Bol. Soc. Mex. Mic. 18: 141 152, 1983.

LOS HONGOS PATÓGENOS DE LA MOSCA PINTA EN MÉXICO, II.GERMINACIÓN, CRECIMIENTO Y ESPORULACION*

Por: Conchita Toriello**Laura López González**Laura Cazares Gutiérrez**Juan Manuel Hernández***Laura Sampedro****Jean Paul Latgé****

THE PATHOGENIC FUNGÍ OF THE SPITTLEBUG IN MÉXICO, II.GKRMINATION, GROWTH AND SPORULATION

SUMMARY

Taking in cunsideration the importance of the utílization of fungí in biologicalcontrol of pests and knovving the inefficiency and problems of chemical insecticides,the prescnt work has been undertaken to demónstrate the influence of differentphysical and nutrítional factors on the growth, germination and sporulation of twoEntomophthorales Erynia neoaphidis and Conidiobolus majar, fungi which in a'natural way attack predatory insects (Cercopideae) of cattle pastures: Aeneolamiaalbofasciata and Prosapia simulans commonly known as spittlebug. The resultaobtained indícate that better growth, germination and sporulation of these micro-organisms are reached in pH's cióse to 7, warm temperatures inherent to tropicalclimates (24 28°C), and simple culture médiums vvitli different sugars (glucose,maltose, fructose) and polysaccharides as carbón sources, as well as complex mixtures(yeast extract, mixtures of aminoacids) as nitrogen sources. These few nutrítionaldemanda could allow the mass production of these fungi to be accomplished easilyat a low cost for the purpose of broad distribution as biological competitors.

* El presente trabajo fue financiado en parte por el CONACyT de México(PCCBBNA-001857, otorgado a la Dra. C. Toriello), institución a la que sele expresa un reconocimiento.

** Depto. Ecología Humana, Facultad de Medicina, U.N.A.M. 04510 México,D.F.

*** Programa Nacional Contra la Mosca Pinta de los Pastos, S.A.R.H.-México,D.F.

**** Unité de Lutte Biologique Contre les Insectes, Instituí Pasteur, París, Francia.

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RESUMEN

Tomando en consideración la importancia del uso de los hongos en el control bio-lógico, dada la ineficiencia y problemas de'los insecticidas químicos, el presente tra-bajo demuestra la influencia de diversos factores físicos y nutricionales sobre el cre-cimiento, germinación y esporulación de dos EntomophthoralesJErym'a neoaphidisy Conidiobolus majar, hongos que atacan en forma natural a insectos (Cercopideac)depredadores de pastizales, tales como: Aeneolamia albofasciata y Prosapia simulans,conocidos comúnmente como mosca pinta de los pastos. Los resultados indican quelas condiciones óptimas para el crecimiento, germinación y esporulación de Eryníaneoaphidis y Conidiobolus majar se obtienen en pH cercanos a 7, temperaturas cáli-das (24-28°C), propias de clima tropical y en medios de cultivo sencillos con dife-rentes azúcares (glucosa, maltosa, fructosa) y polisacáridos como fuentes de carbo-no, así como mezclas complejas (extracto de levadura, mezclas de aminoácidos)como fuentes de nitrógeno. Conociendo estas exigencias nutricionales de los hongosse facilitará la producción en masa para su utilización en el control biológico de lamosca pinta.

INTRODUCCIÓN

Erynia neoaphidis Remaudiere et Hennebert y Conidiobolus majar (Thaxter)Remaudiere et Keller son las dos especies más importantes de Entomoftorales queatacan en formas natural a los Cercopideos Aeneolamia albofasciata y Prosapiasimulans, los cuales son insectos depredadores de los pastizales en México y cono-cidos comúnmente como "mosca pinta" o "salivazo de los pastos". Los dos hongosmencionados se encuentran en las regiones calientes y húmedas de México y consti-tuyen una posibilidad de la utilización de los Entomoftorales en el control biológico.Hasta la fecha, sólo algunos Deuteromycetes, como Metarrhizium anisopliae eHirsutella thompsonii han sido probados como un control biológico en regiones declima caliente (Burges & Hall, 1982).

La tecnología para la producción de hongos, para usarlos en el control biológicoen México, como lo discutió Latgé (1982), se basa en la formación de numerosaspequeñas unidades de producción, en donde los hongos se desarrollarían sobre ma-teriales y nutrientes sencillos y baratos, para después dispersarlos. Sin embargo, antesde la realización de estas unidades de producción, es indispensable el conocimientode todos los factores que influyen sobre el desarrollo del ciclo biológico del hongo.En el presente trabajo se muestra la influencia de diversos factores físicos y nutri-cionales sobre la germinación, el crecimiento y la esporulación de cepas de Erynianeoaphidis y Conidiobolus majar aisladas de la mosca pinta.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Cepas utilizadas.

Las cepas de E. neoaphidis (1121) y C. major (1223, 1231 y 1234) utilizadas en

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este estudio, fueron aisladas de la mosca pinta por uno de los autores (Latgé) y estándepositadas en la micotcca del Servicio de Control Biológico contra los Insectos del Ins-tituto Pasteur de París. Las cepas fueron mantenidas en el medio sólido de Sabouraud(glucosa 40 g/1, peptona 10 g/1, Agar 15 g/l), conteniendo yema de huevo (200 ml/1de Sabouraud) (MB).

2. Kstudio de la germinación.

Las conidias fueron producidas a partir de micelio desarrollado sobre medio MBy proyectadas sobre portaobjetos cubiertos de agar (10 g/1), según la técnica deSampcdro et al, (1983). Se estudiaron solamente dos factores: temperatura y ¡ > l l .Las siete temperaturas estudiadas fueron: 34.5Í0.5, 28.5t(J.5, 25+0.5, 22±1, 19Í1,15.5Í0.5, 9.5í().5°C. Los ocho medios de pll experimentados (3, 4, 5, (i, 7, 8, 9 y10) fueron obtenidos con soluciones de reguladores a una concentración de 0.02 M.Para los pll de 3 a 6 se utilizó regulador citrato-fosfato, para los pH 7 y 8 reguladorde fosfatos mono y dibásiros, para los ph 9 y 10 regulador de giicocoIa-NaOII. Secontaron 100 conidias por portaobjetos y se realizaron 6 laminillas por factor (3experiencias sucesivas). Los porcentajes de germinación (p) fueron transformadosen are sen^fp y el análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de variaiizaseguido del test Duncan (5°/o) de clasificación de medias (Duncan, 1955).

3. Estudio del crecimiento.

La influencia del pH y la temperatura se estudiaron en un medio base contenien-do 35 g de dextrosa y 10 g de extracto de levadura (DH'CO) por litro. Las siete temperaturas estudiadas fueron: 12±!>, 17.5Í0.5, 20, 24, 28Í1, 30Í1 y 35tl°C. El plldel medio se ajustó con regulador de fosfatos 0.033 M y los pH estudiados fueron

5.0, 6.0 y 7.2.

Se probaron las diferentes fuentes de carbono a 21°C en un medio sólido con lasiguiente composición de base: extracto de levadura 10 g, regulador de fosfato 0.033M pll 6.8, 1 litro. Las fuentes de carbono estudiadas fueron glucosa, fructosa, galac-tosa, manilo!, glicerol, maltosa, lactosa, rafinosa, almidón y aceite de girasol. Todasestas fuentes de carbono se ajustaron a una concentración de 8.0 g de carbono porlitro. No se probó la sacarosa pues no es metabolizada por los Entomoftorales

(Latgé, 1975a).Las diferentes fuentes de nitrógeno se estudiaron a 21 °C sobre un medio sólido

con los siguientes componentes: glucosa 20 g, regulador de fosfatos 0.033 M ph 6.8,vitaminas 1 g (suplemento vitamínico NBCo), agua destilada 1 litro. Las fuentes denitrógeno fueron: oxalato de amonio, extracto de levadura (DIKCO), neopeptona(DffCO), casaminoácidos (DIFCO), leucina, metionina, prolina, valina, arginina, ácidoaspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, glicocola y una mezcla de 19 ami-noácidos de concentración equivalente. Todos los aminoácidos utilizados provinie-ron de MERCK. Al medio base se le agregaron todas las fuentes de nitrógeno a unaconcentración de 1.0 g/1. No se ensayaron los nitratos puesto que no son uti l izadospor los F.nlomoftorales, como lo demostró Latgé (1975b).

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La influencia de diferentes sales se estudiaron a 21°C en un medio de base quecontenía: glucosa 20 g, hidrolizado de rasei'na libre de sales y vitaminas (NBCo) 10 g,MgSC>4 0.5 g y regulador de fosfatos 0.033 M ph 6.8. Se hicieron dos ensayos, unocon el medio base sin sales y el otro con las sales siguientes: MgSO^TI^O (500 mg/ml),ZnSO4 .7H2O (50 mg/I), CaCl2 . 7H2O (100 mg/1), FeSÜ4 (20 mg/l),CuSO4 .5H2O(4 mg/1) y MnClg . 4H2O (2 mg/1) y la influencia de vitaminas sobre el crecimientose probó a 21°C en un medio de base conteniendo: glucosa 20 g, hidrolizado de ca-seína libro de sales y vitaminas (NBCo) 10 g, MgSO4 0.5 g y regulador de fosfatos0.033 M ph 6.8, ] litro. La solución de vitaminas contenía: biotina (10~9), y ácidonicoti'nico, inositol, piridoxina, ácido pantoténico y tiamina, a la concentración de10-6.

La influencia de diferentes concentraciones de carbono (C) y nitrógeno (N) asícomo de la relación C/N se estudió a 21°C en un medio de dextrosa (fuente de car-hono) y de extracto de levadura (fuente de nitrógeno). Se realizaron dos series demedios de cultivo. Por una parte, cuatro concentraciones variables de extracto delevadura (5, 10, 20 y 40 g/1) se mezclan con una misma concentración de dextrosa(20 g/1) y por otro lado se utilizan 5 concentraciones variables de dextrosa (5, 10,20, 40 y 80 g/1) con una sola concentración de extracto de levadura (10 g/1).

Los medios sólidos con agar (15 g/1) se distribuyeron en cajas de Petri de 5 cm dediámetro. F.l inoculo fue un fragmento miceliar de 5 mm de diámetro, desarrolladosobre un medio de dextrosa (35 g/1) extracto de levadura (10 g/1). El crecimiento sedeterminó midiendo el diámetro del talo fúngico diariamente en 5 cajas de Petri porparámetro. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de varianza seguidodel test Duncan (5°^>) de clasificación de medias (Duncan, 1955).

4. Estudio de la esporulación.

Los cultivos desarrollados sobre los diferentes medios utilizados para el crecimien-to, se usaron asimismo para estudiar la capacidad del micelio para producir conidias.Con este propósito, se separó un fragmento de micelio de 2.5 cm de diámetro delmedio de cultivo y se depositó sobre una caja de plástico del mismo diámetro, en lasuperficie de un papel de celulosa (6 hojas), humidificadas con 0.2 a 0.3 mi de agua.Después de una noche a-»- 4°C, la caja se invirtió sobre un portaobjetos donde las co-nidias se proyectaron durante 4 horas. Se estimó entonces el número de esporas con-tando todas las conidias en un campo microscópico de 8.9 mm2 en cinco lugaresdiferentes del portaobjetos. Todas las muestras se hicieron por triplicado o quintu-plicado.

Debido a la gran variabilidad observada en los resultados de la esporulación deE. neoaphidis y sobre todo de C. major, se hizo la siguiente escala de apreciación:

De O - 10 conidias proyectadas en 4 hrs +De 10 - 100 conidias proyectadas en 4 hrs4 +De 100 " " • • " " - ) - 4 - +

RESULTADOS

1. Influencia de la temperatura y el pH sobre la germinación, el crecimiento y la es-

144

porulación.

Las conidias de £,'. neoaphidis y C. major germinan fácilmente en presencia deagua y condiciones óptimas, después de tiempos muy cortos de incubación (2 hparaC. major y 4 h para E. neoaphidis). No se necesita ningún nutriente para obteneruna germinación elevada. Entre 4 y 9, el pH no tiene ninguna influencia sobre lacapacidad germinativa de las dos especies (Tabla 1). Sin embargo los pH ácidos (£5)o básicos (~8) inliilK-n parcialmente el desarrollo de las dos especies; los valores depli entre 6 y 7 permiten el mejor crecimiento (Tabla 2). Las condiciones óptimas detcm[>eratura son iguales para la germinación, crecimiento y esporulación de C. majar(28"C), siendo ligeramente más elevada que la de la cepa de E. neoaphidis (24°C)(Tablas I y 2).

TABLA 1

INFLUENCIA DK LA TEMPERATURA Y EL pH SOBRE LA GERMINACIÓN DEErynia neoaphidis ( 1 1 2 1 ) y de Conidiobolus major ( 1 223)

Germinación (°/o)E. neoaphidis C. majar

(4h )* (2h)* (3h)*

Temperatura "C

9.510.5I5.5Í0.5I í) * 1T2Í 12510.528.5+0.534.510.5

6 (e)**58 (c)85 (a)78 (a)80 (a)71 (b)18(d)

0(f)Me)

10(d)32 (c)56 (b)94 (a)

0 ( f )

0(d)24 (c)78 (b)94 (a)99 (a)96 (a)0(d)

pH3456789

10

0(c)39 (b)59 (a)53 (a)66 (a)52 (a)44 (a)33 (b)

0(c)90 (b)

100 (a)100 (a)100 (a)100 (a)

97 (a)NE

* Tiempo de germinación en horas.** Las letras iguales entre paréntesis indican que los porcentajes no difieren signifi-

cativamente según el test Duncan (5°A>) de clasificación de medias.NE No efectuado.

145

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146

2. Influencia de los nutr ientes sobre el crecimiento y la esporulación.

a) Fuentes de carbono.E. neoaphidis y C. majar no presentan exigencias absolutas en azúcares y fueron

capaces de mctabolizar un gran número de fuentes de carbono. Las fuentrs que per-mitieron el mejor crecimiento y esporulación para las dos especies fueron: glucosa,fructosa, maltosa y almidón (Tabla 3). La galactosa, pareció más favorable a la espo-rularión que para el crecimiento. Por otro lado, aunque el crecimiento de estos hon-gos esté bastante extendido en los medios con lactosa, en realidad es un crecimientopobre, puesto que la masa miceliar es muy difusa.

b) I''uenles de nitrógeno.Las fuentes de nitrógeno más favorables al crecimiento (hidroli/ados de proteína

o mezcla compleja de aminoácidos) permitieron también una mejor esporulación,con excepción de la neopcptona (Tabla 4). El menor crecimiento y esporulación seobservó cuando se utilizaron aminoácidos por separado o sales de amonio (Tabla 4).

c) Sales minerales y vitaminas.Las vitaminas favorecieron el crecimiento de E. neoaphidis mientras que las sales

minerales no tuvieron ninguna influencia sobre este hongo (Tabla 5). Un experimenlo posterior demostró que cuando las vitaminas son ensayadas por separado, no esti-mulan el crecimiento. Por lo tanto, se necesitó un complejo de v i t a m i n a s para asegu-rar el buen crecimiento de estas especies. Los resultados irregulares obtenidos en laesporulación no permiten una interpretación estadística. A pesar de eso, la esporula-ción parece similar en los diferentes medios.

d) Diferentes concentraciones de fuentes de carbono y nitrógeno.El crecimiento de los hongos estudiados fue proporcional a la concentración del

extracto de levadura. Sólo una concentración de extracto de levadura de 40 g/l inh i -bió fuertemente el crecimiento de C. majar (Tabla 6).

Las diferentes concentraciones de glucosa, ensayadas entre 5 y 80 g/I, no demostraron tener influencia en el crecimiento de E. neoaphidis, mientras que las altasconcentraciones de dextrosa inhibieron el desarrollo de C. majar; sin embargo, des-pués de 18 días, el crecimiento de C. majar llega hasta los bordes de la caja de Petriindependientemente de la concentración de dextrosa utilizada; los medios de cul t ivoque tenían la mayor concentración de dextrosa exhibieron una colonia plisada loque representa un crecimiento cuantitativamente más elevado que una colonia lisa.Por lo tanto, concentraciones elevadas de dexlrosa de 80 g/l permitieron un desarro-llo más importante del hongo, que bajas concentraciones de este azúcar.

La esporulación fue proporcional al crecimiento en Erynia neoaphidis. Las con-centraciones altas de dextrosa fueron desfavorables en la obtención de una buenaconidiogénesis de E. neoaphidis, mientras que para C. majar todos los medios u t i l i -zados en este experimento produjeron una conidiogénesis similar.

DISCUSIÓN

Entre las diferentes cepas de C. majar (1223, 1231 y 1234) estudiadas no sr en

147

TABLA 3

INFLUENCIA DE DIFERENTES FUENTES DE CARBONO SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA ESPORULACION DEErynia neoaphidis (1121) y Conidiobolus majar (1231 y 1234).

Fuentes decarbono

~(8 g C/l)

GlucosaGalactosaFructosaManitolGlicerolMaltosaLactosaRafinosaAlmidónAceite de tornasol

CrecimientoE. neoaphidis

(8d)«x+DS**

50ÍO (a)***44±4(b)50+ 0 (a)37+3 (b)39Í6 (b)47+3 (a)NENE45± 0 (a)NE

(mm)C. majar(4d)*

xÍDS**

49 ±1 (a)36 + 4 (c)49± 2 (a)NE36+ 1 (c)46 + 4 (a)48± 2 (a) °40+4 (b)40+ 5 (b)25+ 7 (d)

Esporul aciónE. neoaphidis C.

+ + ++ + ++ + ++

+ + +

•f +4-

NENE+ + +NE

majar

4.

+ +

+ +

NE•f+NENE+NE

* Tiempo de crecimiento (d - días)** n=10

*** Las letras iguales entre paréntesis indican que los valores no difieren significativamente según el test Duncan (5^) declasificación de medias.

NE No efectuadoo Crecimiento muy poco denso

TABLA 4INFLUENCIA DE FUENTES DE NITRÓGENO SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA ESPORULACION DE

Erynia neoaphidis (1121) y C. majar (1231 y 1234)

Fuentes denitrógeno

(1 g/D

Oxalato NH4LeucinaMetioninaProlinaValinaArgininaAc. aspar ticoAc. glutámico

Aspar agina

GlutaminaGlicinaMezcla de 1 9 am. ac.CasaminoácidosNeopeptonaExtracto de levadura

CrecimientoE. neoaphidis

(14 d)*;+DS**

13±1 (d)***13 ±3 (d)1 8 ± l ( c )12+1 (d)13±3 (d)13+0 (d)8 + 1 (d)13Í2(d)13 ±1 (d)11+1 (d)14 + 3 (d)50+0 (a)43+ 3 (b)50+0 (a)50±0(a)

(mm)C. majar(13 d)*

x+DS**

15+1 (d)NENEXENE15+0 (d)10+0(d)10+1 (d)21+4 (c)13 + 2 (d)15±2(d)42+1 (b)45 ±2 (b)50±0 (a)50±0 (a)

tsporulaciónE. neoaphidis C.

-r

+

•f

-f

+

-u-

t

-t-

+

+

+

t

•f

•1--H-

major

+NF.NENF.NF.++-+

+•*•++••V

++-H-

* Tiempo decrecimiento (d=di'as)** n=10

*** Las letras iguales entre paréntesis indican que los valores no difieren significativamente según el test Duncan (5°/b) declasificación de medias.

NE No efectuado.

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TABLA 6

INFLUENCIA DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE DEXTROSA Y EXTRACTO DE LEVADURA SOBRE ELCRECIMIENTO Y ESPORULACION DE E. neoaphidis (1121) y C. majar (1234)

Concentracionesdextrosa

(g/1)

80808080

510204080

extracto delevadura

(g/1)

5102040

1010201010

Crecimiento£. neoaphidis

(14 d)*xÍDS**

19+9 (b)***21±1 (b)50±1 (a)50± 1 (a)

32±22 (a)42±3 (a)38Í11 (a)45±0 (a)15±3 (b)

(mm)C. majar(18d)*

x±DS**

38±0 (b)50± 0 (a)50±0(a)6 ± 0 (c)(11 d)50 ±0 (a)50±0(a)35±9 (b)17±1 (c)13±1 (d)

(18d)50+0 (a)50± 0 (a)50Í 0 (a)50± 0 (a)50±0 (a)

EsporulaciónE. neoaphidis C. majar

+ ^+ ++ + -f-+ + +

+ + + ++ + + t+ + 4- +

+ + + +

+

* Tiempo de crecimiento (d-días)** n=10

*** Las letras iguales entre paréntesis indican que los valores no difieren significativamente según el test Duncan (5°/o) declasificación de medias.

LITERATURA CITADA

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