ASPECTOS ANATOMICOS Y FISIOLOGICOSDE CULTIVOS IN VITRO DE

Tropaeolum tuberosum (Ruiz & Pavon)

Orlando Torres Fernandez (1)Tito J. Fandifto Garcia (1)Margarita Perea Dallo& (2)

RESUMEN

Sc cultivaron explantes de peciolo de T tuberosum en rncdto Muraehtge& Skoog suplementado con auxin as y citoquininas. Se describe la formaci6nde callo y la regcncracion de organoides semejantes a ratces obtenidos apartir del subcultivo. Vastagos obtenidos mediante mtcropropagacton. seincubaron a temperaturas de 18°e y 22°C. en media MS para enratxarnten-to. observandose diferencias notorias en la morfologia de las .ntces.

SUMMARY

Petiole explants of T. luberosum were cultivated in Murashtge & Skoogmedium suplemented with auxins and citokinins. Callus formation andabnormal morphogenesis obtained from subcultures are described. Shootsobtained by micropropagalion were incubated at l8°e and 22°e in mediumMS for rooting. Notorius differences in root morphology were observed.

INTRODUCCION

El culttvo de tejtdos vegetales. adem as de ser un recurso de la biotecno-logia que ha permitida avances significativos en la solucion de problemasde prapagaci6n y mejoramiento de plantas de Importancta oconomtca.constituye un media que facilita la mvesttgacton bastca en dtfercntes areasde la morfologia, flstologta y gcnettca vegetal. En este trabajo sc presenta lasegunda parte de un estudio de culttvc de tejidos de la especte Tropaeolwntuberosun I''navto". "cubio", "anu").

(l) Departamento de Brclogta. Univcrsidad Nacional Apdo. Acrcro No. 23227(2) Profesora aststente. Departamento de Btclcgta. Facult.ad de Ciencias. Untvcrsadud Nacional deColombia. Apart.ado Aerec 23227, Bogota.

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T. tuberosum es una plarua herbacea ongrnarta de los Andes. en dondese culttva para ahmentacton desde antes de la llegada de los espanoles(Perez. 1956). EI principal producto aprovechable es su tubercula. lIamadopopularmente "cubio" en In Sabana de Bogota. en doncle el mercado parael ano de 1980 se calculo en unas 500 toneladas/mes (Gonzalezy Obando.1980)

Los anahsts de la composiri6n quimica del tubercula de T. tuberosumdemuestran que posee buenas cualidades como alimcnto; su proteinaconucne tOO05 los arntnoactdos esenctales. excepto la histidina: posee altocontenido de vitamina C y se Ie constdcra rnejor alimento que la yuca ysimilar a la papa. Igualrnente se cree que el t uberculo es aproptado para laindustria de la galleleria (Gonzalez y Obando. 1980).

Un estudio detallado de la historia del culttvo y de la importanciasocioeconomtca de T. lu1Jerosunl. 10presenta Villamizar (1985).

Teniendo en cuenta las deftcrencras nutrtctonales extstentes en grandesnucleos de la poblaci6n colombiana. es urgente l1evar a cabo estudios deaquellos productos que. como el cubto. pueden constHuirse en alternativaspara la alimentaci6n. Mediante el cultivo de tejidos vegetales es posiblemejorar la productividad e tnductr variaciones geneticas que permitanobtener productos de mayor coltdad. Para T. tuberosum no se han reportadotrabajos en Culuvo de Tejidos, excepto el ya publicado por los autores[Fandtno et al .. 1987).

EI presente articulo trata de diferentes aspectos de la anatomia y Ilsiologiadel desarrollo de los callos. asi como de la morfonenesis a partir de losmismos. Igualmente se describe el efecto provocado por la diferencia detemperatura sobre el proceso de enraizamiento "in vitro".

MATERIALES Y METODOS

Se trabajo con plantas cultivadas en predios de la Universidad Nacionalde Colombia. sede Bogota. Se tomaron hojas jovenes. las cuales se trans-ladaron al laboratorto. en donde se lavaron con agua y Teepol. Parainduccion de callo. se separaron explantes de peciolo de aproxrmadamente0.5 em. de longitud. Se desinfectaron surnergiendolos en Etanol 70%durante un minuto y luego en hipoc1otito de sodto 1% durante dos rntnutosDespues de enjuagarlos con agua desulada esteril. se colocaron en el mediode cultivo dentro de frascos de vidrio de 40 m!. Las "siembras" de losexplantes se hicieron en un ambiente aseptico dentro de una camara defiuido laminar. Para la micropopagaci6n. se separaron yemas axilares. lascuales se lIevaron al medio del cultivo siguiendo un procedimiento similar.

En todos los cultivos se utiliz{) un medio basico conformado por macro-nutrientes. micronutrientes. vitaminas y sacarosa segtm Murashige ySkoog (1962). el cual se ajust" a un PH inicial de 5.8 y se solidinc" conAgar-Agar 7g/litro. Finalmente se esteriliz6 en autoclave a una lemperaturade ]21°C Y 15 atm{)sferas de presion durante 20 minutos.

EJ medio basico se suplemenl6 con reguladores de crecimi£:nto vegetal.de acuerdo con el prop()sito de los diferentes cultivQs.

Para inducci6n de callo se cmplearon combinaciones de Kinctina (6-fur-fUrilaminopurina) en un rango de 0.) a 5 ppm con cada una de 1·.iSsiguientesauxinas: 2.4-D (Acido 2.4-diclorofenoxiacetico) 0.5 a 10ppm: AlA (AcidoIndolacetico) 0.01 a 2ppm y ANA (Acido Naflalenacetico) 0.5 a 2 ppm. Los

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cultivos se mcubaron en condtctones de luz U oscurtdad a una temperaturade 22°C-25°C,

EI subculUvo de callos para morfogenests. se efectuo en medio bastco concombtnactones de ANA0.5-2 ppm y BAP (6-bencilamino purina) 0.5-3 ppm,ala misma temperatura y con fotoperiodo controlado de 16 horas dtartas a2,000 lux.

En el cultivo de yernas, para la mtcropropagacton, se utfltzo media bastcosuplernentado can la citoquininas GAPy Kinetina (6-furfurilaminopurinal.en concentraciones de 0-5 ppm, fotoperiodo de 16 horas/dia a 2.000 lux,y se ensayaron tres temperaturas diferentes: 18°e. 22°C y 26°C.

El enratzarmento de vastagos obterndos por propagaci6n "in vitro", se llevoa cabo en medio basico al eual se Ie adicion6 ANA(1-2 ppm). Se mantuvoel mismo fotoperiodo y se ensayaron temperaturas de 18°e y 22°C.

Los resultados prelimianres de estos experimentos se presentaron enpubltcacion anterior (Fandino et al.. 19871

Los callos selecctonados para este estudio se mantuvieron en cultivoprolongado (90-100 dias) en oscurtdad. en medio basi co con concentracio-nes relativamente altas de 2,4-D (5-10 ppm) y Kinetina (3-5 ppm). atemperatura constante de 25°C.

Para los estudios anatomtcos durante la' formacion del callo. se observeprtmero la organizaci6n inicial de los tejidos del peciolo y se tomaronexplantes. cada 5 dias. para analizar los cambios histologtcos ocurridos.Igualmente se estudio la anatomia de los organotdes regenerados a partirde los callos.

Las muestras se fijaron en FAA durante 12 horas y se someueron a losprocedimientos corrtentee de deshidrataci6n con Elanol e tmbtbtcton enparafina para obtener secciones de 7-10 micras. Estas se colorearon conFast-Green y Hematoxilina. Tarnbien se htcieron cortes de material frescoa mano alzada. utilizando Safranina como color-ante.

Este trabajo se llevo a cabo en el laboratorio de culuvo de TejidosVegetates. Departamento de Btologia. Universidad Nacional de Colombia.Bogota,

RESULTADOS Y DISCUSION

Formacion del Callo

EI pectolo de T. tuberosum presenta un lumen central hacia 1<1parte basal.el cual va stendo ocupado por tejido parenqutrnatico a medida que se acercaa la lamina foliar. Los haces. vasculares en numero de 8 a 10 estandistrtbuldos hacia la peri feria rodeados por tejido parenqutrnattco.

A los 5 dlas los explantes comtenzan a ensancharse a manera de huso.El examen histol6glco demuestra pequenas agrupaciones de celulas indife-renciadas dentro de parenqutrna, A los 10 dias de culuvo haygran prolife-racton de estos nucleos mertsternattcos. A los 20 dias aun se conserva laforma alargada del explante. EI examen histologtco (Fig I) muestra que hadesaparecido toda evidencia de tejldo orgarnzado, y los constttuyentescelulares presentan una composici6n heterogenea. Se observ.ln zonas concelulas grandes y vacuoladas de forma irregular y zonas con pequeflascelulas isodiametticas de Upo meristematicoo

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Fig. 1. Sccci6n transversal de un explantc de peciolo de T. tuberoswn a los 20 dtasde culttvado. Observese que ha dcsparectdo la organfzacton de- los tejtdos.(J) Celulas tndtferenciadas. (0) Celulas dtferenctadas. 32>::.

Esta estructura interna del callo corresponde a la descripci6n hecha porotros autores (Butcher e Ingram. 1876). Los callos conststentes de paren-quima uniforme son muy raros; ej: Agave y Rosa (Narayanaswamy. )977).

Nuestras observaciones permitieron establecer que las celulas parenqut-mati cas son las reponsables de la formaci6n de callo a partir de explantesde peciolo de T. tuberosum. Nassuth et. al. (I980), encontraron que laformaci6n del callo en explantes de tallo de CoIJea canephora se tructa apartir de todo el tejido parenqutmattco localizado entre la epidermis y elcilindro central. No observaron actividad -del cambium vascular. Ellis yBorman (l97I) determinaron que las celulas del cambium vascular dteronortgen al calla en explan tes de tallo de nicoliana Tabacwn Raju y Mann(1970) demostraron para Echeveria elegans. mejor respuesta de inducci6ny forrnacton de calla. en hojas jovenes sin tejidos vasculares dtferenctados.que en hojas con tejido vascular diferenciaelo.

Es posible obtener callos en cultivos "in vitro" de diferentes tejidos talescomo epidermis. parenqutrna cortical y medular de tuberculos. cottledones.endospermo. ovocelulas y otros (Narayanaswamy. 1977). La nulipotencia-Iidad 0 totipotencialidad varia de una especie a otra y de un tejtdo a otro.de acuerdo con la condiciones de culttvo, ongen del explante y edad de laplanta (Tran Thanh Van. 1981).

MORFOGENESIS

Callos de 90-100 dias subculuvados para morfogenests (fig. 2) dleronongen. despues de 20-30 elias. a unos organoides de color h1anco-amari-Bento. de forma contca 0 ctlindrtca. los cuales crecieron preferencialmentepar eneima del media de culuvo (fig. 3). De aeuerdo can Esau (1965). estos

TOHHES 0., ~'ANDiNO P" PEREA M.' CUL11VOS IN vrrno 75

ll'i,. 2. Calla de 90 dias obtcntdo a partir del cultivo de un cxplantc de pectolo.

Fig. 3. Organotdee regenerados despues de 30 dias a partir del subcultfvo de callos.

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organoides revelan una eslructura interna con caracteristicas similares alas de muchas raices (fig.4 ). Se destaca el cilindro central con sistemaxtlernattco del ttpo diarco y unas celulas con paredes engrosadas semejantesa la endodermis de rakes de monocottledoneas y dtcouledoneas que nopresentan crecimiento secundario.

Fig. 4. Scccton transversal de los organofdcs rcgcncrados a partir de callos. N6tcsecI ctltndro vascular con xtlcma lipo diarco. La Ilccha tndtcacelulas con paredescngrosadas del tipo cndodcrmtco. lOOX.

Se presento tambien formacton de verdaderas rakes (organogenesis)delgadas, con abundantes pelos que crecian generalmente dentro del mediade CUltiVD.

Si bien el objetivo principal del cultivo de callos es la regeneraclon deplar.tas con variaciones geneucas aprovechables. mediante los procesos deorganogenesis y/o embrtogenesrs. esto no siempre es posible debido a quelas celulas han sido sometidas a una serie de procesos rruumattcos desdeel momento de la excision del explante. Alteracfones geneucas y fisiol6gicaspueden dar ongen a formas anormales como las obtenidas en el presenteestudto.

Despues de la excision, ocurren fen6menos tales como: incremento de lapenneabilidad de la membrana, destrucctcn 0 sintesis de hormonas decrecimiento y la consecuente activacion gcnetrca dtferenctal. cambios en laactividad de la peroxidasa y en el metabolismo de los compuestos fenoltcos,y muchos otros efectos cornplejos que afectan el "estado celular tnherente"ITran Than Van, 1981).

En la mayoria de los casus, la capactdad de regeneracton de vas lagosdisminuye con la edad y el subculuvo. pero la capacidad de formar raicespuede persistir por anos (Narayanaswamy, 1977). Loewenberg (1969) resal-

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t6 Ia capacidad de callos de Cyclamen persicum para regenerar vastagos yraices despues de stele anos de subcultivo.

Otro factor que afecta seriamente la organogenesis a partir de callos es lautiltzacton de 2-4-D. especialmente en altas concentractones. EI AlA Y elANAson auxinas mas adecuadas para mantener la estabilidad cromos6rni-ca (Nickelly Torrey. 1969). Para T tubemsum 110 fue posible obtencr callosempleando estos dos ulumos reguladores de crecimiento. aunque [alto unestudio mas prod undo al respeeto.

EI 2,4-D es ampliamente utilizado en la induccion de callo. perc losexplantes deben transferirse en corto tiempo a un media con c.toqutntnaspara mantener el potencial de regeneraci6n del vastago. EI m-rnterumten tode In estabilidad cromos6mica en cultivos de callos y celulas ell suspenstonconstttuye, en el momenta. uno de los principales objetivos ell las tnvcsn-gactones de organogenesis "in vitro" (Flick. et al., 1983).

ENRAIZAMIENTO

Los vastagce obtenidos por micropropagaci6n a partir de yemas quecrecieron en el medio para enraizamiento a una temperatura de 18°C.desarrollaron numerosas ratces delgadas con abundantes pelos. mientrasque los vastagos incubados a 22°C die ron ongen a rakes tubercsas de unaspecto similar al del tuberculo que constituye la parte comestible de Ttuberosum (fig. 5). La temperatura es un factor Fisico importante que influyeen el desarrollo "in vitro" de dtferentes tejidos y organos vegetales. debidoa su acci6n sobre los procesos enzirnaticos del metabolismo celular (Buten-ko. 1968).

Fla. 5. Morfologia de rakes que crecleron a dtferentes tcmperaturas. IZ4111erda,raicestuberosas desarrolladas en cultivo a 22°C. Derecha. raices del-tadas (Flltfor-mes) obtenidas en cultivoa IBoC.

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Es importante anotar que T. luberosum crece en lugares de bajas tempe-raturas en donde la producci6n de tuberculos es normal. En contraste, latuberizaci6n "in vitro" es favorecida por un incremento rnoderado de latemperatura. Este hecho constituye una demostraci6n significativa de losfenornenos cornplejos que se presenlan durante los procesos efectuados enla aplicaci6n del cullivo de Tejidos Vegetates.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

I. Se establecio que el tejido parenqutmattco rue el responsable de lainducci6n y forrnacton de callo en los culuvos "in vitro" de explantes depeciolo de T. tubemsum.

2. Se obtuvo morfogenesis anorrnal a partir del subcultivo de los callos,probablemente como consecuencia del prolongado cultivo de los,mismos enun medio can concentraciones de 2,4-D relalivamente altas,

3. Se encon tro que la temperatura ejerce una lnfluencta noun ia sobre lamortologta del enraizamiento "in vitro" de vastagce obtenidos por rntcropro-pagacion.

4. Es importante conlinuar los estudios encaminados a obtener regene-racion de plantas a partir de callos y cultivos celulares de esta especie, conel prop6sito de inducir variaciones gcnetrcas que permilan, en un futurocercano. el mejoramiento de la calidad del produeto comestible. y con ello.inerementar su comerctaltzacton. Otros productos de caltdad nutrtctonalscmcjante 0 inferior. como la papa y la yuca, son objeto de programas demejoramiento por parte de mvestigadores del area de culttvo de tejidos enentidades tnter-nactonales tales como eI CIP Yel ClAT,

5. T. tuberosum es una especie que presen ta gran facilidad y diversidadde respucstae en condiciones de cultivo "in vitro". por 10tanto, se recornten-da ulilizarlo como material dtdacuco en cursos de capacttacton.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a los profesores Angela deBarrera. Hernan Cardozo y Jesus Norato del Departamento de lJiologia porsu constante apoyo durante la realizacion de este trabajo, y al senor FabioRamirez del Laboratorio de Ftstologia Vegetal por su colaboracion.

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