av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin · 2017. 12. 7. · V Sammendrag For...

I

Parallel artificial liquid membrane extraction

av et basisk legemiddel og dets polare

metabolitter fra urin

Patryk Oskar Grafinski

Masteroppgave ved avdeling for farmasøytisk kjemi

Faggruppen for legemiddelanalyse

45 studiepoeng

Farmasøytisk institutt

Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet

UNIVERSITETET I OSLO

Mai/2017

III

Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets

polare metabolitter fra urin

Veiledere:

Stig Pedersen-Bjergaard

Professor ved seksjon for farmasøytisk kjemi


Universitetet i Oslo

Astrid Gjelstad

Førsteamanuensis ved seksjon for farmasøytisk kjemi



Kristine Skoglund Ask

Stipendiat ved seksjon for farmasøytisk kjemi



IV

© Patryk Oskar Grafinski

2017

Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets polare

metabolitter fra urin

Patryk Oskar Grafinski

http://www.duo.uio.no

Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo

V

Sammendrag

For første gang ble det vist at parallel artificial liquid membrane extraction (PALME) var i

stand til å ekstrahere et basisk legemiddel og tilhørende metabolitter med store forskjeller i

polaritet (-1.2 < log P < 2.5) fra urin i ett prøveopparbeidelsestrinn. Modellsubstansene i dette

prosjektet var legemidlet venlafaksin med tilhørende metabolitter, hvorav to av disse var

glukuronider med zwitterioniske egenskaper.

PALME ble utført fra kommersielle 96-brønnsplater. Modellsubstansene ble ekstrahert fra

alkalisk urinprøve (donorfase), gjennom en supported liquid membrane (SLM) av organisk

løsningsmiddel immobilisert i en porøs membran av polyvinylidenfluorid (PVDF), og inn i sur

vandig akseptorfase. Etter ekstraksjon ble akseptorfasen analysert direkte med ultra-high

performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS).

Optimalisering av ekstraksjonsbetingelser fokuserte i stor grad på den kjemiske

sammensetningen av fasene i PALME. Donorfasen besto av 125 µl urinprøve som ble justert

med 115 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer med pH 10.5 og 10 µl intern standard

(venlafaksin-D6 hydroklorid). SLM hadde et volum på 4 µl. Den var sammensatt av et helt nytt

organisk løsemiddel i PALME sammenheng, tripentylfosfat, som ble blandet sammen med 25%

av en bæremolekylløsning, Aliquat 336. Aliquat 336 er en teknisk blanding av alkylerte

ammoniumklorider med trioktylammoniumklorid som hovedkomponent. Akseptorfasen var 50

µl av en 20 mM maursyreløsning. Ekstraksjoner foregikk i 45 min og ble fremmet av et orbitalt

ristemønster med en hastighet på 900 rpm.

Metoden gjennomgikk en evaluering basert på retningslinjer fra de europeiske

legemiddelmyndighetene (EMA) der både intra- og interdaganalyse ble gjennomført.

Korrelasjonskoeffisienter (r2) for linearitet hadde verdier mellom 0.98 og 0.99. Over 90% av

resultatene fra evalueringen oppfylte krav med hensyn på presisjon og nøyaktighet. Det ble ikke

observert overdrag i systemet.

Resultatene bekreftet potensialet av PALME og åpnet veien for ytterligere applikasjoner med

polare analytter eller analytter innenfor et betydelig polaritetsvindu.

VI

Forord

Hei Kristine, Astrid og Stig.

Valideringsresultater vises i tabellen under.

Veiledningsvalidering

Oppfølging (r2) 1

Presisjon og nøyaktighet av

tilbakemeldinger

Alle QC godt innenfor krav

Tilgjengelighet over tid Stabilt på svært høyt nivå

Tilbakemeldingstid Svært kort

Overdrag av negative følelser eller andre

uønskede effekter

Aldri observert

Konklusjon: Valideringsresultater bekrefter ypperlig kvalitet av data. Det er derfor høyst

nødvendig å takke for den hyggelige og spennende tiden jeg hadde på legemiddelanalyse siden

det er vel fortjent. Tusen takk skal dere ha!

Dere som alltid er «alle andre på avdelingen», Cecilie, Trine, Øystein, Leon, Chuixiu, Elisabeth,

Inger, Marthe, Linda, Magnus og Maren takk for den trivelige tiden vi hadde sammen.

Clarissa og Ida, det var gøy og vet dere hva deres navn slutter på a - what a coincidence.

Elin Vyvy det ville vært altfor kjedelig og altfor stille uten deg.

Gladys 我的朋友，你是个非常独特人，非常荣幸认识你。

Så er det deg Bassem. Du gjorde de fem siste årene helt topp. Jeg kunne ha skrevet veldig mye

om deg og det ville ha vært kun positive ting. Jeg tror at å kalle deg for en bror fra en annen

mor oppsummerer alt.

Mamma, pappa TAKK!

Det er fint å bli ferdig men det var mange kule mennesker, mye lek på laben og med skrivingen

så det er også trist. Vel, jeg har i hvert fall kjennskap til venlafaksin… 😉

Oslo, mai 2017

Patryk

VII

Innholdsfortegnelse Forkortelser ................................................................................................................................ 1

1. Innledning ........................................................................................................................... 4

1.1. Bakgrunn ..................................................................................................................... 4

1.2. Hensikt ......................................................................................................................... 6

2. Teori .................................................................................................................................... 7

2.1. Analytter og matriks .................................................................................................... 7

2.1.1. Venlafaksin og dens metabolitter ......................................................................... 7

2.1.2. Urin som biologisk matriks .................................................................................. 8

2.2. Prøveopparbeidelse ...................................................................................................... 9

2.2.1. Væske-væske ekstraksjon .................................................................................... 9

2.2.2. Væske-fase mikroekstraksjon ............................................................................ 11

2.2.3. Parallel artificial liquid membrane extraction .................................................... 12

2.3. UHPLC ...................................................................................................................... 14

2.4. MS ............................................................................................................................. 17

2.4.1. Elektrospray-ionisering ...................................................................................... 18

2.4.2. To-dimensjonal ionefelle .................................................................................... 18

3. Materialer og metoder ....................................................................................................... 20

3.1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter ............................................................. 20

3.2. Utstyr ......................................................................................................................... 20

3.3. Kjemikalier ................................................................................................................ 23

3.4. Løsninger og buffere ................................................................................................. 26

3.4.1. Tillaging av buffere ............................................................................................ 26

3.4.2. Løsninger ............................................................................................................ 28

3.4.3. Stamløsninger ..................................................................................................... 30

3.4.4. Arbeidsløsninger ................................................................................................ 30

3.4.5. Standarder ........................................................................................................... 30

3.4.6. Internstandard ..................................................................................................... 30

3.4.7. Biologisk matriks ............................................................................................... 31

3.4.8. Mobilfaser .......................................................................................................... 31

3.5. Instrumentelle betingelser .......................................................................................... 31

3.5.1. UHPLC ............................................................................................................... 31

3.5.2. MS/MS ............................................................................................................... 32

3.6. Utførelse av PALME ................................................................................................. 33

3.6.1. Vandige prøveløsninger ..................................................................................... 33

VIII

3.6.2. Biologiske prøveløsninger .................................................................................. 35

3.7. Utvelgelse av SLM .................................................................................................... 36

3.8. Optimalisering av ekstraksjonen ............................................................................... 37

3.8.1. Optimalisering av organisk fase ......................................................................... 37

3.8.2. Optimalisering av mengden til ionisk bærer ...................................................... 38

3.8.3. Optimalisering av buffer pH i donorfasen .......................................................... 38

3.8.4. Optimalisering av styrken i akseptorfasen ......................................................... 39

3.8.5. Optimalisering av ekstraksjonstid ...................................................................... 39

3.8.6. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen .................................................... 39

3.9. Evaluering av metoden .............................................................................................. 39

3.9.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense ........................................... 39

3.9.2. Linearitet ............................................................................................................ 40

3.9.3. Overdrag ............................................................................................................. 40

3.9.4. Presisjon og nøyaktighet .................................................................................... 40

3.9.5. Matrikseffekter ................................................................................................... 40

3.9.6. Ekstraksjonsutbytte ............................................................................................ 41

3.10. Beregninger ............................................................................................................ 41

4. Resultater og diskusjon ..................................................................................................... 42

4.1. Innledende forsøk ...................................................................................................... 42

4.1.1. Utvelgelse av SLM – del 1 ................................................................................. 42



4.1.4. Testing av pH-betingelser i donorfasen.............................................................. 48



4.1.7. Utvelgelse av SLM ved samtidig testing av utvidede pH-betingelser i

donorfasen – del 6 ............................................................................................................. 53

4.1.8. Utvelgelse av ionisk bærer ................................................................................. 55

4.1.9. Testing av ulike løsemidler og styrker i akseptorfasen ...................................... 57

4.2. Optimaliseringsforsøk ............................................................................................... 59

4.2.1. Optimalisering av SLM ...................................................................................... 59

4.2.2. Optimalisering av buffer pH i donorfasen .......................................................... 61

4.2.3. Optimalisering av styrken i akseptorfasen ......................................................... 63

4.2.4. Optimalisering av ekstraksjonstid ...................................................................... 65

4.2.5. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen .................................................... 67

IX

4.2.6. Testing av motioner ............................................................................................ 69

4.3. Evaluering .................................................................................................................. 70

4.3.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense ........................................... 70

4.3.2. Linearitet ............................................................................................................ 70

4.3.3. Overdrag ............................................................................................................. 73

4.3.4. Presisjon og nøyaktighet .................................................................................... 73

4.3.5. Matrikseffekter ................................................................................................... 75

4.3.6. Ekstraksjonsutbytte ............................................................................................ 75

5. Konklusjon ........................................................................................................................ 77

6. Referanseliste .................................................................................................................... 79

7. Appendix ........................................................................................................................... 83

1

Forkortelser

A336 Aliquat 336

Arb Arbitrary units

C18 Oktadecyl

Cl Klor

CYP450 Cytokrom P450

DBPi Dibenzylfosfitt

DCMA Dodecyltrimetylammoniumbromid

DMSO Dimetylsulfoksid

EMA European Medicines Agency

EME Electromembrane extraction (Elektromembranekstraksjon)

ESI Elektrospray-ionisering

HCl Hydrogenklorid

HCOOH Maursyre

HEPT Høydeekvivalenten til en teoretisk plate

HF-LPME Hollow-fiber liquid phase microextraction

HPLC High-pressure liquid chromatography

K Kalium

LC Liquid chromatography (Væskekromatografi)

LIT Linear ion trap (Lineær ionefelle)

LLE Liquid-liquid extraction (Væske-væske ekstraksjon)

LOD Laveste deteksjonsgrense

LOQ Laveste kvantifiseringsgrense

LPME Liquid-phase microextraction (Væske-fase mikroekstraksjon)

2

m/z Masse over ladning

MS Mass spectrometry (Massespektrometri)

MS2 Tandem massespektrometri

Na Natrium

NaCl Natriumklorid

NaOH Natriumhydroksid

NDV N-desmetyl venlafaksin

NNDODV N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin

NNDODVGLU N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin glukuronid

NODV N,O-didesmetyl venlafaksin

NODVGLU N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid

NPOE 2-nitrofenyloktyleter

ODV O-desmetyl venlafaksin

PALME Parallel artificial liquid membrane extraction

PVDF Polyvinylidenfluorid

QC-prøve Kvalitetskontrollprøve

r2 Korrelasjonskoeffisient

RF Radiofrekvens

rpm Omdreininger per minutt

RSD Relativt standardavvik

SDME Single drop microextraction

SLE Supported liquid extraction

SLM Supported liquid membrane

SNRI Serotonin-noradrenalin reopptakshemmer

3

SPE Solid phase extraction (Fast-fase ekstraksjon)

SRM Selected reaction monitoring

TBAP Tetrabutylammoniumfosfat

TBP Tributylfosfat

TDA Tetradecylammoniumbromid

TEAB Tetraetylammoniumbromid

TEHP Tris(2-etylheksyl)fosfat

TEHPi Tris(2-etylheksyl)fosfitt

TFA Trifluoreddiksyre

TIOPi Triisodecylfosfitt

TOA Trioktylamin

TPP Tripentylfosfat

UDPGT UDP-glukuronosyltransferase

UHPLC Ultra-high-pressure liquid chromatography

V Volt

VEN Venlafaksin

Å Ångstrøm

4

1. Innledning

1.1. Bakgrunn

Det er et stort behov for å måle legemidler, dopingmidler, narkotiske stoffer eller deres

metabolitter i biologiske væsker som blod, urin eller spytt. Nytten av slike målinger er spesielt

synlig i terapeutisk legemiddelmonitorering, dopingkontroll eller rettstoksikologi. Slike

målinger kan også ha høy relevans i legemiddelutvikling (drug discovery). Formålet med dem

er å identifisere og bestemme konsentrasjonen av de nevnte stoffgruppene (1).

Utfordringen er ofte en altfor kompleks sammensetning av matriks som forhindrer direkte

injeksjon av prøven i det analytiske instrumentet. Faren for forurensing av instrumentet eller

oppnåelse av unøyaktige resultater skaper behovet for et foregående trinn. Det er kjent som

prøveopparbeidelsestrinnet. Dets hovedformål er å gjøre prøven kompatibel med etterfølgende

separasjon og deteksjon (1, 2).

De veletablerte teknikkene som væske-væske ekstraksjon (liquid-liquid extraction: LLE) og

fast-fase ekstraksjon (solid phase extraction: SPE) er fortsatt mye brukt.

Ekstraksjonsmekanismene er godt kjent og begge har mange anvendelsesområder (1, 3).

Automatiseringspotensial, mindre prøvevolumer samt løsemiddel forbruk og forbedret

tidseffektivitet var faktorer som initierte interessen for å miniatyrisere teknikkene. LLE ble

videreutviklet til væske-fase mikroekstraksjon (liquid-phase microextraction: LPME) (4, 5).

Hollow-fibre liquid phase microextraction (HF-LPME) er en form av LPME som ble

introdusert på slutten av 1990-tallet (6). Den teknikken kan opereres i et tre-fase system som

gir muligheten for en selektiv ekstraksjon av analytter fra den vandige donorfasen via supported

liquid membrane (SLM) med organisk fase til den vandige akseptorfasen. Donorfasen

inneholder prøven mens akseptorfasen er løsningen som kan injiseres direkte i LC-MS (7).

Utfordringer knyttet til automatisering av den sistnevnte teknikken førte til utvikling av parallel

artificial liquid membrane extraction (PALME) som i stor grad ligner på HF-LPME (8).

PALME er konstruert av to 96-brønnsplater som klemmes sammen under ekstraksjon. Den ene

kalles for donor- mens den andre for akseptorplaten og inneholder henholdsvis donor- og

akseptorfasen. De separeres fra hverandre med en flat SLM som forsegler bunnen av

akseptorplaten (8). Ekstraksjonsprinsippet baseres på diffusjonen av analytter fra donorfasen

via SLM til akseptorfasen. Prosessen fremmes blant annet av riktig pH-justering som påvirker

distribusjonskoeffisienter og risting av platene. Det organiske løsemiddelforbruket i PALME

overskrider vanligvis ikke 500 µl for 96 prøver. Analytter, som for eksempel legemiddelstoffer,

5

i biologiske prøver med et volum på opptil 250 µl kan ekstraheres ved bruk av PALME (8). En

av de store fordelene med PALME er akseptorfasen som er kompatibel med LC-MS.

Fordampning av løsemiddel og gjenoppløsning i mobilfase før LC er således ikke nødvendig

(8).

Publikasjonen hvor PALME ble introdusert bekreftet at denne teknikken var egnet for

ekstraksjoner av hydrofobe basiske legemidler som petidin, nortriptylin, metadon og

haloperidol (8). De etterfølgende studier utvidet applikasjonsområdet med sure legemidler og

viste at PALME hadde potensialet for å rense plasmaprøven opp fra fosfolipider (9, 10). I nylig

publiserte artikler ble PALME benyttet for ekstraksjoner av analyttblandingen som besto av

nye psykoaktive substanser og polare legemiddelstoffer (11, 12). I den sistnevnte studiens

hadde de basiske legemidlene log P-verdier mellom 1.3 til -0.29. Deres ekstraksjonsutbytter var

mellom 50 og 89% (12). Disse studiene benyttet plasma eller fullblod som matriks og de

benyttede analyttene var stort sett upolare forbindelser med log P>2 (8, 9, 11, 12). I denne

masteroppgaven ble det benyttet en analyttblanding som hadde et bredere spekter av fysikalsk-

kjemiske egenskaper i forhold til tidligere forskningsprosjekter. Analyttene omfattet således

legemidlet venlafaksin (log P = 2.5), som var modersubstansen, og en rekke polare metabolitter.

Disse inkluderte glukuronidene (log P = -1.2) som var de mest polare analyttene med amfotære

egenskaper. Plasma og fullblod som matriks ble erstattet med urin.

Polare metabolitter og særlig glukuronider er vanskelige å ekstrahere via SLM. Grunnen til

dette er deres begrensede fordeling over i SLM (12). I et tidligere studie med HF-LPME ble det

benyttet bæremolekyler i SLM for å fremme ekstraksjonen av polare legemidler der atenolol

med log P på 0.01 var det mest hydrofile stoffet (13). Akseptorfasen besto av 50 mM HCl som

ikke var det optimale løsemidlet for LC-MS på grunn av lav pH. En annen publikasjon relaterte

til HF-LPME som studerte ekstraksjon av tre tetrasykliner som hadde log P-verdier mellom -

1.3 og -3.6 (14). Disse legemidlene hadde i likhet med glukuronider zwitterioniske egenskaper.

Ekstraksjon ble oppnådd med bruk av NaCl i akseptorfasen som ble etterfulgt av HPLC-UV

deteksjon, men i kombinasjon med LC-MS er dette systemet lite attraktivt. I tillegg tyder

tendenser på at ultra-high-pressure liquid chromatography (UHPLC) koblet med et

massespektrometer (MS) får enda større betydning i de kommende årene (15). Grunnen til det

er at UHPLC er en kostands- og tidseffektiv separasjonsmetode mens MS klarer å operere med

lavere konsentrasjonsnivåer og høyere selektivitet i forhold til andre deteksjonsteknikker (1).

Få HF-LPME studier har beskrevet ekstraksjoner av analyttblanding som ligner på den fra

denne studien ved samtidig bruk av LC-MS/MS. I en av dem ble østron, østradiol og

6

etinyløstradiol ekstrahert med tre tilhørende glukuronider. Denne analyttblandingen hadde log

P-verdier mellom 1.1 og 4.2 (16). De var dermed to enheter høyere i forhold til dette prosjektet.

Akseptorfasen besto i tillegg av høykonsentrert saltløsning. Det skapte dermed kompatibilitet

utfordringer med MS (16).

1.2. Hensikt

Som nevnt ovenfor, fokuserte de tidligere PALME forskningsprosjektene i stor grad på

blandinger av forholdsvis upolare legemidler eller narkotiske substanser. Det er også få HF-

LPME publikasjoner i dette tema. Hensikten med dette prosjektet var å utvide

applikasjonsområdet til PALME. Det var ønskelig å undersøke om denne teknikken kunne

ekstrahere enda mer polare analytter som i tillegg hadde amfotære egenskaper. Fokuset ble lagt

på ekstraksjoner av modersubstansen og de tilhørende metabolittene fra biologisk matriks for å

etterligne en reel situasjon. Ekstraktene skulle videre analyseres ved hjelp av UHPLC-MS/MS.

Dette konseptuelle arbeidet ble avsluttet med evaluering. Den hadde som formål å bekrefte

kvaliteten av data.

Hensikten med dette prosjektet oppsummeres i den punktvise oversikten:

• Utvikle en UHPLC-MS/MS-metode for identifikasjon og kvantifisering av analyttene

• Undersøke om PALME er egnet for ett-trinnsekstraksjon av et basisk legemiddel og

dets metabolitter med et bredt spekter av fysikalsk-kjemiske egenskaper

• Forbedre ekstraksjonen ved testing av ulike organiske løsemidler i SLM

• Optimalisere ekstraksjonsbetingelser for PALME fra urin

• Utføre evaluering av metoden

7

2. Teori

2.1. Analytter og matriks

2.1.1. Venlafaksin og dens metabolitter

Venlafaksin er en serotonin-noradrenalin reopptakshemmer (SNRI). Virkningen påvirker

hovedsakelig nevrotransmitterne serotonin og noradrenalin som blir værende i den synaptiske

spalten for lengre tidsperioder slik at signaloverføringen mellom nervene blir forbedret.

Venlafaksin er et legemiddel som brukes ofte ved behandling av depresjoner og angst (17, 18).

De terapeutiske dosene i plasma varierer mellom 100 og 400 ng/ml. De blir optimalisert

individuelt med hensyn til indikasjon og type pasient (19).

Venlafaksin er et basisk legemiddel på grunn av tertiært amin i sin struktur, som metaboliseres

i kroppen. Strukturen av venlafaksin og dens metabolitter er vist i figur 1. Cytokrom P450

(CYP450) systemet er en gruppe enzymer som er involvert i stor grad i de første trinnene av

denne prosessen. Disse enzymene finnes i stort omfang i hepatocytter (20). Enzymet CYP2D6

spiller en avgjørende rolle i metabolismen av venlafaksin selv om 3A4 og 2C19 også er

involvert. Individuelle genetiske variasjoner kan bidra til forandringer i metabolismeaktiviteten.

CYP450 demetylerer venlafaksin og gjør den dermed mer polar (17, 20). Metabolitter fra fase

I viser mindre potent farmakologisk effektivitet, der den mest virksomme er O-

desmetylvenlafaksin (18). De metaboliseres videre ved hjelp av UDPGT enzymer i fase II

metabolisme til glukuronider. Disse er enda mer polare forbindelser som i tillegg får amfotære

egenskaper (17). Over 90% av venlafaksin og dens metabolitter skilles ut med urinen (18).

8

Figur 1 Metabolismen av venlafaksin (17, 21)

2.1.2. Urin som biologisk matriks

Urin er et eksempel på en biologisk matriks. Den er enklere å samle opp enn blod, og

sammensetningen er mindre utfordrende. Det er ingen fosfolipider, og forekomsten av proteiner

er vanligvis svært liten. Det skyldes filtreringen i nyrene. I tillegg er den tilgjengelig i større

volumer (22). Til tross for enklere sammensetning av urin, som i hovedsak består av vann, urea,

kreatinin, ioner og en rekke organiske forbindelser, er den fortsatt uegnet for direkte injeksjon

i de fleste analytiske instrumentene som eksempelvis LC-MS (22, 23).

Venlafaksin

↙ ↘

NDV ODV

↘ ↙

→

NODV NNDODV

↙ ↓

NODVGLU NNDODVGLU

9

Urin kan forårsake matrikseffekter som enten øker eller undertrykker signalet i LC-MS fra

analytten når retensjonstiden er tilnærmet lik (2). Forandret desorpsjon av ioner i ionekilden,

eller konkurranse om ladninger er mulige forklaringer for slike effekter i massespektrometre

(1). Fortynningsgraden av urinen kan ha en viss effekt i denne prosessen. Kreatinin, som ofte

blir brukt i målinger av fortynningsgrad, gir ikke alltid pålitelige resultater (2). Stor variasjon i

betingelser mellom de ulike urinprøvene er også en utfordring ved måling av analytter.

Ionestyrken og pH er faktorer som raskt kan påvirkes av forandret kosthold eller væskeinntak

(1). Den store variabiliteten kan ha negative konsekvenser for nøyaktigheten av kvantitative

målinger.

2.2. Prøveopparbeidelse

Som nevnt ovenfor kan noen biologiske væsker ha en altfor kompleks sammensetning som

umuliggjør direkte injeksjon i det analytiske instrumentet. Det er derfor viktig å ha et trinn som

isolerer ønskede analytter og klargjør dem for analysen (1, 4). Prøveopparbeidelsestrinnet kan

enten fjerne de uønskede komponentene eller isolere analytter. Det er et viktig trinn i

analyseprosessen som bidrar til å minimere matrikseffekter på en mest mulig effektiv måte og

å hindre kontaminering av instrumentet. Opprensning av prøven er spesielt viktig hvis analytter

finnes i lave konsentrasjoner, typisk på nanogram per milliliter nivå (1, 3). Valg av riktig

prøveopparbeidelsesteknikk vil være avhengig av flere faktorer. De kjemiske egenskapene og

konsentrasjonsområde til analyttene, sammensetning av matriks eller type analyseinstrument er

noen eksempler (1).

2.2.1. Væske-væske ekstraksjon

LLE er en veletablert prøveopparbeidelsesteknikk og samtidig utgangspunktet for utviklingen

av den miniatyriserte versjonen som kalles for PALME (3, 8). Hovedprinsippet i LLE er å

ekstrahere ønskede analytter fra den vandige biologiske prøven til den organiske fasen.

Forutsetningen er at de to fasene ikke er blandbare med hverandre slik at det dannes to separate

lag (1). Ekstraksjonen er mest effektiv for ikke ladede analytter siden de har bedre løselighet i

den organiske fasen. For å gjøre dem mest mulig hydrofobe er det viktig å eliminere eventuelle

ladninger på funksjonelle grupper. Avhengig av de kjemiske egenskapene til analyttene kan

dette oppnås ved å holde prøven to pH-enheter under eller over i forhold til pKa-verdien for

henholdsvis syrer og baser (3).

10

Fordelingskoeffisienten (KD) beskriver distribusjonen av analytten basert på dens konsentrasjon

i den organiske og vandige fasen. Ligning 1 som representerer det forholdet, viser at høy

konsentrasjon i den organiske fasen krever en høy fordelingskoeffisient (1).

𝐾𝐷 =[𝐴𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘]

[𝐴𝑣𝑎𝑛𝑑𝑖𝑔] (Ligning 1)

I tillegg til pH blir fordelingen avhengig av egenskaper til det organiske løsemidlet og dets

interaksjonsevner med analyttene. Blant de potensielle interaksjoner spiller hydrofobe van der

Waals krefter, dipol- og hydrogenbindingsinteraksjoner en sentral rolle (1). Valg av det beste

løsemidlet kan bli basert på Kamlet og Taft-parametere. De beskriver hydrogenakseptor,

hydrogendonor og polaritet egenskaper til en rekke løsemidler (24). Temperatur er enda en

faktor som kan påvirke fordelingen av analytten mellom to faser (25).

Ekstraksjonsutbytte i LLE er bestemt av fordelingskoeffisienten og volumet av begge faser som

vist i ligning 2. Flere etterfølgende ekstraksjoner med mindre volumer istedenfor en med større

volum gir bedre utbytter (1).

𝑅 =𝐾𝐷∗𝑉𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘

𝐾𝐷∗𝑉𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘+𝑉𝑣𝑎𝑛𝑑𝑖𝑔 (Ligning 2)

R = ekstraksjonsutbytte

Vorganisk = volum av organisk fase

Vvandig = volum av vandig fase

KD = fordelingskoeffisienten

For å forbedre selektiviteten kan det innføres et ekstra trinn som kalles for tilbake-ekstraksjon.

Analyttene ekstraheres først fra den vandige fasen til den organiske fasen. I det påfølgende

trinnet ekstraheres de tilbake til den andre vandige fasen som vanligvis er justert til en pH som

fremmer ionisering. Alle de nøytrale forbindelser blir værende igjen i den organiske fasen mens

de ioniserte vil diffundere ut. Tilbake-ekstraksjonen kan fjerne behovet for fordampning og

gjenoppløsning siden den vandige fasen med analyttene er kompatibel LC-MS (1).

De store fordelene med LLE er fleksibilitet og svært mange anvendelsesområder. Evnen til å gi

rene ekstrakter som fjerner de fleste forurensinger, muligheten for å oppnå konsentrerte prøver

og relativt god kostnadseffektivitet er andre eksempler på de positive sidene ved denne

teknikken. LLE er allikevel ikke fri for ulemper. Høyt forbruk av ofte toksiske løsemidler samt

problemer som emulsjonsdannelse er utfordringer som må overvinnes. Det er også fortsatt få

eksempler på automatisering av denne teknikken til tross for en del forsøk. Det gjør at teknikken

er arbeidskrevende (25). Et eksempel på automatisert LLE er supported liquid extraction (SLE).

11

Prøven overføres til brønner og adsorberes av kiselgur. Påfølgende tilsetting av organisk

løsemiddel tillater ekstraksjonen av analyttene. SLE kan utføres i 96-brønnsformat (1).

2.2.2. Væske-fase mikroekstraksjon

Disse ulempene var en av grunnene til utvikling av nye prøveopparbeidelsesteknikker i

miniatyrisert skala. LPME er en miniatyrisering av LLE og ble introdusert i midten av 1990-

tallet (5). Til tross for det var LLE og SPE fortsatt mye brukt i 2006 (4). Fra det tidspunktet ble

det publisert signifikant flere artikler som beskrev LPME for ekstraksjoner av legemidler fra

biologiske væsker (3). LPME kan utføres som single drop microextraction (SDME) og HF-

LPME. Den sistnevnte teknikken var et mellomtrinn i utviklingen av PALME (3, 8). Begrenset

forbruk av løsemidler, raskere opparbeidelse, automatiseringspotensiale og etter hvert grønn

kjemi var drivkraften bak utviklingen av disse nye teknikkene (3, 4).

HF-LPME er en teknikk som ble innført av Pedersen-Bjergaard og Rasmussen (6, 7). Den er

presentert i figur 2. I dette systemet omringer prøven, som kalles for donorfasen, et rør som er

laget av en porøs polymer. Polypropylen er et eksempel på materiale som brukes for slike

formål. Innsiden av røret er fylt med akseptorfasen som er fysisk adskilt fra donorfasen. En

egnet organisk løsning fanges i membranporene og danner en SLM (7). En organisk løsning

som akseptorfase brukes i to-fase-systemer mens en vandig løsning brukes i tre-fase-systemer.

Fordelingen av analytten i et tre-fase-system er representert i ligning 3 der kn er

ekstraksjonskonstanter (26).

𝐴𝑑𝑜𝑛𝑜𝑟

𝑘1

→←𝑘2

𝐴𝑆𝐿𝑀

𝑘3

→←𝑘4

𝐴𝑎𝑘𝑠𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 (Ligning 3)

Figur 2 Illustrasjon av tre-fase HF-LPME

12

Justering av pH i donor- og akseptorfasen er påkrevet hvis en selektiv ekstraksjon av sure eller

basiske analytter er ønskelig. Løseligheten av analytten i donorfasen bør bli minst mulig for å

fremme distribusjonen til SLM. Analytten bør derimot bli godt løselig i akseptorfasen for å

fremme diffusjonen fra SLM. Riktig pH-justering hindrer også tilbake-ekstraksjon (7).

Konsentrasjon i akseptorfasen kan bli beskrevet av en kinetisk modell under forutsetning av at

massetransporten gjennom SLM er det hastighetsbegrensende trinnet som sikres av tilstrekkelig

omrøring av donorfasen. Det er representert i ligning 4. Det er en funksjon av tid som viser at i

tillegg til fordelingskoeffisienten og konsentrasjonen i donorfasen vil volumer i systemet spille

en avgjørende rolle på den endelige konsentrasjonen i akseptorfasen (27).

𝐶𝐴𝑖(𝑡) =

𝑉𝐷𝐶𝐷𝑖0 −𝐶𝐷𝑖

(𝑡)(𝑉𝐷+𝐾𝑑𝑖∗𝑉𝑚)

𝑉𝐴 𝑡 ≥ 𝑡𝑙𝑎𝑔 (Ligning 4)

CA = konsentrasjon i akseptorfasen

VD = volum av donorfasen

CD = konsentrasjon i donorfasen

Vm = volum av SLM

VA = volum av akseptorfasen

Kd = distribusjonskoeffisient

C0D = opprinnelig konsentrasjon i

donorfasen

t = tid

tlag = tidsforsinkelse

HF-LPME tillater flere modifikasjoner slik at denne teknikken åpner for mange

anvendelsesområder. Blant mange studier som beviste fleksibiliteten, fantes forsøk som

benyttet bæremolekyler for ekstraksjoner av polare stoffer eller belegg på membranen (kalt for

moleculary imprinted polymer coated hollow fibers) (13, 28, 29). Bæremolekyler komplekserer

med analyttene og danner et mer hydrofobt kompleks som er bedre løselig i den organiske fasen.

De dissosierer fra hverandre på grenseoverflaten mellom organisk- og akseptorfase slik at

analytten frigjøres mens bærer forblir i SLM (30).

HF-LPME krever små volumer av organisk løsemiddel, er relativt enkelt og billig i bruk og

ekstrakter egner seg for direkte injeksjon i kromatografiske instrumenter som eksempelvis LC-

MS. På tross av stor vitenskapelig interesse for HF-LPME har det vært utfordringer knyttet til

automatisering (31).

2.2.3. Parallel artificial liquid membrane extraction

PALME har mye felles med HF-LPME siden prinsipper bak transporten av analytten til

akseptorfasen er svært like. Den store forskjellen er geometrien til membranen som er tynnere

i forhold til HF-LPME og er flat. I tillegg er formatet av oppsettet basert på en plate med 96

brønner. De store fordelene med PALME er at teknikken er enklere å automatisere enn HF-

LPME og at mange prøver kan ekstraheres parallelt (8, 31).

13

PALME består av en donor- og en akseptorplate. Begge platene er i 96-brønnsformat.

Akseptorplaten er tildekket med et lokk for å hindre fordampning av akseptorfasen.

Illustrasjonen av utstyret er presentert i figur 3. Donorplaten er laget av polypropylen, og hver

brønn har et volum på 0,5 ml. Det optimale prøvevolumet ble funnet til å være 250 µl (8).

Akseptorplaten som finnes i samme format, har en porøs polyvinylidenfluorid (PVDF)

membran som forsegler bunnen av hver brønn. På denne måten blir begge fasene separert fra

hverandre når platene klemmes sammen (8). PVDF er ikke det optimale materialet, spesielt for

analytter i svært lave konsentrasjoner, siden utbytte og påliteligheten av resultater kan bli

forverret (8). Grunnen til det er ikke-spesifikke bindinger mellom analyttene og membranen.

For å dempe bidraget fra dem ble trioktylamin (TOA) tilsatt i noen av de tidligere prosjektene.

Det hadde som formål å hindre slike interaksjoner (8, 11). Andelen av TOA var ofte lav, for

eksempel 1% av den organiske fasen som immobiliseres i membranporene (11). Det vanlige

volumet av organisk løsemiddel som danner SLM, varierte i de fleste tilfeller mellom 3 og 5 µl

(32). Dets løselighet i de vandige fasene og flyktighet bør bli lavest mulig for å sikre høy

stabilitet av systemet. Det er relevant spesielt ved ekstraksjoner som kan ta opptil to timer (9,

32). Donorfasen er en blanding av en biologisk væske, en buffer som justerer til riktig pH og

demper ioniseringen av analyttene, og eventuelt en intern standard. Analyttene blir da ekstrahert

via SLM til akseptorfasen (32). Volum på 50 µl er vanlig siden det sikrer god oppkonsentrering

og er praktisk i bruk. Mindre volumer av akseptorfase er vanskeligere å håndtere ved pipettering

og øker faren for punktering av SLM med pipettespisser (8). Avhengig av egenskapene til

analyttene skal akseptorfasen bli riktig tilpasset for å sikre ionisering og diffusjon ut fra SLM.

For basiske analytter er det vanlig å bruke en sur akseptorfase der maursyre er en mulig kandidat

for slike formål. I tillegg til surgjøring har den god flyktighet og er dermed kompatibel med

LC-MS (32).

14

Figur 3 Illustrasjon av PALME til venstre og en enkel brønn til høyre

For å sikre kontakten mellom donorfasen og den organiske fasen blir de sammenklemte platene

ristet. Agitasjonen gjelder også akseptorfasen og sikrer tilstrekkelig masseoverføring i systemet

(8).

PALME er et nytt konsept innenfor prøveopparbeidelse som allerede har klart å bevise et bredt

spekter av anvendelsesområder. Denne teknikken klarte å ekstrahere både basiske og sure

legemidler (8, 9). Det ble også dokumentert at PALME var effektiv for opprensing av prøven

fra matrikskomponenter som eksempelvis fosfolipider (10). I likhet med HF-LPME er det en

utfordring å transportere polare analytter med log P under 1-2 enheter gjennom SLM. Nylig ble

det gjennomført forsøk med bæremolekyler som muliggjorde den transporten (12).

Elektromembranekstraksjon (Electromembrane extraction: EME) er en modifisert utvidelse av

PALME der den passive diffusjonen av analytter blir stimulert av elektrisk spenning som tillater

kortere ekstraksjonstider av analytter (33).

2.3. UHPLC

UHPLC er en type væskekromatografi som blir benyttet i stadig større grad (34). Den erstatter

gradvis sin forgjenger, high-pressure liquid chromatography (HPLC), som har den samme

oppbygningen. Mobilfasen fra reservoaret pumpes via injektor mot kolonnen der separasjonen

av analyttene finner sted. De separerte analyttene blir senere målt i en detektor som befinner

seg bak kolonnen (35). Den generelle oppbygningen av UHPLC instrumentet er vist i figur 4.

15

Figur 4 Generell oppbygning av UHPLC

Hovedfordelen med UHPLC ovenfor HPLC er mer robuste pumper som kan tåle trykk på inntil

1400 bar (1, 34). Muligheten for å pumpe med høyere trykk tillater bruk av

stasjonærfasepartikler i sub-2-µm størrelsesområde. Partiklene er således vesentlig mindre enn

i vanlig HPLC. Det er gunstig for oppnåelse av bedre effektivitet i systemet, som beskrives ved

hjelp av høydeekvivalenten til en teoretisk plate (HEPT) (36). Van Deemter plot i figur 5 viser

at mindre partikler selv ved høy hastighet av mobilfasen klarer å opprettholde relativt lave

HEPT-verdier.

Figur 5 van Deemter plot representerer endring av HEPT som en funksjon av økende mobilfasehastighet for ulike

partikkelstørrelser der 5 og 3.5 µm anvendes i HPLC, mens 1.5 µm i UHPLC (1)

16

De bør bli lave for å sikre høy effektivitet med mindre innflytelse av uønskede faktorer som

bidrar til båndspredning. Diffusjonen i mobilfasen (A), eddy diffusjon (B) og massetransporten

mellom stasjonær- og mobilfase (C), som er beskrevet nærmere i van Deemters ligning (ligning

5), er hovedfaktorer ved siden av mobilfasehastigheten (u) som kan påvirke HEPT (35).

𝐻𝐸𝑃𝑇 =𝐴

𝑢+ 𝐵 + 𝐶𝑢 (Ligning 5)

I UHPLC brukes ofte kolonner som er kortere, har mindre indre diameter og er pakket med

mindre partikler i forhold til kolonner i HPLC-instrumenter (34). Den radiale fortynningen blir

dermed mindre (ligning 6) i UHPLC slik at analytter blir eluert i mer konsentrerte bånd. Det vil

gi bedre signal på konsentrasjonsfølsomme detektorer (36, 37).

𝐷 =𝑐0

𝑐𝑚𝑎𝑥= 𝜀𝜋𝑟2(1 + 𝑘)√2𝜋𝐿𝐻/𝑣𝑖𝑛𝑗 (Ligning 6)

D = fortynning

c0 = konsentrasjonen i prøven

cmax = konsentrasjonen i detektoren

Ɛ = porøsitet

r = radius av kolonnen

L = lengden av kolonnen

H = platehøyden

Vinj = prøvevolumet som injiseres

k = konstant

I tillegg til forbedret sensitivitet oppnås lavere løsemiddelforbruk og kortere retensjonstider slik

at tiden som kreves for analyse, reduseres. Disse fordeler gjør at UHPLC separasjoner kan

utføres på kort tid, og at antall prøver som kan analyseres per time blir vesentlig høyere enn for

HPLC (38).

Begge instrumenter har utover det mange felles egenskaper. En av dem er stasjonærfasen. Det

finnes mange ulike materialer som kan gi forskjellige retensjonsmekanismer. Omvendt-fase-

kromatografi er et av de viktigste prinsippene. Den kan baseres på sfæriske partikler som er

laget av silika. De har ulike sidekjeder på overflaten. Oktadecyl, som også kalles for C18, er en

vanlig sidekjede. Det er en svært hydrofob stasjonærfase som har mange anvendelsesområder

(1, 36). Det er allikevel ikke mulig å feste C18-grupper på alle silanolgrupper på overflaten av

silikapartikler. Grunnen til det er sterisk hindring. Det resulterer i dannelsen av såkalte

restsilanolgrupper som kan føre til uønskede sekundære interaksjoner med basiske substanser.

Endcapping, det vil si derivatisering av disse gruppene, gjør at muligheten for slike reaksjoner

blir betydelig redusert (35). En annen viktig utfordring som er knyttet til silikabaserte materialer

17

er deres stabilitet i basisk eller svært surt miljø. Slike stasjonærfaser vil løses opp i pH under 2

og over pH 8. Det er dermed viktig å bruke mobilfaser som er justert til pH mellom 2 og 8 (35).

Mobilfasen inneholder dermed en buffer i lav konsentrasjon som gjør at miljøet blir surt og

stabiliteten til stasjonærfasen bevares. I tillegg spiller den en viktig rolle for retensjonen av

analytter med funksjonelle grupper som lar seg ionisere. De andre bestanddeler av mobilfasen

er vann og en organisk modifikator. Valg av organisk modifikator kan variere avhengig av

ønsket anvendelse og type detektor. Metanol er ofte brukt for slike formål på grunn av lave

kostnader og relativt lav toksisitet (1). Hvis stasjonærfasen baseres på C18-kjeder, bør det alltid

være minst 5% av organisk modifikator for å opprettholde tilstrekkelig påsetingskapasitet. På

denne måten sikres aktivisering av stasjonærfasen (36). Sammensetningen av mobilfasen kan

endres i løpet av analysen slik at elueringsstyrken blir påvirket. Det kalles for gradienteluering

og krever minst 2 reservoarer med mobilfasen og et egnet utstyr som kan blande dem sammen

i riktige proporsjoner. Den type eluering er egnet for analytter med lang retensjonstid. Ulempen

med gradienteluering er blant annet behov for reekvilibrering, det vil si at

mobilfasesammensetningen må tilbakeføres til den opprinnelige tilstanden for å sikre like

elueringsbetingelser for alle prøver (1).

Prøveløsninger injiseres i mobilfasen og separeres på kolonnen. Retensjonen og dermed

separasjonen er avhengig av fysikalsk-kjemiske egenskaper til analyttene. Retensjonen på

omvendt-fase-kromatografi blir i stor grad avhengig av svake men frekvente van der Waals-

krefter. De mest hydrofobe analyttene blir retardert kraftigere enn de mer hydrofile og vil

dermed ha lengre retensjonstider. Mengden av organisk modifikator kan økes for å bryte de

hydrofobe kreftene mellom analyttene og stasjonærfasen raskere slik at fordelingslikevekten

blir skyvet mot mobilfasen. Det vil bidra til kortere retensjonstider. På slutten av kolonnen bør

analyttene bli separert fra hverandre i smale bånd som overføres til detektor (1).

2.4. MS

UHPLC som er koblet sammen med MS er stadig mer brukt for bioanalyse deriblant

applikasjoner som er knyttet til legemiddelmetabolisme (15). De kromatografiske toppene som

dannes ved hjelp av UHPLC instrumenter, kan bli smale, og det er allment akseptert at en topp

bør bestå av minst 10 målepunkter for å gi grunnlag for pålitelige kvantifiseringsdata (34, 39).

Dette øker kravet til detektoren som må ha høyere dataoppsamlingsfrekvens (34).

18

Ionekilden, masseanalysator og detektor er tre hovedelementer i MS som muliggjør deteksjonen

av analytter (1). Hovedfokus i kommende avsnitt blir lagt på elektrospray-ionisering (ESI) som

ionekilden, lineær ionefelle (LIT) som masseanalysator og relevante deteksjonsmodus.

2.4.1. Elektrospray-ionisering

ESI er en vanlig ionekilde som benyttes for analytter som uttrykker polare egenskaper, og som

er mulige å ionisere. Den prosessen er vanligvis fremmet av riktig pH i mobilfasen som i tillegg

må bestå av flyktige komponenter for å kunne bli brukt i MS detektoren (1). Skjematisk

fremstilling av ESI er presentert i figur 6. Mobilfasen strømmer gjennom et kapillærrør som er

koblet til en spenningskilde. Vanligvis er det +5 eller -5 kV som gjør at aerosoldråpene som

dannes ved hjelp av nitrogengass, får ladning. Tilstrekkelig lav mobilfasehastighet må til for å

danne aerosol som vil bidra til optimal ionisering og sensitivitet. Disse dråpene vil gradvis

fordampe på sin vei mot masseanalysatoren. Det minkende overflatearealet vil ha samme antall

ladninger som den opprinnelige større dråpen. Prosessen vil fortsette helt frem til dråpen oppnår

Rayleigh-grensen. Det er det maksimale antall ladninger på en dråpe. Overskridelsen av denne

grensen fører til ustabilitet av dråpen og Coulomb-fisjon. I den prosessen dannes mindre dråper.

Til slutt er det kun ioner som er igjen når hele væsken fordamper. ESI blir brukt i positiv modus

for å detektere ioner som har positiv ladning (1, 40).

Figur 6 Skjematisk fremstilling av ESI

2.4.2. To-dimensjonal ionefelle

Ionefelle er en av flere tilgjengelige masseanalysatorer. De kan deles i to undergrupper som

består av 3D og 2D ionefeller. LIT er et eksempel på en 2D ionefelle (1). Den har høyere

kapasitet og klarer å fange ionene i betydelig større omfang i forhold til 3D. Den er sammensatt

av fire staver som ligner på en kvadrupol med den forskjellen at de er separert fra hverandre i

tre deler. Det er vist i figur 7. Ioner som strømmer inn fra ionekilden, blir fanget i den sentrale

19

delen av LIT. Det er mulig ved hjelp av riktig spenning som anvendes på begge ender av

ionefellen (41). Radiofrekvent (RF) spenning er ansvarlig for å felle ioner radialt, mens

likestrøm virker i den aksiale retningen. Helium, som er en kollisjonsgass, bremser ionene og

hjelper til å fange dem i den sentrale delen (1, 41). Resonansen brukes for å skyte ut alle

uønskede ioner fra LIT. Ioner som blir igjen i ionefellen, aktiveres, og ved hjelp av

resonanseksitasjonen skjer det en fragmentering (41). Økende spenning skyter ut ionene fra

ionefellen mot detektor der ioner med lavest m/z forlater fellen først. De treffer en

elektronmultiplikator som er en detektor. Betydelig forsterket signal blir til slutt omdannet til

et massespektrum av en egnet programvare (1).

Figur 7 Lineær ionefelle med radial utskyting av ioner

Beskrevet virkning av LIT relaterer til tandem MS. I dette systemet utføres to m/z-analyser som

følger etter hverandre. Det ønskede molekylionet blir først isolert fra de andre ved hjelp av

endring i radiofrekvensen og likestrøm. Etter fragmentering blir de spesifikke produktioner

analysert på MS2. LIT er en tandem-i-tid MS slik at alle operasjoner mellom ionisering og

deteksjon av ionet foregår på samme sted. Instrumentet kan virke i ulike modus, men størst

fokus blir lagt på det som kalles på engelsk for selected reaction monitoring (SRM). I SRM

dannes et nytt massespektrum med helt unike fragmenter fra et bestemt ion slik at metoden

sikrer høy spesifisitet og mye strukturelle informasjoner. I tillegg oppnås et mer gunstig forhold

mellom signal og støy slik at bakgrunnsstøyen blir lavere (42).

20

3. Materialer og metoder

3.1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter

Tabell 1 presenterer fysikalsk-kjemiske egenskaper av alle analytter som ble benyttet i dette

prosjektet. Molekylstrukturer er tilgjengelige i figur 1.

Tabell 1 Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter

Analytt

Molekylvekt

(g/mol)

Molekylformel pKa log P

Venlafaksin 277.40 C17H27NO2 9.26±0.28 2.48±0.27

O-desmetyl venlafaksin 263.38 C16H25NO2 9.33±0.28 1.74±0.26

N-desmetyl venlafaksin 263.38 C16H25NO2 10.44±0.20 2.55±0.26

N,O-didesmetyl

venlafaksin

249.35 C15H23NO2 10.59±0.20 1.81±0.26

N,N-didesmetyl O-

desmetyl venlafaksin

235.32 C14H21NO2 10.38±0.10 1.31±0.25

N,O-didesmetyl

venlafaksin glukuronid

425.47 C21H31NO8 COOH

2.78±0.70

NH

10.24±0.20

-0.69±0.47

N,N-didesmetyl O-

desmetyl venlafaksin

glukuronid

411.45 C20H29NO8 COOH

2.78±0.70

NH2

9.85±0.10

-1.19±0.46

Opplysninger er hentet fra www.scifinder.cas.org [12.03.2017] (43)

3.2. Utstyr

Tabell 2 viser alle komponenter av PALME. Det omfatter begge platene og aluminiumsfolie

som tildekket akseptorplaten.

Tabell 2 Utstyr for PALME

Komponent Beskrivelse Produsent By/Land

Akseptorplate med

lokk

MultiScreen®-IP

96-brønnsfilterplate

MAIPN4550, klar

styren, ikke steril,

med Immobilon®-P

PVDF membran,

porestørrelse 0.45

µm

Millipore Darmstadt,

Tyskland

http://www.scifinder.cas.org/

21

Aluminiumsfolie Platemax®

Pierceable

Aluminum Sealing

Film

Axygen Inc. Union City, CA,

USA

Donorplate 96-brønnsplate med

0.5 ml brønner,

polypropylen

Agilent Santa Clara, CA,

USA

Engangsutstyr som ble benyttet i løpet av prøveopparbeidelsen samt senere trinn av

analyseprosessen er vist i tabell 3.

Tabell 3 Forbruksmateriell og engangsutstyr

Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land

Autosampler

glassvialer

Vial Screw Neck N10-1.5, c,

11.6x32, flat

Nerliens

Meszansky

AS

Oslo, Norge

Dramglass Vials, glass, rolled rim, with

plastic snap-cap, 10 ml

VWR

International

Radnor, PA, USA

Eppendorfrør Microcentrifuge tubes 1.5 ml

med lokk, polypropylen

BRAND

GMBH + CO

KG

Wertheim,

Tyskland

Filtreringsvialer Syringeless Filter Device Mini-

UniPrep™, PTFE filter media

with polypropylene housing,

porestørrelse 0.2 µm

GE Healthcare Buckinghamshire,

England

Glassvialer for

organisk fase

Clear 2ml Screw Top Vial

12 x 32

Supelco Bellefonte, PA,

USA

Innsats til vialer Mikroinnsats, klart glass,

15 mm topp, 0.1 ml, 31 x 6 mm

VWR

International

Radnor, PA, USA

Kork til vialer 9mm PPShrtThrdCp, trans,

PTFEvirginal, 53°D, 0.2mm

Nerliens

Meszansky

AS

Oslo, Norge

Kork til vialer

med organisk fase

8mm Open Top Screw Cap, 8-

425 thread, 5mm hole,

polypropylene, septum hvit

silikon/rød PTFE

Thermo

Scientific

San Jose, CA,

USA

Løsemiddel

reservoar

VWR Reagent Reservoir, 25

ml, PS, ikke steril

VWR

International

Radnor, PA, USA

pH-papir Universalindikator pH 0-14 Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Urinbeger Steril, 100 ml, polypropylen VWR

International

Radnor, PA, USA

22

Pipetter og tilhørende utstyr som ble benyttet i dette prosjektet er vist i tabell 4.

Tabell 4 Pipetter


Mekanisk multikanal

pipette med justerbart

volum og 8 kanaler

mLINE 5-100 µl, 30-300 µl Sartorius Göttingen,

Tyskland

Mekanisk pipette med

justerbart volum

Sartorius mLINE 0.5-10 µl, 2-20

µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-

1000 µl, 500-5000 µl

Sartorius Göttingen,

Tyskland

Pipettespisser Optifit Refill Tips 0.1-10 µl, 0.5-

200 µl, 5-350 µl, 10-1000 µl,

100-5000 µl, ikke steril

Sartorius Göttingen,

Tyskland

Stepper Eppendorf Multipette® Plus Eppendorf AG Hamburg,

Tyskland

Tabell 5 presenterer analyseinstrumenter inkludert kolonnen, gass og programvaren som var

uforandrete variabler.

Tabell 5 Analyseutstyr


Gass Helium 6.0 Ultra Plus Yara Praxair Oslo, Norge

Kolonne Acquity UPLC® HSS T3 kolonne, 100 mm

x 2.1 mm ID, partikkelstørrelse 1.8 μm og

porestørrelse 100 Å

Waters Wexford,

Irland

LC Dionex UltiMate 3000 RS Pump, Column

Compartment og Autosampler

Thermo

Scientific

San Jose,

CA, USA

MS Thermo Scientific LTQ XL Linear Ion Trap

Mass Spectrometer

Thermo

Scientific

San Jose,

CA, USA

Programvaren Xcalibur version 2.2. SP1.48 Thermo

Scientific

San Jose,

CA, USA

Elektroniske instrumenter som ble benyttet i ulike trinn av dette prosjektet er vist i tabell 6.

Tabell 6 Diverse utstyr


Analysevekt Mettler AE200 Mettler-Toledo

International Inc.

Columbus, OH,

USA

Analysevekt 2 Mettler Toledo

XS205 Dual Range

Mettler-Toledo

International Inc.

Columbus, OH,

USA

23

Ovn Series FD Binder Tuttlingen, Tyskland

pH-meter 744 pH meter Metrohm Herisau, Sveits

Ristemaskin Heidolph Vibramax

100

Heidolph

Instruments GmbH

& Co.KG

Schwabach,

Tyskland

Vortexmaskin IKA® MS 3 digital IKA®-Werke GmbH

& Co. KG

Staufen, Tyskland

3.3. Kjemikalier

Tabell 7 presenterer identifikasjons- og kvalitetsdata av alle analyttene og intern standard.

Tabell 7 Referansestoffer

Analytt Chemical

Abstracts

Service (CAS)

nummer

Renhet Produsent By/Land

Venlafaksin

hydroklorid

99300-78-4 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich St. Louis, MO,

USA

O-desmetyl

venlafaksin

93413-62-8 ≥98.5%

(HPLC)

Sigma-Aldrich St. Louis, MO,

USA

N-desmetyl

venlafaksin

149289-30-5 97% Toronto

Research

Chemicals

Toronto, ON,

Canada

N,O-didesmetyl

venlafaksin

135308-74-6 98% Toronto

Research

Chemicals

Toronto, ON,

Canada

N,N-didesmetyl

O-desmetyl

venlafaksin

hydroklorid

135308-76-8 98% Toronto

Research

Chemicals

Toronto, ON,

Canada

N,O-didesmetyl

venlafaksin

glukuronid

hydroklorid

1021933-99-2 80% Toronto

Research

Chemicals

Toronto, ON,

Canada

N,N-didesmetyl

O-desmetyl

venlafaksin

glukuronid

1799830-07-1 95% Toronto

Research

Chemicals

Toronto, ON,

Canada

Venlafaksin-D6

hydroklorid

1062606-12-5 Certified

reference

material

Sigma-Aldrich

St. Louis, MO,

USA

24

Alle organiske løsemidler og ioniske væsker som ble testet i dette prosjektet er vist i tabell 8.

Tabell 8 Organiske løsemidler og ioniske væsker

Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land

1-Butyl-1-metylpyrrolidinium

bis(trifluorometylsulfonyl)

imid

223437-11-4 High

purity

Merck

KGaA

Darmstadt,

Tyskland

1-Heksyl-3-

metylimidazolium

heksafluorofosfat

304680-35-1 99% Merck

KGaA

Darmstadt,

Tyskland

1-Heksyl-3-

metylimidazolium

tris(pentafluoroetyl)

trifluorofosfat

713512-19-7 High

pure

Merck

KGaA

Darmstadt,

Tyskland

1-Metyl-3-oktylimidazolium

heksafluorofosfat

304680-36-2 99% Merck

KGaA

Darmstadt,

Tyskland


tetrafluoroborat

244193-52-0 99% Merck

KGaA

Darmstadt,

Tyskland

2-nitrofenyloktyleter

(NPOE)

37682-29-4 99% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Bis(2-etylheksyl)fosfitt 3658-48-8 96% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Dekanol 112-30-1 min

98%

Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Dibenzylfosfitt 17176-77-1 NA Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Diheksyleter 112-58-3 97% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Dodecylacetat 112-66-3 ≥98% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Pentylbenzen 538-68-1 99% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Tributylfosfat 126-73-8 ≥99% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Triisodecylfosfitt 25448-25-3 NA Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

Trioktylamin 1116-76-3 NA Cognis

Corporation

Cincinnati,

OH, USA

Tripentylfosfat 2528-38-3 min

97%

STREM

Chemicals

Newburyport,

MA, USA

Tris(2-etylheksyl)fosfat 78-42-2 ≥98% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

25

Tris(2-etylheksyl)fosfitt 301-13-3 NA Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO,

USA

NA = verdien er ikke tilgjengelig

Tabell 9 presenterer alle ioniske bærere som ble benyttet i dette prosjektet.

Tabell 9 Ioniske bærere

Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land

Aliquat 336 68603-15-6 NA Cognis

Corporation

Cincinnati,

OH, USA

Dodecyltrimetyl

ammoniumbromid

1119-94-4 approx. 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,

USA

Tetrabutyl

ammoniumfosfat

5574-97-0

>97% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,

USA

Tetradecyl

ammoniumbromid

14937-42-9 >99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,

USA

Tetraetyl

ammoniumbromid

71-91-0 min 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,

USA


Tabell 10 presenterer kjemikalier som ble benyttet ved tillaging av mobilfaser, buffere og

modifiserte akseptorfaser.

Tabell 10 Diverse stoffer

Kjemikalie CAS

nummer

Renhet Produsent By/Land

Dimetylsulfoksid 67-68-5 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Kaliumjodid 7681-11-0 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Kaliumklorid 7447-40-7 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Magnesiumnitrat

heksahydrat

13446-18-9 min 99% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Maursyre 64-18-6 For mass

spectrometry,

98%

Sigma-Aldrich St. Louis,

MO, USA

Metanol 67-56-1 Hypergrade

for LC-MS

Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Natriumbikarbonat 144-55-8 Pro analysi

min 99.5%


Tyskland

26

Natriumdihydrogenfosfat

monohydrat

10049-21-5 99-102%

ACS Reag Ph.

Eur


Tyskland

Natriumhydrogenfosfat

dihydrat

10028-24-7 99-102%

ISO Reag Ph.

Eur


Tyskland

Natriumhydroksid 1310-73-2 99.3% VWR

International

Radnor, PA,

USA

Natriumjodid 7681-82-5 NA Sigma Aldrich St. Louis,

MO, USA

Natriumkarbonat 497-19-8 Pro analysi

min 99.9%


Tyskland

Natriumklorid 7647-14-5 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Trifluoreddiksyre 76-05-1 ReagentPlus®

99%

Sigma-Aldrich St. Louis,

MO, USA

Urea 57-13-6 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Renset vann MilliQ water

purification

system

Ultrapure

water (type 1)

Millipore Molsheim,

Frankrike


3.4. Løsninger og buffere

3.4.1. Tillaging av buffere

Det ble brukt fosfat og bikarbonat-karbonatbuffere i forsøk. De hadde som formål å tilpasse pH

til ønsket verdi i donorfasen. Buffere som er beskrevet i dette avsnittet ble tilberedt på bakgrunn

av tabeller som finnes i vitenskapelig litteratur (44).

Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte pH-verdier

500 ml 0.1 M natriumkarbonat løsning

5.2992 g av natriumkarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann.

500 ml 0.1 M natriumbikarbonat løsning

4.2009 g av natriumbikarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann

Disse løsninger ble deretter blandet med hverandre i oppgitte forhold. Styrken på alle buffere i

Tabell 11 er 0.1 M.

27

Tabell 11 Bikarbonat-karbonatbuffer – pH

pH Natriumbikarbonat Natriumkarbonat

Buffer 1 9.4 80 ml 20 ml







Tillaging av fosfatbuffer

100 ml 0.2 M natriumdihydrogenfosfat

2.7802 g av natriumdihydrogenfosfat monohydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann

100 ml 0.2 M natriumhydrogenfosfat

3.5629 g av natriumhydrogenfosfat dihydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann

19 ml av natriumdihydrogenfosfat ble blandet med 81 ml av natriumhydrogenfosfat. Den

blandingen ble deretter fortynnet med 100 ml renset vann. Den endelige fosfatbufferen hadde

styrke på 0.1 M, 200 ml volum og 7.4 pH-enheter.

Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte styrke

Det ble veid bestemte mengder av natriumbikarbonat og natriumkarbonat som vist i

tabell 12. De ble senere overført til målekolber som ble fylt til 100 ml med renset vann.

Buffer med styrke på 0.1 M ble ikke tatt med i betraktning siden den var tilgjengelig

fra før. Alle buffere representerer forhold 20:80 mellom henholdsvis natriumbikarbonat

og natriumkarbonat. De hadde dermed lik pH på 10.5 enheter.

Tabell 12 Bikarbonat-karbonatbuffer – styrke

Buffer styrke (M) Natriumbikarbonat (g) Natriumkarbonat (g)

0.25 0.4200 2.1175

0.5 0.8401 4.2354

0.75 1.2607 6.3555

1 1.6810 8.4779

28

3.4.2. Løsninger

Maursyreløsninger

I tabell 13 presenteres fremgangsmåten som ble brukt for tilbereding av alle maursyreløsninger.

Tabell 13 Maursyreløsninger med ulike styrker fra 1 mM til 200 mM

Styrke (mM) Tilberedelsesmetode

1 20 ml av 5 mM maursyreløsning ble blandet med 80 ml av renset vann

5 50 ml av 10 mM maursyreløsning ble blandet med 50 ml av renset vann

10 37.7 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann

20 75.5 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann

50 189 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann





1 M NaOH-løsning

3.2555 g NaOH ble oppløst i 81.4 ml renset vann

Organiske løsninger

På grunn av et stort antall organiske løsemidler oppgis kun en generell beskrivelse av

fremgangsmåten som ble anvendt i alle tilfellene. Det gjelder både for blandinger av organiske

løsemidler samt blandinger med ioniske bærere. Alle blandinger baseres på (w/w) forholdet der

komponenten med lavest vekt ble veid først. Analysevekten (Mettler AE200) ble benyttet i alle

tilfeller.

Trifluoreddiksyreløsninger (TFA)

Tabell 14 presenterer fremgangsmåten for trifluoreddiksyreløsninger med tre ulike styrker.

Tabell 14 Trifluoreddiksyreløsninger med ulike styrker fra 50 mM til 150 mM

Styrke (mM) Tilberedelsesmetode

50 383 µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann



29

Maursyreløsninger med DMSO

I tabell 15 presenteres forhold mellom maursyreløsninger og dimetylsulfoksid i en 10 ml

målekolbe.

Tabell 15 Løsninger av maursyre med DMSO i ulike forhold

DMSO (%) Tilberedelsesmetode

25 20 mM maursyreløsning tilsatt 25% DMSO (v/v)



«Kunstig urin»

«Kunstig urin» er en blanding av natrium- og kaliumklorid med eller uten urea. Det er

forbindelser som forekommer i størst mengde. Data i tabell 16 viser innveide mengder av

forbindelser som ble oppløst i 100 ml vann der mengden av Na+, Cl-, K+ og urea varierer.

Mengden av Na+, Cl- og K+ holdes konstant i løsninger med og uten urea. Mengder ble basert

på rapporten som ble utarbeidet av Putnam (23).

Tabell 16 Mengden av Na+, Cl-, K+ og urea i «kunstig urin»

Uten urea Med urea

Høy andel Na+, Cl- og K+ NaCl 0.9729 g 0.9695 g

KCl 0.4638 g 0.4647 g

Urea - 2.328 g

Middels andel Na+, Cl- og K+ NaCl 0.6444 g 0.6447 g

KCl 0.3150 g 0.3159 g

Urea - 1.630 g

Lav andel Na+, Cl- og K+ NaCl 0.2987 g 0.3006 g

KCl 0.1551 g 0.1562 g

Urea - 0.9286 g

Motioner i maursyreløsning

I tabell 17 presenteres fire motioner hvorav tre har ulike styrker. Løsninger ble forberedt ved å

oppløse den veide mengden av motioner med 20 mM maursyreløsning i en 10 ml målekolbe.

Hver konsentrasjon av hvert motion ble laget som en separat løsning.

30

Tabell 17 Mengden av motioner med ulik styrke i 20 mM maursyreløsning

Styrke (M) KI Mg(NO3)2*6H20 NaI NaCl

0.1 0.166 g 0.256 g 0.150 g -

0.5 0.830 g 1.28 g 0.750 g -

1 1.66 g 2.56 g 1.50 g 0.585g

3.4.3. Stamløsninger

Analytter ble veid ved hjelp av Mettler Toledo XS2015 Dual Range, og en bestemt mengde av

metanol ble brukt for å oppløse dem til en konsentrasjon på 1 mg/ml. N,O-didesmetyl

venlafaksin glukuronid er et unntak som ble oppløst til konsentrasjon på 0.8 mg/ml.

Disse løsninger ble oppbevart ved -24oC.

3.4.4. Arbeidsløsninger

Arbeidsløsninger ble laget direkte fra stamløsninger. 100 µl av hver analytt og 125 µl av N,O-

didesmetyl venlafaksin glukuronid ble pipettert til en målekolbe som ble deretter fylt opp til 10

ml med renset vann. Blandingen av analytter ble deretter fordelt i eppendorfrør. Hvert rør

inneholdt 500 µl av arbeidsløsningen med en konsentrasjon på 10 µg/ml.

Arbeidsløsninger ble benyttet for tillaging av analyttblandinger for både vandige og biologiske

prøveløsninger.

Arbeidsløsninger ble oppbevart ved -24oC.

3.4.5. Standarder

Standarder ble laget fra arbeidsløsninger. Et bestemt volum av arbeidsløsningen ble pipettert

over til målekolben med et volum på 5 eller 10 ml. Kolben ble deretter fylt med renset vann

opptil målestreken. Etter at løsningen ble ristet godt, ble den pipettert til innsats som ble plassert

inn i vialer til UHPLC.

Standarder ble oppbevart ved -24oC.

3.4.6. Internstandard

Venlafaksin-D6 hydroklorid representert i figur 8 var en ferdiglaget kommersielt tilgjengelig

intern standard som ble benyttet i dette prosjektet. Det var en løsning i metanol med en

konsentrasjon på 100 µg/ml.

31

Intern standard ble oppbevart ved -24oC.

Figur 8 Molekylstruktur til venlafaksin-D6 hydroklorid

3.4.7. Biologisk matriks

Urin ble samlet fra forskjellige donorer på Farmasøytisk Institutt. Urinen ble enten umiddelbart

brukt eller oppbevart i kjøleskapet mellom 2oC og 8oC.

3.4.8. Mobilfaser

Mobilfase A

716 µl konsentrert maursyre blandes med 950 ml renset vann. 950 ml 20 mM av

maursyreløsning blandes deretter med 50 ml metanol.

Mobilfase B

38 µl konsentrert maursyre blandes med 50 ml renset vann. 50 ml 20 mM av

maursyreløsning blandes deretter med 950 ml metanol.

Mobilfase C/D

500 ml renset vann blandet sammen med 500 ml metanol.

Seal wash

450 ml renset vann blandet sammen med 50 ml metanol.

3.5. Instrumentelle betingelser

3.5.1. UHPLC

UHPLC, kolonnen og programvaren som ble benyttet i dette prosjektet, er beskrevet i tabell 5.

Metoden benyttet gradienteluering av mobilfase A og B. Den er beskrevet i tabell 18.

Temperaturen var innstilt til 40oC i løpet av hele sekvensen. Injeksjonsmetoden var partial loop

og injeksjonsvolumet var 2 µL.

32

Tabell 18 Forholdet mellom mobilfase A og B i løpet av gradienteluering

Tid (min) Mobilfase A

(%)

Mobilfase B

(%)

Mobilfase

hastighet

(mL/min)

Kurve

0 70 30 0.3 5

1.5 55 45 0.3 5

1.6 40 60 0.3 5

3.5 35 65 0.3 5

3.6 0 100 0.3 5

6.5 0 100 0.3 5

6.6 70 30 0.3 5

10 70 30 0.3 5

3.5.2. MS/MS

Deteksjon med MS/MS som nevnes i tabell 5, var innstilt til følgende parametere fra tabell 19.

Tabell 19 Innstillinger av MS/MS

Kapillærspenning Segment 1 Segment 2 Segment 3

38 V 32 V 35 V

Tube lens Segment 1 Segment 2 Segment 3

110 V 105 V 145 V

Kapillærtemperatur 275oC

Sheath gas flow rate 26 arb

Sprayspenning 4.5 kV

Forstøvergass Nitrogen

Tørkegass Nitrogen

Ionisering Positiv modus

Type scan SRM

Deteksjonen ble delt opp i tre segmenter. Oppdeling hjelper å oppnå flere punkter som danner

en topp. Grunnen til det er at kun valgte overganger blir scannet i bestemte segmenter mens det

ikke blir tatt hensyn til de andre. Første segment falt mellom 0 min og 1.80 min, den andre

mellom 1.80 min og 3 min og den tredje mellom 3 min og 10 min. Mobilfasen ble ikke

introdusert til MS i løpet av de første 0.5 min og etter 6.5 min.

SRM-overganger for alle analytter er presentert i tabell 20.

33

Tabell 20 SRM-overganger

Analytt SRM overgang Kollisjonsenergi

(%)

Segment

Forløper Fragment

Venlafaksin

hydroklorid

278.17 260.14 24 3

O-desmetyl

venlafaksin

264.16 246.10 34 2

N-desmetyl

venlafaksin

264.16 246.10 34 3

N,O-didesmetyl

venlafaksin

250.12 232.08 24 2

N,N-didesmetyl

O-desmetyl

venlafaksin

hydroklorid

236.06 218.05 22 2

N,O-didesmetyl

venlafaksin

glukuronid

hydroklorid

426.25 408.21 20 1

N,N-didesmetyl

O-desmetyl

venlafaksin

glukuronid

412.20 364.15 25 1

Venlafaksin-D6

hydroklorid

284.28 266.70 19 3

3.6. Utførelse av PALME

PALME ble benyttet for å utføre ekstraksjoner av analytter fra vandige (analyttblanding i vann)

og biologiske (analyttblanding i urin) prøveløsninger. De biologiske prøveløsninger var urin.

Illustrasjon av PALME er vist i figur 3 mens utstyrs detaljer er beskrevet i tabell 2.

3.6.1. Vandige prøveløsninger

Donorfasevolumet var alltid 250 µl. Intern standard ble ikke brukt i forsøk med vandige

prøveløsninger. Arbeidsløsningen med en konsentrasjon på 10 µg/ml ble fortynnet med renset

vann og NaOH-løsning til 200 ng/ml. Styrken av NaOH var justert til 10 mM. Løsningen ble

deretter overført til et løsemiddelreservoar, og denne blandingen ble pipettert over i

donorbrønnene ved hjelp av en multikanalpipette. Etter hvert ble NaOH erstattet med

bikarbonat-karbonatbuffer. Da ble det tilsatt 125 µl buffer til 125 µl av analyttblandingen.

Analyttkonsentrasjoner i donorfasen forble som før på 200 ng/ml.

34

Den organiske fasen ble pipettert ut på PVDF-membranen fra donorplatesiden. Tabell 21

representerer løsemidler som ble testet i SLM. Volumet på 4 µl ble pipettert på membranen.

Det gjaldt alle løsemidler som ble brukt for å danne SLM. De fordelte seg og ble immobilisert

innen 60 sek. Etter den tiden ble SLM klar for bruk.

Akseptorfasen var maursyre med og uten DMSO og trifluoreddiksyre. De ulike styrkene og

forhold er presentert i tabell 21. Akseptorfasene ble også overført til et løsemiddelreservoar og

pipettert ved hjelp av en multikanalpipette i akseptorbrønnene. De ble fylt med 50 µl.

Volumforskjellen mellom donor og akseptor muliggjorde oppkonsentrering av analyttene med

faktor fem når overnevnte volumer ble brukt. Aluminiumsfolie ble limt nøye på toppen av

akseptorplaten. Det hadde som formål å begrense eventuell fordampning av akseptorfasen.

Donorplaten som ble klemt godt sammen med akseptorplaten med aluminiumsfolien på toppen,

ble festet på ristemaskinen Vibramax 100 slik at platene var ubevegelige. Ristefrekvensen var

alltid innstilt til 900 rpm. Alle ekstraksjoner foregikk i 45 min.

Ristingen ble stoppet nøyaktig etter 45 min. Aluminiumsfolien ble fjernet, og

multikanalpipetten med volum innstilt til 50 µl ble brukt for å pipettere mest mulig av

akseptorfasen over i innsats. Akseptorplaten ble holdt på skrå for å gjøre pipetteringen enklere

og redusere sjansen for punktering av membranen, noe som ville medført tap av akseptorfasen.

Innsats ble deretter plassert i UHPLC vialer.

Tabell 21 Oversikt over betingelser som ble brukt for vandige prøveløsninger

Donorfasen 250 µl analyttblanding i 10 mM NaOH

125 µl 0.1 M buffer + 125 µl analyttblanding

Buffer pH: 9.4, 9.5, 9.8, 9.9, 10.1, 10.3, 10.5

Akseptorfasen 20, 100, 200 mM maursyreløsning

20 mM maursyreløsning med 25, 50 eller 75% DMSO

50, 100, 150 mM trifluoreddiksyreløsning

Organisk fase Dodecylacetat

Diheksyleter

Pentylbenzen

NPOE

Bis(2-etylheksyl)fosfitt

Tributylfosfat

Dekanol

1-Butyl-1-metylpyrrolidinium bis(trifluorometylsulfonyl)

imid

35

1-Heksyl-3-metylimidazolium heksafluorofosfat

1-Metyl-3-oktylimidazolium heksafluorofosfat

1-Metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat

1-Heksyl-3-metylimidazolium tris(pentafluoroetyl)

trifluorofosfat

Tris(2-etylheksyl)fosfat

Tris(2-etylheksyl)fosfitt

Triisodecylfosfitt

Dibenzylfosfitt

Tripentylfosfat

Ioniske bærere Tetradecylammoniumbromid

Dodecyltrimetylammoniumbromid

Tetraetylammoniumbromid

Tetrabutylammoniumfosfat

Aliquat 336

3.6.2. Biologiske prøveløsninger

Urin erstattet renset vann i optimaliseringsfasen av prosjektet samt evaluering. Intern standard

ble benyttet i tillegg. Det endelige donorfasevolumet var 250 µl i likhet med vandige

prøveløsninger. Det var sammensatt av 115 µl buffer, 10 µl intern standard og 125 µl av en

analyttblanding som ble laget i urin. Analyttene og intern standard hadde en konsentrasjon på

200 ng/ml i donorfasen. I noen forsøk ble konsentrasjonen av analytter endret. Konsentrasjonen

av dem ble senket ned til 0.05 ng/ml i donorfasen. Bikarbonat-karbonatbuffer hadde som formål

å justere pH fra 9.8 til 10.5, og den hadde varierende styrke fra 0.1 M til 1 M. Ristefrekvensen

var 900 rpm i alle forsøk. Ekstraksjonstiden var 45 min for de fleste forsøk.

Unntaket var forsøk som dannet grunnlaget for tidskurven. De syv målepunktene var spredt

mellom 15 og 180 min. Både akseptor- og donorfasen ble analysert. Siden donorfasen besto

delvis av urin, måtte den filtreres før overføring til innsats. Det ble gjort ved hjelp av vialer med

filter fra GE Healthcare (Buckinghamshire, England).

Maursyre i konsentrasjonsområdet 1-200 mM ble testet. Volumet forble 50 µl. I enkelte forsøk

ble det tilsatt NaCl, KI, Mg(NO3)2 eller NaI til akseptorfasen. De tre sistnevnte hadde ulike

styrker som varierte mellom 0.1 M og 1 M. NaCl styrken var 1 M.

36

I et enkelt forsøk ble urinen i donorfasen erstattet av «kunstig urin», som beskrevet under avsnitt

3.4.2. om løsninger. Den hadde samme volum og analyttblandingen ble tilsatt på samme måte

som til urinen.

Volumet av den organiske fasen forble uendret i forhold til ekstraksjoner fra vandig miljø. Den

ble blandet med ioniske bærere for å finne det optimale forholdet.

Alle andre operasjoner ble lik som ved ekstraksjoner fra vandige prøveløsninger.

Tabell 22 Oversikt over betingelser som ble brukt for biologiske prøveløsninger

Donorfasen 115 µl (bikarbonat-karbonat eller fosfat) buffer + 10 µl intern

standard + 125 µl analyttblanding

115 µl NaOH + 10 µl intern standard + 125 µl analyttblanding

125 µl buffer + 125 µl analyttblanding

Akseptorfasen 1, 5, 10, 20 ,50, 75, 100, 150, 200 mM maursyreløsning

1 M NaCl, 0.1, 0.5, 1 M KI, Mg(NO3)2 og NaI

Organisk fase Tripentylfosfat med og uten 1% trioktylamin

Ioniske bærere Aliquat 336

Tetradecylammoniumbromid

Ekstraksjonstid 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 min

3.7. Utvelgelse av SLM

Valg av det mest egnete løsemidlet for SLM ble gjennomført med vandige prøveløsninger. De

ulike delforsøk er presentert i tabell 23. Suksesskriteriet var utbytte av analyttene. Den største

vekten ble lagt på utbytter av de mest hydrofile stoffene som er vanskeligst å ekstrahere.

Konsentrasjonen av analyttene i alle forsøk ble justert til 200 ng/ml i donorfasen.

Standarder hadde konsentrasjonene på 50, 200, 500 og 1000 ng/ml. Hver konsentrasjon besto

av fire paralleller.

Delforsøk ble kjørt på ulike dager.

Tabell 23 Organiske løsemidler som ble brukt for å finne den optimale SLM

Med 1% trioktylamin (w/w) Uten trioktylamin

Delforsøk 1 (n=5) Dodecylacetat Dodecylacetat

Delforsøk 2 (n=5) Dodecylacetat

Diheksyleter Diheksyleter

Pentylbenzen Pentylbenzen

NPOE NPOE

37

Bis(2-etylheksyl)fosfitt Bis(2-etylheksyl)fosfitt

Tributylfosfat Tributylfosfat

Dekanol Dekanol

Delforsøk 3 (n=5) Dodecylacetat

1-Butyl-1-metylpyrrolidinium

bis(trifluorometylsulfonyl)

imid

1-Heksyl-3-metylimidazolium

heksafluorofosfat


heksafluorofosfat


heksafluorofosfat


heksafluorofosfat


tetrafluoroborat


tetrafluoroborat


tris(pentafluoroetyl)

trifluorofosfat

Delforsøk 4 (n=4) Tributylfosfat

Tris(2-etylheksyl)fosfat Tris(2-etylheksyl)fosfat

Tris(2-etylheksyl)fosfitt Tris(2-etylheksyl)fosfitt

Triisodecylfosfitt Triisodecylfosfitt

Dibenzylfosfitt Dibenzylfosfitt

Delforsøk 5 (n=4) Tributylfosfat

Tripentylfosfat

Delforsøk 1, 2 og 3 hadde fem paralleller av hver SLM. I delforsøk 2 og 3 ble dodecylacetat

med 1% trioktylamin valgt som et sammenligningssystem. Alle analyser i disse forsøkene ble

gjort med vandige løsninger der donorfasen inneholdt 10 mM NaOH.

Delforsøk 4 og 5 brukte tributylfosfat som et sammenligningssystem. De ble utført med fire

paralleller. Donorfasen i disse analysene var justert med bikarbonat-karbonatbuffer istedenfor

NaOH. Akseptorfasen var 50 µl 20 mM maursyre i alle delforsøk.

3.8. Optimalisering av ekstraksjonen

De optimaliserte parameterne ble benyttet i de etterfølgende forsøkene til tidspunktet der alle

testede ekstraksjonsbetingelser ble bestemt.

3.8.1. Optimalisering av organisk fase

Standarder hadde konsentrasjonene 50, 200, 500 og 1000 ng/ml. De var blandet sammen med

intern standard som hadde konsentrasjonen på 200 ng/ml.

38

Donorfasen besto av en 125 µl analyttblanding justert med 115 µl 0.1 M bikarbonat-

karbonatbuffer med pH 9.7 og 10 µl intern standard. Konsentrasjonen av analytter og intern

standard i donorfasen var 200 ng/ml. Akseptorfasen var 50 µl 20 mM maursyre.

I dette forsøket ble det undersøkt ulike sammensetninger av SLM som fremstilt i tabell 24.

Tabell 24 Optimalisering av sammensetning til SLM (n=4)

SLM 1 Tripentylfosfat

SLM 2 Tripentylfosfat 1% trioktylamin

SLM 3 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 20% Aliquat 336

SLM 4 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 3% Tetradecyl

ammoniumbromid


ammoniumbromid


ammoniumbromid

20%

Aliquat 336

SLM 7 Tripentylfosfat 3% Tetradecyl

ammoniumbromid

SLM 8 Tripentylfosfat 20% Aliquat 336

SLM 9 Tripentylfosfat 3% Tetradecyl

ammoniumbromid

20% Aliquat 336

3.8.2. Optimalisering av mengden til ionisk bærer

Andelen av den ioniske bæreren var 0, 10, 15, 20, 25 og 30 prosent i det organiske løsemidlet.

Alle andre variabler ble holdt uforandret i forhold til det forrige optimaliseringstrinnet fra

avsnitt 3.8.1. Hvert forhold ble analysert med fire paralleller.

3.8.3. Optimalisering av buffer pH i donorfasen

Det ble gjennomført to delforsøk som undersøkte ulike pH-verdier brukt til modifikasjonen av

miljøet i donorfasen. Det var fosfat- og bikarbonat-karbonatbuffer i tillegg til NaOH som ble

testet i de forsøkene. Konsentrasjonen av buffere var 0.1 M og 10 mM for NaOH. De testede

pH-verdiene er representert i tabell 25.

Tabell 25 pH-verdier av fosfatbuffer, bikarbonat-karbonatbuffer og NaOH-løsning (n=4)

Buffer/løsning pH

Delforsøk 1 Fosfatbuffer 7.4

Bikarbonat-karbonatbuffer 9.5, 9.7, 9.9, 10.1

NaOH-løsning 12.3

39

Delforsøk 2 Fosfatbuffer 7.4

Bikarbonat-karbonatbuffer 9.8, 9.9, 10.1, 10.3, 10.5

NaOH-løsning 12.3

3.8.4. Optimalisering av styrken i akseptorfasen

Den optimale maursyrestyrken ble valgt på bakgrunn av to delforsøk som ble vurdert i forhold

til utbyttene. Verdier som ble testet, er presentert i tabell 26.

Tabell 26 Styrke av maursyreløsning i akseptorfasen (n=4)

Styrke (mM)

Delforsøk 1 20, 50, 75, 100, 150, 200

Delforsøk 2 1, 5, 10, 20, 50

3.8.5. Optimalisering av ekstraksjonstid

Ekstraksjonen av analyttene ble undersøkt ved ulike tidspunkter. Målinger ble foretatt ved 15,

30, 45, 60, 90, 120 og 180 min både fra akseptor- og donorfasen. Forsøket ble vurdert i forhold

til oppnådde utbytter og tidspunkter for innstilling av likevekt i tillegg til fordelingen av

analyttene i systemet.

3.8.6. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen

Bikarbonat-karbonatbuffere med styrke på 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 og 1 M ble undersøkt. Alle

buffere hadde pH 10.5.

3.9. Evaluering av metoden

Det ble utført en evaluering av denne metoden som var basert på retningslinjer fra europeiske

legemiddelmyndigheter (EMA) (45). Parametere fra avsnitt 3.9.1. til 3.9.6 ble undersøkt. Alle

forsøk benyttet biologiske prøveløsninger.

3.9.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense

For å finne den laveste deteksjonsgrensen ble det laget seks fortynninger av analyttblandingen

i urinen som hadde konsentrasjon på henholdsvis 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 og 10 ng/ml. Hver

konsentrasjon ble analysert med fire paralleller. Intern standard ble ikke brukt i dette forsøket.

40

Etter avsluttet analyse ble topphøyden av hver analytt sammenlignet manuelt med støyhøyden.

Den laveste konsentrasjonen som kunne detekteres, ble bestemt på bakgrunn av forholdet på

tre mellom signal og støy.

Den laveste kvantifiseringsgrensen ble bestemt til å bli signal/støy = 10. Konsentrasjonen ble

funnet ut ved hjelp av data som var tilgjengelige fra beregninger av den laveste

deteksjonsgrensen.

3.9.2. Linearitet

Kalibreringskurven besto av ti punkter med konsentrasjoner på 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500,

750 og 1000 ng/ml i urin. Hver konsentrasjon ble analysert med fire paralleller. En kvadratisk

kurve med 1/x vekting ble benyttet for å finne r2-verdien. Hver analytt hadde sin egen

kalibreringskurve. Lineariteten for NNDODV, NODVGLU og NNDODVGLU var undersøkt i

konsentrasjonsområdet 20 til 1000 ng/ml. For alle andre analytter var det 2 til 1000 ng/ml.

3.9.3. Overdrag

For å undersøke mulige overdrag fra påfølgende paralleller ble det gjennomført forsøk der to

blanke prøver ble plassert bak de høyeste standardene som ble brukt for kalibreringskurven. De

blanke prøvene var akseptorfaser etter ekstraksjon fra 250 µl urin uten analytter eller intern

standard.

3.9.4. Presisjon og nøyaktighet

Presisjon og nøyaktighet ble undersøkt i intradag- og interdaganalyse ved hjelp av QC-prøver.

De hadde en konsentrasjon på 2, 6, 20, 60, 400 og 850 ng/ml. De ble laget uavhengig av

standarder som ble brukt for kalibreringskurven. Hver konsentrasjon ble analysert med fem

paralleller i serie 1 og ti i serie 2. Resultater ble sammenlignet med kalibreringskurven og

eventuelle avvik ble vurdert i henhold til EMAs retningslinjer (45). For intradaganalyse ble det

benyttet resultater fra serie 1 mens for interdaganalyse fra serie 1 og 2.

3.9.5. Matrikseffekter

Dette forsøket benyttet Matuszewskis metode for vurdering av eventuelle matrikseffekter (46).

Det ble ekstrahert 15 urinparalleller uten analytter. Deretter ble akseptorfasen av fem paralleller

slått sammen. Til 120 µl av denne løsningen ble det tilsatt 30 µl analyttblandingen til

konsentrasjonen på 6 ng/ml. Samme fremgangsmåte ble brukt for konsentrasjoner på 60 og 340

ng/ml. For å bestemme matrikseffekter ble det laget samme volum i samme konsentrasjoner

41

som benyttet ren akseptorfase istedenfor den som ble utsatt ekstraksjon. Matrikseffekter ble

senere bestemt ved å finne forholdet mellom areal av analytt fra akseptorfasen utsatt for

ekstraksjon og areal fra den intakte akseptorfasen. Matrikseffekter ble uttrykt i prosent.

3.9.6. Ekstraksjonsutbytte

Ekstraksjonsutbytte ble beregnet ved å dele gjennomsnittlig areal av analyttene i QC-prøvene

med gjennomsnittlig areal av analyttene som stammet fra akseptorfasen der analyttblandingen

ble tilsatt etter ekstraksjonen. Gjennomsnittlige verdier ble basert på fem paralleller. De

endelige resultatene ble funnet for tre konsentrasjonsnivåer 6, 60 og 340 ng/ml for VEN, ODV,

NDV og NODV. De resterende analyttene hadde to konsentrasjonsnivåer 60 og 340 ng/ml.

Ekstraksjonsutbyttene ble uttrykt i prosent.

3.10. Beregninger

Avvik fra de nominelle verdiene som ble brukt ved vurdering av presisjon og nøyaktighet samt

ved tillaging av kalibreringskurven, ble beregnet av Xcalibur-programvaren.

Utbytte ble benyttet i avsnitt 4.1. og 4.2. De ble funnet ved å dele gjennomsnittet av alle

paralleller med et tall som representerte 100% utbytte. Hensyn ble tatt til oppkonsentrering på

grunn av volumforskjeller mellom fasene i PALME. Verdien ble uttrykt i prosent.

RSD ble funnet ved å dele standardavviket av alle paralleller med gjennomsnittet. Verdien ble

uttrykt i prosent.

Matrikseffekter (ME), vist i ligning 7, ble beregnet ved å dele gjennomsnittlige areal av

analyttene tilsatt til akseptorfasen etter ekstraksjon (B) med tilsvarende gjennomsnittlige areal

fra en ren akseptorfase tilsatt analyttene (A) (46). Sluttresultatet ble uttrykt i prosent.

𝑀𝐸 =𝐵

𝐴∗ 100% (Ligning 7)

Ekstraksjonsutbytte (RE), vist i ligning 8, ble benyttet i avsnitt 4.3. De ble beregnet ved å dele

gjennomsnittlige areal av analytter fra QC-prøvene (C) med gjennomsnittlige areal av analytter

fra akseptorfasen som ble tilsatt analyttblanding etter ekstraksjonen (C) (46).

𝑅𝐸 =𝐶

𝐵∗ 100% (Ligning 8)

42

4. Resultater og diskusjon

4.1. Innledende forsøk

De innledende forsøkene ble utført fra vandige prøveløsninger, og den generelle

fremgangsmetoden fra avsnitt 3.6.1. ble brukt.

4.1.1. Utvelgelse av SLM – del 1

I det første forsøket var det ønskelig å undersøke ekstraksjonseffektiviteten for alle analyttene.

Fokuset ble dermed rettet mot SLM. Den ble ansett som en av de mest sentrale faktorene i

ekstraksjonsprosessen. På bakgrunn av tidligere PALME-publikasjoner ble det bestemt at

dodecylacetat var et hensiktsmessig valg (8, 11, 12). Grunnen til denne beslutningen var dens

evne til å ekstrahere analytter med ulik polaritet og med lave RSD-verdier. Dodecylacetat ble

testet med og uten 1% trioktylamin. Trioktylamin var benyttet i tidligere studier som en

substans med maskeringseffekter på ikke-spesifikke bindingsseter i membranen (11).

Analyttene ble ekstrahert via SLM fra basisk miljø i donorfasen som var dannet med 10 mM

NaOH og til sur 20 mM løsning av maursyre. Den største vekten ved vurderingen av resultatene

ble lagt på utbyttene av analyttene.

Dodecylacetat med 1% trioktylamin viste høyere ekstraksjonsutbytter i forhold til SLM som

besto av ren dodecylacetat. Utbyttene samt RSD-verdier for alle analytter er vist i tabell 27. Det

er i samsvar med påstanden at trioktylamin kan redusere de ikke-spesifikke bindinger til PVDF

membranen (11). Allikevel ble kun venlafaksin og N-desmetylvenlafaksin ekstrahert i større

grad med utbytter på henholdsvis 84% og 52%. O-desmetylvenlafaksin hadde utbytte på 6%

mens alle andre analytter var ikke detektert i akseptorfasen. Resultatene viste dermed at

analyttene med de høyeste log P-verdiene ble ekstrahert i størst grad. De mer polare substansene

hadde muligens svært liten fordeling over i den organiske fasen slik at de forble i den vandige

donorfasen.

43

Tabell 27 Utbytter og tilhørende RSD-verdier fra ekstraksjoner med SLM som besto av

dodecylacetat med og uten 1% trioktylamin

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell

27. Donorfase: 250 µl 10 mM NaOH med analyttblanding med konsentrasjon i donorfasen på

200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5.

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Dodecylacetat med 1%

TOA

84%

(7%)

6%

(5%)

52%

(6%)

2%

(1%)

1%

(2%)

NA NA

Dodecylacetat 24%

(14%)

3%

(3%)

26%

(14%)

2%

(6%)

NA NA NA

NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler

Systemet med trioktylamin ble valgt til sammenligningsformål med andre organiske løsemidler

som ble testet i etterfølgende forsøk.


Det neste målet var testing av ulike organiske løsemidler. Spesiell interesse var knyttet til om

noen av dem ville gi høyere utbytte for de mer polare analyttene. Som vist i avsnitt 3.7. tabell

23 ble det testet seks ulike løsemidler i delforsøk 2 både med og uten trioktylamin. De ble

sammenlignet med SLM som besto av dodecylacetat og 1% trioktylamin. Alle andre

ekstraksjonsbetingelser unntatt SLM var uforandret i forhold til avsnitt 4.1.1.

Hensikten med dette forsøket var å velge løsemidler som hadde et bredt spekter av fysikalsk-

kjemiske egenskaper. Mange av dem var benyttet i tidligere PALME- og EME-prosjekter (9,

11, 47). Hvert løsemiddel ble testet med og uten TOA for å få ytterligere erfaringer med dette

reagenset.

Utfra de ulike løsemidlene klarte bis(2-etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat, begge med tilsatt

trioktylamin, å ekstrahere de fleste analyttene som fremstilt i figur 9. Utbyttene av VEN, ODV

og NDV var over 60%. De skilte seg særlig fra utbytter av de mer polare metabolittene NODV

og NNDODV. De var på opptil 20%. Ingen av disse systemene klarte dog å ekstrahere de mest

polare glukuronidene. SLM med trioktylamin viste generelt bedre utbytter i forhold til sine

korresponderende systemer som besto av rene løsemidler. Bis(2-etylheksyl)fosfitt var unntaket

44

i denne sammenhengen. Grunnen var uklar, men en mulig forklaring var at dette løsemidlet

besatt egenskaper som dempet ikke-spesifikke bindinger til PVDF-membranen..

Enkelte utbytter overskred 100%. Den registrerte konsentrasjonen i akseptorfasen var dermed

høyere enn 1000 ng/ml som var representativ for 100% utbytte etter en fem gangers

oppkonsentrering forårsaket av volumforskjellen mellom donor- og akseptorfasen. Dette kunne

skyldes fordampningen av akseptorfasen som bidro til en litt høyere konsentrasjon, et lite avvik

i beregningen fra kalibreringskurven eller avvik i beregningen av topparealet som gjorde at

konsentrasjonen ble over 1000 ng/ml.

De tilhørende RSD-verdiene fra dette forsøket er representert i tabell 28. SLM med bis(2-

etylheksyl)fosfitt hadde RSD-verdier som ikke overskred 7% for noen av de ekstraherte

analyttene. Verdiene fra systemer med og uten trioktylamin var lignende. Ren tributylfosfat

hadde høyere RSD-verdier spesielt for mer polare metabolitter som ODV, NODV og

NNDODV. Tilsetting av trioktylamin bidro til en reduksjon av dem.

Figur 9 Ekstraksjonsutbytter som ble oppnådd med ulike organiske løsemidler i innledende faser av prosjektet

Ekstraksjonsbetingelser, unntatt organisk fase, var uforandret i forhold til tabell 27.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

Utb

ytte

VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU

45

Tabell 28 Tilhørende RSD-verdier for forsøk fra figur 9

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Dodecylacetat + 1% TOA 5% 4% 2% 9% NA NA NA

2-nitrofenyloktyleter 5% 32% 12% NA 11% NA NA

2-nitrofenyloktyleter + 1%

TOA

13% 17% 19% NA 23% NA NA

Bis(2-etylheksyl)fosfitt 7% 6% 6% 4% 4% NA NA

Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1%

TOA

7% 7% 6% 5% 4% NA NA

Dekanol 13% 13% 12% 37% 40% NA NA

Dekanol + 1% TOA 6% 14% 9% 29% 40% NA NA

Diheksyleter 13% 25% 38% 39% 82% NA NA

Diheksyleter + 1% TOA 5% 13% 5% 3% 12% NA NA

Pentylbenzen 10% 30% 8% NA NA NA NA

Pentylbenzen + 1% TOA 11% 22% 3% NA NA NA NA

Tributylfosfat 8% 16% 2% 22% 15% NA NA

Tributylfosfat + 1% TOA 3% 7% 6% 15% 14% NA NA


Det var ønskelig å karakterisere disse løsemidlene og undersøke om det var sammenheng

mellom deres fysikalsk-kjemiske egenskaper og deres ekstraksjonsevne. Tettheten, log P, antall

hydrogenakseptor/donor og arealet av den polare overflaten var tatt i betraktning. Ingen av dem

alene så ut til å ha særlig stor innflytelse på utbyttene. Kamlet og Taft-parametere derimot hadde

et mer synlig mønster som ble ansett som relevant for oppnådde resultater.

Disse parametere kategoriserer løsemidler med α, β og π* variabler som står for henholdsvis

hydrogendonor, hydrogenakseptor og polaritet egenskaper (24). Tabeller som er tilgjengelige i

vitenskapelig litteratur, tilbyr kun oversikten over et begrenset antall substanser. Bestemmelsen

av verdier som er representert i tabell 29, ble dermed gjort på bakgrunn av stoffer med lignende

strukturelle egenskaper.

46

Tabell 29 Estimerte Kamlet og Taft-parametere

Organisk løsemiddel Kamlet og Taft-parametere

α β π*

Dodecylacetat 01 0.51 0.51

Diheksyleter 02 0.52 0.32

Pentylbenzen 03 0.13 0.63

NPOE 04 0.34 14

Bis(2-etylheksyl)fosfitt NA NA NA

Tributylfosfat 05 0.85 0.75

Dekanol 0.75 0.85 0.55

NA = ikke tilgjengelig 1 Utgangspunktet ble tatt i etylacetat, propylacetat og butylacetat. β ser ut til å bli større med økende

kjedelengde mens π blir litt lavere med økende kjedelengde. α-verdien forblir lik 0 (24). 2 Basert på dietyleter og dibutyleter. α er 0. β kan bli marginalt større med økende kjedelengde. π holder seg

stabil på 0.3. 3 Basert på benzen, dimetylbenzen og trimetylbenzen. α er 0. β verdien ser ut til å bli veldig nært 0.1. π kan bli

litt lavere. 4 Basert på nitrobenzen.

Tall fra 2 til 5 er hentet den [28.03.2017] fra http://www.stenutz.eu/chem/solv26.php (48)

Basert på tilgjengelige tall ble det antatt at organiske løsemidler som hadde null verdi for α, høy

verdi for β og moderat π* uttrykte potensiale til å ekstrahere venlafaksin og dens metabolitter

mer effektivt.

Grunnen til bedre utbytter med bis(2-etylheksyl)fosfitt kan være dens evne til

hydrogenbindingsinteraksjoner. Dette løsemidlet ble nylig brukt i EME-studier og bekreftet at

det var anvendelig for ekstraksjoner av polare analytter med log P-verdier mellom -0.40 og 1.3

(49, 50).


Ioniske væsker, oppgitt i tabell 23 delforsøk 3, var en annen gruppe av løsemidler som ble testet

ut. Neglisjerbar flyktighet og lav toksisitet er blant de viktige fordelene (51, 52). Ioniske væsker

har allerede blitt benyttet i HF-LPME der analytter med log P mellom -0.09 og 1.63 ble

ekstrahert til akseptorfasen (53). Det var en av grunnene for å teste dem ut i dette PALME-

prosjektet.

Det praktiske arbeidet avslørte utfordringer knyttet til viskositeten av disse væskene.

Diffusjonen på PVDF-membranen ble betydelig redusert. I tillegg var det vanskelig å utføre

repeterbare pipetteringer. De ioniske væsker ble dermed oppvarmet til 50oC for å redusere

http://www.stenutz.eu/chem/solv26.php

47

viskositeten. Det reduserte allikevel kontrollen over betingelser. Avkjølingshastigheten av

væsken samt potensiell dekomponering var faktorer som kunne kreve en nøye overvåking.

Ekstraksjonen ble utført under samme betingelser som i avsnitt 4.1.1. med den forskjellen at

ioniske væsker ble brukt for å danne SLM. Hver SLM ble testet med fem parallelle forsøk. Data

(ikke vist her) viste ingen målbare topper for analyttene eller svært lave ekstraksjonsutbytter,

ofte under 5%. 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat med 1% trioktylamin ga

ekstraksjon av begge glukuronidene med utbytte omtrentlig på 3%.

Kamlet og Taft-parametere av disse væsker kan være en del av årsaken til de lave utbyttene. De

har lave β, moderate α og høye π* verdier (54, 55). Det sto i kontrast til trender som ble

observert i tabell 29. De antydet at løsemidler med høye verdier for hydrogenakseptor og

fraværende hydrogendonor egenskaper klarte å ekstrahere flere analytter. Samtidig kunne den

høye viskositeten bidratt til betydelig forlenget ekstraksjonstid. Tidligere studier fra HF-LPME

viste at 8-12 timer var nødvendig for oppnåelse av likevekt av ekstraksjoner som stabiliserte

seg på utbytter rundt 50-70% (53). Det var ansett som uakseptabelt langt i dette prosjektet.

Ekstraksjonen av glukuronider kunne skyldes en interaksjon mellom kationet av den ioniske

væsken og den ladede karboksylsyregruppen på analyttmolekylet. På denne måten kunne det

være dannet et kompleks som diffunderte lettere inn i SLM. På overflaten mellom SLM og

akseptorfasen ble det komplekset brutt slik at analytten ble frigjort i akseptorfasen.

Den eneste ioniske væsken som ekstraherte glukuronidene ble testet i en blanding med bis(2-

etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat i forhold 1:1 og 1% TOA for å undersøke om de hadde

supplerende effekt. Dette forholdet ble ansett som et forstandig utgangspunkt med potensiale

for videre optimalisering. Ekstraksjonsutbytter viste allikevel at kun tre analytter (ODV, NODV

og NNDODV) ble ekstrahert hvorav to under 8% (se Appendix II). Videreføring av denne ideen

ble dermed forkastet i dette prosjektet.

48

4.1.4. Testing av pH-betingelser i donorfasen

Analyttens polaritet er avhengig av hvilken pH de er oppløst i. Vanligvis justeres miljøet til et

pH-område som fremmer fullstendig uionisert tilstand av analyttene i donorfasen (3).

Sammenligning av hver enkelt profil tydet på at pH rundt 10 kunne gjøre analyttene mer

upolare. De er presentert i figur 10 til 13 og viser log D-verdien (y-aksen) til analytten som en

funksjon av pH (x-aksen). Alle profiler var baserte på estimerte algoritmer. Det var forventet

at forandringen av pH-betingelser ville forbedre diffusjonen gjennom membranen.

Figur 10 log D til VEN (blå), ODV (oransje) og NDV (grå) fremstilt som en funksjon av pH [hentet fra

chemicalize.com den 29.03.17] (56)

Figur 11 log D til NODV som en funksjon av pH [hentet fra chemicalize.com den 29.03.17] (56)

49

Figur 12 log D til NNDODV som en funksjon av pH [hentet fra chemicalize.com den 29.03.17] (56)

Figur 13 log D til NODVGLU (grønn) og NNDODVGLU (rød) som en funksjon av pH [hentet fra chemicalize.com

den 29.03.17] (56)

50

Bikarbonat-karbonatbuffer med pH 9.5 ble tilsatt til den vandige prøveløsningen i

donorbrønnene istedenfor 10 mM NaOH. Alle andre ekstraksjonsbetingelser forble uendret i

forhold til forrige forsøk. Utbyttene var høyere når buffer med lavere pH ble benyttet. Det gjaldt

for alle analytter unntatt glukuronidene som ikke ble ekstrahert i vesentlig grad med de fire

valgte organiske løsemidlene. Søylediagrammet i figur 14 viser at SLM med tributylfosfat

hadde høyere ekstraksjonsutbytter enn de andre testede systemene. Samtidig var RSD-verdier,

presentert i tabell 29, for dette systemet godt under 15% i motsetning til bis(2-etylheksyl)fosfitt

som hadde verdier opp mot 100%.

Figur 14 Utbyttene av analyttene etter ekstraksjoner med 4 ulike SLM og bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 i

donorfasen

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 14. Donorfase: 125 µl

0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen

på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5.

Tabell 29 RSD-verdier for ekstraksjoner via fire ulike SLM med bikarbonat-karbonat buffer

pH 9.5 i donorfasen

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Dodecylacetat + 1% TOA 5% 5% 9% 9% 5% NA NA

Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1%

TOA

84% 11% 105% 19% 28% NA NA

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%


Utb

ytte

Dodecylacetat + 1% TOA Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1% TOA

Tributylfosfat + 1% TOA 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat + 1% TOA

51

Tributylfosfat + 1% TOA 2% 11% 5% 9% 7% NA NA

1-metyl-3-oktylimidazolium

tetrafluoroborat + 1% TOA

NA 24% NA 15% 24% 41% 31%



Registrerte ekstraksjonsutbytter og RSD-verdier, spesielt ved bruk av tributylfosfat, gjorde at

SLM med fosfater og fosfitter ble ansett som gode kandidater for videre utforskning.

Løsemidler fra delforsøk 4 i tabell 23 ble testet i forhold til ekstraksjonsutbytter. I dette forsøket

ble NaOH erstattet med 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer med pH 9.5. Alle andre

ekstraksjonsbetingelser var uendret. Utvalget av disse løsemidlene ble tatt blant annet på

bakgrunn av løseligheten i vann, som bør være lavere enn 1.2 g/l, og HMS-informasjon

tilgjengelig fra sikkerhetsdatablader (57). Dodecylacetat som var tidligere brukt for

sammenligningsformål ble erstattet med tributylfosfat. Grunnen til det var at det sistnevnte

løsemidlet klarte å ekstrahere flere analytter med høyere utbytter og samtidig hadde avvik

mellom paralleller innenfor krav som stilles av internasjonale retningslinjer for validering av

bioanalytiske metoder (45).

Figur 15 Utbytter etter ekstraksjoner med ulike SLM basert på fosfater og fosfitter



på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

Figur 15 indikerer at ingen av de testede løsemidlene klarte å ekstrahere analyttene med høyere

utbytter i forhold til tributylfosfat. Triisodecylfosfitt (TIOPi) har en log P-verdi høyere enn 12.

Utbytter på under 20% kunne indikere at denne SLM var altfor upolar for de fleste analyttene.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

TBP + 1%TOA

DBPi DBPi + 1%TOA

TEHP TEHP + 1%TOA

TEHPi TEHPi + 1%TOA

TIOPi TIOPi + 1%TOA

Utb

ytte


52

Det var også en mulig forklaring for utbyttene som ble oppnådd med tris(2-etylheksyl)fosfat

(TEHP) og tris(2-etylheksyl)fosfitt (TEHPi), som har log P rundt 9. Forskjellen mellom de to

løsemidlene var en fosfat- og en fosfittgruppe. Resultater viste at fosfitt ga bedre utbytter for

den mest upolare analytten VEN mens fosfat ga høyere utbytter av de mer polare metabolittene

NODV og NNDODV. Noen av tidligere EME-studier beskrev bruk av både bis(2-

etylheksyl)fosfitt og bis(2-etylheksyl)fosfat som kan relateres til TEHP og TEHPi (50, 58, 59).

Begge disse løsemidlene ble brukt i EME for ekstraksjoner av polare analytter med log P på

henholdsvis -0.4 og -1.3. Fosfat i motsetning til fosfitt blir ladet ved basisk pH på det ene

oksygen atomet og dermed kan delta i ioniske interaksjoner. Det kan være en hypotetisk

forklaring av høyere ekstraksjonsutbytter for NODV og NNDODV. Ekstraksjonsutbytter under

30% ble observert for alle analytter unntatt VEN med SLM som besto av dibenzylfosfitt

(DBPi). Dette løsemidlet hadde lavest log P-verdi i dette forsøket. Aromatiske sidekjeder kunne

være mulige årsaken på grunn av bidrag til lavere Kamlet og Taft β-verdi (49). Det ble samtidig

observert at trioktylamin ikke nødvendigvis var gunstig for ekstraksjonsutbytter av mer polare

analytter. Utbyttene for NODV og NNDODV fra figur 15 viste at de var like eller litt høyere i

systemer uten trioktylamin. En mulig forklaring var at de mer upolare analyttene hadde større

affinitet til ikke-spesifikke bindingsseter på PVDF-membranen slik at trioktylamin hadde større

effekt i disse tilfellene.


Det var ønskelig å se om høyere andel av TOA i tributylfosfat kunne bidra til å maskere enda

flere bindingsseter på PVDF-membranen og forbedre ekstraksjoner, og om utbytter av mer

polare metabolitter ble påvirket. Tributylfosfat ble blandet i med 1, 10 og 20% trioktylamin.

Resultatene fra tabell 30 viste at jo mer trioktylamin i SLM desto lavere utbytter av de mer

polare metabolittene. Det ble dermed besluttet å bruke 1% i kommende forsøk.

53

Tabell 30 Utbytter og tilhørende RSD-verdier fra ekstraksjoner der SLM hadde ulik mengde

av trioktylamin


30. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med

den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm.

Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Tributylfosfat + 1%

TOA

124%

(10%)

122%

(16%)

105%

(15%)

79%

(24%)

62%

(19%)

NA NA

Tributylfosfat + 10%

TOA

121%

(9%)

101%

(5%)

88%

(4%)

61%

(7%)

46%

(6%)

NA NA

Tributylfosfat + 20%

TOA

130%

(7%)

103%

(4%)

84%

(7%)

53%

(5%)

38%

(2%)

NA NA


4.1.7. Utvelgelse av SLM ved samtidig testing av utvidede pH-betingelser i donorfasen –

del 6

Tripentylfosfat var et helt nytt løsemiddel i PALME-sammenheng. Det ble testet i forhold til

tributylfosfat, som presentert i tabell 23 delforsøk 5. Tripentylfosfat har lavere løselighet i vann

og høyere kokepunkt slik at fordampning fra membranen var redusert (43). SLM med dette

løsemidlet ble dermed ansett som mer stabil. I tillegg hadde det mer gunstige HMS-egenskaper

(57). Tripentylfosfat er blant annet ikke kreftfremkallende i motsetning til tributylfosfat, ifølge

sikkerhetsdatablader.

Formålet med dette forsøket var å undersøke ekstraksjonsutbytter og RSD-verdier med SLM

som besto av tripentylfosfat i forhold til tributylfosfat. Samtidig var det ønskelig å teste flere

buffere (beskrevet i tabell 21). Unntatt de nevnte forandringer i donorfasen og SLM ble andre

ekstraksjonsparametere holdt konstant.

Utbyttene av analyttene, vist i tabell 31, var bedre eller minst like gode for VEN, ODV, NDV

og NODV med SLM som var basert på tripentylfosfat. Ekstraksjoner av den mer polare

metabolitten NNDODV gav derimot høyere utbytte med tributylfosfat. Dette kunne skyldes

høyere log P-verdi og dermed mer lipofile egenskaper for tripentylfosfat. Det sistnevnte

løsemidlet ga RSD-verdier under 10%, og i mange tilfeller var RSD selv under 5%. Det ble

54

bestemt at optimaliseringsforsøk skulle utføres med tripentylfosfat. Begrunnelsen for den

avgjørelse var større stabilitet av SLM i løpet av ekstraksjonen. Det var synlig ved hjelp av

RSD-verdier som i signifikant flere tilfeller var lavere for SLM som besto av tripentylfosfat i

forhold til tributylfosfat. I tillegg var det et mer operatør- og miljøvennlig løsemiddel.

Den andre delen av dette forsøket skulle undersøke om andre pH-betingelser kunne ha en effekt

på ekstraksjonsutbyttene. Til sammen ble syv forskjellige bikarbonat-karbonatbuffer testet med

pH mellom 9.4 til 10.5.

Ekstraksjonen av VEN og ODV var nesten fullstendige i alle tilfeller og så ikke ut til å bli

påvirket av de små pH-endringene i signifikant grad. NDV derimot ble ekstrahert i betydelig

større grad ved mer basisk pH. En mulig forklaring var høyere pKa-verdi av denne analytten.

Det kreves mer basisk miljø for at analytten skulle eksistere i sin uladede form. Ekstraksjonene

av NODV og NNDODV via tripentylfosfat-baserte membraner viste at buffer med høyere pH

kunne øke utbytter med henholdsvis 20 og 10%. Dette forsøket indikerte at selv en liten endring

i pH på rundt en enhet kunne gi vesentlige forandringer av ekstraksjonsutbyttene. Forandring

av pH-betingelser bidro ikke til signifikante forskjeller i RSD-verdier som forble under 15%.

Tabell 31 Sammenligning av utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med

tripentylfosfat og tributylfosfat i et pH-område mellom 9.4 til 10.5


31. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer med pH-verdier fra tabell 31 + 125

µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml.

Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Buffer 1 pH 9.4 TBP + 1%

TOA

110%

(5%)

97%

(9%)

81%

(8%)

61%

(17%)

50%

(11%)

NA NA

Buffer 1 pH 9.4 TPP + 1%

TOA

113%

(6%)

107%

(6%)

74%

(3%)

59%

(4%)

40%

(6%)

NA NA


TOA

106%

(4%)

92%

(6%)

85%

(2%)

60%

(5%)

49%

(3%)

NA NA


TOA

104%

(4%)

108%

(3%)

86%

(2%)

67%

(3%)

42%

(5%)

NA NA


TOA

112%

(5%)

93%

(6%)

97%

(11%)

68%

(7%)

55%

(8%)

NA NA

55


TOA

108%

(5%)

111%

(3%)

95%

(5%)

71%

(3%)

47%

(5%)

NA NA


TOA

106%

(4%)

89%

(5%)

91%

(2%)

66%

(4%)

53%

(1%)

NA NA


TOA

104%

(9%)

108%

(5%)

101%

(5%)

76%

(3%)

47%

(4%)

NA NA

Buffer 5 pH 10.1 TBP +

1% TOA

106%

(3%)

99%

(7%)

102%

(6%)

77%

(14%)

62%

(17%)

NA NA

Buffer 5 pH 10.1 TPP +

1% TOA

99%

(8%)

108%

(4%)

100%

(3%)

77%

(5%)

49%

(5%)

NA NA


1% TOA

105%

(7%)

95%

(5%)

102%

(4%)

74%

(7%)

59%

(5%)

NA NA


1% TOA

106%

(4%)

108%

(3%)

107%

(6%)

77%

(2%)

50%

(2%)

NA NA


1% TOA

110%

(6%)

94%

(7%)

104%

(8%)

73%

(12%)

60%

(11%)

NA NA


1% TOA

106%

(3%)

113%

(7%)

109%

(5%)

81%

(3%)

50%

(4%)

NA NA


4.1.8. Utvelgelse av ionisk bærer

Ekstraksjon av glukuronidene var fortsatt ikke mulig med rene løsemidler til tross for at

utbyttene av de andre analyttene var betydelig forbedret i forhold til det opprinnelige

utgangssystemet som besto av dodecylacetat. De amfotære egenskapene var muligens en av

hovedutfordringene. Karboksylsyregruppen i glukuronidstrukturen var ladet i det basiske

miljøet i donorfasen. For å utnytte denne negative ladningen under ekstraksjon ble det bestemt

å teste tilsetning av ioniske bærere med en positiv ladning til SLM. Aliquat 336 ble valgt på

bakgrunn av tidligere erfaring fra en annen prøveopparbeidelsesteknikk (14). I tillegg ble fire

andre forbindelser valgt der to av dem, tetradecylammoniumbromid (TDA) og

dodecyltrimetylammoniumbromid (DCMA), ble oppløst i organisk fase mens de to andre,

tetraetylammoniumbromid (TEAB) og tetrabutylammoniumfosfat (TBAP), ble løst i den

vandige donorfasen. De ioniske bærerne er nevnt i tabell 21. Alle disse stoffene var kvartære

aminer, og forskjellen mellom dem var oppbygningen av sidekjedene. TDA og DCMA ble

blandet sammen med tributylfosfat og utgjorde 5% av den organiske fasen (ikke fullstendig

oppløst). TEAB og TBAP utgjorde 2% av den vandige donorfasen

56

Analyttblandingen var oppløst i donorfasen som ble justert med bikarbonat-karbonatbuffer til

pH 9.5. I to tilfeller ble det tilsatt ioniske bærere til donorfasen som nevnt ovenfor. Analyttene

ble deretter ekstrahert til 20 mM maursyre via SLM. Alle andre ekstraksjonsbetingelser ble

uforandret.

Figur 16 Ekstraksjonsutbytter i systemer med ioniske bærere


0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med og uten ioniske bærere. Analyttenes

endelige konsentrasjon i donorfasen var 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

Tabell 32 Tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ioniske bærere fra figur 16

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

TBP + 1% TOA 12% 23% 12% 26% 18% NA NA

TBP + A336 (80:20) 54% 54% 55% 48% 50% 10% 20%

TBP + DCMA + 1% TOA 3% 10% 8% 10% 9% NA NA

TBP + TBAP + 1% TOA 9% 14% 6% 20% 18% NA NA

TBP + TDA + 1% TOA 9% 9% 4% 5% 13% 9% 8%

TBP + TEAB + 1% TOA 5% 3% 6% 7% 11% NA NA


Ekstraksjoner av glukuronidene var vellykket med to systemer. Det gjaldt Aliquat 336 og TDA.

Mekanismen bak var trolig en kompleksdannelse mellom negativt ladet analytt og ionisk bærer

med positiv ladning. Komplekset var lipofilt nok til å distribueres over i SLM. På

grenseoverflaten mellom SLM og akseptorfasen hadde det sure miljøet muligens bidratt til at

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%


Utb

ytte

TBP + 1% TOA TBP + A336 (80:20) TBP + DCMA + 1% TOA

TBP + TBAP + 1% TOA TBP + TDA + 1% TOA TBP + TEAB + 1% TOA

57

karboksylsyren mistet ladningen slik at komplekset dissosierte, og glukuronider som i tillegg

fikk ladning på aminogruppen, ble oppløst i akseptorfasen mens den ioniske bæreren forble i

SLM. De andre ioniske bærerne fungerte ikke tilfredsstillende.

Aliquat 336 bidro til en ekstraksjon på 16% for NODVGLU og 11% for NNDODVGLU.

Ekstraksjonsutbyttene for de andre mindre polare analyttene var derimot lavere i forhold til

SLM som ikke hadde tributylfosfat. En mulig forklaring bak det var viskositeten av Aliquat 336

som gjorde at ekstraksjonshastigheten ble forsinket. I tillegg kunne de fysikalsk-kjemiske

egenskapene til SLM være forandret slik at fordelingskoeffisienten fra donorfasen ble redusert.

SLM med TDA klarte å ekstrahere begge glukuronidene med utbytter på omkring 1%. Samtidig

var utbyttene for alle de andre analyttene forbedret i forhold til SLM som besto av tributylfosfat

med 1% trioktylamin. Grunnen til det var ukjent siden den kationiske bæreren ikke burde ha

effekt på de basiske analyttene. Alle RSD-verdier med TDA var under 15%.

4.1.9. Testing av ulike løsemidler og styrker i akseptorfasen

Tabell 21 viser at ulike løsemidler ble testet i akseptorfasen der både maursyre og

trifluoreddiksyre hadde tre ulike konsentrasjoner. Hensikten med dette forsøket var

undersøkelse av potensielle effekter av akseptorfasen på ekstraksjonsutbyttene av analyttene.

Disse løsemidlene var valgt på bakgrunn av tidligere studier av PALME (12). Utvalg av

potensielle kandidater var begrenset siden akseptorfasen måtte danne et surt miljø for å fremme

ioniseringen av analyttene og samtidig være flyktig for å bli kompatibel med LC-MS.

Figur 17 Ekstraksjonsutbytter med maursyre og trifluoreddiksyre som akseptorfaser

Akseptorfase: 50 µl av løsninger vist i figur 17. Organisk fase: 4 µl TBP + 20% A336. Donorfase: 125 µl 0.1 M

bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på

200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


Utb

ytte

20mM HCOOH 100mM HCCOH 200mM HCOOH 50mM TFA 100mM TFA 150mM TFA

58

Donorfasen i dette forsøket var justert til pH 9.5 med bikarbonat-karbonatbuffer. De organiske

løsemidlene i SLM var tributylfosfat med 20% Aliquat 336.

Resultatene i figur 17 viser at de laveste konsentrasjonene av trifluoreddiksyre ga lignende

ekstraksjonsutbytter i forhold til systemer som benyttet maursyre. Det gjaldt for de mest upolare

analyttene. Ekstraksjonen av glukuronider med trifluoreddiksyre var derimot under 5% for alle

konsentrasjoner av akseptorfasen. Grunnen til det kunne være redusert dissosiasjon av analytter

fra komplekser med den ioniske bæreren. Resultatene viste at maursyre var den akseptorfasen

som ga høyere utbytter. De så ut til å bli avhengige av konsentrasjonen til maursyre der 100

mM fungerte bedre for de fleste analyttene i forhold til de andre konsentrasjonene.

Tabell 33 Tilhørende RSD-verdier for figur 17

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

20mM HCOOH 9% 8% 7% 18% 7% 6% 6%

100mM HCCOH 23% 23% 13% 16% 17% 10% 7%

200mM HCOOH 6% 9% 9% 6% 6% 24% 11%

50mM TFA 9% 2% 9% 10% 10% 16% 18%

100mM TFA 8% 8% 19% 15% 13% 30% 51%

150mM TFA 68% 71% 64% 62% 61% 119% 120%

Den andre hypotesen var at DMSO, som er et organisk løsemiddel blandbar med vann, kunne

bidra til høyere utbytter av analytter ved å øke deres fordelingskoeffisienter over i

akseptorfasen. DMSO ble tilsatt til maursyre i tre ulike forhold som vist i tabell 21.

Data (se Appendix III) viste at ekstraksjonsutbytter var lavere for alle analytter i forhold til

akseptorfaser uten DMSO. Økende mengde av dette løsemidlet resulterte i redusert utbytte.

DMSO er et løsemiddel som klarer å løse opp flere organiske forbindelser (60). Grunnen til

reduksjonen av ekstraksjonsutbytter var dermed ukjent.

59

4.2. Optimaliseringsforsøk

4.2.1. Optimalisering av SLM

De innledende forsøkene viste at sammensetningen av SLM var en av de mest sentrale

parameterne som påvirket ekstraksjonsprosessen av analyttene. Hensikten med forsøkene i

dette avsnittet var å finne hvilke løsemidler og ioniske bærere som ga de høyeste utbyttene og

RSD-verdier under 15%. Sammensetningen av de ni testede SLM er beskrevet i tabell 24.

Ekstraksjonsbetingelser er beskrevet i avsnitt 3.8.1. Den største vekten ved vurderingene av

data ble lagt på de mest polare metabolittene.

Ren løsning av tripentylfosfat både uten og med tilsetning av trioktylamin var ikke i stand til å

ekstrahere glukuronidene. Det bekreftet behovet for en ionisk bærer. TDA var ikke fullstendig

oppløst i noen av de testede SLMene. Tilsetningen av den ioniske bæreren i fast form ble derfor

forkastet på grunn av begrenset løselighet.

Figur 18 Ekstraksjonsutbytter med ulike SLM-sammensetninger



på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet

900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

SLM som besto av tripentylfosfat i en blanding med 20% Aliquat 336 klarte å ekstrahere alle

analytter. Ekstraksjonsutbyttet av glukuronidene var opp mot 17 og 19%. Alle RSD-verdier for

dette systemet var under 15%. Resultatene fra figur 18 viser i tillegg at tilsetning av trioktylamin

bidro til reduserte utbytter. På bakgrunn av tilgjengelige data ble det konkludert med at videre

trinn av optimaliseringsprosessen ble utført med SLM som besto av tripentylfosfat og Aliquat

336.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

TPP TPP + 1%TOA

TPP + 1%TOA + 20%

A336

TPP + 1%TOA + 3%

TDA

TPP + TOA1% + TDA

20%

TPP + TOA1% + TDA3% + A336

20%

TPP + TDA3%

TPP + A33620%

TPP + TDA3% + A336

20%

Utb

ytte


60

I det neste steget i optimalisering av SLM ble det fokusert på mengden av ionisk bærer i SLM.

De eksperimentelle betingelsene er beskrevet i flere detaljer i avsnitt 3.8.2.

Figur 19 Ekstraksjonsutbytter med varierende mengde av Aliquat 336 i SLM



på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet


Ekstraksjonsutbyttene var økende i takt med høyere andel av Aliquat 336. Økningen var

kontinuerlig for glukuronider mens utbyttene til de andre analyttene begynte å falle når

mengden av Aliquat 336 ble økt fra 25 til 30 %. Ekstraksjonsutbytter er vist i figur 19 med

tilhørende RSD-verdier i figur 20. En mulig forklaring var økende viskositet av den organiske

fasen og redusert diffusjonshastighet til analyttene som ikke var avhengige av

kompleksdannelsen.

Figur 20 RSD-verdier for tilhørende forsøk fra figur 19

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

A336 0% A336 10% A336 15% A336 20% A336 25% A336 30%

Utb

ytte

Mengde av A336 i blanding med TPP


0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%


RSD

-ver

die

r

TPP + A336 0% TPP + A336 10% TPP + A336 15% TPP + A336 20% TPP + A336 25% TPP + A336 30%

61

Basert på resultatene fra begge forsøk ble det bestemt at den optimale sammensetningen av

SLM for venlafaksin og dens metabolitter var tripentylfosfat blandet med 25% A336.

4.2.2. Optimalisering av buffer pH i donorfasen

De innledende forsøk antydet at pH i donorfasen kunne påvirke ekstraksjonsutbyttene. Det var

dermed ønskelig å finne den optimale pH-verdien som ville sikre de høyeste utbyttene for alle

analytter.

Fosfat- og bikarbonat-karbonatbuffer i tillegg til NaOH ble testet som nevnt i avsnitt 3.8.3.

Resultatene er vist i tabell 34. Fosfatbuffer ga utbytter på under 10% for de fleste analyttene

unntatt venlafaksin. Grunnen til det var sannsynligvis at analyttene var til stede i ladet form ved

pH 7.4 slik at de ikke kunne diffundere fra donorfasen til SLM. Bikarbonat-karbonatbuffer ga

bedre utbytter enn fosfat og NaOH. Utbyttene økte i mer basisk miljø. Det ble allikevel

observert et fall når NaOH-løsningen ble brukt. Det gjaldt hovedsakelig glukuronidene. Den

hadde pH som var over to enheter høyere enn den mest basiske bikarbonat-karbonatbufferen

fra dette delforsøket. Det var i samsvar med endring av polariteten som en variabel av endrende

pH beskrevet i figur 10-13. En nøye kontroll av pH-betingelser ble dermed ansett som

nødvendig.

Tabell 34 Ekstraksjonsutbyttene med tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ulike pH-

verdier i donorfasen - delforsøk 1

Akseptorfasen: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336.

Donorfasen: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH som vist i tabell 34 + 125 µl

analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl

interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet


VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Buffer pH 7.4 12%

(5%)

10%

(4%)

1%

(6%)

1%

(5%)

2%

(8%)

0.2%

(4%)

0.4%

(7%)

Buffer pH 9.5 70%

(12%)

63%

(13%)

35%

(9%)

33%

(10%)

37%

(8%)

2%

(30%)

5%

(22%)

Buffer pH 9.7 73%

(6%)

67%

(7%)

40%

(6%)

37%

(7%)

43%

(5%)

2%

(4%)

6%

(4%)

62

Buffer pH 9.9 72%

(13%)

67%

(13%)

44%

(19%)

38%

(14%)

47%

(17%)

3%

(29%)

6%

(25%)

Buffer pH 10.1 56%

(12%)

49%

(14%)

40%

(12%)

36%

(15%)

38%

(19%)

4%

(13%)

8%

(10%)

Buffer pH 12.3 70%

(4%)

69%

(6%)

40%

(13%)

34%

(13%)

37%

(22%)

2%

(21%)

3%

(53%)

Siden den mest basiske bikarbonat-karbonatbufferen fra tabell 34 ga høyest utbytte for

glukuronidene, ble det gjennomført et supplerende forsøk som undersøkte et utvidet spekter av

pH-verdier som var mulige å oppnå med den bufferen.

Forsøk ble utført på ulike dager. Dermed har delforsøket fra tabell 35 inkludert en del like pH-

styrker for å bidra til større sikkerhet i den endelige beslutningen. Bikarbonat-karbonatbuffer

med pH 10.5 viste de høyeste ekstraksjonsutbyttene for glukuronidene i forhold til andre

systemene. Ekstraksjonsutbyttene av de andre polare metabolittene NODV og NNDODV var

rundt 50% som er høyere enn med de fleste andre betingelser. Samtidig var RSD-verdiene

mellom 0 og 6%. Disse betingelser ble ansett som optimale til tross for at pH 10.5 var igjen den

ytre grenseverdien. Det betyr at de målte ekstraksjonsutbyttene hadde økende tendenser,

spesielt for glukuronidene. Samtidig ble det observert at forskjeller mellom utbyttene var lave

ved sammenligning av pH 10.1 eller 10.3 med 10.5 Det tydet på at kurvene for

ekstraksjonsutbytter flatet ut og eventuell utforskning av mer basisk pH ikke ville ført til en

vesentlig gevinst. Denne bufferen ble dermed brukt i de kommende forsøk.

Tabell 35 Ekstraksjonsutbyttene med tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ulike pH-

verdier i donorfasen - delforsøk 2

Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i tabell 34. Den eneste

forskjellen var buffer pH. Tabell 35 viser de testede pH-verdier.

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Buffer pH 7.4 14%

(6%)

11%

(6%)

1%

(2%)

1%

(2%)

2%

(2%)

0.2%

(6%)

0.2%

(4%)

Buffer pH 9.8 64%

(17%)

61%

(18%)

38%

(19%)

34%

(14%)

41%

(19%)

2%

(21%)

5%

(17%)

Buffer pH 9.9 56%

(38%)

55%

(45%)

40%

(42%)

34%

(39%)

40%

(43%)

3%

(22%)

6%

(18%)

63

Buffer pH 10.1 68%

(5%)

66%

(8%)

54%

(6%)

48%

(4%)

52%

(2%)

4%

(6%)

8%

(4%)

Buffer pH 10.3 70%

(14%)

63%

(18%)

54%

(14%)

47%

(10%)

50%

(13%)

5%

(13%)

9%

(10%)

Buffer pH 10.5 68%

(6%)

64%

(5%)

57%

(1%)

49%

(3%)

50%

(1%)

6%

(4%)

10%

(0%)

Buffer pH 12.3 72%

(5%)

68%

(8%)

54%

(5%)

38%

(3%)

36%

(3%)

3%

(8%)

4%

(8%)

4.2.3. Optimalisering av styrken i akseptorfasen

Avsnitt 3.8.4. gir oversikt over betingelser som ble undersøkt for å finne den optimale styrken

av maursyre i akseptorfasen. I likhet med de forrige forsøk ble den største vekten lagt på

ekstraksjoner av glukuronidene. Konsentrasjonen av maursyre i et område mellom 20 og 200

mM ble undersøkt. Generelt økte utbyttene for de mest polare analyttene med minkende

konsentrasjon av maursyreløsningene. På grunn av dette og siden 20 mM var den laveste

konsentrasjonen testet i forsøket, var det ønskelig å undersøke om maursyreløsningene med

lavere styrker kunne gi enda høyere utbytter.

Figur 21 Ekstraksjonsutbytter med akseptorfaser som hadde styrker mellom 20-200 mM

Akseptorfasen: 50 µl som vist i figur 21. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfasen: 115 µl 0.1 M


200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900

rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

Delforsøk 2 vist i figur 22 hadde til hensikt å studere konsentrasjonen av maursyre i området 1-

50 mM. Økning av ekstraksjonsutbyttene fra 1 mM til 20 mM kunne skyldes at akseptorfasen

ble surere og dermed sikret ladning av analyttene i økende grad. Følgende nedgang av

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

20 mM HCOOH 50 mM HCOOH 75 mM HCOOH 100 mM HCOOH 150 mM HCOOH 200 mM HCOOH

Utb

ytte


64

ekstraksjonsutbyttene ved høyere styrke av akseptorfasen kunne være en utsaltningseffekt som

begrenset løseligheten av analyttene. Tabell 36 viser at RSD-verdier var under 15% i de fleste

tilfeller. 20 mM maursyreløsning ble valgt til å bli den optimale akseptorfasen.

Figur 22 Ekstraksjonsutbytter med akseptorfaser som hadde styrker mellom 1-50 mM

Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i figur 21. Den eneste forskjellen var styrke

av akseptorfasen. Figur 22 viser de testede styrker av akseptorfasen.

Tabell 36 Tilhørende RSD-verdier for delforsøk 1 og 2 fra figur 21 og 22

Delforsøk 1

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

20 mM HCOOH 13% 8% 10% 4% 6% 12% 6%

50 mM HCOOH 11% 10% 11% 11% 9% 14% 12%

75 mM HCOOH 6% 6% 4% 8% 5% 16% 13%

100 mM HCOOH 3% 5% 2% 6% 7% 23% 19%

150 mM HCOOH 5% 8% 5% 5% 7% 9% 11%

200 mM HCOOH 5% 7% 5% 4% 6% 7% 6%

Delforsøk 2

1 mM HCOOH 9% 9% 5% 4% 7% 2% 4%

5 mM HCOOH 12% 10% 6% 6% 6% 4% 6%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

1 mM HCOOH 5 mM HCOOH 10 mM HCOOH 20 mM HCOOH 50 mM HCOOH

Utb

ytte


65

10 mM HCOOH 5% 3% 7% 4% 2% 4% 4%

20 mM HCOOH 8% 8% 8% 3% 8% 9% 4%

50 mM HCOOH 3% 7% 7% 5% 13% 4% 4%

4.2.4. Optimalisering av ekstraksjonstid

Tidskurve ble laget for å kunne bestemme den optimale ekstraksjonstiden. I avsnitt 3.8.5.

nevnes tidspunkter for målinger i dette forsøket. Både akseptorfasen og donorfasen ble

analysert med UHPLC-MS i dette forsøket. Grunnen til det var et ønske om å ha større

kjennskap til fordelingen av analyttene mellom de ulike fasene som funksjon av tid.

De fleste kurvene steg kraftig til 30 min for så å jevne ut mellom 45 og 60 min. VEN og ODV

konsentrasjonen i akseptorfasen falt deretter betydelig. Glukuronidene hadde en konstant og

sakte økning av utbyttene som funksjon av tid, som flatet ut etter 90 min.

Figur 23 Ekstraksjonsutbytter i akseptorfasen som en funksjon av tid

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µlTPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M



rpm. Ekstraksjonstid: 15, 30, 45, 60, 90, 120 og 180 min. n=4.

Kurvene fra donorfasen viste at mesteparten av alle analyttene ble fjernet fra denne fasen innen

15 min og holdt seg ganske jevnt over de tre kommende timene til tross for en liten økning etter

120 min for de mest upolare metabolittene. Dette kunne tyde på svak tilbake-ekstraksjon etter

lang tid.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Utb

ytte


66

Resultatene tydet på at analyttene som ikke ble registrert verken i akseptor- eller donorfasen,

befant seg andre steder. De kunne blitt fanget i SLM eller på brønnveggene. Den optimale

ekstraksjonstiden ble valgt til 45 min. Ved dette tidspunktet var ekstraksjonsutbyttene på det

høyeste for de fleste analytter, og det var ingen store forandringer i forhold til 60 min. Valg av

45 min fremfor 60 min bidro i tillegg til forbedret tidseffektivitet av prøveopparbeidelsestrinnet.

RSD-verdier for disse forsøkene presenteres i tabell 37 og 38. Gjennomsnittlige relative

standardavvik for analyttene i akseptorfasen var høyeste ved de to tidligste målingspunktene.

De ble fulgt av lavere verdier spesielt ved 45 min der alle RSD verdier var under 6%.

Figur 24 Ekstraksjonsutbytter i donorfasen som en funksjon av tid

Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i figur 23.

Tabell 37 RSD-verdier for akseptorfasen fremstilt i figur 23

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

15 min 15% 16% 18% 15% 17% 16% 13%

30 min 18% 19% 15% 9% 7% 14% 12%

45 min 3% 6% 3% 3% 6% 6% 6%

60 min 7% 11% 1% 5% 3% 17% 12%

90 min 13% 17% 5% 5% 7% 4% 2%

120 min 15% 17% 5% 3% 5% 7% 5%

180 min 9% 11% 10% 6% 13% 2% 6%

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

-5 10 25 40 55 70 85 100 115 130 145 160 175 190

Utb

ytte


67

Tabell 38 RSD-verdier for donorfasen fremstilt i figur 24 V

EN

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

15 min 4% 5% 8% 5% 12% 5% 3%

30 min 8% 16% 33% 6% 3% 4% 4%

45 min 5% 8% 13% 6% 6% 4% 4%

60 min 8% 15% 16% 6% 5% 1% 3%

90 min 8% 14% 9% 9% 9% 5% 4%

120 min 23% 25% 41% 15% 14% 2% 4%

180 min 4% 5% 7% 2% 7% 5% 4%

4.2.5. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen

Ekstraksjonen av glukuronidene og de andre polare metabolittene varierte avhengig av prøven

som de befant seg i. Det ble bekreftet ved hjelp av ekstraksjoner fra ulike urinprøver. Oppnådde

ekstraksjonsutbytter er vist i figur 25. For å redusere denne variasjonen ble effekten av ulike

bufferstyrker i donorfasen undersøkt. Høyere bufferstyrke reduserte innflytelsen av

matrikskomponenter og bidro til en utsaltingseffekt i donorfasen. Til sammen ble det undersøkt

fem ulike styrker som beskrevet i avsnitt 3.8.6. Bikarbonat-karbonatbuffer med styrke på 0.75

M viste de høyeste ekstraksjonsutbyttene med hensyn til glukuronider og ble dermed valgt for

videre arbeid. Det er presentert i tabell 39. Utbyttene av de andre metabolittene var

sammenlignbare med buffere som hadde styrker på 0.5 og 1 M.

Det ble utført et tilsvarende forsøk i forhold til det presentert i figur 25. Bikarbonat-

karbonatbuffer med styrke på 0.1 M ble erstattet med 0.75 M. Det er vist i figur I i Appendix

IV. Resultatene tydet på at variasjonen i ekstraksjonsutbytter var redusert med høyere

bufferstyrke spesielt for de fem mest upolare analyttene. RSD-verdier (ikke vist her) for de to

forsøkene var under 15% i de fleste tilfellene.

68

Figur 25 Sammenligning av ekstraksjonsutbytter oppnådd fra ekstraksjoner med ulike urin prøver

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M




Tabell 39 Ekstraksjonsutbytter og tilhørende RSD verdier for systemer med ulik styrke av

buffer i donorfasen

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336.

Donorfase: 115 µl bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 med bufferstyrke som vist i tabell 39 +

125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl

interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet


VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

0,1M 44%

(8%)

41%

(9%)

17%

(13%)

14%

(10%)

17%

(9%)

0.1%

(35%)

0.5%

(29%)

0,25M 47%

(3%)

44%

(7%)

36%

(7%)

27%

(5%)

26%

(4%)

0.8%

(17%)

1%

(12%)

0,5M

(n=3)

47%

(1%)

44%

(6%)

42%

(7%)

31%

(1%)

27%

(3%)

1%

(18%)

2%

(17%)

0,75M 43%

(8%)

42%

(6%)

38%

(6%)

32%

(1%)

27%

(8%)

2%

(6%)

2%

(4%)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Urin 1 Urin 2 Urin 3 Urin 4

Utb

ytte

Venlafaxine ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU

69

1M 44%

(7%)

44%

(10%)

39%

(6%)

33%

(3%)

27%

(5%)

2%

(19%)

2%

(12%)

Hypotesen bak variasjonen i utbyttene av glukuronider gjaldt mengden av salt i urinen som

burde bli høyere hvis den var konsentrert. Forsøk med såkalt «kunstig urin», beskrevet i avsnitt

3.6.2., viste at salt mengden kunne ha en betydelig effekt hovedsakelig på ekstraksjonen av

glukuronidene. Det er presentert i figur 26. Forsøk med urea viste tilsvarende utbytter og

ekstraksjonsmønster som tydet på at saltkonsentrasjonen hadde større relevans.

Figur 26 Ekstraksjonsutbytter fra kunstig urin som simulerte tre saltkonsentrasjonsnivåer

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M

bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl «kunstig urin» i tre saltkonsentrasjoner med analyttblanding med

den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen

i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

4.2.6. Testing av motioner

Figur 23 viser at glukuronidene hadde betydelig lavere ekstraksjonsutbytter i forhold til de

andre analyttene. Samtidig tydet kurvene fra figur 24 på at glukuronidforekomsten i donorfasen

var under 10%. En mulig forklaring var at de var fortsatt i SLM og klarte ikke å dissosiere fra

komplekset med bæremolekyler. Det var dermed ønskelig å undersøke om tilsetting av et

motion i akseptorfasen kunne forbedre ekstraksjonsutbytter. Motionet skulle ha større affinitet

til de funksjonelle gruppene på bæremolekylet og analytten for å fremme dissosiasjonen. De

var valgt på bakgrunn av den relative selektiviteten som de hadde (61). Til sammen var fire

motioner testet som vist i tabell 22. Ingen av dem klarte å forbedre ekstraksjonsutbytter.

Grunnen til det var ukjent.

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

Høy NaClK Medium NaClK Lav NaClK

Utb

ytte


70

4.3. Evaluering

De endelige ekstraksjonsparameterne var 125 µl urin som ble justert med 115 µl 0.75 M

bikarbonat-karbonatbuffer med pH 10.5 og 10 µl intern standard i donorfasen. SLM besto av 4

µl tripentylfosfat med 25% Aliquat 336 som ble immobilisert i PVDF-membranen.

Akseptorfasen var 50 µl av en 20 mM maursyreløsning. Ekstraksjonstiden var 45 min og

ristehastigheten var 900 rpm. Antall paralleller er beskrevet i avsnitt 3.9. Overnevnte

ekstraksjonsbetingelser var like for tabeller 41 til 47.

4.3.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense

Avsnitt 3.9.1. beskriver betingelser ved bestemmelsen av LOD og LOQ. Gjennomsnittlig høyde

av hver analytt ble sammenlignet med gjennomsnittlig støyhøyde og på bakgrunn av det ble

signal/støy forholdet funnet. Verdiene ble omregnet til konsentrasjoner oppgitt i ng/ml. LOQ

var beregnet ved hjelp av LOD som ble multiplisert med 3.3. Signal/støy forholdet var da lik

10. Verdier presenteres i tabell 40.

Tabell 40 Analyttens laveste deteksjons- og kvantifiseringsgrense

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336.

Donorfase: 125 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl analyttblanding som

vist i avsnitt 3.9.1. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

VEN NNDODV

LOD 0.26 ng/ml LOD 4.25 ng/ml

LOQ 0.87 ng/ml LOQ 14.15 ng/ml

ODV NODVGLU



NDV NNDODVGLU



NODV

LOD 0.55 ng/ml

LOQ 1.82 ng/ml

4.3.2. Linearitet

Serie 1 representerte intradaganalyse mens serie 1 og 2 var brukt for interdaganalyse. Analyse

av lineariteten i serie 2 var nødvendig for beregninger av nøyaktighet og presisjon. R2-verdier

for alle analyttene i begge serier var over 0.99.. Det eneste unntaket var NODVGLU i serie 2

som hadde en verdi over 0.98. Det er presentert i tabell 41. Verdier over 0.99 er viktige når

71

metoden skal brukes til kvantifisering (35). Verdier i nærheten av 1 tyder på god korrelasjon

mellom toppareal og konsentrasjon. Kalibreringskurver for NNDODVGLU, NODVGLU og

NNDODV var laget for et konsentrasjonsområde mellom 20 og 1000 ng/ml med syv ulike

konsentrasjonsnivåer. Hvert nivå besto av fire paralleller. De resterende analytter hadde ti

konsentrasjonsnivåer mellom 2 og 1000 ng/ml. Det oppfylte krav som stilles fra EMA

retningslinjer (45). De krever minst seks konsentrasjonsnivåer. Minst 75% av alle tilbake

kalkulerte konsentrasjoner oppfylte krav som stilles i forhold til avvik fra nominelle verdier.

Tabell 41 Kalibreringskurver med tilhørende ligninger og r2-verdier for alle analyttene

Serie 1 Serie 2

VEN 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9940 Y=-0.000735804+0.0016478*X-1.3285e-008*X^2

VEN 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9979 Y=-2.32071e-005+0.00178545*X-7.25281*X^2

ODV 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9968 Y=0.00214864+0.0048334*X-1.15407e-006*X^2

ODV 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9950 Y=0.006859+0.00486698*X-1.30346e-006*X^2

NDV 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9924 Y=-0.000961599+0.00151653*X-6.89745e-008*X^2

NDV 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9933 Y=0.00070075+0.00153775*X-6.49619e-008*X^2

VENY = -0.000735804+0.0016478*X-1.3285e-008*X^2 R^2 = 0.9940 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.5

1.0

1.5

Are

a R

atio

VENY = -2.32071e-005+0.00178545*X-7.25281e-008*X^2 R^2 = 0.9979 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.5

1.0

1.5

Are

a R

atio

ODVY = 0.00214864+0.0048334*X-1.15407e-006*X^2 R^2 = 0.9968 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0

1

2

3

Are

a R

atio

ODVY = 0.006859+0.00486698*X-1.30346e-006*X^2 R^2 = 0.9950 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0

1

2

3

Are

a R

atio

NDVY = -0.000961599+0.00151653*X-6.89745e-008*X^2 R^2 = 0.9924 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.5

1.0

1.5

Are

a R

atio

NDVY = 0.00070075+0.00153775*X-6.49619e-008*X^2 R^2 = 0.9933 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.5

1.0

1.5

Are

a R

atio

72

NODV 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9932 Y=0.000472237+0.00284025*X-3.40321e-007*X^2

NODV 2 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9908 Y=0.00321006+0.00286773*X-3.28882e-007*X^2

NNDODV 20 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9918 Y=0.00110324+0.00059385*X-2.51865e-008*X^2

NNDODV 20 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9926 Y=0.00043401+0.000642472*X-8.26168e-008*X^2

NODVGLU 20 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9921 Y=-0.000596131+0.000272586*X+5.80109e-

008*X^2

NODVGLU 20 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9856 Y=-0.000896059+0.000264512*X+5.52243e-

008*X^2

NNDODVGLU 20 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9923 Y=-0.000661663+0.00018261*X+2.11402e-

008*X^2

NNDODVGLU 20 – 1000 ng/ml

R^2 = 0.9902 Y=-00042814+0.000170422*X+2.65345e-008*X^2

NODVY = 0.000472237+0.00284025*X-3.40321e-007*X^2 R^2 = 0.9932 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Are

a R

atio

NODVY = 0.00321006+0.00286773*X-3.28882e-007*X^2 R^2 = 0.9908 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Are

a R

atio

NNDODVY = 0.00110324+0.00059385*X-2.51865e-008*X^2 R^2 = 0.9918 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Are

a R

atio

NNDODVY = 0.00043401+0.000642472*X-8.26168e-008*X^2 R^2 = 0.9926 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Are

a R

atio

NODVGLUY = -0.000596131+0.000272586*X+5.80109e-008*X^2 R^2 = 0.9921 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.1

0.2

0.3

Are

a R

atio

NODVGLUY = -0.000896059+0.000264512*X+5.52243e-008*X^2 R^2 = 0.9856 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.0

0.1

0.2

0.3

Are

a R

atio

NNDODVGLUY = -0.000661663+0.00018261*X+2.11402e-008*X^2 R^2 = 0.9923 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Are

a R

atio

NNDODVGLUY = -0.00042814+0.000170422*X+2.65345e-008*X^2 R^2 = 0.9902 W: 1/X

0 200 400 600 800 1000

ng/mL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Are

a R

atio

73

4.3.3. Overdrag

Det ble gjennomført en visuell inspeksjon av kromatogrammer. Hensyn ble tatt til

retensjonstider av analyttene og topper ble sammenlignet med den laveste

kvantifiseringsgrensen. Det ble ikke observert tegn til overdrag for intern standard eller noen

av analyttene.

4.3.4. Presisjon og nøyaktighet

Tabell 42 presenterer RSD verdier som ble beregnet på bakgrunn av QC-prøver fra serie 1. Alle

verdier var innenfor krav som stilles av EMA (45). Det tydet på at spredningen i resultatene var

liten.

Tabell 42 Evaluering - Presisjon fra intradaganalyse

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

2 ng/ml 4% 4% 7% 9%

6 ng/ml 7% 5% 4% 4%

20 ng/ml 8% 5% 6% 5% 13% 10% 11%

60 ng/ml 7% 6% 4% 8% 6% 7% 6%

400 ng/ml 5% 7% 4% 3% 6% 5% 6%

850 ng/ml 5% 5% 10% 8% 7% 9% 9%

Nøyaktigheten fra serie 1 er presentert i tabell 43. QC-prøvene for VEN, NDV og NODV

overskred kravene. Alle andre resultater plasserte seg innenfor kravene fra retningslinjer. Til

sammen hadde 6 av 36 verdier ikke oppfylt EMA kravene. De er markert med understreking.

Tabell 43 Evaluering - Nøyaktighet fra intradaganalyse

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

2 ng/ml 123% 93% 131% 116%

6 ng/ml 104% 107% 114% 118%

74

20 ng/ml 105% 115% 117% 125% 109% 119% 120%

60 ng/ml 98% 104% 107% 116% 108% 109% 100%

400 ng/ml 96% 96% 98% 100% 103% 109% 101%

850 ng/ml 104% 105% 109% 112% 111% 112% 108%

ODV, NDV og NODV fra interdaganalyse overskred 20% grensen for presisjon for de laveste

QC-prøvene. Dette kunne skyldes en liten avstand fra LOQ. Alle andre verdier var innenfor

krav som vist i tabell 44.

Tabell 44 Evaluering - Presisjon fra interdaganalyse

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

2 ng/ml 18% 41% 27% 36%

6 ng/ml 6% 11% 10% 12%

20 ng/ml 10% 10% 10% 12% 14% 12% 14%

60 ng/ml 7% 6% 8% 11% 11% 13% 12%

400 ng/ml 5% 5% 7% 7% 7% 9% 10%

850 ng/ml 7% 5% 10% 12% 9% 11% 10%

De laveste QC-prøvene for ODV var under (under 20%) mens var over (over 20%) kravene for

NODVGLU. EMA stiller krav til ± 20% avvik for de laveste QC-prøvene og 15% for de med

høyere konsentrasjoner (45). Det er presentert i tabell 45. Alle andre verdier var innenfor

grensene.

Tabell 45 Evaluering - Nøyaktighet fra interdaganalyse

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

2 ng/ml 109% 64% 102% 86%

6 ng/ml 101% 96% 103% 104%

20 ng/ml 96% 105% 107% 114% 110% 121% 118%

60 ng/ml 93% 101% 102% 108% 104% 109% 101%

75

400 ng/ml 94% 95% 102% 100% 101% 107% 102%

850 ng/ml 100% 103% 103% 104% 108% 105% 103%

For 72 presisjonsmålinger i evaluering var 69 innenfor EMA kravene mens tre målinger var

utenfor. For nøyaktighetsmålingene var 64 av resultatene innenfor kravene mens åtte målinger

var utenfor. Dette prosjektet var konseptuelt og dermed anses disse resultatene som akseptable

på nåværende stadium.

4.3.5. Matrikseffekter

De to laveste konsentrasjonene for NDV og alle for VEN var under kravet på 15% i forhold til

nøyaktighet. Det er presentert i tabell 46. Alle andre verdier var innenfor kravene. VEN og

NDV hadde lignende retensjonstider som differensierte fra hverandre med 0.03 min. Det kan

skje at litt av SLM lekket ut i akseptorfasen som funksjon av tiden, og at dette koeluerte med

VEN og NDV under LC-MS analysene. På denne måten bidro den til ioneundertrykkelse i MS.

Alternativt skyldes det noen ikke karakteriserte endogene forbindelser fra urinen som klarte å

diffundere gjennom SLM. Dette bør undersøkes nærmere på et senere tidspunkt.

Tabell 46 Matrikseffekter

6 ng/ml 60 ng/ml 340 ng/ml

VEN 73% 78% 84%

ODV 110% 102% 99%

NDV 77% 83% 86%

NODV 106% 100% 99%

NNDODV

95% 96%

NODVGLU

97% 98%

NNDODVGLU

91% 94%

4.3.6. Ekstraksjonsutbytte

Bestemmelsen av ekstraksjonsutbytte er ikke et krav fra retningslinjer (45). Resultater er

allikevel rapportert siden det er anbefalt for teknikker der analytter befinner seg i ulike faser

under prøveopparbeidelsestrinnet (1). Det er tilfelle med PALME. Ekstraksjonsutbytter vises i

tabell 47.

76

Tabell 47 Ekstraksjonsutbytte

6 ng/ml 60 ng/ml 340 ng/ml1

VEN 42% 40% 44%

ODV 42% 45% 47%

NDV 49% 50% 52%

NODV 49% 53% 53%

NNDODV

45% 46%

NODVGLU

14% 15%

NNDODVGLU 12% 12% 1 I motsetning til 6 og 60 ng/ml ble 340 ng/ml ikke beregnet i forhold til en tilsvarende QC-prøve konsentrasjon.

Utgangspunktet ble tatt i en QC-prøve på 400 ng/ml som ble ganget med 0.85 som ga 340 ng/ml.

Ekstraksjonsutbytter varierte fra 12% til 53%. Utbytter av glukuronidene var omtrent tre ganger

lavere i forhold til de andre analyttene. Forskjeller mellom de ulike konsentrasjonene var

neglisjerbare i de fleste tilfellene. Dette tydet på ekstraksjoner ikke var

konsentrasjonsavhengige.

77

5. Konklusjon

Resultatene fra dette prosjektet viste at PALME klarte å ekstrahere legemiddelet venlafaksin

med tilhørende metabolitter i ett prøveopparbeidelsestrinn fra urin. Metabolitter inkluderte

glukuronider som hadde amfotære egenskaper. PALME viste dermed for første gang at det var

en egnet teknikk for ekstraksjoner av analyttblandinger med et bredt spekter av log P-verdier

fra -1.2 til 2.5.

Det var mulig ved hjelp av en omfattende optimalisering av ekstraksjonsbetingelser. Det

innebar bruk av tripentylfosfat som var et helt nytt organisk løsemiddel i PALME-sammenheng.

Det var blandet sammen med Aliquat 336 siden dens bæreregenskaper muliggjorde

ekstraksjonen av glukuronidene. Denne blandingen var brukt for å danne SLM. En forsiktig

justering av pH-betingelser i donorfasen med bikarbonat-karbonatbuffer fremfor en NaOH-

løsning var også nytt og tillot oppnåelsen av høyere ekstraksjonsutbytter. Akseptorfasen

bestående av maursyreløsning ble til slutt injisert direkte i UHPLC-MS/MS.

Ekstraksjonsutbytter var mellom 12 og 53% for henholdsvis polar NNDODVGLU og NODV.

Evaluering av metoden var basert på retningslinjer fra europeiske legemiddelmyndigheter

(EMA). Testing av linearitet, presisjon, nøyaktighet, overdrag og matrikseffekter var blant de

undersøkte parameterne. Mange av de oppnådde verdiene var innenfor krav. Alle

kalibreringskurver hadde r2-verdier over 0.99 unntatt en enkel måling av NODVGLU som

plasserte seg over 0.98. Over 90% av QC-prøver var i samsvar med retningslinjer.

Evalueringsresultater var ansett som akseptable på grunn av den konseptuelle naturen av dette

prosjektet.

Videreutvikling av dette prosjektet kunne rette sitt fokus mot stabilitetsstudier for å få større

kontroll over eventuell degradering av analytter ved brukte betingelser. Matrikseffekter for de

mest upolare analyttene VEN og NDV burde også undersøkes nærmere i forhold til

komponenter fra urinen eller lekkasje av SLM ut i akseptorfasen som kunne bidra til

ioneundertrykkelse.

Disse resultatene bekreftet igjen potensialet av PALME. Den teknikken er egnet for

ekstraksjoner av analyttblandinger med et bredt område av log P-verdier. I tillegg tillater

PALME ekstraksjoner av både basiske og zwitterioniske analytter i ett

prøveopparbeidelsestrinn. Det åpner veien for nye anvendelsesområder som kan etter hvert

78

utnyttes for legemiddelmetabolismestudier i drug discovery eller monitorering av legemidler

og tilhørende metabolitter på rutinelaboratorier.

79

6. Referanseliste

1. Hansen SH, Pedersen-Bjergaard S. Bioanalysis of Pharmaceuticals: Sample

Preparation, Separation Techniques and Mass Spectrometry. Hoboken: Wiley; 2015. 318 s.

2. Schlittenbauer L, Seiwert B, Reemtsma T. Matrix effects in human urine analysis

using multi-targeted liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of

Chromatography A. 2015;1415:91-99.

3. Bylda C, Thiele R, Kobold U, Volmer DA. Recent advances in sample preparation

techniques to overcome difficulties encountered during quantitative analysis of small

molecules from biofluids using LC-MS/MS. Analyst. 2014;139(10):2265-2276.

4. Pawliszyn J, Pedersen-Bjergaard S. Analytical Microextraction: Current Status and

Future Trends. Journal of Chromatographic Science. 2006;44(6):291-307.

5. Jeannot MA, Cantwell FF. Solvent Microextraction into a Single Drop. Analytical

Chemistry. 1996;68(13):2236-2240.

6. Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid−Liquid−Liquid Microextraction for

Sample Preparation of Biological Fluids Prior to Capillary Electrophoresis. Analytical

Chemistry. 1999;71(14):2650-2656.

7. Sarafraz-Yazdi A, Amiri A. Liquid-phase microextraction. Trends in Analytical

Chemistry. 2010;29(1):1-14.

8. Gjelstad A. Parallel artificial liquid membrane extraction: micro-scale liquid–liquid–

liquid extraction in the 96-well format. Bioanalysis. 2013;5(11):1377-1385.

9. Roldán-Pijuán M, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. Parallel artificial liquid

membrane extraction of acidic drugs from human plasma. Analytical and Bioanalytical

Chemistry. 2015;407(10):2811-2819.

10. Ask KS, Bardakci T, Parmer MP, Halvorsen TG, Øiestad EL, Pedersen-Bjergaard S, et

al. Parallel artificial liquid membrane extraction as an efficient tool for removal of

phospholipids from human plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.

2016;129:229-236.

11. Vårdal L, Askildsen H-M, Gjelstad A, Øiestad EL, Edvardsen HME, Pedersen-

Bjergaard S. Parallel artificial liquid membrane extraction of new psychoactive substances in

plasma and whole blood. Journal of Chromatography B. 2017;1048:77-84.

12. Pilarova V, Sultani M, Ask KS, Novakova L, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. One-

step extraction of polar drugs from plasma by parallel artificial liquid membrane extraction.

Journal of Chromatography B. 2017;1043:25-32.

13. Ho TS, Egge Reubsaet JL, Anthonsen HS, Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE.

Liquid-phase microextraction based on carrier mediated transport combined with liquid

chromatography–mass spectrometry: New concept for the determination of polar drugs in a

single drop of human plasma. Journal of Chromatography A. 2005;1072(1):29-36.

14. Shariati S, Yamini Y, Esrafili A. Carrier mediated hollow fiber liquid phase

microextraction combined with HPLC–UV for preconcentration and determination of some

tetracycline antibiotics. Journal of Chromatography B. 2009;877(4):393-400.

15. Rodriguez-Aller M, Gurny R, Veuthey J-L, Guillarme D. Coupling ultra high-pressure

liquid chromatography with mass spectrometry: Constraints and possible applications. Journal

of Chromatography A. 2013;1292:2-18.

16. Kim HY, Yoon SH, Jeong T-Y, Yu S, Kim SD. Determination of conjugated estrogens

in human urine using carrier-mediated hollow-fiber liquid phase microextraction and LC-

MS/MS. Desalination and Water Treatment. 2016;57(34):16024-16033.

17. Magalhães P, Alves G, Llerena A, Falcão A. Venlafaxine pharmacokinetics focused

on drug metabolism and potential biomarkers. Drug Metabolism and Drug Interactions.

2014;29(3):129-141.

80

18. Holliday SM, Benfield P. Venlafaxine: A review of its pharmacology and therapeutic

potential in depression. Drugs. 1995;49(2):280-294.

19. Hiemke C, Baumann P, Bergemann N, Conca A, Dietmaier O, Egberts K, et al. AGNP

Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Psychiatry: Update 2011.

Pharmacopsychiatry. 2011;21(06):195-235.

20. Nemeroff CB, DeVane CL, Pollock BG. Newer antidepressants and the cytochrome

P450 system. American Journal of Psychiatry. 1996;153(3):311-20.

21. Howell SR, Husbands GEM, Scatina JA, Sisenwine SF. Metabolic disposition of 14C-

venlafaxine in mouse, rat, dog, rhesus monkey and man. Xenobiotica. 1993;23(4):349-359.

22. Kohler I, Guillarme D. Multi-target screening of biological samples using LC-MS/MS:

focus on chromatographic innovations. Bioanalysis. 2014;6(9):1255-73.

23. Putnam DF. Composition and concentrative properties of human urine. Technical

Report. Washington: McDonnell Douglas Astronautics Company; 1971. Report No.: NASA-

CR-1802 Contract No.: NAS1-8954.

24. Jessop PG, Jessop DA, Fu D, Phan L. Solvatochromic parameters for solvents of

interest in green chemistry. Green Chemistry. 2012;14(5):1245-1259.

25. Clement RE, Hao C. Liquid–Liquid Extraction: Basic Principles and Automation. I:

Pawliszyn J, red. Comprehensive Sampling and Sample Preparation. Oxford: Academic Press;

2012. s. 51-63.

26. Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-phase microextraction with porous

hollow fibers, a miniaturized and highly flexible format for liquid–liquid extraction. Journal

of Chromatography A. 2008;1184(1):132-142.

27. Gjelstad A, Jensen H, Rasmussen KE, Pedersen-Bjergaard S. Kinetic aspects of

hollow fiber liquid-phase microextraction and electromembrane extraction. Analytica

Chimica Acta. 2012;742:10-16.

28. Bello-López MÁ, Ramos-Payán M, Ocaña-González JA, Fernández-Torres R,

Callejón-Mochón M. Analytical Applications of Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction

(HF-LPME): A Review. Analytical Letters. 2012;45(8):804-830.

29. Chimuka L, Cukrowska E, Michel M, Buszewski B. Advances in sample preparation

using membrane-based liquid-phase microextraction techniques. Trends in Analytical

Chemistry. 2011;30(11):1781-1792.

30. Ho TS, Halvorsen TG, Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-phase

microextraction of hydrophilic drugs by carrier-mediated transport. Journal of

Chromatography A. 2003;998(1):61-72.

31. Carasek E, Merib J. Membrane-based microextraction techniques in analytical

chemistry: A review. Analytica Chimica Acta. 2015;880:8-25.

32. Gjelstad A, Andresen AT, Dahlgren A, Gundersen TE, Pederson-Bjergaard S. High-

Throughput Liquid–Liquid Extraction in 96-Well Format: Parallel Artificial Liquid

Membrane Extraction. LCGC Europe. 2017;30(1):10–17.

33. Eibak L, Parmer M, Rasmussen K, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. Parallel

electromembrane extraction in a multiwell plate. Analytical and Bioanalytical Chemistry.

2014;406(2):431-440.

34. Fekete S, Schappler J, Veuthey JL, Guillarme D. Current and future trends in UHPLC.

Trends in Analytical Chemistry. 2014;63:2-13.

35. Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Legemiddelanalyse. 2. utg. Bergen:

Fagbokforlaget; 2010. 505 s.

36. Lundanes E, Reubsaet L, Greibrokk T. Chromatography : basic principles, sample

preparations and related methods. Weinheim: Wiley-VCH; 2014. 207 s.

37. Vissers JPC, Claessens HA, Cramers CA. Microcolumn liquid chromatography:

instrumentation, detection and applications. Journal of Chromatography A. 1997;779(1):1-28.

81

38. Nováková L, Matysová L, Solich P. Advantages of application of UPLC in

pharmaceutical analysis. Talanta. 2006;68(3):908-918.

39. Steuer AE, Poetzsch M, Koenig M, Tingelhoff E, Staeheli SN, Roemmelt AT, et al.

Comparison of conventional liquid chromatography–tandem mass spectrometry versus

microflow liquid chromatography–tandem mass spectrometry within the framework of full

method validation for simultaneous quantification of 40 antidepressants and neuroleptics in

whole blood. Journal of Chromatography A. 2015;1381:87-100.

40. Bruins AP. Mechanistic aspects of electrospray ionization. Journal of Chromatography

A. 1998;794(1–2):345-357.

41. Schwartz JC, Senko MW, Syka JEP. A two-dimensional quadrupole ion trap mass

spectrometer. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2002;13(6):659-669.

42. Ando DJ, red. Mass spectrometry. 2. utg. Chichester: Wiley; 1999. 509 s.

43. American Chemical Society. Substance Identifier. [hentet 12.03.2017]. Tilgjengelig

fra: http://www.scifinder.cas.org.

44. Stoll VS, Blanchard JS. Buffers: Principles and practice. Methods in Enzymology.

1990;182:24-38.

45. Committee for Medicinal Products for Human Use - European Medicines Agency.

Guideline on bioanalytical method validation: 2011 [hentet 20.03.2017]. Tilgjengelig fra:

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC5

00109686.pdf.

46. Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategies for the assessment of

matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Analytical

Chemistry. 2003;75(13):3019.

47. Seip K, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. The potential of electromembrane

extraction for bioanalytical applications. Bioanalysis. 2015;7:463-480.

48. Stenutz R. Kamlet-Taft solvent parameters. [hentet 28.03.2017]. Tilgjengelig fra:

http://www.stenutz.eu/chem/solv26.php.

49. Huang C, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. Electromembrane extraction with

alkylated phosphites and phosphates as supported liquid membranes. Journal of Membrane

Science. 2017;526:18-24.

50. Huang C, Seip KF, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. Electromembrane extraction of

polar basic drugs from plasma with pure bis(2-ethylhexyl) phosphite as supported liquid

membrane. Analytica Chimica Acta. 2016;934:80-87.

51. Spietelun A, Marcinkowski Ł, de la Guardia M, Namieśnik J. Green aspects,

developments and perspectives of liquid phase microextraction techniques. Talanta.

2014;119:34-45.

52. Pabby AK, Sastre AM. State-of-the-art review on hollow fibre contactor technology

and membrane-based extraction processes. Journal of Membrane Science. 2013;430:263-303.

53. Tao Y, Liu J-F, Hu X-L, Li H-C, Wang T, Jiang G-B. Hollow fiber supported ionic

liquid membrane microextraction for determination of sulfonamides in environmental water

samples by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A.

2009;1216(35):6259-6266.

54. Lee J-M, Ruckes S, Prausnitz JM. Solvent Polarities and Kamlet−Taft Parameters for

Ionic Liquids Containing a Pyridinium Cation. The Journal of Physical Chemistry B.

2008;112(5):1473-1476.

55. Ab Rani MA, Brant A, Crowhurst L, Dolan A, Lui M, Hassan NH, et al.

Understanding the polarity of ionic liquids. Physical Chemistry Chemical Physics.

2011;13(37):16831-16840.

56. ChemAxon. logD vs pH. [hentet 29.03.2017]. Tilgjengelig fra:

http://www.chemicalize.com/.

http://www.scifinder.cas.org/

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf

http://www.stenutz.eu/chem/solv26.php

http://www.chemicalize.com/

82

57. EcoOnline AS. Sikkerhetsdatablad. [hentet 15.08.2016-15.05.2017]. Tilgjengelig fra:

http://www.ecoonline.no/.

58. Gjelstad A, Rasmussen KE, Pedersen-Bjergaard S. Electrokinetic migration across

artificial liquid membranes: Tuning the membrane chemistry to different types of drug

substances. Journal of Chromatography A. 2006;1124(1–2):29-34.

59. Arjomandi-Behzad L, Yamini Y, Rezazadeh M. Pulsed electromembrane method for

simultaneous extraction of drugs with different properties. Analytical Biochemistry.

2013;438(2):136-143.

60. Balakin KV, Savchuk NP, Tetko IV. In silico approaches to prediction of aqueous and

DMSO solubility of drug-like compounds: Trends, problems and solutions. Current Medicinal

Chemistry. 2006;13(2):223-241.

61. Simpson N, van Horne KC. Sorbent extraction technology. 2. utg. Harbor City, CA:

Varian Sample Preparation Products; 1993. 138 s.

http://www.ecoonline.no/

83

7. Appendix I. Sammenligning av ulike ristemønstre og volumer i donor- og akseptorfasen

Tabell I Utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner utført med Vibramax 100 og

Reax 2 ristemaskiner med ulike volum av donor- og akseptorfasen

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl dodecylacetat + 1% TOA.

Donorfase: 250 µl 10 mM NaOH-løsning med analyttblanding med den endelige

konsentrasjonen i donorfasen på 250 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min.

n=5.

OD

V

Ven

lafa

ksi

n

Cit

alo

pra

m

Paro

kse

tin

Flu

ok

seti

n

Flu

vok

sam

in

Norf

luok

seti

n

Ser

trali

n

Vibramax

200 µl Donor

100 µl Akseptor

9%

(8%)

82%

(6%)

74%

(14%)

77%

(20%)

68%

(26%)

83%

(10%)

58%

(15%)

49%

(22%)

Vibramax

200 µl Donor

75 µl Akseptor

10%

(6%)

79%

(3%)

67%

(9%)

72%

(11%)

64%

(17%)

78%

(7%)

54%

(11%)

46%

(23%)

Vibramax

200 µl Donor

50 µl Akseptor

9%

(8%)

74%

(4%)

63%

(8%)

71%

(12%)

61%

(14%)

77%

(6%)

52%

(7%)

45%

(11%)

Vibramax

150 µl Donor

50 µl Akseptor

18%

(9%)

86%

(2%)

81%

(2%)

88%

(7%)

94%

(3%)

90%

(3%)

66%

(7%)

71%

(5%)

Vibramax

250 µl Donor

50 µl Akseptor

12%

(13%)

68%

(6%)

58%

(9%)

64%

(15%)

55%

(15%)

69%

(9%)

46%

(7%)

36%

(16%)

Reax

200 µl Donor

100 µl Akseptor

14%

(6%)

92%

(6%)

85%

(6%)

95%

(8%)

92%

(3%)

89%

(8%)

71%

(3%)

79%

(7%)

Reax

200 µl Donor

75 µl Akseptor

10%

(24%)

76%

(18%)

70%

(23%)

72%

(29%)

76%

(29%)

72%

(28%)

56%

(27%)

70%

(24%)

Reax

200 µl Donor

50 µl Akseptor

11%

(16%)

77%

(6%)

70%

(10%)

81%

(10%)

82%

(7%)

81%

(10%)

57%

(11%)

73%

(9%)

Reax

150 µl Donor

50 µl Akseptor

15%

(13%)

78%

(5%)

75%

(10%)

86%

(12%)

92%

(10%)

79%

(12%)

60%

(16%)

71%

(14%)

Reax

250 µl Donor

50 µl Akseptor

9%

(27%)

62%

(12%)

58%

(14%)

69%

(15%)

64%

(21%)

70%

(14%)

47%

(23%)

49%

(38%)

84

Tabell I viser resultater som ble oppnådd med en annen analyttblanding bestående av basiske

legemidler. Den ble brukt i påvente av modellsubstansen venlafaksin og dens metabolitter.

Formålet med dette forsøket var å finne ut om PALME kunne brukes med andre ristemønster

og om ekstraksjonsutbytter ble betydelig påvirket. Vibramax 100 og Reax 2 begge fra Heidolph

Instruments (Schwabach, Tyskland) ble brukt.

Resultatene viste at PALME var mulig å bruke med en Reax 2. De tydet også på at optimale

volumer burde justeres individuelt til hver ristemaskin.

I tillegg ble det utført forsøk av tilsvarende omfang med andre ristemønstre. HulaMixer®

Sample Mixer fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), festing av PALME-platen

med 25o på Vibramax 100 og bruk av magnetomrøring i både akseptor- og donorfasen ble testet.

De førte allikevel til lavere ekstraksjonsutbytter, lekkasjer av fasene fra plater og perforasjon

av membranen.

Reax 2 og Vibramax 100 var testet for omvendte systemer. Det innebar at noen systemer ble

snudd slik at donorfasen ble fylt i akseptorbønner og akseptorfasen i donorbrønner. Reax 2 viste

at ekstraksjonsutbytter kunne oppnå samme nivå som for ikke omvendte systemer og samtidig

bevarte RSD-verdier under 15%. Vibramax 100 ga lavere ekstraksjonsutbytter for omvendte

systemer.

Det ble også utført sammenligning av ekstraksjonstider mellom Vibramax og Reax.

Tidskurvene hadde fem måletidspunkter fra 15 til 90 min. Både akseptor- og donorfasen ble

testet. Resultatene har ikke vist tydelige forskjeller i ekstraksjonstid profiler.

Til tross for høyere ekstraksjonsutbytter med Reax 2 i noen systemer ble det bestemt at

Vibramax 100 var den foretrukne ristemaskinen. Grunnen til det var muligheten for oppnåelsen

av høyere oppkonsentreringsfaktor, enklere bruk og redusert fare for lekkasjer.

85

II. Blanding av bis(2-etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat med 1-metyl-3-

oktylimidazolium tetrafluoroborat

Tabell II Utbytter og tilhørende RSD-verdier oppnådde med blanding av bis(2-

etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat med 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat i forhold

1:1.


II. Alle organiske faser inneholdt 1% TOA. Donorfase: 250 µl 10 mM NaOH-løsning med

analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 250 ng/ml. Ristehastighet


VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

Dodecylacetat 96%

(8%)

7%

(8%)

63%

(10%)

NA 1%

(7%)

NA NA

Bis(2-etylheksyl)fosfitt +

1-metyl-3-oktyl

imidazolium

tetrafluoroborat (1:1)

NA 26%

(14%)

NA 8%

(13%)

4%

(12%)

NA NA

Tributylfosfat +

1-metyl-3-oktyl

imidazolium tetrafluoroborat

(1:1)

NA 6%

(57%)

NA 5%

(17%)

3%

(9%)

NA NA


86

III. Tilsetting av DMSO til akseptorfasen

Tabell III Utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med varierende mengde av

DMSO i akseptorfasen

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TBP + 20% A336.

Donorfasen: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med

den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm.

Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.

VE

N

OD

V

ND

V

NO

DV

NN

DO

DV

NO

DV

GL

U

NN

DO

DV

GL

U

20mM HCOOH 69%

(15%)

53%

(7%)

60%

(17%)

49%

(21%)

51%

(12%)

8%

(14%)

15%

(11%)

20mM HCOOH +

25% DMSO

34%

(10%)

21%

(8%)

38%

(5%)

17%

(7%)

11%

(12%)

7%

(18%)

9%

(8%)

20mM HCOOH +

50% DMSO

9%

(33%)

6%

(29%)

12%

(49%)

5%

(37%)

3%

(34%)

2%

(44%)

2%

(56%)

20mM HCOOH +

75% DMSO

4%

(21%)

2%

(26%)

2%

(18%)

1%

(21%)

1%

(118%)

NA NA


87

IV. Sammenligning av flere urinprøver med 0.75M bikarbonat-karbonatbuffer

Figur I Sammenligning av ekstraksjonsutbytter oppnådd fra ekstraksjoner med ulike urin prøver

Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.75 M




0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Urin 1 Urin 2 Urin 3 Urin 4

Utb

ytte


88

V. Poster presentert på det 16. norske seminar i massespektrometri

av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin · 2017. 12. 7. · V Sammendrag For...

Documents

Transcript of av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin · 2017. 12. 7. · V Sammendrag For...