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HISTOOUIMICA DE PROTEINAS, AMINAS BIOGENAS Y ACIDOS NUCLEICOS 2633.2. Reacciones especificas para aminocidos particularesEstos mtodos, muy numerosos, han perdido utilidad en anatoma patolgica, sobre todo desde que, a

partir de 1968, empezaron a aplicarse las tcnicas inmunohistoqumicas, que no slo permiten la

caracterizacin de protenas especficas. sino que diferencian sus diversos componentes antigncos. Por

este motivo no se realiza una exposicin detallada de los mismos.4. METODOS PARA LA DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOSLos cidos nucleicos estn compuestos por largas cadenas de unidadesllamadas nucletidos, enlazadas por uniones covalentes. En general, los nucletidos estn formados por:-Acido fosfrico, implicado en el mecanismo de coloracin fisicoquimico por el cual los ncleos se tien

intensamente con colorantes bsicos como la hematoxilina.-Una pentosa, la ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN).- Bases ntrogenadas, dos pricas -adenina y guanina- y dos pirimidnicas -citosina, timina y uracilo (ste ltimo para el ARN).

En las figuras 14.4 a y b se reflejan la composicin qumica de los tipos de unin que conforman las

molculas de ADN y ARN.En el cido desoxirribonucleico (ADN), las molculas de polinucletldos son dos, en lugar de una nica

como en el caso del cido rbonucleco (ARN). Las dos cadenas del ADN son paralelas entre si, trazan un

recorrido espacial helicoidal y estn enlazadas peridicamente por uniones de hidrgeno.La molcula de ADN es capaz de autorreplicarse y contiene almacenada la carga hereditaria del

individuo, en tanto que la de ARN es la responsable de la transmisin de la informacin nuclear al

citoplasma.En condiciones normales, los cidos nucleicos se conjugan con protenas bsicas para formar

nucleoprotenas. Por ello la realizacin de una hidrlisis cida que los separe del componente proteico

puede ser til para demostrarlos.A fin de conseguir una interpretacin correcta de los resultados, deben realizarse siempre preparaciones

testigo, por lo general a travs de la extraccin previa del cido nucleico que se desea demostrar.4.1. Procedimientos para extraccin de cidos nucleicosEXTRACCION DEL ADN

Suelen utilizarse la hidrlisis cida con cido perclrico o tricloroactico. En el primer caso se emplea

en concentracin del 5 por 100 y a 70C durante 20 minutos, seguido de neutralizacin en carbonato

sdico al 1 por 100 durante 5 minutos y lavado en agua corriente tambin durante 5 minutos. El cidotricloroactico se emplea al 5 por 100, a 90 C, durante 15 minutos; a continuacin se lava en agua

corriente otros 5 minutos.


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LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICAFigura 14.48. Frmulas de los componentes de un nucletido. (Acido fosfrico, pentosas y bases nitrogenadas.)


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Figura 14.4b. Formacin de un nucletido.EXTRACCION DEL ARN

Puede aplicarse la hidrlisis en cido perclrico aI 5 por 100 y a 4 C durante 4-18 horas, la cualextrae selectivamente el ARN preservando al ADN, o bien la extraccin mediante ribonucleasa al 0.01

por 100 a 37 C durante 1 hora.4.2. Tcnicas histoqumicas que permiten separarel ADN de otras estructuras

Estas tcnicas se aplican para visualizar el ncleo. El mtodo ms utilizado es Ia reaccin de Feulgen.REACCION DE FEULGENEste procedimiento de coloracin se realiza en dos fases consecutivas:1. Hdrlisis cida del ADN:con ella se pretende, mediante la actuacin del cido clorhdrico, romper laestructura del ADN por el lugar en que la


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256LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICApentosa se une a la base nitrogenada, de forma que sobre cada molcula de azcar aparezca un grupo

carbonilo. Estos grupos se encuentran situados precisamente a una distancia de entre 1 y 1.1 nm.Demostracin de los grupos carbonilos formados mediante el reactivo de Schiff, de forma anloga a ladescrita para la reaccin del PAS.El ARN no puede ser detectado por el reactivo de Schiff tras Ia realizacin de una hidrlisis cida, puesto

que los grupos carbonilos no estn situados a una distancia de entre 1 y.1.1 nm (fig. 14.5) y, por tanto, no

se produce la reaccin con elFigura 14.5. Fragmento de polinucletido (ADN y ARN).


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HISTOQUIMICA DE PROTEINAS, AMINAS BIOGENAS Y ACIDOS NUCLEICOS257PROCEDIMIENTO TECNICOFijacin:cualquiera. excepto el de Bouin; preferentemente, una parte de formalna neutra o tamponada ydiez partes de alcohol o fijadores que contengan cido actico.Soluciones:a) Solucin de almacenamientode verde claro:

-verde claro(c.1.42095)........................ 2.09 g

-Aguadestilada.............................1000.0mL

-Acidoacu'coglacial..............................0.2mL

b) Solucin de trabajo de verde claro:Solucin de almacenamiento de verde claro . . . .. 50.0 mL

-Aguadestilada................................... 50.0mLc) Solucin de cido clorhdrlcoN (N-HCI)-Acido clorhfdrco concemrado .. .. ... .. . .. .. 93.5 mL

-Aguadestilada.............................. 916.5mLd) Reactivo de Schiff (vase tcnica del PAS). l...e) Solucin de metabisulfito:

-Metabisulfito porasacg al 10 por 100 . . . . . . . . . sla mL

-SolucindecdocorhldricoN 5.0mL-Aguadeslilada...._............................90 mlModo de operar1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.2. Lavar en la solucin normal de cido3. Hidrolizar en la solucin N de cido clorhidrico precalentada a 60C durante el tiempo ptimo segn el

fliadof utilizado.Lqudo de Carnoy l minutos

-Formalina 8 minutos

-Llqudo de Zenker...........,.................8 minutos

-Sublimado-formolo-S........................ 8 minutos

-Fjador de regaud.............................14 minutos

-Liquido de FIemming .........,................i minutos4. Lavar en solucin normal de cido clorhidrico a temperatura ambiente durate 1 minuto. .Teir con el reactivo de Schiff entre 30 y 90 minutos.Lavar en tres cambios de solucin de metabisulfito de 2 minutos de duracin cada uno.


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Aclarar bien en agua destiladacontrastar en la solucln de trabajo de verde claro.Lavar en agua destilada.Deshidratar. aclarar y montar.


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258 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICAResultados (fig. 14.6. vase pginas en color):ADN Rojo-prpura _Gimplasma........................... VerdeProblemas generales de la reaccin de Feulgen1. Hidrolisis excesiva

Ei cido clorhdrico es un cido fuerte y, si se prolonga excesivamente el tiempo de hidrlisis disgrega

la molcula de ADN en su totalidad impidiendo su ulterior deteccin, adems de romper los enlaces que

unen las bases nitrogenadas a la pentosa. Por ello el aspecto ms importante de la tcnica es el tiempo de

hidrlisis, que vara mucho segn el fijador utilizado (vase procedimiento tcnico).2. Envejecimiento del reactivo de Schiff

En condiciones normales, el reactivo de Schiff es incoloro; la aparicin de una tonalidad rosada por

liberacin de fucsina indica envejecimiento y, por tanto, que debe desecharse, puesto que el

envejecimiento lo hace inservible para detectar grupos carbonilos.Controles de la tcnica de Feulgen

Por lo general se trata de una tcnica muy segura, pero presenta el inconveniente de que una hidrlisis

prolongada puede producir falso-negativos que no es posible detectar.Para eliminar los falso-positivos (grupos aldehdos preexistentes no contenidos en eI ADN), las

preparaciones control no son sometidas al proceso de hidrlsis.Importancia de la tcnica de Feulgen

Este procedimiento de tincin, que en sentido amplio puede ser considerado de carcter

estequomtrico (es decir, cada molcula fijada de reactivo de Schiff se corresponde con una porcin

constante y equivalente de molcula de ADN). permite conocer la cantidad de ADN que contienen las

diferentes clulas que componen una muestra. Si una clula est en reposo (fase GO), poseer unacantidad simple de ADN, tindose de color rosado o rojo dbil; si por el contrario la clula se encuentra

en proceso de duplicacin del ADN o en divisin activa, contendr el doble de ADN y se coloreara de

rojo intenso.La gran ventaja del procedimiento es que sobre l puede realizarse la objetivacin de esta informacin

mediante espectrofotometra o tcnicas de anlisis digital de imgenes por densitometra de ADN (vase

el captulo sobre anlisis digital de imgenes). En este ltimo supuesto, no deben realizarse coloraciones

de contraste: para evitar errores y favorecer el resalte de la tincin slo deben impregnar los ncleos.


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H\STOOUIMiCA DE PROTEINAS, AMINAS BIOGENAS Y ACIDOS NUCLEICOS 2594.3. Tcnicas para la distincin entre ARN y ADN:mtodo del verde metilo-pironinaEste procedimiento tcnico se utiliza fundamentalmente para distinguir las clulas dotadas de una gran

capacidad secretora de protenas y, por tanto. ricas en ARN ribosmico, como, por ejemplo, las clulasplasmticas productoras de nmunoglobulinas y sus precursores inmediatos. Desde que fuera introducido

por Una en 1910, el mtodo del verde de metilo-pironina ha experimentado numerosas modificaciones,

principalmente a causa de la gran irregularidad de Ia coloracin que produce.Fundamento del mtodo: la basofilia de los cidos nucleicos est ligada a la presencia de grupos cidos

ionizables pertenecientes al cido fosfrco. Con pH adecuado, dichos grupos tienen Ia propiedad de fijar

los grupos electropositivos de ciertos colorantes bsicos, entre los cuales destacan el verde de metilo y la

pironina.Por este motivo, la tcnica del verde de metilo pironina no es una coloracin histoqumica en sentido

estricto, aunque la utilizacin de controles adecuados puede hacerla muy especfica para la coloracin

discrimnatva de cidos nucleicosEl verde de metiloes un colorante derivado del trifenlmetano (fig. 14.7) y se prepara a partir del violetacristal, que debido a ello aparece siempre como contaminante. Se fija selectivamente sobre el ADN; no

obstante, la especificidad de tal unin es variable.Figura 14.7. Frmula del verde de metilo.La pironina Y o G es un colorante rojo derivado del xanteno (fig. 14.8) que tiene apetencia por el ARN,aunque su especificidad no es absoluta.El mecanismo de tincin radica .en la atraccin electrosttica que se produce entre los colorantes bsicos

verde de metilo y pironina y los cidos nucleicos, en unas condiciones adecuadas de pH.Figura 14.8. Frmula de la pronina Y.260LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA

Esta tcnica tiene un fundamento sencillo, pero es de realizacin muy dificultosa por la complejidad

de la preparacin de los reactivos y el engorroso modo de operar. Otro de sus inconvenientes es la

inconstancia de los resultados. Por todo ello se han introducido multitud de variantes; Papenhe/'n-Unna,

Brachet. Lison, Jordan-Baker y otras.Problemas de la preparacin y manejo de los reactivosPara que ocurra una coloracin diferencial (es decir, para que cada colorante tia el cido nucleico

correspondiente) es fundamental que la tcnica se realice con un pH constante en torno a 5 (de 4.8 a 5.2.

segn la variante).Como el verde de metilo es un colorante no puro, pues est contaminado en mayor o menor grado por el

violeta cristal, hay que eliminar este ltimo de la solucin. La separacin se produce decantando el verde

de metilo en solucin acuosa mediante cloroformo, ya que el violeta de cristal es soluble en ste y el

verde de metilo, no.El alcohol etlico tiene la propiedad de disolver la pironina. por lo que pueden surgir problemas de


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amortiguacin del color rojo de la pironina en el momento de deshidratar los cortes.Modificacin personal de la variante de Brachet del mtodo del verde de metiIo-pironinaPROCEDIMIENTO TECNICOFijacin: cualquiera.Soluciones:a) Solucin de tampn acetato do sodio 0.2 M:-Acetatodesodio 16.49-Aguadestilada..................,................1000.0mLb) Solucin de cido lctico 0.2 M:-Acidoacticpuro 12.0mL -Aguadesiiladahasta._............................1000.0mLc) Solucin de trabajo:Mezclar:So|uci6nA 13.2ml. $olucin 36.8mL Aguadestilada......................,........ 50.0mLEl pH de la disolucin Ser 4.2; ajustar con hidrxido sdico o cido actico sies necesario.d) Solucin de verde de metilo:-Dsolver 0.5 g de verde de metilo en 100 mL de tampn.Lavar con cloroformo (se necesita un minimo de 4 a 6 decamaciones). Dejar la solucin asi puriceda en

un recipiente abierto y en frigorfico hasta la eliminacin de los vapores de cloroformo.


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-HISTOOUIMICA DE PROTEINAS, AMINAS BIOGENAS Y ACIDOS NUCLEICOS 261e) Solucin de verde d0 metilo-pironlna:-Solucin de verde de metilo en tampn 100.0 mL -Pironinagammalowr 0.29Esta solucin conservada en frasco opaco bien cerrado y en nevera. puede durar mesesAntes de usar debe llevarse a temperatura ambiente.Modo de operar:1. Desparafinar e hidratar. ' 2. Solucin de verde de metilo-pronina. durante 10 minutos a temperatura

ambiente. , Lavar muy rpidamente en agua destilada.Diferencar y deshidratar en 2 baos breves con alcohol absoluto.

Sumergr brevemente en xileno agitando.Dos baos de xileno de 5 minutos cada uno.Montar.

Resultados:nucleos: (Verdes ADN)

Citoplasmas: (RojoARN)1. No se seca con papel de Filtro.

2. Pese a sus inconvenientes. se emplea el alcohol etlico como deshidratante.

3. Se duplica la cantidad de pironina para compensar la prdida de color.Controles en las tcnicas de verde de metiIo-pironina1. Hidrlisis clorhidrica: pretende destruir los cidos nucleicos mediante el cido clorhdrico, con lo que

se descartan los falso-positivos (sustancias que se colorean sin corresponder a cidos nucleicos).

2. Test de Brachet: digestin de ARN con ribonucleasa, segn tcnica expuesta con anterioridad (vanse

procedimientos para Ia extraccin de cidos nucleicos).5. METODOS PARA LA DETECCION DE AMINS BIOGENASLa adrenalina, la noradrenalina y la serotonina son hormonas que se caracterizan por tener ciertos

radicales quimicos similares, siendo Ia estructura bsica de las dos primeras un difenol que recibe la

denominacin de pirocatequina y la de la tercera un indol oxidado en posicin 5 (-OH) (fig. 14.9). Las

tres hormonas actan regulando los mecanismos de reaccin inmediata ante eI estrs y ante ciertas

agresiones del medio, pero sus funciones no slo no son idnticas, sino que pueden llegar a ser

contrapuestas. La adrenalina y la noradrenalina se producen en la mdula suprarrenal e intervienen en laregulacin de la circulacin sangunea y en los mecanismos de reaccin ante las agresiones del medio.


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262 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICAFigura 14.9. Frmula de adrenalina, noradrenalina y serotonina.Su actuacin se pone de manifiesto cuando se pasa rpidamente de la situacin de reposo a la de alerta,

con aparicin de broncodilatacin, sudoracin, taquicardia, palidez por vasoconstriccin, etc.La serotonina o 5-hidroxitriptamina es un mediador fundamental en los mecanismos airgicos y producevasodilatacin, exudacin y activacin de la reaccin inflamatoria. yEstas tres hormonas pueden detectarse hstoqumicamente a travs de una reaccin, como es la reaccin

cromafn.5.1. Reaccin cromafnLa adrenalina y la noradrenalina son sustancias reductoras que en contacto con un agente oxidante como

el dicromato potsico se oxidan, originando como productos de reaccin xido de cromo e hidrxido

potsico. El xido de cromo es un pigmento pardo, insoluble en agua y que, por tanto, precipita sobre el

tejido.Por ello, los tejidos que contienen estas hormonas intervienen directamente en la reaccin reduciendo eldicromato potsico. La coloracin de contraste Se realiza undamentalmente con hematoxilina, aunque se

puede hacer con verde de metilo.Si se quiere intensificar Ia reaccin, puede aplicarse un PAS sin oxidacin previa, con Ia cual se tien los

grupos carbonilo formados con el reactivo de Schiff. El hecho de que numerosos fijadores (Zenker, Helly,

etc.) contengan dicromato potsico explica que la reaccin cromafin sea una tcnica histoqumica sencilla

en la que la fijacin y la coloracin son simultneas.Si el tejido est fijado en formol, se trata con dicromato potsico y el efecto de tincin ocurre de la misma

forma.PROCEDIMIENTO TECNICOFijacin y soluciones: la fijacin coincide habitualmente con el procedimiento de coloracin. Enocasiones el tejido puede ser fijado previamente en formalina.

El reactivo para la reaccin cromafin se compone de:Solucin acuosa de dicromato de potasio al 5 por 100 . . . 60 mL

-Formaldehido a l40 por 100... 12mL

-Acetato de sodio 1M.. 10mL-Agua destilada.........18ml

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