7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

1/10

American J o u r n a l o f P a t h o l o g y , V o l . 1 3 6 , N o . 6 , June 1 9 9 0C o p y r i g h t American A s s o c i a t i o n o f P a t h o l o g i s t s

H i g h G l u c o s e C a u s e s a n I n c r e a s e i nE x t r a c e l l u l a r M a t r i x P r o t e i n s i nC u l t u r e d M e s a n g i a l C e l l sS u z a n n e H . A y o , R o b e r t A . R a d n i k ,J o A n n G a r o n i , W i l l i a m F . G l a s s 1 1 ,a n d J e f f r e y 1 . K r e i s b e r gFrom t h e D e p a r t m e n t s o f P a t h o l o g y and M e d i c i n e ,T h e U n i v e r s i t y o f T e x a s H e a l t h S c i e n c e C e n t e ra t San A n t o n i o , San A n t o n i o , T e x a s

D i a b e t i c n e p h r o p a t h y i s a maj or c a u s e o f t h e i n -c r e a s e d m o r b i d i t y and m o r t a l i t y i n i n s u l i n - d e p e n -d e n t d i a b e t e s m e l l i t u s . T h e most s i g n i f i c a n t r e n a ll e s i o n o f d i a b e t i c n e p h r o p a t h y i s e x p a n s i o n o f t h eg l o m e r u l a r mesangium. T h i c k e n i n g o f t h e g l o m e r -u l a r basement membrance i s a l s o a p p a r e n t . M e s -a n g i a l e x p a n s i o n i s l a r g e l y du e t o t h e a c c u m u l a -t i o n o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x (ECM) p r o t e i n s s u c ha s f i b r o n e c t i n , l a m i n i n , and t y p e IV c o l l a g e n . T od e t e r m i n e w h e t h e r h i g h g l u c o s e i s r e s p o n s i b l e f o rt h e o b s e r v e d i n c r e a s e i n m e s a n g i a l c e l l ECM p r o -t e i n a c c u m u l a t i o n , m e s a n g i a l c e l l s were gro wn i nt i s s u e c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n i n g 10 m m o l / l( m i l l i m o l a r ) g l u c o s e ( n o r m a l ) o r 30 m m o l / l g l u -c o s e ( h i g h ) . T h e d e g r e e o f ECMp r o t e i n a c c u m u l a -t i o n w as d e t e r m i n e d b y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y anda s o l i d - p h a s e e n z y m e - l i n k e d immunosorbent a s s a y( E L I S A ) d e v e l o p e d i n t h e l a b o r a t o r y . M e s a n g i a lc e l l s c u l t u r e d f o r I week c o n t a i n e d f i b r o n e c t i n a st h e most abundant ECMp r o t e i n , f o l l o w e d b y l a m i -n i n and t y p e I V c o l l a g e n . T y p e I V c o l l a g e n w as s e e no n l y a f t e r t h e c e l l s had p i l e d up i n t o ' h i l l o c k s ' ( a p -p r o x i m a t e l y 4 w e e k s o f c o n t i n u o u s growth w i t h o u tp a s s a g i n g ) . A f t e r 4 w e e k s i n 30 m m o l / l g l u c o s e ,m e s a n g i a l c e l l s c o n t a i n e d i n c r e a s e d amounts o f a l lt h r e e m a t r i x p r o t e i n s . F i b r o n e c t i n and l a m i n i nwere i n c r e a s e d b y a p p r o x i m a t e l y 6 0 % , w h i l e t y p eIV c o l l a g e n was i n c r e a s e d 5 0 % . C e l l s s u b c u l t u r e di n medium c o n t a i n i n g 30 m m o l / l g l u c o s e f o r 8m o n t h s d i s p l a y e d a t w o f o l d i n c r e a s e i n f i b r o n e c t i nand l a m i n i n . T h u s , h i g h g l u c o s e p e r s e can c a u s ec h a n g e s i n m e s a n g i a l c e l l ECM. T h i s c e l l c u l t u r emodel s h o u l d b e u s e f u l i n e l u c i d a t i n g t h e m e c h a -nisms i n v o l v e d . (Am J P a t h o l 1 9 9 0 , 1 3 6 : 1 3 3 9 -1 3 4 8 )

D i a b e t e s m e l l i t u s i s a m a j o r c a u s e o f r e n a l m o r b i d i t y a n dm o r t a l i t y . 1 N e p h r o p a t h y i n d i a b e t e s m e l l i t u s f o l l o w s a p e -r i o d o f c l i n i c a l s i l e n c e i n w h i c h o n l y s u b t l e f u n c t i o n a l a l t e r -a t i o n s c a n b e f o u n d . A f t e r 1 5 t o 2 0 y e a r s , o v e r t p r o t e i n -u r i a , h y p e r t e n s i o n , a n d d e c l i n i n g g l o m e r u l a r f i l t r a t i o n r a t e( G F R ) c a n b e m e a s u r e d i n a p p r o x i m a t e l y 2 5 t o 40% o fp a t i e n t s w i t h i n s u l i n - d e p e n d e n t d i a b e t e s m e l l i t u s . 2 . 3 S e m i -q u a n t i t a t i v e l i g h t m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f r e n a l b i o p s i e sd e m o n s t r a t e d a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s e v e r i t y o f g l o -m e r u l o s c l e r o s i s a n d l o s s o f r e n a l f u n c t i o n . 4 D e t a i l e d m o r -p h o l o g i c a n a l y s i s b y M a u e r e t a l 5 s h o w e d a p r e c i s e c o r r e -l a t i o n b e t w e e n t h e s e v e r i t y o f m e s a n g i a l e x p a n s i o n a n dt h e c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s o f d i a b e t i c n e p h r o p a t h y .

T h e g l o m e r u l u s u n d e r g o e s s i g n i f i c a n t s t r u c t u r a lc h a n g e s i n d i a b e t i c n e p h r o p a t h y . T h e i n t e r c a p i l l a r y g l o -m e r u l o s c l e r o s i s o r K i m m e l s t i e l - W i l s o n n o d u l e s c o m -p o s e d o f i n c r e a s e d e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) m a t e r i a l i nt h e m e s a n g i u m i s v i r t u a l l y p a t h o g n o m i c o f d i a b e t e s . 6 D i -a b e t i c h u m a n s h a v e i n c r e a s e d m e s a n g i a l s t a i n i n g f o r f i -b r o n e c t i n , l a m i n i n , a n d t y p e I V a n d V c o l l a g e n s . 1 0 T h u s ,d i a b e t i c g l o m e r u l o s c l e r o s i s a p p e a r s t o b e c h a r a c t e r i z e db y a p p a r e n t a c c u m u l a t i o n s o f g l o m e r u l a r m a t r i x p r o t e i n s .A l t h o u g h s t r o n g e v i d e n c e e x i s t s i n a n i m a l s a n d man t h a tt h e g l o m e r u l o p a t h y i s r e l a t e d t o t h e d i a b e t i c s t a t e , 1 1 ' 1 2 t h ep r e c i s e m e c h a n i s m s o f d i a b e t i c g l o m e r u l o s c l e r o s i s r e -m a i n u n k n o w n .

B e c a u s e o f t h e i n s i d i o u s c o u r s e o f t h i s d i s e a s e , t h emany m e t a b o l i c a l t e r a t i o n s , a n d t h e l a c k o f s u i t a b l e a n i -m a l m o d e l s , i n v i v o s t u d i e s t o e l u c i d a t e t h e m e c h a n i s m so f t h i s d i s e a s e a r e d i f f i c u l t . W i t h h o m o g e n e o u s c u l t u r e s ,t h e e n v i r o n m e n t o f t h e m e s a n g i a l c e l l , w h i c h i s i n v o l v e di n ECM t u r n o v e r , c a n b e p r e c i s e l y c o n t r o l l e d . T h u s , b ym a n i p u l a t i n g t h e g r o w t h c o n d i t i o n s , o n e c a n s t u d y i n d i -v i d u a l m e t a b o l i c p a r a m e t e r s t h a t m i g h t b e i n v o l v e d i n t h ep a t h o g e n e s i s o f d i a b e t i c g l o m e r u l o s c l e r o s i s . I n t h i s s t u d ywe h a v e s h o w n t h a t h i g h g l u c o s e p e r s e c a n c a u s e m e s -S u p p o r t e d b y U S P H S , N I H DK 2 9 7 8 7 ( J I K ) , t h e C l a y t o n F o u n d a t i o n ( J I K ) ,a n d t h e N a t i o n a l K i d n e y F o u n d a t i o n ( S H A ) . D r . K r e i s b e r g i s a C a r e e r S c i -e n t i s t , V e t e r a n s A d m i n i s t r a t i o n .

A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n J a n u a r y 3 0 , 1 9 9 0 .A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o J e f f r e y - 1 . K r e i s b e r g , P h D , D e p a r t m e n t o fP a t h o l o g y , T h e U n i v e r s i t y o f T e x a s H e a l t h S c i e n c e C e n t e r a t S a n A n t o n i o ,

7 7 0 3 F l o y d C u r l D r i v e , S a n A n t o n i o , T X 7 8 2 8 4 - 7 7 5 0 .1 3 3 9

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

2/10

1 3 4 0 A y o e t a lAJPJune 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 6

a n g i a l c e l l s t o a c c u m u l a t e i n c r e a s e d a m o u n t s o f ECMp r o t e i n s . T h i s s h o u l d b e a u s e f u l m o d e l t o s t u d y t h em e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h i s d i s e a s e p r o c e s s .

t h e r a n g e r e p o r t e d f o r s t r e p t o z o t o c i n d i a b e t i c r a t s ( 6. U U / M l ) . 1 6DNA a n d C e l l u l a r P r o t e i n D e t e r m i n a t i o n s

M a t e r i a l s a n d M e t h o d sR e a g e n t sR P M I 1 6 4 0 , f e t a l c a l f s e r u m ( F C S ) , H a n k ' s b a l a n c e d s a l ts o l u t i o n , a n t i b i o t i c , a n d a n t i m y c o t i c a g e n t were f r o m I r -v i n e S c i e n t i f i c ( S a n t a A n a , C A ) . T r y p s i n - E D T A ( e t h y l e n e d i -a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ) , r a b b i t a n t i - l a m i n i n , a n d HEPESwere f r o m GIBCO L a b o r a t o r i e s ( G r a n d I s l a n d , N Y ) . F i b r o -n e c t i n , l a m i n i n , r a b b i t a n t i - g o a t I g G , g o a t a n d r a b b i t p e r -o x i d a s e - a n t i - p e r o x i d a s e ( P A P ) , 3 ' , 3 ' - d i a m i n o b e n z i d i n e ,4 - 6 d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e , a n d DNA were f r o m S i g m aC h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M O ) . G o a t a n t i - t y p e I V c o l l a g e nw a s f r o m S o u t h e r n B i o t e c h n o l o g y A s s o c . , I n c . ( B i r m i n g -h a m , A L ) . T y p e I V c o l l a g e n w a s f r o m N u i t t a G e l a t i n d o ,L t d . ( S t . P e t e r s b u r g , F L ) . R a b b i t a n t i - f i b r o n e c t i n a n d g o a ta n t i - r a b b i t I g G w a s f r o m C a p p e l ( W e s t C h e s t e r , P A ) . H RPc o l o r d e v e l o p m e n t r e a g e n t was f r o m B i o - R a d L a b o r a -t o r i e s ( R i c h m o n d , C A ) .

C e l l C u l t u r eI s o l a t i o n a n d C u l t u r e o f G l o m e r u l a r M e s a n g i a l C e l l sG l o m e r u l i w e r e i s o l a t e d f r o m 2 0 0 - g m a l e S p r a g u e -

D a w l e y r a t s ( H a r l a n S p r a g u e - D a w l e y , H o us t o n, T X ) u s i n ga g r a d e d - s i e v e t e c h n i q u e a n d w e r e p l a t e d f o r c u l t u r e i nR P M I 1 6 4 0 t i s s u e c u l t u r e m e d i u m w i t h 20% FCS p l u s pen-i c i l l i n , s t r e p t o m y c i n , a n d F u n g i z o n e ( E . R . S q u i b b & S o n s ,P r i n c e t o n , N J ) f o r e x p l a n t g r o w t h o f g l o m e r u l a r c e l l s . 1 3 ' 1 4P o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f m e s a n g i a l c e l l s w a s o b t a i n e d b yu l t r a s t r u c t u r a l e x a m i n a t i o n a n d s h a p e c h a n g e i n r e -s po ns e t o c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( c A M P ) - e l e -v a t i n g a g e n t s . ' 5

M e s a n g i a l c e l l s w e r e g ro w n f o r v a r y i n g p e r i o d s u n d e rn o r m a l ( 1 0 m m o l / I [ m i l l i m o l a r ] ) a n d h i g h ( 3 0 m m o l / l ) g l u -cose c o n d i t i o n s . T h e o s m o l a l i t y o f t h e t w o t y p e s o f m e d i awere w i t h i n t w o s t a n d a r d d e v i a t i o n s as m e a s u r e d b y t h ef r e e z e p o i n t m e t h o d ( 1 0 m m o l / l g l u c o s e = 2 7 7 + 8 . 1mOsm/kg H 2 0 ; 3 0 m m ol / l g l u c o s e = 2 8 7 1 1 . 4 m O s m /k g H 2 0 ) . A lt h ou g h 1 0 m mo l /I g l u co s e i s h i g h c o m p a r e dw i t h n or ma l b l oo d l e v e l s o f g l u c o s e ( 5 m m o l / 1 ) , t h i s i s t h ea m o u n t necessary f o r m e s a n g i a l c e l l s t o g ro w w e l l i n c u l -t u r e ( J . 1 . K r e i s b e r g , p e r s o n a l o b s e r v a t i o n ) . A l s o , b e c a u s et i s s u e c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n s 20% F C S , t h e p o s s i b i l i t ye x i s t s t h a t t h e r e c o u l d b e a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f i n s u l i np r e s e n t . H o w e v e r , when t h e i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n wasm e a s u r e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y ( R I A ) ( S m i t h K l i n e B i o -S c i e n c e L a b o r a t o r i e s , H o u s t o n , T X ) , we f o u n d i t t o b e i n

M e s a n g i a l c e l l s w e r e p l a t e d i n 6 - w e l l m u l t i w e l l ( 3 5 - m m )d i s h e s f o r 1 , 2 , a n d 4 w e e k s . T h e m e d i a w a s a s p i r a t e da n d t h e c e l l s w e r e r i n s e d 3 t i m e s i n i c e - c o l d p h o s p h a t e -b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) ( 0 . 0 2 m o l / l [ m o l a r ] , p H 7 . 3 ) . C e l l sw e r e s c r a p e d w i t h 1 m l o f c o l d P B S 4 t i m e s . T h e c e l l s u s -p e n s i o n w a s s o n i c a t e d f o r 8 t o 1 0 s e c o n d s w h i l e i n a n i c eb a t h . O n e h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f t h e s a m p l e s a nd DNAs t a n d a r d s w e r e p i p e t t e d i n 2 . 5 m l o f D A P I ( 4 - 6 - d i a m i d i n o -2 - p h e n y l i n d o l e ) r e a g e n t a n d v o r t e x e d i m m e d i a t e l y . 1 7 A l li n c u b a t i o n s w e r e d o n e i n t h e d a r k a t 2 5 0 C f o r 2 0 m i n u t e sm i n i m u m a n d 1 2 0 m i n u t e s m a x i m u m . R e l a t i v e f l u o r e s -c e n c e was m e a s u r e d i n a f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e -t e r a t 3 6 0 nm e x c i t a t i o n a n d 4 5 0 nm e m i s s i o n . F o r p r o t e i nd e t e r m i n a t i o n s , c e l l s w e r e e x t r a c t e d i n 2 . 5 % s o d i u m d o -d e c y l s u l f a t e s a m p l e b u f f e r a n d p r o t e i n s q u a n t i f i e d b y t h eb i c i n c h o n i n i c a c i d ( B C A ) m e t h o d ( P i e r c e , R o c k f o r d , I L ) . 1 8

I m m u n o c y t o c h e m i s t r yM e s a n g i a l c e l l s w e r e g r o w n i n c h a m b e r s l i d e s ( 4 - w e l l )( L a b - T e k , N a p e r v i l l e , I L ) u n d e r v a r y i n g c o n d i t i o n s a n ds t a i n e d b y t h e p e r o x i d a s e a n t i - p e r o x i d a s e m e t h o d o fS t e r n b e r g e r . ' 9 T h e y w e r e f i r s t r i n s e d t h r e e t i m e s i n 2 0m m o l / l P B S , p H 7 . 5 a n d t h e n f i x e d w i t h 3 . 7 % p a r a f o r m a l -

d e h y d e f o r 1 0 m i n u t e s a t 2 5 0 C . A f t e r f i x a t i o n , t h e y w e r er i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S a n d p e r m e a b i l i z e d w i t h0 . 0 1 % T r i t o n f o r 3 m i n u t e s . C e l l s w e r e p r e i n c u b a t e d w i t hn o r m a l b l o c k i n g s e r u m , w h i c h was p r e p a r e d f r o m t h es p e c i e s i n w h i c h t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y was m a d e ,w a s h e d , a n d i n c u b a t e d f o r 1 h o u r a t 3 7 0 C w i t h p r i m a r ya n t i b o d i e s . T h e s e a n t i b o d i e s w e r e u s e d a t t h e d i l u t i o n o f1 : 5 0 0 t o 1 : 1 0 0 0 i n P B S . O u r a n t i b o d i e s t o f i b r o n e c t i n , l a m -i n i n , a n d t y p e I V c o l l a g e n w e r e o b t a i n e d c o m m e r c i a l l y .A l t h o u g h t h e m a n u f a c t u r e r c l a i m s s p e c i f i c i t y , w e t e s t e de a c h o f t h e a n t i s e r a b y W e s t e r n b l o t a n d d o t b l o t i m m u n o -a s s a y . We c o n f i r m e d t h e m a n u f a c t u r e r ' s c l a i m s t h a t e a c ha n t i s e r u m was s p e c i f i c . U n b o u n d a n t i b o d y was a s p i r a t e da n d t h e c e l l s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S . C e l l s w e r ei n c u b a t e d w i t h a 1 : 2 5 d i l u t i o n o f a p p r o p r i a t e s e c o n d a r ya n t i b o d y ( e i t h e r g o a t a n t i - r a b b i t o r r a b b i t a n t i - g o a t ) f o r 1h o u r a t 3 7 0 C a n d r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S . N e x t , c e l l sw e r e i n c u b a t e d w i t h a p p r o p r i a t e p e r o x i d a s e a n t i - p e r o x i -d a s e c o m p l e x ( p r e p a r e d i n r a b b i t o r g o a t ) f o r 1 h o u r a t3 7 0 C a n d w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h P B S . T h e y t h e n w e r es t a i n e d w i t h 3 ' 3 - d i a m i n o b e n z i d i n e ( 0 . 3 u g / m l ) a n d0 . 0 0 5 % H 2 0 2 i n 5 0 m m o l / I T R I S - H C I ( p H 7 . 5 ) f o r 5 m i n u t e sa t 2 5 0 C a n d r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S . T h e c e l l s w e r ec o u n t e r s t a i n e d w i t h H a r r i s h e m a t o x y l i n f o r 3 0 s e c o n d s ,

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

3/10

H i g h G l u c o s e a n d E x t r a c e l l u l a r M a t r i x 1 3 4 1A J P J u n e 1 99 0, V oL 1 36 , N o . 6

r i n s e d , a l l o w e d t o a i r d r y , a n d c o v e r s l i p p e d u s i n g P e r -m o u n t ( F i s h e r S c i e n t i f i c , New Y o r k , N Y ) .

D o t B l o t I m m u n o a s s a y ( S o l i d P h a s e E L I S A )M e s a n g i a l c e l l s w e r e p l a t e d i n 6 - w e l l m u l t i w e l l ( 3 5 - m m )d i s h e s ( C o r n i n g , C o r n i n g , N Y ) f o r 1 , 2 , a n d 4 w e e k s . T h e

m e d i a w a s a s p i r a t e d a n d t h e c e l l s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e sw i t h H a n k ' s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n w i t h C a " , M g + +( H B S S + + ) . S o l u b i l i z a t i o n o f w h o l e c e l l m a t r i x p r o t e i n sw a s a c c o m p l i s h e d b y a p r o c e d u r e d e v e l o p e d b y M a d r ie t a l . 2 0 B r i e f l y , 2 m o l / l u r e a i n 2 0 m m o l / l T R I S , p H 7 . 5 , wasa d d e d , a n d t h e c e l l s w e r e s c r a p e d a n d a l l o w e d t o a g i t a t eo v e r n i g h t a t 4 0 C . S a m p l e s w e r e v o r t e x e d a n d m i c r o f u g e df o r 1 m i n u t e . T o b e c e r t a i n we w e r e r e c o v e r i n g p r o t e i n sw i t h 2 m o l / l u r e a , we c o a t e d c u l t u r e d i s h e s w i t h a l l t h r e eECM p r o t e i n s , e x t r a c t e d w i t h 2 m o l / l u r e a , a n d m e a s u r e do u r r e c o v e r y b y t h e d o t b l o t i m m u n o a s s a y . We w e r e a b l et o r e c o v e r 1 0 0 % o f t h e a d d e d p r o t e i n s . T h e s u p e r n a t a n ta n d m a t r i x p r o t e i n s t a n d a r d s w e r e d i l u t e d i n 2 m o l / l u r e ai n T R I S b e f o r e a p p l i c a t i o n t o n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s( 0 . 2 , u m p o r e , H o e f e r S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s , S a n F r a n -c i s c o , C A ) . T h e m e m b r a n e s w e r e p r e - w e t t e d i n T R I S -b u f f e r e d s a l i n e ( T B S ) ( 2 0 m m o l / l T R I S , 5 0 0 m m o l / l N a C I ,p H 7 . 5 ) , a n d a s s e m b l e d w i t h t h e a p p a r a t u s ( B i o - R a d ,R i c h m o n d , C A ) . S a m p l e s ( 1 0 0 t o 3 0 0 1 l ) w e r e a p p l i e d t ot h e w e l l s w i t h v a c u u m f i l t r a t i o n a n d t h e w e l l s w e r e r i n s e dw i t h T B S . T h e m e m b r a n e w a s r e m o v e d , r i n s e d i n T B S ,a n d i n c u b a t e d f o r 1 h o u r a t 2 5 C w i t h 5% n o n f a t d r y m i l ki n T B S a n d g e n t l e r o c k i n g . T h e m i l k s o l u t i o n was r e m o v e da n d r e p l a c e d b y t h e a p p r o p r i a t e p r i m a r y a n t i b o d y d i l u t e di n t o t h e 5% m i l k - T B S s o l u t i o n ( 1 : 5 0 0 t o 1 : 1 0 0 0 ) a n d i n c u -b a t e d f o r 1 h o u r a t 2 5 C w i t h r o c k i n g . T h e u n b o u n d a n t i -b o d y was r e m o v e d a n d t h e m e m b r a n e s w a s h e d t h r e et i m e s w i t h T B S . T h e b l o t s w e r e s t a i n e d b y t h e p e r o x i d a s ea n t i - p e r o x i d a s e m e t h o d . A p p r o p r i a t e s e c o n d a r y a n t i b o d -i e s ( 1 : 5 0 ) a n d PAP ( 1 : 4 0 0 ) w e r e e a c h d i l u t e d i n 5% m i l k -T B S a n d i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 2 5 C w i t h g e n t l er o c k i n g . B l o t s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h T B S b e t w e e ne a c h a p p l i c a t i o n . B l o t s w e r e d e v e l o p e d i n T B S : m e t h a n o l( 5 : 1 ) c o n t a i n i n g 0 . 1 5 % H 2 0 2 a n d 0 . 0 5 % 4 - c h l o r o - 1 - n a p h -t h o l u n t i l t h e l o w e s t s t a n d a r d b e c a m e f a i n t l y v i s i b l e ( a p -p r o x i m a t e l y 2 m i n u t e s ) . S t a n d a r d s r a n g i n g f r o m 1 t o 1 0 0n g w e r e a p p l i e d i n q u a d r u p l i c a t e . R e l a t i v e a b s o r b e n c i e sw e r e d e t e r m i n e d u s i n g a n LKB 2 2 0 2 u l t r a s c a n l a s e r d e n -s i t o m e t e r w i t h a n HP 3 3 9 0 A i n t e g r a t o r i n p e a k h e i g h tm o d e . E a c h e x p e r i m e n t h a s i t s own s t a n d a r d c u r v e . S t a n -d ar d d at a f r o m l a s e r - s c a n n i n g d e n s i t o m e t r y was f i t t e d t ol i n e a r a n d s e c o n d - a n d t h i r d - o r d e r p o l y n o m i a l e q u a t i o n s .T h e d a t a i s l i n e a r f r o m 1 t o 1 0 n g . B e y o n d t h i s r a n g e t h e r ei s a n o n l i n e a r i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e w i t h i n c r e a s e d a n t i -g e n . H o w e v e r , a p p l i c a t i o n o f a p o l y n o m i a l e q u a t i o n a l -l o w s u s e f u l i n f o r m a t i o n t o b e o b t a i n e d . T h e o b s e r v e dn o n l i n e a r i t y i s n o t t h e r e s u l t o f s a t u r a t i o n o f t h e n i t r o c e l l u -

l o s e b e c a u s e t h e i n c l u s i o n o f u p t o 1 0 j g o f b o v i n e s e r u ma l b u m i n w i t h t h e p r o t e i n s t a n d a r d d o e s n o t e f f e c t t h e r e -s u l t s .

R e s u l t sT o t e s t t h e e f f e c t o f g l u c o s e o n m e s a n g i a l ECM p r o t e i na c c u m u l a t i o n , we p l a t e d c e l l s o n t o c h a m b e r s l i d e s a n dg r e w t h e m f o r 1 , 2 , a n d 4 w e e k s , w i t h o u t p a s s a g i n g , i nR P M I 1 6 4 0 t i s s u e c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n i n g 20 % FCSw i t h e i t h e r 1 0 m m o l / l o r 3 0 m m o l / l g l u c o s e . A l t h o u g h 1 0m m o l / l g l u c o s e i s a b o v e p l a s m a v a l u e s ( 5 m m o l / I ) , t h i s i st h e a m o u n t n e c e s s a r y t o s u s t a i n m e s a n g i a l c e l l g r o w t h .T h e i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e m e d i u m w a s t e s t e d b yR I A ( S m i t h K l i n e B i o - S c i e n c e L a b o r a t o r i e s , H o u s t o n , T X )a n d f o u n d t o b e i n t h e r a n g e r e p o r t e d f o r s t e p t o z o t o c i nd i a b e t i c a n i m a l s ( 6 O U / m l ) . 1 6 T h u s , t h e s e e x p e r i m e n t sw e r e i n d e e d s t u d y i n g t h e e f f e c t o f g l u c o s e o n ECM p r o -t e i n a c c u m u l a t i o n . A f t e r 1 , 2 , a n d 4 w e e k s o f g r o w t h , t h ec e l l s w e r e r i n s e d , f i x e d , a n d p r o c e s s e d f o r i m m u n o c y t o -c h e m i c a l d e m o n s t r a t i o n o f f i b r o n e c t i n , l a m i n i n , a n d t y p eI V c o l l a g e n . We f o u n d t h a t c u l t u r e s o f r a t m e s a n g i a l c e l l sc o n t a i n e d f i b r o n e c t i n a s t h e m o s t a b un d an t ECM p r o t e i n ,f o l l o w e d b y l a m i n i n a n d t y p e I V c o l l a g e n . F i b r o n e c t i n a n dl a m i n i n s h o w e d a p r e d o m i n a t e l y e x t r a c e l l u l a r f i b r i l l a r s t a i n -i n g p a t t e r n i n c o n f l u e n t c e l l s ( F i g u r e 1 A , B ) . I n n o n c o n f l u -e n t c e l l s , c y t o p l a s m i c g r a n u l a r s t a i n i n g was a l s o s e e ns i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d b y I s h i m u r a e t a l . 2 ' T h e s t a i n i n gw a s m o r e d e n s e a t a r e a s o f c e l l - t o - c e l l c o n t a c t . I n c o n -t r a s t , t y p e I V c o l l a g e n s t a i n i n g was p r e d o m i n a t e l y o b -s e r v e d i n a r e a s w h e r e t h e c e l l s h a d p i l e d u p a n d f o r m e dw h a t h a s b e e n r e f e r r e d t o a s ' h i l l o c k s ' 2 2 ( F i g u r e 1 C ) . T h i swas r a r e l y o b s e r v e d b e f o r e 4 w e e k s o f g r o w t h . T h e s t a i n -i n g was p r e d o m i n a t e l y c o a r s e l y g r a n u l a r a n d i n t h e a r e a so f c e l l - t o - c e l l c o n t a c t .A f t e r 4 w e e k s o f 3 0 m m o l / l g l u c o s e , a l l t h r e e ECM p r o -t e i n s e x a m i n e d w e r e i n c r e a s e d i n a m o u n t c o m p a r e d w i t hc e l l s g r o w n i n 1 0 m m o l / l g l u c o s e ( F i g u r e s 2 , 3 , a n d 4 ) . T h ei n c r e a s e i n ECM d e p o s i t i o n w a s n o t d u e t o a n i n c r e a s e i nt h e n u m b e r o f c e l l s a n d n o t a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s ei n t o t a l c e l l u l a r p r o t e i n . B e f o r e 4 w e e k s , t h e s t a i n i n g i n t e n -s i t y was s i m i l a r i n b o t h 1 0 m m o l / l a n d 3 0 m m o l / l g l u c o s ec e l l s . T o q u a n t i t a t e t h e s e o b s e r v a t i o n s , w e d e v e l o p e d as o l i d - p h a s e E L I S A ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . T h e r e -s u l t s o b t a i n e d b y t h i s E L I S A c o n f i r m e d o u r i m m u n o c y t o -c h e m i c a l f i n d i n g s ( T a b l e 1 ) . N a m e l y , 1 ) m e s a n g i a l c e l l sc o n t a i n f i b r o n e c t i n a s t h e m o s t a b u n d a n t ECM p r o t e i n ,f o l l o w e d b y l a m i n i n a n d t y p e I V c o l l a g e n , 2 ) t y p e I V c o l l a -g e n was m e a s u r a b l e o n l y a f t e r 4 w e e k s o f g r o w t h , w h e nm e s a n g i a l c e l l h i l l o c k s h a d f o r m e d , a n d 3 ) a f t e r 4 w e e k so f g r o w t h i n 3 0 m m o l / l g l u c o s e , a l l t h r e e ECM p r o t e i n sw e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n a m o u n t a s c o m p a r e d w i t h1 0 m m o l / l g l u c o s e . F i b r o n e c t i n a n d l a m i n i n w e r e i n -

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

4/10

1 3 4 2 A y o e t a lAJPJune 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 6

' . .

V , . .' < . . I . . . I . X . w i : . : . ; ; .. x . . ' s .:. aS" . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ . . . . . ..

F i g u r e 1 . A : I m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g f o r f i b r o n e c t i n i nm e s a n g i a l c e l l s c u l t u r e d i n 1 0 m m o l / l g l u c o s e . N o t e t h e f i b r i l -l a r s t a i n i n g p a t t e r n . C e l l s w e r e f i x e d and s t a i n e d 1 w e e k a f t e rp l a t i t n g . ( X 1 0 0 ) . B : I m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g f o r l a m i n i n i nm e s a n g i a l c e l l s c u l t u r e d i n 1 0 m m o l / l g l u c o s e . S i m i l a r t o t h ef i b r o n e c t i n - s t a i n e d c e l l s , l a m i n i n a l s o s h o w s a f i b r i l l a r s t a i n -i n g p a t t e r n ( a r r o w s ) . C e l l s w e r e f i x e d and s t a i n e d 1 w e e k a f t e rp l a t i n g , ( X 1 0 0 ) . C : I m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g f o r t y p e I V c o l -l a g e n i n c e l l s c u l t u r e d i n 1 0 m m o l / l g l u c o s e . T o d e mo n s t r a t et y p e IV c o l l a g e n , i t w as n e c e s s a r y t o grow t h e c e l l s p a s t c o n f l u -e n c e t o a l l o w t h e f o r m a t i o n o f m e s a n g i a l c e l l h i l l o c k s ( t h e s ec e l l s were gro wn f o r 4 w e e k s w i t h o u t p a s s a g i n g ) . N o t e t h at t h es t a i n i n g i s p r e d o m i n a t e l y i n t h e c e l l s t h a t h a v e p i l e d u p ( a r -r o w s ) ( X 1 0 0 ) .

.. .1 . . ... ,, l ,

C . 'r ,

P ,,....

e. 4s r I . X.

: * . . IV R A l

. . . . . 4

Ao.ze - p).-C AO

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

5/10

H i g h G l u c o s e a n d E x t r a c e l l u l a r M a t r i x 1 3 4 3A J P J u n e 1 9 9 0 , V o L 1 3 6 , N o . 6

Al~~~~~~~~

F i g u r e 2 . A : I m m u n o p e r o x i d a s e s t a i ni n g f o r f b r o n e c t i n f r o m m e s a n g i a l c e l l s g r o w n f o r 4 w e e k s w i t b o u t p a s s a g i n g i n 1 0 m m o l / lg l u c o s e . N o t e t h e ) f i b r i l l a r s t a i n i n g p a t t e r n and t h a t t h e d e g r e e o f s t a i n i n g i s g r e a t e r i n t h e h i l l o c k s ( a r r o w s ) . B : M e s a n g i a l c e l l s g r o w nf o r 4 i w e e k s i n . 3 0 m m o l / l g l u c o s e ) a n l d s t a i n e d f u r f t b r u n e c t i n . N o t e t h a t t h e p a t t e r n o f s t a i n i n g i s s i m i l a r t o 1 0 m m o l / l g l u c o s e c e l l sb u t t h e ) s t a i n i n g i n t e n t s i t y i s much g r e v a t r e r ( X 5 O ) .

c r e a s e d a p p r o x i m a t e l y 6 0 % , w h e r e a s t y p e I V c o l l a g e n i n -c r e a s e d b y 50 % i n c e l l s g r o w n i n 3 0 m m o l / l g l u c o s e .

B e c a u s e d i a b e t i c g l o m e r u l o s c l e r o s i s t a k e s m a n yy e a r s t o d e v e l o p , w e w e r e i n t e r e s t e d i n e x a m i n i n g t h eECM c o n t e n t a f t e r m a n y m o n t h s o f g r o w t h i n 3 0 m m o l / lv e r s u s 1 0 m m o l / l g l u c o s e . T o d o s u c h e x p e r i m e n t s , i t w a sn e c e s s a r y t o s u b c u l t u r e t h e c e l l s ( T h e c e l l s b e g i n t o p e e lo f f t h e d i s h e s i f t h e y a r e a l l o w e d t o g r o w o n t h e s u b s t r a -t u m f o r l o n g e r t h a n 4 w e e k s w i t h o u t p a s s a g i n g . ) . Weu s e d c e l l s t h a t w e r e c u l t u r e d f o r 8 m o n t h s . C e l l s w e r es u b c u l t u r e d t w i c e w e e k l y . T h e s e c e l l s r e s p o n d e d i n as i m i l a r m a n n e r a s y o u n g e r m e s a n g i a l c e l l s t o b o t h i s o p r o -t e r e n o l a n d v a s o p r e s s i n ( i e , s h a p e c h a n g e i n r e s p o n s et o c A M P - e l e v a t i n g a g e n t s a n d i n h i b i t i o n o f s h a p e c h a n g ew i t h a d d i t i o n o f v a s o p r e s s i n 1 3 , 1 5 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e y w e r ef u n c t i o n a l l y l i k e e a r l i e r p a s s a g e d c e l l s .A f t e r 6 w e e k s o f g r o w t h i n 3 0 m m o l / l g l u c o s e , t h e r ewas a p p r o x i m a t e l y a 40% i n c r e a s e i n f i b r o n e c t i n a n d l a m i -n i n c o n t e n t c o m p a r e d w i t h t h e 1 0 m m o l / l g l u c o s e c e l l s .B o t h p r o t e i n s w e r e i n c r e a s e d i n 3 0 m m o l / l g l u c o s e b yt w o f o l d a t 8 m o n t h s ( T a b l e 2 ) . T y p e I V c o l l a g e n w a s n o tm e a s u r a b l e , a s t h e s e c e l l s w e r e n o t a l l o w e d t o p i l e u pa n d f o r m h i l l o c k s w h e r e t y p e I V c o l l a g e n was p r e v i o u s l y

s e e n . S i m i l a r r e s u l t s w e r e f o u n d b y i m m u n o c y t o c h e m i s t r yf o r f i b r o n e c t i n a n d l a m i n i n ( F i g u r e s 5 , 6 ) .

D i s c u s s i o nT h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y d e m o n s t r a t e t h a t g l o m e r u l a r m e s -a n g i a l c e l l s c u l t u r e d u n d e r h i g h g l u c o s e c o n d i t i o n s a c c u -m u l a t e i n c r e a s e d a m o u n t s o f f i b r o n e c t i n , l a m i n i n , a n dt y p e I V c o l l a g e n s i m i l a r t o t h e d i a b e t i c m e s a n g i u m i n v i v o .T h e m e c h a n i s m s t h a t l e a d t o t h i s a c c u m u l a t i o n a r e n o t a sy e t u n d e r s t o o d , b u t c l e a r l y m u s t i n v o l v e i n c r e a s e d s y n -t h e s i s a n d / o r d e c r e a s e d d e g r a d a t i o n o f ECM p r o t e i n s b ym e s a n g i a l c e l l s . I n t h i s r e g a r d , p r e l i m i n a r y s t u d i e s s h o wt h a t m e s a n g i a l c e l l f i b r o n e c t i n s y n t h e s i s a n d mRNA a r es i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d a f t e r 1 w e e k o f g r o w t h i n 3 0 m m o l / lg l u c o s e . 2 3 R e c e n t s t u d i e s i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a c e l l s u r -f a c e s i t e d i s t i n c t f r o m t h e c e l l a d h e s i o n r e c e p t o r t h a t m e -d i a t e s t h e a s s e m b l y o f f i b r o n e c t i n i n t o f i b r i l l a r d i s u l f i d e -b o n d e d s t r u c t u r e s o f t h e c e l l s u r f a c e . 2 4 2 5 C e l l s a p p a r e n t l ya s s e m b l e t h e f i b r o n e c t i n m a t r i x b y f i r s t b i n d i n g t h e f i b r o -n e c t i n a n d s u b s e q u e n t l y t r a n s f e r r i n g i t t o t h e m a t r i x .T h u s , f i b r o n e c t i n d e p o s i t i o n i n t o t h e ECM may b e

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

6/10

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

7/10

H i g h G l u c o s e a n d E x t r a c e l l u l a r M a t r i x 1 3 4 5AJPJune 1 9 9 0 , V ol 1 3 6 , N o . 6

F i g u r e 4 . A : I m m u n i o p e r o x i d a s e s t a i n i n g f o r tpe IV c o l l a g e n i n m e s a n g i a l c e l l s grown f o r 4 w e e k s w i t h o u t p a s s a g i n g i n 10 m m o l / lg l u c o s e . N o t e t h a t t h e h i l l o c k s h o w s most o f t h e s t a i n i n g ( a r r o w s ) . B : C e l l s grown f o r 4 w e e k s i n 30 mmol/l g l u c o s e show i n c r e a s e ds t a i n i i n g i n t h e h i l l o c k f o r t j p e IV c o l l a g e n . N o t e a l s o t h a t t h e s t a i n i n g seems t o o u t l i n e t h e c e l l s . I n some areas t h e s t a i n i n g patternappears g l o b u l a r ( a rr o ws ) ( X 1 0 0 ) .

i n h i b i t o r o f m e t a l l o e n d o p e p t i d a s e . I n a d d i t i o n t o s e c r e t i n ga m e t a l l o p r o t e a s e , c u l t u r e s o f m e s a n g i a l c e l l s p r o d u c et h e u r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r ( u P A ) 3 2 as w e l las t h e t y p e i n h i b i t o r o f uPA ( K r e i s b e r g , u n p u b l i s h e d o b -s e r v a t i o n s ) . P l a s m i n o g e n a c t i v a t o r s a r e s e r i n e p r o t e a s e st h a t c a t a l y z e t h e c o n v e r s i o n o f t h e proenzyme, p l a s m i n o -g e n , t o t h e a c t i v e e n z y m e p l a s m i n , a w i d e - s p e c t r u m p r o -t e a s e c a p a b l e o f d e g r a d i n g m o s t g l y c o p r o t e i n c o m p o -n e n t s o f t h e E C M . 3 4 G l a s s e t a 1 3 5 r e c e n t l y r e p o r t e d t h a t

s h ap e c h a n g e i n m e s a n g i a l c e l l s t r e a t e d w i t h c A M P - e l e -v a t i n g a g e n t s w a s a s s o c i a t e d w i t h r e l e a s e o f f i b r o n e c t i ni n t o t h e m e d i u m . B o t h s h a p e c h a n g e a n d f i b r o n e c t i n r e -l e a s e w e r e i n h i b i t e d b y p r e t r e a t m e n t w i t h an a n t i b o d y t ou P A . T h u s , uPA s e e m s t o b e i m p o r t a n t f o r ECM t u r n o v e ra n d c e l l f u n c t i o n ( i e , s h a p e c h a n g e ) i n c u l t u r e s o f mesan-g i a l c e l l s . A l t e r a t i o n s t o t h e s e p r o t e a s e s o r t h e i r i n h i b i t o r sc o u l d r e s u l t i n d e c r e a s e d d e g r a d a t i o n o f ECM p r o t e i n s .I n s u p p o r t o f s u c h a m e c h a n i s m , C o h e n , S u r m a a n d W u 3 6

T a b l e 1 . E f f e c t o f G l u c o s e o n A c c u m u l a t i o n o f E x t r a c e l l u l a r M a t r i x P r o t e i n s b y R a t M e s a n g i a l C e l l s i n C u l t u r eD u r a t i o n o f g r o w t h F i b r o n e c t i n ( n g ) L a m i n i n ( n g ) T y p e I V c o l l a g e n ( n g )i n g l u c o s eG l u c o s e c o n c e n t r a t i o n ( n o n p a s s a g e d ) DNA ( j i g ) DNA ( M g ) DNA ( , g )1 0 m m o l / l 1 wk 1 1 0 7 + 7 4 . 1 5 5 4 . 5 NM3 0 m m o l / l 1 wk 1 2 5 1 5 0 . 4 4 5 3 . 0 NM1 0 m m o l / I 2 wk 3 0 0 6 2 6 1 . 0 4 4 3 . 5 NM3 0 m m o l / I 2 wk 3 3 6 8 2 4 5 . 2 5 5 3 . 5 NM1 0 m m o l / l 4 wk 4 6 3 2 2 3 4 . 9 5 5 1 . 5 6 5 0 6 5 . 03 0 m m o l / l 4 wk 7 5 8 4 5 2 9 . 3 * 8 5 5 . 5 * 1 0 0 5 3 9 . 5 *

R e s u l t s a r e m e a n s SEM o f t h e mean v a l u e s f r o m a t l e a s t 1 0 s a m p l e s f o r e a c h c o n d i t i o n .* P < 0 . 0 5 3 0 m m o l / l v s . 1 0 m m o l / l g l u c o s e ( S t u d e n t - N e w m a n - K e u l s t e s t )N M , n o t m e a s u r a b l e .

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

8/10

1 3 4 6 A y o e t a lA J P J u n e 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 6

T a b l e 2 . E f f e c t o f G l u c o s e on A c c u m u l a t i o n o f E x t r a c e l l u l a r M a t r i x P r o t e i n s b y R a t M e s a n g i a l C e l l s i n C u l t u r eD u r a t i o n o f g r o w t h n g F i b r o n e c t i n n g L a m i n i ni n g l u c o s eG l u c o s e c o n c e n t r a t i o n ( s u b c u l t u r e d ) z g DNA A g DNA

1 0 m m o l / l 6 w e e k s 1 9 6 6 9 7 . 3 1 1 0 3 . 63 0 m m o l / l 6 w e e k s 2 7 1 3 1 1 0 . 3 * 1 6 0 1 0 . 6 *1 0 m m o l / l 8 m o n t h s 1 6 0 3 1 7 2 . 4 1 0 6 . 6 5 . 03 0 m m o l / l 8 m o n t h s 3 6 0 3 1 0 4 . 4 * 2 2 3 . 6 2 1 . 6 *

R e s u l t s a r e m e a n s SEM o f t h e m e a n v a l u e s f r o m a t l e a s t f i v e s a m p l e s f o r e a c h c o n d i t i o n .* P < 0 . 0 5 3 0 m m o l / l v s . 1 0 m m o l / l g l u c o s e ( S t u d e n t - N e w m a n - K e u l s t e s t )

s h o w e d w i t h p u l s e c h a s e s t u d i e s i n s t r e p t o z o t o c i n d i a -b e t i c r a t s p r o l o n g a t i o n o f G B M t u r n o v e r s u g g e s t i v e t h a td i m i n i s h e d d e g r a d a t i o n may a l s o b e a c o n t r i b u t i n g f a c t o ri n G B M a c c u m u l a t i o n .

G l u c o s e may b e e x e r t i n g i t s e f f e c t o n m e s a n g i a l c e l lm a t r i x t u r n o v e r i n m a n y w a y s . M e t ab ol i c f a c t o r s a t t r i b u t -a b l e t o h i g h g l u co s e a n d/ or c h a n g e s i n m e d i u m t o n i c i t yma y c a u s e a l t e r a t i o n s i n m a t r i x t u r n o v e r . H o w e v e r , o n e o ft h e m a j o r p a t h o p h y s i o l o g i c c o n s e q u e n c e s o f h y p e r g l y c e -m i a i s t h e e x c e s s i v e c h e m i c a l i n t e r a c t i o n o f g l u c o s e w i t hp r o t e i n s , l e a d i n g t o i t s a t t a c h m e n t t o t h e s e p r o t e i n s w i t h -o u t t h e a i d o f e n z y m e s . 3 7 S o m e o f t h e s e e a r l y g l y c o s y l a -t i o n e n d p r o d u c t s o f l o n g - l i v e d p r o t e i n s ( s u c h a s t h o s e i n

t h e m e s a n g i u m ) d o n o t d i s s o c i a t e , b u t i n s t e a d u n d e r g o ac o m p l e x s e r i e s o f c h e m i c a l r e a r r a n g e m e n t s t o f o r m i r r e -v e r s i b l e a d v a n c e d g l y c o s y l a t i o n e n d p r o d u c t s . T h e s e d on o t r e t u r n t o n o r m a l w h e n t h e h y p e r g l y c e m i a i s c o r r e c t e d ,b u t a c c u m u l a t e o v e r t h e l i f e t i m e o f t h e p r o t e i n . I t h a s b e e ns h o w n t h a t g l y c o s y l a t i o n o f p r o t e i n s r e n d e r s t h e m r e s i s -t a n t t o d e g r a d a t i o n b y p r o t e a s e s . F o r e x a m p l e , t h e s u s -c e p t i b i l i t y o f g l y c o s y l a t e d G B M t o d i g e s t i o n b y p r o t e a s e ss u c h a s p a p a i n , p e p s i n , a n d t r y p s i n i s c o n s i d e r a b l y r e -d u c e d . ' T h u s , a n o t h e r m e c h a n i s m o f e x c e s s i v e ECM a c -c u m u l a t i o n i n c u l t u r e s o f r a t m e s a n g i a l c e l l s g r o w n i n m e -d i u m c o n t a i n i n g 3 0 m m o l / l g l u c o s e may b e r e s i s t a n c e o fg l y c o s y l a t e d ECM p r o t e i n s t o d e g r a d a t i o n .

F i g u r e 5 . I m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g f o r f i b r o n e c t i n a f t e r 8 m o n t h s o f g r o w t h i n 1 0 m m o l / l ( A ) and 30 m m o l / l ( B ) g l u c o s e . C e l l swere f i x e d and s t a i n e d a f t e r 1 week o f p l a t i n g N o t e t h e i n t c r e a s e d d e g r e e o f s t a i n i n g i n t h e 30 m m o l l I g l u l c o s e c e l l s ( B ) , ( X 1 0 0 ) .

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

9/10

H i g h G l uc o s e a n d E x t r a c e l l u l a r M a t r i x 1 3 4 7AJPJune 1 9 9 0 , V o l . 1 36 , N o . 6

A~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~m m l / g l c s c e l l ' s ( B ) ( X 2 0 0 ) .

iS w. e=. :. s ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Wg S ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ W . 5 . . 'C s ) ' X s ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ I

F i g u r e 6 . I m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i i n g f o r l a m i n i n a f t e r 8 m o n t h s o f g r o w t h i n 1 0 m m o o / ( A ) and 3 0 m m o l / l ( B ) g l u c o s e . C e l l s weref i x e d a n i d s t a i n i e d a f t e r 1 week o f p l a t i n g . S i m i l a r t o t h e f J i b r o n t e c t i n r e s u l t s i n F i g u r e 5 , l a m i n i n s h o w e d i n c r e a s e d s t a i n i n g i n t h e 3 0m m o l / l g l u c o s e c e l l s ( B ) , ( X 2 0 0 ) .I n c o n c l u s i o n , t h i s m o d e l o f i n c r e a s e d ECM d e p o s i t i o n

u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e c e l l s a r e g r o w n i n h i g h - g l u -c o s e - c o n t a i n i n g m e d i u m s h o u l d h e l p t o e l u c i d a t e t h em e c h a n i s m s i n v o l v e d a n d p e r h a p s a i d i n e s t a b l i s h i n gt h e r a p e u t i c m o d a l i t i e s t o c o m b a t t h i s c o n d i t i o n .

R e f e r e n c e s1 . H a n s - H e n r i k P , M a u e r S M : D i a b e t i c N e p h r o p a t h y : T h e S e c -

o n d W o r l d C o n f e r e n c e o n D i a b e t e s R e s e a r c h , New F r o n -t i e r s 1 9 8 8 . T h e J u v e n i l e D i a b e t e s F o u n d a t i o n I n t e r n a t i o n a l ,1 9 8 8 , p p 2 8 - 3 3

2 . M o g e n s e n C E : R e n a l f u n c t i o n a l c h a n g e s i n d i a b e t e s . D i a b e -t e s 1 9 7 6 , 2 5 ( S u p p l 2 ) : 8 7 2 - 8 7 93 . V i b e r t i G C , P i c k u p J C , J a r r e t t R J , K e e n H : E f f e c t o f c o n t r o lo f b l o o d g l u c o s e o n u r i n a r y e x c r e t i o n o n a l b u m i n a n d # 2 -m i c r o g l o b u l i n i n i n s u l i n - d e p e n d e n t d i a b e t e s . N E n g l J Me d1 9 7 9 , 3 0 0 : 6 3 9 - 6 4 14 . G e l l m a n D D , P i r a n i C L , S o o t h i l l J F , M u e h r c k e R C , M a d u r o s

W , K a r k R M : S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n i n d i a b e t i c n e p h r o p a t h y .T h e i m p o r t a n c e o f d i f f u s e g l o m e r u l o s c l e r o s i s . D i a b e t e s1 9 5 9 , 8 : 2 5 1 - 2 5 6

5 . M a u e r S M , S t e f f e s MW, E l l i s E N , S u t h e r l a n d D E R , B r o w nD M , G oe t z F C : S t r u c t u r a l - f u n c t i o n a l r e l a t i o n s h i p s i n d i a b e t i cn e p h r o p a t h y . J C l i n I n v e s t 1 9 8 4 , 7 4 : 1 1 4 3 - 1 1 5 5

6 . l i d a k a K , M c C o y J , K i m m e l s t i e l P : T h e g l o m e r u l a r m e s a n -g i u m . A q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s . L a b I n v e s t 1 9 6 8 , 1 9 : 5 7 3 - 5 7 97 . K a w a n o K , A r a k a w a M , M c C o y J , P o r c h J , K i m m e l s t i e l P :Q u a n t i t a t i v e s t u d y o f g l o m e r u l i . F o c a l g l o m e r u l o n e p h r i t i s

a n d d i a b e t i c g l o m e r u l o s c l e r o s i s . L a b I n v e s t 1 9 6 9 , 2 1 : 2 6 9 -2 7 5

8 . C o t r a n R S , K u m a r V , R o b b i n s S L : R o b b i n s P a t h o l o g i c B a s i so f D i s e a s e . 4 t h e d i t i o n . P h i l a d e l p h i a , WB S a u n d e r s , 1 9 8 9 ,p p 1 0 4 4 - 1 0 4 7

9 . S c h e i n m a n J I , F i s h A J , M a t a s A J , M i c h a e l A F : T h e i m m u n o -h i s t o p a t h o l o g y o f g l o m e r u l a r a n t i g e n s : I I . T h e g l o m e r u l a rb a s e m e n t m e m b r a n e , a c t o m y o s i n a n d f i b r o b l a s t s u r f a c ea n t i g e n s i n n o r m a l , d i s e a s e d a n d t r a n s p l a n t e d h u m a n k i d -n e y s . A m J P a t h o l 1 9 7 8 , 9 0 : 7 1 - 8 8

1 0 . B r u n e v a l P , F o i d a r t J M , N o c h y D , C a m i l l e r i J P , B a r i e t y J : G l o -m e r u l a r m a t r i x p r o t e i n s i n n o d u l a r g l o m e r u l o s c l e r o s i s i n a s -s o c i a t i o n w i t h l i g h t c h a i n d e p o s i t i o n d i s e a s e a n d d i a b e t e sm e l l i t u s . Hu m P a t h o l 1 9 8 5 , 1 6 : 4 7 7 - 4 8 4

1 1 . S t e f f e s MW, B r o w n D M , B a s g e n J W , M a u e r S M : A m e l i o r a -t i o n o f m e s a n g i a l v o l u m e a n d s u r f a c e a l t e r a t i o n s f o l l o w i n gi s l e t t r a n s p l a n t a t i o n i n d i a b e t i c r a t s . D i a b e t e s 1 9 8 0 , 2 9 : 5 0 9 -5 1 5

7/27/2019 amjpathol00114-0139.pdf

10/10