TECNICAS BASADAS EN ADN FINGERPRINTING...

TECNICAS BASADAS EN ADN FINGERPRINTING SECUENCIACIÓN

Nombre: Dra. Claudia Etchebehere Institución: Grupo de Ecología Microbiana. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay

3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017

CONTENIDO


‣ Clonado y secuenciación de SANGER

‣ Secuenciación masiva

‣ Técnicas de fingerprinting (DGGE, T-RFLP)

‣ Análisis de datos

‣ Ejemplos de nuestro laboratorio

‣ Desafíos y futuro

CARACTERIZACION DE UN AISLAMIENTO


APLICACION A COMUNIDADES MICROBIANAS


BIBLIOTECA DE CLONES


! DNA extraction

! PCR of the desired gene (16S rRNA gene Bacteria, Archea, a group, functional gene)

! Cloning the PCR product ● (Topo TA cloning kit)

! Pick the colonies (100 colonies)

! PCR of the gene cloned or plasmid extraction

! Sequencing

! Analysis

RESULTADO


ES POSIBLE INFERIR LA FUNCION DEL MICROORGANISMO

VENTAJAS Y DESVENTAJAS


VENTAJAS DESVENTAJAS

! Da información certera de los microorganismos que están presentes. Secuencias largas

! Podemos correlacionar con otros métodos (T-RFLP)

! Alto costo (800 dólares 100 secuencias)

! Laborioso

PREGUNTAS QUE PODEMOS RESPONDER


‣ ¿Qué microorganismos están en el reactor? ‣ Si, se logra buena identificación.

‣ ¿La comunidad cambia la cambiar el tipo de operación? ‣ Si, pero si son muchas muestras es caro y complicado

el análisis.

‣ ¿Porqué el reactor funciona mal? ‣ No siempre podemos responder esta pregunta

utilizando esta técnica.

MÉTODOS DE SECUENCIACION MASIVA


! Mas secuencias ! Mas rápido ! Menor costo

! Métodos disponibles ! 454 pyrosequence ! Ion Torrent ! Illumina Mi-seq ! Pac-Bio

SECUENCIACIÓN DE SANGER


Resultado: Fragmentos de diferente tamaño

según donde se incorpora ddNTP

ELECTROFORESIS CAPILAR

96 capilares simultaneamente 1000 nucleótidos de largo

ION TORRENT


PCR en emulsión en beads

Detecta cambios en el pH al adicionar una base

ILLUMINA


Amplificación en fase sólida

Detección de incorporación de nucleótido marcado

PAC-BIO


Se detecta la incorporación de nucleótidos en una sola molécula

APLICACION AL ANALISIS DE COMUNIDADES MICROBIANAS


ANÁLISIS DE DATOS


! QIIME

! MOTHUR (https://www.mothur.org)

! Otros análisis

! PICRUSt permite inferir la función

! STAMP permite comparar pares de muestras

https://www.mothur.org

RESULTADOS


1er operac. 2da operac. Parada

Filo/Días 15 57 271 306 334 356 383 439 531 Promedio %

Acidobacteria 1,9 1,2 2,7 1,3 0,4 1 1,5 1,8 1,7 1,5Chloroflexi 19 23 13 24 11 9,9 13 21 12 16Firmicutes 19 17 14 21 26 56 52 49 48 33,5Hyd24-12 8 10 17 5,6 1,3 7,1 6,5 1,3 2,6 6,7OD1 0,2 0,4 0,4 0,3 1,8 0,8 1,6 1,8 3,5 1,2OP8 3,2 3 6,3 4,6 0,6 1,8 3,6 2,1 2,9 3,1Proteobacteria 8 8 14 6,6 2,2 3,1 4,2 4,9 5,5 6,3Synergistetes 7,5 5 4,4 8,7 2,9 4,1 3,5 4,5 7,5 5,3TM7 1,2 0,8 0,6 0,3 0,4 0,1 0,2 0,3 0,1 0,4TPD-58 2,5 0,6 0,2 0,1 0 0 0 0 0 0,4Thermotogae 3,3 3,4 5 1 0,1 0,3 0,5 0,4 0,6 1,6Verrucomicrobia 11 14 3,1 2,1 46 6 4,8 5,7 3,6 6,2*

SECUENCIACIÓN MASIVA VS SANGER


‣ Secuenciación masiva

! Extracción de ADN (2h) ! PCR de región ARNr16S (3h) ! Purificación (0,5h) ! Secuenciación masiva (10 h) ! Tiempo tot 13,5h

! 40 muestras simultáneas ! Resultado ◦ 10000 reads

! Costo ◦ 50-70 dólares

Cloning library

! Extracción de ADN (2h) ! PCR ARNr de 16S (3h) ! Clonado (5h) ! Repique de 100 colonias (3h) ! Crecer las colonias (24h) ! Extraer plásmido (2h) ! Secuenciación (12h) ! Tiempo tot 41h

! 1 muestra ! Resultado ◦ 100 secuencias

! Costo ◦ 700 dólares

AUMENTA LA COBERTURA DE LA COMUNIDAD


Cloning library Secuenciación masiva

PROBLEMAS Y LIMITACIONES


! Secuencias cortas que limitan la identificación (200-400nt).

! Cobertura de los primers.

! Análisis de gran cantidad de datos requiere capacidad informática importante.

! No se puede comparar muestras on line (BLAST)

PRIMERS PARA SECUENCIACIÓN MASIVA


COBERTURA DE LOS PRIMERS


Cuidado al elegir los primers

Check primers en base Silva



‣ ¿Qué microorganismos están en el reactor? ‣ Si, pero puede haber dificultad en la identificación

‣ ¿La comunidad cambia la cambiar el tipo de operación? ‣ Si, pero si son muchas muestras es complicado el

análisis.



MÉTODOS DE FINGERPRINTING


‣ Permiten tener una “foto” de la comunidad.

‣ Comparar comunidades diferentes.

‣ Las más utilizadas DGGE, T-RFLP

BASES DE LOS METODOS


DGGE


PCRDGGE

MUESTRA

DNA

PCR

M 1 2 3 4 5 6

DGGE


A=TC≡G

Según la secuencia va a ser diferente la capacidad de migrar en el gel desnaturalizante.

DGGE


‣ Extracción de ADN

‣ PCR con un primer con GC clamp

‣ Detección por electroforesis en gel de agarosa

‣ Separación por electroforesis en gel de poliacrilamida

‣ Detección de bandas ‣ ‣ Análisis de perfiles

‣ Extracción de bandas del gel

‣ PCR y secuenciación de ADN de las bandas

RESULTADOS


Es posible obtener la secuencia a partir delas bandas

Análisis de perfiles mediante Gel compare

T-RFLP Terminal-Restriction Fragment Length Polymorfisms


MÉTODO T-RFLP


‣ Extracción de ADN (3hs) ‣ PCR (2-3hs) ‣ Purificación y cuantificación PCR (0,5h) ‣ Digestión con enzimas de restricción (3hs) ‣ Precipitación de fragmentos (1,5h) ‣ Separación por electroforesis capilar (secuenciador

automático) ‣ Análsis de perfiles ‣ Identificación de T-RF

ANÁLISIS DE RESULTADOS


Análisis con Peak scannerCromatograma de T-RF

ES POSIBLE CONOCER LA IDENTIDAD DE LOS T-RF


Correlación con secuencias de bases de datos (MICA)

Clonado o aislamiento y secuenciación

VENTAJAS Y DESVENTAJAS MÉTODOS FINGERPRINTING


‣ Se pueden analizar muchas muestras simultáneamente

‣ Bajo costo (T-RFLP 10 dólares)

‣ Métodos rápidos

‣ Equipamiento de bajo costo

‣ Análisis relativamente fácil

‣ Se puede conocer la identidad de los organismos



‣ ¿Qué microorganismos están en el reactor? ‣ No siempre, solo en el caso de que se logren identificar

los picos.

‣ ¿La comunidad cambia la cambiar el tipo de operación? ‣ Si, es el tipo de pregunta que respondemos.



ANÁLISIS DE DATOS


‣ Comparación entre las muestras ‣ Análisis de Cluster ‣ Análisis de PCA

‣ Correlación con variables ambientales ‣ CCA

‣ Determinación de los índices de diversidad.

‣ Composición de géneros y especies de las diferentes comunidades.

PAST PAleontological STatistics

R The R Project for Statistical Computing

EJEMPLO DE NUESTRO LABORATORIO


Inhibir la metanogénesis

Seleccionar los microorganismos productores de hidrógeno.

GLUCOSE

Fermentative bacteria

VOLATILE FATTY ACIDS, ALCOHOLS, H2 AND CO2

ACETATE

Acetogenic bacteria

METHANE

Methanogenic archaea

Methanogenic archaea

Producción de hidrógeno a partir de aguas residuales industriales

¿Que microorganismos se seleccionan en reactores de alta y baja producción de hidrógeno?

EJEMPLO DE NUESTRO LABORATORIO


‣ 5 research groups

‣ 30 samples

‣ 20 reactors

‣ 5 different configurations: UASB, EGSB, CSTR, FBR, SBR

‣ Different OLR, HRT

‣ Different inoculum, with and without treatment

‣ Different substrates

16S rRNA gene massive sequencing

REACTORES DE PRODUCCION DE HIDROGENO


▪ Low diversity

▪ High dominance

‣ High instability

▪ Lactic acid bacteria and propionic acid bacteria are the main competitors.

▪ Interactions between fermenters could enhance the hydrogen production.

CORRELACIÓN CON VARIABLES AMBIENTALES


MICROORGANISMOS SELECCIONADOS SEGUN LA PERFORMANCE DEL REACTOR


Group 1 High H2 production

Group 2 Middle H2 production

Group 3 Low H2 production

DESAFÍOS Y FUTURO


‣ Mejorar la identificación, secuencias mas largas.

‣ Comparación con muestras en bases de datos.

‣ Análisis de gran cantidad de datos.

‣ Trabajar con ARN y expresión de genes.

‣ Conocer la gran mayoría no cultivable.

DESAFÍOS Y FUTURO


‣ Single Cell Genomics

GRUPO DE ECOLOGIA MICROBIANA


[email protected]

mailto:[email protected]

TRATAMIENTO Y RECICLAJE DE AGUAS INDUSTRIALES M E D I A N T E S O L U C I O N E S S O S T E N I B L E S FUNDAMENTADAS EN PROCESOS BIOLÓGICOS. RED TEMÁTICA 316RT0508Financiado por:


Con la colaboración de:

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