APPRENTISSAGE ET BIOINFORMATIQUEAction spécifique du STIC-CNRS 2003

Groupe de travail « Apprentissage et séquence"

Y. GUERMEURLORIA

Campus scientifiqueBP 239

54 506 Vandoeuvre les Nacy cedexEmail : Yann.Guermeur@loria.fr

C. GEOURJONPôle Rhône-Alpins de BioInformatique

Institut de Biologie et Chimie des Protéines7, Passage du Vercors69 367 Lyon cedex 07

Email : c.geourjon@ibcp.fr

Objectifs du groupe

Principaux problèmes d’apprentissage abordés :Traitement de données séquentiellesPrise en compte d’interactions à distance

Couplage localisation / caractérisationIntégration de sources de connaissances hétérogènes

Approches privilégiées :Apprentissage de machines de reconnaissance probabilistesConception et mise en œuvre de machines à noyau

Conception et mise en œuvre de réseaux de neurones récurrents

Equipes impliquées

Projet Symbiose de l’IRISA, à RennesGroupe de Bioinformatique de l’Ecole des Mines de Paris, à

FontainebleauGroupe de recherche de Pierre Baldi, à l’UCI, aux USAEquipe MODBIO du LORIA, à NancyLaboratoire de Bioinformatique et RMN structurales de l’IBCP

(Insitut de Biologie et Chimie des Protéines), à Lyon

Plan de travail et calendrier des réunions

Calendrier prévisionnel :Réunion de travail fin février / début mars (à Nancy?)Deuxième réunion en septembre

… puis en moyenne une réunion par semestre

Ressources mises à disposition :Une base de séquences protéiques et une liste de références

bibliographiques seront bientôt disponibles à partir de la pageWeb du groupe

Présentation du contexte biologique

La révolution génomique - Une stratégie revisitée

Etude biochimique

Séquenceprotéine

GèneActivité

biologique(Phénotype)

Avant

Aujourd’hui

Gènome Séquenceprotéine

Activité biologique

Etude biochimique

Prédiction d’ORF

Prédiction sites/signaturesPrédiction de structure

(2D et 3D)Modélisation moléculairePrédiction de fonctions

Etude relation structure-activité

Criblage virtuel

Génomes séquencéshttp://wit.integratedgenomics.com/GOLD/

Génomes entièrement séquencés81 génomes procaryotes

Bacillus subtilisBacillus anthracisEscherichia coliHaemophilus influenzaePseudomonas aeruginosa

12 génomes eucaryotesSaccharomyces cerevisiaeCaenorhabditis elegansPlasmodium falciparumDrosophila melanogasterMus musculus

Génomes en cours de séquençage306 génomes procaryotes195 génomes eucaryotes

Nombreux génomes de virus

Géométrie du squelette protéique et des AA Degrés de liberté dans la chaîne principale

i-1O’

χi2

iχ1αC i-1

N i

N Hi

α Ci

αH i

O i

Ni + 1

NH i+1

αC i+1

βC i

γC i

C i-1’

Ci’

ωiΦi

Ψ i

Angle Phi ψ (C’i-1,Ni, αCi)/(Ni,αCi,C’i)

Angle Psi Φ (Ni,αCi,C’i)/(αCi,C’i,Ni+1)

NH2 αC COOH

R

Une protéine : des acides aminés liés entre eux de manière linéaire et répétée par une liaison chimique covalente : la liaison peptidique.

Ces acides aminés ont une structure chimique commune et une chaîne latérale (R) spécifique de l’acide aminé concerné :

R R RR

Phényle

HydroxyleCα

Exemple de la tyrosine :

Les 20 Acides aminés …

Non polaire

Non polaire

Non polaire

Non polaire

Non polaire

Non polaire

Non polaire

Non polaire

Chargé -

Chargé -

Chargé +

Chargé +

Chargé +

Polaire non chargé

Polaire non chargé

Polaire non chargé

Polaire non chargé

Polaire non chargé

Polaire non chargé

Polaire non chargé

Degrés de liberté dans la chaîne principaleDu faite essentiellement de contraintes stériques (en particulier au niveau des Cβ qui est le carbone de la chaîne latérale directement lié au Cα) les paires d’angles Φ et ψne peuvent pas prendre toutes les valeurs possibles.

Carte de Ramachandran : Les régions roses sont les zones permises. Les régions rouges sont les zones préférentielles pour des structures particulières, les éléments de structure secondaires comme les hélices α et les brins β :1 Feuillet β anti-parallèle (-139, 135)2 Feuillet β parallèle (-119, 113)3 Hélice α gauche4 Hélice 310 (-49, -26)5 Hélice α droite (-57, -47)6 Chaîne complètement étirée

Eléments de structure secondaire régulière : a-b Hélice αc-d Feuillet β à 2 brin βL’hélice α est une structure locale dont les liaisons hydrogène se forment, de proche en proche, au sein de la même hélice (O du carbonyle AA i, H de l’amide AA i+4), le brin β n’existe que s’il interagit avec au moins un autre brin β et 2 au plus.

Organisation hiérarchique des protéines

Hélice α

Structure secondaireBrins β

CCHHHHHHHHHHHCCCEEEETTTTEEEEECCCCHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHHHGCCCCStructure secondaire = mot alphabet de 3 à 10 lettres

MKLDEIARLAGVSRTTASYVINGKAKQYRVSDKTVEKVMAVVREHNYHPNAVAAGLRAGRStructure primaire ou séquence = mot alphabet à 20 lettres

AAACGTGGCTACGAGTCCTGACGATGCCCAGCTCGAGTCCTGACGATGCCCCGATGCCCAGSéquence génomique = mot alphabet à 4 lettres

Structure quaternaire(notion d’oligomères)

Structure tertiaire (accessible par Xray-RMN)

De la séquence à la structure 3D …Un grand nombre de protéines avec des séquences

différentes (succession d’acides aminés). Actuellement on connaît entre 600 000 et 1 000 000 de séquences protéiques. On connaît près de 20 000 000 de séquences nucléiques.

Mais un nombre restreint de repliement dans l’espace (entre 700 et 10 000). Actuellement on en connaît entre 600 et 1 200selon les méthodes de comparaison utilisées. Au total près de 20 000 structures 3D (mais avec beaucoup de redondance).

Importance de connaître la structure 3D car elle permet à la protéine d’être biologiquement active.

Difficulté d’obtenir expérimentalement la structure 3D d’une protéine. Deux méthodes :

CristallographieRésonance Magnétique Nucléaire (RMN)

Intérêt de pouvoir attribuer à une séquence un repliement donné ou de pouvoir prédire sa structure 3D.

Conservation de la structure 1D, 2D et 3D

10 20 30 40 .........|.........|.........|.........|..1.pdb1ajj.ent P--CSAFEFHC-LSGECIHSSWRCDGGPDCKDKSDEENCA-- 372.pdb1cr8.ent PGGCHTDEFQCRLDGLCIPLRWRCDGDTDCMDSSDEKSCEGV 42Primary cons. PGGC222EF2CRL2G2CI222WRCDG22DC2D2SDE22C2GVHomology * * : **:* *.* ** *****..** *.***:.*

1AJJ : LDL receptor1CR8 : Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein

50 % d’identité de séquence

Ecart quadratique moyen (CA des résidus conservés) : 1,6A

Conservation de la structure 2D et 3D

16 % d’identité de séquenceet

une topologie conservée

En dessous de 30% d’identité, la structure est plus conservée que la séquence, ceci est vraie également des structures secondaires. Mais ceci n’est pas systématique …

Interactions 3D impliquant des acides aminés distant séquentiellement

Interactions hydrophobes : Fondamentales pour le repliement des protéines.Les atomes ou groupements non polaires ont tendance à fuir le

milieu aqueux environnant pour des raisons thermodynamiques. Cette fuite permet aux éléments hydrophobes de se regrouper au cœur de la structure de la protéine et donc de diminuer leur surface de contact avec le solvant. A l’inverse les chaînes latérales polaires sont plutôt à la surface de la protéine.

Energie d’interaction varie de façon inversement proportionnelle à la distance entre les atomes élevée à la puissance 6.

Faible énergie

Interactions électrostatiques ou ioniques :L’énergie d’interaction varie de manière inverse à la distance (rij)

entre les charges (qi et qj) : Eij=332.qi.qj/(D.rij).Interaction entre acides aminés chargés de charge opposée :

R (Arg), K (Lys), H (His) chargé positivementD (Asp), E (Glu) chargé négativement

Interactions 3D impliquant des acides aminés distant séquentiellement

Liaisons hydrogène :Impliquées dans la stabilisation des éléments de structure secondaire

(au niveau de la chaîne principale)Liaison de faible énergie entre un donneur et un accepteur

d’hydrogène (D-H … A).Distance entre 2.7 et 3.1 Å

Pont disulfure ou cystine : Entre les groupements thiol (-SH) de 2 cystéines (C) (dist. : 2.2 Å).La seule liaison covalente entre des acides aminés distants dans la

séquence mais proche dans l’espace.Peuvent être impliqués dans des phénomènes de multimérisation

(formation d’un dimère entre 2 chaînes peptidiques)

Expérience de dénaturation-renaturation (Anfinsen)

+ UREE etβ Mercaptoethanol

Ribonucléase native, active,thermodynamiquement stable

ms-48h- UREE et

β Mercaptoethanol

Structure instablePlus d’activitéInformation de séquenceAttention exceptions

Ribonucléase, renaturée active,thermodynamiquement stable

Loi des nombres

Soit une petite protéine (100 aa)20100 séquences différentesSupposons 10 conformations par aa (10100 conformations)même si 2 conformations par aa

hélice ou non hélice2100 soit environ 1030 conformations

Durée de vie d'une conformation 0,1 psceci donne 1017s pour que la protéine se replie

Durée par simulation (ordinateur réalisant 1010

opérations/s)1020 s pour simuler par minimisation d'énergie en admettant le calcul d ’une énergie/seconde

Nombre d'atomes dans l'univers 10 100...

Un exemple d’objectifs biologiques …

gues.

des interactions électrostatiques disulfures dans les structures

Cette corrélation doit permettre de mettre en place une

méthode prédictive de ces interactions.

Ces prédictions guideront les approches de prédictions de la

structure 3D des protéines.

Exploiter les séquences de protéines et la notion de famille de protéines homolo

Pour cela établir la corrélation entre la présence et hydrophobes ainsi que des pontstridimensionnelles et leur conservation dans les alignements multiples.

Analyse statistique des structures tridimensionnelles des protéines

(une partie du travail de thèse de Mounir Errami)

Stratégie d’analyse

Recherche de séquences similaires

AlignementMultiple

Sous-base de séquences

Extractblast &Extractfasta

Ponts disulfures Interactions HydrophobesPonts Salins

Base de données d’intéractions

Protéine de S3D connue

Analyse de la conservation

des interactions

Relation?

DSSP modifié

Processus automatique

Intérêts :

Exhaustif

Objectif

Liaisons hydrogènes

Réseaux réguliers Localisation des éléments de SS

DSSPm

S3D

DSSPm (modifié) = DSSP (Kabsch & Sander, 1983)

Détection d’interactions électrostatiques (RHK/DE) :

2 résidus de charges opposées distants de moins de 3 Å.

Détection d’interactions hydrophobes (ILAVMWF) :

2 résidus distants de moins de 3,3 Å.Détection de ponts disulfures (C) :

2 cystéines distantes de moins de 3 Å. Récupération de l’accessibilité des acides aminés.

Sélection des séquences pour calculer un alignement multiple

S

CYS 80 CYS 220CYS 35 CYS 172Séquence pdb

SSS

Longueur minimum entre 2 bornes

E-Value seuil E≤1e-6

Échantillon, représentativité

Significativitéforte

Significativitéfaible

sous-base de séquences apparentées, non redondantes et qui constituent un échantillon représentatif des protéines similaires.

Nombre de séquences

∑−=

=

+

−−=

1

1

)()1(

1)log()log(p

ni

i

ii

nEE

1e-20 1e-19 1e-18 1e-17 …0 …

E-valuep

Conservation des interactions

fp(i)q(j)= np(i)q(j)/N

La conservation f (ou fréquence) d’une interaction entre l’aa p à la position i et l’aa q à la position j pour un alignement de N séquences :

séquence pdb ALTERTHTPRTLKMIEVAGIPVVELMDSKSPCLDIAVGFDNFEAARséquence 2 DATGATNPDKISALCQQAGVPTVNLDLPGS--LSPSVISDNYGGAKséquence 3 IFTDTQGQIKISKHANECGLPTIHTPSKTK--LQPSVFYCVFPGSKséquence 4 KDDAGPCDINILGECNLSGEFWLVKPLLER--LGIRVRADIPGDAR

| | | | |

numérotation 1 10 20 30 40

ici, fR(10)D(40)=0,5

On considère les propriétés biochimiques (ACIDE, BASE, HYDROPHOBE, CYS) :

R10-D40 équivalent à K10-E40 ; ou encore V-L I-W

Dans le cas des ponts salins (asymétriques), les permutations sont acceptées :

R10-D40 équivalent à D10-R40

Validation de la stratégie et de l’architecture : ponts disulfures

Postulat : les cystéines impliquées dans des ponts dissulfures sont plus conservées que celles qui ne le sont pas.Expérience : comparaison conservation ponts disulfures / conservation de paires témoins : une paire témoin = 2 Cys réduites, appariées de façon aléatoire.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tous lesalignements

alignements demoins de 10séquences

alignements de plusde 10 séquences

Con

serv

atio

n (%

)

Résultats :

Effectifs :720 alignements

1300 ponts disulfures

280 paires témoins

Application aux interactions électrostatiques et hydrophobes

Les témoins :

- DSSPm (tag FALSE) : distants de 15 à 16 Å (arbitraire);

- appariement aléatoire (= brassage) des résidus avec les même propriétes biochimiques qui ne sont pas impliqués dans une interaction.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Tous les alignements

Moins de 10 séquences

Plus de 10 séquences

Conservation (%) Interactions électrostatiques

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Tous les alignements

Moins de 10 séquences

Plus de 10 séquences

Interactions hydrophobesConservation (%)

Les interactions sont plus conservées que les paires témoinsLa différence est plus importante dans les alignements les plus grands

Relation identité / conservation

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

Id≤5% Id ≤ 5% 5%<Id ≤ 50%5%<Id ≤ 50% Id>50% Id>50%

Conservation (%) Conservation (%)Interaction électrostatiques Interaction hydrophobes

La conservation préférentielle des interactions est plus marquée dans les alignements les plus divergents.

Ceci a été confirmé avec l’étude de l’effet de la similarité globale sur la conservation des interactions.

Taux de permutation des résidus chargésQuestion : Est ce que la permutation (corrélée) des résidus chargés est signe de la présence d’une interaction?

Taux de permutation =Nombre de permutations observées

Nombre de paires étudiées

Taux de permutations Ponts salins Témoins Différence

Tous alignements 12,41 8,07 4,33

Alignements de moins de 10 séquences 4,62 3,03 1,59

Alignements de plus de 10 séquences 26,16 17,44 8,72

Les permutations sont plus fréquentes dans le cas des interactions électrostatiques, mais elles n’offrent pas un moyen de distinction suffisamment puissant.

Relation accessibilité / conservationL’accessibilité obtenue avec DSSPm. La valeur limite d’accessibilité est vérifiée par les deux acides aminés de l’interaction ou de la paire témoin.

Accessibilité ≤ 10 Å2 Analyse globaleConservation

(%) Ponts salins Témoins Différence Ponts salins Témoins Différence

Tous alignements 79,40 59,04 20,36 64,37 54,28 10,09

Moins de 10 séquences 82,50 71,23 11,27 71,20 62,00 9,20

Plus de 10 séquences 72,59 41,57 31,02 55,05 42,76 12,29

Accessibilité < 10 Å2 Accessibilité > 30 Å2 Analyse globale Conservation

(%) Int. Hyd Témoins Diff Int. Hyd Témoins Diff Int. Hyd Témoins Diff

Tous les alignements 78,85 75,27 3,58 64,60 54,47 10,13 76,38 66,66 9,71

Moins de 10 séquences 82,58 80,66 1,92 71,05 65,00 6,04 80,13 73,68 6,45

Plus de 10 séquences 77,60 73,47 4,13 62,46 50,96 11,49 75,12 64,32 10,80

L’accessibilité a un effet important et spécifique à chaque type d’interaction.

Laboratoire de Bioinformatique et RMN structurales

MéthodologiesPrédiction de structures secondaires de protéines

DPM, SOPM, SOPMA, MLRCRecherches combinées de motifs dégénérés dans les banques (protéomique)

ProScan (une séquence versus PROSITE)PattinProt (un motif face à une banque)

Modélisation moléculaireAutomatique Geno3D (disponible sur Internet)A faible taux d’identité (PROCSS pour l’identification d’empreinte potentielle)Prédiction des sites 3D protéiques fonctionnels (SUrf on the Molecule) SuMo

Développements de logiciels intégrésANTHEPROT (Analyze THE PROTeins=> ANNOtate THE PROTeins) ANTHENUC (Analyse de séquences nucléiques) MPSA (Multiple Protein Sequence Analysis)DICROPROT

Webiciel (partie protéine du PBIL) NPS@ (Network Protein Sequence @nalysis) (http://npsa-pbil.ibcp.fr) Geno3D (http://geno3d-pbil.ibcp.fr) SuMO (http://sumo-pbil.ibcp.fr)

Applications biologiques

Congrès annuel de la Société Française de Biochimie et Biologie Moléculaire(4 et 5 novembre 2003 – Lyon)

Thème :«Post-génome : des protéines aux molécules Bio-actives»

Organisateurs :Christophe Geourjon (c.geourjon@ibcp.fr)Michel Desmadril (michel.desmadril@mip.u-psud.fr)

Comité scientifique :Michel Desmadril (Insitut de Biochimie - Orsay) Christophe Geourjon (IBCP - Lyon)Arnaud Ducruix (IFR Sciences du médicament – Paris) Muriel Delepierre (Institut Pasteur)Hervé GoudonnetUniversité de Dijon) Philippe Dessen (IGR – Villejuif)Philippe Minard (Laboratoire Léon Brillouin - Gif) David Perahia (CEA - Gif sur Yvette)Roger Lahana (Société Synt:em – Nimes) Olivier Poch (IGBMC – Strasbourg)

Congrès annuel de la Société Française de Biochimie et Biologie Moléculaire(4 et 5 novembre 2003 – Lyon)

Conférenciers invités : Christian Cambillau : Du génome a la molécule activeHerman van Tilbeurgh : Genomique structuraleMichel Caron : : Protéomique : de l'identification à la fonctionMarcel Hibert : Récepteurs orphelins : architecture fonctionnelle et criblage par

fluorescenceAnnick Dejaegere : Drug design et dockingLaurent Daviet : Interactions protéine-protéine et identification de nouvelles cibles

therapeutiquesSite web :

http://www.ibcp.fr/SFBBM/ (ouverture fin février)