NU Science Journal 2011; 7(2): 30 - 44

การพฒนาวธการหาปรมาณโปรตนในน ายางพาราโดยใช เครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทไดออกแบบขน

ปรญญา มาสวสด* และ ยทธพงษ อดแนน

Development of Protein Assay in Natural Rubber Latex by the Designed Spectropantonometer

Prinya Masawat* and Yuthpong Udnan

ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร จงหวดพษณโลก 65000 ภาควชาเคม และศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล

*Corresponding author. E-mail: prinyam@nu.ac.th

บทคดยอ

ในงานวจยนไดพฒนาวธการวเคราะหโปรตนในน ายางพารา โดยใชวธการทาใหเกดสดวย

วธเลาร เปรยบเทยบกบวธไบยเรต กอนนาไปตรวจวดดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทไดออกแบบและสรางขน ซงสารสทเกดขนจะมความเขมทแปรผกผนกบความเขมขนของปรมาณโปรตนทมในน ายาง โดยพบวาการวเคราะหโปรตนในน ายางพาราซงมลกษณะเปนคอลลอยดสามารถวเคราะหไดโดยตรง โดยไมตองตกตะกอนกอน ดงนนการวเคราะหโปรตนในน ายางพาราดวยวธน จงสามารถวเคราะหสแลวเทยบกลบไปเปนความเขมขนของโปรตนไดโดยตรง จากการทดลองพบวา ปรมาณของโปรตนในน ายางพารามคาเทากบ 0.037 และ 0.044 % โดยน าหนกตอปรมาตรดวยวธการทาใหเกดสแบบเลารและไบยเรตตามลาดบ ซงวธการทาใหเกดสทงสองวธใหผลไมแตกตางกนอยางมนยสาคญทระดบความเชอมน 95% ค ำส ำคญ : นายางพารา โปรตน วธเลาร วธไบยเรต

NU Science Journal 2011; 7(2) 31

Abstract

In this research, protein assay in natural rubber latex (NRL) was developed by using Lowry and Biuret methods for color developing followed by analysis with a laboratory designed and fabricated spectropantonometer. It was found that the developed method could directly be used to quantify colloidal protein in latex without precipitation and preconcentration. Therefore, this protein assay could directly be used to detect the intensity of the color developed proportional to the concentrations of protein in natural rubber latex. From the experiment, the proteins found in natural rubber are 0.037 and 0.044 %w/v by Lowry and Biuret methods, respectively. The results obtained from both color developing methods are not significantly different at 95 % confidence limit.

Keywords: natural rubber latex, protein, Lowry method, Biuret method

บทน า

ในปจจบนประเทศไทยเปนประเทศทผลตยางพาราเปนอนดบหนงของโลก จากรายงาน การประเมนของสานกงานเศรษฐกจการเกษตรพบวา มผลผลต 32% ของโลกในป 2552 ซงหนวยงาน IRSG (International Rubber Study Group) รายงานวา ความตองการใชผลผลตยางมเพมขน 11.8% ในป 2553 (สกว., 2553) ดงนน ยางพาราจงเปนพชทมความสาคญทางเศรษฐกจ สามารถนารายไดเขาสประเทศไดมากอกชนดหนง ซงในน ายางพาราน น ประกอบดวยอนภาคทเปนไฮโดรคารบอน 30-40 % แขวนลอยอยในเซรม และยงมสวนทไมใชยางอก 2-3 % เชน โปรตน ไขมน คารโบไฮเดรต น าตาล โลหะ และน า ซงในงานวจยนจะเนนถงความสาคญของโปรตนทมอยในน ายางพารา เพราะน ายางพาราซงมโปรตนเปนองคประกอบ กอใหเกดการตกคางของโปรตนในผลตภณฑบางชนด ทาใหเกดอาการแพตามผวหนงสาหรบผทแพโปรตน พบวาโปรตนททาใหเกดอาการแพกบผทสมผสยาง จะมน าหนกโมเลกลอยในชวง 14-30 kD (วราภรณ ขจรไชยกล, 2549) จากการคนควางานวจย ทเกยวกบการหาปรมาณโปรตนในน ายางพารา (NRL proteins) โปรตนแอนตเจน (antigenic proteins) และ โปรตนทกอใหเกดอาการแพ (allergenic proteins) พบวา วธวเคราะหทางภมค มกนวทยา (immunologic method) จะใชเทคนค ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)เปนวธมาตรฐาน สาหรบวเคราะหโปรตนแอนตเจน ซงจะใชแทนปรมาณโปรตนรวมทอาจจะกอใหเกดอาการแพได โดยเปนเทคนคทใหความไวในการวเคราะหสง แตมขอเสยคอ ตองใชตวอยางเปนเซรมของมนษย (human serum) ซงไมสามารถ standardized ได (Tomazic-Jezic et al., 2002; Beezhold, et al., 2002)

NU Science Journal 2011; 7(2) 32

สาหรบการวเคราะหทางเคมเพอหาปรมาณโปรตนในน ายางพารา มวธมาตรฐาน คอวธ เลารดดแปร (Modified Lowry method) ซงเปนวธมาตรฐานสาหรบใชในการหาปรมาณโปรตนทสามารถสกด และละลายน าไดในน ายางและผลตภณฑทไดจากน ายาง (ASTM D5712-05, 2005) โดยโปรตนทละลายน าจะถกสกดในสารละลายบฟเฟอร จากนนทาการตกตะกอนเพอเพมความเขมขน และเพอทาการแยกโปรตนออกจากสารอนๆ ทละลายน าไดซงอาจจะรบกวนการวเคราะห แลวจงนาโปรตนทตกตะกอนไดมาละลายอกครง กอนทาการวเคราะหสดวยวธเลารดดแปรซงเทยบกบสารมาตรฐานโปรตน พบวา วธมาตรฐานนมขนตอนยงยาก เสยเวลาและคาใชจายมาก (Yeang et al., 1995; Siler and Cornish, 1995) ดงนนคณะผวจยจงไดทาการพฒนาวธการวเคราะหปรมาณโปรตนในน ายางพารา ซงจะเปนการวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยตรงในน ายาง โดยอาศย charge-coupled devices (CCD) camera (WebCam) เปนเครองตรวจวด ซงจะทาการถายภาพสดจตอลทเกดจากการฟอรมสของโปรตนในน ายางพาราดวยวธเลาร (ดรณ วชราเรองวทย, 2544; ดารตน ไชยวาร และคณะ, 2552) และวธไบยเรต (สพรรษา หนทอง และคณะ, 2551) แลวจงอานคาสในระบบ red green and blue (RGB) โดยอาศยความสมพนธทวา คาความเขมสทเกดจากการกระเจงแสง (scattering intensity) ทเกดขน และคาสในระบบ RGB จะแปรผนกบคาความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา ซงจากเอกสารงานวจยทเกยวของกบการใช WebCam เปนเครองตรวจวดนนยงไมมงานวจยใดประยกตใชวธการนในการหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราเลย (Maleki et al., 2004; Gaiao et al., 2006; Chuan-Xiao et al., 2007; Wongwilai et al., 2010)

อปกรณ สารเคมและวธการทดลอง

1. Spectropantonometer เครองตรวจวดปรมาณโปรตนในน ายางธรรมชาตดวยวธวดคาความเขมของการกระเจงแสง (Spectropantonometer) ทไดออกแบบและสรางขนน มวตถประสงคเพอทาใหการวเคราะหปรมาณโปรตนในน ายางธรรมชาตเปนวธทงาย รวดเรว และเครองมอยงสามารถเคลอนยายไดสะดวก สาหรบวธการทจะไดพฒนาขนน เปนการวดปรมาณ Total Reactive Protein ในตวอยางคอลลอยด โดยใชหลอดไดโอดแปลงแสงสขาว (LED) เปนแหลงกาเนดแสงขาวทตงฉากกบตวอยาง และวดแสงทกระเจงจากตวอยางทมการฟอรมสกบสารเกดส เชน ไบยเรต เลาร หรอ แบรดฟอรด รเอเจนต เพอใหไดสารสทสามารถกระเจงแสงไดในระบบคอลลอยด โดยไมจาเปนทจะตองนามาทาใหเปนสารละลายใส และในระบบคอลลอยด เมอสารไดผสมกนอยางสมบรณ อนภาคของคอลลอยดนนจะเคลอนทแบบบราวเนยน และแพรกระจายสทกพนทของภาชนะจงสามารถอนมานไดวา ทกสวนของภาชนะนนมความเขมขนของสารละลายและอนภาคของคอลลอยดอยางละเทา ๆ กน ในการสบคนสทธบตร

NU Science Journal 2011; 7(2) 33

ทงในประเทศและตางประเทศ พบวา มการใชระบบนเพยงแตในการวดสของตวอยางในระบบ L*a*b เทานน ยงไมมการใชระบบ RGB สหสมพนธแบบพห (Multiple Regression) ในการหาปรมาณของตวอยางสารละลายใด ๆ เลย มเพยงการประยกตใช RGB model ในการวเคราะหภาพถายดาวเทยมในแบนดตางๆ เทานน (photogrammetry) ดงนนเครองทสรางขนจงเปนเครองแรกทไดมการประยกตใช RGB model ในการหาปรมาณของโปรตนในน ายางธรรมชาต (อยในระหวางดาเนนการขอจด อนสทธบตร)

รป 1 การจดอปกรณของเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทออกแบบและสรางขน ตามรป 1 เปนภาพแสดงองคประกอบของเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงซงประกอบดวย กลองควบคมแสงจากภายนอกซงครอบคลมในสวนของหลอดไดโอดแปลงแสงสขาว (super bright LED) ทาหนาทเปนแหลงกาเนดแสงทสองแสงขาวตงฉากกบสารตวอยางซงคอน ายางพาราทผานการทาใหเกดสกบสารสเชนสารละลายไบยเรตแลวบรรจอยในเซลลใสสารตวอยาง (sample cell) ซงเปน polystyrene cuvette ขนาด 4 มลลลตร โดยมกลองถายวดโอขนาดจว (WebCam) ทาหนาทถายภาพดวยโปรแกรม JPEG PC Camera (China camera Manufacturers, China) และสงขอมลแสงสไปยงเครองคอมพวเตอรโนตบค จากนนใชโปรแกรม Color detector version 1.0 (Cosmin software) ในการอานคาสของตวอยางทระดบโปรตนตางๆ หลงจากทาการฟอรมสกบสารใหสแลวในระบบ RGB จากนนเกบเมตรกซสและความเขมขนไวในตาราง แลวนาคาจากตารางมาสรางกราฟดวยวธ Multiple Regression เพอหาความสมพนธระหวางระดบความเขมของส และปรมาณโปรตน แลวคานวณออกมาเปนปรมาณโปรตนในน ายางพาราไดตอไป ซงวธการคานวณหา

NU Science Journal 2011; 7(2) 34

ความเขมขนของโปรตนโดยใชวธการสรางกราฟมาตรฐานดวยวธ Multiple Regression สามารถแสดงไดดงตาราง 1 และ 2 ดงน

ตาราง 1 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารละลายมาตรฐานโปรตน (Albumin) และ ความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB (เตรยมสารโดยวธเตมสารมาตรฐาน)

ความเขมขนของสารละลาย Albumin

(ppm)

ความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB

R G B

40 115 119 122 80 96 103 111 120 91 98 106 160 91 105 108 200 77 84 94

ตาราง 2 การใสขอมลในโปรแกรม Excel เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐานดวยวธ Multiple Regression

แกน x แกน y แกน x แกน y

40 115 120 106

40 119 160 91

40 122 160 105

80 96 160 108

80 103 200 77

80 111 200 84

120 91 200 94

120 98

NU Science Journal 2011; 7(2) 35

นาขอมลทไดจากตาราง 2 มาสรางกราฟโดยใชโปรแกรม Excel จะไดกราฟเสนตรงดงรป 2และสมการเสนตรงรวมของ RGB จากนนนาสมการทไดมาคานวณหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราไดโดยการแทนคา y = 0 เนองจากใชวธการเตรยมสารละลายเพอทากราฟมาตรฐานแบบวธเตมสารมาตรฐาน เมอแทนคา y = 0 จะไดคา x ออกมา ซงคอความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราในหนวย ppm และ สามารถคานวณเปน % w/v ไดตอไป

รป 2 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารละลายโปรตนมาตรฐานกบความเขมของสในระบบ RGB

2. สารเคม อปกรณ และวธการทดลอง 2.1 วธการท าใหเกดสแบบไบยเรต (สพรรษา หนทอง และคณะ, 2551)

สารละลายไบยเรตประกอบดวย สารละลาย 0.5% w/v คอปเปอรซลเฟต (CuSO4) และ 10% w/vโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ซงสามารถเตรยมไดดงน ละลาย CuSO4 (99.5%, AR grade, Merck, Germany) 0.5 กรม ดวยน าปราศจากไอออน แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน จะไดสารละลาย 0.5% w/v CuSO4 ละลาย NaOH (99%, AR grade, Merck, Germany) 10 กรม ดวยน าปราศจากไอออน แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน จะไดสารละลาย 10% w/v NaOH

NU Science Journal 2011; 7(2) 36

การเตรยมสารละลายเพอท ากราฟมาตรฐานโดยวธเตมสารมาตรฐาน stock solution : สารละลาย 200 ppm Albumin ปรมาตร 500 มลลลตรซงเตรยมไดโดยการ

ชง Albumin (Albumin from hen egg white, Fluka Biochemika, Netherland) มา 0.1000 กรม แลวปรบปรมาตรเปน 500 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน จากนนเตรยม Albumin เขมขน 40, 80, 120, 160 และ 200 ppm ตามลาดบ เตรยมโดยปเปต stock solution มา 20, 40, 60, 80 และ 100 มลลลตร แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออนตามลาดบ

จากนนนาสารละลาย Albumin ทความเขมขนตางๆ มาอยางละ 10 มลลลตร มาทาการเตมน ายางพารา (น ายางขนชนดแอมโมเนยสง) 0.06 มลลลตร เขยาใหเขากน แลวนาไปหมนเหวยงเปนเวลา 20 นาท เพอไลแอมโมเนยออกจากน ายางขนชนดแอมโมเนยสง จากนนทาการเตมสารละลายไบยเรต คอ 0.5% w/v CuSO4 1 มลลลตร และ 10% w/v NaOH 1 มลลลตร เขยาใหเขากน ตงทงไว 5 นาท นาไปวด คาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครอง Spectropantonometer ทออกแบบและสรางขน

2.2 วธการท าใหเกดสแบบเลาร (ดรณ วชราเรองวทย, 2544; ดารตน ไชยวาร และคณะ, 2552)

สารละลาย 3% w/v โซเดยมซเตรท (Na3(C6H5O7)) เตรยมโดยการชง Na3(C6H5O7) (Nutritional Products Ltd., Switzerland) มา 3 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร

สารละลาย A คอ สารละลาย 6 % w/v โซเดยมคารบอเนต (Na2CO3) ซงเตรยมโดย การชง Na2CO3 (AR grade, Merck, Germany) มา 6 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร

สารละลาย B คอ สารละลาย 1.5 % w/v CuSO4 (99.5%, AR grade, Merck,Germany) ซงเตรยมโดยการชง CuSO4 มา 1.5 กรมละลายในสารละลาย 3% w/v Na3(C6H5O7) เปน 100 มลลลตร สารละลาย C เตรยมโดยใชสารละลาย A ปรมาตร 50 มลลลตร ผสมกบสารละลาย B ปรมาตร 1 มลลลตร ซงตองเตรยมใหมทกครงกอนทาการวเคราะห

สารละลาย D คอ 72 % w/v Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, Switzerland) เตรยมโดยปเปตสารละลาย Folin-Ciocalteu มา 3.6 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยน าปราศจากไอออน เปน 5 มลลลตร

สารละลาย 5% w/v กรดไตรคลอโรอะซตก (TCA) เตรยมโดยการชง TCA (C2HCl3O2, 95.5%, Sigma-Aldrich, Germany) มา 5 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร

NU Science Journal 2011; 7(2) 37

สารละลาย 0.2% w/v กรดฟอสโฟทงสตก (PTA) เตรยมโดยการชง PTA (H3O40PW12, Fluka, Switzerland) มา 0.2 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร สารละลาย 0.2 M NaOH เตรยมโดยการชง NaOH (99.9%, AR grade, Merck, Germany) มา 0.8 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร

การเตรยมสารละลายเพอท ากราฟมาตรฐานโดยวธเตมสารมาตรฐาน นาสารละลาย Albumin ทความเขมขนตางๆ มาอยางละ 10 มลลลตร มาทาการเตมน ายางพารา (น ายางขนชนดแอมโมเนยสง) 0.06 มลลลตร เขยาใหเขากน นาสารละลายทไดมา 6 มลลลตรแลวทาการเตมสารละลาย 5% TCA 1 มลลลตร จากนนนาเขาเครองอลตราโซนคเปน เวลา 2 นาท แลวนามาเตม 0.2% PTA 1 มลลลตร นาเขาเครองอลตราโซนคตออก 2 นาท กอนนาไปหมนเหวยงเปนเวลา 30 นาท แลวจงเตมสารละลาย 0.2 M NaOH 2 มลลลตร เขยาและตงทงไว 20 นาท จากนนเตมสารละลาย C 0.6 มลลลตร เขยาใหเขากน ตงทงไว 10 นาท แลวเตมสารละลาย D 0.2 มลลลตร เขยาใหเขากน ตงทงไวอก 10 นาท เพอใหเกดสน าเงนอยางสมบรณ จากนนจงนาไปวดคาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง ทออกแบบและสรางขน

3. ผลการทดลอง และการวจารณ 3.1 การทดสอบหาความสมพนธของโปรตนในตวอยางสารคอลลอยดกบความเขมของ

สในระบบ RGB เนองจากตวอยางน ายางพารามลกษณะเปนสารคอลลอยด ซงไมสามารถวดคาการ

ดดกลนแสงไดโดยตรง เพราะอนภาคของคอลลอยดขดขวางการสองผานของแหลงกาเนดแสง แมวาจะมโครโมฟอร (chromophore) บางชนดทสามารถทาปฏกรยากบสารตวอยางแลวเกดสารสทมความเขมทแปรผนกบความเขมขนของสารเคมททาปฏกรยานน ๆ กตาม สารสทมความเขมของสแปรผนกบความเขมขนของสารทตองการวเคราะห สามารถวเคราะหเทยบความเขมของสกลบไปเปนความเขมขนของสารทตองการวเคราะหในตวอยางนนได ไดแก ระบบ RGB (Red, Green, Blue) และระบบ CMYK (Cyan, Magenta, Yellow, Black) บางระบบ ใชคา L, a, b หรอ L, a*, b

ดงนนจงไดทาการทดลองหาความสมพนธของความเขมขนของโปรตนในตวอยางสารคอลลอยดกบความเขมของสในระบบ RGB โดยใชตวอยางสารคอลลอยดคอ สบซงเตรยม โดยการชงเนอสบ (สขาว) 0.5 กรม ละลายเนอสบในน าปราศจากไอออนปรมาตร 500 มลลลตรบน Hot plate จากนนเตมน ามนพช (มรกต,น ามนปาลมบรสทธ 100%) 0.1 มลลลตร คนจนละลาย เปนสารละลายคอลลอยด ทงใหเยนทอณหภมหอง

NU Science Journal 2011; 7(2) 38

จากนนทาการชงสารมาตรฐานโปรตน (Albumin) 1, 2, 3, 4 และ 5 มลลกรมตามลาดบ แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตรดวยสารละลายคอลลอยดทเตรยมขน ทาการเตมสารละลายไบยเรต คอ 0.5% CuSO4 และ 10% NaOH อยางละ 2 มลลลตร จะไดความเขมของสทแตกตางกนไปขนอยกบความเขมขนของปรมาณโปรตนทมอย แลวนาไปวดคาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทออกแบบและสรางขน แลวทาการสรางกราฟความสมพนธระหวางคาความเขมสในระบบ RGB กบคาความเขมขนของโปรตน จากการทดลองพบวาไดกราฟท มความชนเปนลบเหมอนรป 2 (ไดทาการทดลองซ า 10 ครง) จงทาใหสามารถสรปไดวา โปรตนในสารละลายคอลลอยดสามารถทาใหเกดสกบสารละลายไบยเรต แลวใหสารสมวงทม ความเขมของสแปรผกผนกบความเขมขนของปรมาณของโปรตนทมอยในสารละลายคอลลอยด ทาใหการวเคราะหโปรตนสามารถทาไดโดยตรงจากตวอยางทมลกษณะเปนคอลลอยด โดยไมตองตกตะกอนโปรตนออกมากอน ดงนนวธทพฒนาขนนมความสามารถในการวเคราะหส แลวเทยบกลบไปเปนความเขมขนของปรมาณโปรตนไดโดยตรง โดยการแทนคาในสมการเสนตรงดงทไดอธบายขางตน

3.2 การทดสอบหาชวงความเขมขนของน ายางพาราทเหมาะสม ไดทาการเตรยมน ายางพารา 2 ชวงความเขมขน คอ 0.01-0.05 %v/v (ใชน ายางพาราปรมาตร 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 และ 0.05 มลลลตรตามลาดบ เจอจางดวยน าปราศจากไอออนเปน 10 มลลลตร) และ 0.04-0.08 %v/v (ใชน ายางพาราปรมาตร 0.04, 0.05, 0.06, 0.07 และ 0.08 มลลลตรตามลาดบ เจอจางดวยน าปราศจากไอออนเปน 10 มลลลตร) แลวนาไปเขาเครองเหวยงเปนเวลา 40 นาท จากนนเตมสารละลายไบยเรต คอ 0.5% CuSO4 1 มลลลตร และ 10% NaOH 1 มลลลตร ตงทงไว 5 นาท แลวนาไปวดคาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครอง วดคาความเขมของการกระเจงแสง ไดผลการทดลองดงตาราง 3-4 และรป 3-4 ตาราง 3 คาความเขมของสในระบบ RGB โดยใชปรมาตรน ายางพารา 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 และ 0.05 มลลลตร ตามลาดบ

ความเขมขนของน ายาง (%v/v)

ความเขมของสในระบบ RGB R G B

0.01 81 91 141 0.02 75 77 134 0.03 61 73 115 0.04 55 57 98 0.05 50 50 94

NU Science Journal 2011; 7(2) 39

รป 3 ความสมพนธระหวางความเขมขนของน ายางพารากบความเขมของสในระบบ RGB โดยใชน ายางปรมาตร 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 และ 0.05 มลลลตร ตามลาดบ ตาราง 4 คาความเขมของสในระบบ RGB โดยใชปรมาตรน ายางพารา 0.04, 0.05, 0.06, 0.07 และ 0.08 มลลลตร ตามลาดบ

ความเขมขนของน ายาง (%v/v)

ความเขมของสในระบบ RGB R G B

0.04 108 118 154 0.05 93 112 144 0.06 82 105 130 0.07 73 75 124 0.08 59 68 111

NU Science Journal 2011; 7(2) 40

รป 4 ความสมพนธระหวางความเขมขนของน ายางพารากบความเขมของสในระบบ RGB

โดยใชน ายางปรมาตร 0.04, 0.05, 0.06, 0.07 และ 0.08 มลลลตร ตามลาดบ

จากผลการทดลองพบวา กราฟในรป 3-4 มความชนเปนลบ แสดงใหเหนวาคาความเขมสในระบบ RGB แปรผกผนกบความเขมขนของน ายางพารา (สทตามองเหนดเขมขนเมอความเขมขนของน ายางพาราเพมขนแตคาความเขมสในระบบ RGB กลบลดลงตามความเขมขนของน ายางพารา) ไดความสมพนธเปนสมการเสนตรงดงลงซงมคาความเปนเสนตรง (r2) มากกวา 0.9 ทงสองชวง ความเขมขน แตเราจะเลอกชวงความเขมขนของน ายางพาราเทากบ 0.04-0.08 %v/v สาหรบ การวเคราะหในขนตอนตอไปเนองจากใหคาความเปนเสนตรงดกวาชวงความเขมขน 0.01-0.05 %v/v และไดทาการทดลองซ าแบบเดมอก 5 ซ า กใหผลในทานองเดยวกน โดยในการทดลองเพอ หาความเขมขน ของโปรตนในน ายางพาราดวยวธการทาใหเกดสแบบไบยเรตและเลาร ไดเลอกความเขมขนของน ายางซงเปนคากลางของความเขมขนทเหมาะสม (0.04-0.08 %v/v) คอ เทากบ 0.06 %v/v เนองจากเมอทดลองทาใหเกดสดวยทงสองวธจะสงเกตสไดชดเจนและใชน ายางไมมากหรอนอยเกนไป (ดารตน ไชยวาร และคณะ, 2552) 3.3 การวเคราะหหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา

เมอทราบความสมพนธของโปรตนในตวอยางสารคอลลอยดกบความเขมของส ในระบบ RGB และไดเลอกความเขมขนของน ายางพาราแลวกไดทาการทดลองดงหวขอ 2.1 และ 2.2 ซงวเคราะหหาปรมาณของโปรตนในตวอยางน ายางพาราขนชนดแอมโมเนยสงดวยวธการทาใหเกด ส

NU Science Journal 2011; 7(2) 41

แบบไบยเรตและเลารโดยวธการเตมสารมาตรฐาน (standard addition method) และใชวธการสรางกราฟมาตรฐานดวยวธ Multiple Regression ดงทไดอธบายขางตนซงกราฟทไดจะมลกษณะดงรป 2 คอเปนเสนตรงเสนเดยวทเกดจากการรวมกนของเสนตรง 3 เสนของความสมพนธระหวางคาความเขมขนของโปรตนและคาความเขมสอาร จ และ บ โดยไดทาการทดลองทงหมด 7 ครงทงการทาใหเกดสดวยวธไบยเรตและวธเลาร ไดแสดงสมการของทง 7 ครงดงตาราง 5 และแสดงผลความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราทไดจากการแทนคา y = 0 ในสมการในตาราง 5 ไดผลดงตาราง 6 ตาราง 5 สมการรวมแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของสารละลายโปรตนมาตรฐานกบ ความเขมของสในระบบ RGB ดวยวธไบยเรตและวธเลาร

ครงท

สมการเสนตรงทใชในการคานวณหา ความเขมขนของโปรตนจากวธ Multiple Regression

วธไบยเรต วธเลาร 1 y = -2600x + 115.6

r2 = 0.996 y = -2675x + 93.3

r2 = 0.998 2 y = -2575x + 116.5

r2 = 0.984 y = -3000x + 107.4

r2 = 0.984 3 y = -1040x + 136.8

r2 = 0.994 y = -1050x + 134.8

r2 = 0.999 4 y = -1100x + 148.8

r2 = 0.999 y = -1110x + 129.8

r2 = 0.994 5 y = -1050x + 145.4

r2 = 0.992 y = -1210x + 147.0

r2 = 0.995 6 y = -1080x + 135.2

r2 = 0.997 y = -1500x + 173.4

r2 = 0.989 7 y = -950x + 119.4

r2 = 0.997 y = -1040x + 154.2

r2 = 0.998

NU Science Journal 2011; 7(2) 42

ตาราง 6 ความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราซงไดจากการทาใหเกดสดวยวธไบยเรต และวธเลาร กอนตรวจวดดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง

ครงท

ปรมาณของโปรตนในน ายางพารา (%โดยน าหนกตอปรมาตร)

วธไบยเรต วธเลาร 1 0.045 0.035 2 0.045 0.036 3 0.041 0.039 4 0.042 0.035 5 0.043 0.037 6 0.045 0.038 7 0.047 0.038

คาเฉลย 0.044 0.037

S.D. 0.0021 0.0016

%RSD 4.7 4.3

สรปผลการทดลอง ในงานวจยนไดทาการวเคราะหหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา ซงใชวธทาใหเกดสตามวธการของเลารและไบยเรต แลวจงทาการตรวจวดดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทไดออกแบบและสรางขนโดยมไดโอดสขาวเปนแหลงกาเนดแสง เมอเรานาน ายางพาราทเจอจาง ใสลงในเครองและใช WebCam ถายภาพสดจตอลกอนทาการตรวจวดคาความเขมของสในระบบ RGB แลวจงทาการแปลงคาความเขมของสเปนคาตวเลข พบวาเมอสงเกตดวยตาเปลา สของสารละลายทเกดขนจะเขมขนตามความเขมขนของโปรตนทเพมขน แตเมอทาการตรวจวดคาส ในระบบ RGB แลวทาการสรางกราฟความสมพนธระหวางคาสในระบบ RGB กบคาความเขมขน ของโปรตนพบวาไดกราฟทมความชนเปนลบแสดงวา คาสในระบบ RGB แปรผกผนกบความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา จากนนนาผลการทดลองจากวธการทาใหเกดสทงสองวธมาเปรยบเทยบกนโดยใช paired t-test (Miller et al., 1993) พบวาสามารถใชการทาใหเกดสทงสองวธในการวเคราะหหาปรมาณโปรตนในน ายางพาราได โดยวธการทาใหเกดสทงสองวธใหผลทไมแตกตางกนอยาง มนยสาคญ ทระดบความเชอมน 95% แตวธการทาใหเกดสแบบไบยเรตมขอดทเหนอกวาวธการทาให

NU Science Journal 2011; 7(2) 43

เกดสแบบเลาร คอ สามารถทาไดสะดวก รวดเรว เตรยมตวอยางไดงาย ใชสารเคมในปรมาณ ทนอยกวา และประหยดคาใชจายมากกวา ดงนนวธการทาใหเกดสแบบไบยเรต จงนาจะเหมาะสมสาหรบนาไปวเคราะหหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราไดเปนอยางดตอไป เมอนาน ายางพารามาวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยใชวธมาตรฐาน คอวธเลารดดแปร (Modified Lowry method; ASTM D5712-05, 2005) ซงสงไปใหสวนอตสาหกรรมยาง สถาบนวจยยาง กรมวชาการเกษตร กรงเทพมหานคร เปนผทดสอบ พบวาน ายางพารามปรมาณโปรตนเทากบ 0.046 %โดยน าหนกตอปรมาตร เมอเปรยบเทยบกบวธทเราไดพฒนาขนโดยใชเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง ทไดสรางขนในหองปฏบตการนโดยใช paired t-test (Miller et al., 1993) พบวาใหคาไมแตกตางกนอยางมนยสาคญ ทระดบความเชอมน 95% ดงนนวธการทไดพฒนาขนนจงใหผลการทดลองทเชอถอได อกทงเปนวธทงาย สะดวก รวดเรวกวาวธมาตรฐานมาก กตตกรรมประกาศ ขอขอบคณ ดร.ช.วยากรณ เพชญไพศษฏ นายศภโชค อปาล นางสาวชตมา สารมย และนางสาวพรชนก พนทอง ทชวยใหงานวจยนสาเรจลลวงดวยด ขอขอบคณภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวรทใหความอนเคราะหทาง ดานเครองมอและอปกรณรวมทงเงนทนสนบสนนงานวจยนบางสวน ขอขอบคณมหาวทยาลยนเรศวรทใหเงนทนสนบสนนงานวจยจากงบประมาณแผนดน ประจาป 2553 งานวจยนไดรบการสนบสนนจากศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม (PERCH-CIC) สานกงานคณะกรรมการการอดมศกษา กระทรวงศกษาธการ เอกสารอางอง ดรณ วชราเรองวทย. (2544). การศกษาหาปรมาณโปรตนทละลายน าจากถงมอยางทางการแพทยและ

เทคนคการลดปรมาณโปรตนทละลายน า. กลมงานเทคโนโลยผลตภณฑ 1 กองฟสกสและวศวกรรม กรมวทยาศาสตรบรการ. กรงเทพมหานคร.

ดารตน ไชยวาร นษยา วงษเกดชวน และ ปรญญา มาสวสด. (2552). การพฒนาการวเคราะหโปรตนโดยใชเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร.

วราภรณ ขจรไชยกล. (2549). ยางธรรมชาต : การผลตและการใชงาน. หางหนสวนจากด ซโน ดไซน. กรงเทพมหานคร.

NU Science Journal 2011; 7(2) 44

สพรรษา หนทอง ศรวมล อนทรเอยม และ ปรญญา มาสวสด. (2551). การวดความเขมของแสงโดยอาศยปฏกรยาการเกดสในตวอยางคอลลอยด. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร.

สานกงานการวจยแหงชาต. (2553). เอกสารการประชมวชาการยางพาราแหงชาต ครงท 2 Value Creation สการพงพาตนเอง. กรงเทพมหานคร.

ASTM D5712-05. (2005). Standard Test Method for Analysis of Aqueous Extractable

Protein in Natural Rubber and its Products Using the Modified Lowry Method.

ASTM International. United States.

Beezhold, D.H., Kostyal D.A. and Tomazic-Jezic, V.J. (2002). Measurement of latex

proteins and assessment of latex protein exposure. Method, 27, 46-51.

Chuan-Xiao, Y., Xiang-Ying, S., Bin, L. and Hui-Ting, L. (2007). Determination of Total

Phosphorus in Water Sample by Digital Imaging Colrimetry. Chinese J. Anal. Chem.,

35, 850-853.

Gaiao, E.N., Martins, V.L., Lyra, W.S., Almeida, L.F., Silva, E.C. and Araujo, M.C.U.

(2006).Digital image-based titrations. Anal. Chim. Acta., 570, 283-290. Retrieved June

4, 2010, from http://coursewares.mju.ac.th/ea341/lesson2/ch02_6.pdf

Maleki, N., Safavi, A. and Sedaghatpour, F. (2004). Single-step calibration, prediction and real

samples data acquisition for artificial neural network using a CCD camera. Talanta, 64,

830-835.

Miller, J.C. and Miller, J.N. (1993). Statistics for Analytical Chemistry, 3rd

edition. Ellis

Horwood Limited, England.

Siler, D.J. and Cornish, K. (1995). Measurement of protein in natural rubber latex. Anal.

Biochem., 229, 278-281.

Tomazic-Jezic, V.J. and Lucas, A.D. (2002). Protein and allergen assays for natural rubber

latex products. J. Allergy Clin. Immunol., 110(2), 40-46.

Wongwilai, W., Lapanantnoppakhun, S., Grudpan, S. and Grudpan, K. (2010). Webcam

camera as a detector for a simple lab-on-chip time based approach. Talanta, 81, 1137-

1141.

Yeang, H.Y., Yusof, F. and Abdullah, L. (1995). Precipitation of Hevea brasiliensis latex

proteins with trichloroacetic acid and phosphotungstic acid in preparation for the

Lowry protein assay. Anal. Biochem., 226, 35-43.