Copyright © School of Medicine and Pharmacy,...
78
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ------------ TRẦN MAI ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA 2013 - 2018 HÀ NỘI - 2018
Transcript of Copyright © School of Medicine and Pharmacy,...
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
------------
TRẦN MAI ANH
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA 2013 - 2018
HÀ NỘI - 2018
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
------------
TRẦN MAI ANH
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA 2013 - 2018
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH
HÀ NỘI - 2018
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa
Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm
nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện
cho tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban
Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo
trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học
tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa. Chúng tôi xin cảm ơn Khoa Y - Dược,
Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số
CS.17.01).
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
bên cạnh, ủng hộ tôi trong quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Trần Mai Anh
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
CHỮ VIẾT TẮT
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – performance liquid
chromatography)
MS Khối phổ (Mass Spectrometry)
GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)
DAD Đầu dò chuỗi diode (Diode Array Detector)
FLD Đầu dò huỳnh quang (Fluorecence Detector)
LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)
LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)
ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm
sử dụng cho con người (International conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human use)
EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)
BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)
EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)
USP – NF Dược điển và Công thức Quốc gia Hoa Kỳ (United States
Pharmacopoeia – National Formulary)
ATC Mã Giải phẫu – Điều trị – Hoá học (Anatomical – Therapeutic –
Chemical Code)
NSAIDs Nhóm thuốc chống viêm không steroid (Non–steroidal Anti–
inflammatory Drug)
LD50 Liều gây chết 50% sinh vật thí nghiệm (Lethal dose 50%)
ACN Acetonitril
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen ........................................................... 3
1.1.1. Cấu trúc, tính chất ........................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng dược lý ............................................................................ 3
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang ..... 4
1.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................................... 4
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang ..... 8
1.3. Các phương pháp định lượng flurbiprofen ......................................... 10
1.3.1. Phương pháp chuẩn độ .................................................................. 10
1.3.2. Phương pháp quang phổ phân tử ................................................. 10
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................... 11
1.3.4. Phương pháp sắc ký khí ................................................................ 15
1.4. Thẩm định quy trình phân tích ............................................................. 16
1.4.1. Tính đặc hiệu ................................................................................. 17
1.4.2. Độ chính xác ................................................................................. 18
1.4.3. Độ đúng ......................................................................................... 19
1.4.4. Tính tuyến tính .............................................................................. 20
1.4.5. Miền giá trị .................................................................................... 20
1.4.6. Giới hạn phát hiện ....................................................................... 21
1.4.7. Giới hạn định lượng ...................................................................... 22
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 23
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị .............................................................. 23
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
2.1.1. Dung môi, hóa chất ....................................................................... 23
2.1.2. Trang thiết bị ................................................................................. 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 24
2.2.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký .......................................................... 24
2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích ...................................................... 29
2.2.3. Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén ....................... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 31
3.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký ................................................................. 31
3.1.1. Cài đặt các thông số ban đầu ........................................................ 31
3.1.2. Xác định nồng độ dung dịch khảo sát ........................................... 31
3.1.3. Xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu ........ 32
3.2. Thẩm định quy trình phân tích ............................................................. 35
3.2.1. Tính đặc hiệu ................................................................................. 35
3.2.2. Tính tuyến tính và miền giá trị ...................................................... 37
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ................................... 38
3.2.4. Độ đúng ......................................................................................... 39
3.2.5. Độ chính xác ................................................................................. 39
3.3. Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén .............................. 42
3.4. Bàn luận ............................................................................................... 42
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ............................................................................. 50
4.1. Kết luận ................................................................................................ 50
4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Công bố kết quả nghiên cứu
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Số trang
Bảng 1 Đặc điểm của một số đầu dò 11
Bảng 2 Điều kiện chạy nguồn hoá ESI 17
Bảng 3 Chương trình pha động gradient 17
Bảng 4 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa
lớn nhất của ống quang tử 30
Bảng 5 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng
độ dung dịch chuẩn và diện tích pic của flurbiprofen 41
Bảng 6 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương pháp 43
Bảng 7 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp 44
Bảng 8 Kết quả xác định độ chính xác trung gian của
phương pháp 45
Bảng 9 So sánh kết quả độ chính xác của các phương pháp
định lượng 45
Bảng 10 So sánh các thông số thẩm định quy trình định lượng
flurbiprofen của đầu dò DAD và đầu dò FLD 48
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Số trang
Hình 1 Công thức cấu tạo của flurbiprofen 3
Hình 2 Sơ đồ hệ thống HPLC 5
Hình 3 Minh hoạ các thông số sắc ký 6
Hình 4 Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang 13
Hình 5 Thang độ nhạy của đầu dò FLD 29
Hình 6 Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ
400 ng/ml 35
Hình 7 Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ
100 ng/ml 36
Hình 8 Sơ bộ khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng
phát xạ tối ưu 37
Hình 9 Khảo sát bước sóng phát xạ cực đại 37
Hình 10 Khảo sát bước sóng kích thích cực đại 38
Hình 11 Sắc ký đồ ở điều kiện tối ưu hóa với đầu dò FLD 38
Hình 12
Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) và độ
trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu của các pic: sản
phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c)
40
Hình 13 Sắc ký đồ của mẫu phân huỷ dưới tác động của tác
nhân oxi hóa H2O2 với đầu dò FLD 41
Hình 14 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ
flurbiprofen và diện tích pic 42
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
1
MỞ ĐẦU
Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống
viêm không steroid (NSAIDs) có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt.
Khi sử dụng bằng đường uống, flurbiprofen thể hiện hiệu quả trong điều trị
tấn công các bệnh viêm gan cấp tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt
lưng [10]. Viên nén và gel dùng ngoài chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị
triệu chứng của bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm
cột sống dính khớp [10]. Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong
các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm
(viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13]. Bên cạnh chống
viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen còn cho thấy tác dụng ức chế kết tập
tiểu cầu rất mạnh và giảm nguy cơ cũng như trì hoàn sự xuất hiện của bệnh
Alzheimer khi sử dụng lâu dài [17, 23, 25, 32]. Thuốc nhỏ mắt flurbiprofen
được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn ngừa và
làm giảm co đồng tử trong lúc mổ [18].
Trên thế giới, đặc biệt là tại các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ,
flurbiprofen đang được sử dụng rộng rãi dưới nhiều tên thương mại khác nhau
như Antadys, Amedolfen, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên
các thuốc này chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng
không có chuyên luận về Flurbiprofen. Phát triển các nghiên cứu về
flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có
thêm lựa chọn thuốc trong điều trị, nhất là với một thuốc có giá trị ứng dụng
lâm sàng cao và tác dụng đa dạng như flurbiprofen. Một tính chất đáng chú ý
là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ thuốc dẫn nano có cấu
trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,… đang là hướng nghiên cứu
được quan tâm trên thế giới [10, 18, 25, 35].
Trong quá trình tìm hiểu của chúng tôi, cho đến thời điểm hiện tại, trên
thế giới chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò
huỳnh quang để định lượng flurbiprofen trong dược phẩm tinh khiết và các
dạng bào chế được công bố. Số lượng các nghiên cứu sử dụng phương pháp
HPLC ghép đầu dò huỳnh quang để xác định flurbiprofen trong dịch sinh học
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
2
là không nhiều. Điều này càng cho thấy tính mới và cần thiết của việc xây
dựng quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ghép đầu dò huỳnh quang.
Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã tiến hành Xây dựng quy trình
định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100mg bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode–array [2]. Mục tiêu của đề tài
này là tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên
nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh
quang theo hướng dẫn của Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European
Medicines Agency – EMA) [8] và Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục
đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human use) [33].
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen
1.1.1. Cấu trúc, tính chất
Flurbiprofen có danh pháp quốc tế là 2 – (3–flouro–4–phenylphenyl)
propanoic acid. Flurbiprofen là một chất thuộc nhóm acid phenylalkanoic, có
công thức phân tử là C15H13FO2, khối lượng mol phân tử 244,26 g/mol [28].
Cấu trúc phân tử flurbiprofen được mô tả trong hình 1. Flurbiprofen có các
mã ATC là M01AE09, M02AA19, R02AX01, S01BC04 [36], mã Pubchem là
3394 [28] và mã Drugbank là DB00712 [16].
Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen
Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học
(+) S và (–) R. Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống
nhau và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [12].
Flurbiprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh có màu trắng hoặc gần như trắng
và nóng chảy ở 114 – 117oC. Độ tan trong nước của flurbiprofen ở 22oC là 8
mg/L (22oC), các chỉ số LogP và LogS lần lượt là 4,16 và - 4,49 [15, 16, 28].
1.1.2. Tác dụng dược lý
Flurbiprofen là thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) thuộc nhóm
acid 2–arylpropionic mạnh về hoạt động ức chế tổng hợp prostaglandin.
Cơ chế
Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và
cảm nhận đau. Flurbiprofen có tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
4
(COX) không chọn lọc, từ đó ức chế hoạt động của cả hai enzyme COX–1 và
COX–2 – có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2)
và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit arachidonic. Nồng độ prostaglandin giảm
giúp cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt.
Tác dụng dược lý
Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp của
hai đồng phân quang học (+) S và (–) R. Đồng phân (+) S thể hiện hầu hết trong
tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt tính giảm đau.
Thuốc được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài đối
với bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính
khớp, đau thắt lưng, viêm gan cấp tính [10]. Thuốc cũng có thể được sử dụng
để giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình
đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13].
Bên cạnh chống viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen còn cho thấy tác dụng ức
chế kết tập tiểu cầu rất mạnh. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy việc sử
dụng lâu dài flurbiprofen làm giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và trì hoãn
sự xuất hiện của nó [17, 23, 25, 32]. Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật
nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ [18].
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang
1.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển
của pha động lỏng dưới áp suất cao.
Hình 2. Sơ đồ hệ thống HPLC
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
5
Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu nhỏ
đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao. Khi phân tích
sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân
tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với
nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như
không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong
khoa học và công nghiệp [6, 7, 11, 26, 34].
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
– Thời gian lưu
tR (Thời gian lưu) là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào
hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
t0 (Thời gian chết) là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký
tR’ (Thời gian lưu thực): tR’ = tR – t0
W: chiều rộng đáy pic.
W1/2: chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.
Hình 3. Minh hoạ các thông số sắc ký
- Hệ số dung lượng k
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
6
Trong đó:
Vs : thể tích pha tĩnh; Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh; Qm: lượng chất trong pha động
Cần chọn cột, pha động ... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu 1 < k’< 8.
- Hệ số chọn lọc
Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1. Để tách riêng
2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0.
- Hệ số bất đối xứng As
Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.
Trong đó:
W1/20 : chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2. Giá trị của As càng
gần 1 thì pic càng cân đối.
- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số Số đĩa lý thuyết N của cột:
Trong đó:
W: chiều rộng đo ở đáy pic.
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
- Độ phân giải Rs
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
7
Trong đó:
tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
WB , WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn
vị. Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5.
Quá trình định lượng bằng HPLC có thể chia thành 4 bước. Mỗi bước
đều có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng. Các bước này là:
- Lấy mẫu thử
- Tiến hành sắc ký
- Đo tín hiệu đầu dò
- Phương pháp định lượng
Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng
Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [5, 6]:
- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản,
trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện. Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích
(hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong
mẫu thử.
- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử
những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong
cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội. Từ những dữ kiện về
diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội
và mẫu thử có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng
trong mẫu thử một cách chính xác.
- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết
của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến
hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
8
thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng
của diện tích hoặc chiều cao pic.
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một
chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích
pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò
huỳnh quang
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang dựa
trên cơ chế hấp phụ – chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ
và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ). Sắc kí hấp phụ được dùng nhiều để
tách các chất tương đối ít phân cực, các chất hữu cơ không tan trong nước
có phân tử lượng nhỏ hơn khoảng 5000đvC. Phương pháp này mạnh hơn
hẳn các phương pháp khác trong việc tách đồng phân.
Hiện tượng huỳnh quang
Hiện tượng quang – phát quang là sự hấp thụ ánh sáng có bước sóng
này để phát ra ánh sáng có bước sóng khác thường trong miền ánh sáng nhìn
thấy. Định luật Stokes về sự phát quang: ánh sáng phát quang có bước sóng
dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích λpq > λkt.
Huỳnh quang là sự phát quang (phát xạ bức xạ điện từ, thường là ánh
sáng nhìn thấy) thường xảy ra với chất lỏng và chất khí khi phân tử hấp thụ
năng lượng dạng nhiệt (phonon) hoặc dạng quang (photon). Hiện tượng phát
huỳnh quang có thời gian phát quang ngắn, huỳnh quang tắt sau khi ngừng
kích thích khoảng từ 10-8 đến 10-9s. Trong đó thời gian tồn tại của electron ở
trạng thái kích thích là rất thấp, cỡ 10-9 giây.
Quá trình phát xạ năng lượng của huỳnh quang có 2 bước. Bước 1 phát
xạ dưới dạng nhiệt (phonon), bước 2 phát xạ dưới dạng quang (photon) nên
năng lượng photon khi phát xạ sẽ không thể tương đương năng lượng mà
phân tử đã hấp thụ trước đó.
Đầu dò huỳnh quang
Đầu dò là một trong những bộ phận quan trọng được sử dụng trong
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
9
máy phân tích sắc ký. Đầu dò có khả năng phân tích cả định tính và định
lượng [1, 6].
Đầu dò huỳnh quang ứng dụng hiện tượng nhiều hợp chất có khả năng
hấp thụ chùm tia UV rồi sau đó phát ra bức xạ có bước sóng dài hơn ngay
lập tức (huỳnh quang) hoặc sau một thời gian ngắn (lân quang). Phần năng
lượng phát xạ trở lại sau khi bị hấp thụ thường tương đối thấp nhưng ở một
vài hợp chất, phần phát xạ trở lại có thể có độ lớn từ 0.1 – 1 năng lượng hấp
thụ nên thích hợp cho việc dò tìm huỳnh quang [1, 7].
Bảng 1. Đặc điểm của một số đầu dò
Kiểu đầu dò Đáp ứng Mức ồn Giới hạn phát
hiện (g/cm3)
Thể tích
buồng đo (μl)
UV–VIS Chọn lọc 10-4 a.u 10-8
1-8
Huỳnh quang Chọn lọc 10-7 a.u 10-12 8-25
Đo độ dẫn Chọn lọc 10-2 μS/cm 10-7 1-5
Đo chỉ số khúc xạ Phổ thông 10-7 r.i.u 10-6 5-15
Đầu dò huỳnh quang là ứng dụng của quang phổ huỳnh quang. Phổ
huỳnh quang là phổ phát xạ phân tử. Sau khi hấp thụ năng lượng của bức xạ
tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức xạ kích thích), phân tử bị
kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức
xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang F của một dung
dịch loãng tỉ lệ thuận với nồng độ C (mol/l) trong điều kiện xác định khi
cường độ và bước sóng kích thích là hằng số. Việc đo phổ huỳnh quang chỉ
nên tiến hành với dung dịch loãng C < 10-4 mol/l để tránh ảnh hưởng suy giảm
cường độ của bức xạ phát ra [6].
Hình 4. Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
10
Đầu dò huỳnh quang (FLD) là đầu dò nhạy nhất trong số các đầu dò
hiện có của HPLC, có thể phát hiện sự hiện diện của một phân tử chất duy
nhất trong buồng đo. Thông thường, độ nhạy của đầu dò huỳnh quang cao
hơn 10 – 1000 lần so với đầu dò UV – Vis. Đầu dò huỳnh quang chính xác và
có tính chọn lọc hơn các đầu dò quang học khác.
Khoảng 15% các hợp chất trong tự nhiên có huỳnh quang. Đầu dò
huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các
dẫn suất có huỳnh quang. Sự hiện diện của các liên kết liên hợp, đặc biệt là
trong các thành phần thơm có nhiều nhân cho cường độ huỳnh quang cao
nhất. Nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể chuyển sang các dẫn
xuất có phổ này nhờ xử lý với những thuốc thử thích hợp [4, 7].
1.3. Các phương pháp định lượng flurbiprofen
1.3.1. Phương pháp chuẩn độ
Theo Dược điển châu Âu (EP) 2010 [14] và Dược điển và Công thức
Quốc gia Hoa Kỳ (USP 40 – NF 35) [15], phương pháp chuẩn độ dựa vào
phản ứng acid – base của gốc acid trong cấu trúc flurbiprofen. Phương pháp
được thực hiện bằng cách hòa tan 0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó
chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein,
dừng lại khi dung dịch có màu hồng bền hơn 30 giây [15]. Có thể thay thế chỉ
thị phenolphthalein bằng phương pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện
thế [15]. 1 ml dung dịch NaOH 0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2.
Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ
chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và
người phân tích.
1.3.2. Phương pháp quang phổ phân tử
Phương pháp quang phổ phân tử: Phổ UV – Vis, phổ hồng ngoại, phổ
huỳnh quang đóng vai trò quan trọng trong kiểm nghiệm thuốc. Hầu hết các
dược điển đều áp dụng phương pháp này trong định tính, định lượng và thử
tinh khiết của thuốc và chế phẩm.
Nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã giới
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
11
thiệu hai phương pháp quang phổ phân tử định lượng flurbiprofen. Phương
pháp được tiến hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH và EMA [11].
Trong quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp
thụ quang, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV – Vis hai chùm tia
(HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet 1 cm, tốc độ quét
600 nm/phút, dải quét 190 – 320 nm, độ rộng khe 2 nm. Tín hiệu được xử lý
trên phần mềm Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0
trong hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng
nồng độ 1 – 14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn định lượng
(LOD) là 0,60 μg/ml.
Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen
bằng máy đo huỳnh quang. Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang
SHIMADSU RF–5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ
rộng khe 5,0 nm, bước sóng kích thích λex= 248 nm, bước sóng phát xạ λem=
308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên
bản 10.0 trong hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong
khoảng nồng độ 0,05 – 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,8% và LOQ có
giá trị là 0,03 μg/ml.
Các phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện ngắn, ít tốn
kém, độ chính xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các
nồng độ rất nhỏ. Vì vậy, những phương pháp này có thể được sử dụng thành
công để phân tích dược phẩm, liên quan đến kiểm soát chất lượng sản phẩm
thương mại và nghiên cứu dược động học. Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc
hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi các tạp chất lạ và phải kết hợp với các
phương pháp khác để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu.
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
USP 40 – NF 35 [15] và BP 1993 [29] đều đề xuất phương pháp HPLC
để phân tích flurbiprofen tinh khiết và ở dạng phân liều (thuốc viên và thuốc nhỏ
mắt). Cả hai phương pháp đều đề nghị sử dụng pha động acetonitril : nước :
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
12
acetic acid băng (60 : 35 : 5; v/v/v) ở tốc độ dòng 1 ml/phút.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò UV – Vis
Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ
thống HPLC – DAD [14]. Dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp acetonitril :
nước (45:55). Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung môi trên để
được 100 ml. Pha tĩnh là octadecylsilyl silica gel kích thước 5 µm trong cột
thép kích thước 3,9 × 150 mm. Pha động là hỗn hợp axit axetic : acetonitril :
nước tỷ lệ 5 : 35 : 60. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm là 10 µl. Thời
gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu dò DAD phát
hiện tại bước sóng 254 nm.
Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã xây dựng được quy trình định
lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD. Pha tĩnh được sử dụng là cột silica gel
pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm), pha động là hỗn hợp acetonitril : nước
: acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút. Mẫu
được tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký 8 phút, bước sóng phát hiện 247
nm. Thời gian lưu của flurbiprofen là 3,73 phút. Kết quả thực nghiệm cho thấy
trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml, diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ
dung dịch x (μg/ml) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ theo phương trình y
= 0,680x với bình phương hệ số tương quan tuyến tính R2 = 0,9993. Giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml. Phương pháp
đảm bảo tính đặc hiệu với flurbiprofen, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ
phục hồi ≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,71%, độ lệch
chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34% [2].
Phương pháp có những ưu điểm là độ chính xác cao, nhạy với các nồng
độ nhỏ, tính đặc hiệu cao nên có khả năng tách các chất ra hoàn toàn và có thể
áp dụng được cho những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi. Đặc biệt đầu dò
DAD có khả năng quét phổ hấp thụ, ứng dụng trong kiểm tra độ tinh khiết của
mẫu. Nhược điểm của phương pháp là phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền
và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc hiện đại.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
13
Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen
và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng
hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC – MS/MS) [22,
24, 26, 27].
Nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng phương
pháp LC–MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin, Jing Jin,
Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng Zheng,
Hui Chen thực hiện (2015) [24] sử dụng hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu
UFLC LC–30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối phổ
QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ). Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ thuật
ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Điều kiện chạy nguồn
hoá ESI liệt kê trong bảng 2.
Bảng 2. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI
Thông số Giá trị
Áp suất khí phun 30 psi
Thế phun điện tử –4,5 kV
Nhiệt độ mao quản 400 oC
Nguồn ion 40 psi
Đầu dò với các thông số Năng lượng va chạm (CE) = –12 V, Thế phân
nhóm (DP) = –26 V, Thế đầu vào (EP) = –8 V, Năng lượng (CXP) = –8 V.
Ion có dạng 242,9 → 198,7.
Pha tĩnh: cột silica gel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với
một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex.
Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 3.
Bảng 3. Chương trình pha động gradient
Thời gian (phút) Tốc độ dòng
(ml/phút)
Kênh A: Nước:
Acid formic (99,9 :
0,1; v/v)
Kênh B:
Acetonitril: Acid
formic
(99,9 : 0,1; v/v)
0,1 0,4 60 40
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
14
0,6 0,4 15 85
1 0,4 5 95
2 0,4 5 95
2,5 0,4 60 40
Nhiệt độ cột 40oC và thể tích tiêm mẫu là 5 µl. Phương pháp đã xác
định được khoảng định lượng là 0,04–10 μg/ml. Độ chính xác đạt 2,2 – 3,4%.
Phương pháp có độ nhạy và giới hạn phát hiện cao, độ đặc hiệu cao do
tính phân mảnh riêng biệt của các ion, thời gian phân tích nhanh, có thể định
lượng các chất có thời gian lưu giống nhau và độ phân giải cao. Nhược điểm
của phương pháp là không áp dụng cho những chất kém bền nhiệt, dễ bay hơi,
phương pháp sử dụng hệ thống đắt tiền.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang
Phương pháp HPLC–MS / huỳnh quang đã được Kuma và các cộng sự
phát triển để định lượng flurbiprofen cùng dextromethorphan, midazolam và
các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong huyết tương lợn. Các chất được
phân tách bởi cột Luna C8(II) (50 mm L × 3 mm ID) (Phenomenex, Torrance,
CA) với thời gian cho 1 lần chạy mẫu là 20 phút. Flurbiprofen và 4 –
hydroxyl – flurbiprofen được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang còn các
chất còn lại (dextromethorphan, dextrorphan, midazolam và 1 – hydroxyl –
midazolam) được phát hiện bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ
bắn phá ion dương. Hệ thống sắc ký (Shimadzu, Nhật Bản) bao gồm hai máy
bơm LC–10ADVP, một máy khử khí DGU–14A và một bộ lấy mẫu tự động
SIL–10ADVP. Đầu dò sử dụng là đầu dò huỳnh quang RF10–XL (Shimadzu,
Nhật Bản) ghép đầu dò khối phổ LCMS–2010A (Shimadzu, Nhật Bản). Pha
động bao gồm methanol (dung môi A) và đệm ammonium acetate 20 mM
(điều chỉnh đến pH 3,9 với axit formic) (dung môi B). Tốc độ dòng 0,2 ml /
phút và thực hiện sắc ký ở nhiệt độ môi trường. Nồng độ của methanol trong
dung môi tăng từ 40% tại thời điểm tiêm mẫu đến 90% sau 10 phút và duy trì
đến hết quá trình sắc ký (20 phút). Flurbiprofen và 4 – hydroxyl flurbiprofen
được cài bước sóng kích thích λEx = 260nm và bước sóng phát xạ λEm =
320nm [21]. Có thể thấy cặp bước sóng kích thích λEx = 260nm và bước sóng
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
15
phát xạ λEm = 320nm được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác [19, 30].
Một nghiên cứu đã mô tả phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
đảo để xác định flurbiprofen trong huyết thanh người với mục đích nghiên
cứu dược động học đã sử dụng pha động axetonitrile : nước : acid phosphoric
(650 : 350 : 0,5; v/v/v). Tốc độ dòng là 1,0 ml / phút, thể tích tiêm mẫu 20ml
và thời gian chạy cho mỗi mẫu là 8 phút. Quy trình định lượng sử dụng đầu
dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λEx = 250nm và bước sóng phát xạ
λEm = 315nm. Thời gian lưu của flurbiprofen và acid 4 – biphenylacetic lần
lượt là 5 phút và 6,1 phút [9].
Nghiên cứu của Knadler và các cộng sự (1989) lại sử dụng pha động là
acetonitril : nước (62 : 38) với tốc độ dòng 1ml/phút qua cột C18. Quy trình
định lượng sử dụng đầu dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λEx =
200nm và bước sóng phát xạ λEm = 320nm [20].
1.3.4. Phương pháp sắc ký khí
Cơ sở để tách bằng sắc kí khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha: pha
tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bề mặt tĩnh đó [7].
Trong nghiêm cứu của Yilmaz, Bilal và Emrah Alkan (2015), các tác
giả đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống sắc ký
khí ghép đầu dò khối phổ [37]. Trong đó, phân tích sắc ký thực hiện trên hệ
thống sắc ký khí Agilent 6890 N được trang bị đầu dò MS 5973, hệ thống
tiêm mẫu tự động 7673 và phần mềm điều khiển Agilent ChemStation
(Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Cột HP–5 MS có độ dày 0,25 μm (30
m x 0,25 mm, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách. Tiêm mẫu không chia dòng, khí
mang là helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút. Nhiệt độ đầu phun và máy dò là
250°C. Các thông số của đầu dò MS: nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ
dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV. Miền giá trị được xây dựng
trong khoảng 0,25 – 5,0 μg/ml. Độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt
99,4%, LOD và LOQ là 0,05 và 0,15 μg/ml.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời nhiều chất,
độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột, độ nhạy cao nhờ đầu dò, thể tích
tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao. Phương pháp
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
16
này có nhược điểm là giá thành cao, không áp dụng được cho những chất
không bền nhiệt và chất dễ khó hơi.
1.4. Thẩm định quy trình phân tích
Quy trình phân tích hay cũng còn gọi là quy trình thử nghiệm (test
procedures) là sự mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện một thử
nghiệm phân tích (analytical test), bao gồm từ việc chuẩn bị mẫu thử, mẫu
chuẩn và các thuốc thử, việc sử dụng các trang thiết bị, việc xây dựng đường
cong chuẩn độ, cho đến việc sử dụng công thức để tính toán và biện giải kết
quả, v.v…[5]
Thông thường có 4 loại quy trình phân tích được thẩm định [3, 5]:
- Quy trình định tính (identification test)
- Quy trình định lượng tạp chất (quantitative tests for impurities’ content)
- Quy trình thử giới hạn tạp chất (limit test for the control of impurities)
- Quy trình định lượng (quantitative tests of the active moiety or other
components).
Quy trình định lượng là quy trình nhằm đo lường chất cần thử trong
mẫu thử. Đối với chế phẩm, thử định lượng nhằm xác định hàm lượng của các
hoạt chất có trong mẫu chế phẩm đem thử [5].
Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình thực hiện thiết lập các
thông số đặc trưng của phương pháp để cung cấp bằng chứng khách quan
chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách
khác kết quả của việc thẩm định một quy trình phân tích có thể chứng minh
một cách khoa học rằng các sai số mắc phải của quy trình thử nghiệm là rất
nhỏ và chấp nhận được, nhằm đảm bảo quy trình phù hợp và kết quả phân
tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích. [3, 5].
Theo ISO/IEC 17025 – tiêu chuẩn về hệ thống quản lý chất lượng áp
dụng chuyên biệt cho phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn, do Tổ chức tiêu chuẩn
hóa quốc tế International Organization for Standardization (thường gọi tắt là
ISO) phát triển và ban hành, phương pháp phân tích phải được thẩm định
hoặc thẩm định lại khi [3]:
- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
17
(nonstandard method)
- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa
vào sử dụng thành thường quy
- Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng
của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn
- Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm
định (ví dụ: thiết bị phân tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, người
phân tích…).
Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương
pháp” (Validation of analytical procedures: text and methodology) của
ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11
năm 2005 [33], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần
thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và
miền giá trị. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc
phải có trong quy trình thẩm định.
1.4.1. Tính đặc hiệu
Khái niệm
Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác
định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự
có mặt của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự,
tạp chất,…) có trong mẫu thử. Nếu sử dụng kỹ thuật HPLC với đầu dò DAD
và/hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ
giúp tránh nhầm lẫn các hợp chất khác trong mẫu có cấu trúc tương tự với
hợp chất cần định lượng và có lợi trong việc chứng minh rằng pic sắc ký
không phải là pic của hai thành phần trở lên [3, 5].
Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:
- Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không
có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong
khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [3, 5, 31, 33].
Phương pháp xác định
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
18
Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp. Độ nhiễu càng thấp,
tính đặc hiệu càng cao.
Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử
dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các
hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai
thành phần trở lên.
Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự
tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm
phân huỷ.
1.4.2. Độ chính xác
Khái niệm
Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử
riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất
cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện. Độ chính xác
cũng còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so
với giá trị trung bình [3, 5, 31, 33].
Độ chính xác bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.
Phương pháp xác định
Độ lặp lại: Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và
trong khoảng thời gian ngắn, cụ thể là việc tiến hành thử nghiệm được thực
hiện bởi một người trong cùng một phòng thí nghiệm, trên cùng một thiết bị
và trong cùng một thời gian.
Tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy
trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối
thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.
Độ chính xác trung gian: Biểu thị độ chính xác của quy trình theo các
biến số của phòng thí nghiệm tại nhiều ngày khác nhau (độ chính xác liên ngày),
với nhiều kiểm nghiệm viên khác nhau và với các trang thiết bị khác nhau…
Tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể để đưa ra những cách thức xác
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
19
định phù hợp. Nguyên tắc chung là phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các
yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy… thay đổi.
Yêu cầu
Tiêu chuẩn cho giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD phụ thuộc nhiều vào
loại phân tích mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy,
RSD dễ dàng đạt trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính
xác ở khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao
hơn. Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [3, 5].
1.4.3. Độ đúng
Khái niệm
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm
thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng
một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [3, 5, 31, 33].
Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống.
Phương pháp xác định
Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần
mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3
lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo
công thức sau:
Tỷ lệ phục hồi = 𝑋
µ × 100%
Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được
µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.
Yêu cầu
Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý
mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi
thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [3, 5]. Tỷ lệ phục hồi càng gần
giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
20
1.4.4. Tính tuyến tính
Khái niệm
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của
đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).
Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, tính tuyến tính được biểu thị bằng phương
trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2 [3, 5, 31, 33].
Phương pháp xác định
- Khoảng tuyến tính cần được khảo sát ở khoảng 10 (ít nhất 5 [5, 33]
hoặc 6 [3, 31]) mức nồng độ khác nhau.
- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của
phương pháp.
- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. Khi thẩm định
phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo vài lần (3 lần [3]) để kiểm tra độ lặp
của các nồng độ chuẩn.
- Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp:
trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra
tính thích hợp của phương trình.
Yêu cầu
Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,90 ≤ R2 ≤ 1 [5].
1.4.5. Miền giá trị
Khái niệm
Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và
nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ
nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính
chất tuyến tính của phương pháp [3, 5, 31, 33].
Miền giá trị thường được biểu thị bằng khoảng nồng độ mà ở khoảng
nồng độ này vẫn còn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đo được và nồng độ [3,
5, 31, 33].
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
21
Phương pháp xác định
- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định.
- Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ
tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không.
Yêu cầu
Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của
miền giá trị là phải đạt 80% – 120% nồng độ của mẫu thử [3, 5, 31, 33].
1.4.6. Giới hạn phát hiện
Khái niệm
Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp
nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần
phải xác định chính xác hàm lượng [3, 5, 31, 33].
Phương pháp xác định
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định
bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ
nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn
phát hiện được.
- Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử:
áp dụng với quy trình có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền.
Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là
S. LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3.
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
LOD = 3,3 × 𝑆𝐷
𝑎
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng
SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai
cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào
đường chuẩn định lượng.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
22
1.4.7. Giới hạn định lượng
Khái niệm
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp
nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ
chính xác phù hợp [3, 5, 31, 33].
Phương pháp xác định
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ
chính xác: LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết
trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình
phân tích đang thẩm định vẫn định lượng được với độ đúng và độ chính xác
chấp nhận được.
- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu
thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là
nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
LOD = 10 × 𝑆𝐷
𝑎
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ
SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai
cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào
đường cong chuẩn độ
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
23
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị
2.1.1. Dung môi, hóa chất
Flurbiprofen đạt tiêu chuẩn chất chuẩn theo dược điển châu Âu (code:
EPF0285200).
Natri hydroxid, acid chlorhydric, acid acetic, hydropeoxid từ nhà sản
xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu
chuẩn HPLC.
Nước (H2O) được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure
UV–TOC đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m.
Mẫu dược phẩm được định lượng là viên nén Antadys 100mg
Theramex, Pháp số lô 1M620 01 2014.
2.1.2. Trang thiết bị
Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo
Scientific Hoa Kỳ gồm hệ thống bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự động.
Đầu dò FLD Fluorecence Detector: FLD – 3100 Dionex sử dụng đèn
Xenon, khoảng bước sóng đo được 200 – 880 nm.
Đầu dò DAD Diode Array Detector Model: DAD – 3000 Dionex sử
dụng đèn Deuterium (D2) cho khoảng UV và tungsten (W) cho khoảng VIS,
khoảng bước sóng đo được 190 – 800 nm.
Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150mm.
Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang
bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478.
Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC – 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân
phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản, Pipetman Finnpipette F3, Thermo
Scientific, Hoa Kỳ. Bình định mức, ống đong, cối chày, giấy lọc Whatman®
40, đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC 0,45µm, Sartorius, Đức...
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
24
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh
quang, thẩm định quy trình phân tích và ứng dụng phương pháp đã thẩm định
để định lượng flurbiprofen trong viên nén Antadys 100 mg Theramex, Pháp.
Trước khi sắc ký, các mẫu đều được lọc bằng đầu lọc cellulose tái sinh
Minisart® RC 0,45µm, tiêm mẫu 3 lần, lấy giá trị trung bình.
Xử lí thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel.
2.2.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
Khi phát triển một phương pháp HPLC, ta muốn đạt được một mức độ
tách có thể chấp nhận được tất cả các cấu tử ta quan tâm trong mẫu với một
thời gian vừa phải và độ phân giải vừa đủ xác định. Một số mẫu ta chỉ cần
phân tích một hoặc vài cấu tử có trong mẫu.
Ở một mức độ nào đó, sự tách có thể chịu ảnh hưởng bởi các thông số
như nhiệt độ, cột tách, tốc độ dòng của pha động, đầu dò, thể tích tiêm mẫu và
một trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát tách là thành
phần của pha động [7].
Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen bằng phương pháp HPLC –
DAD, chúng tôi sử dụng dung dịch chuẩn flurbiprofen nồng độ 20 μg/ml để
khảo sát và đã xác định được các điều kiện sắc ký tối ưu như sau [2]:
- Pha tĩnh cột silica gel C8 5 μm, 120 Å trong cột 4,6 mm x 150 mm
- Pha động ACN : H2O : CH3COOH tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v)
- Thể tích tiêm mẫu 10 μl
- Tốc độ dòng 1 ml/phút
- Đầu dò ghi nhận tín hiệu tại bước sóng 247 nm
- Thời gian sắc ký 8 phút
Trong nghiên cứu này, các thông số ban đầu được thiết lập tương tự.
Các yếu tố cần được xác định thêm là nhiệt độ buồng đo, độ nhạy của đầu dò,
nồng độ dung dịch khảo sát, bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối
ưu. Phương pháp được tiến hành như sau:
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
25
Nhiệt độ buồng đo
Nhiệt độ của mẫu ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang của nó. Do đó, sự
biến đổi của nhiệt độ môi trường ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu thu nhận được
từ đầu dò huỳnh quang. Đầu dò huỳnh quang mà nghiên cứu sử dụng cho
phép nâng nhiệt độ của buồng đo và kiểm soát nhiệt độ trong buồng đo ở mức
nhiệt độ ổn định để đảm bảo buồng đo ổn định ngay cả khi nhiệt độ môi
trường thay đổi. Cài đặt nhiệt độ của buồng đo cao hơn nhiệt độ môi trường
khoảng 15˚C – như hướng dẫn của nhà sản xuất.
Độ nhạy của đầu dò
Ống quang tử đo cường độ của ánh sáng phát xạ sau khi đi qua bộ tán
xạ đơn sắc. Độ nhạy của ống quang tử được sử dụng để tối ưu tỉ lệ S/N trong
sắc ký. Độ nhạy được điều chỉnh trong quá trình sắc ký và tối ưu theo 8 mức
dựa trên cường độ của quang phổ phát xạ huỳnh quang. Mức 8 ứng với độ
bão hòa của ống quang tử ≥ 100%. Mỗi mức của độ nhạy tăng lên tương ứng
với sự tăng xấp xỉ 2 lần của cường độ quang phổ phát xạ huỳnh quang.
- Nếu lựa chọn độ nhạy quá nhỏ, chiều cao pic giảm xuống và tỉ lệ
S/N không tối ưu.
- Nếu lựa chọn độ nhạy quá lớn, tín hiệu của ống quang tử bão hòa.
Trong trường hợp này đầu dò tự động giảm độ nhạy đã cài đặt. Khi cài đặt độ
nhạy quá lớn, sắc ký đồ có hình dạng như mức 8 ở hình 5, sau đó hệ thống tự
động cài lại độ nhạy trước đó.
Hình 5. Thang độ nhạy của đầu dò FLD
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
26
Nồng độ dung dịch khảo sát
Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen trong chế phẩm dược phẩm
bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang của Bilal Yilmaz và cộng sự
(2015), khoảng tuyến tính được sử dụng là 50 – 350 ng/ml, bước sóng kích
thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm [11].
Từ đó, chúng tôi tiến hành sắc ký dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ
400 ng/ml với bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm =
308nm để đánh giá hình dạng pic trên sắc ký đồ. Dựa vào tín hiệu thu được và
độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử trên phần mềm điều khiển Chromeleon
Dionex, điều chỉnh nồng độ khảo sát phù hợp để giá trị độ bão hòa lớn nhất
của ống quang tử đạt tối ưu (30 – 80%) theo bảng 4:
Bảng 4. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa lớn nhất của ống
quang tử
Giá trị độ bão hòa lớn
nhất của ống quang tử Giải pháp
< 30% - < 30%: Tăng độ nhạy lên 1 mức
- < 15%: Tăng độ nhạy lên 2 mức.
30% – 80% Giá trị độ nhạy là tối ưu.
80% – 99%
Giảm độ nhạy đi 1 mức để tránh độ bão hòa của
ống quang tử không mong muốn khi nồng độ
thay đổi.
≥ 100% Giảm độ nhạy đi ít nhất 1 mức.
Bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu
Với hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn
Thermo Scientific Hoa Kỳ sử dụng đầu dò FLD – 3100, cặp một bước sóng
kích thích và một bước sóng phát xạ tối ưu sau khi được xác định sẽ cho tỉ lệ
S/N tốt nhất ngay cả với những mẫu có nồng độ nhỏ. Phần mềm điều khiển
Chromeleon Dionex phiên bản 7.1 có những chế độ dò bước sóng như sau:
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
27
- Chế độ Zero Order
Trong chế độ Zero Order, bộ tán xạ đơn sắc cho toàn bộ quang phổ đi
qua thay vì chỉ có một bước sóng nhất định. Bước sóng kích thích được đặt
trước thành 1 giá trị như bình thường. Đầu dò FLD – 3400RS có thêm chức
năng lọc vùng bước sóng không mong muốn. Sau đó, cài đặt thuộc tính của
bước sóng phát xạ và bắt đầu quét.
Chế độ Zero Order phù hợp với các mẫu có nhiều chất phát xạ huỳnh
quang với phổ phát xạ của mẫu rộng. Cường độ của ánh sáng phát xạ trong
chế độ Zero Order cao hơn so với khi hệ thống hoạt động bình thường. Điều
này cho phép hệ thống xác định được chất ở những nồng độ rất thấp.
- Chế độ quét 2D
Với đầu dò FLD – 3100, hệ thống có thể ghi lại một số loại phổ 2D.
Các bước sóng kích thích hoặc bước sóng phát xạ (hoặc đồng thời cả hai)
được quét trên một dải bước sóng được cài đặt. Cường độ của các tín hiệu
huỳnh quang sẽ được tính toán và ghi lại liên tiếp với mỗi bước sóng. Qua đó,
chế độ quét 2D ghi lại phổ 2D, từ đó xác định được bước sóng kích thích và
bước sóng phát xạ tối ưu.
Có 3 chế độ quét 2D như sau:
Quét đồng thời
Khi bước sóng kích thích đã được quét trong phạm vi bước sóng được
cài đặt, bước sóng phát xạ được quét đồng thời với một khoảng cách chênh
lệch cố định so với bước sóng kích thích. Chức năng quét đồng thời cho phép
xác định sơ bộ bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ. Tuy nhiên để xác
định chính xác cặp bước sóng tối ưu, cần sử dụng chức năng quét riêng biệt
hai bước sóng.
Quét bước sóng kích thích
Bước sóng phát xạ được giữ cố định trong khi bước sóng kích thích
được quét trên một dải bước sóng được cài đặt. Kết quả là phổ kích thích
của mẫu.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
28
Quét bước sóng phát xạ
Bước sóng phát xạ được giữ cố định trong khi bước sóng kích thích
được quét trên một dải bước sóng được cài đặt. Kết quả là phổ kích thích
của mẫu.
- Chế độ quét 3D
Từ phiên bản Chromeleon 7.1 trở đi, chức năng quét 3D được hỗ trợ
cho đầu dò huỳnh quang để xác định các thời gian lưu giữ và mức hấp thụ
tối đa của hỗn hợp chất trong dung dịch. Trái ngược với chế độ quét 2D, chế
độ quét 3D không cần chọn trước phạm vi bước sóng để quét mà quét liên
tục trên toàn bộ dải phổ, chế độ này tương tự như chế độ quét phổ 3D của
đầu dò DAD.
Cũng như chế độ quét 2D, chế độ quét 3D bao gồm 3 chế độ Quét bước
sóng kích thích, quét bước sóng phát xạ và quét đồng thời.
Quá trình tối ưu hóa bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ có các
tiêu chí chính sau:
- Tốt nhất là lựa chọn bước sóng kích thích là bước sóng hấp thụ tối đa
của thành phần trong mẫu.
- Pha động nên có các thành phần không hoặc ít hấp thụ bước sóng
kích thích được lựa chọn. Do đó bước sóng kích thích lựa chọn phải
trên giới hạn cực tím của dung môi.
- Chọn bước sóng phát xạ cao hơn ít nhất 20nm so với bước sóng
kích thích.
Trong điều kiện cụ thể của nghiên cứu, chúng tôi cần xác định bước
sóng kích thích tối ưu và bước sóng phát xạ tối ưu của một chất là
flurbiprofen, do vậy việc sử dụng chế độ Zero Order là không cần thiết. Qua
đó, nghiên cứu này lựa chọn chế độ quét 3D – lần lượt quét đồng thời để sơ
bộ xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu, xác định bước
sóng phát xạ tối ưu, xác định bước sóng kích thích tối ưu.
- Sơ bộ xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu:
Quét phổ đồng thời bước sóng kích thích trong dải 200 – 400nm và bước sóng
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
29
phát xạ trong dải 275 – 475nm (luôn chênh so với bước sóng kích thích một
khoảng 75nm cố định).
- Xác định bước sóng phát xạ tối ưu: Trong nghiên cứu trước, chúng
tôi đã xác định được flurbiprofen có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 247nm
[2]. Cài bước sóng kích thích λEx = 247nm và quét phổ bước sóng phát xạ
trong dải phát xạ xác định được.
- Xác định bước sóng kích thích tối ưu: Cài bước sóng phát xạ λEm tối
ưu để quét phổ bước sóng kích thích trong dải 200 – 300nm chứa bước sóng
hấp thu cực đại 247nm.
2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích
Tính đặc hiệu
Đầu dò FLD khác với đầu dò DAD là không có chức năng kiểm tra độ
tinh khiết của pic thông qua sự trùng phổ hấp thụ. Vì vậy để thẩm định tính
đặc hiệu cần kết hợp với một phương pháp khác, ở đây chúng tôi sử dụng đầu
dò DAD [2].
Flurbiprofen được xử lý với các yếu tố khác nhau như acid, base, oxy
hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm làm phân huỷ mẫu và xác định xem
flurbiprofen có tách hoàn toàn ra khỏi sản phẩm phân huỷ (nếu có) hay
không. Những mẫu xuất hiện pic của sản phẩm phân hủy trên sắc ký đồ khi
xác định bằng phương pháp HPLC – DAD tiếp tục được tiến hành sắc ký
bằng phương pháp HPLC – FLD để đánh giá.
Tính tuyến tính và miền giá trị
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm 5 nồng độ là 100, 50, 25, 10, 5 ng/ml.
Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phương trình hồi quy giữa
nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu. Xác định giá trị R2.
Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện (LOD) được xác định bằng phương pháp pha loãng
mẫu. LOD là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 2 – 3 lần đường nền ở tất cả 3
lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
30
Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng (LOQ) được xác định bằng phương pháp pha
loãng mẫu. LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường nền đường
nền ở tất cả 3 lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần.
Độ đúng
Được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ
trong khoảng tuyến tính đã phân tích.
Độ chính xác
Độ lặp lại: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 100, 25, 5 ng/ml, mỗi mẫu 3
lần trong cùng một ngày.
Độ chính xác trung gian: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 100, 25, 5
ng/ml, mỗi mẫu 3 lần. Thực hiện phân tích trong ba ngày khác nhau.
Xác định giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của các lần đo.
Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.
2.2.3. Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén
Áp dụng phương pháp đã thẩm định trên để định lượng flurbiprofen trong
viên nén Antadys 100 mg Theramex, Pháp số lô 1M620 01 2014.
Chuẩn bị mẫu dược phẩm để định lượng
Lấy 20 viên nén flurbiprofen trong vỉ, tính khối lượng trung bình viên.
Cạo lớp bao film và nghiền mịn trong cối sứ. Cân chính xác một lượng bột
viên tương ứng với 10 mg flurbiprofen cho vào bình định mức 50 ml, thêm
pha động sắc ký đến vạch, siêu âm khoảng 15 phút và lọc qua giấy lọc
Whatman® 40. Pha loãng dung dịch trên 2000 lần trong pha động sắc ký được
dung dịch có nồng độ khoảng 50 ng/ml, lọc qua đầu lọc cellulose tái sinh
Minisart® RC 0,45µm.
Tiến hành định lượng flurbiprofen theo phương pháp đã được thẩm
định. Dựa vào phương trình hồi quy để xác định nồng độ C ng/ml của dung
dịch định lượng. Hàm lượng phần trăm flurbiprofen so với hàm lượng ghi trên
nhãn được tính bằng công thức 100(C/50). Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy kết
quả trung bình.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
3.1.1. Cài đặt các thông số ban đầu
Nhiệt độ của buồng đo
Do tín hiệu của mẫu do đầu dò thu được giảm khi nhiệt độ môi trường
tăng lên, không nên cài đặt nhiệt độ buồng đo quá cao. Tuy nhiên, nhiệt độ
buồng đo phải cao hơn nhiệt độ của đèn quang học của đầu dò – nơi chịu ảnh
hưởng bởi nhiệt độ môi trường. Do nhiệt độ trong phòng thí nghiệm của
chúng tôi là khoảng 30˚C, nghiên cứu này lựa chọn cài đặt nhiệt độ của buồng
đo là 45˚C, cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 15˚C – như hướng dẫn của
nhà sản xuất.
Độ nhạy của đầu dò
Cài đặt độ nhạy của đầu dò = 5 là giá trị trung bình trong thang độ nhạy
của đầu dò FLD. Độ nhạy của đầu dò = 5 không quá nhỏ, tránh làm giảm
chiều cao pic và gây ra tỉ lệ S/N không tối ưu. Độ nhạy của đầu dò được cài
đặt quá cao cũng làm tín hiệu của ống quang tử bão hòa gây giảm tuổi thọ của
đèn Xenon.
3.1.2. Xác định nồng độ dung dịch khảo sát
Tiến hành sắc ký dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml với
bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm, sắc ký
đồ thu được thể hiện trong hình 6.
Hình 6. Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
32
Trong trường hợp này độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử ≥ 100%,
tiến hành pha loãng dung dịch 4 lần, sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen
chuẩn nồng độ 100 ng/ml cho pic cân xứng (As = 1,21) với thời gian lưu 3,78
phút (hình 7). Tín hiệu thu được khoảng 19.000.000 counts trùng với mức độ
nhạy của đầu dò = 5 trên thang độ nhạy của đầu dò FLD. Theo hướng dẫn của
nhà sản xuất, chọn nồng độ 100 ng/ml là nồng độ lớn nhất của khoảng định
lượng. Tại đây tín hiệu của ống quang tử chưa bão hòa.
Hình 7. Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 100 ng/ml
Như vậy, chọn tiến hành nghiên cứu với khoảng định lượng 5 – 100
ng/ml và thẩm định khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận,
độ đúng, độ lặp lại hay không.
3.1.3. Xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu
Trong nghiên cứu này, để sơ bộ xác định bước sóng kích thích và bước
sóng phát xạ tối ưu, chúng tôi quét phổ dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ
50 ng/ml đồng thời bước sóng kích thích trong dải 200 – 400nm và bước sóng
phát xạ trong dải 275 – 475nm (luôn chênh so với bước sóng kích thích một
khoảng 75nm cố định), cài đặt tốc độ quét trung bình. Kết quả cho thấy sơ bộ
mẫu có độ kích thích cực đại ở bước sóng kích thích λEx = 245nm, độ phát xạ
cực đại ở bước sóng nằm trong khoảng 310 – 370 nm (hình 8).
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
33
Hình 8. Sơ bộ khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu
Để xác định bước sóng phát xạ tối ưu, tiếp tục quét phổ dung dịch
flurbiprofen chuẩn nồng độ 50 ng/ml, cài đặt bước sóng kích thích λEx =
247nm để quét phổ bước sóng phát xạ trong dải 270 – 400nm, cài đặt tốc độ
quét trung bình. Kết quả cho thấy mẫu có độ phát xạ cực đại ở bước sóng phát
xạ λEm = 312nm.
Hình 9. Khảo sát bước sóng phát xạ cực đại
Sử dụng bước sóng phát xạ tối ưu λEm = 312nm đã khảo sát để quét phổ
bước sóng kích thích trong dải 200 – 300nm, cài đặt tốc độ quét trung bình,
kết quả cho thấy mẫu có độ kích thích cực đại ở bước sóng kích thích λEx =
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
34
247nm.
Hình 10. Khảo sát bước sóng kích thích cực đại
Như vậy đã chọn được điều kiện sắc ký tối ưu là pha tĩnh cột silica gel
pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm), pha động là hỗn hợp acetonitril :
nước : acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút.
Mẫu được tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký 8 phút. Hệ thống sử dụng
đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích thích λEx = 247nm và bước sóng phát
xạ λEm = 312nm, nhiệt độ của buồng đo là 45˚C, độ nhạy của đầu dò = 5. Tại
đây flurbiprofen có thời gian lưu 3,78 phút, pic cân xứng (As = 1,19), số đĩa
lý thuyết 1866,24. Sắc ký đồ thu được thể hiện trong hình 11.
Hình 11. Sắc ký đồ ở điều kiện tối ưu hóa với đầu dò FLD
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
35
Thời gian lưu 3,78 phút ngắn hơn so với thời gian lưu 5 phút khi xác
định flurbiprofen trong huyết thanh người bằng phương pháp HPLC – FLD,
sử dụng cho mục đích nghiên cứu dược động học [9].
3.2. Thẩm định quy trình phân tích
3.2.1. Tính đặc hiệu
Để thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý
với các yếu tố khác nhau acid, base, oxi hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm làm
phân huỷ mẫu. Điều kiện cụ thể như sau:
Acid và base
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml
dung dịch HCl 5 M hoặc 2 ml NaOH 5 M vào ống, đun nóng ở nhiệt độ
khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ, để nguội về nhiệt độ phòng, rồi trung hoà hỗn
hợp bằng lượng acid hoặc base tương ứng.
Oxi hóa
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml
dung dịch H2O2 6% và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ.
Nhiệt độ
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml
dung dịch pha động và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ.
Ánh sáng
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm, cho tiếp xúc với
ánh nắng mặt trời trong 5 giờ.
Sau khi xử lý, hỗn hợp sau phản ứng được pha loãng đến nồng độ thích
hợp trong pha động, lọc qua màng cellulose tái sinh 0,45 μm (Minisart® RC,
Sartorius, Đức) rồi tiến hành sắc ký. Dựa vào thời gian lưu và độ tinh khiết
của pic để xác định khả năng phân tách của flurbiprofen khỏi sản phẩm phân
huỷ (nếu có).
Kết quả cho thấy khi xử lý mẫu với acid, base, chất oxy hoá, nhiệt độ
và ánh sáng trong các điều kiện như đã mô tả, flurbiprofen chỉ bị phân huỷ
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
36
dưới tác động của tác nhân oxi hóa H2O2. Trên sắc ký đồ khi sắc ký dung dịch
có nồng độ khoảng 20 µg/ml bằng phương pháp HPLC – DAD xuất hiện
thêm một pic mới có thời gian lưu 1,68 phút, tách ra hoàn toàn khỏi pic
flurbiprofen. Độ phân giải của hai pic này là 10,75. Sử dụng chức năng kiểm
tra độ tinh khiết thông qua sự trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu cho thấy cả
hai pic đều tinh khiết với độ tương xứng đạt trên 999 (hình 12). Phân tích
thống kê cho thấy không có sự khác biệt về thời gian lưu của flurbiprofen
trong các mẫu được xử lý và trong mẫu chuẩn (t = 0,23 < t0,05(28) = 2,048) [2].
Hình 12. Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) và độ trùng phổ hấp thụ
theo thời gian lưu của các pic: sản phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c).
Pha loãng mẫu phân huỷ dưới tác động của tác nhân oxi hóa H2O2 đến
nồng độ khoảng 50 ng/ml và tiến hành sắc ký với đầu dò FLD, tại vị trí tương
ứng với thời gian khoảng 1,68 phút không có pic (hình 13). Tại điều kiện phát
hiện sử dụng, điều này chứng tỏ sản phẩm phân hủy không phát huỳnh quang.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
37
Hình 13. Sắc ký đồ của mẫu phân huỷ dưới tác động của tác nhân oxi hóa
H2O2 với đầu dò FLD
3.2.2. Tính tuyến tính và miền giá trị
Chuẩn bị 5 mẫu có nồng độ lần lượt là 100, 50, 25, 10, 5ng/ml bằng
cách pha loãng từ dung dịch mẹ có nồng độ 1000 ng/ml.
Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần với điều kiện đã chọn. Kết quả được
trình bày trong bảng 5 và hình 14.
Bảng 5. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch
chuẩn và diện tích pic của flurbiprofen
STT Nồng độ dung dịch chuẩn (ng/ml) Diện tích pic (counts*min)
1 100 1672096,03
2 50 930183,38
3 25 539559,79
4 10 316275,01
5 5 240012,08
Khoảng định lượng 5 – 100 ng/ml
Độ lệch chuẩn S 80,6506
R2
0,9999
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
38
Hình 14. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ flurbiprofen
và diện tích pic
Trong khoảng định lượng 5 – 100 ng/ml, từ phân tích thống kê, nghiên
cứu xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính y = 15098x + 165896 có
dạng y = ax + b với bình phương hệ số tương quan tuyến tính R2 = 0,9999.
Trong đó, y (counts*min) là diện tích pic, x (ng/ml) là nồng độ mẫu phân tích.
Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là có tính
tương thích (F = 35044,83 > F0,05 = 10,13).
Qua trắc nghiệm Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê (t =
187,20 > t0,05 = 2,353), hệ số b có ý nghĩa về mặt thống kê (t = 2056 ,97 >
t0,05 = 2,353).
Vậy phương trình hồi quy có dạng y = 15098x + 165896.
Hệ số R2 > 0,99 đạt yêu cầu.
Kết quả cho thấy mức độ tương quan tốt, độ tuyến tính chặt chẽ. Độ
lệch của các giá trị thực nghiêm với giá trị hồi quy rất gần với 0 chứng tỏ
khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp.
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen đến
khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt khoảng
y = 15098x + 165896R² = 0,9999
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
Diệ
n tí
ch p
ic (c
ou
nts
.min
)
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
39
2 – 3. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện
(LOD) của phương pháp ứng với từng chất.
Giới hạn định lượng: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen
đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt
khoảng 10. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát
hiện (LOQ) của phương pháp ứng với từng chất.
Kết quả phân tích cho thấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
ghép đầu dò huỳnh quang đã được xây dựng có giới hạn phát hiện LOD =
0,01 ng/ml và giới hạn định lượng LOQ = 0,025 ng/ml.
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng này là thấp nhất trong phạm
vi nghiên cứu và tìm hiểu của nhóm nghiên cứu, cho thấy độ nhạy với những
nồng độ mẫu nhỏ của phương pháp.
3.2.4. Độ đúng
Độ chính xác của phương pháp quang phổ huỳnh quang được xác định
bởi độ lặp lại (trong ngày) và độ chính xác trung gian (qua nhiều ngày). Thẩm
định độ đúng bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ trong khoảng
tuyến tính đã phân tích.
Bảng 6. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương pháp
STT Nồng độ dung dịch
chuẩn (ng/ml)
Nồng độ thực
nghiệm (ng/ml)
Tỷ lệ phục hồi
(%)
1 100,00 99,76 99,76
2 50,00 50,62 101,24
3 25,00 24,75 99,00
4 10,00 9,96 99,60
5 5,00 4,91 98,18
Phương pháp có các giá trị của độ phục hồi đều nằm trong khoảng 100
± 2% → đạt yêu cầu về độ đúng.
3.2.5. Độ chính xác
Độ lặp lại
- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là: 100, 25, 5
ng/ml pha trong pha động.
- Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
40
Bảng 7. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp
Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ lặp lại đều
nhỏ hơn 2,08%.
Độ chính xác trung gian
- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là: 100, 25, 5 ng/ml
pha trong dung dịch pha động.
- Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần.
- Lặp lại thí nghiệm trong ba ngày khác nhau.
Nồng độ dung
dịch chuẩn
(ng/ml)
Diện tích pic
(Counts.min)
Diện tích pic
trung bình
(Counts.mi)
SD
RSD (%)
100,00
1672096,03
1653902,11 29255,9102 1,77 1620154,71
1669455,60
25,00
539559,89
541246,83
3413,7542
0,63
545175,66
539005,03
5,00
240012,08
242178,37
5041,1741
2,08
247940,60
238582,43
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
41
Bảng 8. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp
Nồng độ dung
dịch chuẩn
(ng/ml)
Ngày Diện tích pic
(Counts.min)
Diện tích pic
trung bình
(Counts.mi)
SD RSD (%)
100,00
1 1653902,11
1678095,77
24097,54
1,44
2 1702096,03
3 1678289,15
25,00
1 541246,83
536648,54
15883,83
2,96
2 518972,86
3 549725,93
5,00
1 242178,37
244019,93
6156,00
2,52
2 250886,53
3 238994,90
Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ chính xác
trung gian đều nhỏ hơn 2,96%.
Như vậy, giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ lặp lại đều nhỏ
hơn 2,08% và trong thí nghiệm thẩm định độ chính xác trung gian đều nhỏ
hơn 2,96%. Độ lệch chuẩn của phương pháp tương đối thấp đối với các lượt
chạy mẫu khác nhau và các ngày khác nhau.
So sánh giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD của phương pháp được
xây dựng với một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được báo cáo.
Bảng 9. So sánh kết quả độ chính xác của các phương pháp định lượng
Tên phương pháp
RSD (%) của độ lặp lại RSD (%) của độ chính
xác trung gian
Đo độ hấp thu quang [11] ≤ 3,10 ≤ 3,20
Đo độ phát xạ huỳnh
quang [11]
≤ 2,05
≤ 3,80
LC–MS/MS [24] ≤ 2,20 ≤ 3,40
GC–MS [37] ≤ 2,65 ≤ 3,64
HPLC – DAD [3] ≤ 1,73 ≤ 2,96
Phương pháp xây dựng ≤ 2,08 ≤ 2,96
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
42
RSD của độ lặp có giá trị trong khoảng trung gian so với phương pháp
trên. RSD của độ lặp lại của phương pháp xây dựng thấp hơn tiêu chí trong
các nghiên cứu sử dụng phương pháp đo độ hấp thu quang, LC–MS/MS và
GC–MS đưa ra. RSD độ chính xác trung gian của phương pháp xây dựng đạt
được thấp hơn giá trị trong cả bốn nghiên cứu đã được giới thiệu. Từ đó
khẳng định phương pháp có độ chính xác cao.
3.3. Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén
Áp dụng phương pháp được xây dựng thẩm định để định lượng
flurbiprofen trong viên nén Antadys 100 mg Theramex, Pháp. Theo USP 40 –
NF 35, hàm lượng flurbiprofen phải đạt từ 90 – 110% so với hàm lượng ghi trên
nhãn [22]. Theo tài liệu này, flurbiprofen trong viên nén được chiết bằng pha
động sắc ký là hỗn hợp ACN và đệm phosphate pH 3,0 (43 : 57). Sử dụng 25 ml
pha động cho mỗi lượng bột thuốc tương đương 75 mg flurbiprofen, sau đó pha
loãng một phần dung dịch thu được 20 lần trong pha động rồi tiến hành sắc ký.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tỷ lệ dung môi chiết cao gấp
15 lần: 50 ml pha động cho lượng bột thuốc chứa tương đương 10 mg
flurbiprofen. Kết quả thu được khối lượng trung bình viên là 420,7mg, diện
tích pic trung bình là 904339,18 counts.min. Nồng độ dung dịch định lượng
trung bình là 48,91 ng/ml. Như vậy, hàm lượng flurbiprofen trong viên nén là
100(48,91/50) = 97,82% hàm lượng lí thuyết, nằm trong khoảng 90 –
110% đạt tiêu chuẩn của USP 40 – NF 35. Hàm lượng flurbiprofen trong
viên nén là 97,82 mg.
3.4. Bàn luận
Hiện nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đang được ứng dụng
rộng rãi trong các quy trình định tính, thử độ tinh khiết và định lượng các chất.
HPLC có các ưu điểm là độ chính xác cao, ổn định, dễ thực hiện, nhạy với các
nồng độ nhỏ. Phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống HPLC – FLD
có những ưu điểm nổi bật của cả phương pháp HPLC và phương pháp phổ
huỳnh quang đem lại: có khả năng tách các chất ra hoàn toàn nên tính đặc hiệu
cao, độ chính xác cao và nhạy với các nồng độ nhỏ. Bên cạnh đó, phương pháp
cũng có một số nhược điểm như hệ dung môi đắt tiền, cần một hệ thống máy
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
43
móc hiện đại.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, thời gian lưu tR là thời gian tính từ khi
chất được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi phát hiện ở nồng độ cực đại.
Thông thường thời gian sắc ký thường gấp đôi thời gian lưu. Hệ số dung
lượng k’ cần nằm trong khoảng tối ưu 1< k’ < 8 căn cứ vào pha tĩnh, pha
động,…Hệ số As cho biết mức độ cân đối của pic và thường nằm trong
khoảng 0,9 – 2,5 pic càng cân đối thì hiệu lực tách của cột càng tốt.
Thời gian chạy mẫu là 8 phút, ngắn hơn so với 16 phút được sử dụng
bởi Hutzler [19] nhưng phù hợp với thời gian lưu của flurbiprofen với đầu dò
FLD (3,78 phút). Do đó, phương pháp này rút ngắn được thời gian định lượng
và sử dụng để phân tích một lượng lớn mẫu.
Lựa chọn cài đặt đầu dò huỳnh quang tại bước sóng kích thích λEx = 247nm
và bước sóng phát xạ λEm = 312nm, nhiệt độ của buồng đo là 45˚C, độ nhạy của
đầu dò = 5. Tại bước sóng đó, độ hấp thụ và độ phát xạ có giá trị lớn nhất.
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong điều kiện khảo sát, flurbiprofen khá
bền trong acid, base, nhiệt độ và ánh sáng nhưng dễ bị phân hủy bởi tác nhân
oxi hóa. Vì vậy, trong quá trình bảo quản cần tránh để flurbiprofen tiếp xúc
với các tác nhân oxi hóa làm giảm chất lượng của thuốc.
Quy trình này không cần phân lập flurbiprofen tinh khiết từ mẫu, dược
phẩm được sử dụng định lượng trực tiếp sau khi hòa tan và lọc do đó giảm sai
số trong quá trình định lượng và tiết kiệm thời gian.
So sánh phương pháp định lượng flurbiprofen bằng HPLC sử dụng
đầu dò FLD và đầu dò DAD (tiến hành trên cùng hệ thống HPLC)
Trong nghiên cứu này, một quy trình định lượng flurbiprofen tiến
hành trên cùng hệ thống HPLC với phương pháp đã xây dựng, thay thế đầu
dò FLD bằng đầu dò DAD cũng đã được thực hiện để đưa ra đối chứng và
nhận định so sánh bước đầu về 2 đầu dò trong định lượng flurbiprofen khi
ghép với thiết bị HPLC đã sử dụng.
Đối với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò FLD và
đầu dò DAD, các dung dịch được chuẩn bị bằng cách pha loãng từ dung dịch
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
44
flurbiprofen gốc để đạt nồng độ 5 – 100 ng/ml và 2 – 20 µg/ml. Đường chuẩn
được xây dựng và đánh giá bình phương hệ số tương quan tuyến tính R2. Bình
phương hệ số tương quan tuyến tính của các đường chuẩn luôn >0,99. Kết quả
về các thông số khi thẩm định quy trình phân tích về tính đặc hiệu, tính tuyến
tính và miền giá trị, LOQ và LOD, độ đúng và độ chính xác được thể hiện
trong bảng 10.
Bảng 10. So sánh các thông số thẩm định quy trình định lượng flurbiprofen
của đầu dò DAD và đầu dò FLD
Thông số Đầu dò FLD Đầu dò DAD
Khoảng định lượng 5 – 100 ng/ml 2 – 20 µg/ml
Phương trình hồi quy
tuyến tính y = 15098x + 165896 y = 0,68x
R2 0,9999 0,9993
LOQ 0,025 ng/ml 0,15 μg/ml.
LOD 0,01 ng/ml 0,05 μg/ml
Độ đúng
Tỷ lệ phục hồi (%) 98,18 – 101,24% 98,10 – 101,59%
Độ chính xác
Độ lặp lại RSD < 2,08% RSD < 1,71%
Độ chính xác trung gian RSD < 2,96% RSD < 2,34%
Cả hai phương pháp đều có R2 >0,99 cho thấy mức độ tương quan
tuyến tính chặt chẽ. Các giá trị của độ phục hồi khi thẩm định độ đúng 2
phương pháp đều nằm trong khoảng 100 ± 2% → đạt yêu cầu về độ đúng, các
giá trị này tương đương phản ánh sai số hệ thống ảnh hưởng lên 2 quy trình
phân tích khá tương đồng do 2 quy trình đều thực hiện trên cùng hệ thống,
người phân tích và điều kiện phòng thí nghiệm tương đương.
Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ lặp lại và
độ chính xác trung gian của đầu dò FLD đều lớn hơn đầu dò DAD. Điều này
là do độ chính xác của đầu dò FLD bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố hơn.
Phương pháp sử dụng đầu dò FLD tiến hành trên khoảng định lượng 5 – 100
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
45
ng/ml có nồng độ rất thấp so với khoảng định lượng 2 – 20 µg/ml khi tiến
hành phương pháp sử dụng đầu dò DAD do đó gây ra các sai số ngẫu nhiên
ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp.
Đầu dò FLD được cho là nhạy hơn đầu dò DAD đối với flurbiprofen do
giới hạn phát hiện LOD = 0,01 ng/ml và giới hạn định lượng LOQ = 0,025
ng/ml của đầu dò FLD thấp hơn khoảng 5000 lần so với đầu dò DAD. LOD
và LOQ thấp hơn của đầu dò DAD cùng với khoảng định lượng nằm trong
vùng nồng độ nhỏ cỡ ng/ml cho phép đầu dò FLD phát hiện mẫu ngay ở
những nồng độ rất nhỏ.
Từ những kết quả của đề tài, chúng tôi xây dựng Quy trình định lượng
flurbiprofen trong viên nén đơn hoạt chất bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang được trình bày trong Phụ lục 2.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
50
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
4.1. Kết luận
Dựa trên các tài liệu về thẩm định quy trình phân tích của ICH và
EMA, nghiên cứu này đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định
lượng flurbiprofen bằng hệ thống HPLC – FLD.
Phương pháp đã được ứng dụng để định lượng một dược phẩm chứa
flurbiprofen dạng viên nén – viên nén Antadys 100mg Theramex, Pháp.
4.2. Kiến nghị
Ứng dụng phương pháp để phân tích định kỳ và kiểm tra chất lượng
flurbiprofen trong các dạng bào chế khác như thuốc nhỏ mắt, viên nang, cao dán.
Phương pháp cũng là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các
thuốc giảm đau, chống viêm chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên
cứu tương đương sinh học, sinh khả dụng và dược động học của chúng.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. PGS.TS. Trần Tử An (2007), "Hóa phân tích, Phân tích dụng cụ", Nhà
xuất bản Y học, tập 2.
2. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đặng Ngọc Anh, et al. (2017), "Xây dựng
quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nénbao phim 100 mg bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode-array", Tạp
chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 33(2), 41-49.
3. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), "Thẩm định
phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật", NXB Khoa học và
Kỹ thuật, 10-59.
4. Th.s Lê Nhất Tâm (2006), "Nguyên lý hoạt động của một số detector
trong sắc kí lỏng và khí", Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ
Chí Minh.
5. Bộ Y tế (2012), "Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai
học)", Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, 135-184.
6. Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), "Kiểm nghiệm dược phẩm",
NXB Y học, 68-110.
7. Bùi Xuân Vững (2012), "Cơ sở Hóa phân tích Định lượng", Trường
Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
Tiếng Anh
8. Agency European Medicines (2011), "Guideline on bioanalytical
method validation", Committee for Medicinal Products for Human Use
(CHMP).
9. Albert KS, Gillespie WR, et al. (1984), "Determination of flurbiprofen
in human serum by reverse‐phase high‐performance liquid
chromatography with fluorescence detection", Journal of
pharmaceutical sciences, 73(12), 1823-1825.
10. Bhaskar Kesavan, Anbu Jayaraman, et al. (2009), "Lipid nanoparticles
for transdermal delivery of flurbiprofen: formulation, in vitro, ex vivo
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
and in vivo studies", Lipids in health and disease, 8(1), 6.
11. Bilal Yilmaz Emrah Alkan (2015), "Spectrofluorometric and
Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the
Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations",
Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4).
12. Brittain Harry G (2013), Profiles of drug substances, excipients, and
related methodology, Academic Press.
13. Calapai G, Imbesi S, et al. (2013), "Fatal hypersensitivity reaction to an
oral spray of flurbiprofen: a case report", Journal of clinical pharmacy
and therapeutics, 38(4), 337-338.
14. Commission The Europaean Pharmacopieal (2010), "Pharmacopoeia
Europaea 7th Edition vol 2", 2056-2057.
15. Convention United States Pharmacopoeial (2010), "United States
Pharmacopoeia 35th Edition", 3258.
16. Drugbank http://www.drugbank.ca.
17. Geerts Hugo (2007), "Drug evaluation:(R)-flurbiprofen--an enantiomer
of flurbiprofen for the treatment of Alzheimer's disease", IDrugs: the
investigational drugs journal, 10(2), 121-133.
18. Gonzalez-Mira E, Egea MA, et al. (2010), "Optimizing flurbiprofen-
loaded NLC by central composite factorial design for ocular delivery",
Nanotechnology, 22(4), 045101.
19. Hutzler J Matthew, Frye Reginald F, et al. (2000), "Sensitive and
specific high-performance liquid chromatographic assay for 4′-
hydroxyflurbiprofen and flurbiprofen in human urine and plasma",
Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications,
749(1), 119-125.
20. Knadler MP and Hall SD (1989), "High-performance liquid
chromatographic analysis of the enantiomers of flurbiprofen and its
metabolites in plasma and urine", Journal of Chromatography B:
Biomedical Sciences and Applications, 494, 173-182.
21. Kumar Atul, Mann Henry J, et al. (2007), "Simultaneous analysis of
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
cytochrome P450 probes—dextromethorphan, flurbiprofen and
midazolam and their major metabolites by HPLC-mass-
spectrometry/fluorescence after single-step extraction from plasma",
Journal of Chromatography B, 853(1-2), 287-293.
22. Lee Hye-In, Choi Chang-Ik, et al. (2014), "Simultaneous determination
of flurbiprofen and its hydroxy metabolite in human plasma by liquid
chromatography-tandem mass spectrometry for clinical application",
Journal of Chromatography B, 971, 58-63.
23. McGeer Patrick L, Schulzer Michael, et al. (1996), "Arthritis and anti-
inflammatory agents as possible protective factors for Alzheimer's
disease A review of 17 epidemiologic studies", Neurology, 47(2), 425-
432.
24. Mei Chenghan, Li Bin, et al. (2015), "Liquid chromatography-tandem
mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human
plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of
Chromatography B, 993, 69-74.
25. Meister Sabrina, Zlatev Iavor, et al. (2013), "Nanoparticulate
flurbiprofen reduces amyloid-β 42 generation in an in vitro blood–brain
barrier model", Alzheimer's research & therapy, 5(6), 51.
26. Murray Kermit K, Boyd Robert K, et al. (2013), "Definitions of terms
relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure
and Applied Chemistry, 85(7), 1515-1609.
27. NARUI Takashi, NIKAIDO Ayako, et al. (2002), "Separation and
determination of diastereomeric flurbiprofen acyl glucuronides in
human urine by LC/ESI-MS with a simple column-switching
technique", Drug metabolism and pharmacokinetics, 17(2), 142-149.
28. Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.
29. Pharmacopoeia British (2010), "British Pharmacopoeial Commission,
London, United Kingdom", II, 292,293.
30. Qayyum Aisha, Najmi Muzammil Hasan, et al. (2011), "Determination
of pharmacokinetics of flurbiprofen in Pakistani population using
modified HPLC method", Journal of chromatographic science, 49(2),
108-113.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
31. Smith Graeme (2012), "European Medicines Agency guideline on
bioanalytical method validation: what more is there to say?",
Bioanalysis, 4(8), 865-868.
32. Townsend Kirk P and Praticò Domenico (2005), "Novel therapeutic
opportunities for Alzheimer’s disease: focus on nonsteroidal anti-
inflammatory drugs", The FASEB Journal, 19(12), 1592-1601.
33. Use The International Council for Harmonisation of Technical
Requirements for Pharmaceuticals for Human (2005), "Validation of
analytical procedures: text and methodology", Q2(R1), 6-13.
34. Vikrant Kokane and Sonali Naik (2014), "Formulation and evaluation
of topical flurbiprofen gel using different gelling agents", World
Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9), 654-663.
35. Wang GJ, Sun JG, et al. (2003), "Identification of phase I and phase II
metabolites of Guanfu base A hydrochloride in human urine",
European journal of drug metabolism and pharmacokinetics, 28(4),
265-272.
36. WHOCC http://www.whocc.no.
37. Yilmaz Bilal and Alkan Emrah (2015), "Determination of flurbiprofen
in pharmaceutical preparations by GC–MS", Arabian Journal of
Chemistry.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1
Công bố kết quả nghiên cứu
Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong
viên nén bao phim 100mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ghép đầu dò diode-array
Nguyễn Thị Thanh Bình*, Đặng Ngọc Anh, Trần Mai Anh, Nguyễn Thanh Hải
Khoa Y Dược, Đai học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam
Tóm tắt: Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng được quy trình
định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode–array theo hướng dẫn của Cơ
quan quản lý thuốc châu Âu và Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các yêu cầu
kỹ thuật để đăng ký dược phẩm sử dụng trên người. Pha tĩnh được sử dụng là
cột silica gel pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm), pha động là hỗn hợp
acetonitril : nước : acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), tốc độ
dòng 1 ml/phút. Mẫu được tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký 8 phút,
bước sóng phát hiện 247 nm. Thời gian lưu của flurbiprofen là 3,73 phút. Kết
quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ từ 2 – 20 μg/ml, có sự tương
quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung
dịch x (μg/ml) theo phương trình y = 0,680x với hệ số xác định R2 = 0,9993.
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml.
Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với flurbiprofen, có độ đúng và độ chính
xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại
≤ 1,71%, độ lệch chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34%.
Từ khóa: Flurbiprofen, định lượng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò
diode–array.
1. Đặt vấn đề
Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống
viêm không steroid (NSAIDs) với tác dụng giảm đau, hạ sốt. Flurbiprofen
được sử dụng bằng đường uống để điều trị tấn công trong các bệnh viêm gân
cấp tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt lưng. Viên nén và gel dùng
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
ngoài chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng của bệnh viêm khớp
dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp. Thuốc nhỏ mắt
flurbiprofen được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn
ngừa và làm giảm co đồng tử trong lúc mổ [1-5]. Một tính chất đáng lưu ý của
flurbiprofen là rất kém tan trong nước, chính vì vậy, việc bào chế các hệ dẫn
thuốc kích thước nano có cấu trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,…
là hướng nghiên cứu đang được quan tâm trên thế giới [6-9].
Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen
Hiện nay flurbiprofen được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước, đặc biệt là
các nước châu Âu và Bắc Mỹ dưới nhiều tên thương mại khác nhau như
Antadys, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên, các thuốc này
lại chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng không có
chuyên luận về flurbiprofen. Cho đến thời điểm hiện tại, trong nước chưa có
nghiên cứu nào về flurbiprofen được công bố. Như vậy, phát triển các
nghiên cứu về flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện
cho bệnh nhân có thêm một lựa chọn thuốc trong điều trị. Xây dựng phương
pháp định lượng flurbiprofen theo tiêu chuẩn quốc tế là công việc hết sức
cần thiết nhằm kiểm soát chất lượng thuốc đồng thời tạo tiền đề cho các
nghiên cứu tiếp theo như bào chế, đánh giá tương đương sinh học, theo dõi
dược động học của thuốc.
Các phương pháp định lượng flurbiprofen trong dược phẩm và trong
dịch sinh học đã được công bố bao gồm chuẩn độ [10], quang phổ [11], sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12-16], sắc ký khí [17]. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng hoạt chất trong dạng
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
bào chế thông dụng nhất hiện nay của flurbiprofen là viên nén bao phim 100
mg bằng phương pháp HPLC ghép đầu dò diode–array (DAD) theo hướng
dẫn của Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency –
EMA) [18] và Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các yêu cầu kỹ thuật để đăng
ký dược phẩm sử dụng trên người (International conference on Harmonisation
of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human
use – ICH) [19].
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Hóa chất, dung môi
Flurbiprofen đạt tiêu chuẩn chất chuẩn theo dược điển châu Âu (code:
EPF0285200), natri hydroxid (NaOH), acid clorhydric (HCl), acid acetic
(CH3COOH), hydro peroxid (H2O2) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích,
acetonitrile (ACN) đạt tiêu chuẩn HPLC được mua từ nhà sản xuất Merck
KGaA, Đức. Nước (H2O) được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific
GenPure UV–TOC đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m. Mẫu dược phẩm được định
lượng là viên nén bao phim Antadys 100 mg (Theramex, Pháp; lot: 2M653
05 2015).
2.2. Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị được sử dụng là hệ thống HPLC Ultimate 3000 – Dionex
(Thermo Scientific, Hoa Kỳ) trang bị bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự
động. Đầu dò DAD 3000 Dionex sử dụng đèn Deuterium cho khoảng UV và
tungsten cho khoảng VIS. Cột silica gel pha đảo Thermo Scientific Acclaim
120 C18 và C8 có cùng kích thước hạt 5 μm, 120 Å, đường kính 4,6 mm, chiều
dài 150 mm. Thiết bị xử lý tín hiệu là hệ thống máy vi tính với hệ điều hành
Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex
phiên bản 7.1.2.1478.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Trong suốt quá trình thực nghiệm, tất cả các mẫu đều được phân tích 3
lần, lấy giá trị trung bình. Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm
Microsoft Office Exel 2007.
Tối ưu hoá điều kiện sắc ký
Sử dụng dung dịch chuẩn flurbiprofen nồng độ 20 μg/ml để khảo sát.
Quét phổ hấp thụ của dung dịch trên trong khoảng 190 – 800 nm để tìm
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
bước sóng hấp thụ cực đại. Khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau như:
pha tĩnh: cột silica gel pha đảo C18 và C8; pha động: hỗn hợp các dung môi
ACN, H2O và CH3COOH với các tỷ lệ khác nhau; thể tích tiêm mẫu: 5, 10,
15, 20, 40 μl. Duy trì tốc độ dòng 1 ml/phút. Xác định điều kiện sắc ký cho
pic đạt độ đối xứng tốt, tỷ lệ diện tích pic trên nồng độ và chiều cao pic
trên nồng độ lớn nhất.
Xác định tính đặc hiệu của phương pháp
Để xác định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý
với các yếu tố khác nhau như acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm
làm phân huỷ mẫu. Cụ thể như sau:
- Acid hoặc base: Lấy 0,5 ml dung dịch flurbiprofen 1000 μg/ml cho
vào ống nghiệm. Thêm 2 ml dung dịch HCl 5 M hoặc 2 ml dung dịch NaOH 5
M, đun nóng ở nhiệt độ 80 ± 5˚C trong 3 giờ, để nguội về nhiệt độ phòng, rồi
trung hoà hỗn hợp bằng lượng acid hoặc base tương ứng.
- Oxi hoá: Lấy 0,5 ml dung dịch flurbiprofen 1000 μg/ml cho vào ống
nghiệm. Thêm 2 ml dung dịch H2O2 6%, đun nóng ở nhiệt độ 80 ± 5oC trong 3 giờ.
- Nhiệt độ: Lấy 0,5 ml dung dịch flurbiprofen 1000 μg/ml cho vào ống
nghiệm. Thêm 2 ml dung dịch pha động, đun nóng ở nhiệt độ 80 ± 5oC trong
3 giờ.
- Ánh sáng: Lấy 0,5 ml dung dịch flurbiprofen 1000 μg/ml cho vào
ống nghiệm, cho tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong 5 giờ.
Hỗn hợp sau phản ứng được pha loãng thành 25 ml trong pha động, lọc
qua màng cellulose tái sinh 0,45 μm (Minisart® RC, Sartorius, Đức) rồi tiến
hành sắc ký. Dựa vào thời gian lưu và độ tinh khiết của pic để xác định khả
năng phân tách của flurbiprofen khỏi sản phẩm phân huỷ (nếu có).
Xác định tính tuyến tính và miền giá trị
Từ chất chuẩn flurbiprofen ban đầu, pha dung dịch có nồng độ 1000
μg/ml trong acetonitril. Pha loãng dung dịch trên trong pha động để tạo thành
dãy gồm 6 dung dịch chuẩn có nồng độ 2, 4, 8, 12, 16, 20 μg/ml. Tiến hành
sắc ký các dung dịch chuẩn để xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích
pic tín hiệu y (mAU.min) và nồng độ chất phân tích x (μg/ml). Xác định giá
trị R2. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F
để kiểm tra tính thích hợp của phương trình.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương
pháp được xác định bằng phương pháp pha loãng dung dịch chuẩn. LOD là
nồng độ flurbiprofen thấp nhất cho pic có chiều cao gấp 2 – 3 lần đường nền
ở tất cả 3 lần sắc ký. LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường
nền đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký.
Thẩm định độ đúng
Độ đúng của phương pháp được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ
phục hồi của dãy dung dịch chuẩn trong khoảng tuyến tính đã phân tích. Tỷ lệ
phục hồi được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ xác định được từ thực
nghiệm so với nồng độ dung dịch chuẩn.
Thẩm định độ chính xác
Độ lặp lại: tiến hành định lượng 3 dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt
là 2, 8, 20 μg/ml, mỗi dung dịch 3 lần trong cùng một ngày. Xác định độ lệch
chuẩn tương đối (RSD) giữa các lần đo.
Độ chính xác trung gian: tiến hành định lượng 3 dung dịch chuẩn có
nồng độ lần lượt là 2, 8, 20 μg/ml, mỗi dung dịch 3 lần, lặp lại thí nghiệm
trong 3 ngày khác nhau. Xác định giá trị RSD giữa các lần đo ở 3 ngày.
Định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg
Cân 10 viên chế phẩm, tính khối lượng trung bình viên đã loại bỏ lớp bao
phim rồi nghiền mịn trong cối sứ. Cân lượng bột thuốc tương đương với 50 mg
flurbiprofen cho vào bình định mức 50 ml, thêm pha động sắc ký đến vạch, siêu
âm 15 phút và lọc qua giấy lọc Whatman® 40. Pha loãng 1 ml dung dịch 100 lần
trong pha động, lọc qua đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC 0,45µm. Tiến
hành định lương flurbiprofen theo phương pháp đã được thẩm định. Dựa vào
phương trình hồi quy để xác định nồng độ C μg/ml của dung dịch định lượng.
Hàm lượng phần trăm flurbiprofen so với hàm lượng ghi trên nhãn được tính
bằng công thức 100(C/10). Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
3. Kết quả và bàn luận
3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký
Trên phổ hấp thụ UV – VIS của flurbiprofen trong khoảng 190 – 800
nm có một cực đại tại 247 nm (hình 2). Bước sóng này được chọn làm bước
sóng phát hiện.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Hình 2. Phổ hấp thụ UV – VIS của flurbiprofen trong khoảng 190 – 800 nm.
Trong quá trình khảo sát, khi sử dụng pha tĩnh là silica gel C18 và pha
động là hỗn hợp ACN : H2O với các tỷ lệ tăng dần từ 60 : 40 đến 80 : 20, thời
gian lưu của flurbiprofen giảm dần từ 5,13 xuống 2,65 phút. Tuy nhiên, pic có
hình dạng không cân xứng với hệ số bất đối As = 0,69 – 2,02. Việc thêm
2,5% CH3COOH vào pha động có tác dụng chuyển flurbiprofen về dạng
không ion hóa, và do đó tình trạng kéo đuôi của pic được cải thiện nhưng
không hoàn toàn mất hẳn. Thêm CH3COOH vào pha động đồng thời thay pha
tĩnh bằng silica gel C8 đã giúp giải quyết được tình trạng này. Qua khảo sát
cũng đã xác định được thể tích tiêm mẫu cho tỷ lệ diện tích pic trên nồng độ
và chiều cao pic trên nồng độ lớn nhất là 10 μl.
Từ thực nghiệm đã chọn được điều kiện sắc ký tối ưu như sau: Pha tĩnh
là silica gel C8 5 μm, 120 Å trong cột 4,6 mm x 150 mm, pha động ACN : H2O
: CH3COOH tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), thể tích tiêm mẫu 10 μl, tốc độ dòng
1 ml/phút, đầu dò ghi nhận tín hiệu tại bước sóng 247 nm, thời gian sắc ký 8
phút. Flurbiprofen có thời gian lưu 3,73 phút, pic cân xứng (As = 1,08), số đĩa
lý thuyết là 3491. Sắc ký đồ được thể hiện trong hình 3.
Hình 3. Sắc ký đồ của flurbiprofen tại điều kiện tối ưu.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
3.2. Tính đặc hiệu
Khi xử lý mẫu với acid, base, chất oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng trong
các điều kiện như đã mô tả, flurbiprofen chỉ bị phân huỷ dưới tác động của tác
nhân oxy hóa H2O2. Trên sắc ký đồ xuất hiện thêm một pic mới có thời gian
lưu 1,68 phút, tách ra hoàn toàn khỏi pic flurbiprofen. Độ phân giải của hai
pic này là 10,75. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết thông qua sự trùng
phổ hấp thụ theo thời gian lưu cho thấy cả hai pic đều tinh khiết với độ tương
xứng đạt trên 999 (hình 4). Phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt
về thời gian lưu của flurbiprofen trong các mẫu được xử lý và trong mẫu
chuẩn (t = 0,23 < t0,05(28) = 2,048). Các kết quả trên cho phép khẳng định tính
đặc hiệu của phương pháp phân tích.
Hình 4. Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) và độ trùng phổ hấp thụ
theo thời gian lưu của các pic: sản phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c).
3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị
Phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ
dung dịch flurbiprofen x (μg/ml) trong khoảng 2 – 20 μg/ml thu được phương
trình y = 0,680x + 0,022 với hệ số xác định R2 = 0,9993, độ lệch chuẩn S =
0,00885 (bảng 1).
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Bảng 1. Phân tích hồi quy tương quan giữa diện tích pic và nồng độ flurbiprofen
STT Nồng độ flurbiprofen x (µg/ml) Diện tích pic y (mAU.min)
1 2,00 1,38
2 4,00 2,73
3 8,00 5,53
4 12,00 8,24
5 16,00 10,68
6 20,00 13,76
Khoảng định lượng 2 – 20 µg/ml
Phương trình hồi quy y = 0,680x + 0,022
Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,00885
R2
0,9993
Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là có tính
tương thích (F = 5907,328 > F0,05 = 10,13). Qua trắc nghiệm Student, hệ số a =
0,68 có ý nghĩa về mặt thống kê (t = 76,86 > t0,05 = 2,132), hệ số b = 0,022
không có ý nghĩa về mặt thống kê (t = 0,85 < t0,05 = 2,132). Từ đó, phương
trình hồi quy được đưa về dạng y = 0,680x.
Như vậy, trong khoảng nồng độ được khảo sát, có sự tương quan tuyến
tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ flurbiprofen. Độ lệch của các giá
trị thực nghiệm so với giá trị hồi quy rất gần với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy
của phương trình hồi quy hẹp.
3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Bằng phương pháp pha loãng đã xác định được giới hạn phát hiện của
phương pháp LOD = 0,05 μg/ml và giới hạn định lượng của phương pháp
LOQ = 0,15 μg/ml.
3.5. Độ đúng
Tỷ lệ phục hồi của dãy dung dịch flurbiprofen có nồng độ trong khoảng
tuyến tính đã phân tích được trình bày trong bảng 2.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Bảng 2. Tỷ lệ phục hồi của dãy dung dịch flurbiprofen chuẩn trong
khoảng tuyến tính
STT
Nồng độ dung dịch
chuẩn
(µg/ml)
Nồng độ thực
nghiệm (µg/ml)
Tỷ lệ phục hồi
(%)
1 2,00 2,03 101,47
2 4,00 4,01 100,37
3 8,00 8,13 101,65
4 12,00 12,12 100,98
5 16,00 15,71 98,16
6 20,00 20,24 101,18
Kết quả thu được cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng với các
giá trị của độ phục hồi đều nằm trong khoảng ≤ 100 ± 2%.
3.6. Độ chính xác
Độ lặp lại
Khi tiến hành sắc ký 3 dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 20, 8, 2
μg/ml, mỗi dung dịch 3 lần trong cùng một ngày, giá trị RSD giữa các lần đo
đều nhỏ hơn 1,71% (bảng 3).
Bảng 3. Độ lệch chuẩn tương đối giữa các lần đo trong cùng một ngày
Nồng độ dung
dịch chuẩn
(µg/ml)
Diện tích pic
(mAU.min)
Diện tích pic
trung bình
(mAU.min)
SD RSD (%)
2,00
1,38
1,35 0,02 1,71 1,34
1,34
8,00
5,55
5,53
0,03
0,46
5,53
5,50
20,00
13,78
14,00
0,22
1,57
14,22
13,99
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Độ chính xác trung gian
Tiến hành sắc ký 3 dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 20, 8, 2
μg/ml, trong 3 ngày khác nhau, giá trị RSD giữa các ngày đều nhỏ hơn 2,34%
(bảng 4).
Bảng 4. Độ lệch chuẩn giữa các lần đo trong 3 ngày khác nhau
Nồng độ dung
dịch chuẩn
(µg/ml)
Ngày Diện tích pic
(mAU.min)
Diện tích pic
trung bình
(mAU.min)
SD RSD (%)
2,00
1 1,34
1,38
0,03
2,34
2 1,40
3 1,39
8,00
1 5,53
5,55
0,10
1,71
2 5,46
3 5,65
20,00
1 14,00
13,89
0,15
1,06
2 13,72
3 13,94
Bảng 5 thể hiện độ chính xác của một số phương pháp định lượng
flurbiprofen đã được báo cáo như đo độ hấp thụ quang [11], đo độ phát xạ
huỳnh quang [11], sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần liên tiếp (LC–
MS/MS) [13], sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ (GC–MS) [17]. So với các
phương pháp này, giá trị RSD của phương pháp được xây dựng thấp hơn,
điều này cho phép khẳng định đây là phương pháp có độ chính xác cao.
Bảng 5. So sánh độ chính xác của một số phương pháp định lượng flurbiprofen
Tên phương pháp Độ lặp lại Độ chính xác trung gian
Đo độ hấp thu quang RSD ≤ 3,10 % RSD ≤ 3,20 %
Đo độ phát xạ huỷnh quang RSD ≤ 2,05 % RSD ≤ 3,80 %
LC–MS/MS RSD ≤ 2,20 % RSD ≤ 3,40 %
GC–MS RSD ≤ 2,65 % RSD ≤ 3,64 %
Phương pháp xây dựng RSD ≤ 1,71 % RSD ≤ 2,34 %
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
3.7. Định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg
Áp dụng phương pháp được xây dựng để định lượng flurbiprofen trong
viên nén bao phim Antadys 100 mg (Theramex, Pháp). USP 40 – NF 35 quy
định viên nén flurbiprofen phải chứa 90 – 110% so với hàm lượng ghi trên
nhãn [12]. Theo tài liệu này, flurbiprofen trong viên nén được chiết bằng pha
động sắc ký là hỗn hợp ACN và đệm phosphate pH 3,0 (43: 57). Sử dụng 25
ml pha động cho mỗi lượng bột thuốc tương đương 75 mg flurbiprofen, sau
đó pha loãng một phần dung dịch thu được 20 lần trong pha động rồi tiến
hành sắc ký.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tỷ lệ dung môi chiết cao gấp
3 lần: 50 ml pha động cho lượng bột thuốc chứa tương đương 50 mg
flurbiprofen. Sau đó pha loãng 1ml dung dịch 100 lần với pha động để thu
được dung dịch có nồng độ lý thuyết 10 μg/ml. Tiến hành sắc ký 3 lần, lấy
diện tích pic trung bình để tính nồng độ C μg/ml của dung dịch định lượng.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả được thể hiện trong bảng 6.
Bảng 6. Kết quả định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim Antadys
100 mg (Theramex, Pháp; lot: 2M653 05 2015)
Lần Diện tích pic trung bình
(mAU.min)
Nồng độ C
(µg/ml)
Hàm lượng (%)
1 6,33 9,31 93,1
2 6,48 9,53 95,3
3 6,37 9,37 93,7
Như vậy hàm lương flurbiprofen trong chế phẩm bằng 94,0% hàm
lượng ghi trên nhãn, đạt tiêu chuẩn USP 40 – NF 35.
4. Kết luận
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng được quy trình định lượng
flurbiprofen trong dạng bào chế thông dụng nhất hiện nay là viên nén bao
phim 100 mg theo các hướng dẫn của ICH và EMA. Phương pháp HPLC –
DAD sử dụng pha tĩnh là cột silica gel C8 5 μm, 120 Å, kích thước 4,6×150
mm, pha động là hỗn hợp ACN : H2O: CH3COOH với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5
(v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 μl, thời gian sắc ký 8
phút, bước sóng phát hiện 247 nm. Bằng cách xử lý mẫu với nhiều yếu tố
khác nhau để tạo sản phẩm phân hủy đã chứng minh được tính đặc hiệu của
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
phương pháp. Trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml, có sự tương quan tuyến
tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch theo phương trình y =
0,680x với hệ số xác định R2 = 0,9993. Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu
đã xác định được LOD và LOQ lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml. So sánh với
một số nghiên cứu định lượng flurbiprofen khác đã được công bố cho thấy
phương pháp được xây dựng có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi
≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,71% và độ lệch chuẩn
tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34%.
Nghiên cứu có thể được ứng dụng trong công tác kiểm nghiệm, đảm
bảo chất lượng thuốc đồng thời là tiền đề quan trọng để phát triển các nghiên
cứu tiếp theo như định lượng flurbiprofen trong các dạng bào chế khác, bào
chế, đánh giá tương đương sinh học, dược động học của các thuốc giảm đau
kháng viêm chứa flurbiprofen.
Lời cảm ơn
Các tác giả xin cảm ơn Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài
trợ kinh phí cho nghiên cứu (đề tài mã số CS.17.01).
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Tài liệu tham khảo
[1] Calapai G, Imbesi S, Cafeo V, Ventura SE, Minciullo PL, et al. Fatal
hypersensitivity reaction to an oral spray of flurbiprofen: a case report. J Clin
Pharm Ther. 2013; 38(4): 337-338.
[2] Geerts H. Drug evaluation: (R)-flurbiprofen—an enantiomer of
flurbiprofen for the treatment of Alzheimer's disease. Idrugs. 2007; 10 (2):
121-133.
[3] Mironov GG, Logie J, Okhonin V, Renaud JB, Mayer PM, Berezovski
MV. Comparative study of three methods for affinity measurements: capillary
electrophoresis coupled with UV detection and mass spectrometry, and direct
infusion mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2012; 23 (7): 1232-120.
[4] Zhou SF, Zhou ZW, Yang LP, Cai JP. Substrates, inducers, inhibitors and
structure-activity relationships of human Cytochrome P450 2C9 and
implications in drug development. Curr Med Chem. 2009; 16 (27): 3480-3675.
[5] Drugbank. http://www.drugbank.ca. Flurbiprofen. Consulted jun 20th 2017.
[6] Bhaskar K, Anbu J, Ravichandiran V, Venkateswarlu V, Rao YM.
Lipid nanoparticles for transdermal delivery of flurbiprofen: formulation, in
vitro, ex vivo and in vivo studies. Lipids in health and disease. 2009; 8: 6-21.
[7] Gonzalez-Mira E, Egea MA, Souto EB, Calpena AC, Garcia ML.
Optimizing flurbiprofen-loaded NLC by central composite factorial design for
ocular delivery. Nanotechnology. 2010; 22 (4): 045101.
[8] Meister S, Zlatev I, Stab J, Docter D, Baches S, et al. Nanoparticulate
flurbiprofen reduces amyloid-β 42 generation in an in vitro blood-brain
barrier model. Alzheimer's research & therapy. 2013: 5 (6): 51-63.
[9] Zhao X, Li W, Luo Q, Zhang X. Enhanced bioavailability of orally
administered flurbiprofen by combined use of hydroxypropyl-cyclodextrin
and poly (alkyl-cyanoacrylate) nanoparticles. European journal of drug
metabolism and pharmacokinetics. 2014; 39 (1): 61-67.
[10] European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia 9th
edition. 2017.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
[11] Bilal Y, Emrah A. Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV
Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in
Pharmaceutical Preparations. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2015; 4 (4): 1-8
[12] United States Pharmacopeial Convention. United States
Pharmacopoeia 40–NF 35. 2017
[13] Chenghan M, Bin L, Qiangfeng Y, Jing J, Ting X, et al. Liquid
chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of
flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence.
Journal of Chromatography B. 2015; 993-994: 69-74.
[14] Lee HI, Choi CI, Byeon CY, Lee JE, Park SY, et al. Simultaneous
determination of flurbiprofen and its hydroxy metabolite in human plasma by
liquid chromatography-tandem mass spectrometry for clinical application.
Journal of chromatography B. 2014; 971: 58-63.
[15] Murray KK, Boyd RK, Eberlin MN, Langley GJ, Li L, NaitoY.
Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations
2013). Pure Appl. Chem. 2013; 85: 1515-1609.
[16] Mano N, Narui T, Nikaido A, Goto J. Separation and determination of
diastereomeric flurbiprofen acyl glucuronides in human urine by LC/ESI-MS
with a simple column-switching technique. Drug Metabol Pharmacokin.
2002; 17: 142-149.
[17] Yilmaz B, Emrah A. Determination of flurbiprofen in pharmaceutical
preparations by GC-MS. Arabian Journal of Chemistry. 2015; accepted.
[18] European Medicines Agency. Guideline on bioanalytical method
validation. 2011; 9-10.
[19] The International Council for Harmonisation of Technical
Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. Validation of analytical
procedures: text and methodology Q2(R1). 2005; 6-13.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Validation of a High-Performance Liquid Chromatographic
Method with diod array detection for the Quantification of
Flurbiprofen in 100 mg Film-coated Tablet
Nguyen Thi Thanh Binh, Dang Ngoc Anh, Tran Mai Anh, Nguyen Thanh Hai
VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam
Abstract: A high-performance liquid chromatographic method was
developed for the quantification of flurbiprofen in 100 mg film-coated tablet
in accordance with the direction of the European Medicines Agency and the
International Council for Harmonisation of Technical Requirements for
Pharmaceuticals for Human Use. 10 μl of flurbiprofen solution was injected
onto a C8 reverse phase column (5 μm, 120 Å, 4.6×150 mm). The mobile
phase employed was acetonitrile : water : glacial acetic acid (65 : 32.5 : 2.5,
v/v/v) at a flow rate of 1 ml/min. The column effluent was monitored within 8
minutes by diot array detection at 247 nm. The retention time of flurbiprofen
was found to be 3.73 minutes. In the concentration range of 2 - 20 μg/ml,
there was a tight linear correlation between peak area y (mAU.min) and
sample concentration x (μg/ml) according to the equation y = 0,680x as the
squared correlation coefficient R2 was 0.9993. The limit of detection and
limite of quantification were respectively 0.05 and 0.15 μg/ml. The method
was specific to flurbiprofen with good precision and accuracy. The percentage
recovery was ≤ 100 ± 2%, the relative standard deviation of the repeatability
was ≤ 1.71% and the relative standard deviation of the intermediate precision
was ≤ 2.34%.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
PHỤ LỤC 2
Quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén đơn hoạt chất bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang
1. Mục đích
Định lượng flurbiprofen trong viên nén đơn hoạt chất bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang.
2. Đối tượng
Viên nén flurbiprofen đơn hoạt chất.
3. Phạm vi áp dụng
Các phòng thí nghiệm có trang thiết bị phân tích phù hợp.
4. Trách nhiệm
- Nghiên cứu viên được giao nhiệm vụ có trách nhiệm thực hiện đúng
quy trình.
- Cán bộ quản lý chất lượng, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm
giám sát việc tuân thủ quy trình và nhận định kết quả định lượng.
5. Khái niệm và từ viết tắt
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – performance liquid
chromatography)
DAD Đầu dò chuỗi diode (Diode Array Detector)
FLD Đầu dò huỳnh quang (Fluorecence Detector)
ACN Acetonitril
6. Nguyên lý
Flurbiprofen có danh pháp quốc tế là 2 – (3–flouro–4–phenylphenyl)
propanoic acid. Flurbiprofen là một chất thuộc nhóm acid phenylalkanoic,
có công thức phân tử là C15H13FO2, khối lượng mol phân tử 244,26 g/mol.
Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học (+) S
và (–) R. Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống nhau
và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [1,2].
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen
Hiện tượng huỳnh quang là sự hấp thụ ánh sáng có bước sóng này để
phát ra ánh sáng có bước sóng khác thường trong miền ánh sáng nhìn thấy,
thường xảy ra với chất lỏng và chất khí khi phân tử hấp thụ năng lượng dạng
nhiệt (phonon) hoặc dạng quang (photon). Hiện tượng phát huỳnh quang có
thời gian phát quang ngắn, tắt sau khi ngừng kích thích khoảng từ 10-8 đến 10-
9s. Trong đó thời gian tồn tại của electron ở trạng thái kích thích ở huỳnh
quang là rất thấp, cỡ 10-9 giây.
Quy trình định lượng được chia thành các công đoạn như sau:
Hình 1. Sơ đồ quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén đơn hoạt chất
7. Nguyên vật liệu và trang thiết bị
7.1. Dung môi, hóa chất
Acid acetic từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích.
Viên nén flurbiprofen
Xử lý mẫu
Dung dịch flurbiprofen có nồng độ lý thuyết 50 ng/ml
Sắc ký dung dịch bằng HPLC – FLD
Tính hàm lượng flurbiprofen trong viên nén
Tính khối lượng trung bình viên
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn
HPLC.
Nước (H2O) được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure
UV-TOC đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m.
Giấy lọc Whatman® 40, đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC
0,45µm, Sartorius, Đức…
Mẫu viên nén flurbiprofen được định lượng.
7.2. Trang thiết bị
Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo
Scientific Hoa Kỳ gồm hệ thống bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự động.
Đầu dò FLD Fluorecence Detector: FLD - 3100 Dionex sử dụng đèn
Xenon, khoảng bước sóng đo được 200 – 880 nm.
Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150mm.
Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang
bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478.
Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân
phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo
Scientific, Hoa Kỳ. Bình định mức, ống đong, cối chày,..
8. An toàn
Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét
nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm.
9. Quy trình thực hiện
Bước 1. Thu thập và xử lý mẫu viên nén
1. Lấy 20 viên nén flurbiprofen trong vỉ
2. Tính khối lượng trung bình viên
3. Cạo lớp bao film (nếu có) và nghiền mịn trong cối sứ
4. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 10 mg flurbiprofen
cho vào bình định mức 50 ml, thêm pha động acetonitril : nước : acid acetic
băng tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v) đến vạch
5. Siêu âm khoảng 15 phút
6. Lọc qua giấy lọc Whatman® 40
7. Pha loãng dung dịch trên trong pha động acetonitril : nước : acid
acetic băng tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v) đến nồng độ khoảng 50 ng/ml
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
8. Lọc qua đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC 0,45µm
9. Lấy khoảng 1ml dung dịch thu được lọc qua đầu lọc cellulose tái
sinh Minisart® RC 0,45µm, bơm vào lọ thủy tinh sắc ký V = 1,5 ml.
Bước 2. Sắc ký dung dịch flurbiprofen đã xử lý bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang
1. Điều kiện sắc ký
- Pha tĩnh cột silica gel pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm)
- Pha động là hỗn hợp acetonitril : nước : acid acetic băng với tỷ lệ 65
: 32,5 : 2,5 (v/v/v)
- Tốc độ dòng 1 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu 10 μl
- Thời gian sắc ký 8 phút
- Hệ thống sử dụng đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích thích λEx
= 247nm và bước sóng phát xạ λEm = 312nm
- Nhiệt độ của buồng đo là 45˚C
- Độ nhạy = 5.
2. Số lần sắc ký: 3 lần. Tính diện tích pic (counts.min) và lấy giá trị
trung bình.
Bước 3. Xác định hàm lượng flurbiprofen trong viên nén
1. Xác định nồng độ x (ng/ml) của flurbiprofen trong dung dịch sắc ký
theo công thức:
x = 𝑦−165896
15098 (ng/ml)
2. Nếu x có giá trị nằm trong khoảng 5 – 100ng/ml, hàm lượng C (%)
của flurbiprofen trong viên nén trên hàm lượng lý thuyết được tính
theo công thức:
C = 𝑥
50 × 100 (%)
3. Nếu x có giá trị không nằm trong khoảng 5 – 100 ng/ml, tiến hành
pha loãng dung dịch mẫu với hệ số pha loãng a lần. Hàm lượng C
(%) của flurbiprofen trong viên nén được tính theo công thức:
C = 𝑥 × 𝑎
50 × 100 (%)
Trong đó: a là hệ số pha loãng.
Copyr
ight ©
Sch
ool o
f Med
icine
and
Pha
rmac
y, VN
U
10. Tài liệu tham khảo
1. Brittain Harry G (2013), Profiles of drug substances, excipients, and
related methodology, Academic Press.
2. Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.
