostos para não haver danos no
tecido vegetal.
1.5.4. H2O2
Em resposta ao ataque de um patógeno, a planta produz H2O2 localmente
e sistemicamente (OROZCO-CARDENAS e RYAN, 1999). Embora o seu papel
não esteja bem estabelecido, é sabido que o H2O2 têm uma importante função na
defesa da planta (BUCKNER et al., 2000). Em interações incompatíveis, a
produção de ROS acontece de maneira bifásica. No início da infecção há acúmulo
muito rápido de H2O2 e, em seguida, um segundo acúmulo ocorre, sendo
caracterizado por ser mais prolongado do que o primeiro (BAKER e ORLANDI,
1995). Barreto (2005) observou que a cultivar de feijão-de-corda resistente a C.
gloeosporioides, TE-97-411-1E (TE-97), apresentou proeminente acúmulo de
H2O2. No entanto, este aumento nos teores de H2O2 não foi observado na cultivar
susceptível BR-3-TRACUATEUA, sugerindo, assim, que o H2O2 deve está
envolvido neste processo de resistência/susceptibilidade.
O acúmulo de H2O2 na planta pode favorecer a formação de ligações
cruzadas de HRGPs e PRPs e, consequentemente, promover o fortalecimento da
parede celular (TENHAKEN et al., 1995). HRGPs e PRPs estão envolvidas na
fortificação da parede celular por duas formas. Primeiramente, HRGPs e PRPs
pré-formadas estabelecem, rapidamente, interações cruzadas com constituintes
da parede celular sob indução de H2O2. Depois, ocorre síntese de novo de
HRGPs e PRPs e, em seguida, adição e polimerização de lignina (HAMMOND-
KOSACK e JONES, 2000).
Outra conseqüência da produção de H2O2 e de outras ROS é a
peroxidação de fosfolipídios e glicolipídios das membranas da célula (MCCORD,
2000). A peroxidação de lipídios é um processo que envolve três passos distintos:
iniciação; propagação; e terminação. Em seguida, as moléculas de hidroperóxido
de lipídios são degradadas em aldeídos, malonaldeído (MDA), hidrocarbonos e
etileno (BRADLEY e MINN, 1992; LESHEM, 1992). Além disso, o H2O2 pode
causar modificações e inativação de enzimas e moléculas de DNA (BARBER e
ANDERSSON, 1992; OLEINICK et al., 1986).
Em adição aos danos causados pelo H2O2, um dos fatores ligados à defesa
vegetal e que está relacionado com o seu acúmulo é a indução de HR, um tipo de
morte celular programada (PCD) (PALAVAN-UNSAL et al., 2005; DAT et al.,
2003). Como em animais, a morte celular é um evento muito importante
desenvolvido pelas plantas (KROEMER et al, 1998). Esta resposta de defesa se
apresenta sob forma de discretas lesões que impossibilitam a propagação de
determinados patógenos para outros tecidos da planta, parando, assim, a
progressão da doença (GOODMAN e NOVACKY, 1994). Diferente da morte por
necrose (morte celular passiva), a PCD é caracterizada pela formação de
agregados de cromatina, contração da célula, condensação do citoplasma e
núcleo, e fragmentação de DNA (BUCKNER et al., 2000). A morte por necrose
não é um evento fisiológico ativado pela planta durante o estresse, mas sim,
resulta de um processo degenerativo decorrente de traumas conseqüentes do
mesmo (O’BRIEN et al., 1998). Dessa forma, a HR é caracterizada por uma
intensa expressão e supressão de genes que desencadeiam o processo de morte
celular (JABS, 1999).
Trabalhos têm mostrado que o contato direto de H2O2 exógeno com fungos
pode inibir seu crescimento vegetativo (BARRETO, 2005; LU e HIGGINS, 1999).
Além disso, plantas transgênicas que expressam enzimas produtoras de H2O2
apresentam resistência a muitos fungos biotróficos e bactérias (SANTOS et al.,
2001; XU e PAN, 2000), como é o caso daquelas que super-expressam glucose-
oxidase (GO), uma enzima produtora de H2O2 através da degradação de D-
glucose (WU et al., 1997). Entretanto, fungos necrotróficos crescem mais
facilmente em plantas que acumulam muito H2O2 (GOVRIN e LEVINE, 2000).
Apesar de muitos estudos terem sido realizados para esclarecer a interação
destes dois tipos de fungos, muitos trabalhos ainda deverão ser realizados para
elucidar o papel do H2O2 na interação de plantas com fungos hemibiotróficos
(HAMMOND-KOSACK e JONES, 1996).
Muitos estudos têm mostrado que o H2O2 é um composto que pode se
difundir entre as células e servir como molécula sinalizadora para expressão de
genes relacionados à defesa vegetal (NEILL et al., 2002). Três principais modos
de atuação do H2O2 credenciam-no como molécula indutora da expressão gênica.
Primeiro, sensores de H2O2 podem ser ativados para induzir uma cascata de
sinalização. Segundo, componentes das vias de sinalização, como as proteínas-
quinases de ativação da mitose (MAPK, MAPKK e MAPKKK) podem ser oxidados
e ativados. Por último, o H2O2 pode modificar diretamente fatores de transcrição
envolvidos na expressão de genes de defesa (APEL e HIRT, 2004; NEILL et al.,
2002; WOJTASZEK, 1997).
A ativação de genes de forma sistêmica e o desenvolvimento de resistência
de forma duradoura consolidam-se em um processo chamado de Resposta
Sistêmica Adquirida (SAR) (GODIARD et al., 1994). Durante a SAR, muitas
proteínas de defesa são expressas. Dentre estas, as mais frequentemente
estudadas são as PR-proteínas. Atualmente, 17 famílias de PR-proteínas são
reconhecidas (ANTONIW et al., 1980; EPPLE et al., 1995; GARCÍA-OLMEDO et
al., 1995; GREEN e RYAN, 1972; LAGRIMINI et al., 1987; MELCHERS et al.,
1994; MÉTRAUX et al., 1988; OKUSHIMA et al., 2000; SOMSSICH et al., 1986;
TERRAS et al., 1992; VAN LOON, 1982; VAN LOON et al., 2006; VERA e
CONEJERO, 1988; WEI et al., 1998; ZHANG et al., 1995), dentre elas as β-1,3-
glucanases e quitinases que apresentam atividade antifúngica potencial. Além
disso, muitas peroxidases são reconhecidas como PR-proteínas já que estas
enzimas estão relacionadas à lignificação da parede durante a invasão por
patógenos e, também, por apresentarem atividade antifúngica (STAEHELIN,
1992).
1.5.5. Mecanismos Antioxidantes Não-Enzimáticos
Muitos compostos não-enzimáticos funcionam como verdadeiros tampões
redoxes nas células vegetais. Os mais importantes são ascorbato, glutationa,
tocoferol e carotenóides.
O ascorbato (vitamina C) é uma importante vitamina que está relacionada a
muitos processos fisiológicos na planta (FOYER, 1993). A síntese deste composto
ocorre no citosol a partir de hexoses, como a D-glucose. Sendo um antioxidante,
o ascorbato pode reagir com radicais superóxido, peróxido de hidrogênio e
radicais tocoferoxil para formar monodesidroascorbato (MHDA) e/ou
desidroascorbato (DHA). As formas reduzidas são recicladas na via Halliwell-
Asada, na qual há o envolvimento das enzimas monodesidroascorbato redutase
(MDAR) e desidroascorbato redutase (DHAR), usando equivalentes de NAD(P)H
ou glutationa, respectivamente (ASADA, 1992; FOYER e HALLIWELL, 1976).
A glutationa é um tripeptídio (Glu-Cys-Gly) que funciona como antioxidante,
assim como a vitamina C. Esta propriedade é conferida devido ao grupo sulfidrila
da cisteína, que serve como um agente redutor (HAUSLADEN e ALSCHER,
1993). A glutationa oxidada pode ser novamente reduzida através da enzima
redutase da glutationa (RG) dependente de NAD(P)H. Devido à participação
conjunta do ascorbato e glutationa, a via Halliwell-Asada também pode ser
chamada de via/ciclo Ascorbato-Glutationa (APEL e HIRT, 2004).
Outro composto importante como antioxidante é o tocoferol (vitamina E).
Esta vitamina possui um anel de benzoquinona e uma cadeia fitil reduzida que
reage com ROS (FRYER, 1992; HESS, 1993). Além disso, a vitamina E está
relacionada ao controle da peroxidação de lipídios e estabilização da membrana
plasmática.
Além desses compostos, isoprenóides C40 e tetraterpenos, como os
carotenóides, são moléculas antioxidativas importantes que estão presentes nos
plastídios de tecidos fotossintéticos e não fotossintéticos. Juntamente com o
tocoferol, este composto está envolvido no processo antioxidante de espécies
mais reativas, como o oxigênio singlet (KLOTZ, 2002).
1.5.6. Mecanismos Antioxidantes Enzimáticos
1.5.6.1. Dismutase do Superóxido (SOD; EC 1.15.1.1.)
A enzima superóxido dismutase (SOD) foi isolada pela primeira vez por
Mann e Kleilis (1938). Subseqüentemente, foi identificada por muitos nomes
como: eritrocupreina; indofenol oxidase; e tetrazolium oxidase. McCord e
Fridovitch (1969) descobriram a função catalítica da enzima e hoje está
estabelecido que ela catalisa a reação de dois radicais superóxido para a
formação de uma molécula de H2O2 e uma de O2. Diferentes isoformas são
encontradas no apoplasto, no citosol, nas mitocôdrias, nos peroxissomos e nos
cloroplastos (APEL e HIRT, 2004).
Existem quatro tipos distintos de SOD, classificadas com base no íon
presente no seu sítio ativo. SOD que apresentam cobre e zinco (CuZnSOD) são
encontradas em eucariotos e são as mais abundantes em plantas (SCANDALIAS,
1993). As CuZnSOD presentes no citosol geralmente apresentam estrutura
homodimérica, enquanto as do apoplasto são homotetraméricas. Embora
isoformas de CuZnSOD estejam em maior quantidade nas plantas, outras
isoformas de SOD que apresentam ferro (FeSOD) ou manganês (MnSOD) são
observadas em organelas como cloroplasto e mitocôndria de diferentes
eucariotos. No entanto, isoformas que apresentam níquel (NiSOD) em seus sítios
ativos são relatadas apenas em bactérias do gênero Streptomyces (FRIDOVICH,
1998).
1.5.6.2. Peroxidase do Ascorbato (APX; EC 1.11.1.11)
Durante o processo de infecção, as isoformas de peroxidases do ascorbato
(APX) eliminam peróxido de hidrogênio em uma reação dependente de ascorbato
(VENICE et al., 2002). Assim como as isoformas de SOD, as APX estão
distribuídas em muitos compartimentos da célula, tais como mitocôndrias,
cloroplastos, peroxissomos, citosol e apoplasto (VANACKER et al., 1998).
A APX requer um sistema de regeneração de ascorbato e glutationa, o ciclo
Ascorbato-Glutationa. A desentoxificação de H2O2 ocorre pela oxidação de
ascorbato a MHDA, que pode ser regenerado pela MDAR. A regeneração é
mediada por DHAR dirigida pela oxidação de glutationa. Finalmente, a glutationa
oxidada pode ser reduzida pela enzima RG (APEL e HIRT, 2004; ASADA, 1992;
FOYER e HALLIWELL, 1976).
Estudos têm mostrado que a APX e a catalase (CAT) são as principais
enzimas responsáveis pela eliminação de H2O2 nas plantas (SIEGEL, 1993). Da
mesma forma, ambas são sensíveis ao AS e ao óxido nítrico (NO), cujo aumento
causa inibição destas enzimas e, conseqüentemente, elevação dos teores de
H2O2 (KLESSIG et al., 2000).
1.5.6.3. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6.)
A enzima CAT catalisa a conversão de H2O2 em água e oxigênio. Diferente
da APX, a CAT não requer um co-fator antioxidante e nem um sistema de
regeneração (APEL e HIRT, 2004). Esta oxirredutase possui quatro grupos
ferriprotoporfirínicos que são essenciais para desempenhar sua atividade.
Esta enzima é encontrada em todos os eucariotos aeróbicos e muitas
isoformas têm sido descritas em muitas plantas. São enzimas que apresentam
isoformas no citosol e mitocôndria, mas são encontradas principalmente nos
peroxissomos e glioxissomos (SCANDALIAS, 1993; SIEGEL, 1993). São
extremamente sensíveis à fotoinativação e podem ser inativadas por altas
concentrações de H2O2 (ANDERSON et al., 1995).
2 – OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Na interação entre planta e patógeno, o H2O2 é considerado uma molécula
muito relevante, sendo o aumento ou diminuição de sua concentração cruciais
para a defesa da planta. Assim, o modelo do presente trabalho foi baseado em
estudos realizados sobre a interação entre a cultivar suscetível de feijão-de-corda,
BR-3, com o fungo C. gloeosporioides. Nesta interação é observado baixo
acúmulo de H2O2, diferente do patossistema envolvendo a cultivar resistente TE-
97 que aumenta. Dessa forma, a pergunta central que norteou o presente trabalho
foi:
“Alterações nas concentrações fisiológicas de H2O2 em feijão-de-corda
determinariam alguma diferença quanto ao grau de resistência/susceptibilidade da
planta à doença causada pelo fungo hemibiotrófico C. gloeosporioides?”
Portanto, o presente estudo foi conduzido com o objetivo central de
elucidar o papel do H2O2 na interação feijão-de-corda x C. gloesporioides, através
da manipulação de seus teores na planta, investigando as respostas do
hospedeiro e o desenvolvimento do fungo diante de dois tipos de situações: com
os níveis aumentados ou diminuídos de H2O2.
2.2. Objetivos Específicos
1 – Induzir alterações nos teores de H2O2 presentes em folhas primárias
destacadas, através da intervenção de substâncias farmacológicas;
2 – Medir os teores de H2O2 nas folhas primárias destacadas tratadas com as
substâncias farmacológicas;
3 – Avaliar a peroxidação de lipídios em folhas primárias destacadas tratadas com
as substâncias farmacológicas;
4 – Avaliar o desenvolvimento do fungo e a formação de necroses nas folhas,
através de análises macroscópicas;
5 – Avaliar os vários estágios de desenvolvimento do fungo e de suas estruturas
relacionadas à infecção, através de análises microscópicas.
3 – MATERIAIS
3.1 Sementes
Sementes maduras quiescentes de feijão-de-corda (V. unguiculata),
genótipo BR-3 TRACUATEUA (BR-3), foram fornecidas pela Empresa Brasileira
de Pesquisa Agropecuária, Unidade do Estado do Piauí, Embrapa Meio Norte.
3.2. Fungo
O fungo C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [teleomorfo: G. cingulata
(Stonem.) Spauld. & von Schrenk] foi obtido da micoteca do Laboratório de
Microbiologia do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará
(UFC). A cultura do fungo foi mantida em placas contendo meio de cultura Batata-
dextrose Ágar (BDA), à temperatura de 22 ºC.
3.3. Materiais para Certificação do Fungo
Kit de seqüenciamento (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing
Kit), matriz de poliacrilamida (MegaBACE Long Read Matrix) e marcadores
moleculares para eletroforese em gel de agorose foram adquiridos da Amersham
Bioscience Corp. (USA). Oligonucleotídeos sintéticos, para as reações de PCR,
foram sintetizados pela Invitrogen do Brasil. Os demais reagentes também foram
de grau analítico e obtidos comercialmente.
3.4. Reagentes Químicos
Ácido láctico, ácido salicílico, ácido tricloroacético (TCA), ácido
tiobarbitúrico (TBA), azul de Evans, Calcofluor White M2R, catalase isolada de
fígado bovino (E.C. 1.11.1.6), cloreto de difenilenoiodônio (DPI), 3,3-
diaminobenzidina (DAB), fenol, glicerol e glucose oxidase proveniente de
Aspergillus niger (E.C. 1.1.3.4) foram obtidos da Sigma-Aldrich Co., St. Louis
USA. Os demais reagentes utilizados também foram de grau analítico e obtidos
comercialmente.
4 – MÉTODOS
4.1. Identificação do Fungo
Para assegurar a taxonomia do fungo estudado foi feito a identificação da
espécie pela análise das seqüências do agrupamento interno ITS-1, 5,8S e ITS-2.
4.1.1. Purificação do DNA genômico
O DNA genômico do fungo foi purificado de acordo com a metodologia
descrita por Warner (1996), usando CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio), um
detergente muito empregado na purificação de DNA genômico, com pequenas
adaptações para as condições experimentais do presente trabalho.
No início do experimento foi adicionado ao tampão de extração [Tris-HCl
100 mM pH 8,0; EDTA 20 mM; NaCl 1,4 M; CTAB 2% (m/v) e 2-mercaptoetanol
0,2% (v/v)] 5 µL de proteinase K (USBTM Inc. EUA) para hidrolisar algumas
ligações da parede celular do fungo. No final, foi realizado um tratamento com 5
µL de RNAse A por 1 hora na temperatura de 37 ºC. Após a extração do DNA
genômico, uma nova precipitação foi realizada adicionando ao sistema uma
solução de acetato de amônio a 10% e, depois de 5 minutos, foram somados 2,5
volumes de etanol 100%. Em seguida, foi feita centrifugação a 1000 x g, por 20
minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi então descartado, o
precipitado lavado com etanol a 70% e submetido a uma nova centrifugação a
1000 x g por 10 minutos. Posteriormente, o precipitado foi suspendido novamente
em tampão TE [Tris – HCl 10 mM pH 8,0, contendo EDTA 1 mM (TE)]
esterilizado.
Eletroforeses de DNA em gel de agarose 0,8%, pH 8,0, foram
desenvolvidas de acordo com o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989)
para averiguar a qualidade da extração do DNA por análise qualitativa de
formação de bandas.
4.1.2. Reação em cadeia da DNA polimerase e Seqüenciamento dos
Fragmentos Amplificados
As seqüências do agrupamento ITS-1, 5,8S e ITS-2 foram amplificadas por
reações em cadeia da DNA polimerase (PCR), a partir de DNA genômico isolado
de micélio do fungo. Para isso, foram utilizados iniciadores específicos da
Invitrogen Brasil LTDA (São Paulo, Brasil), ITS 5 (5´-
GCAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3´) e ITS 4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-
3´), para as extremidades que flanqueiam as referidas seqüências (Figura 4.1).
As misturas dos reagentes para PCR foram realizadas em tubos de 0,2 mL,
específicos para este tipo de reação, da Axygen Scientific Inc. (Union City – CA,
EUA). As reações de amplificação foram realizadas em um volume de 25 µL
contendo Tris-HCl a 20 mM, pH 8,4, KCl a 50 mM, MgCl2 a 1,5 mM, dATP, dCTP,
dGTP e dTTP a 100 µM cada, oligonucleotídeo (5 µmoles) e 1,25 U Taq DNA
polimerase (Invitrogen Brasil LTDA, São Paulo, Brasil). A cada tubo foi
acrescentada uma quantidade de 300 ηg de DNA e um volume de água estéril
para se obter um volume final de 25 µL por reação.
Figura 4.1 – Representação esquemática da organização dos genes de rDNA, em
eucariontes, e do anelamento dos oligonucleotídeos ITS-4 e ITS-5 nas suas
respectivas regiões. NTS – “espaçador não transcrito”, ETS – “espaçador
transcrito externo” e ITS – “espaçador transcrito interno”. Modificado de Doyle
(1987).
18 S rDNA
28 S rDNA
5,8 S rDNA
ITS-1 ITS-2
ITS-5
ITS-4
5’ 3’ NTS NTS ETS
As amplificações foram realizadas em um termociclador PTC-200 (MJ
Research Inc.,EUA) programado para um passo de desnaturação (4 min a 94 ºC),
seguido por 35 ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 55 ºC e 2 min a 72 ºC. O último
passo foi seguido por uma incubação por 10 min a 72 ºC. Para a visualização dos
resultados das reações de PCR, descritos a seguir, foi realizada uma eletroforese
em gel de agarose a 1,0%, pH 8,0, seguindo o protocolo de Sambrook et al.
(1989).
Os produtos de PCR foram diluídos na proporção de 1:20 e submetidos a
reações de seqüenciamento pelo método da terminação da cadeia por
didesoxinucleotídeo (SANGER, 1977), em reações de 10 µL de acordo com as
especificações do fabricante (Amersham Pharmacia Biotech, DYEnamicTM ET
terminator). As amostras foram submetidas a um seqüenciador automático
(MEGABACE 1000, Amersham Pharmacia Biotech) e a análise inicial dos dados
obtidos do seqüenciamento foi feita por um pacote de programas, “MEGABACETM
DNA Sequencing System” (Amersham Pharmacia Biotech).
4.1.3. Montagem dos Fragmentos Obtidos, Alinhamento e Edição da
Seqüência
O resultado bruto do seqüenciamento proveniente das intensidades das
fluorescências foi submetido a um pacote de programas para montagem e
obtenção das seqüências de consenso, Phred (EWING et al., 1998; EWING e
GREEN, 1998) Phrap (Phil Green, University of Washington), em ambiente Linux.
As seqüências consensos das repetições montadas pelos programas foram
visualizadas e editadas pelo programa de interface gráfica Consed (GORDON et
al., 1998, 2001), e alinhadas com o auxílio do programa CLUSTALX, versão 1.82
(THOMPSON et al., 1997). A seqüência completa do fungo foi submetida à busca
por similaridade no GenBank (NCBI – National Center Biotechnology Information)
através da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL
et al., 1990 e 1997), para, a partir da similaridade com outras seqüências
depositadas, determinar se as seqüências consenso obtidas realmente
correspondem às regiões desejadas.
4.2. Obtenção dos Esporos
O fungo foi mantido em meio de cultura BDA. Na preparação do meio de
cultura, 39 g de BDA foram dissolvidos em água grau Milli-Q, q.s.p. 1 litro. A
seguir, o meio foi autoclavado (121 ºC, 20 minutos, 1,5 atm) e, após, distribuído
(20 mL) em placas de Petri de 10 cm de diâmetro. Após 12 dias de cultivo a 27 ºC
(fotoperíodo 12 h claro – 12 h escuro), os esporos foram liberados da superfície
das culturas do fungo com auxílio de uma espátula de Drigalsky, manuseada,
gentilmente, sobre a superfície da cultura. Esta suspensão foi filtrada em malha
de nylon e a concentração de esporos ajustada para 2 x 105 conídios mL-1, após
contagem com auxílio de Câmara de Neubauer.
4.3. Tratamento e Germinação das Sementes
As sementes de feijão-de-corda foram desinfetadas com NaOCl 0,05 %
(cloro ativo) por três minutos e, em seguida, lavadas abundantemente com água
destilada (Figura 4.2 A). Para germinação das sementes, foi utilizado papel toalha
de germinação Germitest®, nas dimensões de 28 x 38 cm (Figura 4.2 B),
umedecido com água destilada em um volume correspondendo 2,5 vezes ao seu
peso seco (Figura 4.2 C, D e E). As sementes, em número de 12, foram dispostas
em uma única fileira, sobre três folhas de papel sobrepostas, a uma distância
média de 4 cm do ápice da folha e 2 cm das bordas laterais (Figura 4.2 F). Após a
distribuição das sementes, o papel foi dobrado na forma de cartucho. Um grupo
de três cartuchos foi envolto por uma única folha de papel de germinação e
colocado dentro de um saco plástico transparente, desinfetado com álcool a 70%,
com o objetivo de manter as condições de umidade (Figura 4.2 G). O sistema foi
transferido para câmara de germinação com fotoperíodo ajustado para 13 horas
claro e 11 horas escuro, com intensidade luminosa de 110 µE.m-2.seg-1, umidade
relativa de 70% e temperatura de 27 ºC (Figura 4.2 H). Após o quarto dia de
plantio, as plantas sadias foram coletadas e transferidas para meios hidropônicos
em vasos de polietileno de 3 L, contendo 2,5 L de solução nutritiva de Hoagland &
Arnon (1950) diluída 10 vezes (Figura 4.2 I, J e L). O sistema foi mantido sob
aeração, utilizando-se de bombas aeradoras. Três dias após o transplantio, a
solução nutritiva foi concentrada, adicionando, em cada vaso, 80 mL de solução
estoque 5 vezes concentrada (1:5). As plantas foram mantidas sob as condições
da câmara por mais 8 dias (Figura 4.2 M).
Figura 4.2 – Tratamento e germinação das sementes de feijão-de-corda, genótipo
BR-3. (A): Tratamento com NaOCl 0,05 % (cloro ativo); (B): Papel de germinação;
(C), (D) e (E): Papéis de germinação umidificados com água destilada; (F):
Disposição das sementes; (G): Envolvimento do cartucho com saco plástico; (H):
Detalhe dos cartuchos dispostos na câmara; (I): Detalhe dos vasos e da solução
hidropônica sendo aerados; (J): Disposição das sementes transplantadas; (L):
Detalhe das condições da câmara, vasos, umidificador e aeradores; (M): plantas
com 8 dias após transplantio.
4.4. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com Substâncias
Farmacológicas
Folhas primárias de plantas sadias, crescidas sob condições hidropônicas,
foram destacadas no oitavo dia após transplantio e, com auxílio de uma seringa,
tratadas com substâncias farmacológicas produtoras ou eliminadoras de peróxido
de hidrogênio. O tratamento foi feito por infiltração, seguindo metodologia descrita
por Zhang et al. (2004), modificado para as condições do experimento.
Para elevar os níveis de H2O2 foliar, as folhas foram tratadas com ácido
salicílico a 1,0; 2,5 e 5,0 mM (AS). A injeção foi realizada na região abaxial, em
quatro campos da folha (2 do lado esquerdo e 2 do lado direito da nervura
central), utilizando-se seringa descartável de 1 mL (Injex Indústrias Cirúrgicas
LTDA), até atingir uma área foliar de 1 – 2 cm2 (Figura 4.3 b). Folhas tratadas com
água destilada serviram como controle. Para medir a área de infiltração na folha,
foi utilizado papel com medidas milimétricas impresso em transparência plástica e
com perfuração para encaixe da seringa (Figura 4.3 a). Após isso, as folhas foram
transferidas para placas de Petri contendo papel toalha umidificado com água
destilada estéril, na proporção 1:2,5 (m/v), para prover cerca de 100% de
umidade. As folhas permaneceram no escuro, a 28 ºC ± 2 ºC, para posterior
análise.
Com o mesmo objetivo, outro grupo de folhas foi tratado com oxidase da
glucose (GO), na concentração de 50; 100 e 200 U mL-1. A enzima foi dissolvida
com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5, contendo 2,0 mM de glucose
(GO+G), no momento da infiltração, de acordo com especificações de Grant et al.
Figura 4.3 – Folhas primárias destacadas de feijão-de-corda infiltradas com
substâncias farmacológicas, atingindo uma área de 1 – 2 cm2 de infiltração. (A):
Detalhe da folha primária e do medidor de área foliar; (B): Detalhe da infiltração
utilizando seringa descartável; (C): Região adaxial da folha após infiltração; (D):
Região abaxial da folha após infiltração.
(2000). Folhas tratadas com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5 serviram
como controle.
Com o propósito de diminuir os níveis de H2O2, folhas primárias foram
tratadas com catalase (CAT) na concentração de 500; 1000 e 2000 U mL-1, em
tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5. Outro grupo de folhas foi tratado com 1,0,
2,5 e 5,0 µM de cloreto de difenilenoiodonio (DPI), dissolvido em DMSO 0,05%,
com o intento de inibir a oxidase do NAD(P)H. Folhas tratadas apenas com
tampão fosfato e DMSO serviram como controles.
Embora a concentração de tampão fosfato de sódio utilizada para dissolver
a enzima CAT tenha sido 50 mM, tampões com concentrações de 10 mM e 25
mM foram infiltrados em folhas primárias para avaliar, preliminarmente, que
concentração de tampão não interferia nos níveis de H2O2. Da mesma forma,
soluções de DMSO 0,010%, 0,025% e 0,050% foram testadas com o mesmo
intuito.
4.5. Determinação do Teor de Peróxido de Hidrogênio
4.5.1. Determinação Quantitativa
O acúmulo de peróxido de hidrogênio foi determinado de acordo com a
metodologia descrita por Gay et al. (1999). Folhas primárias destacadas foram
analisadas 2, 12 e 24 horas após tratamento com as substâncias farmacológicas .
Para isso, as folhas foram cortadas nas regiões que haviam sido infiltradas e, em
seguida, estas regiões foram armazenadas a -85 ºC. Em seguida, o material foi
homogeneizado com tampão borax-borato, 50 mM, pH 8,4, em gral, na proporção
de 1:5 (m/v). Logo após a homogeneização, a suspensão foi centrifugada (20 min,
12000 x g, 4 °C), e o sobrenadante usado para o ensaio. A mistura reacional
consistiu de 200 µL do sobrenadante + 1 mL da solução de alaranjado de xilenol
(100 µL solução A + 10 mL solução B); (solução A: FeSO4, 25 mM + (NH4)2SO4,
25 mM + H2SO4, 2,5 M + água grau Milli-Q, q.s.p. 10 mL. solução B: alaranjado de
xilenol, 125 µM + sorbitol, 100 mM + água grau Milli-Q, q.s.p. 100 mL). A mistura
reacional foi incubada por 30 minutos, à temperatura ambiente, e a absorbância
lida a 560 nm. Uma curva padrão com concentrações conhecidas de peróxido de
hidrogênio (0 – 8,0 nmol H2O2/1,2 mL) foi construída e usada para determinar a
quantidade de peróxido de hidrogênio nos tecidos vegetais.
4.5.2. Determinação Qualitativa
Para avaliar o teor de peróxido de hidrogênio nos tecidos foliares tratados
com substâncias farmacológicas, foi utilizado diaminobenzidina (DAB) (Thordal-
Christensen et al., 1997). Além dos tratamentos com AS, GO+G, CAT e DPI, e
seus respectivos controles (H2O, tampão e DMSO), folhas íntegras tratadas e não
tratadas com DAB, e folhas apenas com a lesão da seringa tratadas com DAB
foram analisadas. A infiltração com DAB (1 mg mL-1) foi conduzida segundo
Lohaus et al. (2001), modificado para as condições do experimento, como
descrita a seguir. DAB (100 mg) foi dissolvido em, aproximadamente, 50 mL de
água Milli-Q e o pH da solução ajustado para 3,0 com HCl 1 N (baixo pH é
necessário para solubilizar DAB). Posteriormente, a solução foi incubada a 50 ºC,
sob agitação, por 1 hora. Em seguida, o pH foi ajustado a 4,0 com NaOH 1N, o
volume aferido para 100 mL e a solução transferida para Kitassato acoplado a um
compressor (Dia-Pump®, Fanem LTDA®). Folhas primárias tratadas com as
substâncias farmacológicas foram coletadas nos tempos de 2 e 12 horas e
transportadas para o Kitassato contendo solução de DAB. Em seguida, as folhas
foram submetidas a uma pressão positiva de, aproximadamente, 20 kPa, por 10
minutos. Após lavagem com água destilada e de 8 horas de reação, as folhas
foram descoradas com solução de TCA em placas de Petri, até remoção completa
dos pigmentos. A fotodocumentação foi feita com câmera digital.
4.6. Peroxidação de Lipídios (Formação do Complexo MDA-TBA)
A peroxidação de lipídios foi determinada segundo a metodologia descrita
por Peever e Higgins (1989) modificada por Peixoto (1998). Folhas primárias
destacadas foram analisadas 2, 12 e 24 horas após tratamento com as
substâncias farmacológicas. Para isso, as folhas foram cortadas nas regiões que
haviam sido infiltradas. Em seguida, os tecidos infiltrados foram homogeneizados
na proporção de 1:3 (p/v) com ácido tricloroacético (TCA) a 1%, em almofariz de
porcelana, sob banho de gelo. O material obtido foi centrifugado a 12.000 x g, por
15 minutos, o precipitado descartado e o sobrenadante utilizado nas
determinações. 1,0 mL do sobrenadante foi adicionado a 3 mL de 0,5% ácido
tiobarbitúrico (TBA) em TCA 20% e a mistura imediatamente incubada em banho-
maria, a 95 °C, por 2 horas. A reação foi interrompida pelo resfriamento em banho
de gelo. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 9.000 x g, por 10
minutos, a 25 °C e a absorbância lida em duas faixas de comprimento de onda,
532 e 660 nm. Os valores de absorbância a 532 nm foram subtraídos dos valores
lidos em 660 nm (Sudhakar et al., 2001). A quantidade de complexo MDA-TBA
(Malonaldeído – Ácido tricloroacético) formada foi determinada utilizando-se, para
os cálculos, o coeficiente de absorptividade de 155 mM-1 cm-1.
4.7. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com Substâncias
Farmacológicas e Inoculação com o Fungo C. gloeosporiodes
Duas horas após o tratamento com substâncias farmacológicas, duas gotas
de 50 µL de água destilada estéril contendo, cada uma, 104 esporos do fungo
foram depositadas no campo direito da região adaxial do limbo foliar, enquanto
duas gotas de mesmo volume de água, depositadas no campo esquerdo,
serviram como controle. Foram realizadas análises macroscópicas e
microscópicas das folhas nos tempos de 12, 24, 48 e 72 horas após inoculação.
4.8. Análises Macroscópicas
As análises macroscópicas foram feitas através de observações a olho nu,
do número, tamanho e forma das lesões necróticas, e o desenvolvimento micelial
apresentadas nas folhas primárias de feijão-de-corda infectadas com C.
gloeosporioides. As lesões foram registradas através de fotografias com câmera
digital (1800 x 1200 pixels) (MVC-CD350, CD MAVICA SONY®).
4.9. Análises Microscópicas
Após tratamento das folhas primárias com H2O, tampão fosfato, DMSO,
GO+G, AS, CAT e DPI sendo que estes foram descoradas com solução de ácido
tricloroacético (TCA) [1,5 g de TCA em 750 mL de etanol e 250 mL de clorofórmio]
em placas de Petri, até remoção completa dos pigmentos.
Para visualizar as estruturas do fungo, as folhas descoradas foram
cortadas em secções, dispostas sobre lâminas de microscópio e coloridas em
lactofenol azul de anilina (Balows et al., 1991).
Para avaliar estruturas fluorescentes sob luz U.V., as folhas descoradas
foram tratadas com solução de calcoflúor 0,1% (Calcofluor White M2R, Sigma),
um fluorocromo com habilidade de se ligar à celulose e quitina. Antes da
coloração com a solução de calcoflúor, hidróxido de potássio a 10% foi utilizado
para atuar como um agente clareador por dissolução de células dos tecidos. O
corante Azul de Evans (0,04%) foi incorporado para minimizar o campo de fundo
e destacar as outras estruturas fluorescentes.
Todas as lâminas foram visualizadas em microscópio óptico (Olympus
System Microscope BX 60), sob luz branca e, em alguns casos, com
fluorescência de luz azul refletida (Olympus System Attachment Modelo BX-FLA,
Olympus), sendo fotografadas com o sistema de fotomicrografias (Olympus
Photomicrosgraphics System PM 20) acoplado ao microscópio. As
fotomicrografias foram digitalizadas e o brilho, contraste e plano de fundo das
imagens processados para melhor resolução das estruturas microscópicas
(Heath, 2000). Para o processamento das imagens, foram utilizados programas
básicos como Microsoft Office Picture Manager e PhotoImpact XL para Windows.
4.9. Delineamento Experimental
Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, em triplicatas, para
os diferentes tratamentos, sendo cada parcela representada por três plantas. As
análises estatísticas foram conduzidas usando o programa SISVAR e as médias
comparadas pelo teste de Tukey.
5 – RESULTADOS
5.1. Identificação do Fungo
Para confirmar a identidade da espécie do fungo usado neste trabalho, a
seqüência completa do agrupamento ITS-1, 5,8S, ITS-2 foi determinada e
depositada no GenBank (nº. de acesso DQ868520). De acordo com o
alinhamento feito, o comprimento total da seqüência foi de 558 pb, sendo 167 pb
para a região ITS-1 e 157 pb para ITS-2 (Figura 5.1). A seqüência do fungo foi
submetida a uma busca de similaridade através da ferramenta BLAST e
apresentou identidade de 99 – 100% com seqüências ITS de diferentes isolados
de C. gloeosporioides.
5.2. Tratamento com Ácido Salicílico (AS)
5.2.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de
Lipídios
Folhas primárias destacadas de feijão-de-corda foram infiltradas com AS
nas concentrações de 1,0; 2,5 e 5,0 mM com o objetivo de distinguir qual seria a
concentração de AS que elevaria os teores de H2O2 a valores mais altos. Para
permitir comparações com teores basais de H2O2, estes foram determinados em
plantas não tratadas (controles) com substâncias farmacológicas, mas apenas
com água estéril, estando representados, também, na Figura 5.2.
Figura 5.1 – Seqüência consenso completa da região ITS-1, 5,8S, ITS-2 do fungo
C. gloeosporioides com um comprimento total de 558 pb.
CAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGTTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAA
Figura 5.2 – Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-corda
[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas em diferentes tempos após
tratamentos com H2O e com soluções de ácido salicílico (AS) em diferentes
concentrações. Valores basais de H2O2 em folhas que não receberam tratamento
nenhum são, também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas
representam o desvio padrão das médias obtidas. Letras diferentes denotam que
houve diferenças significativas entre as médias de acordo com o teste de Tukey
(ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas representam comparações entre as médias dos
diferentes tratamentos em cada tempo especificado. Letras maiúsculas,
comparações entre as médias de um mesmo tratamento ao longo do período
experimental.
Os dados demonstram não haver diferenças significativas dos teores basais de
H2O2 no intervalo de 2 a 24 horas após tratamento com H2O (Figura 5.2).
Entretanto, folhas tratadas com soluções de AS apresentaram acúmulo de H2O2
chegando a níveis de 186,05 ηmoles g-1 de massa fresca (MF), em folhas tratadas
com 5,0 mM de AS, 2 horas após tratamento (2 hat). Assim, folhas tratadas com
5,0 mM de AS apresentaram níveis de H2O2 aumentados em até 72 %, quando
comparadas com o grupo controle (Figura 5.2).
O acúmulo de H2O2 também foi determinado por análise qualitativa usando
o método de infiltração de DAB. Através dessa técnica, a formação de precipitado
indicou a presença de H2O2, cujo teor aumentou, consideravelmente, após 2
horas de tratamento (2 hat). Tal acúmulo foi visualizado pelo aparecimento de
manchas vermelho-amarronzadas na região infiltrada de folhas tratadas com AS
(Figura 5.3 C e D). No entanto, a polimerização de DAB não foi visualizada em
folhas controles (Figura 5.3 A e B). Para fins comparativos, folhas íntegras
tratadas e não tratadas com DAB, e folhas apenas com a lesão provocada pela
seringa e tratadas com DAB podem ser visualizadas na Figura 5.4.
A peroxidação de lipídios, nas regiões das folhas primárias de feijão-de-
corda tratadas com 5,0 mM de AS, foi observada pela formação do complexo
MDA-TAB. Durante o experimento, foi observado aumento de 112 % nos níveis
de MDA (13,21 ηmols g-1 MF), 2 hat, mantendo a concentração significativamente
constante (ρ < 0,01) no decorrer do tempo (Figura 5.5).
Figura 5.3 – Detalhe do acúmulo de H2O2 em folhas primárias destacadas de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, visualizado através da
polimerização de DAB, depois de tratadas com: (A) - H2O, 2 horas após
tratamento (hat); (B) - H2O, 12 hat; (C) – 5,0 mM de ácido salicílico (AS), 2 hat; e
(D) – 5,0 mM de AS, 12 hat. Zonas de coloração vermelho-amarronzado
representam regiões onde houve acúmulo de H2O2 (setas vermelhas).
Figura 5.4 – Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda
[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, visualizado através da polimerização
de DAB. (A) - Folhas primárias íntegras sem DAB, 2 horas após a coleta; (B) -
Folhas primárias íntegras sem DAB, 12 horas após a coleta; (C) - Folhas
primárias íntegras tratadas com DAB, 2 horas após a coleta; (D) - Folhas
primárias íntegras tratadas com DAB, 12 horas após a coleta; (E) - Folhas
primárias mostrando lesões provocadas pela seringa (setas pretas), tratadas com
DAB, 2 horas após lesão; (F) - Folhas primárias mostrando lesões com seringa,
tratadas com DAB, 12 horas após lesão.
Figura 5.5 – Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias de feijão-
de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em diferentes
tempos, após tratamentos com H2O e 5,0 mM de ácido salicílico (AS). As barras
verticais sobre as colunas representam o desvio padrão das médias obtidas.
Letras diferentes denotam que houve diferenças significativas entre as médias de
acordo com o teste de Tukey (ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas representam
comparações entre as médias dos diferentes tratamentos em cada tempo
especificado. Letras maiúsculas, comparações entre as médias de um mesmo
tratamento ao longo do período experimental.
5.2.2. Análises Macroscópicas
Análises macroscópicas foram realizadas em folhas primárias tratadas com
5,0 mM de AS para avaliação do desenvolvimento de sintomas e de lesões
necróticas relacionadas ao tratamento com o ácido, bem como avaliar o modo de
interação do fungo C. gloeosporioides com o feijão-de-corda. Com isso, o
experimento foi conduzido com o intuito de testar o papel do H2O2 nesta interação
e analisar se este composto confere, ou não, ao feijão-de-corda resistência ao
fungo. As folhas foram avaliadas quanto ao número e intensidade das lesões
necróticas, como também, quanto ao crescimento fúngico em relação à formação
de micélio na superfície destas folhas. Folhas tratadas com H2O serviram como
controle.
As folhas primárias tratadas com AS não apresentaram lesões necróticas
nas primeiras 12 horas após inoculação (hai) (Figura 5.6 A), à semelhança das
folhas controles tratadas com H2O (Figura 5.7 A). Porém, necroses foram
observadas 24 hai (Figura 5.6 B), em contraste ao grupo controle que só
manifestou esse sintoma 48 hai (Figura 5.7 C e D). A colonização feita pelo fungo
foi caracterizada pelo intenso aumento das lesões e pela proeminente
propagação micelial (Figura 5.6 C-F). Entretanto, no grupo controle, as necroses
permaneceram pequenas e confinadas na região do inóculo (Figura 5.7 C-F).
Figura 5.6 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0 mM de ácido salicílico (AS) e
inoculadas com esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50
µL de uma suspensão de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região
infiltrada do lado direito da nervura central. A deposição de água no lado
esquerdo da folha serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após
inoculação (hai); (B) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai
(setas pretas); (C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai
(setas pretas); (D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região
abaxial foliar, 48 hai (seta vermelha); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região
adaxial foliar, 72 hai (seta preta); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do
fungo na região abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).
Figura 5.7 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com H2O e inoculadas com esporos de C.
gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma suspensão de 2 x
105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do lado direito da
nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha serviu como
controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas inoculação (hai); (B) – Região
adaxial foliar, 24 hai; (C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar,
48 hai (seta preta); (D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região
abaxial foliar, 48 hai (seta vermelha); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região
adaxial foliar, 72 hai (seta preta); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do
fungo na região abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).
5.2.3. Análises Microscópicas
Para acompanhar as etapas do desenvolvimento e colonização do fungo C.
gloeosporioides nas folhas primárias de feijão-de-corda tratadas com 5,0 mM de
ácido salicílico (AS), foram realizadas análises através de microscopia de luz.
Para este experimento, folhas primárias tratadas com H2O serviram como
controle. Dessa maneira, o estudo foi dirigido com o propósito de analisar o papel
do H2O2 nesta interação e examinar se este composto está relacionado com a
susceptibilidade do feijão-de-corda ao fungo C. gloeosporioides.
Após inoculação em folhas tratadas com AS, conídios asseptados e
uninucleados com, aproximadamente, 5 µm de comprimento, aderiram à cutícula
e realizaram mitose. Neste processo, houve formação de um novo núcleo que se
localizou do lado oposto daquele que lhe deu origem, sendo separado por um
septo. Os conídios binucleados e septados (12 µm) germinaram e formaram
longos tubos germinativos (Figura 5.8 A), 12 hai, diferindo dos curtos tubos
germinativos em plantas do grupo controle (Figura 5.8 B). Esta estrutura adquiriu
aspecto intumescido formando, então, apressórios (5 – 8 µm) que não se
tornaram, porém, melanizados (Figura 5.8 C). Estes resultados diferiram do grupo
controle, já que os apressórios apresentaram-se melanizados (Figura 5.8 B e D).
Em seguida, o fungo penetrou na planta através dos estômatos, 24 hai (Figura 5.8
E). Embora o fungo tenha desenvolvido apressórios, mas não-melanizados, não
ficou evidenciado o processo de infecção da planta através do uso desta
estrutura, ou seja, de modo direto. Porém, no grupo controle, a penetração direta
foi consistentemente observada, caracterizando-se pela presença da hifa (peg) de
penetração, que emergiu da base do apressório, 48 hai (Figura 5.8 D). Após
penetração nas folhas do grupo controle, o fungo desenvolveu estratégia
hemibiotrófica de infecção, com formação de vesículas de infecção biotrófica em
formato globular (13 – 30 µm de diâmetro) (Figura 5.9 A, B e C), 48 hai. O
processo de infecção foi seguido pela emissão de brotos pela vesícula (Figura 5.9
A e B), que se estenderam para formar as hifas primárias (Figura 5.9 D). Estas
hifas apresentaram comprimento variado e diâmetro de, aproximadamente, 5 µm.
Estas estruturas apresentam a capacidade de se desenvolver intracelularmente e
infectar células vizinhas, produzindo lesões nas superfícies de folhas infectadas.
72 hai, hifas secundárias necrotróficas, com formato cilíndrico e filamentoso,
foram observadas (Figura 5.10 A, B e C). Estas hifas variaram muito em
comprimento, assim como em diâmetro (1,5 – 2,5 µm), sendo este muito menor
em relação às hifas primárias. Assim, o sucesso do processo de colonização ficou
patente pela observação da emissão de vários acérvulos, seguidas pela produção
de novos esporos. Os acérvulos são estruturas de reprodução assexuada do
fungo proveniente da formação da aglomeração de hifas na epiderme (Figura 5.10
D, E e F).
Em contraste, em folhas tratadas com AS, não foram observadas vesículas
globulares biotróficas nem hifas primárias, 24 hai. Porém, hifas secundárias
necrotróficas foram emitidas após infecção, sugerindo que, o fungo infectou o
tecido utilizando uma estratégia subcuticular, intramural necrotrófica (Figura 5.11
A). Este modo de infecção foi caracterizado pela rápida difusão de hifas
secundárias e intenso dano de membrana. Dessa forma, 48 hai, vários acérvulos
foram observados (Figura 5.11 B), aumentando de tamanho entre 48 e 72 hai
(Figura 5.11 C). Em seguida, a formação destas estruturas foi acompanhada por
uma intensa propagação de novos conídios (Figura 5.11 D).
Figura 5.8 – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, observado por
microscopia de luz. (A): Detalhe da germinação de conídios (c) mostrando o
desenvolvimento do tubo germinativo (TG) próximo à região estomática (e) em
folhas destacadas tratadas com 5,0 mM de ácido salicílico (AS), 12 horas após
inoculação (hai); (B): Detalhe da germinação de conídios (c) e do processo de
melanização de apressório (Ap1, Ap2 e Ap3) em folhas tratadas com H2O, 12 hai,
próximo a um estômato (e); (C): Detalhe de tubo germinativo e apressórios não-
melanizados (Ap) em folhas tratadas com AS, 24 hai; (D): Detalhe do apressório
com o poro de penetração em folhas tratadas com H2O, 48 hai; (E): Detalhe de
penetração de tubo germinativo em estômato, em folhas tratadas com AS, 24 hai.
Coloração feita com lactofenol azul de anilina (A , B, C e E) ou calcoflúor e azul de
Evans (D).
Figura 5.9 – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, tratadas com H2O,
observado por microscopia de luz. (A) – (C): Detalhe de conídio (c), tubo
germinativo (TG) apressório (Ap), vesícula de infecção (Ve) e emissão de brotos
(b), 48 hai; (D): Detalhe da formação e aglomeração de hifas primárias (hp), 48
hai. Coloração feita com lactofenol azul de anilina (D) ou calcoflúor e azul de
Evans (A – C). No quadro B, a visualização foi feita por fluorescência.
Figura 5.10. – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, tratadas com H2O,
observado por microscopia de luz. (A) – (C): Detalhe de conídio (c) e formação de
apressório (Ap), vesículas de infecção (Ve), hifas primárias (HP) e hifas
secundárias (HS), 72 hai; (D) e (E): Detalhe da formação de vesículas de
infecção, hifas primárias e desenvolvimento de acérvulo (Ac) com produção de
conídios (c), 72 hai; (F): Detalhe de acérvulos (Ac), 72 hai. Coloração feita com
lactofenol azul de anilina.
Figura 5.11. – Desenvolvimento do fungo C. gloeosporioides nas folhas primárias
de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, tratadas com 5,0
mM de ácido salicílico (AS), observado por microscopia de luz. (A): Formação de
hifas secundárias (HS), 24 hai; (B): Detalhe da formação de aglomerados de hifas
secundárias (HS) e de acérvulos (Ac), 48 hai; (C): Desenvolvimento de grandes
acérvulos, 72 hai; (D): Detalhe da propagação de novos conídios, 72 hai. Cmit –
Conídio em fase mitótica com desenvolvimento de apressório não-melanizado
(Cmit). Coloração feita com lactofenol azul de anilina.
5.3. Tratamento com Oxidase da Glucose (GO) + Glucose (G)
5.3.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de
Lipídios
Inicialmente, folhas primárias destacadas do feijão-de-corda foram
infiltradas com tampão fosfato de sódio nas concentrações de 10; 25 e 50 mM, pH
6,5, para avaliar que concentração seria ideal para a dissolução da enzima GO,
sem interferir no nível basal de H2O2. Esta análise quantitativa não mostrou haver
diferenças significativas (ρ ≥ 0,01) dos teores de H2O2 por ação do tampão (Figura
5.12).
Escolhida a concentração do tampão fosfato, 50 mM, folhas primárias
foram infiltradas com GO nas concentrações de 50; 100 e 200 U mL-1 + 2,0 mM
de glucose (G) com o intuito de averiguar qual seria a concentração da enzima
que promoveria elevação suave do teor de H2O2. O acúmulo de H2O2 chegou a
níveis de até 22 % (144,96 ηmoles g-1 MF) maiores que o grupo controle, nas
folhas tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 2 hat (Figura 5.12). Em
seguida, nos tempos de 12 e 24 hai, os teores de H2O2 em folhas tratadas com
200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G diminuíram cerca de 53 % em relação ao tempo
de 2 horas (Figura 5.12).
A análise qualitativa dos teores de H2O2, usando o método de infiltração de
DAB, mostrou formação de manchas levemente escuras, indicando a
polimerização de DAB na região infiltrada, 2 hat (Figura 5.13). Estes resultados
corroboram com as análises quantitativas, visto que, 2 hat houve maior acúmulo
de H2O2 na região infiltrada.
Figura 5.12 – Teores de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda [V.
unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas em diferentes tempos, após
tratamentos com tampão fosfato e com diferentes concentrações de GO + 2,0 mM
de G. Valores basais de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum
são, também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas representam o
desvio padrão das médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve
diferenças significativas entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤
0,01). Letras minúsculas representam comparações entre as médias dos
diferentes tratamentos em cada tempo especificado. Letras maiúsculas,
comparações entre as médias de um mesmo tratamento ao longo do período
experimental.
Ab
Aa
Aa
Ab
Aa
Aa
Ab
Aa
Aa
Ab
Aa
Aa
Ab
Aa
Aa
Ab
Bb
Bb
Aa
Bb
Bb
0
50
100
150
200
2 12 24
Tempo (h)
H2O
2 (nm
ol g
-1 M
F)
Sem TratamentoTampão 10,0 mMTampão 25,0 mMTampão 50,0 mM50 U de GO + 2,0 mM de G100 U de GO + 2,0 mM de G200 U de GO + 2,0 mM de G
Figura 5.13 – Detalhe do acúmulo de H2O2 através da visualização da
polimerização de DAB em folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, após tratamento com: (A) – Tampão fosfato 50 mM, pH
6,5, 2 horas após tratamento (hat); (B) – Tampão fosfato 50 mM, pH 6,5, 12 hat;
(C) – 200,0 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 2 hat; (D) – 200 U mL-1 de GO + 2,0
mM de G, 12 hat. Zonas de coloração vermelho-amarronzado representam
regiões onde houve acúmulo de H2O2 (setas vermelhas).
A peroxidação de lipídios nas regiões tratadas com 200,0 U mL-1 de GO +
2,0 mM de G em folhas primárias de feijão-de-corda foi observada pela formação
do complexo MDA-TAB. Durante o experimento, foi observado aumento de 36 %
nos níveis de MDA (8,6 ηmols g-1 MF), 2 hat, mantendo concentração
significativamente constante (ρ < 0,01) no decorrer do tempo (Figura 5.14).
5.3.2. Análises Macroscópicas
À semelhança do tratamento das folhas primárias de feijão-de-corda com
AS, o experimento usando 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G foi conduzido para
testar o papel do H2O2 na interação entre feijão-de-corda e o fungo C.
gloeosporioides. O objetivo foi analisar se o aumento dos teores de H2O2 na
planta confere, ou não, resistência do feijão-de-corda ao fungo. As folhas foram
avaliadas da mesma forma que no experimento anterior.
As análises macroscópicas das folhas primárias de BR-3 tratadas com 200
U mL-1 de GO + 2,0 mM de G e inoculadas com esporos do fungo C.
gloeosporioides revelaram lesões necróticas, logo em 24 hai (Figura 5.15 A e B).
Durante este mesmo intervalo de tempo, folhas do grupo controle não
desenvolveram necroses, ao passo que, este sintoma só foi observado 48 hai
(Figura 5.16 A-D). Assim, como no tratamento com AS, o exame macroscópico de
folhas tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G revelou rápida propagação
e intenso desenvolvimento micelial do fungo (Figura 5.15 C-E). Entretanto, folhas
tratadas apenas com tampão fosfato apresentaram apenas necroses de pequena
extensão e com pouco desenvolvimento de micélio (Figura 5.16).
Figura 5.14 – Concentrações de Malonaldeído (MDA) de extratos de folhas
primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas
em diferentes tempos após tratamentos com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e
200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G. As barras verticais sobre as colunas
representam o desvio padrão das médias obtidas em diferentes experimentos.
Letras minúsculas representam comparação das médias dos tratamentos em
cada tempo especificado. Letras maiúsculas representam comparação das
médias de cada tratamento ao longo do período experimental. Letras diferentes
denotam que houve diferenças significativas entre as médias de acordo com o
teste de Tukey (ρ < 0,01).
Figura 5.15 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G e
inoculadas com esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50
µL de uma suspensão de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região
infiltrada do lado direito da nervura central. A deposição de água no lado
esquerdo da folha serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após
inoculação (hai); (B) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai
(setas pretas); (C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai
(setas pretas); (D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região
abaxial foliar, 48 hai (setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões necróticas na
região adaxial foliar, 72 hai (setas pretas); (F) – Detalhe do desenvolvimento
micelial do fungo na região abaxial foliar, 72 hai (setas vermelhas).
Figura 5.16 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com tampa fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e
inoculadas com esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50
µL de uma suspensão de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região
infiltrada do lado direito da nervura central. A deposição de água no lado
esquerdo da folha serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após
inoculação (hai); (B) – Região adaxial foliar, 24 hai; (C) – Detalhe de lesões
necróticas na região adaxial foliar, 48 hai (seta preta); (D) – Detalhe do
desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 48 hai (seta vermelha);
(E) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 72 hai (setas pretas);
(F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 72 hai
(seta vermelha).
5.3.3. Análises Microscópicas
As etapas do desenvolvimento e colonização do fungo C. gloeosporioides
nas folhas primárias de feijão-de-corda, tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM
de G, foram acompanhadas através de microscopia de luz. Para este
experimento, folhas primárias tratadas com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5,
serviram como controle. Dessa maneira, como já mencionado, o estudo foi
conduzido com o propósito de analisar o papel do H2O2 na interação entre feijão-
de-corda e C. gloeosporioides e examinar se este composto está relacionado com
a susceptibilidade do feijão-de-corda ao fungo C. gloeosporioides, agora, através
de observações microscópicas.
O processo infeccioso foi iniciado com a etapa de adesão dos conídios à
superfície do hospedeiro, como observado nos tratamentos anteriores. Não foram
observadas diferenças morfológicas nem na cronologia de desenvolvimento das
estruturas do fungo entre folhas tratadas com tampão fosfato e H2O. Entretanto,
folhas primárias tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G apresentaram, no
tempo de 12 hai, emissão de apressórios não-melanizados que, posteriormente,
tornaram-se melanizados (Figura 5.17 A e B). Nas primeiras 24 hai, o fungo
infectou células hospedeiras utilizando estratégia subcuticular, intramural
necrotrófica. Neste processo, não houve emissão de vesículas de infecção nem
de hifas primárias, caracterizando a não existência da fase biotrófica. A
progressão do crescimento do fungo ocorreu através da emissão de hifas
secundárias necrotróficas estreitas, que se alojaram em células epidérmicas.
Posteriormente, estas hifas se ramificaram e se espalharam para invadir tecidos
vizinhos (Figura 5.17 C). O sucesso do processo de colonização foi evidenciado
pela emissão de vários acérvulos, 48 hai (Figura 5.17 D). Estas estruturas de
disseminação se tornaram mais robustas 72 hai (Figura 5.17 E) e foram
acompanhadas por intensa produção de conídios jovens (Figura 5.17 F).
Figura 5.17. – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 200 U
mL-1 de GO + 2,0 mM de G, observado por microscopia de luz. (A) e (B): Detalhe
da germinação de conídio (c) formando tubo germinativo (TG) e apressório (Ap)
12 e 24 hai, respectivamente; (C): Formação de hifas secundárias (HS), 24 hai;
(D): Formação de acérvulos (Ac) e hifas secundárias (HS), 48 hai; (E):
Desenvolvimento de grandes acérvulos, 72 hai; (F): Detalhe da produção de
novos conídios e da formação de novos apressórios, 72 hai. Coloração feita com
lactofenol azul de anilina.
5.4 Tratamento com CAT
5.4.1 Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de
Lipídios
Com o propósito de diminuir os teores de H2O2, folhas primárias foram
infiltradas com solução de CAT nas concentrações de 500; 1000 e 2000 U mL-1.
As enzimas foram dissolvidas em tampão fosfato de sódio 50,0 mM, pH 6,5,
devido à não intervenção deste tampão nos níveis de H2O2. Dessa forma, esse
experimento foi conduzido para saber que concentração de CAT diminuiria mais
proeminentemente os teores deste composto. Assim, esta solução de
concentração escolhida seria utilizada para os experimentos posteriores.
Todas as soluções de CAT apresentaram diminuição nos teores de H2O2, 2
hat. A solução de 2000 U mL-1 de CAT foi a que reduziu mais os teores de H2O2,
chegando a 46,36 % (55,5 ηmoles g-1 MF) menos do que o controle (119,7
ηmoles g-1 MF) (Figura 5.18). Nos demais tempos examinados, os teores de H2O2
aumentaram e atingiram níveis 86,6 % mais elevados, 24 hai, em comparação ao
tempo de 2 horas (Figura 5.18), mas, mesmo assim, ainda permaneceram abaixo
dos níveis das plantas controles.
A presença de H2O2 também foi detectada por análise quantitativa usando
o método de infiltração de DAB. Durante o experimento, não foram observadas
manchas escuras na região infiltrada (Figura 5.19) que denunciassem a presença
excessiva de H2O2. Dessa forma, estes resultados sugerem que os teores de
H2O2 foram mantidos baixos, corroborando, assim, com os resultados
quantitativos.
Além disso, foi observada, em folhas tratadas com CAT, diminuição de
38,66 % nos níveis de MDA (3,87 ηmols g-1 MF), 2 hat. Estes resultados indicam
diminuição de peroxidação de lipídios nos tecidos infiltrados. Entretanto, os teores
de MDA chegaram a níveis similares ao do controle, 24 hat (Figura 5.20).
5.4.2 Análises Macroscópicas
As análises macroscópicas foram conduzidas para testar o papel do H2O2
na interação entre o feijão-de-corda e o fungo C. gloeosporioides, a fim de
analisar se a diminuição de seus teores na planta confere, ou não, resistência do
feijão-de-corda ao fungo. As folhas foram avaliadas da mesma forma que nos
experimentos anteriores.
Folhas primárias tratadas com CAT 2000 U mL-1 e inoculadas com
suspensão de esporos do fungo C. gloeosporioides apresentaram lesões
necróticas (Figura 5.21 A e B), 24 hai, diferenciando, assim, do grupo controle,
que desenvolveu necroses somente 48 hai (Figura 5.16). Da mesma forma que os
tratamentos com AS e GO, folhas tratadas com CAT desenvolveram lesões mais
extensas e com desenvolvimento micelial mais destacado do que os controles
(Figura 5.21 C-D).
Figura 5.18 – Teores de H2O2 em folhas primárias destacadas de feijão-de-corda
[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em diferentes tempos após
tratamentos com tampão fosfato e com soluções de diferentes concentrações de
CAT. Valores basais de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum
são, também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas representam o
desvio padrão das médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve
diferenças significativas entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤
0,01). Letras minúsculas representam comparações entre as médias dos
diferentes tratamentos em cada tempo especificado. Letras maiúsculas,
comparações entre as médias de um mesmo tratamento ao longo do período
experimental.
Aab
Aab
Aa
Aab
Aab
Aa
Aa
Aab
Aa
Aa
Aab
AabB
b
Aa A
abBbc
Aab A
b
Cc
Bb
Ab
0
50
100
150
200
2 12 24Tempo (h)
H2O
2 (n
mol g
-1 M
F)
Sem TratamentoTampão 10,0 mMTampão 25,0 mMTampão 50,0 mM500 U de CAT1000 U de CAT2000 U de CAT
Figura 5.19 – Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda
[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após tratamento com 2000 U mL-1 de
CAT, através da visualização da polimerização de DAB. (A) e (B) representam
folhas 2 e 12 horas após tratamento, respectivamente.
Figura 5.20 – Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em
diferentes tempos após tratamento com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5, e 2000
U mL-1 de CAT. As barras verticais sobre as colunas representam o desvio padrão
das médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve diferenças significativas
entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas
representam comparações entre as médias dos diferentes tratamentos em cada
tempo especificado. Letras maiúsculas, comparações entre as médias de um
mesmo tratamento ao longo do período experimental.
Figura 5.21 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 2000 U mL-1 de CAT e inoculadas com
esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma
suspensão de 2 x 105 esporos mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do
lado direito da nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha
serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após inoculação (hai);
(B) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai (setas pretas);
(C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai (setas pretas);
(D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 48 hai
(setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 72
hai (setas pretas); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região
abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).
5.4.3. Análises Microscópicas
Análises microscópicas de folhas tratadas com 2000 U mL-1 de CAT
mostraram diferenças nos primeiros estágios de desenvolvimento do fungo em
relação ao grupo controle. Assim, após 12 horas de inoculação (hai), conídios
binucleados desenvolveram tubos germinativos e apressórios. Uma característica
peculiar decorrente deste tratamento foi o desenvolvimento de múltiplos tubos
germinativos e apressórios por um mesmo conídio (Figura 5.22 A).
A penetração nas células epidérmicas pelo fungo foi observada pela
emissão da hifa de penetração, 24 hai. Este processo foi imediatamente seguido
pela formação de várias vesículas biotróficas globulares (Figura 5.22 B),
indicando que o fungo desenvolveu estratégia de infecção hemibiotrófica. Estas
vesículas emitiram brotos que se desenvolveram em hifas primárias filamentosas
de grande diâmetro (Figura 5.22 C). Além disso, foi observado o aparecimento de
massas de hifas em forma de nó na região estomática, indicando a formação de
acérvulo (Figura 5.22 D). Posteriormente, 48 hai, o processo de colonização
prosseguiu com o desenvolvimento de hifas secundárias, seguidas pela formação
de vários acérvulos e propagação de novos conídios (Figura 5.22 E). O progresso
da infecção se tornou mais expressivos 72 hai, quando novas infecções
autóctones foram observadas (Figura 5.22 F).
Figura 5.22 – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 2000 U
mL-1 de CAT, observado por microscopia de luz. (A): Detalhe de conídio (c)
formando tubo germinativo (TG) e apressório (Ap), 12 hai; (B) – (D): Formação de
vesículas de infecção (Ve), hifas primárias (HP) e acérvulo (Ac) na região
estomática (e), 24 hai; (E): Detalhe da formação de acérvulo e da maturação
gradual de conídios (c1, c2, c3 e c4), 48 hai; (F): Propagação de conídios e
formação de apressório, 72 hai. Coloração feita com lactofenol azul de anilina (A,
B, D, E e F) ou azul de Evans (C).
5.5 Tratamento com Cloreto de Difenilenoiodônio (DPI)
5.5.1 Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de
Lipídios
Para preparação da solução de DPI a ser infiltrada nas folhas de feijão-de-
corda, este composto, que é inibidor de NAD(P)H oxidase e, portanto, da
produção de ROS, foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO). Portanto, para
determinação da concentração ideal de DMSO suficiente para dissolução do DPI,
mas sem interferir nos níveis de H2O2 das folhas, DMSO foi infiltrado nas
concentrações de 0,010, 0,025 e 0,050 % (v/v). Estabelecida a concentração
operacional de DMSO (0,05%), folhas primárias foram infiltradas com DPI nas
concentrações de 1,0; 2,5 e 5,0 µM com o intuito de estabelecer qual seria a
concentração que promoveria maior diminuição dos teores de H2O2.
Assim, a análise quantitativa dos teores de H2O2 nas folhas primárias de
feijão-de-corda tratadas com soluções de diferentes concentrações de DMSO não
mostrou diferenças significativas (ρ ≥ 0,01) entre elas. Dessa forma, a solução de
maior concentração, 0,050 %, foi utilizada para dissolver DPI (Figura 5.23 ).
De acordo com a Figura 5.23, os teores de H2O2 somente foram reduzidos
quando foi utilizado DPI na concentração de 5,0 µM. Nesta concentração, as
folhas primárias apresentaram teor de H2O2 54,14 % menor (56,44 ηmoles g-1
MF) do que o grupo controle (123,03 ηmoles g-1 MF), tendo permanecido
constante seu nível no decorrer do experimento. Da mesma forma que o
tratamento com CAT, a análise qualitativa de H2O2 não mostrou manchas escuras
na região infiltrada. Estes resultados indicam a redução dos teores de H2O2,
corroborando com as análises quantitativas (Figura 5.24).
A peroxidação de lipídios nas regiões tratadas com 5,0 µM de DPI em
folhas primárias de feijão-de-corda foi observada pela formação do complexo
MDA-TAB. Durante o experimento foi observado redução de 51,2 % nos níveis de
MDA (3,56 ηmols g-1 MF), 2 hat, mantendo a concentração significativamente
constante (ρ ≤ 0,01) no decorrer do tempo (Figura 5.25).
5.5.2 Análises Macroscópicas
As análises macroscópicas de folhas primárias tratadas com 5,0 µM de DPI
foram conduzidas com o mesmo objetivo do tratamento com CAT. As folhas foram
avaliadas da mesma forma que os experimentos anteriores.
O exame macroscópico das folhas primárias tratadas com 5,0 µM de DPI
apresentou ausência de lesões necróticas nas primeiras 2 horas após inóculo
(hai) (Figura 5.26 A). Durante este mesmo intervalo de tempo, folhas do grupo
controle também não apresentaram necroses (Figura 5.27 A). No entanto, 24 hai,
folhas tratadas com DPI desenvolveram lesões (Figura 5.26 B). Este mesmo
sintoma somente foi observado 48 hai, no grupo controle (Figura 5.27 C). Assim
como nos outros tratamentos (AS, GO e CAT), as necroses cresceram e
expandiram-se, sendo acompanhadas por um intenso desenvolvimento micelial
(Figura 5.26 C-E e 5.27 C-E).
Figura 5.23 – Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-corda
[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em diferentes tempos após
tratamento com soluções de diferentes concentrações de DMSO e de DPI.
Valores basais de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum são,
também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas representam o
desvio padrão das médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve
diferenças significativas entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤
0,01). Letras minúsculas representam comparações entre as médias dos
diferentes tratamentos em cada tempo especificado. Letras maiúsculas,
comparações entre as médias de um mesmo tratamento ao longo do período
experimental.
Figura 5.24 – Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda
[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após tratamento com 0,050% (v/v) de
DMSO, 2 (A) e 12 (B) horas após tratamento (hat) e 5,0 µM de DPI, 2 hat (C) e 12
hat (D), através da visualização da polimerização de DAB.
Figura 5.25 – Concentrações de malonaldeído (MDA) de extratos de folhas
primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas
em diferentes tempos após tratamentos com 0,050 % (v/v) de DMSO e 5,0 µM de
DPI. As barras verticais sobre as colunas representam o desvio padrão das
médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve diferenças significativas
entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas
representam comparações entre as médias dos diferentes tratamentos em cada
tempo especificado. Letras maiúsculas, comparações entre as médias de um
mesmo tratamento ao longo do período experimental.
Aa
Aa
Aa
AbA
b
Ab
0
10
20
2 12 24
Tempo (h)
nm
ol/g
MF
0,050 % de DMSO
5,0 uM de DPI
Figura 5.26 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0 µM de DPI e inoculadas com esporos
de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma suspensão
de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do lado direito
da nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha serviu como
controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após inoculação (hai); (B) – Detalhe
de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai (setas pretas); (C) – Detalhe
de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai (setas pretas); (D) – Detalhe
da região abaxial foliar, 48 hai (setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões
necróticas na região adaxial foliar, 72 hai (setas pretas); (F) – Detalhe do
desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 72 hai (setas
vermelhas).
Figura 5.27 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)
Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 0,050 % (v/v) de DMSO e inoculadas com
esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma
suspensão de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do
lado direito da nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha
serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após inoculação (hai);
(B) – Região adaxial foliar, 24 hai; (C) – Detalhe de lesões necróticas na região
adaxial foliar, 48 hai (seta preta); (D) – Detalhe da região abaxial foliar, 48 hai
(setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 72
hai (setas pretas); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região
abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).
5.5.3. Análises Microscópicas
O exame microscópico do desenvolvimento do fungo, em folhas tratadas
com 5,0 µM de DPI, apresentou as mesmas características do tratamento com
CAT. Da mesma forma, as características morfológicas e cronológicas do fungo e
do processo de infecção, em folhas tratadas com DMSO 0,050 %, não diferenciou
dos tratamentos com H2O e tampão fosfato.
Nas primeiras 12 horas após inóculo (hai), conídios germinaram e
desenvolveram múltiplos tubos germinativos e apressórios (Figura 5.28 A), ao
contrário de folhas do grupo controle. Posteriormente o apressório desenvolveu
hifa (peg) de penetração, que emergiu de sua base 24 hai. Neste mesmo intervalo
de tempo, vesículas globulares biotróficas foram desenvolvidas (Figura 5.28 B)
nas quais, em seguida, emitiram hifas primárias de infecção (Figura 5.28 B e C).
Entretanto, estas estruturas foram observadas somente 48 hai em folhas tratadas
com DMSO. Posteriormente, a fase necrotrófica foi iniciada a partir 48 hai com a
emissão de hifas secundárias, seguidas pela formação de vários acérvulos e
propagação de novos conídios (Figura 5.28 D-F).
Figura 5.28 – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de
feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0 µM
de DPI, observadas por microscopia de luz. (A): Detalhe da germinação de
conídio (C) formando dois tubos germinativos (TG) e um apressório (Ap), 12 hai;
(B) – (C): Formação de vesículas de infecção (Ve) e hifa primária (HP), 24 hai;
(D): Detalhe de hifas secundárias, 48 hai; (E) – (F): Detalhe de acérvulo (Ac) e
conídios (C), 48 e 72 hai, respectivamente. Coloração feita com lactofenol azul de
anilina (A, D, E e F) ou azul de Evans (B e C).
6 - DISCUSSÃO
A classificação de fungos tem cerca de 200 anos e, atualmente, os
sistemas de classificação para Colletotrichum não são eficientes. As espécies
constituintes deste gênero são inadequadamente definidas por características
inapropriadas, pouco entendidas e freqüentemente ignoradas por muitos
fitopatologistas (ABANG et al., 2002; MARTIN E GARCIA, 1999; SHEN et al.,
2001). Para avaliação das hipóteses do presente trabalho, o fungo utilizado para
infectar o feijão-de-corda foi classificado como da espécie Colletotrichum
gloeosporioides, através da análise do agrupamento ITS-1, 5,8S, e ITS-2 do rDNA
(Figura 5.1). A análise da seqüência completa de nucleotídeos deste
agrupamento isolado mostrou 99 – 100 % de identidade com seqüências ITS de
diferentes isolados de C. gloeosporioides presentes no GenBank. Comparação
feita entre a seqüência do fungo estudado (DQ868520) e C. gloeosporioides f. sp.
aeschynomene (NIRENBERG et al., 2002) com nº de acesso AJ301986, mostrou
identidade de 99%, diferenciando apenas em duas posições do alinhamento: uma
inserção/deleção e uma mutação. Da mesma forma, quando a seqüência do
fungo foi comparada com àquelas de C. gloeosporioides isolados de Agavaceae
(DQ286203, DQ286224, DQ286202 e DQ286200), foi possível observar
identidade de até 100%. Além disso, Latunde-Dada et al. (1997) mostraram que
seqüências da região ITS-2 e D2 do rDNA de isolados de Colletotrichum
encontrados em feijão-de-corda apresentavam 97-99% de similaridade com
isolados de alfafa, podendo apresentar modos de infecção similares. Além disso,
espécies de Colletotrichum que causam infecção latente e antracnose em feijão-
de-corda apresentaram 95-96% de identidade com C. gloeosporioides isolados de
Aeschynomene virginica, Stylosanthes scabra e Mangifera indica (LATUNDE-
DADA et al., 1999).
Dessa forma, a maioria dos avanços significativos em taxonomia se deve,
em geral, a comparações de análises de seqüência de DNA (SHERRIFF et al,
1994). Assim, comparações das regiões ITS do rDNA confirmam a utilidade das
análises das seqüências ITS de Colletotrichum para a descriminação de espécies
e resolução de problemas sistemáticos com o gênero (BAILEY et al., 1996;
FREEMAN et al., 2000; LATUNDE-DADA et al., 1996, SHERRIFF et al., 1994,
SHERRIFF et al., 1995, SREENIVASAPRASAD et al., 1996).
A presença do fungo C. gloeoeporioides em monoculturas de genótipos
susceptíveis de feijão-de-corda pode proporcionar grandes problemas, pois essas
plantas não apresentam mecanismos de defesa eficientes para bloquear a
infecção causada pelo patógeno (KOMBRINK E SOMSSICH, 1995). Muitas
moléculas sinalizadoras de resistência têm sido estudadas, sendo que,
atualmente, o H2O2 vem sendo relatado como um composto muito importante no
processo de defesa vegetal (BUCKNER et al., 2000; LU e HIGGINS, 1999; NEILL
et al., 2002).
A infiltração de 5,0 mM de ácido salicílico (AS) em folhas primárias de
feijão-de-corda proporcionou aumento nos teores de H2O2 e peroxidação de
lipídios (Figura 5.2; Figura 5.3; Figura 5.5). O aumento dos níveis de H2O2 está,
geralmente, relacionado à atividade da enzima oxidase do NAD(P)H, presente na
membrana plasmática de células vegetais e de neutrófilos de mamíferos
(WOJTASZEK, 1997). Esta produção de H2O2 é realizada no sítio catalítico gp91pox
desta enzima, no qual muitas proteínas citoplasmáticas regulam sua atividade.
Assim, folhas de Nicotiana benthamiana infiltradas com AS apresentam aumento
de expressão de genes e de transcritos relacionados à síntese desta subunidade
catalítica, responsável por elevar os níveis de H2O2 (YOSHIOKA et al., 2003).
Além disso, o aumento de AS nas plantas causa inibição de CAT e APX, enzimas
responsáveis pela degradação de H2O2 (APEL e HIRT, 2004).
As análises macroscópicas e microscópicas de folhas tratadas com 5,0 mM
de AS mostraram indiretamente que o fungo infecta a planta, utilizando, assim, os
estômatos como porta de entrada (Figura 5.8 E). Inicialmente, antes da infecção,
os conídios desenvolveram longos tubos germinativos e apressórios não-
melanizados (Figura 5.8 A e C). Alguns trabalhos mostram que a comunicação
molecular começa logo quando o conídio adere à superfície do tecido vegetal
(BRAUN e HOWARD, 1994; VIRET et al., 1994). Estudos realizados com C.
gloeosporioides mostram que ácidos graxos presentes na camada de cera das
células vegetais são importantes neste processo de adesão e,
conseqüentemente, no desenvolvimento do fungo sobre a superfície do tecido.
Além disso, a camada de cera contém alguns componentes lipídicos que
estimulam e outros que inibem a formação de apressório (PODILA et al., 1993;
PRUSKY et al., 2000). Assim, de acordo com Ali et al. (2005) o aumento da
concentração de MDA indica peroxidação de lipídios nas regiões onde ocorreu
acúmulo de H2O2. Dessa forma, é sugerido que o acúmulo de H2O2 efetuou
modificações estruturais em lipídios que estão relacionados à formação e ao
desenvolvimento normal do apressório Embora o apressório tenha sido
desenvolvido, a melanização não aconteceu (Figura 5.8 C). Assim como
observado em nosso trabalho, a emissão de longos tubos germinativos e
apressório não-melanizados também pode ser observada em mutantes
deficientes em melanina (CHUMLEY e VALENT, 1990). Neste caso, mutantes que
não expressam os genes PKS1, SCD1 e THR1 não são capazes de sintetizar
melanina e, portanto, não desenvolve o processo de melanização.
Embora folhas infiltradas com 200 U mL-1 de oxidase da glucose + 2,0 mM
de Glucose tenham apresentado aumento nos teores de H2O2 (Figura 5.12), o
mecanismo de alteração da concentração de H2O2 é diferente do tratamento com
5,0 mM de AS. Oxidase da glucose hidrolisa D-glucose a D-glucono-1,5-lactona,
liberando H2O2, numa reação dependente de O2 (MEGAZYME, 2007). Plantas
transgênicas do gênero Arabidopsis infiltradas com 2,5 U mL-1 de glucose oxidase
+ 2,5 mM de glucose apresentaram aumento na produção de H2O2 na região
infiltrada, bem como em regiões infectadas com Pseudomonas syringae pv.
Tomato (GRANT et al., 2000).
No presente trabalho, folhas tratadas com 200 U mL-1 de glucose oxidase +
2,0 mM de glucose não apresentaram mudanças marcantes nas fases iniciais do
desenvolvimento do fungo (Figura 5.17). O fungo penetrou nas células
hospedeiras e desenvolveu estratégia de infecção subcuticular, intramural
necrotrófica, 24 hai (Figura 5.17), desenvolvendo, então, uma vigorosa formação
de acérvulos (Figura 5.17 D e E). Trabalhos mostram que as fases iniciais do
desenvolvimento do fungo são, essencialmente, as mesmas para todas as
espécies de Colletotrichum (MORIN et al, 2000). Durante este processo o conídio
adere à cutícula e germina para produzir o tubo germinativo que, ao longo do
processo, se diferencia em apressório melanizado. Em seguida, uma estreita hifa
de penetração emerge da base do apressório e, posteriormente, penetra
diretamente na cutícula (Van der BRUGGEN e MARAITE, 2000). Como
demonstrado em outros trabalhos, seguindo a penetração da cutícula, este
patógeno não entra imediatamente no lúmen da célula, mas se desenvolve abaixo
da cutícula, dentro das paredes periclinais e anticlinais das células epidérmicas
(PRING et al., 1995). Esta estratégia é marcada por uma difusão rápida pelas
regiões intra e intercelular, causando morte da célula e dissolução das paredes
celulares durante o processo de infecção (PRUSKY et al., 2000).
Os resultados das análises microscópicas das folhas tratadas com 5,0 mM
de AS ou 200 U mL-1 de glucose oxidase + 2 mM de Glucose indicaram relação
do H2O2 na mudança da estratégia de infecção do fungo (Figuras 5.8, 5.11 e
5.17). Muitos trabalhos mostraram a participação do H2O2 na fortificação e
modificação da parede celular vegetal através da formação de ligações cruzadas
de proteínas ricas em hidroxiprolina (HRGPs) e proteínas ricas em prolina (PRPs)
(BRISSON et al., 1994; BUCHANAN et al., 2000; ILYAMA et al., 1994; LEVINE et
al., 1994; SHOWALTER et al., 1985; TENHAKEN et al., 1995). Diante deste
quadro, é possível sugerir que, no presente trabalho, durante a infecção em folhas
de feijão-de-corda, genótipo BR-3, tratadas com 5,0 mM de ácido salicílico ou
200,0 U mL-1 de glucose oxidase + 2,0 mM de glucose, o fungo C. gloeosporioides
(Isolado LPVD II) penetrou na cutícula da célula hospedeira, mas não foi capaz de
perfurar a parede celular devido sua fortificação. Diante destas alterações
estruturais da parede celular vegetal, o fungo, então, desenvolveu estruturas mais
adaptadas às condições adversas, que foram as hifas secundárias (Figura 5.11 A;
Figura 5.17 C), realizando, assim, infecção subcuticular, intramural necrotrófica.
Na folha controle, sem tratamento com ácido salicílco ou glucose oxidase +
glucose, o modo de infecção foi do tipo hemibiotrófico que abrange duas fases
que se alternam entre si, a biotrófica e a necrotrófica, nas quais o fungo progride
em seu desenvolvimento se alimentando de células vivas e, depois, de células
mortas do hospedeiro, respectivamente (Figura 5.9; Figura 5.10).
Em adição aos resultados das folhas tratadas com ácido salicílico e
glucose oxidase + glucose, não pode ser descartada a participação do H2O2 na
formação de ligações cruzadas na parede celular do fungo. Trabalhos mostram
que, durante a fase biotrófica de certas espécies de Colletotrichum que realizam a
estratégia hemibiotrófica, vesículas de infecção e hifas primárias são circundadas
por uma matriz que separa a parede celular do fungo da membrana plasmática da
célula hospedeira (PRUSKY et al., 2000). Recentemente, uma glicoproteína
fúngica rica em prolina e hidroxiprolina, CHI 1, foi identificada associada a esta
matriz (PAIN et al., 1994; PERFECT et al., 1998 e 2001; WHARTON et al., 2001).
Em adição, segundo observações feitas por Wharton et al. (2001), durante o
processo de penetração da cutícula, a hifa de penetração de Colletotrichum
sublineolum é diferenciada em vesícula antes mesmo de penetrar na parede
celular, podendo ser observada a formação de septo na hifa. Dessa forma, a
presença de altos teores de H2O2 no apoplasto da célula hospedeira pode causar
formação de ligações cruzadas das glicoproteínas ricas em hidroxiprolina e
prolina da vesícula imatura, dificultando seu desenvolvimento e forçando o fungo
a se desenvolver através da estratégia necrotrófica de infecção.
Entretanto, no presente trabalho, folhas tratadas com CAT e DPI
apresentaram diminuição dos níveis de H2O2 e baixa peroxidação de lipídios
(Figura 5.18; Figura 5.20; Figura 5.23; Figura 5.25). Estes resultados corroboram
com os de Borden e Higgins (2002), na qual a infiltração de CAT ou DPI em
Lycopersicon esculentum proporcionou diminuição de regiões coradas com DAB,
em conseqüência da diminuição dos níveis de H2O2.
Foi observado, em folhas tratadas com CAT e DPI, um processo de
infecção hemibiotrófico do fungo sendo caracterizado pela formação de vesículas
de infecção com formato globoso (Figura 5.22; Figura 5.28). É sugerido que a
presença de baixos níveis de H2O2 nas folhas da planta hospedeira não
favoreceria, aparentemente, fortificação da sua parede celular nem alteraria,
sensivelmente, a estrutura das vesículas de infecção do fungo (PANSTRUGA,
2003). De acordo com o processo de infecção, o fungo C. gloeosporioides se
assemelha com o do C. lindemuthianum em P. vulgaris. Estas vesículas
apresentaram muita semelhança com àquelas de fungos pertencentes ao
agregado de espécies C. orbiculare (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001;
PRUSKY et al., 2000). Entretanto, diferiram das estruturas de C. destructivum,
infectando feijão-de-corda ou alfafa, casos nos quais são desenvolvidas vesículas
de infecção consideravelmente inchadas, formando estruturas multilobadas que,
eventualmente, expandem para preencher a célula hospedeira (LATUNDE-DADA
et al., 1996 e 1997).
Em adição, folhas controles de feijão-de-corda, genótipo Br-3, que
possuem naturalmente baixos teores de H2O2 (Figura 5.2; Figura 5.12; Figura
5.18; Figura 5.23), também foram infectadas através da estratégia de infecção
hemibiotrófica. Assim, diferente dos outros tratamentos, o grupo controle
apresentou lesões necróticas apenas 48 hai (Figura 5.7; Figura 5.16; Figura 5.27).
Entretanto, subseqüentemente após a formação de hifas primárias (Figura 5.9),
foi possível observar que ocorreu necrotrofia (Figura 5.7 B; Figura 5.16 B; Figura
5.27 B). De acordo com a literatura, a fase biotrófica de fungos hemibiotróficos é
assintomática, diferente da fase necrotrófica (PRUSKY et al., 2000). De acordo
com Wharton et al. (2001), esta fase necrotrófica está associada à formação de
hifas secundárias. Além disso, trabalhos mostram que durante este estágio as
células do hospedeiro morrem rapidamente com o avanço da infecção, sendo que
as paredes celulares das células hospedeiras são rapidamente degradadas e
inchadas, sugerindo a participação de enzimas hidrolíticas que são secretadas
neste estágio (LATUNDE-DADA et al, 1997; O’CONNELL et al, 1996; PERFECT
et al., 2001; WHARTON et al., 2001; WIJESUNDERA et al., 1989). Tendo em
vista que as hifas primárias estão confinadas nas células epidérmicas e nas do
esclerênquima, as hifas secundárias se ramificam por toda a parte da folha,
incluindo células do mesófilo e tecido vascular (PERFECT et al., 2001), o que
explica no presente trabalho, a intensa propagação de hifas na fase necrotrófica.
Trabalhos mostram que, ainda durante esta fase, as hifas secundárias se
desenvolvem entre as células hospedeiras, dentro das células e abaixo da
cutícula. Além disso, compostos de defesa do hospedeiro são sintetizados neste
estágio, mas o crescimento do fungo não é retardado porque as células
hospedeiras que produzem estas substâncias são mortas antes mesmo de
inibirem o desenvolvimento fúngico (PRUSKY et al., 2000).
Foi observado nos tratamento controles e com CAT e DPI a presença de
dimorfismo entre as hifas primárias e secundárias (Figura 5.9; Figura 5.10; Figura
5.22; Figura 5.28). Como notado por Heath e Skalamera (1997), a produção de
micélio dimórfico, com a produção de hifas primárias e secundárias, é uma
característica típica de muitos hemibiotróficos, incluindo C. destructivum, C.
truncatum, C. sublineolum e Magnaporthe grisea (WHARTON et al., 2001;
O’CONNELL et al., 1993; LATUNDE-DADA et al., 1996). A elevada razão
área/volume e a presença de paredes celulares mais finas das hifas secundárias
fazem com que estas estruturas se tornem bastante especializadas para a
nutrição, secreção de enzimas hidrolíticas e de toxinas, durante a fase
necrotrófica.
Em todos os tratamentos o sucesso do processo de colonização pôde ser
observado pela emissão de vários acérvulos (Figuras 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, 5.17,
5.22, 5.28) estruturas responsáveis pela reprodução assexuada e disseminação
de conídios. Além disso, estas estruturas não foram acompanhadas por setas.
Dessa forma, o fungo C. gloeosporioides estudado neste trabalho apresenta
acérvulos glabros, diferente de fungos setosos, como por exemplo, C.
lindemuthianum e C. destructivum (PRUSKY et al., 2000).
Em resumo, os dados referentes à atuação do H2O2 na interação feijão-de-
corda, genótipo BR-3, x C. gloeosporioides sugerem que o acúmulo desta ROS
na planta pode ativar uma estratégia mais violenta e destruidora de infecção do
fungo C. gloeosporioides no feijão-de-corda, como foi visto nos tratamentos das
folhas com 5,0 mM de ácido salicílico e 200 U mL-1 de glucose oxidase + 2,0 mM
de glucose. Em contrapartida, a diminuição dos teores de H2O2, por meio do uso
de CAT e DPI, não limitou o desenvolvimento do fungo na planta. Este fungo é
capaz de desenvolver estratégia de infecção mais branda, porém com o sucesso
da colonização. Estes resultados corroboram com observações feitas sobre a
interação de plantas com fungos necrotróficos, onde o aumento de H2O2 pelo uso
de substâncias farmacológicas facilita a entrada e propagação do patógeno
(GOVRIN e LEVINE, 2000; YE et al., 2006). Contudo, diferem da interação de
plantas com fungos biotróficos obrigatórios, onde o H2O2 atua na morte celular e,
subsequentemente, impede a propagação do fungo nos tecidos vegetais
(BORDEN e HIGGINS, 2002; HÜCKELHOVEN et al., 1999; LU e HIGGINS, 1999;
THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1997). Dessa forma, o H2O2 não confere
resistência ao genótipo de feijão-de-corda, BR-3, contra a infecção de C.
gloeosporioides.
Fica claro, então, que outros estudos deverão ser realizados com o objetivo
de elucidar outros mecanismos que estejam relacionados com a defesa do feijão-
de-corda a esse fungo. Por exemplo, folhas primárias do genótipo TE-97 de
feijão-de-corda, resistente ao fungo C. gloeosporoides, apresentam, além do
acréscimo de H2O2, aumento bastante significativo (ρ ≤ 0,05) dos níveis de β-1,3-
glucanase, que não é observado em folhas primárias do genótipo BR-3,
suscetível, quando infectado por este fungo (BARRETO, 2005). Dessa forma, a
ausência ou inibição de fatores que são ativados pelo H2O2, tais como fosfatases,
proteíno-quinases, MAPK e fatores de transcrição, relacionados à expressão da
enzima β-1,3-glucanase, pode ser crucial para falta de resistência do genótipo
BR-3, ao fungo C. gloeosporioides.
7 – CONCLUSÃO
A partir dos resultados apresentados neste trabalho, referentes ao estudo
do papel do peróxido de hidrogênio na interação feijão-de-corda x C.
gloeosporioides, foi observado que este composto, por si só, não conferiu
resistência ao genótipo de feijão-de-corda, BR-3, contra o ataque de C.
gloeosporioides. Em adição, a manipulação de suas concentrações proporcionou
diferenças quanto à cronologia do processo de infecção e ao tipo de estratégia
utilizada pelo fungo. É sabido que genótipos de feijão-de-corda resistentes ao
fungo C. gloeosporioides apresentam aumento de enzimas superóxido dismutase
(SOD) e diminuição de catalase (CAT), culminando em acúmulo de H2O2.
Entretanto, genótipos suscetíveis apresentam níveis baixos de SOD e altos de
CAT, tendo como conseqüência, diminuição dos teores de H2O2. Assim, de
acordo com os resultados obtidos, o H2O2 isoladamente não pode ser
considerado como único responsável pela resistência do genótipo de feijão-de-
corda. Dessa forma, é sugerida a participação de outras moléculas que estejam
relacionados com o grau de resistência/suscetibilidade da planta a esse
fitopatógeno. Assim, estudos posteriores deverão ser realizados para elucidar que
tipos de mecanismos estão envolvidos em interações incompatíveis e compatíveis
entre feijão-de-corda e C. gloeosporioides.
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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