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1 N Acta Scientiae Veterinariae, 2011. 39(2): 957. Acta Scientiae Veterinariae, 2011. 39(2): 957. Acta Scientiae Veterinariae, 2011. 39(2): 957. Acta Scientiae Veterinariae, 2011. 39(2): 957. Acta Scientiae Veterinariae, 2011. 39(2): 957. REVIEW ARTICLE Pub. 957 Pub. 957 Pub. 957 Pub. 957 Pub. 957 ISSN 1679-9216 (Online) Received: November 2010 www.ufrgs.br/actavet Accepted: January 2011 Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, Brasil. CORRESPONDÊNCIA: S.V. Castro [[email protected] - Fax: +55 (85) 3101-9840]. Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, Brasil. Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil. Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos de tecido ovariano e oócitos de tecido ovariano e oócitos de tecido ovariano e oócitos de tecido ovariano e oócitos Intracellular Cryoprotectant Agents: Characteristics and Use of Ovarian Tissue and Oocyte Cryopreservation Simone Vieira Castro, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da Silva, Luciana Rocha Simone Vieira Castro, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da Silva, Luciana Rocha Simone Vieira Castro, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da Silva, Luciana Rocha Simone Vieira Castro, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da Silva, Luciana Rocha Simone Vieira Castro, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da Silva, Luciana Rocha Faustino austino austino austino austino, J J J J José R osé R osé R osé R osé Ric ic ic ic icar ar ar ar ardo de F do de F do de F do de F do de Figueir igueir igueir igueir igueiredo & A edo & A edo & A edo & A edo & Ana P na P na P na P na Paula R aula R aula R aula R aula Rib ib ib ib ibeir eir eir eir eiro R o R o R o R o Rodr dr dr dr drigues igues igues igues igues ABSTRACT Background: The application of cryopreservation in human and animal reproductive medicine has stimulated several studies about the effects of low temperatures and freezing processes on cells and tissues, in order to develop efficient protocols for gamete and embryo preservation. Moreover, cryopreservation is a fundamental tool for the establishment of animal germplasm banks, allowing the preservation of genetic material from several species and breeds or for further study and/or recovery of desirable characteristics. For the success of cryopreservation, the addition of an intracellular cryoprotectant agent in the freezing solution is indispensable. However, issues related to intracellular cryoprotectant agents used, e.g., their metabolism and potential toxicity, must be examined carefully so we can choose the cryoprotectant most suitable for a specific structure. Review: In this regard, this review introduces several aspects of cryopreservation, such as basic principles and methods used (slow freezing and vitrification), describing the fundamental steps of cryoprotectant agent’s exposure, cooling, storage, thawing or warming and removal of the cryoprotectant agent. The addition of an intracellular cryoprotectant to the freezing solution is essential, but does not guarantee the success of the cryopreservation protocol, due to its toxic effect, which requires a perfect balance between cryoprotectant concentration, temperature and exposure time to the structure which will be cryopreserved. Some studies attribute the toxicity of these agents mainly to the secondary metabolites formed when the cell resumes its activity and gradually begins to metabolize the cryoprotectant agent. These secondary metabolites, such as lactate resulting from the degradation of propanediol and the production of oxalic acid after the catalysis of ethylene glycol, can interfere in a number ways on cellular homeostasis, resulting from an acid-base imbalance with cellular acidosis until the uncoupling of oxidative phosphorylation in the mitochondrial membrane, preventing the production of adenosine triphosphate. In addition, there are characteristics of tissue’s formation and metabolic peculiarities inherent to each species, resulting in differences in optimal conditions required to maintain the biological properties of cells after thawing. Therefore, in addition to the knowledge about the chemical and biological characteristics of the most suitable cryoprotectant agent for a given species, it is also necessary to adjust the concentration and exposure time to it, allowing a more efficient preservation of various cell types. Conclusion: Cryopreservation is a valuable tool for female gametes preservation, providing support for several reproductive biotechnologies allowing safeguard the genetic material and facilitating its propagation. However, the success of this procedure depends on the proper use of a cryoprotectant agent, which application, although essential, can cause irreversible cell damage that can result in cellular death. Although there is no ideal cryoprotectant agent, able to protect completely the cell at low temperatures and also to be free of toxicity, it has been demonstrated that the cryoprotectants currently employed enabled the preservation of oocytes and ovarian tissue allowing the in vitro production of embryos and the restoration of fertility after transplantation. Keywords: cryopreservation, female gamete, ethylene glycol, propanediol, dimethylsulphoxide, glycerol. Descritores: criopreservação, gameta feminino, etilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, glicerol.
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Acta Scientiae Veter inariae, 2011. 39(2) : 957.Acta Scientiae Veter inariae, 2011. 39(2) : 957.Acta Scientiae Veter inariae, 2011. 39(2) : 957.Acta Scientiae Veter inariae, 2011. 39(2) : 957.Acta Scientiae Veter inariae, 2011. 39(2) : 957.
REVIEW ARTICLEPub. 957Pub. 957Pub. 957Pub. 957Pub. 957
ISSN 1679-9216 (Online)
Received: November 2010 www.ufrgs.br/actavet Accepted: January 2011
Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV).Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, Brasil. CORRESPONDÊNCIA: S.V. Castro [[email protected] - Fax: +55 (85)3101-9840]. Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, Brasil. Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP 60740-000 Fortaleza,CE, Brasil.
Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservaçãoAgentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservaçãoAgentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservaçãoAgentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservaçãoAgentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservaçãode tecido ovariano e oócitosde tecido ovariano e oócitosde tecido ovariano e oócitosde tecido ovariano e oócitosde tecido ovariano e oócitos
Intracellular Cryoprotectant Agents: Characteristics and Use of Ovarian Tissue and OocyteCryopreservation
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ABSTRACT
Background: The application of cryopreservation in human and animal reproductive medicine has stimulated several studiesabout the effects of low temperatures and freezing processes on cells and tissues, in order to develop efficient protocols forgamete and embryo preservation. Moreover, cryopreservation is a fundamental tool for the establishment of animal germplasmbanks, allowing the preservation of genetic material from several species and breeds or for further study and/or recovery ofdesirable characteristics. For the success of cryopreservation, the addition of an intracellular cryoprotectant agent in the freezingsolution is indispensable. However, issues related to intracellular cryoprotectant agents used, e.g., their metabolism and potentialtoxicity, must be examined carefully so we can choose the cryoprotectant most suitable for a specific structure.Review: In this regard, this review introduces several aspects of cryopreservation, such as basic principles and methods used(slow freezing and vitrification), describing the fundamental steps of cryoprotectant agent’s exposure, cooling, storage, thawingor warming and removal of the cryoprotectant agent. The addition of an intracellular cryoprotectant to the freezing solution isessential, but does not guarantee the success of the cryopreservation protocol, due to its toxic effect, which requires a perfectbalance between cryoprotectant concentration, temperature and exposure time to the structure which will be cryopreserved.Some studies attribute the toxicity of these agents mainly to the secondary metabolites formed when the cell resumes its activityand gradually begins to metabolize the cryoprotectant agent. These secondary metabolites, such as lactate resulting from thedegradation of propanediol and the production of oxalic acid after the catalysis of ethylene glycol, can interfere in a number wayson cellular homeostasis, resulting from an acid-base imbalance with cellular acidosis until the uncoupling of oxidativephosphorylation in the mitochondrial membrane, preventing the production of adenosine triphosphate. In addition, there arecharacteristics of tissue’s formation and metabolic peculiarities inherent to each species, resulting in differences in optimalconditions required to maintain the biological properties of cells after thawing. Therefore, in addition to the knowledge about thechemical and biological characteristics of the most suitable cryoprotectant agent for a given species, it is also necessary to adjustthe concentration and exposure time to it, allowing a more efficient preservation of various cell types.Conclusion: Cryopreservation is a valuable tool for female gametes preservation, providing support for several reproductivebiotechnologies allowing safeguard the genetic material and facilitating its propagation. However, the success of this proceduredepends on the proper use of a cryoprotectant agent, which application, although essential, can cause irreversible cell damagethat can result in cellular death. Although there is no ideal cryoprotectant agent, able to protect completely the cell at lowtemperatures and also to be free of toxicity, it has been demonstrated that the cryoprotectants currently employed enabled thepreservation of oocytes and ovarian tissue allowing the in vitro production of embryos and the restoration of fertility aftertransplantation.
Keywords: cryopreservation, female gamete, ethylene glycol, propanediol, dimethylsulphoxide, glycerol.
Descritores: criopreservação, gameta feminino, etilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, glicerol.
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FFigura 2
I. INTRODUÇÃO
II.FUNDAMENTOS DA CRIOPRESERVAÇÃO
1. Métodos de criopreservaçãoIII. HISTÓRICO DOS AGENTES CRIOPROTETORES
IV. AGENTES CRIOPROTETORES INTRACELULARES
1. Etilenoglicola. Obtenção e aplicaçõesb. Metabolização e mecanismo tóxicoc. Utilização do EG na criopreservação de
tecido ovariano e gametas femininos2. Dimetilsulfóxido
a. Obtenção e aplicaçõesb. Metabolização e mecanismo tóxicoc. Utilização do DMSO na criopreservação
de tecido ovariano e gametas femininos3. Propanodiol
a. Obtenção e aplicaçõesb. Metabolização e mecanismo tóxicoc. Utilização do PROH na criopreservação
de tecido ovariano e gametas femininos4. Glicerol
a. Obtenção e aplicaçõesb. Metabolização e mecanismo tóxicoc. Utilização do GLI na criopreservação de
tecido ovariano e gametas femininosV. CONCLUSÃO
VI. REFERÊNCIAS
I. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a criotecnologia tem conquis-tado grande destaque tanto na medicina reprodutiva hu-mana quanto na reprodução animal, seja através dacriopreservação de embriões [58]; células germinativasmasculinas [12] ou femininas [65] ou mesmo através dacriopreservação de tecido gonadal como ovário [92].
A criopreservação tem como princípio básico aredução da temperatura como forma de reduzir o meta-bolismo celular, permitindo que as células ou os tecidossejam conservados por períodos indeterminados, permi-tindo a retomada do desenvolvimento celular normal apóso armazenamento [86] em nitrogênio líquido (-196 °C).No entanto, o sucesso dessa técnica depende de umadelicada e complexa interação entre importantes variá-veis, que envolve tanto questões físicas, como o volumeda solução de criopreservação e as taxas de resfriamento;quanto questões químicas referentes à composição dasolução de criopreservação. Além disso, para reduzir ouevitar as injúrias induzidas pelas baixas temperaturas é
essencial a adição de substâncias que proporcionem umacrioproteção celular e tecidual durante a redução da tem-peratura [108]. Essas substâncias, conhecidas como agen-tes crioprotetores (ACPs) são fundamentais para o su-cesso da criopreservação.
Embora, os ACPs sejam absolutamente neces-sários e amplamente utilizados nos protocolos de crio-preservação, os mecanismos que conferem proteçãoao material biológico, bem como a toxicidade e ametabolização celular destes agentes não são completa-mente esclarecidos e abordados na literatura. Neste con-texto, a presente revisão tem como objetivo descreveros aspectos ligados ao processo de criopreservação, res-saltando os ACPs intracelulares, isto é, aqueles que atra-vessam a membrana celular e, portanto, evitam, sobretu-do, a formação de gelo no interior da célula.
II. FUNDAMENTOS DA CRIOPRESERVAÇÃO
A criopreservação consiste na conservação domaterial biológico, por tempo indefinido, a temperaturasnegativas [94], para que quando descongelado, o materi-al biológico possa prosseguir seu desenvolvimento nor-mal [86]. A temperatura em que é realizada acriopreservação é conhecida como “temperaturacriogênica”, isto é, temperatura extremamente baixa naqual os gases encontram-se liquefeitos à pressão atmos-férica [94]. Essa temperatura é obtida com o nitrogêniolíquido, cuja temperatura é de -196 °C, ou em sua fasede vapor [54], na qual a temperatura varia em função dadistância entre a amostra e o nível de nitrogênio líquido.À temperatura criogênica, todas as reações químicas,processos biológicos, bem como as atividades intra eextracelulares estão suspensas, portanto, teoricamente,uma célula ou tecido podem ser mantidos criopreservadosindefinidamente [102]. Porém, para isso, é necessária autilização de um ACP na composição da solução decriopreservação, cuja concentração depende do métodode criopreservação empregado.
1. Métodos de criopreservaçãoO processo de criopreservação pode ser reali-
zado por dois métodos, isto é, a congelação lenta e avitrificação. Independente do método utilizado, acriopreservação baseia-se em cinco etapas fundamen-tais: 1) exposição ao ACP, com a finalidade de permitira difusão desses agentes nos compartimentos celulares;2) resfriamento com redução da temperatura de for-ma gradual (congelação lenta) ou súbita(vitrificação), na qual a amostra passa da temperatura
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ambiente para a temperatura criogênica; 3) arma-zenamento ou estocagem, permitindo a preservaçãodo material em temperatura ultrabaixa por períodosindefinidos; 4) descongelação ou aquecimento, etapana qual ocorre o resgate do material criopreservado eretomada do metabolismo celular; e 5) diluição ou re-moção do ACP, a fim de evitar, na presença de tempe-ratura fisiológica ou ambiente, a produção de metabólitossecundários, o que intensificaria a ação tóxica destesaditivos.
Os métodos de criopreservação divergem entreem si, principalmente, quanto à taxa de redução de tem-peratura empregada. A congelação lenta é caracteriza-da por uma redução gradual da temperatura, com o ob-jetivo de reduzir o estresse térmico na fase de transiçãodas soluções do estado líquido para o estado sólido [96].Além disso, é caracterizada também por uma desidrata-ção celular gradual que evita ou reduz a formação decristais de gelo. Nesta situação, baixas concentraçõesde ACP são suficientes a fim de que esses objetivos se-jam alcançados [101].
Para o resfriamento lento, o material biológicogeralmente é congelado sob o controle de um freezerprogramável e, uma vez atingido uma adequada desidra-tação celular, a qual ocorre quando a temperatura seencontra entre -30 a -80 ºC, o material é estocado emnitrogênio líquido [85] à temperatura de -196 °C.
Por outro lado, a vitrificação consiste no métodode criopreservação na qual a redução de temperaturaocorre de forma brusca, cujo objetivo é a obtenção deum sólido amorfo ou em estado vítreo, que difere do só-lido cristalino por não haver formação de cristais de gelono interior dos compartimentos celulares [114]. Contudo,para a obtenção desse estado vítreo é necessário, alémde uma alta taxa de resfriamento (por exemplo, 2500 °C/min), a utilização de uma solução de vitrificação comalta viscosidade, a qual é obtida com o emprego de ele-vadas concentrações de ACPs [27,115].
Independente do método empregado, a adiçãode um ACP representa um fator chave para o sucessoda criobiologia, sendo indispensável sua presença paraque as células possam resistir às injúrias resultantes doprocedimento de criopreservação [71,77,87]. Contudo,os metabólitos resultantes da degradação dos ACPs pelacélula podem ser tóxicos para as células, sendo este umfator limitante para o sucesso da utilização dos mesmos[32].
III. HISTÓRICO DOS AGENTES CRIOPROTETORES
A descoberta acidental da ação crioprotetorado glicerol por Polge et al. [88] durante as suas tenta-tivas para preservar espermatozóides de aves revo-lucionou os métodos de criopreservação de diversascélulas e tecidos. No ano seguinte, Smith (Smith,1950) estendeu as observações da função desse agen-te para a criopreservação de eritrócitos do sanguehumano. Esses dois relatos foram fundamentais paraidentificar elementos chaves que desempenhariamum papel crucial na evolução do campo da bio-preservação, como por exemplo, a) a necessidadede utilização de um ACP; b) o processo pelo qual ascélulas poderiam ser expostas com sucesso a um ACPpenetrante ou intracelular, bem como a c) a maneirade congelar e descongelar. Na década seguinte, exa-tos dez anos mais tarde, Lovelock e Bishop [63],descreveram a utilização do dimetilsulfóxido comoACP, cujas características conferem maior per-meabilidade a vários tipos de células em relação aoGlicerol.
Somente, a partir da década de 80, estudos jáconsideravam o efeito tóxico dos crioprotetores comoum obstáculo para o sucesso da criobiologia [31]. Desdeentão, tem-se buscado novas substâncias capazes deproteger as células dos efeitos deletérios das baixas tem-peraturas e que não seja prejudicial às mesmas. Os ACPssão substâncias de classe orgânica variada, que agemprotegendo a célula durante o período de estocagem embaixas temperaturas, prevenindo a formação de gelointracelular e possíveis danos causados pela desidrata-ção [46]. Dependendo do local de ação, os ACPs podemser classificados como intracelulares ou extracelulares.Por razões didáticas, na presente revisão, serão aborda-dos somente os ACPs intracelulares.
IV. AGENTES CRIOPROTETORES INTRACELULARES
Os crioprotetores intracelulares são solventesorgânicos de baixo peso molecular que possuem a capa-cidade de penetrar na célula [89]. Dentre os crioprotetoresintracelulares destacam-se, o etilenoglicol, o dime-tilsulfóxido e o propanodiol por apresentarem umacapacidade de penetração superior a do glicerol e baixatoxicidade. Contudo, a eficiência destes ACPs pode va-riar em função da estrutura (célula ou tecido) a sercriopreservada [90], do tipo e concentração e tempo deexposição utilizado antes do processo de criopreservação
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propriamente dito. Além disso, as diferenças estrutu-rais entre as espécies animais é também um fator quepode influenciar na eficácia de um ACP [33,37].
De forma geral os ACPs intracelulares atuamsubstituindo parcialmente a água no interior da célula eligam-se ao hidrogênio das moléculas de água intracelular[52], aumentando a viscosidade da solução de congela-ção, consequentemente, reduzindo o ponto de congela-ção da mesma. Além disso, os ACPs também agem pre-venindo a exposição do material a altas concentrações
de eletrólitos, através da ligação aos próprios eletrólitosou pela substituição parcial pela água. Os tópicossubsequentes apresentam uma descrição detalhada so-bre as características dos agentes crioprotetoresintracelulares mais amplamente utilizados nos processosde criopreservação de materiais biológicos. A Tabela 1mostra uma síntese dos principais resultados da utiliza-ção de diferentes agentes crioprotetores para acriopreservação de estruturas como o tecido ovariano e
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oócitos de diversas espécies
1. Etilenoglicol1.a. Obtenção e aplicações
O etilenoglicol (EG) ou monoetilenoglicol é umálcool de fórmula molecular C2H4(OH)2, obtido a partirda hidrólise do óxido de eteno, empregado como anticon-gelante em sistemas de refrigeração de motores, fluídode freio e como matéria prima para produção de fibrapoliéster [70]. Devido às suas características de baixopeso molecular (62,07 g/mol) e baixo ponto de fusão (-15,6°C), o EG tem sido amplamente empregado comoagente crioprotetor intracelular [78]. Todavia, ametabolização desse crioprotetor gera subprodutos po-tencialmente tóxicos, como o acido glicólico e oxalato[25].1.b. Metabolização e mecanismo tóxico
No sistema celular, a metabolização do EG ocorreinicialmente no retículo endoplasmático, onde é converti-do em glicoaldeído pela enzima álcool desidrogenase(ADH) e em menor quantidade pela citocromo P4502E1 [106]. O glicoaldeído pode originar como subprodutoo ácido glicólico, que representa a via prioritária demetabolização, e o glioxal, de menor importância in vivodevido à sua meia-vida curta [35,66]. O ácido glicólico érapidamente degradado pela enzima aldeído desi-drogenase (ALDH), resultando na formação de áci-do glioxílico. A partir deste metabólito, o ácido oxálico éformado pela ação da glicolato oxidase (GD) e lactatodesidrogenase (LDH). O ácido oxálico, por sua vez podeconjugar-se com íons cálcio originando o oxalato de cál-cio, um componente tóxico que compromete principal-mente a função renal [25]. As reações de metabolizaçãodo EG são mostradas na Figura 1.
Dependendo da quantidade de EG metabolizado,o ácido glicólico formado excede a capacidade tam-ponante natural da célula, levando a uma redução dopH com consequente acidose celular, resultando na for-mação de glicina e ácido oxálico [15]. Em um estudosobre células renais, McMartin e Wallace [72] observa-ram o efeito do oxalato de cálcio monohidratado, resul-tante da conjugação do ácido oxálico advindo do meta-bolismo do EG com íon cálcio e, sugeriram que o acúmulointracelular deste metabólito pode levar a uma alteraçãoda permeabilidade mitocondrial, inibindo a cadeia respi-ratória, culminando com a morte celular devido à inibi-ção da síntese de adenosina trifosfato (ATP). Contudo,estudos realizados in vivo, avaliando a quantidade desubprodutos do EG secretados na urina, revelaram uma
variação entre indivíduos em decorrência dopolimorfismo dos sistemas ADH e ALDH. Nesta abor-dagem, Gross et al. [43] avaliando a ação de diferen-tes isoformas de ALDH humana, demonstraram quea oxidação dos aldeídos (glicoaldeídos), em seus res-pectivos ácidos, representam a etapa limitante para atoxicidade do EG. Um estudo realizado em ratos cor-robora com este fato, pois foi demonstrado que a di-ferença de sensibilidade à toxicidade do EG está re-lacionada a fatores genéticos [27]. Porém, vale res-saltar que a toxicidade biológica dos agentescrioprotetores está diretamente relacionada às suasrespectivas concentrações. Assim, nas concentraçõesnormalmente empregadas para o processo de con-gelação lenta, a toxicidade não parece ser um fatorlimitante para a utilização do EG como agentecrioprotetor, uma vez que, diversos estudos mostram
Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcooldesidrogenase; ALDH: aldeído desidrogenase; AO: aldeído oxidase;LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina glioxilatoaminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase)Adaptado de Corley et al. [25].
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altas taxas de sobrevivência celular apóscriopreservação de folículos caprinos [3] e bovinos[18], oócitos humanos [28] e embriões ovinos [103]com o uso de EG.1.c. Utilização do EG na criopreservação de tecidoovariano e gametas femininos
O EG tem sido corriqueiramente empregado paraa conservação de folículos ovarianos pré-antrais isola-dos [94,97] ou inclusos em tecido ovariano [9,33], oócitos[7] e embriões [30], obtendo-se resultados satisfatóriose promissores. Apesar disso, alguns estudos têm demons-trado resultados contraditórios quanto à utilização desteagente.
Um estudo realizado na espécie bovina, utilizan-do diferentes crioprotetores (EG, PROH, DMSO eglicerol) para a congelação lenta de tecido ovariano mos-trou que o EG nas concentrações de 1,5 e 3,0 M, reduziusignificativamente o percentual de folículos mor-fologicamente normais (52,5% e 32,8%, respectiva-mente). Segundo os autores [64], esse resultado foi pro-vavelmente devido à ação tóxica desse crioprotetor. Poroutro lado, Celestino et al. [18] obtiveram um altopercentual de folículos viáveis, semelhante ao controlefresco, tanto após a exposição quanto após a congela-ção-descongelação do tecido ovariano bovino, utilizando1,5 M de EG.
Em suínos, a utilização de 1,5 M EG mostrou sermais eficiente no que concerne à manutenção damorfologia e ultraestrutura de folículos pré-antrais inclu-sos em tecido ovariano, proporcionando taxas superioresao PROH e glicerol com duas horas de incubação apósa descongelação [9]. Amorim et al., [2] avaliaram dife-rentes concentrações de EG para a congelação defolículos pré-antrais ovinos isolados e observaram queas concentrações de 1,0; 1,5 e 2,0 M foram capazes demanter a viabilidade semelhante à verificada para folículosfrescos ou não congelados (controle). A eficiência dediferentes concentrações pode ser devido à diferençaespécie-específica e, principalmente, à forma de conge-lação, pois apesar do EG apresentar uma boapermeabilidade, por razões físico-químicas, a penetra-ção do ACP em um tecido é mais lenta quando compa-rada às estruturas ou células em suspensão.
A alta permeabilidade do EG tem justificado suagrande utilização na criopreservação de oócitos maturos(camundongo [22]; coelho [11]) e imaturos (ovino [7];bovino [19]). A exposição de oócitos humanos a 1,5 Mde EG por 10 min conservou a conformação da rede de
filamentos corticais de actina, após a congelação53,8% dos oócitos apresentavam fuso organizado ecom os cromossomos alinhados, 7,7% apresentaramdesorganização do fuso sem alterar o alinhamentodos cromossomos e 38,5 % possuíam fuso desorga-nizado ou ausente aliado à desorganização doscromossomos [28]. Porém, a exposição de oócitosde camundongas a 6,0 M de EG por mais de 10 minresultou em distúrbios na organização dos filamentosdo citoesqueleto, sendo possível observar irregulari-dades na distribuição cortical da actina e ausência darica rede de filamentos que circundam oscromossomos logo após a quebra da vesícula germinativa[34,49].
2. Dimetilsulfóxido2.a. Obtenção e aplicações
O dimetilsulfóxido (DMSO) é um composto po-lar, cuja fórmula química é C2H6SO [93]. É caracteriza-do por possuir peso molecular de 78 g/mol [16] e tempe-ratura de congelação de 18,5 °C [10]. O DMSO é am-plamente utilizado para solubilizar pequenas moléculasorgânicas [13] e foi sintetizado pela primeira vez peloquímico russo Alexander Saytzeff, sendo inicialmenteempregado apenas como solvente [76]. Por ser umsubproduto da indústria de extração de celulose e, por-tanto, facilmente disponível, o DMSO passou a ser utili-zado industrialmente a partir da década de quarenta doséculo XX [80].
A partir da década de sessenta, o DMSO foiintroduzido na medicina com fins farmacológicos eterapêuticos, sendo descritas mais de trinta proprieda-des, incluindo atuação intiinflamatória, imunomoduladora,antimicrobiana, vasodilatadora, antioxidante ecrioprotetora [10]. Como crioprotetor, o DMSO foi utili-zado pela primeira vez na criopreservação de sêmen detouro e hemácias humanas e bovinas, por Lovelock eBishop [63]. Desde então, a ação crioprotetora desseagente vem se destacando e tem sido largamente utiliza-do na criopreservação de folículos ovarianos [29,55],oócitos [65,107] e embriões [58].2.b. Metabolização e mecanismo tóxico
Por ser um álcool dipolar, o DMSO é capaz deinteragir ou combinar-se com ácidos nucléicos,carboidratos, lipídeos, proteínas e muitas drogas sem al-terar de forma irreversível a configuração das moléculas[105]. Essa substância é considerada relativamenteatóxica [112] e é encontrada em diversas espécies vege-tais e animais, incluindo o homem [59]. O DMSO interage
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com as membranas, atravessando-as rapidamente pormeio de difusão. Recentemente, estudos com injeçãointraoocitária de RNA através do canal protéicoaquaporina-3, em oócitos de rã (Xenopus sp.), foi de-monstrado pela primeira vez o transporte de DMSO poreste canal, mesmo em condições de baixo gradientede concentração [113].
As vias metabólicas seguidas pelo DMSO,bem como seu efeito sobre diversos sistemas bioló-gicos ainda não são completamente elucidados. Deum modo geral, o DMSO é oxidado emdimetilsulfona (DMSO2), também conhecida commetilsulfonilmetano (MSM), um importantemetabólito utilizado como fonte de enxofre na sínte-se de metionina [81]. O MSM é eliminado por viaurinária [50] ou pode ser reduzido pela DMSO-redutase em dimetilsulfuro (DMS), um produto vo-látil que é eliminado pelos pulmões [74]. Estudosrealizados em camundongos com a administração deaté 2 g/kg de MSM demonstraram tolerância a essecomposto, sem efeitos agudos ou crônicos, não cau-sando nenhuma lesão patológica ou alterações deórgãos [48].
Tanto o DMSO quanto seus metabólitos têmbaixo potencial tóxico [5,38]. Avaliando-se a geno-toxicidade dos agentes crioprotetores mais utilizadosna criopreservação, foi confirmado que, dentre osagentes estudados (DMSO, EG e propanodiol), o DMSOfoi o único que não induziu alterações cromossômicas,mesmo em concentrações elevadas de 150 a 200 mg/mL. Contraditoriamente, Zampolla et al. [116], traba-lhando com oócitos de Zebrafish, demonstraram que apósexposição a 2,0 M de DMSO por 30 min, ocorreu umaumento no DNA mitocondrial, na tentativa de corrigiras injúrias causadas pela adição deste agente. Porém,em concentrações superiores a 3,0 M, os oócitos foramincapazes de realizar a replicação do DNA mitocondrial,além de ocorrer uma queda imediata dos níveis celularesde ATP.2.c. Utilização do DMSO na criopreservação de te-cido ovariano e gametas femininos
O DMSO tem sido utilizado com sucesso paracriopreservação de gametas e embriões. Quando utiliza-do na concentração de 1,5 M para criopreservação defragmentos de tecido ovariano humano (25 mm3), segui-da por xenotransplante em camundongosimunodeficientes, foi observado uma baixa recuperaçãode oócitos e taxa de maturação oocitária, com oócitosapresentando grande desorganização da cromatina [56].
Em ovinos, a análise histológica revelou que acriopreservação de tecido ovariano com 1,5 M de DMSO,seguida por isolamento folicular e cultivo in vitro defolículos isolados, resultou em 50% de degeneraçãofolicular no primeiro dia de cultivo. Ao fim de 10 dias decultivo, uma análise da interação célula-célula revelouuma redução significativa neste parâmetro quando com-parado com tecido criopreservado com EG ou tecido nãocriopreservado [17]. Contudo nestes trabalhos os folículossofreram grande influência do tipo de cultivo e do orga-nismo para o qual foi xenotransplantado. Isto supõe queos resultados não podem ser atribuídos exclusivamente àcriopreservação ou ao agente crioprotetor empregado,haja vista, que utilizando a mesma concentração deDMSO, Demeestere et al. [29] obtiveram sucesso apóstranplantes ortotópico e heterotópico (subcutâneo) detecido ovariano criopreservado, constatando a retomadada ciclicidade hormonal e da fertilidade com obtenção degestação natural.
No que diz respeito à criopreservação de oócitos,muitos trabalhos associam o DMSO a outros agentesintracelulares, principalmente ao EG [23,107,109].Mahmoud et al. [65], comparando diferentes combina-ções de agentes crioprotetores na vitrificação de oócitosimaturos de búfalas, demonstraram que a combinaçãode EG e DMSO é mais efetiva, resultando em maiorestaxas de maturação pós vitrificação, quando comparadoa apenas ao EG ou às combinações EG ou DMSO comglicerol. No entanto, na espécie bovina, Campos-Chillònet al. [14] encontraram um percentual de clivagem(87,5%) e formação de blastocisto (23,6%) significativa-mente superior em zigotos criopreservados com 7,0 Mde EG quando comparado aqueles criopreservados com2,5 M de DMSO (79,4%).
3. Propanodiol3.a. Obtenção e aplicações
O 1,2-propanodiol (PROH) foi inicialmente des-crito por Wurtz em 1859, mas sua produção em escalaindustrial iniciou-se em 1930. Este composto é produzidopela hidrólise direta do óxido de propileno, sendo forma-do o 1,2- propilenoglicol e o 1,3-propilenoglicol simulta-neamente, pela adição sequencial do óxido de propilenoao propilenoglicol [75]. O PROH (C3H8O2) também podeser obtido a partir do glicerol (1,2,3,-propanotriol) atravésde uma reação de hidrogenólise, conduzida em tempera-turas que variam de 150 a 200 °C, na presença decatalisadores ácidos [75]. Outra forma de obtenção des-te composto é através da glicerina, que é constituída por
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95% de glicerol. A glicerina pode, inclusive, ser obti-da como um co-produto do biodiesel, apresentando-se como uma alternativa viável e sustentável para aprodução de PROH [100].
A maior aplicação do PROH é na manufaturade resinas de poliéster insaturadas sendo também apli-cado na indústria farmacêutica e de alimentos [39]. Con-tudo, por possuir características como baixo pesomolecular, alta permeabilidade à membrana celular[36] e biodegradabilidade, o PROH tem sido utiliza-do como agente descongelante e anti-congelante emnaves espaciais, automóveis e máquinas refrigera-das [75], além de mostrar-se como um eficientecrioprotetor na preservação de diversos tipos celula-res e tecidos (Tecido ovariano:[92]; folículos: [4];oócitos: [53]; sêmen: [41];embriões: [24]).3.b. Metabolização e mecanismo tóxico
O efeito tóxico do PROH na criopreservaçãoainda é pouco explorado, contudo, por sua utilização emoutras áreas, como na indústria alimentícia e cosmética,existem trabalhos que relatam seus efeitos tóxicos emensaios experimentais, quando administrado em altasdoses em casos acidentais [6,82], havendo relato de ca-sos de sinais de intoxicação pelo PROH utilizado comoveículo de medicamentos [111]. De toda forma, os efei-tos observados incluem a produção de lactato intracelularcom consequente acidificação e alterações hematológicas,podendo ocasionar desequilíbrio ácido-básico e mortecelular [111].
No organismo, o PROH é oxidado a mono-hidroxiacetona e convertido a ácido pirúvico(piruvato), que é destinado ao ciclo do ácido cítrico paraprodução energética através da gliconeogênese. Essecomposto também pode sofrer oxidação resultando emprodução de lactoaldeído, posteriormente convertido emácido láctico (lactato). Os produtos formados, lactoaldeídoe monohidroxiacetona, são interconversíveis, ou seja, umproduto pode ser convertido no outro [95], assim como olactato e o piruvato (Figura 2).
Estudos conduzidos em células de tecido vascularsuíno, indicaram que a alteração do pH ou o do estresseoxidativo não possuem papel decisivo nas lesões tóxicasprovocadas pela exposição ao PROH. O efeito tóxicodeste composto parece ser exercido através de um influ-xo de sódio para o meio intracelular. Este mecanismoainda é incerto, contudo acredita-se que ocorram lesõespor alterações secundárias como alteração da homeostasedo cálcio intracelular, via disfunção da bomba Na+/Ca2+
e distúrbios na permeabilidade das mitocôndrias com o
decréscimo de função da Na+/K+-ATPase [112].3.c. Utilização do PROH na criopreservação de te-cido ovariano e gametas femininos e embriões
Devido às suas características estruturais, oPROH despertou grande interesse de pesquisadores quepassaram a investigar a aplicabilidade desta substânciapara a preservação de gametas femininos [20,24,53].
Na criopreservação de tecido ovariano suíno, oPROH mostrou-se menos eficiente quando comparadoao EG e DMSO, proporcionando uma menor taxa defolículos morfologicamente normais, tanto imediatamen-te quanto após curto período (2 h) de incubação [9].Quando utilizado na concentração de 1,5 M com 10 minde exposição, o PROH proporcionou taxas aceitáveis demanutenção da morfologia e ultraestrutura de folículospré-antrais inclusos em tecido ovariano de cutia,
Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcooldesidrogenase; ALDH: aldeído desidrogenase; GLUr:glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase).
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Dasyprocta aguti (dados não publicados). Amorim etal. [4] avaliando diferentes concentrações de PROH (0,5;1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 M) na criopreservação de folículosprimordiais isolados ovinos, obtiveram melhores resulta-dos com 1,5 M, encontrando 10,6% de folículos viáveiscomparado com o controle. Já para tecido ovarianocaprino o PROH nas concentrações de 1,5 ou 3 M re-sultaram em taxas de folículos morfologicamente nor-mais significativamente inferiores a criopreservação com1,5 M de DMSO [92].
Em oócitos de macacas rhesus (Macaca mu-latta), o PROH mostrou-se mais permeável que oDMSO e o EG [53]. Além disso, o PROH (1,5 M) foicapaz de manter a organização do fuso meiótico deoócitos de camundongos em temperaturas subfisiológicas,no entanto, essa organização foi perdida após o aqueci-mento dos mesmos [20]. Em felinos, a mesma concen-tração de PROH foi eficiente na preservação de oócitosimaturos, proporcionando taxas de maturação e desen-volvimento embrionário (clivagem e formação deblastocisto) semelhantes às observadas para oócitos fres-cos ou não congelados (controle). Porém, nas concen-trações de 0,75 e 3,0 M foi observado um grandepercentual de anormalidade do fuso meiótico, 62% e42,7%, respectivamente [24]. Em oócitos humanosmaturos e imaturos, o PROH na concentração de 1,5 Minduziu a liberação de cerca de 70% dos grânulos corticais[40], evidenciando que seu uso pode acarretar em difi-culdades para a fertilização devido ao enrijecimento pre-coce da zona pelúcida. Parmegiani et al. [83] relataramo nascimento de uma criança saudável após a fertiliza-ção in vitro de oócitos humanos maturos que permane-ceram criopreservados com 1,5M de PROH por cincoanos. Utilizando a mesma concentração (1,5 M) associ-ada a 0,3 M de sacarose, Konc et al. [57] relataram onascimento dos primeiros bebês húngaros oriundo deoócitos congelados, que resultaram em 127 embriõestransferidos com taxa de gestação de 20%.
4. Glicerol4.a. Obtenção e aplicações
O glicerol, ou 1,2,3-propanotriol (C3H8O3) ocor-re naturalmente em formas combinadas, como com áci-dos graxos nos triglicerídeos, em todos os óleos graxosanimais e vegetais, sendo isolado quando estes óleos sãosaponificados com hidróxido de sódio ou potássio no pro-cesso de manufatura de sabões [75]. O primeiro relatode isolamento do glicerol foi descrito por Scheele em1779, pelo aquecimento de uma mistura de óxido de
chumbo com azeite de oliva, na época, chamado de“o doce princípio das gorduras”. Apesar disso as pri-meiras evidências de um material parecido com sa-bão é datado de 2800 a.C. encontradas em escava-ções na antiga Babilônia. A denominação de “sabão”foi dada pelos romanos, tendo origem no Monte Sapo,onde eram realizados sacrifícios de animais, cujagordura derretida era levada pelas águas da chuva e,misturado com cinzas e barro, acumulava ao longodas margens do rio Tibre e era utilizado pelas mulhe-res romanas para limpar suas vestes [1].
Desde 1949, o glicerol também tem sido pro-duzido comercialmente pela síntese do propeno. Aetapa inicial é a cloração a alta temperatura, envol-vendo radicais livres como intermediários, para for-mar o cloreto de alila. Este é então reagido com áci-do hipocloroso dando um produto de adição à dupla(haloidrina). Por fim, o tratamento da haloidrina comexcesso de base leva ao glicerol [75]. Atualmente, aprodução de biodiesel [42] tem se tornado uma for-ma alternativa para a obtenção de glicerol. O óleoutilizado no processamento do biodiesel, ou seja, ossão triglicerídeos, sob a ação de um catalisador bási-co e na presença de metanol ou etanol sofre umatransesterificação originando três moléculas de ésteresmetílicos ou etílicos (que constituem o biodiesel emsua essência) e liberando uma molécula de glicerol[69].
Figura 3. Principais setores industriais de utilização da glicerina.Fonte: Mota et al. [75].
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O termo glicerol é utilizado apenas para o pro-duto químico puro, comercialmente é encontradocomo glicerina, um produto purificado com pelomenos 95% de glicerol. A glicerina tem aplicaçãoem diferentes setores de cosmético, higiene pessoal,alimentos e medicamentos dentre outros [75]. A Fi-gura 3 mostra uma distribuição percentual de aplica-ções usuais da glicerina.4.b. Metabolização e mecanismo tóxico
O glicerol é encontrado normalmente em to-dos os tecidos animais, sendo o nível plasmático nor-mal de 0,1 mM em ratos, 0,05-0,1 mM em humanos[61] e 0,65 mM em frangos [104], porém estes ní-veis variam em função da atividade do indivíduopodendo elevar de 65 mol l-1 para 150 mol l-1 emapenas duas horas de exercícios [44]. No organismoanimal, o glicerol é metabolizado em glicerol 3-fosfatopela enzima glicerol quinase e transformado emdiidroxiacetona fosfato e gliceraldeído-3-fosfato queé intermediário do metabolismo dos carboidratos [84].O destino metabólico do glicerol pode ser dirigido,dependendo do tecido e do estado nutricional doanimal, para o fornecimento de esqueleto carbônicopara a gliconeogênese, entrar na via glicolítica para ageração de energia ou ser utilizado como precursorna síntese de novos triglicerídeos (Figura 4).
Por ser um constituinte normal presente nasmembranas celulares e em todos os óleos e gordurasanimal e vegetal, todas as células são capazes demetabolizar o glicerol, não havendo informaçõestoxicológicas referentes ao mesmo, ou sua forma co-mercial, glicerina, em bancos de dados reconhecidos in-ternacionalmente. Contudo, já foi relatado que o glicerolpode afetar eventos físicos no citoplasma, como a orga-nização citoplasmática através da alteração napolimerização da tubulina e aumento da viscosidade; al-tera a permeabilidade e estabilidade da bicamada lipídicae atua diretamente de modo prejudicial no glicocálix enas proteínas de membrana, formando ligações nãocovalentes com as mesmas [45]. Apesar de ser utilizadona dosagem de 6 mL/kg para induzir modelos de lesãorenal aguda em camundongos, semelhante a ocorrida narabdomiólise [67], é uma excelente fonte de carbono efavorece o metabolismo secundário, como demonstradopor Oliveira [79] que obteve uma maior produção deviolaceína (pigmento com atividade antibiótica, antiviróticae anti Trypanossoma cruzi) pela bactéria Chro-mobacterium violaceum substituindo a glicose peloglicerol.
4.c. Utilização do GLI na criopreservação de tecidoovariano e gametas femininos
Apesar de considerado o crioprotetor padrão nacriopreservação de gametas masculinos, o glicerol nãoapresenta uma alternativa eficiente para preservação degametas femininos. Amorim et al. [4] avaliando a efici-ência do glicerol na preservação de folículos primordiaisisolados ovinos, obtiveram taxas de sobrevivência de 0,44;1,33; 3,72. 3,12 e 2,52% utilizando 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; e 2,5M, respectivamente. Além disso, um estudo realizado paraavaliar a eficácia do glicerol, EG, PROH e DMSO, nasconcentrações de 1,5 e 3 M, na a criopreservação defolículos pré-antrais ovinos isolados demonstraram que oglicerol é o agente menos efetivo na preservação dessasestruturas [98].
Figura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabóli-cos.
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Utilizando as mesmas concentrações (1,5 e3M) de glicerol acima mencionadas para a espécieovina, na congelação de tecido ovariano caprino,Rodrigues et al. [91] demonstraram que é possívelpreservar folículos pré-antrais inclusos no tecido,obtendo 41% (1,5 M) e 36% (3 M) de folículosmorfologicamente normais, mantendo também anormalidade das características ultraestruturais (Fi-gura 5). Apesar disso já foi demonstrado com acriopreservação de tecido ovariano felino, que a uti-lização de glicerol não é eficiente na preservação dosfolículos pré-antrais, proporcionando um percentualde folículos morfologicamente normais semelhanteao observado no tecido congelado sem a adição deagentes crioprotetores, sendo 39,3% e 26%, respec-tivamente [60]. O mesmo foi constatado por Borgeset al. [9], que avaliando os quatro agentescrioprotetores na preservação de tecido ovariano su-íno, não obtiveram nenhum folículomorfologicamente normal com a utilização doglicerol.
Em oócitos, a presença da zona pelúcida dificul-ta ainda mais a penetração do glicerol quando compara-do a outros tipos celulares. A criopreservação de oócitosbovinos maturados in vitro utilizando 10% de glicerol,resultou em apenas 3% de clivagem após fertilização e
cultivo in vitro, porém nenhuma estrutura desenvolveu-se ao estádio de blastocisto [99]. Hunter et al. [51] ava-liando a empregabilidade do glicerol e DMSO nacriopreservação de oócitos humanos, verificaram queapesar de serem fertilizados, as estruturas não foramcapazes de continuar seu desenvolvimento normal após48 h de cultivo. Um estudo conduzido para avaliar o co-eficiente de permeabilidade da membrana do oócito adiferentes crioprotetores, utilizando o coelho como mo-delo, demonstrou que o glicerol não alterou significativa-mente a condutividade hidráulica quando comparado como EG e o DMSO, porém a permeabilidade a solutos (ex-presso em cm mim-1) foi inferior (DMSO: 2,9 x 10-3; EG:2,7 x 10-3; GLI: 0,27 x 10-3). Nesse mesmo estudo, ava-liando a capacidade de desenvolvimento de oócitos apósativação partenogenética, apenas 19% dos oócitos ex-postos ao glicerol chegaram ao estádio de 2-8 células,não sendo obtida nenhuma mórula ou blastocisto [62].
V. CONCLUSÃO
A criopreservação representa uma valiosa fer-ramenta para a preservação de gametas femininos tantode animais quanto de humanos, oferecendo suporte paradiversas biotecnias reprodutivas permitindo salvaguar-dar o material genético e, facilitando a sua difusão. Noentanto o sucesso do procedimento depende da utiliza-
Figura 5. Análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão de folículo criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol(Imagem cedida por Rodrigues et al. [91]).
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celular ou tecido. A relevância da criopreservação paraa reprodução assistida estimula novos estudos a fim decompreender, determinar e otimizar os protocolos paracada espécie e estrutura, incluindo também a busca pornovos agentes crioprotetores, que sejam eficientes e nãoprejudiciais às estruturas a serem criopreservadas.
Declaration of interest. The authors report no conflicts ofinterest. The authors alone are responsible for the contentand writing of the paper.
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