CHRISTIAN LAFLAMME

IMPLICATION DE L'APOPTOSE DES LYMPHOCYTES BRONCHO-

ALVÉOLAIRES HUMAINS DANS L'AL*OLITE ALLERGIQUE

EXTRLNSEQUE.

Mémoire

présenté

À la Facultd des études supérieures

de l'université Laval

pour l'obtention

du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

FACULTÉ DE MJ?DECINE

&DECINE EXPÉRIMENTALE

UNIVERSITÉ LAVAL

MAI 2000

O Christian Laflamme, 2000

National Library I*I .,,a Bibliotheque nationale du Canada

Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie Services services bibliographiques

395 Wellington Sveet 395, ~ i e Wdimgton OnawaûN KlAON4 O(lewa ON K1A ON4 Canada Canada

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L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.

Résumé

L'aivéolite allergique extrinsèque ( A M ) est une maladie inflammatoire

pulmonaire caractérisée par une lymphocytose alvéolaire persistante. Les buts de l'étude

étaient : 1) évaluer si une diminution de l'apoptose des lymphocytes pulmonaires pouvait

expliquer la persistance des lymphocytes dans le poumon, 2) décrire les mécanismes de

cette apoptose. Deux catégories de sujets furent étudiées, AAE et normaux sans contact.

Le pourcentage de lymphocytes en apoptose était significativement plus élevé chez les

sujets normaux que chez les patients atteints de I'AAE. La proportion de lymphocytes

positifs pour le Fas (récepteur associé à l'apoptose) était environ 50% plus élevée chez

les lymphocytes des patients AAE que chez ceux des normaux. Le Fas soluble (Fas,) est

augmenté de plus de 300% dans le liquide du lavage bronchoalvéolaire (LBA) des

patients AAE. De plus, les lymphocytes des patients AAE produisent significativement

plus de Bcl-xL (protéine mi-apoptotique). Lorsqu'isolés et mis en culture pendant 24

hres, 4 1.2% des lymphocytes pulmonaires non stimulés des patients AAE sont morts par

apoptose comparativement à 12'9% chez les lymphocytes provenant des sujets contrôles

@=0,004). Les lymphocytes T des patients AAE ne sont pas sensibles à l'apoptose suite à

une stimulation à I'anti-Fas. Par contre, l'interleukine-2 (IL-2) inhibe I'apoptose de ces

celluIes @=0,07). En conclusion, l'apoptose des lymphocytes dans I'AAE est diminuée et

s'explique en partie par 1) une augmentation du Fas, (inhibe l'initiation de l'apoptose), 2)

une augmentation de Bcl-xL, 3) une augmentation de l'IL-2 dms le poumon et 4) une

défaillance dans Ie sentier Fas-FasL.

Christian ~ a f l & e B.SC.

Étudiant

~ y ~ v o n Cormier M.D.

Directeur de recherche

Ce mémoire est composé d'un article et d'une section de résultats

complémentaires à l'article. Le chapitre 3 présente la publication s'intitulant : Apoptosis

of bronchoalveolar lavage lymphocytes in hypersensitivity pneumonitis. (C. Laflamme, E.

Israël-Assayag, Y. Cormier). Cette étude a été soumise pour publication dans uThe

Journal of Immunology B. Le chapitre 4 est, quant à lui, formé d'une section de résultats

complémentaires (non-publiés) à l'article. Ii est important de prendre note que la

bibliographie, située à la fin de ce mémoire, englobe tous les chapitres sauf le numéro 3,

qui a sa propre section de références associées.

Je tiens tout d'abord à remercier le Dr Yvon Cormier, qui m'a accueilli au sein de

son équipe. Ses nombreux conseils et sa simplicité ont su modifier mon approche tant au

niveau scientifique que dans la vie de tous les jours. Merci h Évelyne Israël-Assayag,

1' assistante de recherche de notre laboratoire, pour son soutien technique et scientifique.

Évelyne est une personne indispensable, tant pour ses idées que pour ses connaissances.

Merci également à tout les gens des laboratoires de pneumologie et de

cardiologie. le pense entre autres à Nathaiie Pagé pour ses conseils techniques, au Dr

Guy Tremblay (père spirituel pour les congrès), à Martin Coulombe, mon grand ami,

pour tout le défoulement lors de nos parties de squash « fiil1 contact ),, à Francis Davoine,

pour nos conversations de tracteurs et à Sophie Lavigne pour la cytométrie en fiux.

Finalement, je ne peux passer sous silence mes parents Yvan et Blanche, mes

arnis(es) est bien sûr ma copine Stéphanie; leur soutien et leur amour sont source de

motivation et d'énergie.

Encore une fois merci!

TABLE DES MATI~RES

PAGE

RÉSUMÉ

AVANT-PROPOS

TABLE DES MATIÈRES

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES FIGURES

LISTE DES ABRÉVIATIONS

CHAPITRE 1 Introduction

1 . 1 L'alvéolite ailergique extrinsèque

1.2 L'inflammation pulmonaire

1.2.1 Cellules épithéliales des voies respiratoires

1.2.2 Macrophages alvéolaires

1.2.3 Neutrophiles

1.2.4 Lymphocytes

1.3 L'inflammation pulmonaire dans I'AAE

1.3.1 Prolifération locale

1.3.2 Augmentation du recrutement

1.3.3 Inhibition de l'apoptose

1.4 L'homéostasie cellulaire

1.4.1 Prolifération locale

1.4.2 Mort cellulaire

1.4.2.1 Nécrose

1.4.2.2 Apoptose

A. Le Fas :récepteur cellulaire de l'apoptose

B. Les gènes impliqués dans l'apoptose

B. 1 Les produits de gènes pro-apoptotiques

8 1.1 Bax et Bad

B.2 Les produits de gènes anti-apoptotiques

B.2.1 Bcl-2

B.2.2 Bcl-XL

C. IRs enzymes impliquées dans I'apoptose

D. Fragmentation de l'ADN

1.5 Sommaire

CHAPITRE 2 Hypothèses de travail

CHAPITRE 3 Apoptosis of bronchoalveolar lavage lymphocytes

in hypersensiîiviîy peurnonilis.

3.1 Résumé

3.2 Abstract

3.3 Introduction

3.4 Materials and Methods

3.5 Results

3.6 Discussion

3.7 Rrferences

3.8 Table and Figtrres

CHAPITRE 4 Augmentation et mécanismes de 19apoptose in vitro

des lymphocytes du lavage broncho-alvéolaire de

I'alvéolite allergique extrinsèque.

4.1 Mise en situation

4.2 Matériel et méthodes

4.2.1 Lavage broncho-alvéolaire

4.2.2 Purification des lymphocytes sur colonne laine-nylon

et culture cellulaire

4.2.3 TUNEL

4.2.4 Activité de la caspase 3

4.2.5 Analyse statistique

4.3 Résultats

4.3.1 Quantification de l'apoptose (test de TUNEL)

des lymphocytes T en culture non stimulés. 57

4.3.2 Mesure de l'activité de la caspase 3 chez les

lymphocytes T pulmonaires cultivés pendant 24 heures

sans stimulation. 58

4.3.3 Effet de I'anti-Fas et de I'IL-2 sur l'apoptose

des lymphocytes T cultivés pendant 24 heures (apoptose

quantifiée par TUNEL). 58

CHAPITRE 5 Conclusion générale 63

Bibliographie 67

LISTE DES TABLEAUX

PAGE

Tableau 1 . 1 : Maladies associées à un dérèglement du processus apoptotique. 11

Tableau 3.1 : BAL characteristics of HP patients and nomals subjects. 4 1

LISTE DES FIGURES

PAGE

Figure 3.1 :

Figure 3.2 :

Figure 3.3 :

Figure 3.4 :

Figure 3.5 :

Figure 3.6 :

Figure 4.1 :

Figure 4.2 :

Figure 4.3 :

Evaluation of BAL lymphocytes apoptosis. 43

Percentage of BAL lymphocytes for the surface

receptors Fas and FasL. 45

Quantification of ,Fas in BAL. 47

Correlation between BAL lymphocytosis and the concentration

of ,Fa5 in the BAL fluid and the percentage of Annexin+/PI-cells. 49

Proportion of BAL Iymphocytes positives for Bcl-2, 5 L

Quantification of the Bcl-xL protein in the BAL lymphocytes. 53

Dénombrement de la quantité & lymphocytes pulmonaires

cultivés sans stimulation et qui sont positifs pour le test de

TUNEL.

Activité de la caspase 3 en fonction du temps.

Effet de l'anti-Fas et de l'IL-2 sur l'apoptose des

lymphocytes T pulmonaires après 24 hres de culture.

AAE

ACV

APC

A l w n

BAL

BS A

DUTP

FasL

Fus

FBS

GM-CSF

HP

ICE

IL- 1

IL-2

IL-6

L-8

LBA

MA

MIP- 1 a

N

PBS

PI

PVDF

sF=

SR

SIDA

TBS

TdT

alvéolite allergique extrinsèque

Arrêt cardio-respiratoire

antigen presenting ce11

acide ribonucléique messager

bronchoalveolar lavage

bovine serum albumin

desoxy uridine tri-phosphate

Fas ligand

Fas soluble

Fœtal bovine serum

Granulocyte Macrophage Colony Srimulating Factor

hypersensitivity pneumonitis

interleukine-1 convening enzyme

interleukine 1

interleukine 2

interleukine 6

interleukine 8

lavage broncho-alvéolaire

macrophage alvéolaire

macrophage idanimatory protein- 1 a

normaux, normal

phosphate buffered saline

propidium iodine

polyvinylidene de fluoride

soluble Fus

Saccaropolyspora rectivirgula

S indrôme d' irnmuno-déficience acquise

tris buffered saline

terminal deoxinucleotidyl transferase

TNF Tumor Necrosis Factor

TUNEL Terminal Uridine Nick End Labelling

1.1 L'alvéolite allergique extrinsèaue

L'alvéolite allergique extrinsèque (AM) est une maladie pulmonaire interstitielle

inflammatoire résultant d'une réaction immunitaire d'hypersensibilité à des antigènes

dérivés de bactéries, de champignons microscopiques, de protéines animales et, plus

rarement, de substances chimiques réactives (1). Chez les patients, les symptômes varient

en fonction du stade de la maladie (aigu, subaigu ou chronique). Les manifestations les

plus courantes sont de la fièvre, de la dyspnée, une toux sèche et une perte de poids (2).

Dans certains cas plus graves, on constate des dommages pulmonaires irréversibles

comme la fibrose et l'emphysème (2).

Au niveau pulmonaire, cette pathologie est caractérisée par une augmentation

importante de cellules inflammatoires et de médiateurs pro-inflammatoires (cytokines)

(3). Dans l'établissement du diagnostique de l'AAE, un lavage broncho-alvéolaire (LBA)

est pratiqué. Cet examen de routine consiste 21 injecter et à retirer séquentiellement de

petits aliquots (50-60 ml) de saline physioIogique (0,996).

Chez un patient AAE en phase aiguë, le nombre de cellules dans le LBA est élevé

(100 à 150 x 106 cellules par lavage de 300 ml) et le pourcentage de lymphocytes T

dépasse souvent les 50% (se situe entre 30 et 70%) (2). Les nombres absolus de

neutrophiles et de macrophages sont aussi plus élevés. Par opposition, chez un sujet sain,

le nombre de cellules inflammatoires dans le LBA est d'environ 15 x 106 cellules par

lavage de 300 ml (2). Le LBA contient normalement, en moyenne, 89% de macrophages,

10% de lymphocytes et 1% de neutrophiles (4).

1.2 L'inflammation pulmonaire

De façon générale, l'inflammation est une réaction physiologique complexe et

multifactorielle par laquelle un tissu vascularisé, comme le poumon, répond à un stress de

nature étrangère ou à une blessure (5). Durant ce processus, toute une panoplie de

médiateurs solubles et de composantes cellulaires iravaillent de concert afin de réguler, le

plus finement possible, I'blimination de l'agent causal. L'infIamrnation est un phénomène

crucial au niveau immunitaire pour maintenir l'organisme en santé. Cependant, cet

équilibre est fragile et lorsque l'inflammation est peu contrôlée, il en résulte des

pathologies.

De façon traditionnelle, l'inflammation est divisée en deux catégories.

Dépendemment des auteurs, on parlera d'immunité cellulaire et d'immunité humorde ou

d'inflammation aiguë et d'inflammation chronique (5). Quoi qu'il y ait certaines

différences entre les deux terminologies, les bases conceptuelles sont ii peu près les

mêmes. L'inflammation aiguë est de courte durée (minutes B jours). Elle est caractérisée

par l'accumulation de fluide, de protéines plasmatiques et de leucocytes phagocytants, le

plus souvent des neutrophiles (5). En contrepartie, il y a la forme chronique qui est de

longue durée et est caractérisée par un influx de lymphocytes (T et B) et de macrophages

( 5 ) .

Au niveau pulmonaire, le contrôle de l'inflammation est vitai. En effet, il est

essentiel de conserver intacte et stérile l'interface entre les alvéoles et l'air ambiant, et ce

afin d'assurer l'efficacité des échanges gazeux dans le processus respiratoire (6). il

devient dors important, dans ce milieu fragile, de neutraliser et d'éliminer les antigènes

respirés le plus rapidement et le plus discrètement possible. Dans le cas d'une inhalation

massive et répétée d'antigène (comme dans L'AM), le processus inflammatoire s'engage

laissant place aux différentes cellules inflammatoires et aux médiateurs solubles.

Mentionnons toutefois que seulement une faible proporcion de gens exposés à des

antigenes causant I'AAE vont développés la maladie. La raison à ce fait est jusqu'à

présent inconnu.

Plusieurs types de cellules régulent l'inflammation pulmonaire. Parmi celles-ci,

mentionnons les ceIlules épithéliales bronchiques et alvéolaires, les cellules dendntiques,

les neuuophiles, les macrophages alvéolaires (MA), les éosinophiles, les mastocytes, les

lymphocytes, etc. Chacune d'entre elles joue un rôle clé dans le processus inflammatoire

et cela aussi bien par leurs actions (phagocytose, présentation d'antig6nes. ..) que par le

biais de la sécrétion d'un patron de médiateurs solubles qui est propre à chacun des

différents types cellulaires (7).

1.2.1 Cellules épithéliales des voies resoiratoires

Les cellules épithéliales des voies respiratoires peuvent participer à la régulation

de Ia fonction des cellules inflammatoires en synthétisant et en sécrétant différentes

cytokines. Parmi celles-ci mentionnons certaines chimiokines (l'interleukine4 (ILS), le

Growth regrrlaring oncogene-alpha (Gro-a), le Gro- y), l ' L I , l'IL-6, le Tumor Necrosis

Factor (TNF), différents Colony Stimulating Factor (CSF) comme le Grandocyre

Macrophage - CSF (GM-CSF) qui vont promouvoir la survie, l'activation et la

différentiation des macrophages, des neutrophiles et des éosinophiles, et bien d'autres

cytokines (8). Dépendemrnent de la pathologie et du type de stress inflammatoire, les

cellules épithéliales bronchiques sécrèteront différents médiateurs solubles.

1.2.7 Macro~hages alvéolaires

Le MA occupe une position cxuciale dans l'immunité pulmonaire. En effet, il agit

comme première ligne de défense, afin de conserver les épithéliums alvéolaires et

pulmonaires exempts de particules dtrangères (ex : poussière, matières organiques,

bactéries, etc.) (9). Lorsque des antigènes sont inhalés, les MA phagocytent ces

substances, ce qui les stimulent. iis relâchent alors des médiateurs pro-inflammatoires à

large spectre de stimulation, comme l'IL-1 et le TNF (10). Ces cytokines ont pour effet

direct d'avertir les cellules avoisinantes de la présence d'un étranger et de promouvoir le

recrutement des leucocytes de la circulation sanguine en augmentant la perméabilité

vasculaire (1 1). De plus, ces médiateurs sont responsables de la libération d'autres

cytokines contribuant à l'activation du processus inflammatoire comme l'IL-8 et l'IL-6.

1.2.3 Neutrophiles

Une des réponses les plus précoces et crucides dans l'inflammation est le

recrutement de neutrophiles du sang périphérique au site inflammatoire (5). Ceci se fait

sous l'influence d'agents chimiotactiques comme l'IL-8. Les neutrophiles recrutés au site

de l'inflammation sont dors activés et phagocytent les particdes étrangères et

pathogènes (12). Ils vont ainsi digérer ces particules à l'aide de leurs granules

intracellulaires contenant des oxydants endogènes et des enzymes protéolytiques (12).

La majorité des antigènes sont éliminés de cette façon. Cependant, dépendemrnent

de Ia nature et de la quantité d'antigènes présents dans le poumon, ii arrive parfois que les

cellules phagocytantes ne suffisent pas à la tâche et il faut dors enclencher une réaction

inflammatoire plus spécifique menant à l'inflammation chronique.

Une augmentation de la concentration de certaines cytokines, dont I'IL-1, au site

de l'inflammation va servir de chimioattractant et de stimulant pour les lymphocytes. Les

lymphocytes T-helper (Th) activés par certaines cytokines vont enclencher une réponse

Th1 ou Th2. Certaines lymphokines seront alors synthétisées (13). Parmi ces

lymphokines, l'IL-2 semble jouer un rôle important dans l'activation et la survie des

lymphocytes dans le poumon (14). Les lymphocytes T activés vont ensuite stimuler les

lymphocytes B pour la production d'immunoglobulines spécifiques à l'antigène à

éliminer. Certaines cytokines produites subséquemment par les lymphocytes

contribueront à la régulation et au retour à l'homéostasie lors de la résolution de la

réaction inflammatoire.

1.3 L'inflammation ~ulma~iaire dans l'ME

L'AAE est caractérisée par une réponse irnmunologique anormale suite à une

exposition à des antigènes environnementaux non pathogènes. En effet, chez certaines

personnes exposées à ces antigènes, il se développe une réaction d'hypersensibilité face à

ceux-ci. L'augmentation du nombre de lymphocytes T dans le LBA des patients AAE

constitue une particulmit6 de cette maladie (2). Les lymphocytes T ont, en génhl, un

profi1 CD8 positif (lymphocytes T suppresseurs/cytotoxiques) (2). De plus. ces cellules

sont activées et sécrktent des facteurs de croissance reconnus pour occasionner des

dommages tissulaires importants, voire même irréversibles (ex : fibrose, emphysème)

( 12).

Une propriété importante de cette lymphocytose pulmonaire est qu'elle est

persistante dans le temps, parfois même jusqu'à deux ans après la fin du contact

antigénique (15). il devient alors tout ii fait pertinent de tenter d'expliquer l'étiologie de

ce débalancement homéostasique si dommageable pour le tissu pulmonaire. D'emblée,

deux mécanismes généraux sont retenus : 1) une prolifdration locale (l6,17,18) et 2) une

augmentation du recrutement de ces cellules (19,20). C'est deux processus

immunologiques ont déjà fait l'objet d'études plus approfondies. Cependant, un troisième

mécanisme, celui-là hypothétique, n'a jamais été évdué. ii s'agit d'une augmentation de

la survie par l'inhibition de l'apoptose normale. Cette hypothèse sera vérifiée dans ta

présente étude. ii est raisonnable de penser que les trois mécanismes puissent agir de

concert.

1.3.1 Prolifération locale

Plusieurs rapports ont déjà fait état d'évidences sur l'état prolifératif des

lymphocytes pulmonaires dans I'AAE. L'un d'eiles a démontré que les MA et le

surfactant des patients atteints d ' M E ne sont plus capables d'inhiber l'activation des

lymphocytes T pulmonaires, suggérant que ces ceiiules sont en prolifération (16). De

plus, il a été démontré que les lymphocytes T du LBA des patients AAE expriment

davantage de marqueurs d'activation, comme le récepteur p75, associé à l'IL-2, le VLA-1

et l'antigène du HLA-Dr comparativement aux lymphocytes du LBA de sujets contrôles

(17). Ces observations sont donc des indices sur l'état prolifératifs des lymphocytes T

pulmonaires dans 1'AAE.

Une autre étude a démontré que le niveau d'IL-2, un facteur important dans

l'expansion clonale et la survie (par inhibition de l'apoptose) des lymphocytes T, est

augmenté dans le liquide du LBA des patients AAE (18). De plus, ces cellules proliférent

de façon dose-dépendante suite à une stimulation avec cette cytokines (18). Ces résultats

suggèrent que l'IL-2 joue un rôle important dans I'AAE en stimulant la prolifération des

lymphocytes et peut-être permet leur persistance dans le poumon. L'évaluation de ce

dernier item fait partie de ce rapport.

1.3.2 Augmentation du recrutement

D'autres études ont vérifié la possibilité d'une augmentation du recrutement des

lymphocytes au site de l'inflammation. L'une d'elles a remarqué l'augmentation des

ARN, des chirniokines RANTES et macrophage inflammatory protein-1-alpha (MIP-1-

a) chez les cellules inflammatoires du LBA des patients AAE (19). De plus, il a été

démontré que des cellules épithéliales pulmonaires (A549) stimulées avec l'antigène

Saccharopolyspora rectivergula (SR), responsable de ta maladie du poumon de fermier

(une forme d'AM), expriment (ARN,) et sécrètent (protéine) l'IL-8 en réponse à ce

stress (20). 11 est connu que RANTES, MIP-la et l'IL-8 sont des facteurs

chirnioattractants pour les lymphocytes (21). Pris ensemble, ces résultats suggèrent une

augmentation du recrutement des lymphocytes dans I'AAE et donc l'influence de ce

phénomène dans le maintien de la lymphocytose.

1.3.3 inhibition de I'awvtose

A notre connaissance, aucune étude n'a été publiée concernant un rôle potentiel

de I'apoptose des lymphocytes T pulmonaires dans le maintien de l'inflammation dans

I'AAE. Cependant, on retrouve dans la Littérature des indices nous permettant de poser

comme hypothèse qu'une diminution de I'apoptose des lymphocytes T pulmonaires

pourrait être impliquée dans I'AAE. Tout d'abord, tel que mentionné plus haut, le niveau

d'IL-2 (un facteur anti-apoptotique pour les lymphocytes T) est augmenté dans I'AAE et

les lymphocytes T pulmonaires sont aptes à répondre à cette cytokine grâce, entre autres,

à leur récepteur p75 qui est surexprimé (17). De plus, ces cellules proliferent de manière

dose-dépendante en réponse à L'IL-2 (18).

Un autre indice intéressant est issu de la recherche dans le domaine du systeme de

costimulation B7-CD28. Ce sentier est impliqué spécifiquement dans l'activation et la

survie des lymphocytes. Le CD28 est une molécule portée par les lymphocytes et est un

ligand pour le B7-1 (CD80) et B7-2 (CD86) qui sont des récepteurs associés aux cellules

présentatrices d'antigènes (22). La costimulation B7-CD28 est connue pour augmenter la

production d'IL-2 par les lymphocytes permettant ainsi à ces cellules de résister

davantage à I'apoptose (23). De plus, la costimulation B7-CD28 amplifie, de façon

substantielle, l'expression du Bcl-xL (protéine anti-apoptotique) chez les lymphocytes

123).

Dans L'AAE, l'expression du 87 (1 et 2) est augmentée sur les macrophages

alvéolaires des patients atteints de la maladie (24). De plus, le CD28 est fortement

exprimé chez tous les lymphocytes pulmonaires des patients AAE (24). Prises ensemble,

ces données suggèrent que les lymphocytes du LBA des patients AAE sont susceptibles

de produire davantage d'iL-2 et de Bcl-xL, deux facteurs de survie pour ces cellules.

Une observation intéressante a été faite par le groupe de Agostini et al. qui a

démontré que les lymphocytes pulmonaires des patients AAE expriment davantage de

Fas (récepteur connu pour induire l'apoptose chez les lymphocytes) à leur surface

comparativement aux lymphocytes pulmonaires de sujets normaux (25). Cet élément

d'information va à l'encontre de l'hypothèse d'une diminution de l'apoptose des

lymphocytes dans I'AAE puisqu'une augmentation de l'expression cellulaire du Fas

corrèle habituellement avec une augmentation de l'apoptose.

En résumé, I'AAE est caractérisée par une forte inflammation pulmonaire. La

grande majorité des cellules inflammatoires retrouvées dans le poumon sont des

lymphocytes T. Or, il semble que cette lymphocytose pulmonaire soit persistante dans le

temps. L'hypothèse d'une diminution de I'apoptose des lymphocytes dans I'AAE n'a pas

été évaluée. Cet élément pourrait peut-être expliquer la lymphocytose persistante dans

cette pathologie où l'homéostasie cellulaire est affectée.

1.4 L'homéostasie cellulaire

On peut définir l'homéostasie cellulaire comme un état d'équilibre entre les

ceilules en prolifération, celles en différentiation et celles qui meurent (26). Ce contrôle

des populations cellulaires chez les êtres vivants est un phénomène vital pour maintenir

un organisme en santé.

Si l'un ou l'autre des différents états est dérégulé, cet équilibre est rompu. Les

réactions physiologiques découlant directement de cette homéostasie deviennent dors

affectées à différents degrés. L'inflammation est un phénomène de débalancement

homéostasique et la résorption de l'inflammation peut être vue comme le retour 21

l'homéostasie par l'élimination des cellules inflammatoires accumulées.

1.4.1 Prolifération cellulaire

La proIifération cellulaire est un phénomène par lequel un clone cellulaire entre en

division cellulaire. Le phénomène a déjii été abordé plus haut (section 1.3.1).

1.4.3 Mort cellulaire

II existe deux types distincts de mort cellulaire, soient la nécrose et l'apoptose.

Des deux catégories de mon cellulaire, seule I'apoptose est impliquée dans le maintien

physiologique de l'homéostasie cellulaire, constituant ainsi une mort cellulaire naturelle

(27).

1.4.2.1 Nécrose

La nécrose est une mort ceildaire non physiologique résultant d'un événement

fortuit comme par exemple une privaiion subite d'oxygène, une force mécanique

localisée, une élévation rapide du taux d'acidité, etc, (28). Ce phénomène ne nécessite

pas une dépense d'énergie (sous forme (L'ATP) pour la cellule (29). Lors de la nécrose, la

membrane cellulaire est brisée et le contenu cytoplasmique est alors déversé dans

I'environnement immédiat de la cellule, induisant ainsi une inflamrnatiori tissulaire

localisée (30).

En 1972, Kerr et al. publièrent un nouveau type de mort cellulaire qu'ils ont

nommé apoptose, terme désignant, en Grec, la chute des feuilles à l'automne (31).

L'apoptose ou mort cellulaire programmée, est un phénomène hautement régulé de

suicide cellulaire. Son rôle dans l'homéostatie est axé principalement sur l'élimination

des cellules qui ont été produites en excès (ou accumulées), qui se sont mal développées

ou qui ont subi des dommages génétiques lors de leur développement (30).

Une cellule qui entre en apopiose subit des changements morphologiques

caractéristiques. Elle se rétrécit légèrement et démontre subséquemment une chromatine

dense, le noyau se fragmente, le cytoplasme bourgeonne et, finalement, la cellule se

subdivise en petits morceaux que l'on appelle des corps apoptotiques. Ces corps

apoptotiques seront alors phagocytés, évitant ainsi que le contenu cellulaire ne soit

déversé dans l'environnement (28). De ce fait, l'apoptose est un processus n'induisant

pas d'inflammation.

L'apoptose affecte les cellules de façon individuelle et précise, et ce sans atteindre

les cellules saines. À l'opposé, la nécrose est beaucoup moins singularisée et est piutôt un

événement de masse. L'apoptose est en quelque sorte l'étape finale dans le

renouvellement des populations de celiules. Dans la majorité des cas, une cellule naît

d'une division cellulaire, se différencie et finalement meurt par apoptose.

Des évidences récentes suggèrent qu'une altération de l'apoptose normale de

différents types cellulaires est la cause d'une panoplie de pathologies et de dérèglements

physiologiques. Par exemple, une suactivation de l'apoptose serait impliquée dans des

maladies neuro-dégénératives, comme la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer, alors

qu'une apoptose inhibée serait à la base de certains cancers et de maladies auto-immune

(voir tableau 1.1) (32).

Tableau 1.1 Maladies associées à un dérèglement du processus apoptotique.

Catégories Exemples APptose

Suractivée Inhibée

Maladies neuro- Alzheimer + Dégénératives Parkinson + Désordres Maladies auto- + Immunitaires immunes

SIDA + Diabète + Thyroïdi te +

Ischémie Infarctus du myocarde + Reperfusion ACV + Néoplasies Lymphomes +

Astrocytomes + Hépatomes + Mélanomes + Autres +

Divers Vieillissement

Alopécie

L'apoptose peut être activée chez les cellules de mammiferes par une multitude de

facteurs intrinsèques et extrinsèques ailant des radiations ionisantes aux rayons

ultraviolets, aux infections virales en passant par les cytokines, l'expression d'une vaste

gamme de gènes faisant partie de la famiHe du Bcl-2 et le contact cellule/cellule via les

systèmes ligands-récepteurs (comme par exemple celui du Fas/FasL) (30).

Au niveau immunitaire, I'apoptose des cellules est généralement initiée par des

systèmes de ligands-récepteurs. En effet, c'est un contact cellule/cellule via certains

récepteurs et leurs ligands physiologiques qui contrôle en bonne partie le déclenchement

de cette mort cellulaire. L'implication d'une multitude de gènes est également

déterminante dans l'initiation et la régulation du phénomène de mort cellulaire

programmée. De plus, l'environnement dans tequel résident les cellules est aussi un

facteur ayant beaucoup d'influence.

A. Le Fas : récerxeur cellulaire de I'awotose

Le plus documenté des récepteurs cellulaires associés à I'apoptose est sans

contredit le Fas (aussi connu sous le nom de CD95 ou de APO-1). Le Fas fait partie de la

famille de récepteurs du TNF. Chez l'humain, ce récepteur est constitué de 325 acides

aminés (45 KDa) et est classé parmi les prothes membranaires de type 1 (33). 1 est

présent chez une variété de tissus du corps humain, comme le thymus, le foie, les

poumons, les reins, les ovaires, etc. Certaines cellules, comme les lymphocytes T

matures, expriment de façon constitutive le Fas (33). L'activation de ces cellules par un

antigène a pour effet d'augmenter l'expression de ce récepteur à leur surface. Ainsi, les

lymphocytes T sont généraiement plus sensibles B I'apoptose via le sentier Fas/FasL (34).

Le ligand physiologique du Fas, le Fas ligand (FasL), est également une mdécule

faisant partie de la famille du TNF. La ligation du FasL au Fas induit normalement

I'apoptose. Dans des conditions nonnales, il y a seulement un nombre très réduit de

cellules qui expriment le FasL et l'expression de cette molécule de surface est faible (35).

Le FasL est exprimé principalement chez les cellules T activées (35). Le sentier Fas/FasL

est un mécanisme très utilisé par le système immunitaire afin de contrôler les populations

de lymphocytes T activés par des antigènes et ainsi de s'assurer qu'il n'y ait pas un

surplus de ces cellules stimuldes (35). De plus, ce système initiateur de l'apoptose est

employé pour éliminer les cellules infectées par des virus (35).

Une forme soluble du Fas peut être produite à partir de I'ARN, du Fas par

épissage alternatif. Le Fas soluble (Fe) est similaire au Fas cellulaire, exception faite

qu'il lui manque le domaine transmembranaire. Le Fas, a la propriété d'inhiber

l'initiation de l'apoptose par le sentier Fas/FasL. En effet, le Fas, se lie au FasL (molécule

limitée en nombre) présent à la surface des cellules, bloquant ainsi le site actif et

l'empêchant de livrer son message de suicide celIulaire (36).

B. Les gènes impliaués dans f'amotose

Les gènes influencent beaucoup le devenir cellulaire. Au niveau de l'apoptose, il

existe une balance entre l'expression de gènes anti-apoptiques et de gènes pro-

apoptotiques. La génétique de l'apoptose a été intensément étudiée grjse au modèle du

nématode Camohabditis elegans. L'avantage d'un tel modèle est que la séquence de

division et de mort cellulaire durant le développement est connue. En effet, suc 671

cellules formées au cours de son développement, il y a exactement 1 13 d'entre elles qui

meurent par apoptose et ce, il des temps précis (37). Trois gènes régulent cette mort

programmée, soient ced-3, ced-4 et ced-9. Les gènes ced-3 et ced-4 sont essentiels pour

la mort cellulaire programmée durant le développement des nématodes tandis que ced-9

peut prévenir leurs actions (37).

Chez les cellules de mammifères, les gènes régulant l'apoptose font partie de la

famille Bcl-2. À ce jour, pas moins de 15 protéines de cette famille ont été identifiées et

cela sans compter les protéines virales apparentées (38). Les membres de la famille Bc1-2

sont localisés dans la membrane externe des mitochondries. Ils peuvent se pairer les uns

aux autres dans des combinaisons variées. Par exemple, il est possible de retrouver un

homodymère Bcl-2:Bcl-2 ou un hétérodymères Bci-2:Bax. Ces dimères forment des

canaux ioniques dans la membrane mitochondnale et contrôlent ainsi le transfert d'ions

entre le cytoplasme et la mitochondrie (particulièrement le cytochrome c) (39). Depuis

quelques années, la régulation mitochondriale a pris une place considérable dans l'étude

et la description de la mort cellulaire programmée. Elle semble être impliquée dans deux

phases distinctes de I'apoptose, soient la phase de contrôle et la phase effectrice (39).

B. 1 Les produits de gènes pro-apoptotiques

B.l.l Bax et Bad

Bax et Bad sont les deux protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 les plus

documentées. Une surexpression de ces gènes cause l'apoptose rapide des cellules (38).

B.2 Les uroduits de gènes anti-aw~totiaues

Le gène bcI-2 est le premier gène de la famille à avoir dté découvert (40). Le

produit du gène bcl-2 (la protéine Bcl-2) est un homologue structural et fonctionnel du

gène c d 9 (chez le nématode). il est situé sur un site de translocation entre les

chromosomes 14 et 18. Le gène bel-2 est reconnu pour permettre aux lymphocytes

quiescents (mémoire) de survivre sur une longue période de temps (40). De plus, une

surexpression de ce gène prévient l'initiation de I'apoptose chez la cellule en réponse à

une vaste gamme de stimulations. Ainsi, une grande quantité de la protéine Bcl-2 chez la

cellule protège celle-ci de I'apoptose induite par les rayons uliraviolets, la privation de

cytokines, certains conicostéroïdes, etc. (41). De plus, une concentration élevée de cette

protéine est reconnue pour protéger la cellule de la mort cellulaire programmée induite

par le Fas chez de nombreux types cellulaires dont les lymphocytes T (42).

La protéine Bcl-xL est issue du gène Bcl-x. Ce peptide est composé de 233 acides

aminés. Tout comme le Bcl-2, la protéine Bcl-xL est reconnue pour augmenter la

résistance cellulaire au processus apoptotique. La différence enue les deux protéines est

que le Bcl-2 est présent davantage chez les ceiiules T naïves (constitutif), alors que le

Bcl-xL est surtout pksent chez Les ceiiules T activées (inductible) (43). Il a été demontré,

chez des cellules MCF7 (cellules épithéliales tumorales) exprimant le Fas, qu'une

surexpression de Bcl-xL rend ces cellules résistantes ii l'apoptose induite par le Fas (44).

C. Les enzymes impliquées dans l'am~tose

La vaste gamme de signaux initiateurs (intra et extracellulaires) de l'apoptose

chez Ies cellules de mammifères convergent inévitablement vers un effecteur commun,

les caspases. La compréhension de la phase exécutrice de L'apoptose a débutée lorsque

ced-3 a été démontré comme faisant partie d'une nouvelle famille de protéases

(maintenant appelées caspases) (45). et où l'activation séquentielle et le clivage de

protéines cibles, en aval de la régulation par les gènes de la famille Bd-2, mène à la mort

de la cellule par apoptose (45). Les caspases sont des cystéines protdases de la famille de

l'interleukine-1 converting entyme (ICE) et sont très conservées chez les cellules de

mammiferes (46). ElIes clivent leurs substrais protéiques (en général une autre caspase) à

des sites contenant un résidu aspartate, activant ainsi une nouvelle caspase (45). Ceci

initie une cascade protéolytique létale menant à l'exécution de l'apoptose. Ainsi, les

caspases activées clivent les autres caspases subséquentes en des formes matures et

actives d'enzymes. Une fois que la cascade des caspases est activée, les changements

morphoIogiques cellulaires de'butent et i'apoptose devient à ce moment un processus

irréversible (45). Notons que leurs actions dans l'apoptose sont universelles (ex : la

caspase 3 est retrouvée dans tous les modèles d'apoptose chez les cellules de

mammiferes) (47). Jusqu'à maintenant, douze caspases sont connues chez les cellules de

rnammiferes (45).

D. La framentation de l'ADN

L'apoptose en phase finale se caractérise par la fragmentation de l'ADN

génomique en morceaux de 180 paires de bases (48). Dès les premiers stades du

processus, une endonucléas endogène ca2+ et M~'' ddpndante s'active et coupe l'ADN

entre Les nuciéosomes (situes à tous les 180-200 paires des bases dans le génome) (48).

Ces fragments sont en fait des complexes ADN-octamères d'histone. Cette segmentation

de l'ADN est à la base de plusieurs tests de détection de l'apoptose. En effet, la

dégradation de l'ADN peut être ditectée par electrophorèse sur gel d'agame (49). De

plus, cette fragmentation d'ADN peut être détectée in situ dans la cellule (en

microscopie) par le test de TUNEL (Terminal Uridinie Nick End Lubelling), méthode qui

a été mise au point par Graviel et al. en 1992 (50).

1.5 Sommaire

L'apoptose est donc un phénoméne hautement régule tant au niveau de son

initiation (FasEasL) que de son contrôle ginétique (Bcl-2. Bçl-xL, Bax ...) et de son

éxécution (cascade des caspases, Eragmentation de l'ADN.. .). Nous proposons d'étudier

l'apoptose des lymphocytes T pulmonaires dans le contexte de 1'AAE et de caractériser

ce phénomène.

Tel que mentionné précédemment, I'AAE est une maladie inflammatoire

caractérisée par une lymphocytose pulmonaire persistante. Deux mécanismes pouvant

expliquer la lymphocytose alvéolaire ont été avancés et étuàiés. Nous proposons

d'étudier une troisième possibilité, celle-là hypothétique, selon laquelle les lymphocytes

T pulmonaires de I'AAE auraient une apoptose diminuée. Ceci pourrait expliquer leur

persistance et leur accumulation dans le poumon. L'évaluation de certains paramètres de

I'apoptose (Fas, FasL, Fas,, Bcl-2 et Bcl-xL) font également partie de cette étude de

quantification et de caractérisation des mécanismes. Les données obtenues pour les

patients atteints d 'AM seront comparées avec celles obtenues chez des volontaires sains

(sans contact avec des antigènes causant I'AAE). Le chapitre 3 est voué à la résolution de

cette première hypothèse et présente l'article : Apoptosis of bronchoalveolar lavage

lymphocytes in hypersensitivity pneumoniris.

Dans un deuxième temps, le travail est axé davantage sur la mécanistique de

l'apoptose des lymphocytes dans I'AAE. Plus précisément, les lymphocytes T

pulmonaires des deux groupes de sujets à l'étude seront comparés dans un système de

culture cellulaire. L'effet de la stimulation avec l'IL-2 et avec I'anti-Fas (jouant le rôle de

FasL) sur I'apoptose de ces cellules sera évalué. L'hypothèse est que l'IL-2, diminue

l'apoptose des lymphocytes de I'AAE en culture et que l'anti-Fas fait augmenter cette

apoptose (comparativement dans les deux cas aux lymphocytes non stimulés). Le chapiue

4 intitulé : Augmentation et mécanismes de I'apoptose in vitro des lymphocytes T du

lavage broncho-alvéolaire de I'alvéolite allergique exinns2que » est consacré à

l'évaluation de cette deuxième hypothèse.

CHAPITRE 3

APOPTOSIS OF BRONCHOALVEOLAR LAVAGE LYMPHOCYTES IN

HYPERSENSITMTY PNEWMONITIS.

Article soumis pour publication dans : Am J Respir Ce11 Mol Biol.

3.1 Résumé

L'alvéolite allergique extrinsèque (AAE) est une maladie pulmonaire caractérisde par

l'accumulation d'une grande quantité & lymphocytes dans le poumon. Cette étude a été

faite dans le but d'évaluer le rôle potentiel de l'apoptose (mort cellulaire programmée)

des lymphocytes broncho-alv6olaires dans cette pathologie. Deux groupes de sujets ont

été étudiés: patients AAE et normaux sans contact. Le pourcentage des lymphocytes

apoptotiques était plus faible chez les patients de AAE que chez les sujets N (37.4%

contre 56.5% pour le test Annexine/iodure de propidium (p=û,004) et 0,4% contre 1.0%

pour les analyses de TUNEL (pû.033). La proportion de lymphocytes positifs pour Fas

était 42% plus élevée chez les sujets AAE que chez les sujets normaux (71.7% contre

50.4%). Cependant, aucune différence significative n'a été trouvée pour la proportion de

lymphocytes positifs pour le FasL. Les niveaux de Fas soIuble dans le liquide du lavage

bronchoalvéolaire ( D A ) des patients AAE et des sujets normaux étaient de 80,s pg/rnl et

de 23.2 pg/rnl respectivement (p=0,0001). Une condlation positive a été trouv6e entre le

pourcentage de lymphocytes et la concentration de Fas dans le LBA. La concentration

intracellulaire de Bcl-xL (prot6ine anti-apoptotique) était augmentée de 2,6 fois chez les

lymphocytes pulmonaires des patients AAE comparativement aux normaux. Aucune

différence significative n'a été trouv6e concernant le pourcentage des lymphocytes du

LBA positifs pour le Bci-2 (protéine anti-apoptotique constitutive). En conclusion,

I'apoptose des lymphocytes pulmonaires est diminuée chez les sujets AAE

comparativement aux sujets normaux. Cette diminution d'apoptose peut s'expliquer, du

moins en partie, par une augmentation du Fass et par l'augmentation de la protéine h l -

xL.

APOPTOSIS OF BRONCHOALVEOLAR LAVAGE LYMPHOCYTES IN

HYPERSENSUMTY PNEUMOMTIS.

Christian Laflamme, Evelyne Israël-Assayag and Yvon Cormier.

Unité de recherche, Centre de Pneumologie, Hôpital Laval, institut de cardiologie et de

pneumologie de l'université Lavai.

Running title : Apoptosis of BAL Lymphocytes in Hypersensitivity Pneumonitis.

Keyword: h g , inflammation, apoptosis.

Please send correspondence to:

Dr. Yvon Cormier, Hôpital Laval

2725, Chemin Ste-Foy

S te-Fo y, Québec, Canada, G 1V 4G5

Tel: 4 18-656-4747

FAX: 4 18-656-4762

E-mail: yvon.cormier8med.ulaval.ca

3.2 Abstract

Hypersensitivity pneumonitis (HP) is a pulmonary disease characterized by the

accumulation of large quantities of lymphocytes in the lung. This snidy was done to

evaluate a possible role of apoptosis (programmed ce11 death) of bronchoalveolar lavage

(BAL) Iymphocytes in HP. Two groups were studied: HP patients and nomal 0

unexposed controls. The percentage of apoptotic lymphocytes was signiflcantly lower in

HP patients than in N subjects (37.4% vs 56.5% for AnnexinJpropidium iodine test

(p=0,0041 and 0.4% vs 1 .O% for the TUNEL assays @=0,033). The proportion of BAL

lymphocytes positive for Fas was 42% higher in HP than in N (71.7% vs 50.4%).

However, no significant difference was found for the proportion of BAL lymphocytes

positive for FasL between the two groups of subjects. Soluble Fas (Jas) levels in the

BAL fluid of the HP patients and N subjects were: 80.5 p g h i and 23.2 p g h i

respectively @=û,0001). A positive correlation was found between the percentage of

BAL lymphocytes and the concentration of ,Fa. The intracellular quantity of the

inductible anti-apoptotic gene Bcl-xL product was increased 2.6 times in the pulmonary

Iymphocytes of HP patients compared to N. No difference was found for the percentage

of BAL tyrnphocytes positive for %cl-2 (constitutive anti-apoptotic protein). In

conclusion, the apoptosis of pulmonary lymphocytes is lower in HP than in N subjects.

This lower apoptosis can be explained, at least in part, by an increase of ,Fa5 and by the

intracelIular increase of the Bcl-xL protein.

3.3 Introduction

Although the lung is contiauously exposed to antigens, sometirnes to massive

loads, local immune responses are under tight regdations and usualiy prevent

inflammation and tissue damage. Hypersensitivity pneumonitis (HP), an antigen-induced

inflammatory lung disease, represents a clinical situation where the immune regulation is

overcome, leading to the accumulation of large numbers of lymphocytes in the lung (1).

There are three possible mechanisms, not mutually exclusive, by whicb lymphocytes can

accumulate in the lung in HP: 1) increased recruitment (2), 2) local proliferation (3,4),

and 3) increased survival (decreased apoptosis). This study addresses the issue of

lymphocyte removal by apoptosis in HP.

During an immune response against foreign antigens, cional expansion of

immunocompetent cells is necessary to mount an effective protection. These cells must

eventually die off in order to maintain tissue homeostasis (5). Regulation of ce11 survival

is therefore crucial to lirnit the accumulation of potentially harmful cells in the lung.

Apoptosis is a physiological, genetically controlled, cellular response to externd and

interna1 stimuli whose purpose is to eliminate unwanted cells while preventing damage to

surrounding celIs or tissue (6). Regulation of apoptosis is achieved by several gene

products as well as by exulnsic factors. Apoptosis is often associated with the cross-

linking between Fas antigen (Fas or CD95) and its physiologie ligand (FasL or CD95L)

through cell-ce11 interactions (7). These interactions are often implicated in the regulation

of inflamrnatory ce11 death, particularly the lymphocytes (8). This pathway can be

inhibited by the soluble fonn of Fas molecule (3s) (9).

The Bcl-2 gene family regulates the apoptotic process through the balance of pro-

apoptotic (Bax, Bcl-xS) and anti-apoptotic products (Bcl-2, Bcl-xL) (10). Several

cytokines can also affect apoptosis. For example, interleukin-2 (IL-2) c m inhibit

inflarnrnatory ce11 apoptosis (1 1). IL-2 is increased in the BAL fluid of HP patients and

could therefore contribute to decrease lymphocyte apoptosis (12).

Another mechanism implied in lymphocytes swvivai of the lymphocytes is the

B7-CD28 costimulation pathway- CD28, a molecule camied by the lymphocytes, is a

ligand for B7-1 and B7-2 receptors on antigen presenting ce11 (APCs) like the alveolar

macrophage (13). CD28 stimulation increases the expression of Bcl-xL and IL-2

production by lymphocytes (14). We recently showed that aiveolar macrophages of

patients with active HP have an up-regulated expression of B7 molecules (15). Moreover.

in an animal mode1 of HP, a treatment with the fusion protein CTLA4-Ig, a high affinity

ligand for the 87 receptor without the effect of costimulation, decreases pulmonary

lymphocytosis in mice exposed to the HP antigen (16). Thus, B7-CD28 costimulation

pathway could contribute to lymphocytes accumulation in HP by an up-regdation of

certain lymphocyte specific anti-apoptotic factors.

Pulmonary lymphocytes are not oniy increased in HP but are also highly activated

and reside in a milieu containing high levels of anti-apoptotic cytokines. We hypothesize

therefore that lymphocyte accumulation could result from decreased apoptosis. The

present study was done to quantify the apoptosis of lung lymphocytes recovered from

BAL of normal subjects and from HP patients and characterize this process.

3.4 Materials and Methods

Subjects. Thirty nine patients with non treated HP and 40 non-smoking normal 0

subjects (not exposed to HP antigens) were studied. The diagnosis of HP was based on

previously published criteria which include exposure to an appropriate environment, the

presence of inspiratory crackles on physical examination, intestitial infiltration on chest

X rays, dtered lung functions, and an abnomai number of lymphocytes in

bronchoalveolar lavage (BAL) (>3O % lymphocytes) (1). BAL was done in al1 patients

as part of their clinical diagnostic evaiuation. Our Institution's Ethics Committee

approved the snidy and al1 subjects signed an infonned consent form.

BAL. BAL was obtained by standard bronchoscopy. For the patients, a total of 300 ml of

sterile 0.9% saline solution (warmed at 37°C) was instilled in the middle lobe or the

lingula in 50 mi aliquot with a fiberoptic bronchoscope. Since normal subjects have fewer

BAL lymphocytes, they had a double lavage (240 mI in right middle lobe and 240 ml in

the lingula). Each instilled aliquot was aspirated and the recovered volume determined.

BAL cells were washed with HBSS solution, resuspended in RPMI 1640 medium

(Canadian Life Techndogy, Burlington, Ont.) supplemented with 10% fatal bovine

serum (FM) and 1% penicillin-streptavidin, and counted with a hemacytometer. Ce11

viability was done using trypan blue exclusion dye. BAL cells viability ranged between

90% to 99% (average of 97.2%). Differentiai counts for the different inflarnmatory cells

(lymphocytes, macrophages, neutrophils and eosinophils) was perfonned using a glass

cover technique (17) stained with Diff-Quik (Baxter Diagnostics, Mississauga, Ont). The

isolation of BAL Iymphocytes was done using the standard method of nylon-wwl

column (18). Using this technique, an average of 92 % pure lymphocytes was recovered

(range between 85 % to 95 '$6).

Annexin Vfpropidium iodine (PI) assays. The BAL cells were stained using Apoptosis

Detection kit ( M D System, Minneapolis, Min) according to the manufacturer instruction

with minor modifications. Briefly, celis were washed in phosphate buffered saline (PBS)

(pH 7.4) and suspended at a concentration of 106 cellslml. One hundred microliters of

suspension (10' cells) were added to a 5-ml cytometry tube with 2 pl of fluorescein-

conjugated annexin V and 2 pl of propidium iodine (PI). The mixture was gently

vortexed and incubated for 15 minute at room temperature. At the end of the incubation,

300 pl of binding buffer (IOmM HEPESNaOH (pH 7.4) + 140rnM NaCl + 2.5mM

CaC1,) were added to stop the reaction. Cytometry anaiysis of the cells was done

immediately using an EPICS" ELïTE ESP flow cytometer (Beckman-coulter. Miami,

FL). The appropriate controls were done. Cells that were annexin positive and PI

negative were counted as apoptotic.

Analysis of in situ DNA fragmentation. Paraformaldehyde-fixed air-dned cytospin

preparations were stained by the terminal deoxinucleotidyl transferase (TdT)-mediated

dUTP nick end labeling technique (TUNEL). For the assay, the cytospin preparation was

fixed 30 min in fresh solution of 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.4). The slides were

then washed twice with PBS and incubated in a permeabilisation solution (0.1% Triton

X- LOO in O. 1% sodium citrate) for 2 min on ice (4°C). After another lavage with PBS, the

area around the sample was dried and a drop of 20 pl of enzyme solution (0.3 U rTdT

(Canadian Life Technologies), 5x10''~ M biotin-16-dUTP (Roche Diagnostics Canada,

Laval, Que.), 0.1 M potassium cacodylate (pH 7.2), 2x10" M C0Cl2, 2x10' M DTT) was

added and a cover slip was placed on the sample. The preparation was incubated for 60

min at 37°C in a humidified chamber. After three lavages in PBS, 13.5 nM of conjugated

fluorescent dye sueptavidine-Aiexa 4 8 P (Molecular probes, Eugene, OR) was added in

a drop of 20 pl and kept in the dark for 20 min at 4°C. ProlongTM Antifade kit (Molecular

probes, Eugene, OR) was used (according to the manufacturer protocol) to mount the

slides and to avoid fluorescence quenching. For negative control, rTdT was replaced with

enzyme buffer and, for positive control, a pre-incubation with 5 U of Dnase 1 (Arnersham

Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) was done immediately before the incubation with

enzyme solution. The count was done using a epifluorescence microscope (Nikkon

Eclipse 6600) with the appropriate filter (Nikkon filter B2-A, ex: 450490, em: 505). A

minimum of 300 cells was count for each siide. Two criteria were used to qualify a

positive ce11 : bright green fluorescence on nuclei and morphologic feature of a ce11 in

apoptosis.

Antibodies. Bcl-21100 (mouse IgGi anti-human Bcl-2-FiTC), Dx2 (mouse IgGl, anti-

human CD95-PE (Fas)), NOK-1 (mouse IgGi ami-human CD95L-PE (FasL)), 2H12

(mouse anti-human Bcl-xL), HIT3a (mouse IgG1 anti-human CD3-PerCP) and the

isotype control (mouse IgGi-FFTC, mouse IgGI-PE and mouse IgGi-PerCP) were

purchased from Phanningen (San Diego, CA).

Flow cytometry for Fas, FasL and Bcl-2. 2.0~106 BAL ccils were resuspended in 200

pl of PBS + bovine serum aibumin @SA) 1%. A batch of cells (5xld ceW50 ~ 1 ) was

labelle with 2 pl of anti-CD3 or 2 pl of isotype control and put on ice (4'C) for 45 min.

The same protocol was used to label a sample of the ceUs 1.0~106 with anti-CD95 (2 VI)

and mti-CD95L (2 pl) and spccific isotype conmls. The remaining celis (5xld a U in

50 pl) were permeabilized using a commercial kit (Perm Kit, Pharmingen) M o r e the

incubation with anti-Bcl-2 antibodies and its specific isotype control (2 pl of the

antibodies, 45 min on ice).

Evaluation of ,Fas in BAL fiuid. The quantification of the soluble form of Fas in BAL

fluids was done by a sandwich type ELISA using OptElA Human Fas kit (Pharmingen)

according to the protocol provided by the manufacturer.

Preparation of the samples for Western hl& 1x10~ BAL Lymphocytes purified on

nylon-wooi columns were resuspended in 20 pl of lysis buffer (10mM Tris-HCl (pH 7.4).

150rnM NaCI, 2mM EDTA, 2% viton X-100, 1% of mixture of protease inhibitor (2 mM

EDTA, 2 mM PMSF, Ip@d of aprotinin, lpglml of leupeptine, aü from Sigma)) and

?Op1 of 2x loading buffer (200 rnM Tris HC1 (pH 6.8), 20% glycerol, 2% SDS, 0.00058

bromophenol blue, 10% Zmercapto-ethanol). The mixture was denatured by a passage at

IO0 O C during 5 min and then centrifuged at 10 OOOg for 1 min in order to precipitate

phospholipids present in tbe samples. The supernatant (40~1) was fiozen at -70°C until

used.

Western blot for Bcl-XI,. The samples (106 purified BAL lymphocytes) were sepmied

on a 12 % polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and transferred on a polyvinylidene

difluonde (PVDF) membrane. The blot was blocked for 1 h at m m temperature with

blocking buffer (5% nonfat dry milk, 0.05% tween 20 in tris buffered saline (TBS)) and

probed for 1 h with a monoctonal antibody to Bc1-xi. used at a dilution ot' 1: 1000 in the

blocking buffer. The secondary probe (l:lûûû, in blocking buffer) with a goat IgG anti-

mouse IgG HRPO (Cedariane, Ont) was detected by cherniluminescence using ECL

(Arnersham). BAL alveolar macrophages were used as positive control. The

densitornetric anaiysis was performed using Scion image (beta 3b,

htt~:llwww.scioncom.corn~.

Sîatistical analysis. Results were expressed as mean value f SEM. Al1 data were

analyzed using t-test except for Fig. 4A and 4B where a Spearman rank correlation test

was used and for Fig. 6B where a Mann-Whitney U test was applied. Ail reported P-

value were declareci significant atp < 0.05.

3.5 Results

BAL characteristics of HP patients and normal subjects.

A total of 39 HP patients and 40 normai subjects tmk part in the snidy (table 1).

There was no difference between the proportion of men and women in the two groups of

subjects. However. the average age of the HP subjects was higher than that of the normal

subjects. The percentage and number of the various BAL cells for each group of subjects

was similas to that previously published (15) (table 1).

BAL lymphocytes apoptosis.

The BAL lymphocytes of HP subjects were less Annexin+/PI- than those of

normal subjects (37.4% I 3.4 (n=lS) vs 56.5% I 5.5 (n=15) respectively, p d . 0 0 4 , Fig.

IA). To confirm this result, cytospins of BAL cdls were tested by TUNEL in a subgroup

of our subjects. This technique allows the quantification of cells in their final phase of

apoptosis, at the stage where the genomic DNA breaks-up ( 19). Fewer BAL lymphocytes

of HP patients were TUNEL positive than those from hedthy subjects (0.4% 2 0.1

(n=9)vs 1 .O% I: 0.2 (n=7), p=0.033, Fig 1 B).

No correlation was found between the nurnber of apoptotic lung Iymphocyte

(tested with AnnexidPI and TUNEL wsay) and the age of the subject in the study

(patient and control) (Fig 1C).

F m receptor.

As shown in the Fig.2A, the percentage of positive lymphocytes for Fas was

approximately 50% higher in HP patients han in normai subjects (68.8 î 5.4 (n=18) and

46.7% r 9.0 (n=9) respectively, pd.004).

The proportion of positive lymphocytes for FasL was also determined. As show

in the Fig. 2B, no signifiant difference was found in the proportion of BAL lymphocytes

positive for FasL (84.9 î 5.7 (n=12) and 95.6 î 3.2 (n=6), @,23) respectively for HP

patients and normal subjects.

SolrtbIe Fus.

The quantity of sFas present in the BAL fluid was higher by more than 3-folds in

HP patients cornpared to the normals (80.5 pghl I 8.5 (n=23) vs 23.2 pglrnl I 3.1

(n=14), p=0.0001, Fig 3). A positive correlation was obse~ed between the percentage of

BAL 1 ymp hoc ytes and the concentration of $as in the BAL fluid (R' = 0.38, p=0.000 1,

Fig 4A). A negative correlation (R' = 0.24, p=0.0058, Fig 4B) was found between the

percentage of lymphocytes and the percentage of the cells in apoptosis (AnnexinPI test).

However no correlation (data not show) was found between the concentration of ,Fas and

the percentage of cells in apoptosis (AnnexinPI test).

Bcl-2 prorein and intracellular concentration of Bcl-xl in BAL lymphocytes.

In order to further explain the reduction in the apoptosis of pulmonary

lymphocytes within the framework of HP, the proportion of BAL positive lymphocytes

for the anti-apoptotic protein Bcl-2 was obtained by flow cytometry and the expression of

Bcl-xL, another anti-apoptotic protein, was quantified by Western blot.

No significant difference was found in the proportion of positive lymphocytes for

Bcl-2 protein (74,4.% I: 7.71 (n=6) vs 93.1% * 2,8 (n=5), p=0.066, Fig. 5). However, the

intracellular level of Bcl-xL (Fig. 6A,B) was increased by more than 2.5 times in the

BAL lymphocytes of HP compared to N (9.9 t 3.3 (n=6) vs 3.8 * 1.9 (n=7), pd.03, Fig.

6B). Fig 6A show representative results on western blot.

3.6 Discussion

This study shows, by two different techniques, that the apoptosis of BAL

lymphocytes is decreased in HP comparai to BAL lymphocytes of normal subjects. The

persistent lymphocytosis characteristic of HP could therefore be explained, at Ieast partly,

by a reduction in the apoptosis of the pulmonary lymphocytes.

As mentioned in the introduction, there are tfuee mechanisms likely to influence

lymphocyte persistence in HP: Iwal proliferation, an increase in cellular recniitment, and

a reduction in the apoptosis of the pulmonary infiammatory cells. Previous reports

demonstrated an increased recruitment of the lymphocytes in HP. The mRNA of

RANTES (2)- MIP-1-alpha (2) and IL-8 (20) are upregulated in the BAL lung cells of HP

patient, t h e potent chemokine for the recruitment of lymphocytes. In contmt to

alveolar macrophages and surfactant of normal subjects, alveolar macrophages and

surfactant of HP patients do not inhibit the activation of pulmonary T-cells (3),

suggesting that these ceIls are more proliferative in HP. Moreover, BAL lymphocytes of

HP patients express more markers of activation like the p75 chah (receptor associated

with IL-21, the VLA-1 and the HLA-Dr antigen, an index of the state of activation and

proliferatian of lymphocytes (4). The results of the current study add another potential

mechanism to explain the alveolar accumulation of lymphocytes in HP. Our results

cannot quantify the relative importance of apoptosis in the maintenance of pulmonary

inflammation in HP but suggest it could be a signif~cant one. Although al1 tests were not

done on the BAL ceIls of al1 subjects of each groups, the marked differences between the

groups is clearly shown by the studies performed.

The presence of fewer apoptotic cells for lymphocytes of which there is an

increase in the number that are Fas positive at Fust seems contradictory. However, this

resuit is in agreement with the data of Agosrini and al. (21) who showed that the Fas is

expressed at a lower level on the surface of pulmonary lymphocytes of normal subjects

compared to those from infiammatory alveolar diseases like HP and sarcoidosis.

However, this result seems to be paradoxal since, as shown in the figure 1 (A and B),

BAL lymphocytes of HP patients were less apoptotic than the BAL lymphocytes of

normal subjects, the opposite of what would be expected in the presence of more Fas.

The anticipated higher percentage of apoptosis assosiated with Fas expression

was probably overcompensated by the increased concentration of the soluble Fas and by

the increased intracellular Bcl-xL. The ligation of FasFasL is a c e k e l l interaction often

implicated in the initiation of apoptosis. $as binds to FasL therefore limiting the number

of this pro-apoptotic receptor on activated lymphocytes (22). An increase of ,Fis

molecules was expected in the presence of a higher nurnber of BAL lymphocytes since

these cells are major producers of this molecule. An increase of 3 a s is an inflammatory

mechanism by which the immune system cm prolong the viability of lung lymphocytes;

this is what seems to happen in HP. This affirmation is support by a positive corelation

seen between the percentage of BAL lymphocytes and the concentration of ,Fa in the

BAL fluid (Fig. 4A).

We cannot elirninate the possibility of a failure in the initiation of the apoptosis by

the FasFasL. Other studies are necessq to verify if the Fas/FasL pathway is

dysfunctionai by other mechanisms. For example, an overproduction of the Bcl-2 protein

in lymphocytes in culture (of Jurkat type) inhibits the Fas-induced apoptosis (23). Also an

overproduction of Bcl-xL in MCF7 cells (thurnorai epitheliai cells) expressing Fas,

makes these cells resistant to Fas induced apoptosis (24).

Although we can confirm that puimonary lymphocytes in HP express more Bcl-

xL than normal ones, we do not know if the intracellular level of Bcl-2 is increased. Since

our results only indicate a percentage of positive lymphocytes, we canot say if the

intracellular levels of Bci-2 are increased in the BAL lymphocytes of HP patients. A

positive ce11 cm contain an unknown quantity of Bcl-2 (limit of detection of the test to a

maximum concentration). Western blot technique will be needed to further evaluate the

real implication of the Bcl-2 protein in the reduction of apoptosis in HP.

The increase in the intracellular levels of Bcl-xL of the BAL lymphocytes in HP

could be related to the increase in costimulation via the B7-CD28 pathway. Indeed. as

previously mentioned, this pathway is unregulated in HP. An increase in costimulation

B7-CD28 is known to increase resisrance of lymphocyte apoptosis, this via the

intracellular increase of the Bcl-xL protein and by the increased in the expression of IL-2,

a survival factor for these cells (14).

An interesting question raised by the results obtained in this study is whether the

reduction in the apoptosis of the BAL lymphocytes in HP is due to an intrinsic

modulation of the cells themselves andor to the pulmonary microenvironment from

where they were collected. It is possible that other anti-apoptotic factors, other than Bcl-

xL and ,Fa, present in the pulmonary environment, could participate to decreased

lymphocytes apoptosis. For example, it is known that IL-2 is an anti-apoptotic factor for

lymphocytes and that the concentration of this cytokine is increased in the BAL fluid of

HP patients (12). Moreover, the HP pdmonary lymphocytes proliferate in a dose-

dependent fashion during stimulation with IL-2 (12). Thus, this result suggests that IL-2

plays a role in HP by producing a stimulus for the accumulation of lymphocytes and iheir

persistence in the lung.

Further studies are needed to elucidate the mechanisms involved in the control of

lymphocyte survival in HP. The effect of the microenvironment would require in vitro

studies looking at the effect of anti-apoptotic cytokines on BAL lymphocytes. For

exarnple, purified BAL lymphocytes of HP patients and controls subjects could be

cultured with Fas agonist and IL-2 in order to evaluate these different stimulations on the

lymphocyte apoptosis in time. Our hypothesis is that in HP a Fas agonist stimulation

would have no effect on lymphocyte apoptosis while iL-2 would inhibit this p r o g r m e d

ceIl death. A better comprehension of these phenornena could be useful to understand

whether an intrinsic factor in the ce11 itself andlor the pulmonary microenvironment are

responsible for the conuol of lung inflarnmatory ce11 accumulation seen in HP or both

similar disease.

3.7 Conclusions

This study shows that a decrease in lymphocyte apoptosis may be involved in the

dveolar lymphocytosis seen in HP. Potential mechanisms for the increased survival of

these lymphocytes include high levels of Zas, enhanced Bcl-xL and the presence of anti-

apoptotic cytokines in the lungs.

We thank Dr Guy Tremblay and Dr Michel Laviolette for helpful discussion.

This work was support by the medical research council of Canada Grant (MT-15170) and

by the J. D. Bégin Foundarion.

3.9 References

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Table 3.1 BAL characteristics of HP patients and nomals subjects.

Subjects

HP

Normal

n

39

40

Sexe (M-F)

25-14

26-14

Average ags

48.85

25.75

% lymphocytes

56.58

9.89

Celldml (x103)

734.80

102.11

% macrophages

34.1 9

87.89

% neutrophils

7.1 1

1.65

Figure 3.1 The BAL lymphocytes of HP patients (n=18) were Less AnnMPI- (smailer

population in apoptosis) than those of N subjects (n=15, @.004) (A). The results

obtained with the TUNEL test. [n the final phase of apoptosis assessed by this method,

BAL lymphocytes in HP (n=7) have less positive nuclei for DNA fragmentation thm

those of the conuol subjects (n=9, pr0.033) (B). No correlation was found between the

age of the patient en the percentage of lymphocyte apoptosis (using annexin/PI assay)

(C).

Figure 3.2 Percentage of BAL lymphocytes positive for the surface receptors Fm (A) and

FasL (B). The proportion of positive Iymphocytes for Fas was approximately 50% higher

in HP (n=18) than in N (n=9, pd.001) (A). No signifiant difference was noted in the

percentage of positive lymphocytes for FmL between the two groups (n=12 for HP

patient and n=6 for control subject) (B).

0J HP Normal

n a 18 9 HP Normal

n r 12 6

Figure 3.3 Quantification of ,Fas in BAL. BAL fluid ,Fas level was much higher in HP

patient (n=23) than in N subjects (n=14, p=0.0001).

Figure 3.4 Correlation between BAL lymphoçytosis and the concentration of ,Fas in the

BAL fluid {A) and (B) the percentage of annexintP1 cells. A positive correlation exist

between the percentage of BAL lymphocytes and the concentration of ,Fa in the BAL

fluid (A) (R' = 0.38, @.0001). A negative correlation is observed between the

percentage of BAL lymphocytes and the proportion of apoptotic BAL lymphocytes (B)

(R' = 0.24, p=û.006) suggesting that $as have a significant role to play in the reduction

of BAL Iymphocyte ripoprosis in HP.

O 25 50 75 100125150175200225250 sFn BAL -1)

Figure 3.5 Proportion of BAL lymphocytes positive for Bcl-2. No significant difierence

was noted between the HP patients (n=6) and N subjects (n=S) for the percentage of

pulmonary lymphocytes positive for the Bcl-2 protein.

Figure 3.6 Quantification of the Bcl-xL protein in the BAL lymphocytes. The protein (A

representative result of Western blot are shown in A. for. The bands were then evaluated

by densiometry software (Scion hage)(B). A significantly higher concentration was

found in HP patients (n=6) than in N subjects (n=7, w.03).

4.1 Mise en situation

Dans le chapitre 3, il est démontré qu'une inhibition du processus ripoptotique

normal des lymphocytes est un des mécanismes impliqués dans l'accumulation des

lymphocytes dans 1'AA.E. En d'autres termes, le maintien de l'inflammation locale est

dû, en partie, à une mauvaise élimination des lymphocytes. Tel que vu dans le chapitre 3,

malgré une diminution de l'apoptose des lymphocytes dans L'AAE, ces cellules du LBA

de patients surexpriment le Fas. Cette surexpression devrait normalement s'associer à une

augmentation de l'apoptose des cellules en question. Ce paradoxe peut s'expliquer, en

partie, par une augmentation du Fas dans le liquide du LBA de ces patients. Le Fas,

inhibe la liaison FasIFasL, processus essentiel pour initier l'apoptose. ii est toutefois

posssible que le sentier FasIFasL soit disfonctionnel.

Ce chapitre est axé sur la clarification des mécanismes impliqués dans ce

dérèglement de I'apoptose dans I'AAE. L'objectif ultime est de déterminer si la

diminution de la mon cellulaire des lymphocytes obtenus du LBA dans I'AAE est due à

une défaillance intrinsèque des cellules elles-mêmes et/ou au micro-environnement

pulmonaire d'où elles proviennent (riche en facteurs anti-apoptotiques).

Une façon de tester cette hypothèse est de stimuler les lymphocytes du LBA avec

de l'IL-2 (facteur ami-apoptotique pour les lymphocytes T), de regarder l'apoptose dans

le temps et de comparer les données à des lymphocytes non stimulés du LBA de sujets

sains et de patients AAE. De la même façon, la fonctionnalité du sentier Fas/FasL sera

évaluée par une stimulation avec un anticorps anti-Fas (jouant le rôle du FasL) et

l'apoptose sera évaluée dans le temps avec les mêmes comparaisons que pour l'IL-2.

1.2 Matériel et méthodes

4.2.1 LBA

Voir chapitre 3 (section BAL dans « Materiais and Methods m).

4.2.2 Purification des lvm~hocvtes T sur colonne laine-nvlon et culture cellulaire

Les cellules totales du LBA ont été mises en culture dans du RPMI l m , 1 heure

à 37°C. 5% COz dans des plaques de culture 24 puits (Falcon) 5 une concentration de 106

macrophages/ml. Le but de cette étape était de faire adhérer les macrophages et ainsi de

récolter les cellules non adhérentes qui sont en majorité des lymphocytes. Ensuite, les

plaques ont été lavées trois fois avec le milieu de culture et les cellules non adhérentes

ont été passées dans une colonne laine-nylon. Après 1 hre incubation à 37°C les

colonnes ont été lavées avec 30 mi de RPMI, afin de recueillir les cellules non adhérentes

(lymphocytes T) de la colonne. Les lymphocytes T ainsi purifiés (pureté > 95%) ont été

ensuite incubés dans un système de culture cellulaire (toujours dans le RPMI 1640)

schématisé ici-bas, afin d'évaluer leur potentiel apoptotique en présence de différents

agents.

Lymphocytes seuls

Lymphocytes + L 2 * 1 Incubation O hre, 4 hres, 24 hres.

Lymphocytes + anti-Fas (2pg/mi)**

* La concentration optimale de stimulation était de lnglml.

** Concentration recommandé par le manufacturier (Phanningen).

Aux divers temps d'incubation, un échantillon cellulaire a été prélevé et les taux

d'apoptose ont été mesurés par deux tests : 1) TUNEL et 2) essai mesurant l'activité de la

caspase 3.

4.2.3 TUNEL

Voir chapitre 3 (section Analysis of in situ DNA fragmentation dans Materials and

Methods »).

4+2.4 Activité de la casDase 3

Un total de 2,5x1oS lymphocytes T purifiés a été resuspendu dans un tampon de

lyse à une concentration de 10x10~ ceiiuledd (25 pl). Le lysat a ensuite été déposé en

entier dans un des puits d'une plaque à 96 puits. Ensuite 200 pl de e p n HEPES IX a

été ajouté. Finalement, 5 pi de substrat de la caspase 3 a été ajoutés (Ac-DEVD-AMC).

Le contrôle suivant a éte effectué en duplicata : tampon HEPES (200 pi) + tampon lyse

(25 pi) + substrat de la caspase 3 (5 pi). On incube le tout 1 heure 37°C dans le noir.

Après l'incubation, la plaque a éti lue en fluoroscopie avec le filtre d'excitation 380 nM

et le filtre d'émission entre 420-460 nM. Les vdeurs obtenues ont été soustraites de la

valeur du puits contrôle.

Le test statistique de « student » a ét6 utilisé pour les figures 4.1 et 4.3. Dans le

cas de la figure 4.1, Le test est basé sur des données non-pairées (unpaired t-test) et pour

la figure 4.3, des analyses pairées et non-pairées ont été effectuées (paired t-test,

rrnpaired t-test). Les analyses ont été faite avec le logiciel Stat View 5.0.

Pour la figure 4.2, les courbes ont été comparées statistiquement par un test

d'mdyse de profil. Le test statistique a été effectué avec le logiciel SAS par le

biostatisticien de notre centre de recherche (Serge Sirnard). Toutes les données sont

présentées en moyenne h SEM.

4.3 Résultats

4.3.1 Quantification de l'amtose (test TUNEL) des lvm~hocytes T en culture non

stimulés.

Les lymphocytes T pulmonaires isolés des deux groupes de sujets à l'étude ont été

mis en culture sans stimülation. Les cellules ont été récoltées aux temps 0, 4 hres et 24

hres. L'apoptose a été quantifiee à ces différents temps par le test de TUNU.

Au temps 0, c'est-à-dire au moment où les cellules sont obtenues du LBA, ii y a

significativement moins de cellules ayant des noyaux TUNEL positifs chez les sujets

AAE que chez les N (voù figure 3.1 8). Cependant, lorsque les lymphocytes T de I'AAE

sont placés in vitro, en culture, on assiste à une apoptose massive de ces cellules. Comme

on peut le voir à la figure 4.1, après 4 hres de culture, il y a significativement plus

d'apoptose chez les lymphocytes T des sujets AAE que chez ceux des sujets contrôles

( 1 1'33% vs 4'38%' p=0,005). L'écart entre AAE et normaux augmente davantage après

24 hres de culture (4 1'17% vs 12.93%' p=0,004, fig.4.1).

4.3.2 Mesure de l'activité de la caspase 3 chez des ivm~hocvtes T ~ulmonaires cultivés

pendant 24 hres sans stimulation.

Les résultats démontrés à la figure 4.1 ont été confirmés par la mesure de

l'activité de la caspase 3 chez ces mêmes lymphocytes. En effet, une tendance

intéressante @=0,09 avec le test d'analyse de profil, Fig 4.2) montre que les lymphocytes

pulmonaires des sujets AAE ont une activité de la caspase 3 plus grande (pour tous les

temps : 0, 4 et 24 h m ) que chez les lymphocytes pulmonaires de sujets normaux.

Cependant, le nombre de sujets dans le groupe des normaux est trop faible pour faire des

statistiques vaiables (n=2).

4.3.3 Effet de I'anti-Fas et de l'IL-2 sur I'apo~tose des lymbhocvtes T cultivés mndant

24 hres (auoutose ~uantifiée par TUNEL).

De la figure 4.3, il se dégage quatre messages. Le premier est similaire à ce que

l'on voit à la figure 4.1, c'est-à-dire qu'il y a significativement plus d'apoptose après 24

hres chez les lymphocytes pulmonaires non stimulés des patients AAE que chez les

lymphocytes des sujets contrôles. Le deuxième est qu'une stimulation à I'anti-Fas n'a

aucun effet sur les taux d'apoptose de lymphocytes pulmonaires des sujets AAE. Ceci

laisse présager une défaillance dans l'initiation de I'apoptose par le sentier Fas/FasL. Le

troisième message est que l'IL-2 diminue les taux d'apoptose des lymphocytes

pulmonaires de I'AAE. La tendance est intéressante malgré le fait qu'elle n'est pas

significative (p=0,07). Ce demier résultat suggère fortement un rôle de cette cytokine in

vivo. Ensuite, le quatrième message est que la stimulation à l'IL-2 ramène les taux

d'apoptose des lymphocytes des patients AAE au même aiveau que ceux des sujets

contrôles stimulés Li l'IL-2, ce qui sugghe que les lymphocytes des patients AAE sont

dépendants de L'IL-2 pour leur survie.

T IAAE

Fieure 4.1 : Dénombrement de la quantité de lymphocytes pulmonaires cultivés sans

stimulation et qui sont positif pour le test de TUNEL. Les lymphocytes du LBA des

patients AAE et des sujets normaux ont ét6 mis en culture pendant 24 heures. Les cellules

ont ensuite été récoltées aux temps 0, 4 hres et 24 hres et l'ampleur de I'apoptose a été

mesurée par le test de TUNEL. Au temps O, il y avait significativement plus de

lymphocytes (exprimés en moyenne f SEM) ayant des noyaux TUNEL positifs

provenant des sujets normaux que des patients AAE @ = 0,03). Cependant, après 4 hres

et 24 hres, la situation est inverse et il y a significativement plus d'apoptose chez les

lymphocytes des sujets M E que chez les sujets normaux. ( p = 0,005 pout T = 4hres et p

= 0,004 pour T = 24 hres).

O 4 24 Temps (Hm)

Fimire 4.2 : Activité de la caspase 3 en fonction du temps, La mesure de l'activité de

la caspase 3 a ét6 faite dans le temps chez les lymphocytes pulmonaires des patients AAEi

et des sujets normaux. Une mesure a été prise aux temps 0 ,4 hres et 24 hres. A tous les

temps, les lymphocytes puIrnonaires des patients AAE ont démontré une activité plus

élevée de la caspase 3. Un test d'analyse de profil rivele une différence presque

significative entre les deux types de sujets et ce, pour tout temps confondus @ = 0,W)

malgré Ie faible nombre de sujets dans le groupe des normaux (n = 2).

AAE O Normaux

Sans Anîi-F as 11-2 stimulation

Figure 4.3 : Effet de I'anti-Fas et de l'IL-2 sur I'apoptose des lymphocytes T

pulmonaires après 24 heures de culture. Tel que déjh présenté à la figure 4.1, sans

stimulation. après 24 hres de culture, il y a davantage de lymphocytes pulmonaires

provenant des patients AAE qui sont apoptotiques comparativement à ceux provenant de

sujets normaux. Également, ce graphique montre qu'une stimulation h l'ami-Fas n'a

aucun effet sur I'apoptose des lymphocytes des sujets AAE (41,17% vs 38'95, p = 0.17).

Par contre, l'IL-2 diminue tes taux d'apoptose chez tes lymphocytes des patients AAE

comparativement à ces mêmes lymphocytes mais non stimulés (41,178 vs 15'94%' p =

0.07). Les taux d'apoptose des lymphocytes AAE stimdés à l'IL-2 sont équivalents aux

taux d'apoptose des lymphocytes pulmonaires des sujets normaux aussi stimulés à l'IL-2.

CHAPITRE 5

CONCLUSIONS GÉNERALES

La première partie de l'étude (objectif 1) a démontré, par deux techniques

distinctes (annexine Vliodure de propidium et TUNEL), que l'apoptose des lymphocytes

du LBA des patients AAE est diminuée. Deux mécanismes sont proposés pour expliquer

cette diminution. Tout d'abord, les quantités de Fas, sont augmentées dans le liquide du

LBA des patients AAE. Cette molécule a la propriété d'inhiber I'apoptose induite par le

sentier Fas-FasL. Ensuite, des concentrations élevées de Bcl-xL ont été retrouvées chez

les lymphocytes T des patients AAE (2'6 fois plus que chez les normaux). Cette protéine

est reconnue pour inhiber l'apoptose des cellules qui l'expriment.

On se rappellera que l ' M E est caractérisée par une lymphocytose persistante.

Deux mécanismes généraux ont été proposés p o ~ expliquer ce phénomène: 1) une

prolifération locale soutenue et 2) une augmentation du recrutement. Les deux premiers

principes ont déjà fait l'objet d'études plus poussées. il a déjà été démontré que la

prolifération lyrnphocytaire dans le poumon, ainsi que l'augmentation de molécules et de

médiateurs pour le recrutement lymphocytaire puisse expliquer, en partie, la persistance

lymphocytaire dans I'AAE. Nous avions posé comme hypothèse que la diminution de

I'apoptose des lymphocytes T pulmonaires pournit être un troisième mécanisme

impliqué. La présente étude apporte donc un nouvel élément dans l'élucidation du

mécanisme de la persistance lyrnphocytaire en démontrant une diminution de l'apoptose

des lymphocytes T.

Tel que mentionné dans l'introduction (Chapitre 1). un rapport a déjà démontré

(sans quantifier) que l'expression du Fas était augmentée à la surface des lymphocytes du

LBA dans I'AAE. Ce résultat a été reproduit et quantifié. Cependant, celui-ci est

paradoxal si l'on tient compte qu'une diminution de l'apoptose a été trouvée chez ces

mêmes lymphocytes. Ce paradoxe est en bonne partie résolu par le fait qu'il y a pIus de

Fas, dans le liquide du LBA des patients AAE. De plus, il a déjà été rapporté chez des

cellules MCF7 (cellules épithéliaies tumorales) exprimant le Fas qu'une surexpression du

Bcl-xL rend ces cellules résistantes à l'apoptose induite par le Fas. il est donc possible

que le même phénomène puisse s'appliquer chez les lymphocytes T du LBA des patients

AAE qui eux aussi surexpriment le Bcl-xL.

La seconde partie de l'étude (objectif 2) a démontré que les lymphocytes T du

LBA des patients AAE, lorsque mis en culture, meurent (par apoptose) plus rapidement

que les lymphocytes des sujets contrôles et cela sans aucune stimulation. Ce résultat a été

quantifié par le test de TUNEL et a été c o n h é grâce à l'essai mesurant l'activité de la

caspase 3. Ainsi, ces données montrent bien l'implication du milieu pulmonaire

relativement au maintien de la survie des lymphocytes T dans 1'AAE.

Le milieu pulmonaire spécifique à 1'AAE est riche en facteurs anti-apoptotiques

de toutes sortes (Fas,, IL-2). Une fois retirés de ce milieu, les lymphocytes hautement

activés meurent rapidement par apoptose. De plus, il a été démontré que les lymphocytes

du LBA des patients AAE ne répondent pas à une stimulation à l'anti-Fas. Le type de

stimulation utilisé est un anticorps anti-Fas mimant le FasL. Ce résultat suggère une

défaillance dans l'initiation de l'apoptose par le sentier Fas/FasL. En d'autres ternes. le

message de mort cellulaire ne se transmet pas. Ceci explique donc, en partie, pourquoi on

retrouve moins d'apoptose chez les lymphocytes de I'AAE même s'ils expriment plus de

Fas que les lymphocytes provenant de sujets conuôles.

De façon à évaluer le rôle potentiel de l'IL-2 dans le maintien de la lymphucytose

dans I'AAE, les lymphocytes T des patients AAE et des sujets normaux ont été stimulés

avec des doses physiologiques de cette cytokine. Chez les sujets contrôles, l'IL-2 a peu

ou pas d'effet sur l'apoptose. Par contre, si l'on compare les lymphocytes T non stimulés

des patients AAE avec ceux stimulés l'IL-2, on se rend compte que cette cytokine

diminue de plus de 2,s fois l'apoptose. Cela vient confirmer que l'IL-2 est capable de

maintenir artificiellement en vie les lymphocytes T pulmonaires. De plus, la stimulation à

l'IL-2 des lymphocytes T des patients AAE donne des taux d'apoptose comparatifs à

ceux provenant des sujets nonnaux stimulés avec cette cytokine. Ceci suggère donc que

les lymphocytes de I'AAE sont dépendants de U-2 pour leur survie.

En résumé, cette étude a démontré que les lymphocytes du LBA des patients AAE

ont une apoptose diminuée par rapport aux lymphocytes de LBA des sujets normaux.

Cette diminution d'apoptose implique plusieurs mécanismes. Tout d'abord, le milieu

pulmonaire dans I'AAE joue un cale important puisque des niveaux élevés de Fas, et

d' IL-2 sont détectés. Ces deux médiateurs sont des facteurs anti-apoptiques pur les

lymphocytes T. De plus, les lymphocytes des sujets AAE manifestent des différences par

rapport aux lymphocytes normaux, en surexprimant le Bcl-xL et en ayant une disfonction

au niveau du Fas cellulaire étant donné que la stimulation à i'anti-Fas n'a aucun effet. Il

est clair ici que la diminution de l'apoptose est un mécanisme majeur dans le maintien de

Ia lymphocytose alvéolaire caractéristique à I'AAE. Cette étude apporte un nouvel

élément d'information dans l'établissement de la pathologie de 1'AA.E.

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