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Clase 2. Replicacin del ADN.Lic. Luis SnchezTecnlogo Medico en Laboratorio Clnico y Anatoma Patolgica

CURSO DE BIOLOGIA MOLECULAR1The Eukaryotic Cell Cycle DNASynthesisRestrictionPointMitosisQuiescenceSSSG1SMSG2SG12II. Historical BackgroundA. 1953 Watson and Crick: La estructura del ADN predice el mecanismo de la replicacinIt has no escaped our notice that the specific pair we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.B. 1958 Meselson and Stahl: La replicacin del ADN es semiconservativa

3Replicacin del ADN. Caractersticas generales1. Requiere un ADN template (molde) y un primer con Extremo 3 OH end (La sintesis de ADN no puede iniciarse de novo) 2. Requiere dNTPs.3. Ocurre en la direccion 5 3.DNA Synthesis:Pequeos ARN actuan como primers en vivo

4La Replicacin es:SemiconservativaSemidiscontinuaBidireccional.

SEMICONSERVACIONthe most beautiful experiment in biology.Los tres modelos potenciales de replicacion el ADN y sus resultados predichos.The actual data!1/4 old:3/4 new1/2 hybids:1/2 newAllhybrids1/2 old:1/2 newAllhybrids6

SEMIDISCONTINUASntesis ContinuaSntesis discontinuaContinua + discontinua =semidiscontinua

Cientos a miles de pb/tipo celularCadena liderCadena rezagada7

BidireccionalQuiere decir, que en algn momento estas dos Horquillas se van a encontrar antes de separarse.

Cmo se lleva a cabo la replicacin en el ADN circularMayora de las bacteriasUsado por los virus,No necesita primersUsado por mitocondrias y cloroplasto

Mapa del cromosoma de E. coli cada numero es minuos (40 000 bp)10

Como se ve realmente una replicacin de ADN en E. coli.

El complejo ADN Enzima Bsico para la replicacin

Recuerdan en que direccin proceda la replicacin?13

EL REPLISOMA O SISTEMA ADN REPLICASAComo se produce la replicacin en una bacteriaPuede ser dividida en:IniciacinElongacinTerminacinIniciacin (Bacteria)Acomodo de secuencias en el origen de replicacin de E. coli (OriC)

Fase de elongacinEs cuando la cadena se alarga producto de la sntesis. Sntesis de las dos cadenas se da en formas diferentes: cadena lder y rezagada.

Sntesis de la cadena rezagada

TERMINACION DE LA REPLICACION

Seq Ter aprox 20pb, actan como trampa, donde las horquillas entran pero no salen.Las protenas TUS (sustancia de utilizacin del terminal) encuentran estas secuencias Ter y el complejo TER-TUS detiene la replicacin por un solo ladoLas ADN polimerasas se equivocan?Si. Pero tiene mecanismos que reparan el dao (Proofreading = correccin de lectura).La E. coli tiene 4,6 x 106 pb en su genoma.La ADN polimerasa se equivoca en 1/1000 1/10 000 pb.Entonces, como se explica que al final de la replicacin, la ADN polimerasa se equivoque 1x10-9 1x10-10 x base?Primero, el emparejamiento A-T y C-G hace que geomtricamente sea correcto ello.Segundo, esto no es suficiente, se necesitan enzimas que ayudan a mejorar la fidelidad de la replicacin.Tercero, a pesar de estas enzimas de reparacin en la replicacin, aun hay mas enzimas que actan post-replicacin.

25Mecanismo de correccin de lecturas (Proofreading)Ejm. Fragmento de Klenow de E. coli

REPLICACION EN EUCARIOTASHasta aqu todo lo explicado es para procariotas (bacterias).

Cmo sucede entonces la replicacin en organismos mas complejos como los eucariotas?En qu diferencia un procariota de un eucariota?En trminos de replicacin en que se diferencian?Tienen diferentes orgenes de replicacin.

Son genomas Lineales o circulares?Se agrupan en verdaderos cromosomas? Por qu?entonces cuales son las partes?En el humano cada origen esta distanciada entre 30 000 300 000 pbOriC = ORC (Complejo de reconocimiento del origen)

Cual es el problema con los telmeros

MitosisMeiosisApoptosis lo eliminaTerminando el trabajo de replicacin en los eucariotas

IV. DNA Polymerases of E. coliThe first DNA polymerase was discovered by Arthur Kornberg in 1957 ( DNA Polymerase I

A. E. coli DNA Pol I has 3 enzymatic activities:

1) 5 ( 3 DNA polymerase

Klenow Fragment

2) 3 ( 5 exoncuclease (For proofreading)

3) 5 ( 3 DNA exonuclease (To edit out sections of damaged DNA)

1 323

Hans Klenow showed that limited proteolysis with either subtilisin or trypsin will cleave Pol I into two biologically active fragments.

Facts about DNA Synthesis Error Rates:

DNA polymerase inserts one incorrect nucleotide for every 105 nucleotides added.

Proofreading exonucleases decrease the appearance of an incorrect paired base to one in every 107 nucleotides added.

Actual error rate observed in a typical cell is one mistake in every 1010 nucleotides added.

Error rate for RNA Polymerase is 1/105 nucleotides.aa 928

Klenow Fragment

5 to 3 Exo.

5 to 3 Pol & 3 to 5 Exo