Cholesterol-Reducing Bacterium From Human Feces

8/3/2019 Cholesterol-Reducing Bacterium From Human Feces

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APPLID A ND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L o G Y , O c t . 1 9 7 7 , p . 3 5 5 - 3 6 2C o p y r i g h t C 1 9 7 7 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y V o l . 3 4 , N o . 4P r i n t e d i n U . S . A .

C h o l e s t e r o l - R e d u c i n g B a c t e r i u m f r o m Human F e c e sM. R . SADZIKOWSKI, J . F . SPERRY, AND T . D . WILKINS*

A n a e r o b e L a b o r a t o r y , V i r g i n i a P o l y t e c h n i c I n s t i t u t e and S t a t e U n i v e r s i t y , B l a c k s b u r g , V i r g i n i a 2 4 0 6 1R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 5 F e b r u a r y 1 9 7 7

A n a n a e r o b i c , g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s t h a t r e d u c e s c h o l e s t e r o l t o copros-t a n o l was i s o l a t e d f r o m human f e c e s a n d r a t c e c a l c o n t e n t s . T h e i s o l a t e s c l o s e l yr e s e m b l e a c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m i s o l a t e d b y E y s s e n e t a l . ( H . E y s s e ne t a l . , E u r . J . B i o c h e m . 3 6 : 4 1 2 - 4 2 1 , 1 9 7 3 ) f r o m a r a t ' s cecum. T h e s e o r g a n i s m sw o u l d n o t f o r m c o l o n i e s a n d were i s o l a t e d a n d c u l t i v a t e d i n an a n a e r o b i cmedium c o n t a i n i n g h o m o g e n i z e d p o r k b r a i n s ( n a t u r a l l y h i g h i n c h o l e s t e r o l ) .T h e s e o r g a n i s m s r e q u i r e f r e e or e s t e r i f i e d c h o l e s t e r o l f o r g r o w t h . T h e y werei s o l a t e d b y s e r i a l l y d i l u t i n g f e c e s or c e c a l c o n t e n t s a n d i n o c u l a t i n g b r a i nm e d i u m . C o l o n y - f o r m i n g o r g a n i s m s , w h i c h d i d n o t r e d u c e c h o l e s t e r o l , weree l i m i n a t e d b y a d d i t i o n o f i n h i b i t o r y a g e n t s t o t h e b r a i n medium c u l t u r e s . T h i ss e r i a l d i l u t i o n p r o c e d u r e was p e r f o r m e d u n t i l a pure c u l t u r e o f a c h o l e s t e r o l -r e d u c i n g o r g a n i s m was o b t a i n e d .

C o l o n c a n c e r i s o n e o f t h e m o s t commonhuman t u m o r s i n t h e U n i t e d S t a t e s ( 2 , 1 1 , 2 0 ) .T h i s i s a n e n v i r o n m e n t a l d i s e a s e , m o s t l i k e l yr e l a t e d t o d i e t ( 2 , 3 , 7 , 1 1 , 1 9 ) . P o p u l a t i o n sf r o m d e v e l o p e d c o u n t r i e s , w h i c h c o n s u m e d i e t sh i g h i n m e a t a n d l o w i n r o u g h a g e , a r e a t amuch h i g h e r r i s k f o r c o l o n c a n c e r t h a n a r em o r e r u r a l p o p u l a t i o n s ( 9 , 1 4 ) . I n v e s t i g a t i o n sc o n d u c t e d b y H i l l a n d A i r e s ( 9 ) a n d l a t e r b yR e d d y a n d W y n d e r ( 1 4 ) s u g g e s t e d a c o r r e l a t i o nb e t w e e n a h i g h d e g r e e o f b a c t e r i a l d e g r a d a t i o no f b i l e a c i d s a n d n e u t r a l s t e r o i d s a n d a h i g hi n c i d e n c e o f c o l o n c a n c e r . Our i n t e r e s t i n b a c -t e r i a l a c t i o n o n c h o l e s t e r o l i s d u e t o t h e s u g g e s -t i o n b y s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s t h a t c h o l e s t e r o lo r b i l e a c i d s m i g h t b e made i n t o c a r c i n o g e n sb y i n t e s t i n a l b a c t e r i a ( 9 , 1 4 , 1 7 ) . H o w e v e r ,n o n e o f t h e p o s t u l a t e d c a r c i n o g e n s h a v e y e tb e e n f o u n d i n t h e i n t e s t i n a l t r a c t o r h a v e b e e np r o d u c e d b y b a c t e r i a e i t h e r i n v i v o o r i n v i t r o .A p r i m a r y r e a c t i o n o f i n t e s t i n a l b a c t e r i a o nn e u t r a l s t e r o i d s i s t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e s t e r o lt o c o p r o s t a n o l . T h i s r e a c t i o n r e s u l t s i n t h er e d u c t i o n o f t h e 5 , 6 - d o u b l e b o n d o f c h o l e s t e r o lt o f o r m t h e s a t u r a t e d d e r i v a t i v e c o p r o s t a n o l .E a r l y a t t e m p t s t o o b t a i n a p u r e c u l t u r e o f t h ei n t e s t i n a l o r g a n i s m ( s ) r e s p o n s i b l e f o r t h e f o r -m a t i o n o f c o p r o s t a n o l ( 6 , 1 6 ) w e r e u n s u c c e s s f u l ;h o w e v e r , i n 1 9 7 3 C r o w t h e r e t a l . ( 5 ) r e p o r t e dt h a t 3 0 o f t h e 9 0 s t r a i n s t h e y t e s t e d o f commoni s o l a t e s o f i n t e s t i n a l b a c t e r i a w e r e c a p a b l e o fr e d u c i n g c h o l e s t e r o l t o c o p r o s t a n o l . I n t h a tsame y e a r , E y s s e n e t a l . ( 8 ) a l s o r e p o r t e d t h ei s o l a t i o n f r o m r a t c e c a l c o n t e n t s o f a n a n a e r o -b i c , g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s t h a t r e d u c e dA 5 - 3 f 3 - h y d r o x y s t e r o i d s ( i . e . , c h o l e s t e r o l , c a m -

p e s t e r o l , f 3 - s i t o s t e r o l , a n d s t i g m a s t e r o l ) t o t h ec o r r e s p o n d i n g s a t u r a t e d d e r i v a t i v e s . T h i s o r -g a n i s m (ATCC 2 1 4 0 8 ) h a s b e e n t e n t a t i v e l yp l a c e d i n t h e g e n u s E u b a c t e r i u m , a n d i t h a sa n a b s o l u t e g r o w t h r e q u i r e m e n t f o r A 5 - 3 / 8 - h y -d r o x y s t e r o i d s ( 1 t o 2 m g / m l o f m e d i u m ) . T h eE u b a c t e r i u m o f E y s s e n e t a l . ( 8 ) d o e s n o t f o r mc o l o n i e s o r g r o w o n c o n v e n t i o n a l m e d i a , a n dt h e i s o l a t i o n o f t h i s o r g a n i s m r e q u i r e d t h e u s eo f c o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n s a n d a f i l t r a t i o ns t e p t o e l i m i n a t e o t h e r o r g a n i s m s . E y s s e n e ta l . ( 8 ) f o u n d t h a t t h e n o r m a l i n t e s t i n a l b a c t e -r i a , w h i c h f o r m e d c o l o n i e s o n a n a e r o b i c a g a rp l a t e s , c o u l d n o t f o r m c o p r o s t a n o l f r o m c h o l e s -t e r o l .I n t h e p r e s e n t w o r k , we c o n f i r m t h e c o n c l u -s i o n s o f E y s s e n e t a l . ( 8 ) a n d r e p o r t w h a t web e l i e v e t o b e t h e f i r s t i s o l a t i o n o f a c h o l e s t e r o l -r e d u c i n g b a c t e r i u m f r o m human f e c e s .

M A T E R I A L S A ND M E T H O D SB a c t e r i a l s t r a i n s . T h e E u b a c t e r i u m i s o l a t e d b yE y s s e n e t a l . ( 8 ) was o b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a nT y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n (ATCC 2 1 4 0 8 ) . S t o c k c u l -t u r e s o f t h e E u b a c t e r i u m w e r e t r a n s f e r r e d e v e r y 2w e e k s i n s t a n d a r d p o r k b r a i n ( S P B ) m e d i u m . O t h e rs t r a i n s o f a n a e r o b i c b a c t e r i a w e r e f r o m t h e c u l t u r ec o l l e c t i o n o f t h e A n a e r o b e L a b o r a t o r y o f V i r g i n i aP o l y t e c h n i c I n s t i t u t e a n d S t a t e U n i v e r s i t y ( V P I )a n d a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . T h e m a j o r i t y o f t h e s eo r g a n i s m s w e r e i s o l a t e d b y W. E . C . M o o r e a n d L .V . H o l d e m a n i n t h e i r s t u d y o f t h e human f e c a lf l o r a o f 2 0 J a p a n e s e - H a w a i i a n s ( 1 2 ) . T h e s e o r g a -n i s m s w e r e i d e n t i f i e d a n d c u l t u r e d b y m e t h o d sd e s c r i b e d i n t h e A n a e r o b e L a b o r a t o r y Manual ( 1 3 ) .M e d i a . T h e S PB med ium was s i m i l a r t o t h a td e s c r i b e d b y S n o g - K j a e r e t a l . ( 1 6 ) a n d c o n t a i n e d ,

3 5 5


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356 SADZIKOWSKI, SPERRY, AND WILKINST a b l e 1 . B a c t e r i a l s t r a i n s w h i c h w e r e t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o r e d u c e c h o l e s t e r o l t o c o p r o s t a n o l

O r g a n i s m V P I S t r a i n NumberS t r a i n s u s e d w i t h C r o w t h e r e t a l . ' s medium a n d m e t h o d s :

B a c t e r o i d e s t h e t a i o t a o m i c r o n 5 9 5 1 , 3 5 1 2 , 3 0 5 1 , 2 3 0 2 , 0 9 4 0 - 1 ,8 6 0 1 , 6 3 8 7 , 5 4 4 4 - A , 3 9 3 6 , 0 0 6 1 - 1T h e 1 6 m o s t f r e q u e n t l y o c c u r r i n g b a c t e r i a l s p e c i e s o f t h e f e c a l f l o r a o f 2 0 J a p a n e s e - H a w a i i a n s ( 1 1 ) :

B a c t e r o i d e s v u l g a t u sF u s o b a c t e r i u m p r a u s n i t z i iB a c t e r o i d e s a d o l e s c e n t i sE u b a c t e r i u m a e r o f a c i e n sP e p t o s t r e p t o c o c c u s p r o d u c t u s - I IB a c t e r o id e s t h e t a i o t a o m i cr o nE u b a c t e r i u m e l i g e n sP e p t o s t r e p t o c o c c u s p r o d u c t u s - IE u b a c t e r i u m b i f o r m eE u b a c t e r i u m a e r o f a c i e n s - I I IE u b a c t e r i u m r e c t a l e - IB a c t e r o i d e s d i s t a s o n i sE u b a c t e r i u m r e c t a l e - I IB a c t e r o i d e s f r a g i l i s s s . aE u b a c t e r i u m r e c t a l e - IVB i f i d o b a c t e r i u m l o n g u m

C 9 - 2 8 , C 7 - 2 , C 6 - 7 , C 1 - 1 3C 2 3 - 3 2 , C 2 2 - 3 0 , C 1 8 - 2 2 , C 1 7 - 4C 2 3 - 4 , C 2 2 - 3 7 , C 1 7 - 2 9 , C 1 4 - 2 0C 2 2 - 5 , C 1 8 - 1 3 , C 1 4 - 9 , C 1 3 - 8 AC 2 3 - 1 , C 2 1 - 3 8 , C194, C 1 8 - 2 3C 2 2 - 1 5 , C 1 4 - 5 , C G l - 1 5 , C 9 - 1 1C 2 3 - 1 9 , C 2 2 - 1 9 , C 1 9 - 2 0 , C 1 8 - 6C 2 2 - 2 3 , C 2 1 - 3 1 , C 1 9 - 2 , C 1 8 - 3 7C 1 7 - 5 , C 1 5 - 1 8 , C 1 2 - 6 , C 1 O - 1 4C 1 9 - 2 4 , C 1 7 - 3 9 , C 1 5 - 8 A , C 1 4 - 1 0C 1 8 - 1 7 , C 1 3 - 4 5 , C 1 2 - 1 8 , C 1 0 - 1 6C 2 1 - 1 , C 1 9 - 1 7 , C 1 8 - 7 , C 1 4 - 2C 2 1 - 1 5 , C 1 3 - 4 , C l l - 5 0 , C 1 0 - 1 7C 1 2 - 2 4 , C 8 - 1 9 , C 1 - 2 3 , C 2 - 1 9C 2 3 - 3 2 , C 1 7 - 1 , C 1 5 - 7 , C 1 3 - 3C 2 3 - 5 , C 1 4 - 6 , C 1 0 - 2 1 , C 9 - 8p e r l i t e r : h o m o g e n i z e d p o r k b r a i n , 1 3 0 g ; T r y p t i c a s e( B B L ) , 1 8 g ; y e a s t e x t r a c t ( D i f c o ) , 0 . 5 g ; s o d i u mc h l o r i d e , 2 . 2 g ; d i p o t a s s i u m p h o s p h a t e , 1 . 3 g ; a g a r( D i f c o ) , 0 . 5 g ; L - e y s t i n e ( S i g m a ) , 0 . 4 g ; c h o l e s t e r o l( S i g m a ) , 0 . 5 g ; s o d i u m t h i o g l y c o l a t e ( S i g m a ) , 0 . 3 g ;a n d m e t h y l e n e b l u e , 2 m g . A l l medium i n g r e d i e n t sw e r e c o m b i n e d a n d t h o r o u g h l y b l e n d e d i n a N o v a IW a r i n g b l e n d e r ( W a r i n g P r o d u c t s D i v . , New H a r t -f o r d , C o n n . ) f o r 1 m i n . T h e pH w a s a d j u s t e d t o 7 . 2w i t h 8 N s o d i u m h y d r o x i d e , a n d t h e m e d i u m wasb o i l e d f o r 3 t o 5 m i n . W i t h i n 1 0 m i n , t h e mediumwas p l a c e d i n s i d e a n a n a e r o b i c g l o v e b o x ( C o yM a n u f a c t u r i n g C o . , Ann A r b o r , M i c h . ) f o r 4 5 t o 6 0mi n a n d d i s p e n s e d i n t o t e s t t u b e s ( 1 8 b y 1 4 2 m m ) , 9m l / t u b e , a n d n o . 1 b l a c k r u b b e r s t o p p e r s w e r e i n -s e r t e d . T h e t u b e s w e r e a u t o c l a v e d ( 1 2 1 C , 1 5 m i n )i n a p r e s s . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e medium ( 4 ) u s e db y C r o w t h e r e t a l . ( 5 ) c o n t a i n e d , p e r l i t e r : a c e t o n e -e x t r a c t e d p o r k b r a i n s , 2 0 g ; d i p o t a s s i u m p h o s p h a t e ,5 g ; c y s t e i n e - h y d r o c h l o r i d e ( S i g m a ) , 0 . 5 g ; T w e e n 8 0( B a k e r ) , 2 . 5 m l ; c h o l e s t e r o l ( S i g m a ) , 2 . 5 g ; a n di n o r g a n i c s a l t s o l u t i o n , 1 0 m l . T h i s medium w a smade a s d e s c r i b e d f o r SPB m e d i u m . A c e t o n e - e x -t r a c t e d p o r k b r a i n s w e r e p r e p a r e d b y e x t r a c t i n g 5 0 0g o f h o m o g e n i z e d p o r k b r a i n s w i t h 1 l i t e r o f a c e t o n ef o r 2 4 h o n e a c h o f 1 0 c o n s e c u t i v e d a y s w i t h c o n s t a n ts t i r r i n g . C h o l e s t e r o l c o u l d n o t b e d e t e c t e d a f t e r t h i sp r o c e d u r e . The e x t r a c t e d b r a i n s w e r e a i r d r i e d b e -f o r e b e i n g u s e d .Medium f o r c h o l e s t e r o l e s t e r s . T h e medium f o rc h o l e s t e r o l e s t e r s c o n t a i n e d , p e r l i t e r : a c e t o n e - e x -t r a c t e d p o r k b r a i n , 2 8 . 8 g ; T r y p t i c a s e ( B B L ) , 2 0 g ;N a C l , 2 . 5 g ; K 2 H P O 4 , 1 . 5 g ; y e a s t e x t r a c t ( D i f c o ) ,1 . 0 g ; s o d i u m t h i o g l y c o l a t e , 0 . 7 5 g ; L - c y s t i n e , 0 . 4 g ;N a 2 S O 3 , 0 . 2 g ; m e t h y l e n e b l u e , 1 m g ; a n d NaOH t opH 7 . 2 . T h e medium w a s b o i l e d , t a k e n i n t o t h e

g l o v e b o x , d i s p e n s e d a t 1 0 m l / t u b e , s t o p p e r e d , a n da u t o c l a v e d ( 1 2 1 C , 1 5 m i n ) i n a p r e s s . E i t h e r 0 . 5 m lo f c h o l e s t e r o l ( 2 0 m g / m l ) i n e t h e r o r 0 . 5 m l o fc h o l e s t e r o l p a l m i t a t e ( 2 8 m g / m l ) i n e t h e r was a d d e dp e r 1 0 m l o f m e d i a u n d e r 0 2 - f r e e N 2 , a n d t h e N 2was a l l o w e d t o e v a p o r a t e t h e e t h e r . T h i s m e d i u mw a s i n o c u l a t e d w i t h e i t h e r 0 . 5 m l o f E u b a c t e r i u m(ATCC 2 1 4 0 8 ) o r o u r human i s o l a t e . C u l t u r e s w e r ei n c u b a t e d f o r 5 t o 7 d a y s a t 3 7 C .C o n v e n t i o n a l a n ae r o bi c b r o t h m e d i a w e r e p r e -p a r e d a s d e s c r i b e d i n t h e V P I A n a e r o b e L a b o r a t o r yM a n u a l ( 1 3 ) . We u s e d t h e f o l l o w i n g m e d i a f o r a g a rp l a t e s : b r a i n h e a r t i n f u s i o n a g a r w i t h a n d w i t h o u t5 % ( v o l / v o l ) s h e e p b l o o d , c h o p p e d - m e a t a g a r , e g gy o l k a g a r , rumen f l u i d - g l u c o s e - c e l l o b i o s e - a g a r , p e p -t o n e - y e a s t e x t r a c t - g l u c o s e a g a r , a n d T r y p t i c a s e s o ya g a r . T h e p l a t e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d ( 1 ) i n a na n a e r o b i c c h a m b e r .S o u r c e o f human f e c a l s a m p l e s . F e c a l s a m p l e sw e r e o b t a i n e d f r o m s t a f f v o l u n t e e r s w o r k i n g a t t h eVPI A n a e r o b e L a b o r a t o r y . A l l v o l u n t e e r s w e r e i ng o o d p h y s i c a l h e a l t h a n d w e r e n o t o n u n u s u a l d i e t s .T h e s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d i n 1 2 - b y 1 2 - i n c h ( c a .3 0 . 5 - b y 3 0 . 5 - c m ) , i n t e r l o c k i n g - s e a l , p o l y e t h y l e n eb a g s (KCL C o r p . , S h e l b y v i l l e , I n d . ) . A l l s a m p l e sw e r e p r o c e s s e d w i t h i n 1 0 t o 1 5 mi n o f d e f e c a t i o n .B e f o r e a f e c a l s a m p l e w a s u s e d , i t was m i x e d b yv i g o r o u s l y k n e a d i n g t h e b a g .S e r i a l d i l u t i o n s o f f e c e s . A p p r o x i m a t e l y 1 g o fm i x e d human f e c e s was t r a n s f e r r e d t o 9 m l o fp r e r e d u c e d d i l u t i o n s a l t s o l u t i o n ( 1 3 ) u n d e r 0 2 - f r e eN 2 . T h e e x a c t w e i g h t o f s a m p l e was c a l c u l a t e d f r o mt h e i n c r e a s e d w e i g h t o f t h e d i l u t i o n t u b e . T h e f i r s td i l u t i o n t u b e was v i g o r o u s l y s h a k e n f o r a b o u t 1mi n u n t i l a h o m o g e n e o u s m i x t u r e was o b t a i n e d .S e r i a l 1 0 - f o l d d i l u t i o n s w e r e t h e n m a d e . From e a c h

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


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CHOL ES T E R O L- R E DUCING B A C T E R I U M 357o f t h e d i l u t i o n t u b e s a 1 - m l s a m p l e was i n o c u l a t e di n t o 9 m l o f SPB medium a n d i n c u b a t e d a t 3 7 C . I nt h e i s o l a t i o n o f a c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s mf r o m human f e c e s , t h e h i g h e s t d i l u t i o n t h a t f o r m e dc o p r o s t a n o l was a g a i n s e r i a l l y d i l u t e d a n d i n o c u -l a t e d a g a i n i n t o SPB m e d i u m . T h e s e r i a l d i l u t i o n swere c o n t i n u e d i n t h i s manner u n t i l a t o t a l o f sevenc o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n s were made f o r t h i s i s o -l a t i o n .T h e s e t o f 1 1 f e c a l d i l u t i o n s ( T a b l e 2 ) was per-f o r m e d b y u s i n g a b l e n d e r i n s i d e t h e a n a e r o b i cg l o v e b o x . A p p r o x i m a t e l y 1 g o f f e c e s i n 9 m l o fd i l u t i o n s a l t s o l u t i o n was a d d e d t o 9 0 ml o f d i l u t i o ns o l u t i o n i n t h e b l e n d e r . T h i s s o l u t i o n was b l e n d e df o r t h r e e 1 - m i n p e r i o d s . T h e s o l u t i o n was t h e nd i l u t e d i n a s e r i e s o f e i g h t 1 0 - f o l d d i l u t i o n s . E a c hd i l u t i o n ( 1 m l ) was i n o c u l a t e d i n t o 9 ml o f SPBmedium a n d i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 2 0 d a y s .

P h e n e t h y l a l c o h o l t r e a t m e n t . P h e n e t h y l a l c o h o l( 1 0 m l ) was f i l t e r s t e r i l i z e d w i t h a 0 . 4 5 - , u m mem-b r a n e f i l t e r ( M i l l i p o r e C o r p . ) . T h e t u b e c o n t a i n i n gt h e a l c o h o l was f l u s h e d w i t h 0 2 - f r e e N 2 , a n d t h ea l c o h o l was k e p t u n d e r t h i s a t m o s p h e r e . The p h e n -e t h y l a l c o h o l was a d d e d t o m i x e d c u l t u r e s i n SPBmedium t o a c h i e v e c o n c e n t r a t i o n s f r o m 0 . 1 t o 1 . 0 %( v o l / v o l ) i n 0 . 1 % i n c r e m e n t s .E x t r a c t i o n o f s t e r o i d s . F e c e s were e x t r a c t e d b yp l a c i n g a p p r o x i m a t e l y 1 g o f f e c a l s a m p l e i n a t e s tt u b e ( 2 5 b y 1 5 0 mm) a n d a d d i n g 2 0 - m l o f p e t r o l e u me t h e r . T h i s m i x t u r e was v i g o r o u s l y s h a k e n f o r 1m i n , t h e s o l i d m a t t e r was a l l o w e d t o s e t t l e , a n d t h ep e t r o l e u m e t h e r was r e m o v e d . The p e t r o l e u m e t h e rwas c e n t r i f u g e d a t 9 3 5 x g f o r 1 0 m i n . T h e superna-t a n t was a s s a y e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y .S t e r o i d s were e x t r a c t e d f r o m SPB medium b y a d d -i n g 1 ml o f 1 N s o d i u m h y d r o x i d e a n d 2 ml o fp e t r o l e u m e t h e r t o 1 ml o f medium i n a t e s t t u b e( 1 5 b y 1 2 5 mm) a n d t h e n f o l l o w i n g t h e a b o v e proce-d u r e . The presence o f c h o l e s t e r o l a n d c o p r o s t a n o l i nt h e p e t r o l e u m e t h e r e x t r a c t s f r o m SPB c u l t u r e s wasc o n f i r m e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s s spec-t r o m e t r y .A s s a y o f c h o l e s t e r o l e s t e r s . One m i l l i l i t e r o f c u l -

t u r e was a d d e d t o 2 m l o f p e t r o l e u m e t h e r i n a t e s tt u b e t h a t was c a p p e d a n d i n v e r t e d a t l e a s t 2 0 t i m e s .T h e t u b e was c e n t r i f u g e d a t 1 , 0 0 0 x g f o r 1 m i n ,a n d a s a m p l e o f t h e p e t r o l e u m e t h e r e x t r a c t wasa s s a y e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A n o t h e r 1m l o f c u l t u r e was a d d e d t o 5 m l o f 1 N KOH i n 90%e t h a n o l a n d h e a t e d a t 9 0 C f o r 9 0 m i n . The t u b ewas a l l o w e d t o c o o l , t h e n 1 . 5 ml o f d i s t i l l e d w a t e ra n d 2 ml o f p e t r o l e u m e t h e r was a d d e d , a n d t h es a m p l e was e x t r a c t e d a n d a s s a y e d b y t h e a b o v ep r o c e d u r e .G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y f or n e u t r a l s t e r o i d s .E x t r a c t e d n e u t r a l s t e r o i d s ( i n p e t r o l e u m e t h e r ) weres e p a r a t e d a n d q u a n t i t a t e d w i t h a H e w l e t t - P a c k a r dm o d e l 5 8 3 0 - A c o m p u t e r - i n t e g r a t e d ( 1 8 8 5 0 A GC t e r -m i n a l ) gas c h r o m a t o g r a p h w i t h a h y d r o g e n f l a m e -i o n i z a t i o n d e t e c t o r ( H e w l e t t - P a c k a r d C o . , A v o n -d a l e , P a . ) . N 2 was u s e d as c a r r i e r gas a t a f l o w r a t eo f 3 0 c m 3 / m i n . A c o i l e d g l a s s c o l u m n ( 2 7 4 . 3 cm b y 2 -mmI D ) was p a c k e d w i t h 3 % Q F - 1 on GasChrom Q ,1 0 0 t o 1 2 0 mesh ( A p p l i e d S c i e n c e L a b o r a t o r i e s I n c . ,S t a t e C o l l e g e , P a . ) . The c o l u m n was k e p t a t ac o n s t a n t t e m p e r a t u r e o f 2 2 5 C . T h e i n j e c t o r a n dd e t e c t o r were a t 2 7 0 C . T h e r e l a t i v e r e t e n t i o n t i m e swere d e t e r m i n e d w i t h known r e f e r e n c e s t a n d a r d s( S i g m a C h e m i c a l C o . ) . When q u a n t i t a t i o n o f t h es t e r o i d s was r e q u i r e d , 5 - a - c h o l e s t a n e was u s e d asan i n t e r n a l s t a n d a r d .I n h i b i t i o n o f b a c t e r i a l c h o l e s t e r o l r e d u c t i o n . T h ef i n a l d i l u t i o n ( 1 0 - 1 0 ) o f a f e c a l s p e c i m e n f r o m a l o w -c h o l e s t e r o l c o n v e r t e r was s t r e a k e d on a rumen f l u i d -g l u c o s e - c e l l o b i o s e - a g a r r o l l t u b e f o r i s o l a t i o n o fo r g a n i s m s t h a t m i g h t a n t a g o n i z e c h o l e s t e r o l re-d u c t i o n . T h e o r i g i n a l m i x t u r e c o n t a i n e d t h r e e mor-p h o l o g i c a l l y d i f f e r e n t c o l o n y t y p e s . T h e s e d i f f e r e n tc o l o n y t y p e s were p i c k e d a n d grown i n c h o p p e d -meat b r o t h u n d e r pure C O 2 e i t h e r as pure c u l t u r e sor as a m i x e d i n o c u l u m .T u b e s o f SPB medium ( 9 m l ) were i n o c u l a t e du n d e r O 2 - f r e e N 2 w i t h 0 . 5 ml o f a 7 - t o 1 0 - d a y - o l dSPB c u l t u r e o f e i t h e r E u b a c t e r i u m (ATCC 2 1 4 0 8 ) orour human f e c a l i s o l a t e . We t h e n t e s t e d f o r i n h i b i -t i o n b y a d d i n g 0 . 5 ml o f t h e o r i g i n a l m i x t u r e t o

T a b l e 2 . C o m p a r i s o n o f 1 1 d i f f e r e n t s e r i a l d i l u t i o n s o f f e c e s% C o p r o s t a n o l F o r m e d i n F e c a l D i l u t i o n C u l t u r e sS u b j e c t a % C o p r o s t a n o l 2 o - 3Number I n F e c a l S a m p l e 1 o - 2 1 0 - 4 1 o - 5 i o - 6 i 0 - 7 i 0 o 8 1 0 - 9 l o - 1 o

1 4 8 1 4 3 3 4 6 3 7 6 6 0 02 6 2 5 8 1 2 8 8 6 7 1 03 1 0 4 6 8 1 9 0 0 0 0 04 1 5 2 6 1 3 8 1 2 2 6 1 0 40 05 4 3 1 4 3 4 3 0 0 0 0 06 44 0 0 0 0 0 0 0 0 07 6 2 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 8 1 8 1 6 3 08 7 9 4 4 70 1 0 0 82 1 0 0 80 7 9 0 09 8 6 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 47 6 5 01 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 7 8 1 0 0 80 1 0 0 5 5 7 5 01 1 100 1 0 0 1 0 0 100 100 100 1 0 0 100 1 0 0 0

a S a m p l e s i z e r a n g e d f r o m 0 . 9 0 t o 1 . 1 6 o f wet f e c e s .

V O L . 3 4 , 1 9 7 7


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358 SADZIKO WSKI, SPE R RY, AND WILKINSsome t u b e s , s e p a r a t e i s o l a t e s t o o t h e r s , a n d a l lp o s s i b l e c o m b i n a t i o n s o f t h e i s o l a t e s t o o t h e r t u b e s .T h e t u b e s were i n c u b a t e d f o r 1 0 d a y s a t 3 7 C , a n dt h e n we d e t e r m i n e d t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f c h o -l e s t e r o l a n d c o p r o s t a n o l .

R E S U L T SI s o l a t i o n o f o r g a n i s m s f r o m t h e r a t cecum.I n i t i a l a t t e m p t s t o r e p e a t t h e i s o l a t i o n as d e -s c r i b e d b y E y s s e n e t a l . ( 8 ) o f a c h o l e s t e r o l -r e d u c i n g o r g a n i s m f r o m t h e c e c a l c o n t e n t s o f a

r a t were n o t s u c c e s s f u l . C o p r o s t a n o l was n o tf o u n d on i n c u b a t i o n o f SPB medium w i t h c e c a lc o n t e n t s f r o m a r a t f e d P u r i n a L a b o r a t o r yChow ( R a l s t o n P u r i n a C o . , S t . L o u i s , M o . ) .O n l y s m a l l amounts o f c h o l e s t e r o l ( 0 . 0 5 4 m g / g ,w e t w e i g h t ) a n d c o p r o s t a n o l ( 0 . 0 2 1 m g / g , w e tw e i g h t ) were f o u n d i n t h e c e c a l c o n t e n t s o fr a t s f e d t h i s d i e t , a n d o n l y a b o u t 2 8% o f t h ec h o l e s t e r o l was c o n v e r t e d t o c o p r o s t a n o l i n s u c ha n i m a l s . We a t t e m p t e d t o i n c r e a s e t h e concen-t r a t i o n o f c h o l e s t e r o l a n d , we h o p e d , t h e con-c e n t r a t i o n o f c o p r o s t j a n o l b y f e e d i n g r a t s a h i g h -c h o l e s t e r o l d i e t ( 2 % C h o l e s t e r o l F e e d , N u t r i -t i o n a l B i oc h e m i c a l s , C l e v e l a n d , O h i o ) . I n r a t sf e d t h e h i g h - c h o l e s t e r o l d i e t t h e r e was an i n -crease i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f c h o l e s t e r o l i nt h e f e c e s ( 5 m g / g , w e t w e i g h t ) , b u t t h e concen-t r a t i o n o f c o p r o s t a n o l was s t i l l l o w ( 0 . 2 m g / g ,w e t w e i g h t ) even a f t e r 2 4 d a y s on t h i s d i e t .R o s e n h e i m a n d W e b s t e r ( 1 5 ) r e p o r t e d t h a tr a t s f e d a d i e t o f raw b r a i n e x c r e t e d very l a r g eamounts o f c o p r o s t a n o l . S i n c e t h e mammalianb r a i n c o n t a i n s 12% ( d r y w e i g h t ) c h o l e s t e r o l , i twas n o t necessary t o s u p p l e m e n t t h e d i e t w i t ha d d i t i o n a l c h o l e s t e r o l . A f t e r 1 d a y on t h e b r a i nd i e t , a r a t e x c r e t e d 1 mg o f c h o l e s t e r o l a n d 4mg o f c o p r o s t a n o l per g ( w e t w e i g h t ) o f f e c e s .T h i s h i g h l e v e l o f c o p r o s t a n o l f o r m a t i o n c o n t i n -

u e d t h r o u g h d a y 6 , when t h e a n i m a l was s a c r i -f i c e d . T h e c e c a l c o n t e n t s were u s e d i n an a t -t e m p t t o i s o l a t e t h e o r g a n i s m ( s ) r e s p o n s i b l e f o rt h e f o r m a t i o n o f c o p r o s t a n o l .C e c a l c o n t e n t s ( 0 . 5 7 g ) were s e r i a l l y d i l u t e d .T u b e s c o n t a i n i n g 9 m l o f t h e SPB medium

were i n o c u l a t e d w i t h 1 ml o f e a c h d i l u t i o n .A f t e r i n c u b a t i o n , t h e amount o f c o p r o s t a n o l i ne a c h t u b e was d e t e r m i n e d , a n d t h e h i g h e s td i l u t i o n c o n t a i n i n g c o p r o s t a n o l was u s e d ast h e i n o c u l u m f o r t h e n e x t d i l u t i o n s e r i e s . D a t af o r t h e f i r s t t h r e e c o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n sar e g i v e n i n T a b l e 3 .As t h e n u m b e r o f c o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n si n c r e a s e d , t h e n u m b e r o f c e l l t y p e s d i s c e r n i b l ew i t h t h e l i g h t m i c r o s c o p e a n d t h e number o fc o l o n y t y p e s t h a t o c c u r r e d on a v a r i e t y o fa n a e r o b i c p l a t e s d e c r e a s e d . None o f t h e c o l o n yt y p e s p i c k e d f r o m t h e s e agar p l a t e s f o r m e dc o p r o s t a n o l i n pure c u l t u r e i n SPB m e d i u m .A ft e r t h e t h i r d s e r i a l d i l u t i o n , t h e 1 0 - 7 d i l u t i o nt u b e c o n t a i n e d : a g r a m - n e g a t i v e r o d , a gram-p o s i t i v e r o d , a n d a g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s .T wo c o l o n y t y p e s were f o u n d on a n a e r o b i cb r ai n h e a r t i n f u s i o n agar p l a t e s t h a t corre-s p o n d e d t o t h e g r a m - n e g a t i v e a n d g r a m - p o s i -t i v e r o d s . N e i t h e r o f t h e s e t w o o r g a n i s m s c o u l df o r m c o p r o s t a n o l .T h e g r a m - n e g a t i v e r o d was e l i m i n a t e d f r o mt h e c u l t u r e b y a d d i t i o n o f p h e n e t h y l a l c o h o l i n0 . 1 % i n c r e m e n t s f r o m 0 . 1 t o 1 . 0 % . M i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o n o f t h e 0 . 5 % c u l t u r e a n d i t s s u b s e -q u e n t s u b c u l t u r e s r e v e a l e d t h a t t h e gram-neg-a t i v e r o d h a d b e e n e l i m i n a t e d . A f t e r f o u r morec o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n s , t h e g r a m - p o s i t i v eb a c i l l u s was e l i m i n a t e d ( T a b l e 3 ) . A s m a l l ( 0 . 4b y 1 . 0 , m ) , g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s waso b s e r v e d w i t h t h e l i g h t m i c r o s c o p e i n t h e c h o -l e s t e r o l - r e d u c i n g c u l t u r e s . We c o u l d n o t o b t a i n

T a b l e 3 . R e s u l t s o f 7 c o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n s o f r a t c e c a l c o n t e n t sH i g h e s t D i l u t i o n % C o p r o s t a n o lD i l u t i o n T o Form I n H i g h e s t I n c u b a t i o nS e r i e s C o p r o s t a n o l D i l u t i o n P e r i o d ( d a y s )

F i r s t i o - 8 7 0 7S e c o n d 1 0 - 9 6 1 3 7T h i r d a 1 0 - 7 2 7 9F o u r t h 1 0 - 9 6 8 7F i f t h 1 0 - 7 7 0 8S i x t h i o - 8 7 0 1 4S e v e n t h 1 0 6 8 0 2 3a T h e 1 0 - 7 t u b e o f t h e t h i r d d i l u t i o n w a s u s e d t o i n o c u l a t e t u b e o f SPB m e d i a c o n t a i n i n g

p h e n e t h y l a l c o h o l . T h e o n e c o n t a i n i n g 0 . 5 % ( v o l / v o l ) p h e n e t h y l a l c o h o l w a s u s e d t o i n o c u l a t e t h ef o u r t h d i l u t i o n s e r i e s .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


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V O L . 3 4 , 1 9 7 7c o l o n i e s on any o f a v a r i e t y o f a er ob i c a n da n a e r o b i c agar m e d i a , a n d t h e o r g a n i s m d i dn o t grow i n c o n v e n t i o n a l b r o t h m e d i a e i t h e ra e r o b i c a l l y or a n a e r o b i c a l l y . T h u s , t h e c h o l e s -t e r o l - r e d u c i n g r a t i s o l a t e a p p e a r e d t o b e verys i m i l a i r t o t h a t d e s c r i b e d b y E y s s e n e t a l . ( 8 ) ,w h i c h was a l s o i s o l a t e d f r o m r a t c e c a l c o n t e n t s .I s o l a t i o n o f o r g a n i s m s f r o m human f e c e s .I n i t i a l a t t e m p t s t o i s o l a t e s u c h o r g a n i s m s f r o mhuman f e c e s were b a s e d on t h e use o f a f e c a li n o c u l u m f r o m a person w h o s e f e c e s c o n t a i n e dmore c o p r o s t a n o l t h a n c h o l e s t e r o l . A f e c a l sam-p l e ( 0 . 7 5 g ) was d i l u t e d s e r i a l l y i n 1 : 1 0 d i l u -t i o n s , a n d t h e n s a m p l e s o f t h e s e d i l u t i o n s werei n o c u l a t e d i n t o SPB m e d i u m . A g a i n , t h e h i g h -e s t d i l u t i o n i n w h i c h c o p r o s t a n o l was f o u n dwas s e r i a l l y d i l u t e d . A t o t a l o f seven consecu-t i v e s e r i a l d i l u t i o n s were p e r f o r m e d d u r i n g t h i si s o l a t i o n ( T a b l e 4 ) .A f t e r t h e seven c o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n s ,o n l y t h r e e m o r p h o l o g i c a l t y p e s o f b a c t e r i a c o u l db e f o u n d : a g r a m - n e g a t i v e r o d , a g r a m - p o s i t i v ecoccus, a n d a s m a l l g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s .O n l y t h e g r a m - n e g a t i v e r o d a n d g r a m - p o s i t i v ecoccus f o r m e d c o l o n i e s on a n a e r o b i c b r a i n h e a r ti n f u s i o n agar p l a t e s ; h o w e v e r , i n pure c u l t u r e st h e s e t w o o r g a n i s m s d i d n o t f o r m c o p r o s t a n o l .I n an a t t e m p t t o e l i m i n a t e t h e s e o r g a n i s m s ,s u b c u l t u r e s were made i n t u b e s o f SP B mediumw h i c h c o n t a i n e d d i f f e r e n t a n t i b i o t i c s . The f o l -l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i b i o t i c s weret e s t e d : c h l o r a m p h e n i c o l , 1 2 , u g / m l ; c l i n d a m y -c i n , 1 . 6 , g /m l ; e r y t h r o m y c i n , 3 , g / m l ; p e n i c i l -l i n , 2 U / m l ; a n d t e t r a c y c l i n e , 6 , u g / m l . A f t e r 5d a y s o f i n c u b a t i o n , c o p r o s t a n o l was d e t e c t e d i nt h o s e c u l t u r e s c o n t a i n i n g c l i n d a m y c i n , e r y t h -r o m y c i n , a n d p e n i c i l l i n G . The e r y t h r o m y c i n -t r e a t e d c u l t u r e c o n t a i n e d o n l y a g r a m - n e g a t i v eb a c i l l u s a n d g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s . T heg r a m - p o s i t i v e coccus h a d b e e n k i l l e d b y t h ee r y t h r o m y c i n .

CHOL ES T E R O L- R E DUCING B A C T E R I U M 359T h e m i x t u r e was s u b c u l t u r e d i n t o t u b e s o fSPB medium s u p p l e m e n t e d w i t h p h e n e t h y l a l -c o h o l as p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . A f t e r 7 d a y s o fi n c u b a t i o n , c o p r o s t a n o l was d e t e c t e d i n t h et u b e s c o n t a i n i n g l e s s t h a n 0 . 8 % p h e n e t h y l a l -c o h o l . T h i s e l i m i n a t e d t h e g r a m - n e g a t i v e r o d ,a n d a g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s a p p e a r e d t ob e t h e o n l y r e m a i n i n g o r g a n i s m . T h e c h o l e s -t e r o l - r e d u c i n g d i p l o b a c i l l u s d i d n o t f o r m c o l o -n i e s on any o f a v a r i e t y o f a e r o b i c a n d anaero-b i c agar m e d i a , a n d t h e o r g a n i s m d i d n o t growi n c o n v e n t i o n a l b r o t h m e d i a a e r o b i c a l l y or an-a e r o b i c a l l y i n p r e r e d u c e d a n a e r o b i c b r o t h me-d i a .T h i s o r g a n i s m i s very s i m i l a r t o t h e orga-n i s m i s o l a t e d b y E y s s e n e t a l . ( 8 ) ; b o t h orga-n i s m s h a v e s l i g h t l y p o i n t e d c e l l e n d s a n d a

c h a r a c t e r i s t i c d i p l o i d c e l l s h a p e , a n d t h e c e l ld i m e n s i o n s ar e e s s e n t i a l l y t h e same ( 0 . 4 b y 1 . 0g m ) .E y s s e n e t a l . ( 8 ) r e p o r t e d t h a t t h e i r c h o l e s -t e r o l - r e d u c i n g i s o l a t e d i d n o t r e d u c e t h e d o u b l eb o n d o f c h o l e s t e r o l when t h e c h o l e s t e r o l wasp r e s e n t as an e s t e r . S i n c e we f o u n d m o d e r a t e l yh i g h l e v e l s o f e s t e r i f i e d c o p r o s t a n o l i n t h e f e c e so f r u r a l S o u t h A f r i c a n n a t i v e s ( J . F . S p e r r y ,u n p u b l i s h e d d a t a ) , we w o n d e r e d w h e t h e r ourhuman c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g i s o l a t e c o u l d re-d u c e t h e d o u b l e b o n d o f e s t e r i f i e d c h o l e s t e r o l .We f o u n d t h a t E y s s e n ' s o r g a n i s m c o n v e r t e d1 6 % o f t h e c h o l e s t e r y l p a l m i t a t e t o c o p r o s t a n o lp a l m i t a t e , a n d our human c h o l e s t e r o l - r e d u c i n gi s o l a t e c o n v e r t e d 23% o f t h e c h o l e s t e r y l p a l m i -t a t e t o c o p r o s t a n o l p a l m i t a t e . T h e r e weree s s e n t i a l l y no u n e s t e r i f i e d n e u t r a l s t e r o i d s i nt h e s e c u l t u r e s .R e q u i r e m e n t o f c h o l e s t e r o l f o r c e l l g r o w t h .T h e c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g E u b a c t e r i u m i s o l a t e db y E y s s e n e t a l . ( 8 ) r e q u i r e d t h e presence o f aA 5 s t e r o l f o r g r o w t h . G r o w t h o f our r a t a n dhuman c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g i s o l a t e s i n m e d i a

T a b l e 4 . R e s u l t s o f c o n s e c u t i v e s e r i a l d i l u t i o n s o f b u m a n f e c e sH i g h e s t D i l u t i o n % C o p r o s t a n o lD i l u t i o n T o Form I n H i g h e s t I n c u b a t i o nS e r i e s C o p r o s t a n o l D i l u t i o n P e r i o d ( d a y s )

F i r s t 1 o - 5 44 1 4S e c o n d 1 0 - 7 7 7 1 1T h i r d 1 0 - 7 70 2 6F o u r t h 1 0 6 7 1 9F i f t h 1 0 6 7 2 1 0S i x t h 1 0 - 7 5 4 7S e v e n t h 1 0 - 7 8 2 1 1


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3 6 0 SADZIKOWSKI, SPERRY, A ND WILKINSmade w i t h a c e t o n e - e x t r a c t e d p o r k b r a i n ( c h o -l e s t e r o l - f r e e ) w a s c h e c k e d . No g r o w t h w a s o b -s e r v e d , e v e n a f t e r w e e k s o f i n c u b a t i o n . Whenc h o l e s t e r o l w a s a d d e d b a c k t o t h e mediump r e p a r e d w i t h a c e t o n e - e x t r a c t e d p o r k b r a i n ,b o t h t h e r a t a n d t h e human i s o l a t e s g r e w a n dr e d u c e d t h e c h o l e s t e r o l t o c o p r o s t a n o l .V a r i a t i o n i n p e r c e n t c o p r o s t a n o l f o r m e dw i t h d i f f e r e n t f e c a l i n o c u l a . A f e c a l s a m p l et h a t c o n t a i n e d m o r e c o p r o s t a n o l t h a n c h o l e s -t e r o l was u s e d f o r i s o l a t i o n o f t h e o r g a n i s mf r o m human f e c e s . H o w e v e r , many p e o p l e n o r -m a l l y e x c r e t e f e c e s i n w h i c h m o s t o f t h e c h o l e s -t e r o l h a s n o t b e e n r e d u c e d t o c o p r o s t a n o l ( 1 8 ) .We w e r e i n t e r e s t e d i n k n o w i n g w h a t i n f l u e n c et h e o r i g i n a l f e c a l i n o c u l u m w o u l d h a v e o n t h ei n v i t r o c o n v e r s i o n o f c h o l e s t e r o l t o c o p r o s t a n o l .T h e r e f o r e , f e c a l s a m p l e s f r o m 1 1 v o l u n t e e r sw e r e h o m o g e n i z e d i n a b l e n d e r , d i l u t e d , a n di n o c u l a t e d i n t o SPB m e d i u m . T h e c u l t u r e sw e r e i n c u b a t e d f o r 2 0 d a y s a n d t h e n t e s t e d f o rt h e p r e s e n c e o f c o p r o s t a n o l . D a t a f o r t h e s e r i a ld i l u t i o n s o f t h e s e 1 1 s a m p l e s a r e g i v e n i n T a b l e2 . F e c a l s a m p l e s w i t h l o w a m o u n t s o f c o p r o s -t a n o l ( s u b j e c t s 1 t o 5 ) c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d al o w l e v e l o f c o p r o s t a n o l i n t h e d i l u t i o n c u l t u r e s .S i m i l a r l y , s a m p l e s w i t h h i g h a m o u n t s o f c o -p r o s t a n o l ( s u b j e c t s 7 t o 1 1 ) p r o d u c e d a h i g hp e r c e n t a g e o f c o p r o s t a n o l i n t h e d i l u t i o n c u l -t u r e s . I t a p p e a r e d , f r o m t h e d i l u t i o n s t u d i e s ,t h a t t h e r e l a t i v e n u m b e r s o f c h o l e s t e r o l - r e d u c -i n g o r g a n i s m s a r e s i m i l a r i n h i g h a n d l o wc o n v e r t e r s .I n h i b i t i o n o f c h o l e s t e r o l r e d u c t i o n . S i n c et h e n u m b e r o f c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m sa p p e a r s s i m i l a r i n h i g h a n d l o w c o n v e r t e r s ,t h e l o w e r a m o u n t o f c o p r o s t a n o l f o r m e d b ym i x e d c u l t u r e s o b t a i n e d f r o m c e r t a i n i n d i v i d -u a l s m i g h t b e e x p l a i n e d i n t w o w a y s . T h eo r g a n i s m ( s ) r e s p o n s i b l e f o r c o p r o s t a n o l f o r m a -t i o n c o u l d b e d i f f e r e n t a n d h a v e d i f f e r e n t d e -g r e e s o f e f f i c i e n c y i n r e d u c i n g c h o l e s t e r o l , o ro t h e r o r g a n i s m s p r e s e n t i n t h e m i x e d c u l t u r e sc o u l d i n h i b i t t h e r e d u c t i o n o f c h o l e s t e r o l .T h e r e f o r e , we a t t e m p t e d t o i s o l a t e t h e c h o l e s -t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m ( s ) f r o m t h e f e c e s o f a ni n d i v i d u a l who r o u t i n e l y e x c r e t e d v e r y l i t t l ec o p r o s t a n o l . T h e same g e n e r a l i s o l a t i o n s c h e m ewas u s e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . We w e r ea b l e t o r e d u c e t h e number o f o r g a n i s m s t ot h r e e t h a t f o r m c o l o n i e s o n a g a r p l a t e s , b u t d on o t f o r m c o p r o s t a n o l a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n ,a n d a g r a m - p o s i t i v e d i p l o b a c i l l u s t h a t w i l lg r o w o n l y i n SPB b r o t h . T h i s m i x e d c u l t u r er e d u c e d o n l y a b o u t 50% o f t h e c h o l e s t e r o l i nSPB b r o t h t o c o p r o s t a n o l . T h e s e i s o l a t e d o r g a -n i s m s w e r e a s s a y e d f o r i n h i b i t i o n o f c o p r o s -

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .t a n o l f o r m a t i o n when m i x e d w i t h p u r e c u l t u r e so f t h e E u b a c t e r i u m o f E y s s e n e t a l . ( 8 ) a n d o u rhuman i s o l a t e . T h e s e o r g a n i s m s d i d n o t s i g n i f -i c a n t l y i n h i b i t t h e f o r m a t i o n o f c o p r o s t a n o l b yt h e human i s o l a t e , b u t t h e m i x t u r e i n h i b i t e dt h e r e d u c t i o n o f c h o l e s t e r o l b y 5 0 % w i t h t h eE u b a c t e r i u m . T h e m o s t a c t i v e i n h i b i t o r y o r g a -n i s m ( 4 7 % ) h a s b e e n t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d a s as t r a i n o f F u s o b a c t e r i u m r u s s i i a n d a l e s s i n h i b -i t o r y i s o l a t e ( 3 4 % ) h a s b e e n i d e n t i f i e d a s B a c -t e r o i d e s v u l g a t u s .A n a e r o b i c i n t e s t i n a l b a c t e r i a n o t c a p a b l eo f f o r m i n g c o p r o s t a n o l . I n v e s t i g a t o r s ( 6 , 1 5 ,1 6 ) h a v e b e e n u n s u c c e s s f u l i n a t t e m p t s t o d e m -o n s t r a t e c o p r o s t a n o l f o r m a t i o n b y o r g a n i s m st h a t w i l l g r o w o r f o r m c o l o n i e s o n c h o l e s t e r o l -f r e e a g a r m e d i a e i t h e r a e r o b i c a l l y o r a n a e r o b i -c a l l y . D u r i n g t h e i r i s o l a t i o n o f t h e c h o l e s t e r o l -r e d u c i n g E u b a c t e r i u m , E y s s e n e t a l . ( 8 ) a l s of o u n d t h a t n o n e o f t h e c o l o n y - f o r m i n g o r g a -n i s m s c o u l d f o r m c o p r o s t a n o l . C r o w t h e r e t a l .( 5 ) , h o w e v e r , r e p o r t e d t h a t n u m e r o u s a n a e r o b i ci n t e s t i n a l b a c t e r i a , w h i c h t h e y i s o l a t e d o n c o n -v e n t i o n a l m e d i a , f o r m e d c o p r o s t a n o l f r o m c h o -l e s t e r o l . T o r e s o l v e t h e s e c o n f l i c t i n g r e p o r t s ,t h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d .I n t h e f i r s t e x p e r i m e n t , t h e s a m e m e t h o d sa n d m e d i a u s e d b y C r o w t h e r e t a l . ( 5 ) w e r eu s e d ( B . D r a s a r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .T h e s e w o r k e r s f o u n d t h a t s t r a i n s o f B a c t e r o i d e st h e t a i o t a o m i c r o n p r o d u c e d t h e l a r g e s t a m o u n t so f c o p r o s t a n o l . U n f o r t u n a t e l y , a l l o f t h e o r i g i -n a l s t r a i n s u s e d b y C r o w t h e r e t a l . ( 8 ) w e r el o s t ( M . J . H i l l , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .T h e r e f o r e , 1 0 f e c a l i s o l a t e s o f B . t h e t a i o t a o m i -c r o n ( T a b l e 1 ) w e r e t e s t e d f o r c o p r o s t a n o l f o r -m a t i o n . C o p r o s t a n o l w a s n o t d e t e c t e d i n a n y o ft h e c u l t u r e s . T h i s e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e dw i t h t h e s a m e r e s u l t s .We n e x t t e s t e d f o u r s t r a i n s o f e a c h o f t h e 1 6m o s t f r e q u e n t l y i s o l a t e d b a c t e r i a l s p e c i e s f r o mt h e f e c e s o f 2 0 J a p a n e s e - H a w a i i a n s ( 1 2 ) f o rt h e i r a b i l i t y t o f o r m c o p r o s t a n o l i n SPB m e -d i u m ( T a b l e 1 ) . C o p r o s t a n o l w a s n o t f o r m e d i na n y c u l t u r e .T o f u r t h e r t e s t t h e a b i l i t y o f c o l o n y - f o r m i n go r g a n i s m s t o f o r m c o p r o s t a n o l , s a m p l e s f r o ms e v e n o f t h e l a s t d i l u t i o n t u b e s s h o w i n g c o p r o s -t a n o l f o r m a t i o n i n t h e e x p e r i m e n t r e p o r t e d i nT a b l e 2 w e r e s t r e a k e d o n rumen f l u i d - g l u c o s e -c e l l o b i o s e - a g a r r o l l t u b e s ( 1 3 ) a n d i n c u b a t e df o r 4 d a y s . E a c h t y p e o f c o l o n y w a s p i c k e d ,g r o w n i n p u r e c u l t u r e i n c h o p p e d - m e a t - c a r b o -h y d r a t e b r o t h ( 1 3 ) i n o c u l a t e d i n t o SPB m e -d i u m , a n d i n c u b a t e d f o r 1 0 d a y s . C o p r o s t a n o lwas n o t f o r m e d b y a n y o f t h e 4 8 c o l o n y - f o r m i n go r g a n i s m s i s o l a t e d f r o m t h e s e c u l t u r e s .


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CHOL ES T E R O L- R E DUCING B A C T E R I U M 361DISCUSSION

T h e c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m i s o l a t e df r o m human f e c e s i n t h i s s t u d y a p p e a r s t o b et h e f i r s t s u c h i s o l a t i o n . T h e r e p o r t b y C r o w t h e re t a l . ( 5 ) o f c o p r o s t a n o l f o r m a t i o n b y l a r g en u m b e r s o f a n a e r o b e s w a s n o t c o n f i r m e d . Wec o u l d n o t r e p e a t t h e i r r e s u l t s , a n d t h e y c o u l dn o t s u p p l y u s w i t h c u l t u r e s t h a t p e r f o r m e dt h i s r e a c t i o n . M o r e o v e r , e a r l i e r i n v e s t i g a t o r sf o u n d t h a t t h e d o u b l e b o n d i n c h o l e s t e r o l w a sn o t r e d u c e d b y common f e c a l b a c t e r i a ( 6 , 8 , 1 5 ,1 6 ) .T h e human i s o l a t e i s v e r y s i m i l a r t o t hE u b a c t e r i u m i s o l a t e d b y E y s s e n e t a l . ( 8 ) f r o r .t h e c e c u m o f a r a t . B o t h o f t h e s e c h o l e s t e r o l -r e d u c i n g o r g a n i s m s a r e s m a l l ( 0 . 4 b y 1 . 0 , u m ) ,g r a m - p o s i t i v e , a n a e r o b i c d i p l o b a c i l l i t h a t r e -q u i r e c h o l e s t e r o l f o r g r o w t h . B o t h o r g a n i s m sc o u l d u s e c h o l e s t e r y l p a l m i t a t e f o r l i m i t e dg r o w t h , a n d t h e d o u b l e b o n d o f t h e c h o l e s t e r o li n t h e e s t e r w a s r e d u c e d . T h e l o w e r l e v e l o ft h e d o u b l e b o n d r e d u c t i o n w a s p r o b a b l y d u e t ot h e l o w s o l u b i l i t y o f t h i s s u b s t r a t e i n t h e m e -d i u m .T h e i n a b i l i t y o f t h e s e o r g a n i s m s t o f o r mc o l o n i e s n e c e s s i t a t e d l a b o r i o u s a n d u n c o n v e n -t i o n a l i s o l a t i o n p r o c e d u r e s . A l t h o u g h t h e SPBm e d i u m s u p p o r t e d g r o w t h when u s e d a s ab r o t h m e d i u m , i t d i d n o t s u p p o r t g r o w t h a s as o l i d m e d i u m . T h i s may b e d u e t o t h e s m a l la m o u n t o f c h o l e s t e r o l a v a i l a b l e a t t h e s u r f a c eo f t h e a g a r . I f t h e c h o l e s t e r o l i s u n a b l e t od i f f u s e t h r o u g h t h e s o l i d m e d i a , g r o w t h w o u l db e l i m i t e d b y t h e a v a i l a b i l i t y o f t h i s s u b s t r a t es i n c e t h e s e o r g a n i s m s r e q u i r e c h o l e s t e r o l f o rg r o w t h . E y s s e n e t a l . ( 8 ) r e p o r t e d t h a t p i n p o i n t ,w a t e r y c o l o n i e s d e v e l o p e d o n b r a i n a g a r m e -d i u m a f t e r 7 d a y s o f i n c u b a t i o n . We o b s e r v e dp i n p o i n t d r o p l e t s o f a l i p o i d a l s u b s t a n c e o n t h es o l i d m e d i u m ; h o w e v e r , t h e s e d r o p l e t s d i d n o tc o n t a i n c e l l s when e x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l y .F a i l u r e t o o b t a i n c o l o n i e s o f t h e o r g a n i s m a l s om e a n s t h a t we c a n n o t b e a b s o l u t e l y c e r t a i nt h a t we h a v e a p u r e c u l t u r e . I t c e r t a i n l y i sp o s s i b l e t h a t t w o s p e c i e s t h a t l o o k i d e n t i c a lc o u l d b e p r e s e n t , b u t i t d o e s n o t s e e m l i k e l y .F e c a l s a m p l e s w i t h i n i t i a l l o w c o p r o s t a n o ll e v e l s p r o d u c e d l o w a m o u n t s o f c o p r o s t a n o l i nv i t r o , a n d t h e c o n v e r s e was t r u e f o r s a m p l e sw i t h h i g h l e v e l s . W i l k i n s a n d Hackman ( 1 8 )h a v e r e p o r t e d t h a t 2 5 % o f t h e i n d i v i d u a l s i n aN o r t h A m e r i c a n p o p u l a t i o n c o n v e r t e d l e s s t h a n50% o f t h e i r f e c a l c h o l e s t e r o l t o c o p r o s t a n o l ,a n d t h e p e r c e n t a g e o f c h o l e s t e r o l c o n v e r t e d i na n i n d i v i d u a l w a s r e l a t i v e l y c o n s t a n t . S i n c ei n o c u l a o f f e c e s w i t h a l o w p e r c e n t a g e o f c o p r o s -t a n o l r e t a i n e d t h e i r l o w c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g

a b i l i t y i n t h e d i l u t i o n c u l t u r e s , t h e r e a s o n s f o rd i f f e r e n c e s i n c o p r o s t a n o l f o r m a t i o n i n - v i v ow o u l d s e e m t o b e r e l a t e d t o t h e b a c t e r i a l f l o r ao f a n i n d i v i d u a l r a t h e r t h a n t o d i f f e r e n c e s i nt h e c o l o n i c e n v i r o n m e n t .C h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m s f r o m l o wc o n v e r t e r s a p p e a r t o b e i n h i b i t e d b y c e r t a i nm e m b e r s o f t h e f e c a l f l o r a . E y s s e n ' s E u b a c t e -r i u m (ATCC 2 1 4 0 8 ) w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d( 5 0 % ) b y t h e m i x e d f l o r a i s o l a t e d f r o m a l o wc o n v e r t e r . O n e o r g a n i s m , t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e da s F u s o b a c t e r i u m r u s s i i , c a u s e d o v e r 40% i n -h i b i t i o n o f c o p r o s t a n o l f o r m a t i o n b y E u b a c t e -r i u m (ATCC 2 1 4 0 8 ) . Our human c h o l e s t e r o l - r e -d u c i n g i s o l a t e w a s o n l y s l i g h t l y i n h i b i t e d b y F .r u s s i i , s u g g e s t i n g t h a t t h e d i f f e r e n c e s i n t h ea m o u n t o f c o p r o s t a n o l i n t h e f e c e s o f i n d i v i d -u a l s may b e d u e t o d i f f e r i n g s u s c e p t i b i l i t i e s o ft h e c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m s t o c e r t a i na n t a g o n i s t i c b a c t e r i a o f t h e f e c a l f l o r a .T h e c h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m s a p p e a rt o b e u n i q u e l y a d a p t e d t o a s p e c i a l i z e d n i c h ei n t h e e n v i r o n m e n t o f t h e c o l o n . M o s t o t h e ri n t e s t i n a l b a c t e r i a a r e n o t c a p a b l e o f a t t a c k i n gt h e a b u n d a n t c h o l e s t e r o l o f f e c e s ; h o w e v e r , t h ec h o l e s t e r o l - r e d u c i n g o r g a n i s m s s e e m t o h a v ee v o l v e d a m e a n s o f u s i n g i t a s a t e r m i n a le l e c t r o n a c c e p t o r a s o r i g i n a l l y p r o p o s e d b y E y s -s e n e t a l . ( 8 ) . T h i s c o u l d b e a d v a n t a g e o u s s i n c ei t m i g h t a l l o w a d e n o s i n e 5 ' - t r i p h o s p h a t e t o b eg e n e r a t e d v i a a c o m p o u n d t h a t i s n o t u t i l i z e db y t h e r e s t o f t h e f e c a l f l o r a .

A C KN O W L E D G M E N T SWe e x t e n d o u r a p p r e c i a t i o n t o J . R . H a s s , C h e m i c a lS c i e n c e s B r a n c h , N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a lH e a l t h S c i e n c e s , f o r t h e g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c -t r o m e t r y d a t a .T h i s w o r k was s u p p o r t e d b y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e c o n -t r a c t N O 1 - C P 5 6 6 8 5 f r o m t h e N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e a n db y g r a n t 8 2 8 8 4 8 - 4 f r o m t h e A b e r c r o m b i e F o u n d a t i o n .

L I T E R A TU R E CIT E D1 . B a l i s h , E . , J . F . B r o w n , a n d T . D . W i l k i n s . 1 9 7 7 .T r a n s p a r e n t p l a s t i c i n c u b a t o r f o r t h e a n a er o bi c g l o v eb o x . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 5 2 5 - 5 2 7 .2 . B e r g , J . W . , M . A . H o w e l l , a n d S . J . S i l v e r m a n . 1 9 7 3 .D i et a ry h y p o t h e s e s a n d d i e t - r e l a t e d r e s e a r c h i n t h ee t i o l o g y o f c o l o n c a n c e r . H e a l t h S e r v . R e p . 8 8 : 9 1 5 -9 2 4 .3 . B u r k i t t , D . P . 1 9 7 1 . E p i d e m i o l o g y o f c a n c e r o f t h ec o l o n a n d r e c t u m . C a n c e r 2 8 : 3 - 1 3 .4 . C o l e m a n , D . L . , a n d C . A . B a u m a n . 1 9 5 7 . I n t e s t i n a ls t e r o l s . V . R e d u c t i o n o f s t e r o l s b y i n t e s t i n a l m i c r o o r -g a n i s m s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 7 2 : 2 1 9 - 2 2 5 .5 . C r o w t h e r , J . S . , B . S . D r a s a r , P . G o d d a r d , M . J . H i l l ,a n d K . J o h n s o n . 1 9 7 3 . The e f f e c t o f a c h e m i c a l l yd e f i n e d d i e t o n t h e f a e c a l f l o r a a n d f a e c a l s t e r o i dc o n c e n t r a t i o n . G u t 1 4 : 7 9 0 - 7 9 3 .6 . Dam, H . 1 9 3 4 . T h e f o r m a t i o n o f c o p r o s t a n o l i n t h ei n t e s t i n e . I I . T h e a c ti on o f i n t e s t i n a l b a c t e r i a o nc h o l e s t e r o l . B i o c h e m . J . 2 8 : 8 2 0 - 8 2 5 .7 . D r a s a r , B . S . , a n d M . J . H i l l . 1 9 7 2 . I n t e s t i n a l b a c t e r i a

V O L . 3 4 , 1 9 7 7


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3 6 2 SADZIKOWSKI, SPERRY, AND W I L K INSa n d cancer. Am. J . C l i n . N u t r . 2 5 : 1 3 9 9 - 1 4 0 4 .8 . E y s s e n , H . , G . P a r m e n t i e r , F . C . C o m p e r n o l l e , G . DeP a u w , a n d M . P i e s s e n s - D e n e f . 1 9 7 3 . B i o h y d r o g e n a -t i o n o f s t e r o l s b y E u b a c t e r i u m A T C C 2 1 , 4 0 8 - n o v aspecies. E u r . J . B i o c h e m . 3 6 : 4 1 2 - 4 2 1 .9 . H i l l , M . J . , a n d V . C . A i r e s . 1 9 7 1 . F a e c a l s t e r o i dc o m p o s i t i o n a n d i t s r e l a t i o n s h i p t o cancer o f t h el a r g e b o w e l . J . P a t h o l . 1 0 4 : 1 2 9 - 1 3 9 .1 0 . K a u c h e r , M . , H . G al br ai t h , V . B u t t o n , a n d H . H .W i l l i a m s . 1 9 4 3 . T h e d i s t r i b u t i o n o f l i p i d s i n a n i m a lt i s s u e s . A r c h . B i o c h e m . 3 : 2 0 3 - 2 1 5 .1 1 . M a c D o n a l d , E . J . 1 9 7 2 . E p i d e m i o l o g y o f c o l o n - r e c t a lcancer. C a n c e r B u l l . 2 5 : 3 3 - 4 1 .1 2 . M o o r e , W. E . C . , a n d L . V . H o l d e m a n . 1 9 7 4 . Humanf e c a l f l o r a : t h e n o r m a l f l o r a o f 2 0 J a p a n e s e - H a w a i i -ans. A p p l . M i c r o b i o l . 2 7 : 9 6 1 - 9 7 9 .1 3 . M o o r e , W. E . C . , a n d L . V . Holdeman ( e d . ) . 1 9 7 5 .A n a e r o b e l a b o r a t o r y m a n u a l , 3 r d e d . V i r g i n i a P o l y -t e c h n i c I n s t i t u t e a n d S t a t e U n i v e r s i t y , B l a c k s b u r g .1 4 . R e d d y , B . S . , a n d E . L . W y n d e r . 1 9 7 3 . L a r g e - b o w e l

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .c a r c i n o g e n e s i s : f e c a l c o n s t i t u e n t s o f p o p u l a t i o n s w i t hd i v e r s e i n c i d e n c e r a t e s o f c o l on c a n c e r . J . N a t l . C a n -c e r I n s t . 5 0 : 1 4 3 7 - 1 4 4 2 .1 5 . R o s e n h e i m , O . , a n d T . A . W e b s t e r . 1 9 4 1 . A d i e t a r yf a c t o r c o n c e r n e d i n c o p r o s t a n o l f o r m a t i o n . B i o c h e m .J . 3 5 : 9 2 0 - 9 2 7 .1 6 . S n o g - K j a e r , A . , I . P r a n g e , a n d H . Dam. 1 9 5 6 . C o n v e r -s i o n o f c h o l e s t e r o l t o c o p r o s t a n o l b y b a c t e r i a . J . G e n .M i c r o b i o l . 1 4 : 2 5 6 - 2 6 0 .1 7 . W e i s b e r g e r , J . H . 1 9 7 1 . C o l o n c a r c i n o g e n s : t h e i r m e t a b -o l i s m a n d m o d e o f a c t i o n . C a n c e r 2 8 : 6 0 - 7 0 .1 8 . W i l k i n s , T . D . , a n d A . S . H a c k m a n . 1 9 7 4 . T wo p a t t e r n so f n e u t r a l s t e r o i d c o n v e r s i o n i n t h e f e c e s o f n o r m a lN o r t h A m e r i c a n s . C a n c e r R e s . 3 4 : 2 2 5 0 - 2 2 5 4 .1 9 . W y n d e r , E . L . , T . K o j i t a n i , S . U s h i h a w a , H . D o d o ,a n d A . T a k a n o . 1 9 6 9 . E n v i r o n m e n t a l f a c t o r s o f c a n c e ro f t h e c o l o n a n d r e c t u m . C a n c e r 2 3 : 1 2 1 0 - 1 2 2 0 .2 0 . W y n d e r , E . L . , a n d T . S h i g e m a t s u . 1 9 6 7 . E n v i r o n m e n -t a l f a c t o r s o f c a n c e r o f t h e c ol on a n d r e c t u m . C a n c e r2 0 : 1 5 2 0 - 1 5 6 1 .

Cholesterol-Reducing Bacterium From Human Feces

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