การตรวจสอบคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพ

ดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล

โดย นางสาวปยะพร เนยมมณ

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร ภาควชาเทคโนโลยอาหาร

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2559

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

การตรวจสอบคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพ ดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล

โดย นางสาวปยะพร เนยมมณ

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร ภาควชาเทคโนโลยอาหาร

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2559

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

THE DETERMINATION OF COLLAGEN IN FUNCTIONAL DRINK USING NEAR-INFRARED SPECTROSCOPY

By Miss Piyaporn Neammanee

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree Master of Science Program in Food Technology

Department of Food Technology Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2016 Copyright of Graduate School, Silpakorn University

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “ การตรวจสอบคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ” เสนอโดย นางสาวปยะพร เนยมมณ เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร

……........................................................... (รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ) คณบดบณฑตวทยาลย วนท..........เดอน.................... พ.ศ........... อาจารยทปรกษาวทยานพนธ ผชวยศาสตราจารย ดร.บศรากรณ มหาโยธ คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ .................................................... ประธานกรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปราโมทย ควจตรจาร) ................/......................../.............. .................................................... กรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.รณฤทธ ฤทธรณ) ................/......................../.............. .................................................... กรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.บศรากรณ มหาโยธ) ................/......................../..............

ง

56403211 : สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร ค าส าคญ เครองดมเพอสขภาพ คอลลาเจน ไฮดรอกซโพรลน วธตรวจสอบแบบไมท าลาย ปยะพร เนยมมณ การตรวจสอบคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพดวยเทคนคสเปกโทร สโกปอนฟราเรดยานใกล. อาจารยทปรกษาวทยานพนธ ผศ.ดร.บศรากรณ มหาโยธ. 171 หนา.

งานวจยนมวตถประสงคเพอศกษาความเปนไปไดในการตรวจสอบปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล (Near Infrared Spectroscopy, NIRS) โดยแบงการศกษาออกเปน 3 ขนตอน ไดแก (1) การศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา จ านวน 110 ตวอยาง (2) การศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหาร ไดแก น าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และ ซงคกลโคเนต ตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS ในสารละลายคอลลาเจนทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา จ านวน 630 ตวอยางและ (3) การศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายภายในประเทศ จ านวน 114 ตวอยาง ท าการวดสเปกตรมทชวง 12500-4000 cm-1 ดวยรปแบบการวดแบบสองผานสะทอนกลบ ทคาความสามารถในการแยกพค 8 cm-1 และจ านวนครงของการสแกนตวอยาง 32 ครง ควบคมอณหภมของตวอยางกอนการวดสเปกตรมท 30±1 องศาเซลเซยส ซงเปนอณหภมทใชในการขนสงและเกบรกษาผลตภณฑ เปนเวลา 1 ชวโมง ท าการวดสเปกตรมตวอยางละ 3 ซ าของทง 3 การศกษา ในการศกษาท 1 และ 2 สรางสมการหาความสมพนธระหวางขอมลสเปกตรมเฉลยกบปรมาณคอลลาเจนทเตรยมได ดวยวธการถดถอยก าลงสองนอยทสดบางสวน (PLSR) พบวาการศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน โดยปรบแตงสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนดวยวธอนพนธอนดบสอง พบพคของคอลลาเจนทชวงเลขคลน 7486-6896, 5500-4998 และ 4701-3999 cm-1 ซงมต าแหนงพคทตรงกบการวดสเปกตรมคอลลาเจนผง ในการศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS ในสารละลายคอลลาเจน พบวาวตถเจอปนอาหารชนดทศกษาทความเขมขนของน าตาลซโครสรอยละ 10 วตามนซรอยละ 0.10 โซเดยมเบนโซเอท 1,000 มลลกรมตอลตร และซงคกลโคเนตรอยละ 0.10 ไมสงผลตอการสรางสมการเทยบมาตรฐานคอลลาเจน แตจะท าใหต าแหนงการดดกลนแสงของคอลลาเจนเบยงเบนไปเลกนอย ในการศกษาสวนท 3 เมอวดสเปกตรมตวอยางเครองดมแลวจะน าตวอยางเครองดมไปวเคราะหคณภาพทางเคมเบองตนและปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงทตอกบตวตรวจวดสญญาณชนดฟลออเรสเซนส จากนนสรางสมการหาความสมพนธระหวางขอมลสเปกตรมเฉลยกบคาทางเคม ดวยวธการถดถอยก าลงสองนอยทสดบางสวน (PLSR) พบวาสมการท เหมาะสมท ใหคาการท านายดทสดมค าสมประสท ธการตดสนใจ ( coefficients of determination, R2) เทากบ 0.973 คาความคลาดเคลอนในการท านาย (root mean square error of prediction, RMSEP) เทากบ 3,510 มลลกรมตอลตร และมคาสดสวนระหวางสวนเบยงเบนมาตรฐานกบคาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมทวนสอบสมการ (RPD) เทากบ 6.13 โดยมรอยละความถกตองของการท านายเทากบรอยละ 80 แตยงใหคาความผดพลาดในการท านายทสง เมอน าคาทางเคมทวเคราะหไปค านวณหาคา standard error of laboratory (SEL) มคาเทากบ 12,221.62 mg/L ซงมคามากกวาคาความคลาดเคลอนของการวเคราะหดวย NIRS (SEP) โดยสมการเทยบมาตรฐานของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน มคาเทากบ 3,574 mg/L พบวา มคา SEL ทสงกวา SEP เนองมาจากวตถดบทใชในการสกดคอลลาเจนทตางชนดกนและเมอสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR ของตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน พบวา ใหคาการท านายทด ดวยการใชเลขคลนจ านวน 9 เลขคลน ไดแก 7351, 7166, 5303, 5191, 4971, 4968, 4748, 4451 และ 4215 cm-1 โดยใหประสทธภาพของการท านาย แสดงคา R2 เทากบ 0.939 RMSECV เทากบ 6697 และ Bias เทากบ 31.2 แตสมการนยงใหคาความคลาดเคลอนทสง เนองจากปรมาณคอลลาเจนในตวอยางเครองดมยงไมหลากหลาย สามารถปรบปรงสมการไดโดยการเพมจ านวนตวอยางเพอท าใหสมการท านายมประสทธภาพทดขน ภาควชาเทคโนโลยอาหาร บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2559 ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ............................................................... ....................................................

จ

56403211 : MAJOR : FOOD TECHNOLOGY KEY WORD : FUNCTIONAL DRINK, COLLAGEN, HYDROXYPROLINE, NON-DESTRUCTIVE PIYAPORN NEAMMANEE : THE DETERMINATION OF COLLAGEN IN FUNCTIONAL DRINK USING NEAR-INFRARED SPECTROSCOPY. THESIS ADVISOR : ASST.PROF.BUSARAKORN MAHAYOTHEE, Ph.D.. 171 pp. The aim of this research was the feasibility of Near Infrared Spectroscopy (NIRS) for collagen content determination in commercial functional drinks. This research was divided into three parts. Part one was to study the feasibility of NIRS for determining collagen solution which was prepared by commercial collagen from a total of 110 samples. Part two was to study the influences of food additive on collagen solution determining by NIRS for example, sugar, ascorbic acid, zincgluconate and sodiumbenzoate from a total of 630 samples which was prepared by commercial collagen. Part three was to study the feasibility of NIRS for collagen content determination in commercial functional drinks in the country from a total of 114 samples. All samples were measured using NIRS in the region of 12500-4000 cm-1 and using transflectance mode at 8 cm-1 resolution and were scanned 32 times. Prior to spectral measurements, the temperature of the samples was adjusted to 30±1ºC which used for transporting and storing products for 1 hour. The samples of three parts were measured the spectra in triplicate. Part one and Part two, calibration models obtained from partial least squares (PLS) regression using the average spectral data and actual collagen content in prepared sample solutions. In Part one, it was found that second derivative spectra at wavenumber of 7486-6896, 5500-4998 and 4701-3999 cm-1 were related to the peak that found in raw spectra of collagen powder. In Part two, the addition of sugar 10%, ascorbic acid 0.1%, sodiumbenzoate 1,000 mg/L and zincgluconate 0.1% did not affect calibration models. On the other hand, the absorption of collagen position was slightly refracted. In Part three, the samples were taken to determine the chemical quality content and collagen content by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) equipped with fluorescence detector. Moreover, calibration model was developed by applying partial least squares (PLS) regression using the average spectra data and reference measurement of collagen content. The optimum model for predicting collagen content in commercial functional drinks was showed the coefficients of determination (R2) = 0.973, root mean square error of prediction (RMSEP) = 3,510 mg/L and Ratio of standard error of prediction to standard deviation (RPD) = 6.13 and 80 percentage of accuracy and gave a high error of prediction. After that, the chemical data were analyzed the standard error of the laboratory (SEL)=12,221.62 mg/L, which was higher than the NIRS analysis error (SEP)=3,574 mg/L because the raw materials were used to extract collagen from different sources. Multiple linear regression (MLR) was used to develop the calibration model using the full cross-validation method. The performance of calibration model shows R2=0.939, RMSECV=6,697 mg/L and Bias=31.2 by using wavenumber of the 7351, 7166, 5303, 5191, 4971, 4968, 4748, 4451 and 4215 cm-1. However, this model gave a high error of prediction because the collagen content was not various. Thus, the model could be improved to be more accuracy by increasing the number of samples. Department of Food Technology Graduate School, Silpakorn University Student's signature ........................................ Academic Year 2016 Thesis Advisor's signature.......................................................................................................................................

ฉ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบน สามารถส า เ รจ ล ลว ง ไปไ ด ด วย ด ผ ว จ ยขอกราบขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.บศรากรณ มหาโยธ ทกรณาใหค าแนะน า แนวทางในการท างานวจย พรอมทงขอเสนอแนะในการแกไขปญหา ปรบปรงใหงานวจยนมความถกตองและสมบรณ ตลอดจนความดแลการด าเนนงานวจย จนส าเรจลลวงไปไดดวยด

งานวจยนไดรบทนสนบสนนจากเงนงบประมาณแผนดนประจ าป 2557 ผานสถาบนวจยและพฒนา มหาวทยาลยศลปากร ภายใตชดโครงการวจย เรอง “การพฒนาวธตรวจสอบอยางรวดเรวเพอวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพ” โครงการยอยเรอง นวตกรรมการตรวจสอบแอลคารนทนและคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพดวยเครองสเปกโตรสโคปอนฟราเรดยานใกล เลขท SURDI 57/02/02.02 ผวจยขอขอบพระคณเปนอยางสง

ขอขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.ปราโมทย ควจตรจาร ประธานกรรมการสอบ ทใหค าแนะน า ความชวยเหลอและค าปรกษาในเรองการวเคราะหขอมล การวเคราะหคาทางเคม และวธการวเคราะห HPLC ขอขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.รณฤทธ ฤทธรณ ทใหเกยรตเปนกรรมการผทรงคณวฒภายนอก รวมทงความรความเขาใจเรองเทคนค NIRS และใหค าแนะน าดานการวเคราะหผล NIRS

ขอขอบพระคณ อาจารย ดร.ศราวธ ภไพจตรกล ทใหค าปรกษาในดานการวเคราะหผล NIRS และขอขอบพระคณ อาจารย หรญรตน สวรรณนท ทใหความชวยเหลอและใหค าปรกษาดานวธการวเคราะหปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนคโครมาโตกราฟของเหลวสมรรถนะสง (HPLC)

ขอขอบคณ ศนยบรการประกนคณภาพอาหาร สถาบนคนควาและพฒนาผลตภณฑอาหาร ทใหความอนเคราะห ใหค าปรกษาและชแนะวธการวเคราะหปรมาณคอลลาเจน

ขอขอบพระคณ คณาจารยภาควชาเทคโนโลยอาหาร คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร ทใหความรพนฐานและประสทธประสาทความร ต างๆ แกผวจยตลอดระยะเวลาทศกษา และขอขอบคณ นกวทยาศาสตรและเจาหนาทประจ าภาควชาเทคโนโลยอาหารทกทาน ทอ านวยความสะดวกในดานการใชเครองมอวทยาศาสตร และดานงานธรการ

ขอขอบคณ นางสาวขนษฐา เนยมมณ ทคอยชวยเหลอในการเตรยมตวอยางและอปกรณในการวจยน และขอขอบพระคณบคคลในครอบครวทใหโอกาสในการศกษาน ตลอดจนใหก าลงใจ และสนบสนนการศกษาของผวจยเสมอมา

ช

สารบญ หนา

บทคดยอภาษาไทย.......................................................................................................................... .....ง บทคดยอภาษาองกฤษ..................................................................................................................... .....จ กตตกรรมประกาศ .............................................................................................................................. ฉ สารบญ ................................................................................................................................................ ช สารบญตาราง ...................................................................................................................................... ฎ สารบญภาพ ..........................................................................................................................................ฐ บทท 1 บทน า ....................................................................................................................................... 1 1.1 ความส าคญและทมาของปญหาทท าการวจย ............................................................. 1 1.2 วตถประสงคของงานวจย ........................................................................................... 3 1.3 สมมตฐานของงานวจย ............................................................................................... 4 1.4 ขอบเขตของงานวจย .................................................................................................. 4 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ ............................................................................................... 6 2.1 คอลลาเจน ................................................................................................................. 9 2.1.1 โครงสรางของคอลลาเจน .................................................................................. 9 2.1.2 วตถดบทใชในการสกดคอลลาเจน ................................................................... 10 2.1.3 วธทใชในการสกดคอลลาเจน .......................................................................... 11 2.1.4 วธการวเคราะหปรมาณคอลลาเจน ................................................................. 12 2.2 การผลตเครองดมเสรมคอลลาเจน ........................................................................... 15 2.3 เทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ............................................................... 17 2.4 การประยกตใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพ ................... 21 2.4.1 การใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหตวอยางทเปนของเหลว .......................... 22 2.4.2 เทคนคทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐาน ................................................ 24 2.5 อทธพลขององคประกอบทซบซอนในอาหารตอการวดสเปกตรมดวยเทคนค NIRS ......................................................................................................................... 26 3 วธด าเนนการวจย ................................................................................................................... 32 3.1 วตถดบ ..................................................................................................................... 32 3.1.1 วตถดบและอปกรณทใชในการวจย ................................................................. 32

ซ

บทท หนา 3.1.2 สารเคม ............................................................................................................ 32 3.1.3 เครองมอ ......................................................................................................... 33 3.2 วธการทดลอง ........................................................................................................... 34 3.2.1 การศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรด ยานใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทม ความบรสทธรอยละ 95.10 .............................................................................. 35 3.2.1.1 การเตรยมตวอยาง .............................................................................. 35 3.2.1.2 การวดสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนดวยเครองสเปกโทรสโกป อนฟราเรดยานใกล .............................................................................. 36 3.2.1.3 การปรบแตงสเปกตรม ........................................................................ 37 3.2.1.4 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน .......................................................... 38 3.2.1.5 การทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน .......................... 39 3.2.1.6 การวดสเปกตรมคอลลาเจนผงดวยเครองสเปกโทรสโกป อนฟราเรดยานใกล .............................................................................. 39 3.2.2 การศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารตอการวดปรมาณคอลลาเจน ดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในสารละลายคอลลาเจน ทมความบรสทธรอยละ 95.10 ......................................................................... 41 3.2.2.1 การเตรยมตวอยาง .............................................................................. 41 3.2.2.2 การวดสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนทมการเตมวตถเจอปนอาหาร ดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ...................................... 43 3.2.2.3 การปรบแตงสเปกตรม ........................................................................ 43 3.2.2.4 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน .......................................................... 43 3.2.2.5 การทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน .......................... 44 3.2.2.6 การวดสเปกตรมวตถเจอปนอาหารผงดวยเครองสเปกโทรสโกป อนฟราเรดยานใกล .............................................................................. 44 3.2.3 การศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยาน ใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรม คอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด ............................................................ 45

ฌ

บทท หนา 3.2.3.1 สมเกบตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมจ าหนาย ในประเทศ .......................................................................................... 45 3.2.3.2 วเคราะหคณลกษณะทางเคมเบองตนของผลตภณฑน าผลไมทม การเสรมคอลลาเจนทวางจ าหนายในประเทศ .................................... 47 3.2.3.3 การวดสเปกตรมเครองดมน าผลไมเสรมคอลลาเจนดวยเครอง สเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ...................................................... 47 3.2.3.4 การปรบแตงสเปกตรม ........................................................................ 49 3.2.3.5 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน .......................................................... 49 3.2.3.6 การทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน .......................... 50 3.2.3.7 วเคราะหปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรม คอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาดดวยเครอง High Performance Liquid Chromatography (HPLC) .......................... 51 3.2.3.7.1 การเตรยมตวอยาง .................................................................... 51 3.2.3.7.2 การท าอนพนธตวอยาง ............................................................. 51 3.2.3.7.3 การวเคราะหปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไม เสรมคอลลาเจนดวย HPLC ....................................................... 52 4 ผลการทดลองและวจารณผล ................................................................................................. 53 4.1 การใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการตดตามปรมาณ คอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธรอยละ 95.10 ........................ 53 4.1.1 ลกษณะสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจน .................................................. 53 4.1.2 ลกษณะสเปกตรมของคอลลาเจนผง................................................................ 55 4.1.3 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน ...................................................................... 56 4.2 การศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนค สเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธ รอยละ 95.10 .......................................................................................................... 63 4.2.1 ลกษณะสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปน อาหาร .............................................................................................................. 63 4.2.1.1 สารละลายและผงวตถเจอปนอาหารบรสทธ ....................................... 63 4.2.1.2 สารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปนอาหาร ........................ 71

ญ

บทท หนา 4.2.2 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน ...................................................................... 76 4.3 การศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน ทมวางจ าหนายในทองตลาด .................................................................................. 100 4.3.1 สมเกบตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมจ าหนายในประเทศ.... 100 4.3.2 วเคราะหคณลกษณะทางเคมเบองตนของเครองดมน าผลไมทมการเสรม คอลลาเจนทวางจ าหนายในประเทศ .............................................................. 102 4.3.3 ลกษณะสเปกตรมของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมจ าหนายใน ประเทศ .......................................................................................................... 106 4.3.4 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน .................................................................... 109 4.3.4.1 การสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ PLSR................................... 109 4.3.4.2 การสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ Multiple Linear Regression (MLR) ............................................................................ 117 สรปผลการทดลอง .......................................................................................................................... 122 รายการอางอง ................................................................................................................................. 123 ภาคผนวก ........................................................................................................................................ 139 ภาคผนวก ก ................................................................................................................ 140 ภาคผนวก ข ................................................................................................................ 145 ภาคผนวก ค ................................................................................................................ 157 ภาคผนวก ง .................................................................................................................. 160

ประวตผวจย .................................................................................................................................... 171

ฎ

สารบญตาราง ตารางท หนา 1 แนวทางการอธบายความสามารถของสมการเทยบมาตรฐานดวยคาสมประสทธ สหสมพนธ (coefficient of correction, R) หรอคาสมประสทธการตดสนใจ (coefficient of determination, R2)…………………………………………………………… 20 2 แนวทางการอธบายความสามารถของสมการเทยบมาตรฐานดวยคาสดสวนระหวาง คาเบยงเบนมาตรฐานของคาทางเคมและคาความผดพลาดมาตรฐานในการ ท านายของกลมตวอยางทใชในการตรวจสอบสมการ (standard error of prediction, SEP) (RPD)……………………………………………………………………………… 20 3 งานวจยทแสดงถงความสามารถของการใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสาร ออกฤทธทางชวภาพ…………………………………………………………………………………….. 28 4 การเตรยมตวอยางสารละลายคอลลาเจนทความเขมขนแตกตางกน จาก stock solution 10,000 มลลกรมตอลตร………………………………………………………………… 35 5 ปรมาณวตถเจอปนอาหารทเตมในสารละลายคอลลาเจนเพอเปนระบบจ าลอง……………. 41 6 การสมตวอยางเครองดมน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนส าหรบการศกษา……………..….. 46 7 คาสถตของสารละลายคอลลาเจนส าหรบสรางสมการและส าหรบทวนสอบสมการ ดวยเทคนค NIRS………………………………………………………………………………………… 57 8 คาทางสถตของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนดวย เทคนค NIRS………………………………………………………………………………………………. 58 9 การเปรยบเทยบคาจรงและคาท านายของปรมาณคอลลาเจนในน าผลไมเสรม คอลลาเจนทจ าหนายในทองตลาด ดวยสมการสารละลายคอลลาเจน ทเหมาะสมทสด…………………………………………………………………………………………...62 10 คาสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารส าหรบสรางสมการ เทยบมาตรฐานและทวนสอบสมการดวยเทคนค NIRS…………………………………….. 78 11 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของน าตาลซโครสตอการวดคอลลาเจน ดวยเทคนค NIRS………………………………………………………………………………………… 81 12 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของวตามนซตอการวดคอลลาเจนดวย เทคนค NIRS………………………………………………………………………………………………. 85 13 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของโซเดยมเบนโซเอทตอการวด คอลลาเจนดวยเทคนค NIRS………………………………………………………………………… 89

ฏ

ตารางท หนา 14 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของซงคกลโคเนตตอการวดคอลลาเจน ดวยเทคนค NIRS………………………………………………………………………………………… 93 15 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของน าตาลซโครส วตามนซ โซเดยม เบนโซเอท และซงคกลโคเนตตอการวดคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS………………… 96 16 การเปรยบเทยบคาจรงและคาท านายของปรมาณคอลลาเจนในน าผลไมเสรม คอลลาเจนทจ าหนายในทองตลาด ดวยสมการสารละลายคอลลาเจน มาตรฐานทท าการเตมวตถเจอปนอาหารทเหมาะสมทสด………………………………….99 17 ลกษณะปรากฏของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทใชในการศกษา…………………… 101 18 คณลกษณะทางเคมเบองตนของผลตภณฑน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนทใชใน การศกษา………………………………………………………………………………………………… 103 19 คณลกษณะทางเคมเบองตนของผลตภณฑน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนทใชใน การศกษา………………………………………………………………………………………………… 104 20 คาสถตของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน ส าหรบสรางสมการและส าหรบ ทวนสอบสมการดวยเทคนค NIRS……………………………………………………………….. 110 21 คาทางสถตของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม จ านวน 114 ตวอยาง…………………………………………………………………………………. 112 22 คาทางสถตของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม จ านวน 109 ตวอยาง…………………………………………………………………………………. 113 23 การเปรยบเทยบคาจรงและคาการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม ดวยสมการทเหมาะสมทสด………………………………………………………………………… 116 24 การเลอกเลขคลนในการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR…………………………….. 119 25 คาจดตดแกน y (intercept) และคาสมประสทธของเลขคลนทเลอกใชในการสราง สมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR……………………………………………………………… 119 26 สภาวะส าหรบการวเคราะหหาปรมาณคอลลาเจนดวย HPLC………………………………….. 153 27 พนทใตกราฟของสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน ทความเขมขนตางๆ……………………154 28 การตรวจสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐานผลตภณฑน าผลไมเสรม คอลลาเจน……………………………………………………………………………………………….. 158

ฐ

สารบญภาพ ภาพท หนา 1 โครงสรางของวตามนซ……………………………………………………………………………………………. 7 2 โครงสรางของโซเดยมเบนโซเอท……………………………………………………………………………….7 3 โครงสรางของซงคกลโคเนต…………………………………………………………………………………….. 8 4 โครงสรางของน าตาลซโครส……………………………………………………………………………………. 8 5 โครงสรางของโมเลกลคอลลาเจนทเปนเสนใย (fibrillar collagen)……………………………… 9 6 สตรโครงสรางของไฮดรอกซโพรลน………………………………………………………………………… 13 7 โครมาโตแกรมผลการวเคราะห 4-ไฮดรอกซโพรลน โดยใช NBD-Cl ในการเตรยม อนพนธ………………………………………………………………………………………………………. 13 8 สตรโครงสรางทางเคมของ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (NBD-Cl)…………………….. 14 9 ปฏกรยาการเกดอนพนธระหวางไฮดรอกซโพรลนกบ NBD-Cl…………………………………… 14 10 กระบวนการผลตน าผลไม……………………………………………………………………………………….16 11 สวนประกอบของระบบ FT-NIR (รน MPA S/N2197, Bruker Germany)…………………. 18 12 สเปกตรมทผานการปรบแตงดวยวธปรบเรยบของน าเบยเบอรร…………………………………. 23 13 การวดสเปกตรมตวอยางสารละลายคอลลาเจนโดยวางอปกรณในระบบสะทอน ผานตวอยาง……………………………………………………………………………………………….. 36 14 ขนตอนการสรางสมการเทยบมาตรฐานสารละลายคอลลาเจน…………………………………… 37 15 การวดสเปกตรมตวอยางคอลลาเจนผงดวยระบบสะทอนกลบ…………………………………… 40 16 แผนผงการเตมวตถเจอปนอาหารลงในสารละลายคอลลาเจน จ านวนรวม 630 ตวอยาง……………………………………………………………………………………………………… 42 17 ขนตอนการสรางสมการเทยบมาตรฐานของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทม วางจ าหนายในทองตลาด……………………………………………………………………………… 48 18 ตวอยางสเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนทความเขมขน ตางๆ กน……………………………………………………………………………………………………. 54 19 ตวอยางสเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจน ทความเขมขน ตางๆ กน ทผานการปรบแตงดวยอนพนธอนดบสอง……………………………………….. 55 20 สเปกตรมคอลลาเจน…………………………………………………………………………………………….. 56 21 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนทไมผานการปรบแตงสเปกตรม……….. 59

ฑ

ภาพท หนา

22 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน ทไดจากการสราง สมการเทยบมาตรฐานและทวนสอบสมการดวยเทคนค NIRS…………………………… 60 23 การกระจายตวของปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน………………………………… 60 24 สเปกตรมสารละลายน าตาลซโครส…………………………………………………………………………. 64 25 สเปกตรมน าตาลซโครส…………………………………………………………………………………………. 64 26 สเปกตรมสารละลายน าตาลซโครสจากเอกสารอางอง (ก) สเปกตรมดงเดม (ข) สเปกตรมทปรบแตงดวยอนพนธอนดบสอง……………………..……………………….. 65 27 สเปกตรมสารละลายวตามนซ………………………………………………………………………………… 66 28 สเปกตรมวตามนซ………………………………………………………………………………………………… 66 29 สเปกตรมวตามนซจากเอกสารอางอง……………………………………………………………………… 67 30 สเปกตรมสารละลายซงคกลโคเนต…………………………………………………………………………. 68 31 สเปกตรมซงคกลโคเนต…………………………………………………………………………………………. 68 32 สเปกตรมสารละลายโซเดยมเบนโซเอท………………………………………………………………….. 69 33 สเปกตรมโซเดยมเบนโซเอท…………………………………………………………………………………… 70 34 สเปกตรมของสารละลายชนดตางๆ ทปรบแตงดวยวธอนพนธอนดบสอง…………………….. 71 35 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมน าตาลซโครสทความ เขมขนแตกตางกน……………………………………………………………………………………….. 72 36 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมวตามนซทความเขมขน แตกตางกน…………………………………………………………………………………………………. 73 37 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมซงคกลโคเนตทความ เขมขนแตกตางกน………………………………………………………………………………………. 74 38 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมโซเดยมเบนโซเอทท ความเขมขนแตกตางกน………………………………………………………………………………. 75 39 สเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปนอาหารชนดตางๆทปรบแตง ดวยวธอนพนธอนดบสอง……………………………………………………………………………… 76 40 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลาย น าตาลซโครส ทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง……………………………. 77

ฒ

ภาพท หนา

41 การกระจายตวของปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปน อาหาร (ก) น าตาลซโครส (ข) วตามนซ (ค) โซเดยมเบนโซเอท (ง) ซงคกลโคเนต และ (จ) รวมทกตว……………………………………………………………………………………… 80 42 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของ น าตาลซโครส ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบ ดวยเทคนค NIRS………………………………………………………………………………………… 82 43 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาลซโครส ท ผานการปรบแตงดวยวธ SNV……………………………………………………………………….. 83 44 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลาย วตามนซ ทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง…………………………………... 84 45 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของ วตามนซ ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวย เทคนค NIRS………………………………………………………………………………………………. 86 46 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของวตามนซทผาน การปรบแตงดวยวธ SNV……………………………………………………………………………… 87 47 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลาย โซเดยมเบนโซเอท ทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง…………………….. 88 48 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของ โซเดยมเบนโซเอท ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการ ทวนสอบดวยเทคนค NIRS…………………………………………………………………………… 90 49 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของโซเดยมเบนโซเอท ทผานการปรบแตงดวยวธ SNV…………………………………………………………………….. 91 50 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลาย ซงคกลโคเนตทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง…………………………….. 92 51 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของ ซงคกลโคเนตทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบ ดวยเทคนค NIRS………………………………………………………………………………………… 94 52 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของซงคกลโคเนตท ไมผานการปรบแตงสเปกตรม……………………………………………………………………….. 95

ณ

ภาพท หนา

53 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของ น าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และซงคกลโคเนต ทไดจากการ สรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS……………………. 97 54 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และซงคกลโคเนต ทผานการปรบแตงดวย วธ MSC…………………………………………………………………………………………………….. 98 55 ปรมาณคอลลาเจนทวเคราะหไดจากวธ HPLC เทยบกบปรมาณคอลลาเจนทระบ บนฉลากบรรจภณฑ…………………………………………………………………………………… 105 56 ตวอยางสเปกตรมของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทใชในการศกษา…………………107 57 สเปกตรมผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทปรบแตงดวยวธอนพนธอนดบสอง………. 108 58 การกระจายตวของปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน…………….. 111 59 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมทผานการ ปรบแตงดวยวธ SNV…………………………………………………………………………………. 114 60 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมทไดจากการสราง สมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS…………………………. 115 61 คา X-loading ของแบบจ าลองคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมดวยเทคนค สเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล........................................................................ 117 62 สมประสทธการถดถอยของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม ในชวงคลน 12500-4000 cm-1………………………………………………………………….. 118 63 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณคอลลาเจนทวดไดจรงกบปรมาณ คอลลาเจนทท านายไดดวยวธ MLR…………………………………………………………….. 121 64 เครอง Digital refractometer……………………………………………………………………………..146 65 เครองวดส (Tintometer) ทใชในการวดเครองดมทมการเสรมคอลลาเจน………………… 147 66 การวางเครองมอและตวอยางของเครองวดส…………………………………………………………. 147 67 เครอง Brookfield Viscometer………………………………………………………………………….. 148 68 ภาชนะใสตวอยางและหว probe ชนด UL ทใชในการวดความหนดผลตภณฑน า ผลไมเสรมคอลลาเจน………………………………………………………………………………… 148 69 อณหภมและเวลาทใชในการยอยตวอยางดวยเครอง Autoclave…………………………….. 152 70 กราฟมาตรฐานสาร 4-ไฮดรอกซโพรลน………………………………………………………………… 154

ด

ภาพท หนา

71 โครมาโตแกรมผลการวเคราะห 4-ไฮดรอกซโพรลน โดยใช NBD-Cl ในการเตรยม อนพนธในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน…………………………………….156 72 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณคอลลาเจนทวดไดจรงกบปรมาณ คอลลาเจนทท านายไดทชวงความเขมขนต า…………………………………………………. 159 73 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณคอลลาเจนทวดไดจรงกบปรมาณ คอลลาเจนทท านายไดทชวงความเขมขนสง…………………………………………………. 159

1

บทท 1

บทน า

1.1 ความส าคญและทมาของปญหาทท าการวจย

ตลาดวตามนและผลตภณฑเสรมอาหารในประเทศไทยเตบโตเฉลยสง คดเปนรอยละ 11.0 ตอป โดยในป พ.ศ. 2555 มมลคา 35,390 ลานบาท และเพมขนเปน 53,810 ลานบาท ในป พ.ศ.2559 โดยผลตภณฑเสรมอาหารมสวนแบงทางการตลาดสงทสด คอรอยละ 86.4 ดวยมลคา 46,503 ลานบาท รองลงมาคอ วตามนและเกลอแร รอยละ 11.6 ดวยมลคา 6,225 ลานบาท (สถาบนอาหาร กระทรวงอตสาหกรรม, 2560) ประกอบกบผผลตพฒนาผลตภณฑใหมเขาสตลาดอยางตอเนอง เพอเพมความหลากหลายใหกบผลตภณฑ โดยเฉพาะผลตภณฑทดตอสขภาพ เชน น าผลไมน าตาล ต า หรอมสวนผสมของไฟเบอร วตามนซ และหนงในสวนผสมทมความโดดเดนในอตสาหกรรมการผลต ผลตภณฑเพอสขภาพ ไดแก คอลลาเจน (Bilek และ Bayram, 2015) โดยคอลลาเจนมขอดในเชงอตสาหกรรมคอ มลกษณะเปนผง งายตอการน าไปผสมเปนวตถเจอปนในอาหาร อกทงมการกระจายตวสง ความหนดนอย มความสามารถในการละลายน าสง มลกษณะใส และใชเปนอมลซฟายเออร จงนยมน ามาใชในผลตภณฑเครองดม

โดยทวไปรางกายมนษยและสตวประกอบไปดวยโปรตนรอยละ 25 ในรปคอลลาเจน เมออายมากขนคอลลาเจนจะเสอมสลาย ท าใหชนผวหนงยบตว อนเปนสาเหตของความเหยวยนและรวรอย รวมถงการเกดปญหาขอเสอม กระดกเสอม (Iwai และคณะ, 2005) ดงนนจงมการศกษาทชใหเหนวาการรบประทานคอลลาเจนปรมาณ 10 กรมตอวน ชวยลดอาการปวดขอได (Moskowitz, 2000; Benito- Ruiz และคณะ, 2009; Walrand และคณะ, 2008) สามารถลดรวรอยเหยวยน (Tanaka และคณะ , 2009) และปรบปรงผวใหดขน (Matsumoto, 2006; Zague, 2008) นอกจากนยงมการศกษาอนๆ ทแสดงใหเหนวาการรบประทานอาหารทอดมไปดวยคอลลาเจนสามารถชวยปรบปรงกระบวนการเมทาบอลซมของกระดกได (Guillerminet และคณะ, 2010; Koyama และคณะ, 2001) ลดอาการปวดในผปวยโรคขอเขาและขอสะโพกเสอมโดยการเพมความเขมขนของไฮดรอกซ โพรลนในเลอด (Moskowitz, 2000) และปองกนโรคกระดกพรน (Bonjour, 2005) ดานการเปนสวนผสมของผลตภณฑอาหาร การใชคอลลาเจน ทมน าหนกโมเลกลต าในชวง 2000-5000 ดาลตน (Da) จะชวยปองกนการตกตะกอนและปญหาการขนในเครองดมได (Moskowitz, 2000)

2

คอลลาเจนสามารถท าปฏกรยากบพอลแซกคาไรดและแทนนน สงผลใหคณลกษณะทางประสาทสมผสทางดานรสชาตของผลตภณฑลดลง เนองจากรสฝาดของแทนนน ทงนกฎหมายอาหารยงไมมขอจ ากดส าหรบการใชปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑอาหาร อยางไรกตามการเตมคอลลาเจนรอยละ 2-30 ในอาหารเหลวจะใหผลในดานลกษณะปรากฏทด เนองจากคณสมบตการเปนอมลซฟายเออร จงชวยลดปญหาการตกตะกอนในเครองดมได แตถาความเขมขนมากกวารอยละ 30 สงผลใหความหนดในเครองดมเพมสงขน สงผลเสยตอคณภาพของผลตภณฑ ดงนนการเตมคอลลาเจนในเครองดมสามารถเพมคณคาทางโภชนาการไดและชวยปรบปรงลกษณะปรากฏของเครองดมใหดขนได (Bilek และ Bayram, 2015) ดงนนเพอเปนการเพมความมนใจใหกบอตสาหกรรมผผลต และทส าคญผบรโภคไดรบขอมลทถกตอง นาเชอถอ และเปนประโยชนตอการพจารณาเลอกซอ จงจ าเปนตองมการตรวจวเคราะหคอลลาเจนในผลตภณฑอาหาร รวมทงในผลตภณฑเครองดมภาชนะบรรจปดสนท ไดแก เครองดมเพอสขภาพตางๆ ทก าลงไดรบความนยมอยางแพรหลาย ซงวธการทใชในการตรวจวเคราะหคอลลาเจนในปจจบน ไดแก การใชสเปกโทรโฟโตมเตอร หรอเทคนคทเรยกวา Colorimetric method (AOAC, 2000) และการใชเทคนคโครมาโตกราฟของเหลวสมรรถนะสง ชนดดดกลนแสงอลตราไวโอเลต (HPLC-FLD) (Dai และคณะ, 2014) แมวธการดงกลาวจะใหผลการวเคราะหทถกตองแมนย า แตตองใชเวลาในการเตรยมตวอยางมาก มคาใชจายของสารเคมและใชเครองมอทมราคาคอนขางสง ตองท าลายตวอยาง อกทงยงตองใชผทมความช านาญในการตรวจสอบ ดงนนการตรวจวเคราะหดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล (Near Infrared Spectroscopy, NIRS) จงเปนอกหนงทางเลอกทชวยลดปญหาดงกลาวไดในระยะยาว ในปจจบนมการศกษาการใชเทคนค NIRS ในการตรวจตดตามสารออกฤทธทางชวภาพ ไดแก Bai และคณะ (2014) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณแอนโทไซยานนในบลเบอรร 100 ตวอยาง พบวาเทคนคนมความสามารถในการท านายคาตางๆ ไดด เนองจากใหคาสมประสทธการตดสนใจ (coefficients of determination, R2 ) และคาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางทวนสอบสมการเทยบมาตรฐาน (standard error of prediction, SEP) อยในเกณฑทด โดยม R2 ในชวง 0.87-0.92 และ SEP ในชวง 20-25 มลลกรมตอ 100 กรม ตามล าดบ Liu และคณะ (2015) ใชเทคนค NIRS ในการควบคมคณภาพของใบแปะกวย เนองจากนยมใชเปนสวนผสมในสมนไพรจนและเปนสารปรงแตงในอาหารเพอสขภาพ พบวา เทคนค NIR สามารถท านายปรมาณฟลาโวนอลไกลโคไซด ใหคา R2 เทากบ 0.93 และม SEP เทากบ 9.01% นอกจากน Shi และคณะ (2012) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณฟลาโวนอยดทงหมดในใบแปะกวยสด จ านวน 120 ตวอยาง ทชวงเลขคลน 10000-4000 cm-1 พบวาใหคา R2 เทากบ 0.89 และ คาความคลาดเคลอนในการท านาย (root mean square error of prediction, RMSEP) เทากบ 3.0 มลลกรมตอกรม

3

Carames และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดและแอนโทไซยานนในน าองน พบวาใหคา RMSEP ต า เทากบ 4.44 มลลกรมตอ 100 มลลลตร เปนตน รวมถงมการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณกรดอะมโนและโปรตน ไดแก Gonzalez-Martin และคณะ (2009) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณกรดอะมโนไฮดรอกซโพรลนในไสกรอกหม และไสกรอกวว ซงกรดอะมโนไฮดรอกซโพรลน ถกใชเปนเกณฑในการประเมนปรมาณคอลลาเจน โดยสมการท านายทไดมคา R2 และ SEP เทากบ 0.772 และ 0.05% ตามล าดบ นอกจากน Ingle และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณโปรตนในเวยโปรตน จ านวน 20 ตวอยาง ซงมปรมาณโปรตนอยในชวง 22-90% วดตวอยางดวยระบบสะทอนกลบ พบพคการดดกลนท 8424 (C-H), 6684 (N-H), 5973 (C-H), 5737 (C-H), 5050 (N-H), 4866 (ROH หรอ N-H) และ 4614 (N-H) cm-1 และจะเหนพคการดดกลนทมากขนเมอมปรมาณโปรตนเพมขน ซงคณสมบตการดดกลนเหลานสอดคลองกบพนธะภายในโครงสรางโปรตน มคาความถกตองของสมการท านาย โดยใหคา R2 เทากบ 0.986 คาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางสรางสมการเทยบมาตรฐาน (Standard Error of Calibration, SEC) เทากบ 3%

จะเหนไดวาเทคนค NIRS มความเปนไปไดทจะใชในการตรวจสอบคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพแตยงไมมการศกษาในเรองน ซงผลจากการวจยนาจะเปนประโยชนและเปนความรใหมสทงภาควชาการและอตสาหกรรม

1.2 วตถประสงคของงานวจย

1) เพอศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน ทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา ทมความบรสทธรอยละ 95.10

2) เพอศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในสารละลายคอลลาเจน ทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา ทมความบรสทธรอยละ 95.10

3) เพอศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด

4

1.3 สมมตฐานของงานวจย

โครงสรางของคอลลาเจนประกอบดวยโมเลกล C, H, N และ O ซงมความจ าเพาะตอการดดกลนของรงส NIRS จงมความเปนไปไดทจะใชเทคนคน ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพได

1.4 ขอบเขตของงานวจย

1. การศกษานแบงการทดลองเปน 3 ขนตอน 1.1 ศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนใน

สารละลายคอลลาเจน ทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา ทมความบรสทธรอยละ 95.10 1.2 ศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหาร ไดแก น าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบน

โซเอท และ ซงคกลโคเนต ตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS ในสารละลายคอลลาเจน ทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา ทมความบรสทธรอยละ 95.10

1.3 ศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนใน ตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด 2. จ านวนตวอยางทศกษาในแตละขนตอน ไมนอยกวา 100 ตวอยาง เพอความแมนย าในการสราง สมการเทยบมาตรฐาน 3. วดสเปกตรมดวยเทคนค NIRS โดยควบคมอณหภมของตวอยางใหตรงกบทวางจ าหนาย ใน ภาคอตสาหกรรม (อณหภมหอง) ซงจะสามารถน าเทคนคนไปประยกตใชไดจรง โดยวดสเปกตรม ในชวงเลขคลน 12500-4000 cm-1 4. การศกษาขนตอนท 1.3 วธมาตรฐาน (reference method) ทใชในการวเคราะหปรมาณคอลลา เจน คอการใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงทตอกบตวตรวจวดสญญาณชนดฟลออ เรสเซนส (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) ดดแปลงจากวธของ Vazquez-Ortiz และคณะ (2005) 5. สรางแบบจ าลองทเหมาะสมในการท านายคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมน าผลไมเสรมคอลลา เจน โดยน าคาปรมาณคอลลาเจนทไดจากการวเคราะหดวยเทคนค HPLC และคาทไดจากการวด ดวยเทคนค NIRS มาวเคราะหผลโดยการสรางสมการท านาย และทวนสอบสมการท านายทสราง ขน ดวยวธ PLS ดวยโปรแกรม OPUS 7.2.139.1294 6. สรางแบบจ าลองทเหมาะสมในการท านายคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมน าผลไมเสรมคอลลา เจน โดยน าคาปรมาณคอลลาเจนทไดจากการวเคราะหดวยเทคนค HPLC และคาทไดจากการวด ดวยเทคนค NIRS มาวเคราะหผลโดยการสรางสมการท านาย และทวนสอบสมการท านายทสราง

5

ขน ดวยวธ Multiple Linear Regression (MLR) ดวยโปรแกรม the unscambler 7. คดเลอกความยาวคลนทเหมาะสมในการสรางสมการท านาย (select wavelength) จากกราฟ สมประสทธการถดถอย (regression coefficient)

6

บทท 2

เอกสารและงานวจยทเกยวของ

เครองดมเพอสขภาพเปนเครองดมทมการเตมสารทเปนประโยชนตอรางกายลงในผลตภณฑ เพอตอบสนองความตองการของผบรโภคในดานการปองกนโรค เชน โรคหวใจและหลอดเลอด โรคทางเดนอาหารและโรคกระดก นอกจากนยงรวมไปถง การมสขภาพด ความสวยงาม ควบคมน าหนก ชวยเผาผลาญไขมน รวมถงรสชาตและความสะดวกในการรบประทาน (Bilek และ Bayram, 2015) สวนผสมทน ามาเพมเตมลงในเครองดม ไดแก แอลกลตาไทโอน (L-glutathione) แอลคารนทน (L-carnitine) โคเอนไซมควเทน (co-enzyme Q10) ซอยเปปไทด (soy peptide) วตามนซ (vitamin C) และคอลลาเจน (collagen) เปนตน (สถาบนอาหาร กระทรวงอตสาหกรรม, 2556)

โดยขนตอนการผลตจะผสมสวนประกอบตางๆ ไดแก น าตาลซโครสหรอสารใหความหวาน ซงคกลโคเนต วตามนซ และโซเดยมเบนโซเอท ใหเปนเนอเดยวกน จากนนน าไปใหความรอนทอณหภม 60 องศาเซลเซยส กอนบรรจลงขวด และท าการพาสเจอรไรสท 95 องศาเซลเซยส ดวยหมอตมแบบใชไอน า (steam jacket mixing) (Bilek และ Bayram, 2015)

สวนประกอบดงกลาวเปนสวนทมการเตมลงในอตสาหกรรมเครองดม โดยกรดเปนสวนประกอบส าคญอยางหนงของเครองดม มหนาทส าคญ ไดแก ใหรสขนและเปรยว กระตนใหเกดความพอใจในการรบรส ชวยเพมความหวานของน าตาล และเปนตวชวยเสรมการถนอมรกษาเครองดม การใชกรดในเครองดมคอนขางสะดวก ปรมาณทใชไมมากนก โดยกรดทนยมผสมในเครองดม ไดแก วตามนซหรอวตามนซ แสดงโครงสรางดงภาพท 1 นอกจากนยงท าหนาทปองกนและระงบการเกดออกซเดชน ดงนนจะชวยท าใหกลนรสของเครองดมคงตวอยไดนาน แมวาวตามนซ จะชวยรกษาในดานคณคาของเครองดมแตจะไมชวยเสรมส กลน และรสของเครองดม (Rodriguez-Bernaldo และคณะ , 2009) ปรมาณทแนะน าใหบร โภคตอวนคอ 100–200 มลลกรมตอวน (Malegori และคณะ, 2016)

7

ภาพท 1 โครงสรางของวตามนซ ทมา: Liu และคณะ (2006)

นอกจากนมการเตมโซเดยมเบนโซเอทซงเปนสารกนเสยในเครองดม แสดงโครงสรางดงภาพท 2 ปรมาณทใชอยในชวง 100-1,000 มลลกรมตอลตร ซงเปนปรมาณทมการอนญาตใหเตมกนทางการคา ซงการใชโซเดยมเบนโซเอททความเขมขนต ามผลยบยงการเจรญของยสต รา และแบคทเรย แตถาเตมในปรมาณทมากเกนไปจะมผลอยางมนยส าคญตอกลนและรสชาตของเครองดม โดยเฉพาะในน าผลไม และมการเตมซงคกลโคเนต แสดงโครงสรางดงภาพท 3 ซงเปนตวชวยควบคมใหกระบวนการตางๆ ในรางกายด าเนนไปไดอยางมประสทธภาพ และคอยชวยซอมบ ารงระบบเอนไซมและเซลลตางๆ (Mareta และ Sandstead, 2006) โดยมปรมาณทอนญาตใหใชไดคอ 15 มลลกรมตอวน (ส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา, 2549)

ภาพท 2 โครงสรางของโซเดยมเบนโซเอท ทมา: Zhang และ Ma (2013)

กรดเบนโซอกและเกลอเบนโซเอท มประสทธภาพสงทสดทชวงความเปน กรด-ดาง 2.5-4.0 และมประสทธภาพสงในรปของกรดทไมแตกตวจงเหมาะทจะใชกบผลตภณฑอาหารทมความเปนกรดสงหรอมความเปนกรด-ดางต า ตวอยางเชน เครองดมชนดตางๆ น าผลไม และน าหวาน (วรยา, 2552)

8

ภาพท 3 โครงสรางของซงคกลโคเนต ทมา: Mareta และ Sandstead (2006)

น าตาลเปนองคประกอบของเครองดมทมความส าคญมาก นอกจากจะเปนสารใหความหวาน ใหรสชาตแกเครองดมแลว ยงท าใหเกดสมดลของรสชาตอนๆ ทมในเครองดมอยางเชน รสเปรยว เคม และขม นอกจากนยงเปนสารใหความหนด ใหน าหนก และในระดบความเขมขนสงขนถงระดบหนง น าตาลยงท าหนาทระงบการเจรญของเชอจลนทรยโดยแรงออสโมตกอกดวย โดยน าตาลซโครสเปนน าตาลทใชกนมากและแพรหลายทสดในอตสาหกรรมอาหารทวๆ ไป ซงสวนมากไดมาจากออยและหวบท เปนผลตภณฑทบรสทธรอยละ 99.8 (Lu และคณะ, 2017) แสดงโครงสรางดงภาพท 4 ภาพท 4 โครงสรางของน าตาลซโครส ทมา: Momeni และคณะ (2017)

9

2.1 คอลลาเจน

2.1.1 โครงสรางของคอลลาเจน คอลลาเจนเปนกลมของโปรตนทมองคประกอบหนวยยอยคอกรดอะมโน ทเรยงตอกนดวย

พนธะเปปไทด (peptide bond) คอลลาเจนเปนสายโพลเปปไทด 3 เสนพนกน (triple helix) โดยจะหมนเปนเกลยววนขวา (right-hand helix) ดงภาพท 5 และจะมพนธะไฮโดรเจนเชอมระหวางสายโพลเปปไทดแตละเสน (Zhou และคณะ, 2016; Pal และ Suresh, 2016; Pal และคณะ, 2015; Gómez-Guillén และคณะ, 2011) โดยภายในสายโพลเปปไทดแตละสายเกดจากการรวมกนของกรดอะมโน (G-X-Y)n โดย G คอ ไกลซน (Glycine: Gly) เปนองคประกอบรอยละ 33 X คอโพรลน (Proline: Pro) ประมาณรอยละ 10 และ Y คอไฮดรอกซโพรลน (Hydroxyproline: Hyp) มประมาณรอยละ 14 (Lin และ Kuan, 2010; Shoulders และ Raines, 2009; Gelse และคณะ, 2003) โดย ไฮดรอกซโพรลนเปนโพรลนทมการเตมหมไฮดรอกซล (-OH) ซงอาศยเอนไซมและโคแฟคเตอร คอวตามนซ (ascorbic acid) เปนตวชวยใหเกดปฏกรยาในกระบวนการสรางคอลลาเจนไฟเบอร ซงคอลลาเจนเปนโปรตนชนดเดยวทอดมไปดวยไฮดรอกซโพรลน มมากถงรอยละ 14 ของคอลลาเจนในสตวเลยงลกดวยนม และไฮดรอกซโพรลนเองจะไมพบในโปรตนชนดอนๆ ดงนนไฮดรอกซโพรลนจงมกเปนตวบงชปรมาณคอลลาเจนในตวอยางอาหาร (Lareu และคณะ, 2010)

ภาพท 5 โครงสรางของโมเลกลคอลลาเจนทเปนเสนใย (fibrillar collagen) ทมา: Gelse และคณะ (2003)

คอลลาเจนเปนโปรตนหลกทพบประมาณรอยละ 30 ในสตวมกระดกสนหลง (Liu และคณะ, 2015; Lin และ Kuan, 2010; Chen และคณะ, 2016; Pal และ Suresh, 2016) โดยพบวาปจจบนคอลลาเจนถกแบงออกเปน 29 ชนด (Liu และคณะ, 2012; Hu และคณะ, 2016; Shoulders และ

Triple helix N-propeptide C-propeptide

telopeptide (non-helical)

telopeptide (non-helical)

N-procollagenase C-procollagenase

10

Raines, 2009; Kozlowska และคณะ, 2015) ไดแก คอลลาเจนชนดท 1 2 3 5 และ 11 เปนคอลลาเจนเสนใย คอลลาเจนชนดท 4 เปนเยอคอลลาเจนทประกอบไปดวยเสนใยคอลลาเจนบางๆ และโพลแซคคาไรดพบไดในเนอเยอบผว สวนคอลลาเจนชนดท 6 เปนคอลลาเจนไมโครไฟเบอร พบไดในกระดกออน รก ปอด และผนงหลอดเลอด เปนตน แตชนดของคอลลาเจนทพบมากทสด คอคอลลาเจนชนดท 1 และคอลลาเจนชนดท 3 พบไดในกระดก ผวหนงชนนอกสด เอนกลามเนอและผนงหลอดเลอด (Gelse และคณะ, 2003; Nagai และคณะ, 2008) สามารถน าไปใชประโยชนไดอยางกวางขวาง เชน อตสาหกรรมอาหาร ผลตภณฑอาหารเสรมเพอสขภาพ อตสาหกรรมยา และการใชประโยชนทางการแพทย (Kozlowska และคณะ, 2015; Gómez-Guillén และคณะ, 2011; Liang และคณะ, 2014a; Pal และคณะ, 2015)

โดยมการศกษาประโยชนของคอลลาเจนทางดานอตสาหกรรมยาและทางการแพทยพบวาการรบประทานคอลลาเจนปรมาณ 10 กรมตอวน ชวยลดอาการปวดขอได (Moskowitz, 2000; Benito-Ruiz และคณะ, 2009; Walrand และคณะ, 2008) สามารถลดรวรอยเหยวยน (Tanaka และคณะ, 2009) และปรบปรงผวใหดขน (Zague, 2008) นอกจากนชวยปรบปรงกระบวนการเมทาบอลซมของกระดกได (Guillerminet และคณะ, 2010; Koyama และคณะ, 2001) ลดอาการปวดในผปวยโรคขอเขาและขอสะโพกเสอม และปองกนโรคกระดกพรน (Bonjour, 2005)

นอกจากนมการศกษาประโยชนการใชคอลลาเจนในอตสาหกรรมอาหารและผลตภณฑอาหารเสรมเพอสขภาพ พบวา การใชคอลลาเจน ทมน าหนกโมเลกลต าจะชวยปองกนการตกตะกอนและปญหาการขนในเครองดมได (Moskowitz, 2000) ทงนกฎหมายอาหารยงไมมขอจ ากดส าหรบการใชปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑอาหาร อยางไรกตามการเตมคอลลาเจนมากกวารอยละ 30 สงผลใหความหนดในเครองดมเพมสงขน (Bilek และ Bayram, 2015)

2.1.2 วตถดบทใชในการสกดคอลลาเจน วตถดบทใชในการสกดคอลลาเจนมความหลากหลาย ซงวตถดบทใชสวนใหญ คอ หนงและ

กระดกจากวว สกร และสตวปก แตในระยะเวลาหลายปทผานมามการระบาดของโรคววบา โรคปากและเทาเปอย นอกจากนยงมโรคไขหวดนกทระบาดในสตวปก และคอลลาเจนจากหมไมสามารถใชเปนสวนประกอบของอาหารส าหรบผบรโภคบางศาสนาได (Liu และคณะ, 2015) จงมการหาแหลงวตถดบตางๆ อกมากมายทสามารถน ามาผลตคอลลาเจนได โดยเฉพาะสตวน า ซงเปนแหลงของคอลลาเจนทนาสนใจ เชน หนงปลาสด กระเพาะปลา ครบ เกลดและกางปลา ซงมปรมาณคอลลาเจนอยสง (Niu และคณะ, 2013; Yang และคณะ, 2007) ดงนนผลตผลพลอยได (by-product) จาก

11

อตสาหกรรมแปรรปสตวน า จงสามารถใชเปนทางเลอกใหมส าหรบการสกดคอลลาเจนได (Kittiphattanabawon และคณะ, 2005; Kozlowska และคณะ, 2015)

2.1.3 วธทใชในการสกดคอลลาเจน การสกดคอลลาเจนสามารถท าไดหลายวธ ซงโดยทวไปแลวจะเรมตนจากการน าหนงสตว

กระดกสตว หรอเกลดปลา มาลางท าความสะอาด ลดขนาด จากนนก าจดโปรตนบรเวณผวหนา และก าจดสวนอนๆ ทไมใชโปรตนคอลลาเจน เชน แคลเซยม ไขมน เมดส เปนตน แลวจงท าใหคอลลาเจนทมอยละลายออกมา ดวยวธตางๆ เชน การใชเกลอ กรด เอนไซมรวมกบกรด และเทคนคอลตราซาวด เปนตน

การสกดคอลลาเจนโดยใชเกลอ เชน โซเดยมคลอไรด (0.15-2 M) ซงวธนไมคอยไดรบความนยมในการสกดคอลลาเจน โดย Liang และคณะ (2014b) และ Wang และคณะ (2014b) สกดคอลลาเจนจากหนงและกระดกออนปลาสเตอรเจยนดวยโซเดยมคลอไรด 0.45 M อตราสวน 1 ตอ100 (มวลตอปรมาตร) เปนเวลา 24 ชวโมง กวนเบาๆ อยางตอเนอง

การสกดคอลลาเจนโดยการใชกรด เชน กรดอะซตก 0.5 M นอกจากนสามารถใชกรดอนทรย (organic acid) ไดแก กรดคลอโรอะซตก (chloroacetic acid) กรดซตรก (citric acid) และกรดแลคตก (lactic acid) หรอกรดอนนทรย (inorganic acid) ไดแก กรดไฮโดรคลอรก (hydrochloric acid) ซงการสกดโดยการใชกรดเปนทนยม เนองจากใหประสทธภาพในการสกดทดกวาการใชเกลอ (Kittiphattanabawon และคณะ, 2005) มหลายงานวจยทสกดคอลลาเจนจากผลตผลพลอยได โดยใชกรดอะซตก ไดแก หนงปลา (Pal และคณะ, 2015; Wang และคณะ, 2014a; 2014b; 2014c) เกลด (Chuaychan และคณะ, 2015; Matmaroh และคณะ, 2011) กระเพาะปลา (Wu และคณะ, 2016) กระดกออน (Liang และคณะ, 2014a; 2014b) กระดก (Duan และคณะ, 2009) ครบ (Mahboob, 2015) และหวปลา (Jeevithan และคณะ, 2015) โดยจะสกดทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48 ชวโมง

การสกดคอลลาเจนโดยใชเอนไซมทสภาวะความเปนกรด (pH 2-3) (Liu และคณะ, 2015) ซงการสกดโดยการใชเอนไซมทสภาวะความเปนกรดจะไดคอลลาเจนทมขนาดโมเลกลเลกกวาการสกดโดยใชกรดเพยงอยางเดยวและสามารถเพมผลตอบแทนของการสกดได ซงเอนไซมทนยมใช ไดแก เปปซน (pepsin) ทรปซน (trypsin) และคอลลาจเนส (collagenase)

12

นอกจากนมการใชเทคนคอลตราซาวดท 20 กโลเฮรทซ (kHz) และแอมพลจด (amplitude) ทใชรอยละ 20-80 เพอใชในการปรบปรงอตราผลตอบแทนของการสกด (Kim และคณะ, 2013; Ran และ Wang, 2014; Yang และคณะ, 2013) ในการสกดโดยใชอลตราซาวดจะตองแชตวอยางในกรดอะซตกเปนเวลา 12 ชวโมง จากนนถกสกดดวยอลตราโซนค ซงอตราผลตอบแทนของคอลลาเจนขนอยกบแอมพลจดและระยะเวลาในการอลตราโซนค (Pal และ Suresh, 2016)

จากนนจงน าไปตกตะกอนโดยใชเกลอทความเขมขนตางๆ ท าใหแหง และลดขนาดเพอท าเปนผง (Wolf และคณะ, 2009)

2.1.4 วธการวเคราะหปรมาณคอลลาเจน วธการตรวจวดปรมาณคอลลาเจนโดยทวไปใชเทคนคสเปกโทรสโกป อาศยการวดปรมาณ

ของไฮดรอกซโพรลนซงสตรโครงสรางแสดงดงภาพท 6 (Colgrave และคณะ, 2008) เนองจากคอลลาเจนมองคประกอบของกรดอะมโนไฮดรอกซโพรลนในปรมาณสงแตกตางจากโปรตนสวนอนๆ โดยการท าปฏกรยาออกซเดชน (oxidation) เปลยนรปไฮดรอกซโพรลนเปน Pyrrole-2- carboxylic acid (Hofman และคณะ, 2011) และ ใช p-dimethylaminobenzaldehyde (DMBA) เปนตวตดฉลากกรดอะมโนทสนใจ ซงจะสามารถตรวจวดปรมาณของสทเกดขนไดดวยเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร ทความยาวคลน 550 นาโนเมตร ซงจะคลายกบการวเคราะหหาปรมาณไฮดรอกซโพรลนทเปนทยอมรบตามมาตรฐานสากล ปจจบน คอ AOAC (2000) ซงเปนการวเคราะหปรมาณคอลลาเจนเฉพาะในเนอสตวและผลตภณฑเนอสตว ซงจะตองยอยตวอยางคอลลาเจนใหอยในรปกรดอะมโน ดวยกรดไฮโดรคลอรกเขมขนหรอซลฟรกเขมขน ทอณหภม 105 องศาเซลเซยสเปนระยะเวลา 16 ชวโมง น าไปท าปฏกรยากบสารคลอรามนท (chloramine-T) จะไดสารผลตภณฑทมสมวงแดง จากนนวดปรมาณสทเกดขนดวยเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร ทความยาวคลน 560 นาโนเมตร เพอวเคราะหหาปรมาณไฮดรอกซโพรลน จากนนจงน าไปค านวณเปนปรมาณสารคอลลาเจนตอไป ซงเรยกเทคนคนวา colorimetric method แตวธการนยงมขอจ ากดดานเวลาในการเตรยมตวอยางตองใชเวลานานและการควบคมสภาวะในการเกดปฏกรยาออกซเดชนใหคงทเปนไปไดยาก

นอกจากน Vazquez-Ortiz และคณะ (2005) วเคราะหปรมาณคอลลาเจน โดยการยอยคอลลาเจนดวยกรด ตามวธของ AOAC (2000) และ Sobral และคณะ (2001) และท าใหกรดอะมโนเกดปฏกรยาอนพนธหรอ derivatization แบบ pre-column ดวย 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (NBD-Cl) ซงสามารถแยกโดยใชโครมาโทกราฟแบบผนกลบดวยคอลมน C18 และตรวจวด ดวยตวตรวจวดสญญาณชนดฟลออเรสเซนส (fluorescence detector) โดยมความยาวคลนทใหพลงงานกบสารหรอ excitation เทากบ 465 นาโนเมตร และความยาวคลนทสารดดกลนหรอ emission

13

เทากบ 535 นาโนเมตร โดยโครมาโตแกรมของผลการวเคราะห 4-ไฮดรอกซโพรลน โดยใช NBD-Cl ในการเตรยมอนพนธแสดงดงภาพท 7 ภาพท 6 สตรโครงสรางของไฮดรอกซโพรลน ทมา Afara และคณะ (2013)

ภาพท 7 โครมาโตแกรมผลการวเคราะห 4-ไฮดรอกซโพรลน โดยใช NBD-Cl ในการเตรยมอนพนธ ทมา Vazquez-Ortiz และคณะ (2005)

4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (NBD-Cl) เปนสารทรจกกนแพรหลายในการท าอนพนธกบสารทในโครงสรางมหมเอมน (amine group) มสตรโครงสรางแสดงดงภาพท 8 ซงมความสามารถในการท าปฏกรยากบหมเอมนปฐมภม (primary amine) และหมเอมนทตยภม (secondary amine) ทกอใหเกดผลตภณฑเรองแสงทมความคงตว (Annenkov และคณะ, 2015; Maroulis และคณะ, 2008)

14

ภาพท 8 สตรโครงสรางทางเคมของ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (NBD-Cl) ทมา: Annenkov และคณะ (2015)

โดยกลไกการเกดปฏกรยาระหวางไฮดรอกซโพรลนกบ NBD-Cl ใชปฏกรยาแทนทแบบนวคล

โอฟลก (nucleophilic substitution) ในสภาวะเบส ไดอนพนธทมสเหลอง โครงสรางทางเคมสามารถเรองแสงได เนองจากโครงสรางของอนพนธทเกดขนมลกษณะเปนวงแหวนอะโรมาตก (aromatic rings) และในโครงสรางไมมหมฮาโลเจน (halogen) ซงมความวองไวตอการเกดปฏกรยาเคมสง

การเกดปฏกรยาระหวางไฮดรอกซโพรลนกบ NBD-Cl แสดงดงภาพท 9 เกดจากอะตอมของไนโตรเจนในหมเอมนของไฮดรอกซโพรลนมสภาพขวเปนลบและมความวองไวในการเกดปฏกรยา สามารถเกดปฏกรยากบคารบอนต าแหนงท 4 ในโครงสรางของ NBD-Cl ซงมความชอบประจลบ (electrophile) จากนนอะตอมคลอรนทตออยกบคารบอนต าแหนงท 4 หลดออกไป เรยกหมนวา หมหลดออก (leaving group) ซงอนพนธทไดสามารถเกดการเรองแสงได

+ ภาพท 9 ปฏกรยาการเกดอนพนธระหวางไฮดรอกซโพรลนกบ NBD-Cl ทมา: Maroulis และคณะ (2008)

-HCl

60°C

Hydroxyproline NBD-Cl

Fluorogenic product

15

2.2 การผลตเครองดมเสรมคอลลาเจน

ผลตภณฑเครองดมประเภทน าผลไมไดรบความนยมจากผบรโภคเปนอยางมาก เนองจากน าผลไมประกอบดวยวตามน และสวนประกอบตางๆ ทเปนประโยชนตอสขภาพ ซงน าผลไมทผบรโภคนยม ไดแก น าสม น าผกรวม น าแอปเปล และน าองน เปนตน นอกจากน มน าสตรอวเบอรรและน าทบทม ทมฤทธในการตานสารอนมลอสระ (Arend และคณะ, 2017; Aaby และคณะ, 2012; Scalzo และคณะ, 2005) มฤทธตานการอกเสบ ปองกนสารกอมะเรง มฤทธยบยงการกลายพนธ ชวยปกปองระบบหวใจและหลอดเลอด ชวยปกปองระบบประสาทสวนกลางและลดเบาหวานชนดท 2 (Beaulieu แ ละ Obando-Ulloa, 2 0 1 7 ; Basu แ ละ Penugonda, 2 0 0 9 ; Del Rio แ ละ คณะ , 2 0 1 3 ; Johanningsmeier และ Harris, 2011)

นอกจากนผลตภณฑเครองดมประเภทน าผลไมยงมการเตมสารทเปนประโยชนตอรางกาย เชน คอลลาเจน ลงในผลตภณฑในดานการปองกนโรคและบ ารงผวพรรณ เปนตน โดยกระบวนการผลตน าผลไมเสรมคอลลาเจน มกระบวนการผลตเรมจากวตถดบหลก คอน าผลไมเขมขน สวนมากจะน าเขาจากตางประเทศ ผานการแชแขงทอณหภม -10 องศาเซลเซยส ในหองเยนเปนเวลา 3 เดอน เมอจะท าการผลต จะน าน าผลไมแชแขงมาละลายทอณหภมหอง กอนน าไปผสมกบสวนผสมแหง จากนนสวนผสมจะถกแยกละลายในถงผสมขนาดเลก กอนสงไปยงถงผสมไฟฟาขนาดใหญ สวนผสมตางๆ จะถกผสมใหเปนเนอเดยวกนกบน ากรองและน าเชอมเปนเวลา 30 นาท หลงจากนนจงเตม ส กลน รส และสวนประกอบอนๆ เชน คอลลาเจน แลวจงเขาสระบบพาสเจอไรซ เพอท าลายจลนทรยกอโรคทอณหภมระหวาง 92-105 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15-30 วนาท จากนนบรรจรอนทอณหภม 82-84 องศาเซลเซยส ลงขวดพลาสตกใส (Poly Ethylene Terephthalate, PET) (Spinelli และคณะ, 2010; Manfredi และ Vignali, 2015) และถกท าใหเยนทนท เพอปองกนการไหมของน าตาล และการสลายตวของส วตามน และคอลลาเจน โดยเฉพาะคอลลาเจน สามารถสลายตวได เนองจากสายโพลเปปไทด 3 เสนพนกน (triple helix) ของโครงสรางคอลลาเจนไมคงตวตอความรอน เมอโครงสรางนถกความรอน ความรอนจะไปท าลายพนธะไฮโดรเจน (hydrogen bond) ระหวางสายโพลเปปไทด และถาความรอนนนสงมากๆ จะสงผลใหเกดการแตกหกของพนธะเปปไทดทท าหนาทเชอมกรดอะมโนในโปรตน (Wu และคณะ, 2017; Usha และ Ramasami, 2004; Privalov และ Tiktopulo, 1970) นอกจากน ปรมาณกรดอะมโนไฮดรอกซโพรลนกสงผลตอความคงตวตอความรอนของโครงสรางคอลลาเจนเชนกน เนองมาจากการเชอมตอของโมเลกลน าระหวางหมไฮดรอกซล (hydroxyl group, -OH) และหมคารบอนล (carbonyl group, -C=O-) ในสายโซหลก (Nagai และคณะ, 2008) จากนนจงตดฉลาก ยงวนท บรรจลงกลอง และเกบในโกดงผลตภณฑส าเรจรปทอณหภมหอง (Rahim และ Raman, 2015) แสดงดงภาพท 10

16

ภาพท 10 กระบวนการผลตน าผลไม ทมา: Rahim และ Raman (2015)

พาสเจอไรซ อณหภม 92-105 ºC เวลา 15-30 วนาท

น ารอนอณหภม 75ºC ใชเวลาผสม 30 นาท กรอง

น าผลไมเขมขน น ากรอง

preheat

วตถดบ

ผสมของแหง

กรอง

บรรจรอน อณหภม 90±2 ºC ขวด/ฝา

สวมฉลาก/ยงวนท

บรรจกลอง/เรยงลงพาเลท

เกบในโกดงผลตภณฑส าเรจรป

เปาแหง/ Lamp checking

ท าใหเยน อณหภม 38±2 ºC เวลา 7-9 นาท

คว าขวดเพอฆาเชอคอขวด

ถงผสม กลน คอลลาเจนผง

17

2.3 เทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล เทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล (Near Infrared Spectroscopy, NIRS) เปน

วธการวดและวเคราะหรงสคลนแมเหลกไฟฟาในชวงความยาวคลนระหวาง 800-2500 นาโนเมตร (12500-4000 cm-1) เปนเทคนคทใชว เคราะหสารไดทงเชงปรมาณและเชงคณภาพ สามารถประยกตใชไดตงแตการตรวจสอบคณภาพวตถดบไปจนถงการตรวจสอบและปรบปรงคณภาพของผลตภณฑทได โดยใชเทคนคทางคณตศาสตรรวมกบวธการทางเคมกบโปรแกรมคอมพวเตอรในการวเคราะหสารทสนใจ (Huang และคณะ, 2008) โดยอาศยการสรางความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงจากการวดดวยเครอง NIRS กบการปรมาณองคประกอบดวยวธมาตรฐาน (reference or standard method) ทแสดงผลในรปแบบกราฟทเรยกวา สเปกตรม โดย NIRS มขอไดเปรยบหลายประการ ไดแก เปนวธทดสอบทไมท าลายตวอยาง รวมทงวธการเตรยมตวอยางไมยงยากและใชตวอยางในปรมาณนอย ประหยดระยะเวลา เชอถอไดและปลอดภย ใชทดแทนการวเคราะหทางเคมไดในระยะยาว สามารถลดตนทนการผลตได อกทงยงไมใชสารเคมในการเตรยมตวอยาง ดงนนจงเปนมตรตอสงแวดลอม ในการวเคราะหแตละครงสามารถน ามาวเคราะหเพอท านายคาตางๆไดหลายคาในเวลาเดยวกน อกทงยงสามารถคดแยกสนคาใหมคณภาพสง เพอสรางมาตรฐานสนคาทางการเกษตรใหสงขนได (Osborne, 2007; Liu และคณะ, 2011; Pasquini, 2003; Xiaowei และคณะ, 2014)

เทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล อาศยการตรวจวดปรมาณแสงทถกดดกลนในพนธะของโมเลกลสารตวอยาง โดยเมอแสงสองผานเขาไปยงตวอยางไมวาจะเปนสารละลายหรอวตถ สารจะเกดการดดกลนแสงในชวงอนฟราเรดยานใกล ท าใหโมเลกลของสารเกดการสนทความถสงในการสนของพนธะตางๆ เชน O-H, C-H, N-H และ C=H เปนตน ซงเปนโมเลกลหลกของสารอนทรย โดยการสนนนจะเกดขนทชวงความยาวคลนแตกตางกนไป ซงเปนคาเฉพาะของแตละหมฟงกชน ดงนนเมอโมเลกลไดรบรงสอนฟราเรดทมความยาวคลนตรงกบพนธะในโมเลกลจะเกดการสนและดดกลนรงสไว ท าใหมพลงงานมากกวาปกต จากเดมทโมเลกลอยในสภาวะพน (vibration groung state) เมอไดรบพลงงานเพมมากขนจะอยในสภาวะกระตนแบบขามขน (Excited vibration level) อยางไรกตามเมอโมเลกลกลบสสภาวะพนกจะปลอยพลงงานทรบเพมเขาไปออกมาในรปพลงงานความรอน ซงปรมาณการดดกลนพลงงานแสงจะเปนไปตามกฎของเบยร -แลมเบรต (Beer– Lambert) พลงงานของคลนแสงเมอผานเขาไปในตวอยางจะถกดดกลนไวโดยองคประกอบทางเคมในตวอยาง ความเขมขนของแสงทผานออกมาโดยทวไปจะเปนสดสวนกบจ านวนหรอปรมาณขององคประกอบทางเคมนน ทมอยในตวอยาง (Nicolaï และคณะ, 2007) ดวยเหตนจงท าใหเทคนค NIRS สามารถวเคราะหสารประกอบอนทรยทมหม C, H, O และ N เปนองคประกอบได

18

โดยภาพท 11 แสดงสวนประกอบของระบบ NIRS ประกอบไปดวยแหลงก าเนดแสง (light source) ทเปนหลอดทงสเตนฮาโลเจน (tungsten halogen Lamp) มความยาวคลนในชวง 800-2500 นาโนเมตร จากนนแสงจะเดนทางไปยง Beam Splitter เพอแยกแสงออกเปน 2 ทศทาง โดยล าแสงทงสองทศทางจะเกดการสะทอนภายในกระจก 3 ชน ทเรยกวา cube-corner mirror ซงเคลอบดวย เทลลเลยม ไดออกไซด (TeO2) และการสะทอนดงกลาวจะท าใหเกดการแทรกสอดของแสง จากนนแสงทงสองทศทางจะมารวมตวกนแลวเขาสตวอยาง ซงบรเวณทวดตวอยางจะมอปกรณทเรยกวา Integrating Sphere ซงท าหนาทรวบรวมแสงทออกมาจากตวอยาง แลวเขาสตวตรวจวดสญญาณ (detector) โดยเครอง MPA จะมตวตรวจวดสญญาณ 2 ตว ตวแรกเปนตวตรวจวดสญญาณชนด Indium Gallium Arsenide (InGaAs) เหมาะส าหรบของเหลว และตวตรวจวดสญญาณชนด Lead sulphide (PbS) เหมาะส าหรบของแขง จากนนจะเขาสคอมพวเตอรทมโปรแกรมรองรบตอไป

ภาพท 11 สวนประกอบของระบบ FT-NIR (รน MPA S/N2197, Bruker Germany) ทมา: Simon และคณะ (1994)

โดยรงส NIR ในชวงความยาวคลน 12500-9090 cm-1 เปนชวงคลนสนซงมพลงงานสงสามารถทะลทะลวงเขาไปในตวอยางได 5-10 มลลเมตร และชวงความยาวคลน 9090-4000 cm-1

แหลงก าเนดแสง

Beam Splitter

Fixed mirror

Fixed mirror

cube

-corn

er m

irror

cube-corner mirror

19

เปนชวงคลนยาวจะมพลงงานต ากวาสามารถทะลทะลวงตวอยางได 1-3 มลลเมตร (Nicolaï และคณะ, 2007) ระบบการวดดวยเทคนค NIRS ทนยมใชกนในปจจบนม 4 แบบ ไดแก แบบสองผาน (transmittance) แบบสะทอนกลบ (reflectance) แบบสองผานสะทอนกลบ (transflectance) และแบบอนเตอรแอกแทนซ (Interactance) (Pasquini, 2003; Reich, 2005)

ส าหรบพคของการดดกลนแสงในชวง NIR นน มกจะมลกษณะเปนพคทกวางเตย (broad bands) และมลกษณะพคเหลอมซอนกน (overlapping peaks) หรออาจจะเรยกวาเปนแถบของการดดกลนแสง (absorption band) เนองจากเกดการรวมตวกนแบบโอเวอรโทนและสเปกตรมเกดการรวมกนของการสนทมรปแบบตางกน (combination) หรอการทพคของการดดกลนแสงหลายอนรวมกนแบบพหคณ (multiple of bands) ซงท าใหสเปกตรมทไดยากตอการวเคราะห (Nicolaï และคณะ, 2007)

ดงนนจงมการใชเทคนคทางคณตศาสตรรวมกบวธการทางเคม (chemometrics) เปนการใชการวเคราะหความถดถอยรวมกบการปรบแตงสเปกตรม (pretreatment) กอนการวเคราะห เพอก าจดอทธพลทหลงเหลออยท าใหคาสเปกตรมทไดเปลยนแปลงไป ไดแก วธการปรบแกการกระเจงแบบผลคณ (multiplicative scatter correction, MSC) และ วธการปรบความแปรปรวนใหเปนมาตรฐานและการปรบแนวโนม (Standard Normal Variate; SNV และ Detranding) สามารถลดหรอก าจดอทธพลของการกระเจงของแสงทเกดจากการยกตวของเสนสเปกตรมทงเสน (baseline offsets) และใช NIRS แบบวดการสะทอนกลบของแสง (diffuse reflectance) (Reich, 2005; Cen และ He, 2007)

นอกจากนวธการหาคาอนพนธ (derivative) สามารถแกปญหาพคทมฐานกวางเนองจากการซอนทบกนของพคและอทธพลจากการยกตวของเสนสเปกตรม (baseline shift) ทเกดจากการกระเจงแสง (scattering light) ซงท าใหสเปกตรมเบยงเบนไป ทงนมสาเหตมาจากขนาดของตวอยางไมสม าเสมอและการกระจายตวของตวอยาง หรอการใชวธการหาคาอนพนธ (derivative) รวมกบการปรบเรยบ (smoothing) เพอก าจดสญญารบกวนออกจากสเปกตรม (Cen และ He, 2007)

จากนนสเปกตรมทไดจากการบนทกดวยเครอง NIRS ภายหลงจากปรบแตงสเปกตรมแลว กบองคประกอบในตวอยางทวเคราะหดวยวธมาตรฐานจะถกน ามาสรางความสมพนธ ดวยการวเคราะหถดถอยแบบหลายตวแปร (multivariate regression) ซงวธการวเคราะหเชงปรมาณทนยมมากทสดในการวเคราะห NIR ปจจบน คอการถดถอยก าลงสองนอยทสดบางสวน (Partial Least Square Regression; PLSR) และการถดถอยโดยใชองคประกอบหลก (Principle Component Regression; PCR) เพอสรางเปนแบบจ าลองเทยบมาตรฐาน (Calibration set) และตรวจสอบความแมนย าของสมการมาตรฐานทสรางขน (Validation set) ดวยการทดสอบแบบภายนอก (external

20

validation) เมอไดสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะสมทสดแลว จะประเมนความสามารถของสมการเทยบมาตรฐาน โดยอธบายไดจากคาทางสถต R หรอ R2 และคา RPD ซงเปนสดสวนระหวางคาเบยงเบนมาตรฐานของคาทางเคมและคา SEP ของตวอยางในกลมทดสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐาน แสดงดงตารางท 1 และตารางท 2 ตารางท 1 แนวทางการอธบายความสามารถของสมการเทยบมาตรฐานดวยคาสมประสทธสหสมพนธ

(coefficient of correction, R) หรอคาสมประสทธการตดสนใจ (coefficient of determination, R2)

R R2 ประสทธภาพของสมการท านาย ± 0.5 0.25 ไมควรใชในการท านาย

± 0.51-0.70 0.26-0.49 ความสมพนธไมดพอ ± 0.71-0.80 0.50-0.64 สามารถใชคดเลอกเบองตนได ± 0.81-0.90 0.65-0.81 สามารถใชในการคดเลอกหรอประมาณคาเบองตน ± 0.91-0.95 0.82-0.90 สามารถใชตรวจคณภาพได ± 0.96-0.98 0.92-0.96 สามารถใชในงานประกนคณภาพได ± 0.99 ขนไป 0.98 ขนไป สามารถใชไดกบทกงาน

ทมา: William (2007) ตารางท 2 แนวทางการอธบายความสามารถของสมการเทยบมาตรฐานดวยคาสดสวนระหวางคา

เบยงเบนมาตรฐานของคาทางเคมและคาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลม ตวอยางทใชในการตรวจสอบสมการ (standard error of prediction, SEP) (RPD)

คา RPD การคดแยกกลมตวอยาง การประยกตใชเพอวเคราะหเชงปรมาณ 0.0-2.3 แยมาก (very poor) ไมแนะน าใหใช (not recommended) 2.4-3.0 ไมดพอ (poor) การแบงระดบปรมาณอยางหยาบ (very rough

screening) 3.1-4.9 ปานกลาง (fair) การแบงระดบปรมาณ (screening) 5.0-6.4 ด (good) การควบคมคณภาพ (quality control) 6.5-8.0 ดมาก (very good) การควบคมกระบวนการ (process control) 8.1 -ขนไป ยอดเยยม (excellent) ทกงาน (any application)

ทมา: William (2007)

21

2.4 การประยกตใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพ

ปจจบนเทคนค NIRS สามารถน ามาประยกตใชในการตรวจสอบผลตผลทางการเกษตรและอตสาหกรรมเกษตร (Nicolaï และคณะ, 2007) อตสาหกรรมยา (Reich, 2005) นอกจากนยงมการประยกตใชในอตสาหกรรมอาหารและเครองดม (Cen และ He, 2007; Huang และคณะ, 2008) เนองจากสามารถวเคราะหตวอยางไดโดยไมตองท าลายตวอยางและรวดเรว เชน Ncama และคณะ (2017) และ Torres และคณะ (2017) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามคณลกษณะทางกายภาพและคณลกษณะทางดานประสาทสมผสในผลไมตระกลสม Munera และคณะ (2017) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามคณภาพผลลกพลบ และ Nordey และคณะ (2017) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามคณภาพภายในของผลมะมวง

ส าหรบการประยกตใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพและความสามารถในการตานอนมลอสระของผลตภณฑอาหารและเครองดมนน พบวา Redaelli และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามความสามารถในการตานอนมลอสระทงหมดในแปงขาวโพดพบวา เทคนค NIRS มประสทธภาพในการประเมนคาเบองตนในโรงงานอตสาหกรรมได ขณะท Caramês และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดและปรมาณสารแอนโทไซยานนทงหมดในน าองน ผลการศกษาพบวาสมการท านายปรมาณสารประกอบฟนอลกมประสทธภาพด ใหคา RMSEP เทากบ 0.37 มลลกรมสมมลของกรดแกลลกตอมลลลตร และสมการท านายปรมาณสารแอนโทไซยานน ใหคา RMSEP ทต า เทากบ 4.44 มลลกรมตอ 100 กรม

Fernandez-Novales และคณะ (2009) และ Cozzolino และคณะ (2004) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณสารแทนนน และสาร Malvidin-3-glucoside ในไวนแดง โดยผลทไดพบวา เทคนคนมความสามารถในการท านายคาตางๆ ไดด เนองจากใหคา R2 และ SEP อยในเกณฑทด Chen และคณะ (2009) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคาเทชนในชาเขยว ดวยระบบการวดแบบสะทอนกลบ ทชวงเลขคลน 10000-4000 cm-1 สรางสมการท านายดวยวธ PLSR พบวาใหคา R2 ของปรมาณอพแกลโลคาเทชน (epigallocatechin, EGC) เ ทากบ 0 .985 อพคาเทชน (epicatechin, EC) เทากบ 0.959 อพแกลโลคาเทชนแกลเลต (epigallocatechin gallate, EGCG)เทากบ 0.976 และอพคาเทชนแกลเลต (epicatechin gallate, ECG) เทากบ 0.976 ซงเปนคาทสง สมการจงมความนาเชอถอ

22

Krähmer และคณะ (2015) ศกษาการใชเทคนค NIRS ในการท านายคณสมบตดานชวเคมในโกโก ทชวงคลน 12500-3600 cm-1 สรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ PLSR พบวาใหคาการท านายองคประกอบตางๆ ในโกโกทสง โดยมคา R2 อยในชวง 0.82-0.93 และมคา RMSECV อยในชวง 0.14-0.75

Deák และคณะ (2015) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณแคโรทนอยด (Carotenoids) ในน ามะเขอเทศ ทชวงเลขคลน 10526-6060 cm-1 และ 10526-7692 cm-1 ดวยระบบการวดแบบสะทอนกลบ พบวาใหคา R2

CV เทากบ 0.75 และคา RMSECV เทากบ 6.88 ไมโครกรมตอกรม Escuredo และคณะ (2013) และ Tahir และคณะ (2016a) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณสารในกลมฟนอลก ฟลาโวนอยด แคโรทนอยด ในน าผง และในขณะเดยวกน Tahir และคณะ , (2016b) ศกษาการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด ปรมาณสารประกอบฟลาโวนอยด และความสามารถในการตานอนมลอสระในกระเจยบดวยเชนกน พบวาใหคา R2 อยในชวง 0.85-0.91 และ RMSECV ในชวง 0.08-0.33

นอกจากน Zhang และคณะ (2004) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระในชาเขยว และ Moncada และคณะ (2013) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณวตามนอและคณสมบตในการตานอนมลอสระในควนว นอกจากนยงมงานอนๆ อกมากทใชเทคนค NIRS ในการท านายสารออกฤทธทางชวภาพ แสดงดงตารางท 3

2.4.1 การใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหตวอยางทเปนของเหลว

การวเคราะหตวอยางทเปนของเหลวดวยเทคนค NIRS มกจะเลอกใชระบบการวดแบบสอง

ผาน (transmittance) ตวอยางทเปนสารละลายมกจะบรรจในภาชนะควอตซหรอแกวทมทางเดนแสงอยในชวง 1-50 มลลเมตร และเนองจากการดดกลนแสงจะลดลง (molar absorptivity) เมอใชวดในชวงความยาวคลนสน ดงนนจงตองใชตวอยางทมความหนา แตหากใชวดในชวงความยาวคลนยาว พบวา การดดกลนของน าจะสงมาก ในตวอยางทมน าเปนองคประกอบ ดงนนจงตองใชตวอยางทมความบาง เชน การวเคราะหปรมาณน าตาลในน าเบยเบอรร โดยใชระบบการวดแบบสองผาน ทชวงความยาวคลน 12500-4000 cm-1 โดยน าตวอยางบรรจลงควเวตควอตซทมความหนา 1 มลลเมตร ภายใตสภาวะทอณหภมหอง ทชวงความยาวคลน 12500-5405 cm-1 และ 4878-4255 cm-1 โดยจะไมน าชวงความยาวคลน 5405-4878 cm-1 และ 4255-4000 cm-1 มาใชในการวเคราะหปรมาณน าตาล เนองจากวาเปนชวงทมการดดกลนน าสง (Xie และคณะ, 2009; Xie และคณะ, 2011) แสดงสเปกตรมดงภาพท 12 ในขณะท Shao และ He (2007) ศกษาการใชเทคนค NIRS ในการตดตามคณภาพภายในของน าเบยเบอรรดวยระบบการสองผานเชนกน

23

ภาพท 12 สเปกตรมทผานการปรบแตงดวยวธปรบเรยบของน าเบยเบอรร ทมา: Xie และคณะ (2009)

เชนเดยวกบ Cozzolino และคณะ (2004) ใชเทคนค NIRS ตรวจสอบปรมาณสาร Malvidin-3-glucoside และปรมาณแทนนนในไวนแดง และ Martelo-Vidal และ Vázquez (2014) ใชเทคนค NIRS ในการท านายปรมาณสารประกอบโพลฟนอลกในไวนแดง ดวยระบบการวดแบบสองผานเชนกน ซงจะเหนไดวาการวดสเปกตรมตวอยางทเปนของเหลว นยมใชรปแบบการวดแบบสองผาน แตไมสามารถน าขอมลในชวงความยาวคลนยาวมาวเคราะหได เนองจากมการดดกลนน ามาก (over absorption) โดยเฉพาะวตถดบทางการเกษตร อาหารสด และน าผลไม สงผลใหการศกษาการดดกลนสารทสนใจยากขน เนองจากการดดกลนของสารทสนใจนอยมากเมอเทยบกบปรมาณน า และพคของน าไปบดบง ดงนนสเปกตรมการดดกลนของน าจะถกตดออก เพอใหปรากฏพคของสารตางๆ และจ าแนกสเปกตรมขององคประกอบในตวอยางได

ดงนนจงมการศกษาระบบการวดในรปแบบสงผานและสะทอน (transflectance) ซงจะมอปกรณทเรยกวา ตวสะทอน (reflector) ทชวยควบคมความหนาของตวอยาง หรอม physical pathlength ทนอยกวา 1 มลลเมตร ท าใหสามารถน าขอมลมาใชในการวเคราะหไดตลอดทงชวงคลน

โดย Downey และ Kelly (2003) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามการปลอมปนของน าแอปเปลในน าสตรอวเบอรรและน าราสเบอรรเขมขน โดยใชระบบสองผานและสะทอน (transflectance) ทมตวก าหนดความหนาของตวอยาง 0.1 มลลเมตร และ Caramês และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมดและปรมาณสารแอนโทไซยานนทงหมดในน าองน ซงใชระบบการวดเดยวกน

Alamar และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการประเมนคณภาพ (ความชน ปรมาณกรด ปรมาณน าตาล ปรมาณของแขงทละลายได คาความเปนกรด ดาง และปรมาณวตามนซ) ในฝรงและ

24

เนอเสาวรสแชแขง วดสเปกตรมในชวง 10000-4000 cm-1 และสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ PLSR พบวาใหคาความผดพลาดของการท านายทต า และมคา R2 มากกวา 0.70 ซงสามารถน าเทคนคนมาประยกตใชในการตรวจสอบคณภาพของตวอยางดงกลาวได

Caramês และคณะ (2017) ใชเทคนค NIRS ในการควบคมคณภาพเนกตาฝรงและเนกตามะมวงหมพานต ไดแก ปรมาณกรด ปรมาณน าตาล ปรมาณของแขงทละลายได คาความเปนกรด ดาง และปรมาณวตามนซ แสดงคา RMSEP ในสมการท านายคณภาพเนกตาฝรง โดยสมการน านายปรมาณกรดเทากบรอยละ 0.024 น าตาลทงหมดเทากบรอยละ 0.315 ปรมาณของแขงทละลายไดเทากบ 0.301ºBrix ความเปนกรด-ดาง เทากบ 0.107 และวตามนซเทากบ 7.44 มลลกรมตอ 100 กรม ส าหรบสมการท านายเนกตามะมวงหมพานต ใหสมการท านายปรมาณกรดเทากบรอยละ 0.025 น าตาลทงหมดเทากบรอยละ 0.60 ความเปนกรด ดางเทากบ 0.123 และวตามนซเทากบ 4.80 มลลกรมตอ 100 กรม

จากงานวจยทกลาวมาขางตน แสดงใหเหนวาสามารถประยกตใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหคณภาพตวอยางน าผลไมและเครองดมในอตสาหกรรมได เนองจากใหคาความแมนย าในการท านายสารออกฤทธทางชวภาพทสง ดงนนจงมความเปนไปไดทจะน าเทคนค NIRS มาใชในงานวจยนได

2.4.2 เทคนคทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐาน ส าหรบการสรางสมการท านายเชงปรมาณในปจจบนนยมใชเทคนค multiple linear

regression (MLR) เชน Shafie และคณะ (2015) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามวตถแหง (Dry matter) ในกว โดยเปรยบเทยบวธทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐานทงหมด 4 แบบ ไดแก การใชวธ MLR โดยเลอก 1 เลขคลนทมความสมพนธกบวตถแหง กบการใชวธ MLR โดยเลอกเลขคลนทงหมด 6 เลขคลน มาใชในการสรางสมการ เปรยบเทยบกบวธ PLS ทใช 81 เลขคลนมาสรางสมการกบการใชวธ PLS แบบใชเลขคลนทงชวงมาสรางสมการ พบวา สมการท านายทใชวธ MLR โดยเลอกใช 6 เลขคลนใหคา RMSEP ทต าทสด และเลขคลนทสมพนธกบวตถแหงคอ 15384, 12500, 12269, 11299, 10869 และ10752 cm-1 นอกจากน Liu และคณะ (2015) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณของแขงทละลายได ในผลไม 3 ชนด ไดแก แอปเปล ลกแพร และพช โดยเปรยบเทยบวธทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐานทงหมด 3 แบบ คอใชวธ PLS ทชวงเลขคลน 20000-9900 cm-1 และ 11904-10869 cm-1 และวธ MLR โดยเลอก 3 เลขคลน ไดแก 11415, 11235 และ 11111 cm-1 พบวาสมการท านายทใชวธ PLS ใหคา R2 เทากบ 0.97 และ RMSEP เทากบ 0.45 และสมการท านายทใชวธ MLR ใหคา R2 เทากบ 0.96 และ RMSEP เทากบ 0.46 พบวาทงสองวธใหคาความแมนย าของการท านายทไมแตกตางกน

25

partial least square regression (PLSR) (Ncama และคณะ, 2017; Nordey และคณะ , 2017) หรอจะเปนการเลอกเฉพาะชวงความยาวคลนทมความสมพนธกบองคประกอบทมภายในตวอยางทตองการศกษา ซงวธดงกลาวเปนวธทมการใชกนมากทสดในปจจบน โดย Viegas และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณสารแอนโทไซยานนทงหมดและปรมาณสารประกอบ ฟนอลทงหมดในชมพ โดยสรางสมการดวยวธ PLS รวมกบการปรบแตงสเปกตรมดวยอนพนธอนดบสอง พบวา สมการท านายใหคา R2 เทากบ 0.940 และ RMSEP เทากบ 22.18

Khodabakhshian และคณะ (2017) ใชเทคนค NIRS ในการตรวจสอบคณลกษณะภายในของทบทม สรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ PLS ในชวงเลขคลนตงแต 25000-9090 cm-1 รวมกบการปรบแตงสเปกตรมดวยวธตางๆ พบวา สมการเทยบมาตรฐานทปรบแตงสเปกตรมดวยวธ MSC และ SNV ใหผลดทสด ในการตรวจสอบปรมาณของแขงทละลายไดทงหมด คาความเปนกรด ดางและปรมาณกรด โดยม R2 เทากบ 0.93 0.84 และ 0.94 RMSEC เทากบ 0.22 0.06 และ 0.25 RPD เทากบ 6.40 4.95 และ5.35 ตามล าดบ

Soltanikazemi และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตรวจสอบคาคณภาพและปรมาณแอนโทไซยานนทงหมดในน ามลเบอรร สรางสมการท านายดวยวธ PLS โดยจะเลอกชวงเลขคลนทงหมดมาใชในการสรางสมการ และวธ GA-PLS โดยใช 31 เลขคลนในการสรางสมการ พบวา ทง 2 วธใหคาความแมนย าทไมแตกตางกน

นอกจากนยงมเทคนคอนๆ ทน ามาประยกตใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐาน ไดแก MPLS (Núñez-Sánchez และคณะ , 2016) iPLS GA-PLS และ iSPA-PLS (Mariani และคณะ , 2015) iSPA-PLS LS-SVM MC-UVE-PLS และ MC-UVE-LS-SVM (Han และคณะ, 2017) ซงวธดงกลาวพฒนาขนโดยการใช MATLAB version R2016a และ R software

26

2.5 อทธพลขององคประกอบทซบซอนในอาหารตอการวดสเปกตรมดวยเทคนค NIRS

เครองดมในทองตลาดมกมการเตมวตถเจอปนอาหารตางๆ และสารทเปนประโยชน ซงองคประกอบตางๆ ของเครองดมจะขนอยกบชนดของเครองดม โดยมน าเปนสวนประกอบหลกส าคญ ท าหนาทเปนตวประสานสวนประกอบอนๆ เขาดวยกน นอกจากนยงมสารใหรสหวาน รสเปรยว และสารใหกลนรสอนๆ ประกอบกบสารทเสรมใหคณลกษณะของเครองดมเปนไปตามลกษณะทตองการอยางสมบรณ รวมไปจนถงแกสคารบอนไดออกไซด สารใหกลน ส สารใหเนอ หรอสารทใหความหนดแกเครองดม ทงน คณภาพของเครองดมขนอยกบชนดและปรมาณของสวนประกอบเหลานเปนส าคญ ปจจยทมผลตอคณภาพของเครองดมมหลายอยาง เชน รสชาต กลน ความหนด เนอสมผส และส ซงองคประกอบดงกลาวขางตนอาจสงผลตอการวด NIRS เนองดวยสวนประกอบดงกลาว มหม -OH และ C=O อยในโครงสราง เชนเดยวกบในคอลลาเจน ทประกอบไปดวยกรดอะมโน 3 ชนดเรยงตอกน ไดแก ไกลซน โพรลน และโฮดรอกซโพรลน มหม -NH -OH และ C=O อยในโครงสรางเชนกน ซงอาจท าใหเกดการคาบเกยวกนของหมฟงกชน ดงเชนงานวจยของ Subedi และคณะ (2012a) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามความเปนกรดจากการไทเทรตในสารละลายกรดซตรก โดยแบงเปน 3 สวนการทดลอง สวนท 1 เตรยมสารละลายกรดซตรกทความเขมขนตางๆกน ไดแก 0.0 , 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0 และ 20.0 น าหนกตอปรมาตร (w/v) วดสเปกตรมดวยเครอง NIR system 6500 ทชวงความยาวคลน 25000-4000 cm-1 ดวยระบบสองผาน บรรจสารละลายกรดซตรกในภาชนะควอตซทความหนา 2 มลลเมตร และภาชนะแกว ทมความหนา 10 มลลเมตร สวนท 2 น าสารละลายกรดซตรกในสวนท 1 มาเตมซโครสรอยละ 10, 13 และเตมน าสม ซงมซโครสเปนสวนประกอบรอยละ 12.7 โดยก าหนดใหมความหนาตวอยาง 27 มลลเมตร วดสเปกตรมทชวงคลน 25000-9090 cm-1 สวนท 3 น าสารละลายกรดซตรกมาวดสเปกตรมดวยระบบสองผานรวมกบการใช fibre-optic พบวาใหสมประสทธการถดถอยของสมการทปรบแตงสเปกตรมดวยอนพนธอนดบสองเหมอนกนทงในสารละลายกรดซตรก สารละลายกรดซตรกทเตมซโครส และสารละลายกรดซตรกทเตมในน าสม นอกจากนการวดความเขมขนของกรดซตรกในสารละลายดวยระบบสองผานใหคา RMSECV เทากบ 0.17% ในชวง 9090-4000 cm-1 และ 0.39% ในชวงคลนสน แตพบวาใหคาเพมขนเปน 0.79% ในองคประกอบทซบซอน (น าสม) ในชวงคลนสนเชนกน

27

เชนเดยวกบ Subedi และคณะ (2012b) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามความเปนกรดจากการไทเทรต (TTA) ในมะนาวและลกพช ดวยระบบอนเตอรแอกแทนซ ในชวงความยาวคลนสนพบวา ใหคาการท านาย TTA ในลกพชไมดเนองจาก เปนผลไมทมความเปนกรดต า สวนคาการท านาย TTA ในมะนาวใหคาการท านายทดในมะนาวหนชน และใหคาการท านายทลดลงส าหรบมะนาวทงผล เนองมากจากการกระเจงของแสงผานเนอเยอผลไมเมอเทยบกบการสองผานในตวอยางของเหลว

28

ตารางท 3 งานวจยทแสดงถงความสามารถของการใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพ

ผลตภณฑ คณลกษณะ จ านวนตวอยาง

ความยาวคลน (nm) หรอเลขคลน (cm-1)

ระบบการวด การวเคราะห

ขอมล คาความแมนย า อางอง

เมลดขาว ปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด ฟลาโวนอยด ความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระ

264 1100-2498 แบบสะทอนกลบ

PCA PLS mPLS

R2= 0.714 SEP= 69.35 R2= 0.276 SEP= 14.08 R2= 0.693 SEP= 0.40 R2= 0.693 SEP= 47.10 R2= 0.331 SEP= 13.55 R2= 0.822 SEP= 0.280 R2= 0.864 SEP= 45.87 R2= 0.378 SEP= 13.07 R2= 0.829 SEP= 0.28

Zhang และคณะ (2008)

ชารอยบอส (ชาแดง)

สารประกอบฟนอลก ปรมาณของแขงทละลายไดทงหมดความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระทงหมด

340 1100–2500 แบบสองผาน PLS R2= 0.370 SEP= 17.49 R2= 0.210 SEP= 44.97 R2= 0.460 SEP= 112.63

Manley และคณะ (2006)

องน ปรมาณสารแอนโทไซยานนทงหมด 579 4000–10000 สะทอนแบบแพร

iSPA-PLS R2= 0.650-0.890 RMSEP= 7.55-9.35

Mariani และคณะ (2015)

29

ตารางท 3 งานวจยทแสดงถงความสามารถของการใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพ (ตอ)

ผลตภณฑ คณลกษณะ จ านวนตวอยาง

ความยาวคลน (nm) หรอเลขคลน (cm-1)

ระบบการวด การวเคราะห

ขอมล คาความแมนย า อางอง

ไวนองน ปรมาณสารแอนโทไซยานน 50 928–1695 แบบสะทอนกลบ

SVR PLSR

R2= 0.941 RMSEP= 0.0046 R2= 0.841 RMSEP= 0.0129

Chen และคณะ (2015)

แอปเปล ความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระทงหมด ปรมาณของแขงทละลายไดทงหมด

92 6267-4173 10000–4000

fibre optic probe สะทอนแบบแพร

PLS R2= 0.850 SEP= 0.13 R2= 0.760 SEP= 0.55

Schmutzler และ Huck (2016)

มลเบอรร ปรมาณสารแอนโทไซยานนทงหมด ความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระ

180 380–1030 แบบสะทอนกลบ

PLSR LS-SVM

R2= 0.959 RPD= 4.96 R2= 0.995 RPD= 14.26

Huang และคณะ (2017)

30

ตารางท 3 งานวจยทแสดงถงความสามารถของการใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพ (ตอ)

ผลตภณฑ คณลกษณะ จ านวนตวอยาง

ความยาวคลน (nm) หรอเลขคลน (cm-1)

ระบบการวด การวเคราะห

ขอมล คาความแมนย า อางอง

มะเขอเทศราชนอบแหง

ไลโคปน ปรมาณกรดทงหมด ปรมาณน าตาล ปรมาณฟนอลกทงหมด

92 800–2500 แบบสะทอนกลบ

PLSR RBF-NN

R2= 0.919 RMSEP= 18.6 R2= 0.814 RMSEP= 0.22 R2= 0.975 RMSEP= 1.21 R2= 0.904 RMSEP= 0.12 R2= 0.939 RMSEP= 16.1 R2= 0.880 RMSEP= 0.18 R2= 0.972 RMSEP= 1.22 R2= 0.954 RMSEP= 0.08

Ding และคณะ (2016)

กาแฟบด กรดกาเฟอก คาเฟอน คาเทชน กรดคลอโรจนก ทโอฟลลน

61 10000-4000 แบบสะทอนกลบ PLS R2= 0.922 RMSEP= 32.40 R2= 0.945 RMSEP= 655.00 R2= 0.877 RMSEP= 4.40 R2= 0.708 RMSEP= 352.00 R2= 0.845 RMSEP= 38.50

Magalhães และคณะ (2016)

31

ตารางท 3 งานวจยทแสดงถงความสามารถของการใชเทคนค NIRS ในการวเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพ (ตอ)

ผลตภณฑ คณลกษณะ จ านวนตวอยาง

ความยาวคลน (nm) หรอเลขคลน (cm-1)

ระบบการวด การวเคราะหขอมล คาความแมนย า อางอง

ขาวบารเลย ปรมาณฟนอลกทงหมด กรดพ คมารก

135

165

1100-2500 แบบสะทอนกลบ PLS LS-SVM MC-UVE-PLS MC-UVE-LS-SVM

R2= 0.934 RMSEP= 149.43 R2= 0.948 RMSEP= 140.68 R2= 0.948 RMSEP= 139.57 R2= 0.949 RMSEP= 138.54 R2= 0.958 RMSEP= 0.12 R2= 0.940 RMSEP= 0.15 R2= 0.953 RMSEP= 0.13 R2= 0.961 RMSEP= 0.12

Han และคณะ (2017)

32

บทท 3

วธด าเนนการวจย 3.1 วตถดบ

3.1.1 วตถดบและอปกรณทใชในการวจย

ในการศกษาครงนใชคอลลาเจนทางการคา ความบรสทธรอยละ 95.10 โดยซอมาจากบรษท คอสมก คอนคอรด คอรปอเรชน จ ากด เตรยมตวอยางส าหรบการศกษาในตอนท 1 เรองการศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน ทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา ทมความบรสทธรอยละ 95.10 และตอนท 2 เรองการศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหาร ไดแก น าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และ ซงคกลโคเนต ตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS ในสารละลายคอลลาเจน ทเตรยมจากคอลลาเจนทางการคา ทมความบรสทธรอยละ 95.10 และสมซอผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนจ านวน 9 ยหอ จากรานคาปลกภายในประเทศ จ านวนตวอยางรวมทงหมด 114 ตวอยาง ส าหรบใชในการศกษาตอนท 3 เรองการศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด 3.1.2 สารเคม

1. น ากลน (Distillated Water, VUNIQUE, Thailand) 2. กรดไฮโดรคลอรก (Hydrochloric acid, QRëC, New Zealand) เกรด 37% 3. เมทานอล (Methanol HPLC grade, RCI Labscan, Thailand) 4. อะซโตไนไตรล (Acetonitrile HPLC grade, RCI Labscan, Thailand) 5. โซเดยมไฮดรอกไซด (Sodium hydroxide, Merck, Germany) 6. โพแทสเซยมไฮดรอกไซด (Potassium hydroxide (KOH), Ajax Finechem, Australia) 7. กรดบอรค (Boric acid, Ajax Finechem, Austral

33

8. โซเดยม ฟอสเฟต โมโนเบสก (Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O), Carlo Erba Reagent, USA) 9. สารมาตรฐานทรานส-4- ไฮดรอกซ-แอล-โพรลน (trans-4-Hydroxy-L-proline ≥99%, Fluka, China)

10. สารอนพนธ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (4–chloro -7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl), Sigma-Aldrich, Austria) 11. สารคอลลาเจนทซอมาทางการคา (ยหอ Colla 1000D, บรษท คอสมก คอน คอรด คอรปอเรชน จ ากด, ประเทศไทย) 12. น าตาลซโครส (บรษท น าตาลมตรผล จ ากด, ประเทศไทย) 13. กรดแอสคอรบก (บรษท เคมภณฑ คอรปอเรชน จ ากด, ประเทศไทย) 14. โซเดยมเบนโซเอท (บรษท เคมภณฑ คอรปอเรชน จ ากด, ประเทศไทย) 15. ซงคกลโคเนต (บรษท รวมเคม 1986 จ ากด, ประเทศไทย)

3.1.3 เครองมอ

1. เครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลแบบ FT-NIR Spectrometer (รน MPA S/N 2197, บรษท Bruker, Germany) 2. เครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (High Performance Liquid Chromatography) (Shimadzu model RF-20A prominence fluorescence, degassing unit (DGU-20A3R); LC- 20AD, Japan; heating box model T-120D, Thailand) 3. เครอง Ultrasonic (รน 360D, บรษท Advance Ceramics Technology, Malaysia) 4. เครองวดปรมาณของแขงทละลายน าได (Digital refractometer) (รน Pal 1, Atago, Japan) 5. เครองวดความเปนกรด – ดาง (pH meter) (รน PHM 210, Metro Lab Co., Ltd. France) 6. เครองวดความหนดแบบดจตอล (ยหอ Brookfield รน DV2T, Brookfield Engineering

Laboratories, USA) 7. เครองวดส (Tintometer) (ยหอ Lovibond® รน SV 100, Tintometer, Germany)

34

8. เครองชงน าหนกละเอยด 4 ต าแหนง (Digital balance รน BP 221S, Sartorius, Germany) 9. เครองชงน าหนกแบบตวเลข แบบทศนยม 2 ต าแหนง (Digital balance, TE 3102S Sartorius, Germany) 10. หมอนงฆาเชอดวยไอน า (Autoclave) (ยหอ TOMY รน Autoclave SS-325, TOMY SEIKO, Tokyo, Japan) 11. เครองกวนสารละลาย (magnetic stirrer) (ยหอ CAT รน Topolino, IKA, Germany) 12. เครองเขยาสารละลาย (Vortex mixer) (Vortex-Genie2, รน G560E, Scientific Industries, USA) 13. อางน าควบคมอณหภม (Water bath) (รน MEM-1 WNB 7, ยหอ MEMMERT, Germany) 14. เครองระเหยสญญากาศแบบหมน (Rotary evaporator) (รน RV 10 B S99, IKA, Malaysia) 15. คอลมน Luna C18 (2) 5 ไมโครเมตร 100 องสตรอม ขนาด 250x4.6 มลลเมตร (Phenomenex, Torrance, USA) 16. NIR sample cup ใช petri dish (Duran, steriplan, Germany) ขนาด 100 มลลเมตร x 15 มลลเมตร 17. NIR sample cell ส าหรบวดตวอยางทเปนของเหลว ม path length 0.2 มลลเมตร

3.2 วธการทดลอง

ในการศกษานแบงการศกษาออกเปน 3 สวนการทดลอง ไดแก (1) การศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธรอยละ 95.10 (2) การศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนค สเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธรอยละ 95.10 และ (3) การศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด ซงมรายละเอยดการศกษาดงน

35

3.2.1 การศกษาความเปนไปไดในการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการ ตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธรอยละ 95.10

3.2.1.1 การเตรยมตวอยาง

ในการศกษานท าการเตรยมตวอยางสารละลายคอลลาเจนจ านวน 110 ตวอยาง โดยน าสาร

คอลลาเจนทางการคา ทมความบรสทธรอยละ 95.10 (ยหอ Colla 1000 D, บรษท คอสมก คอนคอรด คอรปอเรชน จ ากด) มาละลายในน ากลนใหมความเขมขน 10,000 มลลกรมตอลตร เพอเปน stock solution โดยชงคอลลาเจน 10 กรมละลายในน ากลน 1 ลตร จากนน เตรยมสารละลายคอลลาเจนทความเขมขนแตกตางกนในชวง 500-9,000 มลลกรมตอลตร จาก stock solution จะไดสารละลายคอลลาเจนทความเขมขนตางกนซงเปนความเขมขนของคอลลาเจน อยในชวงทมการเตมในเครองดมน าผลไมเสรมคอลลาเจนทจ าหนายในประเทศ แสดงรายละเอยดดงตารางท 4 ตารางท 4 การเตรยมตวอยางสารละลายคอลลาเจนทความเขมขนแตกตางกน จาก stock solution

10,000 มลลกรมตอลตร ตวอยางสารละลาย คอลลาเจน (mg/L)

สารคอลลาเจนทางการคา (g)

สารละลาย stock solution (ml)

น ากลน (ml)

จ านวนตวอยาง

500 - 0.5 9.5 10 1,000 - 1 9 10 2,000 - 2 8 10 3,000 - 3 7 10 4,000 - 4 6 10 5,000 - 5 5 10 6,000 - 6 4 10 7,000 - 7 3 10 8,000 - 8 2 10 9,000 - 9 1 10

10,000 (stock solution) 10 - 1,000 10 รวม 110

36

3.2.1.2 การวดสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล

น าตวอยางทเตรยมไดจากขอ 3.2.1.1 มาท าการวดสเปกตรมดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล (FT-NIR spectrometer รน MPA) โดยกอนการวดสเปกตรมตวอยางสารละลายคอลลาเจนตองควบคมอณหภมของสารละลายท 30±1 องศาเซลเซยส ซงเปนอณหภมทใชในการขนสงและเกบรกษาตามภาคอตสาหกรรม เปนเวลา 1 ชวโมง ดวย incubator จากนน ปเปตสารละลายคอลลาเจน ปรมาตร 10 มลลลตร (ml) ลงบนจานแกวกลมขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร (mm) สง 15 มลลเมตร (mm) และวางทบดวยตวสะทอน (reflector) เพอเปนการควบคมความหนาของตวอยางใหมความหนาหรอ physical pathlength เทากบ 0.2 มลลเมตร (mm) บรเวณกลางจานแกว และในขณะทวางตวสะทอนจะตองระวงไมใหเกดฟองอากาศขณะวด แสดงดงภาพท 13 โดยวดตวอยางทความเขมขนละ 3 ซ า แลวใชคาเฉลยขอมลสเปกตรมทไดจากการวดทง 3 ครง เปนตวแทนขอมลสเปกตรมของตวอยางนนๆ วดสเปกตรมในรปแบบการวดแบบสองผานสะทอนกลบ (transflectance) ชวงความยาวคลน 800-2500 นาโนเมตรหรอมเลขคลน 12500-4000 cm-1 ทคาความสามารถในการแยกพค หรอ resolution 8 cm-1 และจ านวนครงของการ scan ตวอยาง หรอ sample scan time 32 ครง แสดงการวดสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนดงภาพท 14

ภาพท 13 การวดสเปกตรมตวอยางสารละลายคอลลาเจนโดยวางอปกรณในระบบสะทอน

ผานตวอยาง

37

ภาพท 14 ขนตอนการสรางสมการเทยบมาตรฐานสารละลายคอลลาเจน

3.2.1.3 การปรบแตงสเปกตรม กอนท าการวเคราะหขอมลตองท าการปรบแตงเสนสเปกตรม (pretreatment) กอนเพอลดสญญาณรบกวน (noise) และอทธพลอนๆ ภายนอกทไมสามารถควบคมได โดยวธปรบแตงสเปกตรมทใช ไดแก (1) การปรบแกการกระเจงแบบผลคณ (multiplicative scatter correction, MSC)

(2) การปรบความแปรปรวนใหเปนมาตรฐาน และการปรบแนวโนม (standard normal variate, SNV)

(3) อนพนธอนดบหนง (first derivative, 1st derivative) (4) อนพนธอนดบสอง (second derivative, 2nd derivative) (5) การปรบเรยบ (smoothing) แบบซาวสก-โกเลย (Savitzky-Golay, SG) หรอ (6) ใชหลายวธรวมกน

สารละลาย คอลลาเจน

วดสเปกตรมในรปแบบสองผานสะทอนกลบ ชวงความยาวคลน 12500-4000 cm-1

คาความสามารถในการแยกพค 8 cm-1 และ จ านวนครงของการ scan ตวอยาง 32 scans (ไมใหมฟองอากาศขณะวด)

ควบคมอณหภมของสารละลายท 30±1ºC เปนเวลา 1 ชวโมง ดวย incubator

Vortex 10 วนาท กอนวดสเปกตรม

ปรบแตงสเปกตรมดวยวธ MSC, SNV, 2ndderivative และsmoothing

สรางสมการเทยบมาตรฐานและทดสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ PLS ดวยโปรแกรม OPUS 7.2.139.1294

ทดสอบประสทธภาพสมการ ดวยตวอยาง 20 ตวอยาง (prediction set)

38

3.2.1.4 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน สรางสมการเทยบมาตรฐานดวยโปรแกรม OPUS Version 7.2.139.1294 โดยการน าสเปกตรมทไดจากขอ 3.2.1.3 มาแบงกลมตวอยางออกเปน 2 กลม คอ กลมทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐาน (Calibration set) โดยตวอยางในกลมนจะตองมความหลากหลายคลอบคลมตวอยางทคาดวานาจะพบในอนาคต จากนนตรวจสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน (Validation set) เปนกลมท 2 เพอเปนการเลอกสมการเทยบมาตรฐานทมความเหมาะสมมากทสด แบบทดสอบภายนอก (test set) ในอตราสวน 70 ตอ 30 โดยตวอยางในกลม Calibration set จะตองมคาทางเคมทกวางเพยงพอคลอบคลมตวอยางในกลม Validation set และตองมจ านวนมากกวา และจะแบงกลมตวอยางดวยการเรยงล าดบคาทางเคมจากนอยไปมาก จากนนก าหนดสามตวอยางแรกและสามตวอยางสดทายเปนกลม Calibration set สวนตวอยางทเหลอใหสลบสดสวนตวอยางตามตองการ โดยในการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยโปรแกรม OPUS Version 7.2.139.1294 เลอกใชฟงกชนการหาความสมพนธทเหมาะสมทสดดวยฟงกชนอตโนมต (optimize) เพอเปนแนวทางในการตรวจสอบชวงคลนและเทคนคการปรบแตงขอมลสเปกตรมทมประสทธภาพ โดยใชวธการถดถอยก าลงสองนอยทสดบางสวน (Partial Least Square Regression, PLSR) และเลอกชวงความยาวคลนทใหผลในการสรางสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะสมทสด โดยเลอกความยาวคลนใหครอบคลมกบองคประกอบทตองการหาใหมากทสดหรอเลอกจากความยาวคลนอางองทบงบอกถงชวงความยาวคลนทคาดวานาจะมความสมพนธกบคาทจะท าการวเคราะห

พจารณาประสทธภาพของสมการจากคาสมประสทธสหสมพนธ (Coefficient of correction) หรอ R2 และ RPD (Ratio of standard error of prediction to standard deviation) ทสง คาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางสรางสมการเทยบมาตรฐาน (Standard Error of Calibration) หรอ SEC และ คาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางทวนสอบสมการเทยบมาตรฐาน (Standard Error of Prediction) หรอ SEP ทต า นอกจากนยงมจ านวนตวแปร (PLS factor) และคาความคลาดเคลอนเฉลยหรอ bias ซงคาทไดสามารถค านวณไดจากสมการในภาคผนวก ก

ซงการสรางสมการเทยบมาตรฐานน เพอใหทราบลกษณะสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจน และเพอทจะศกษาอทธพลของความเขมขนทแตกตางกน

39

3.2.1.5 การทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน ท าการทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐานดวยตวอยางน าผลไมเสรมคอลลาเจน จ านวน 20 ตวอยาง (prediction set) ซงเปนตวอยางทซอมาใหมจากทองตลาด โดยมตวอยาง E2500 จ านวน 3 ขวด E3000 จ านวน 4 ขวด D2000 จ านวน 4 ขวด A2000 จ านวน 5 ขวด I5000 จ านวน 2 ขวด และ H5000 จ านวน 2 ขวด โดยกอนวดสเปกตรมตวอยางทซอมาใหมจะท าการควบคมอณหภมของสารละลายท 30±1 องศาเซลเซยส ซงเปนอณหภมทใชในการขนสงและเกบรกษาตามภาคอตสาหกรรม เปนเวลา 1 ชวโมง ดวย incubator จากนน ปเปตสารละลายคอลลาเจน ปรมาตร 10 มลลลตร (ml) ลงบนจานแกวกลมขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร (mm) สง 15 มลลเมตร (mm) และวางทบดวยตวสะทอน (reflector) และวดสเปกตรมเหมอนขอ 3.2.1.2 โดยในการทดสอบประสทธภาพการท านายจะพจารณาจากคาระยะหางมาหาลาโนบสเฉลย (Average Mahalanobis Distance) ถาพบวาเกนขดจ ากดของคาน ตวอยางนนกจะเปน Outlier และคาความคลาดเคลอน (%error) ทต า แสดงการค านวณ %error ดงภาคผนวก ก

3.2.1.6 การวดสเปกตรมคอลลาเจนผงดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล

น าผงคอลลาเจนทางการคา เทลงบนจานแกวกลมทมขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร (mm) สง 15 มลลเมตร (mm) ใหเตมจานแกว โดยไมมการกดอด จากนนปาดผงคอลลาเจนสวนเกนออก และตองระวงไมใหกดอดตวอยาง จากนนจะวดสเปกตรมทงหมด 5 จด โดยการหมนจานแกว แลวใชคาเฉลยขอมลสเปกตรมทไดจากการวดทง 5 ครง เปนตวแทนขอมลสเปกตรมของตวอยางนนๆ วดสเปกตรมในรปแบบการวดแบบสะทอนกลบ (reflectance) ชวงเลขคลน 12500-4000 cm-1 ทคาความสามารถในการแยกพค หรอ resolution 32 cm-1 และจ านวนครงของการ scan ตวอยาง หรอ sample scan time 64 ครง แสดงการวดสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนดงภาพท 15

40

ภาพท 15 การวดสเปกตรมตวอยางคอลลาเจนผงดวยระบบสะทอนกลบ

41

3.2.2 การศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนค สเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธรอยละ 95.10 ในการผลตน าผลไมเพอสขภาพทวๆไปจะมการเตมวตถเจอปนอาหาร เพอวตถประสงคตางๆ

เชน ยดอายการเกบรกษา เสรมส กลน และรสของเครองดม รวมไปถงรกษาคณคาของเครองดม เปนตน

ทงนวตถเจอปนอาหารทนยมเตมลงในน าผลไมเพอสขภาพทวๆ ไปสามารถสงเกตไดจากฉลากของผลตภณฑทมในทองตลาดไดแก น าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และ ซงคกลโคเนต ทงนวตถเจอปนอาหารชนดตางๆ อาจจะแสดงอทธพลตอการวดสเปกตรมคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมดวยเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ดงนนการศกษานจงไดศกษาอทธพลของสารดงกลาว โดยมรายละเอยดดงน

3.2.2.1 การเตรยมตวอยาง

จากการเตรยมสารละลาย stock solution คอลลาเจน ในขนตอนการศกษาท 1 น าสารละลายคอลลาเจนในชวง 500-5,000 mg/L มาเตมวตถเจอปนอาหาร รวมจ านวนตวอยางทงหมด 630 ตวอยาง โดยวตถเจอปนอาหารทศกษา ในการศกษานมทงหมด 4 ชนด ไดแก น าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และ ซงคกลโคเนต โดยเตมวตถเจอปนอาหารแตละชนดท 3 ระดบความเขมขนลงในสารละลายคอลลาเจนทเตรยมไดจากขางตน แสดงรายละเอยดการเตมวตถเจอปนอาหาร ดงภาพท 16 และปรมาณวตถเจอปนอาหารทเตม แสดงดงตารางท 5

โดยเตมวตถเจอปนอาหารแตละชนด เพอเสรมรสชาตใหกบเครองดม ปองกนและระงบการเกดออกซเดชน ท าใหกลนรสของเครองดมคงตวอยไดนาน เพอยบยงการเจรญของยสต รา และแบคทเรย หรอเพอเสรมคณคาของเครองดม เปนตน ตารางท 5 ปรมาณวตถเจอปนอาหารทเตมในสารละลายคอลลาเจนเพอเปนระบบจ าลอง

วตถเจอปนอาหาร ปรมาณทเตม น าตาลซโครส (%) 2 5 10 วตามนซ (%) 0.01 0.05 0.10 โซเดยมเบนโซเอท (mg/L) 200 500 1,000 ซงคกลโคเนต (%) 0.01 0.05 0.10

42

ภาพท 16 แผนผงการเตมวตถเจอปนอาหารลงในสารละลายคอลลาเจน จ านวนรวม 630 ตวอยาง

ปรมาณคอลลาเจน

น าตาล

ซงคกลโคเนต

วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท

43

3.2.2.2 การวดสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนทมการเตมวตถเจอปนอาหารดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล

น าตวอยางทเตรยมไดจากขอ 3.2.2.1 ดงภาพท 16 มาท าการวดสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนทมการเตมวตถเจอปนอาหารดวยเทคนค NIRS เชนเดยวกบขอท 3.2.1.2 นอกจากนยงท าการวดสเปกตรมของสารละลายวตถเจอปนอาหารดวยวธเดยวกน

3.2.2.3 การปรบแตงสเปกตรม กอนท าการวเคราะหขอมลตองท าการปรบแตงเสนสเปกตรม (pretreatment) กอน เพอลดสญญาณรบกวน (noise) และอทธพลอนๆ ภายนอกทไมสามารถควบคมได โดยวธปรบแตงสเปกตรมทใช เชนเดยวกบขอ 3.2.1.3 เพอศกษาการปรบแตงสเปกตรมดวยวธตางๆ กน ตอการสรางสมการเทยบมาตรฐาน 3.2.2.4 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน สรางสมการเทยบมาตรฐานดวยโปรแกรม OPUS Version 7.2.139.1294 โดยการน าสเปกตรมทไดจากขอ 3.2.2.3 มาแบงกลมตวอยางออกเปน 2 กลม คอ กลมทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐาน (Calibration set) โดยตวอยางในกลมนจะตองมความหลากหลายคลอบคลมตวอยางทคาดวานาจะพบในอนาคต จากนนตรวจสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน (Validation set) เปนกลมท 2 เพอเปนการเลอกสมการเทยบมาตรฐานทมความเหมาะสมมากทสด แบบทดสอบภายนอก (test set) ในอตราสวน 70 ตอ 30 โดยตวอยางในกลม Calibration set จะตองมคาทางเคมทกวางเพยงพอคลอบคลมตวอยางในกลม Validation set และตองมจ านวนมากกวา และจะแบงกลมตวอยางดวยการเรยงล าดบคาทางเคมจากนอยไปมาก จากนนก าหนดสามตวอยางแรกและสามตวอยางสดทายเปนกลม Calibration set สวนตวอยางทเหลอใหสลบสดสวนตวอยางตามตองการ โดยในการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยโปรแกรม OPUS Version 7.2.139.1294 เลอกใชฟงกชนการหาความสมพนธทเหมาะสมทสดดวยฟงกชนอตโนมต (optimize) เพอเปนแนวทางในการตรวจสอบชวงคลนและเทคนคการปรบแตงขอมลสเปกตรมทมประสทธภาพ โดยใชวธการถดถอยก าลงสองนอยทสดบางสวน (Partial Least Square Regression, PLSR) และเลอกชวงความยาวคลนทใหผลในการสรางสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะสมทสด โดยเลอกความยาวคลน

44

ใหครอบคลมกบองคประกอบทตองการหาใหมากทสดหรอเลอกจากความยาวคลนอางองของวตถเจอปนอาหาร ทบงบอกถงชวงความยาวคลนทคาดวานาจะมความสมพนธกบคาทจะท าการวเคราะห

พจารณาประสทธภาพของสมการจากคาสมประสทธสหสมพนธ (Coefficient of correction) หรอ R2 และ RPD (Ratio of standard error of prediction to standard deviation) ทสง คาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางสรางสมการเทยบมาตรฐาน (Standard Error of Calibration) หรอ SEC และ คาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางทวนสอบสมการเทยบมาตรฐาน (Standard Error of Prediction) หรอ SEP ทต า นอกจากนยงมจ านวนตวแปร (PLS factor) และคาความคลาดเคลอนเฉลยหรอ bias ซงคาทไดสามารถค านวณไดจากสมการในภาคผนวก ก

3.2.2.5 การทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน

ท าการทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐานดวยตวอยางน าผลไมเสรมคอลลาเจน จ านวน 20 ตวอยาง (prediction set) ซงเปนตวอยางทซอมาใหมจากทองตลาด โดยใชตวอยางเดยวกบการศกษาขนตอนท 1 โดยกอนวดสเปกตรมตวอยางทซอมาใหมจะท าการควบคมอณหภมของสารละลายท 30±1 องศาเซลเซยส ซงเปนอณหภม ทใชในการขนสงและเกบรกษาตามภาคอตสาหกรรม เปนเวลา 1 ชวโมง ดวย incubator จากนน ปเปตสารละลายคอลลาเจน ปรมาตร 10 มลลลตร (ml) ลงบนจานแกวกลมขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร (mm) สง 15 มลลเมตร (mm) และวางทบดวยตวสะทอน (reflector) และวดสเปกตรมเหมอนขอ 3.2.1.2 โดยในการทดสอบประสทธภาพการท านายจะพจารณาจากคาระยะหางมาหาลาโนบสเฉลย (Average Mahalanobis Distance) ถาพบวาเกนขดจ ากดของคาน ตวอยางนนกจะเปน Outlier และคาความคลาดเคลอน (%error) ทต า แสดงการค านวณ %error ดงภาคผนวก ก

3.2.2.6 การวดสเปกตรมวตถเจอปนอาหารผงดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล

ผงวตถเจอปนอาหารทง 4 ชนด ไดแก น าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และ ซงคกลโคเนต น าวตถเจอปนอาหารแตละชนดมาวดสเปกตรม โดยเทลงบนจานแกวกลมทมขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร (mm) สง 15 มลลเมตร (mm) ใหเตมจานแกว โดยไมมการกดอด จากนนปาดผงวตถเจอปนอาหารสวนเกนออก และตองระวงไมใหกดอดตวอยาง จากนนจะวด

45

สเปกตรมทงหมด 5 จด โดยการหมนจานแกว แลวใชคาเฉลยขอมลสเปกตรมทไดจากการวดทง 5 ครง เปนตวแทนขอมลสเปกตรมของตวอยางนนๆ วดสเปกตรมในรปแบบการวดแบบสะทอนกลบ (reflectance) ชวงเลขคลน 12500-4000 cm-1 ทคาความสามารถในการแยกพค หรอ resolution 32 cm-1 และจ านวนครงของการ scan ตวอยาง หรอ sample scan time 64 ครง

3.2.3 การศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด

3.2.3.1 สมเกบตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมจ าหนายในประเทศ

สมเกบตวอยางเครองดมน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนทวางจ าหนายในประเทศ ซงมการเสรมปรมาณคอลลาเจนจากยหอตางๆ 9 ยหอ วนทหมดอายทแตกตางกน จ านวน 114 ตวอยาง และรหสตวอยาง แสดงรายละเอยดดงตารางท 6 ทงนปรมาณคอลลาเจนทแสดงในตารางท 6 เปนปรมาณทบรษทผผลตแสดงคาไวทฉลากบรรจภณฑ ซอตวอยางมาในชวงเดอนพฤษภาคม-มถนายน 2559 จากนนรบน าตวอยางไปยงหองปฏบตการ ภาควชาเทคโนโลยอาหาร คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร ควบคมอณหภม 30±5 องศาเซลเซยส เพอท าการศกษาตอไป

46

ตารางท 6 การสมตวอยางเครองดมน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนส าหรบการศกษา

ยหอ วนทหมดอาย ปรมาณคอลลาเจน*

(mg/L) จ านวน

ตวอยางทสม รหสตวอยาง

ขนาดบรรจภณฑ (ml)

A 04/12/15, 24/02/17

4,444 20 A2000 450

B 22/04/17 4,857 15 B1700 350

C 11/03/17, 19/03/17

5,479 15 C2000 365

D 21/12/16 28/03/17

7,143 5 D2000 280

E 21/04/17 7,576 15 E2500 330

E 01/04/17, 10/05/17

9,091 20 E3000 330

E 31/05/17 80,000 5 E4000 50

F 10/05/17 10,000 4 F1000 100

G 20/02/17, 29/03/17

66,667 5 G8000 120

H -/-/2017 100,000 5 H5000 50

I -/-/2019 111,111 5 I5000 45

*ปรมาณคอลลาเจนทระบบนฉลากบรรจภณฑ (มลลกรมตอลตร)

47

3.2.3.2 วเคราะหคณลกษณะทางเคมเบ องตนของผลตภณฑน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนทวางจ าหนายในประเทศ

ในการศกษานจะท าการวเคราะหคณลกษณะทางเคมเบองตนของเครองดมน าผลไมทมการ

เสรมคอลลาเจนทวางจ าหนายในประเทศ กอนน าไปวดสเปกตรมดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลและวเคราะหคณสมบตทางเคมดวยเครอง HPLC แสดงรายละเอยดการวเคราะหดงน

(1) ปรมาณของแขงทละลายไดทงหมด (Total soluble solids, TSS) โดยใชมาตรดชน หกเห โดยสอบเทยบเครองมอดวยน ากลน กอนใชงานทกครง จากนนน าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลาเจนมา มาหยดลงบน Digital refractometer กดวดตวอยาง และบนทกคา

(2) คาความเปนกรด - ดาง โดยใชเครองวดความเปนกรด - ดาง (pH meter) น าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลาเจนมาวดคา pH ดวยเครองวดความเปนกรดดาง

(pH meter) โดยกอนใชงานทกครงตองสอบเทยบเครองมอดวย pH 4 7 และ 10 จากนนจะใชตวอยาง 30 มลลลตร ใสลงในบกเกอร และน าหว probe จมลงในตวอยางใหทวม บนทกคา

(3) คาส โดยใชเครอง Tintometer น าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลาเจน วดคาส (L*,a*,b*, C* และ hº) ดวยเครอง Tintometer โดยรายละเอยดแสดงในภาคผนวก ข

(4) คาความหนด โดยใชเครอง Brookfield Viscometer น าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลาเจน วดคาความหนด โดยใชเคร อง Viscometer

Brookfield โดยจะใชตวอยาง 16 มลลลตร ใสลงในภาชนะใสตวอยาง แสดงในภาคผนวก ข จากนนน าหว probe ชนด UL ใสในตวอยาง วดคา และบนทกคา

3.2.3.3 การวดสเปกตรมเครองดมน าผลไมเสรมคอลลาเจนดวยเครองสเปกโทร สโกปอนฟราเรดยานใกล

น าตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด มาวดสเปกตรมดวยเครองสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ควบคมอณหภมของเครองดมท 30±1 องศาเซลเซยส กอนการวดสเปกตรม ซงเปนอณหภมทใชในการขนสงและเกบรกษาตามภาคอตสาหกรรม เปนเวลา 1 ชวโมง ดวย incubator จากนน ปเปตสารละลายคอลลาเจน ปรมาตร 10 มลลลตร (ml) ลงบนจานแกวกลมขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร (mm) สง 15 มลลเมตร (mm) และวางทบดวยตวสะทอน (reflector) เพอเปนการควบคมความหนาของตวอยางใหมความหนาหรอ physical pathlength เทากบ 0.2 มลลเมตร (mm) บรเวณกลางจานแกว และในขณะทวางตวสะทอนจะตองระวงไมใหเกดฟองอากาศขณะวด โดยวดตวอยางทความเขมขนละ 3 ซ า แลวใชคาเฉลยขอมล

48

สเปกตรมทไดจากการวดทง 3 ครง เปนตวแทนขอมลสเปกตรมของตวอยางนนๆ วดสเปกตรมในรปแบบการวดแบบสองผานสะทอนกลบ (transflectance) ชวงเลขคลน 12500-4000 cm-1 ทคาความสามารถในการแยกพค หรอ resolution 8 cm-1 และจ านวนครงของการ scan ตวอยาง หรอ sample scan time 32 ครง และขนตอนการสรางสมการเทยบมาตรฐานของน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด แสดงดงภาพท 17

ภาพท 17 ขนตอนการสรางสมการเทยบมาตรฐานของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวาง

จ าหนายในทองตลาด

เครองดมน าผลไม เสรมคอลลาเจน จ านวน 9 ยหอ

ปเปต 10 ml

ควบคมอณหภมของสารละลายท 30±1ºC

เปนเวลา 1 ชวโมง

ดวย incubator

Vortex 10 วนาท กอนวดสเปกตรม

เลขคลน 12500-4000 cm-1 resolution 8 cm-1 และscan time 32 ครง

วดดวยระบบสองผานสะทอนกลบ และวางทบดวยตวสะทอน (reflector) เพอเปนการควบคมความหนาของตวอยางใหมความหนา หรอ physical pathlength เทากบ 0.2 mm (ไมใหมฟองอากาศขณะวด)

ปรบแตงสเปกตรมดวยวธ (SNV MSC และ derivative)

สรางสมการเทยบมาตรฐานและทดสอบความแมนย าของสมการดวยวธ PLS ดวยโปรแกรม OPUS 7.2.139.1294

สรางสมการเทยบมาตรฐานและทดสอบความแมนย าของสมการดวยวธ MLR ดวยโปรแกรม the unscambler

ทดสอบประสทธภาพสมการ ดวยตวอยาง 20 ตวอยาง (prediction set)

คาปรมาณคอลลาเจนทวเคราะหดวยวธ HPLC

49

3.2.3.4 การปรบแตงสเปกตรม กอนท าการวเคราะหขอมลตองท าการปรบแตงเสนสเปกตรม (pretreatment) กอนเพอลดสญญาณรบกวน (noise) และอทธพลอนๆ ภายนอกทไมสามารถควบคมได โดยวธปรบแตงสเปกตรมทใช เชนเดยวกบขอ 3.2.1.3 เพอศกษาการปรบแตงสเปกตรมดวยวธตางๆ กน ตอการสรางสมการเทยบมาตรฐาน 3.2.3.5 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน สรางสมการเทยบมาตรฐานดวยโปรแกรม OPUS Version 7.2.139.1294 โดยการน าสเปกตรมทไดจากขอ 3.2.3.4 และคาองคประกอบทางเคมของเครองดมน าผลไมเสรมคอลลาเจน มาตรวจสอบคาความผดพลาดจากการทดลองซงเปนขอมลทไมสอดคลองกบความเปนจรง เพอลดความคลาดเคลอนในสรางสมการ จากนนจงแบงกลมตวอยางออกเปน 2 กลม คอ กลมทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐาน (Calibration set) โดยตวอยางในกลมนจะตองมความหลากหลายคลอบคลมตวอยางทคาดวานาจะพบในอนาคต จากนนตรวจสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน (Validation set) เปนกลมท 2 เพอเปนการเลอกสมการเทยบมาตรฐานทมความเหมาะสมมากทสด แบบทดสอบภายนอก (test set) ในอตราสวน 70 ตอ 30 โดยตวอยางในกลม Calibration set จะตองมคาทางเคมทกวางเพยงพอคลอบคลมตวอยางในกลม Validation set และตองมจ านวนมากกวา แบงกลมตวอยางดวยการเรยงล าดบคาทางเคมจากนอยไปมาก จากนนก าหนดสามตวอยางแรกและสามตวอยางสดทายเปนกลม Calibration set สวนตวอยางทเหลอใหสลบสดสวนตวอยางตามตองการ โดยในการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยโปรแกรม OPUS Version 7.2.139.1294 เลอกใชฟงกชนการหาความสมพนธทเหมาะสมทสดดวยฟงกชนอตโนมต (optimize) เพอเปนแนวทางในการตรวจสอบชวงคลนและเทคนคการปรบแตงขอมลสเปกตรมทมประสทธภาพ โดยใชวธการถดถอยก าลงสองนอยทสดบางสวน (Partial Least Square Regression, PLSR) และเลอกชวงความยาวคลนทใหผลในการสรางสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะสมทสด โดยเลอกความยาวคลนใหครอบคลมกบองคประกอบทตองการหาใหมากทสดหรอเลอกจากความยาวคลนอางองของวตถเจอปนอาหาร ทบงบอกถงชวงความยาวคลนทคาดวานาจะมความสมพนธกบคาทจะท าการวเคราะห นอกจากนสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ Multiple Linear Regression (MLR) โดยใชโปรแกรม The Unscrambler (CAMO, Olso, Norway) ซงเปนวธการคดเลอกความยาวคลนทมความสมพนธกบตวแปรตามทจะท านาย โดยเลอกความยาวคลนจากการวดสเปกตรมสารบรสทธทง

50

แบบสารละลายและแบบผงรวมกบความยาวคลนจากเอกสารอางอง ทบงบอกถงชวงความยาวคลนทคาดวานาจะมความสมพนธกบคาทน ามาวเคราะห โดยแสดงรายละเอยดขนตอนการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR ดงภาคผนวก ง

พจารณาประสทธภาพของสมการจากคาสมประสทธสหสมพนธ (Coefficient of correction) หรอ R2 และ RPD (Ratio of standard error of prediction to standard deviation) ทสง คาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางสรางสมการเทยบมาตรฐาน (Standard Error of Calibration) หรอ SEC และ คาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางทวนสอบสมการเทยบมาตรฐาน (Standard Error of Prediction) หรอ SEP ทต า นอกจากนยงมจ านวนตวแปร (PLS factor) และคาความคลาดเคลอนเฉลยหรอ bias ซงคาทไดสามารถค านวณไดจากสมการในภาคผนวก ก

จากนนจงท าการตรวจสอบคาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางทวนสอบสมการ (SEP) ทไดดวยคา unexplained error confidence limits (UECLs, TUE) ซงสามารถค านวณไดจาก F-test คา SEP ทไดควรมคานอยกวาคา TUE ตามมาตรฐาน ISO 12099 ตรวจสอบคาความผดพลาดเฉลยในการท านาย (bias) โดยการเปรยบเทยบคาทางเคมหรอคาทวเคราะหไดจากวธมาตรฐานกบคาทท านายไดจากสมการท านายดวยการทดสอบแบบจบค (pair t-test) ตามสตรทแสดงไวในภาคผนวก ก โดยคา bias ทไดตองมคานอยกวา Tb ซงหมายถงคาทท านายไดจากสมการท านายไมแตกตางจากคาทางเคมอยางมนยส าคญ ทระดบความเชอมน 95% หรอ P นอยกวาหรอเทากบ 0.05 และตรวจสอบคาความชน (slope) พจารณาคา tobs โดย คา tobs ทไดตองนอยกวาคา t-value โดยคาความชนทดทสดควรมคาเทากบ 1 เพอใหไดสมการทมความแมนย าตอการน าไปใชวเคราะหไดดทสด

3.2.3.6 การทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐาน

ท าการทดสอบประสทธภาพของสมการเทยบมาตรฐานดวยตวอยางน าผลไมเสรมคอลลาเจน จ านวน 20 ตวอยาง (prediction set) ซงเปนตวอยางทซอมาใหมจากทองตลาด โดยใชตวอยางเดยวกบการศกษาขนตอนท 1 โดยกอนวดสเปกตรมตวอยางทซอมาใหมจะท าการควบคมอณหภมของสารละลายท 30±1 องศาเซลเซยส ซงเปนอณหภม ทใชในการขนสงและเกบรกษาตามภาคอตสาหกรรม เปนเวลา 1 ชวโมง ดวย incubator จากนน ปเปตสารละลายคอลลาเจน ปรมาตร 10 มลลลตร (ml) ลงบนจานแกวกลมขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร (mm) สง 15 มลลเมตร (mm) และวางทบดวยตวสะทอน (reflector) และวดสเปกตรมเหมอนขอ 3.2.1.2 โดยใน

51

การทดสอบประสทธภาพการท านายจะพจารณาจากคาระยะหางมาหาลาโนบสเฉลย (Average Mahalanobis Distance) ถาพบวาเกนขดจ ากดของคาน ตวอยางนนกจะเปน Outlier และคาความคลาดเคลอน (%error) ทต า แสดงการค านวณ %error ดงภาคผนวก ก

3.2.3.7 วเคราะหปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาดดวยเครอง High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

3.2.3.7.1 การเตรยมตวอยาง

ชงตวอยางประมาณ 5.0000±0.0010 กรม ดวยเครองชงละเอยด 4 ต าแหนง ใสในขวดสชาปรมาตร 25 มลลลตร ทมฝาปด เพอปองกนการสมผสกบอากาศ จากนนเตม 6 M HCl 5 มลลลตร เขยาเบาๆ ใหเขากนดวย Vortex mixer เปนเวลา 10 วนาท แลวน าไปยอยดวย Autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ทงไวใหเยนทอณหภมหอง จากนนน าสารละลายตวอยางทผานการยอย มาระเหยตวท าละลาย ดวยเครองระเหยสญญากาศทอณหภม 60 องศาเซลเซยส ความเรวรอบ 150 rpm เปนเวลา 10 นาท จนสารละลายแหงสนท น าสารละลายทแหงแลวมาปรบปรมาตรดวยน ากลน (Distilled Water) 5 มลลลตร ดวยขวดปรบปรมาตร 5 มลลลตร เขยาใหเขากน และกรองสารละลายดวย Nylon Syringe Filter ขนาด 13 มลลลตร 0.22 ไมโครเมตร (µm) เกบสวนใสของตวอยางไว เพอใชในการวเคราะหตอไป 3.2.3.7.2 การท าอนพนธตวอยาง

น าสารละลายสวนใสจากขางตน ปเปตสารละลาย 1,250 ไมโครลตร จากนนเจอจางใหเปน 5 มลลลตร ดวย 0.4 M Borate buffer pH 10.4 จากนน ปเปต 250 ไมโครลตร ของสารละลายตวอยาง ผสมกบ 250 ไมโครลตร ของ 0.2% 4–chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) ผสมใหเขากน น าไปใหความรอนท 60±1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท จากนนหยดปฏกรยา โดยเตม 50 ไมโครลตร 1 M HCl จากนนท าใหเยนทนทท 0±1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท กรองสารละลายดวย Nylon Syringe Filter ขนาด 13 มลลลตร 0.22 ไมโครเมตร แลวน าสารละลายปรมาตร 10 ไมโครลตร มาวเคราะหดวยเครอง HPLC

52

3.2.3.7.3 การวเคราะหปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนดวย HPLC

การวเคราะหปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนดวยเครอง

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) จะใชคอลมน C18 และใชเฟสเคลอนทแบบผสม (Gradient) โดยใชเฟสเคลอนท A เปนโพแทสเซยม ไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (potassium dihydrogen phosphate) pH 7.8 และเฟสเคลอนท B เปน เมทานอล (Methanol) : อะซโตไนไตรล (Acetonitrile) : น ากลน ในอตราสวน 45 : 40 : 15 (v/v/v) อณหภมคอลมน 30 องศาเซลเซยส และอตราการไหล 0.8 มลลลตรตอนาท (ml/min) โดยมความยาวคลนทใหพลงงานกบสาร (excitation wavelengths) ท 465 นาโนเมตร และความยาวคลนทสาร ดดกลน (emission wavelengths) ท 535 นาโนเมตร ตรวจวด ดวยตวตรวจวดสญญาณชนดฟลออเรสเซนส โดยใชเวลาในการวเคราะห 65 นาทตอตวอยาง และค านวณปรมาณคอลลาเจน โดยหาอตราสวนพนทพคเทยบกบกราฟมาตรฐาน ตามวธของ Vazquez-Ortiz และคณะ (2005) และ Prockop และ Udenfriend (1960) แสดงรายละเอยดดงภาคผนวก ข

53

บทท 4

ผลการทดลองและวจารณผล

4.1 การใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธรอยละ 95.10

4.1.1 ลกษณะสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจน

ตวอยางสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทความเขมขนตางๆ แสดงดงภาพท 18 พบวาสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทความเขมขนตางๆ มลกษณะคลายกน และคลายกบสเปกตรมน ากลน โดยพบพคการดดกลนแสงทชดเจนอยทเลขคลน 6900 และ 5200 cm-1 ซงต าแหนงดงกลาวแสดงขอมลส าคญทเกยวของกบการสนแบบโอเวอรโทนอนดบหนงของพนธะ O-H และคอมบเนชนของพนธะ O-H (Rodriguez-Saona และคณะ, 2001; Xie และคณะ, 2009) ทเปนลกษณะเฉพาะของโมเลกลของน า เนองจากน าสามารถดดกลนคลนรงส NIRS ไดสง จงสงผลใหตวอยางทมน าเปนองคประกอบในจ านวนมาก มสเปกตรมการดดกลนคลน NIRS ทเดนชดจากโมเลกลของน า (Büning-Pfaue, 2003) และเมอท าการปรบแตงสเปกตรมทไดดวยวธอนพนธอนดบสอง (second derivative) เพอท าใหยอดพคมลกษณะทชดเจนแสดงดงภาพท 19 จะเหนลกษณะของสเปกตรมมความแตกตางกนในชวงเลขคลน 4700-4200 cm-1, 5500-4880 cm-1 และ 7400-6600 cm-1 ซงชวงดงกลาวมความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ N-H C-H และ O-H คอมบเนชน ซงแสดงถงพนธะภายในโครงสรางของกรดอะมโน นอกจากนมความสมพนธกบการดดกลนของโอเวอรโทนอนดบทสองของพนธะ C=O พนธะ O-H และ N-H และมความสมพนธกบการดดกลนของโอเวอรโทนอนดบทหนงของพนธะ O-H และ N-H (Osborne และคณะ, 1993) ซงมความสอดคลองกบสเปกตรมคอลลาเจนดงภาพท 20 แสดงพคการดดกลนของคอลลาเจนทเลขคลน 4396 , 4485, 4592, 4868, 4975, 5135, 5402, 5767, 5883, 6035, 6658, 8448 และ 9721 cm-1 นอกจากนยงสอดคลองกบงานวจยของ Prevolnik และคณะ (2011) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณกรดอะมโนอสระในแฮม โดยพบเลขคลนทมความสมพนธกบการสนของพนธะ N-H ของโครงสรางกรดอะมโน ไดแก 6849-6369 และ5000-4587 cm-1 และ Fernández และคณะ (2008) พบพคการดดกลนขององคประกอบ

54

0

0.5

1

1.5

2

2.5

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)น ากลน สารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตรสารละลายคอลลาเจน 1,000 มลลกรมตอลตร สารละลายคอลลาเจน 10,000 มลลกรมตอลตรสารละลายคอลลาเจน 100,000 มลลกรมตอลตร

โปรตน เปปไทด และกรดอะมโน ซงสมพนธกบพนธะ N-H และเอไมด ทเลขคลน 7042, 6250, 5000 และ 4545 cm-1

ภาพท 18 ตวอยางสเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนทความเขมขนตางๆ

กน

6900 cm-1 O-H overtone

5200 cm-1 O-H combination

55

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2(lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1) น ากลน สารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตรสารละลายคอลลาเจน 1,000 มลลกรมตอลตร สารละลายคอลลาเจน 10,000 มลลกรมตอลตรสารละลายคอลลาเจน 100,000 มลลกรมตอลตร

ภาพท 19 ตวอยางสเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจน ทความเขมขนตางๆ

กน ทผานการปรบแตงดวยอนพนธอนดบสอง

4.1.2 ลกษณะสเปกตรมของคอลลาเจนผง

ตวอยางสเปกตรมคอลลาเจนผงแสดงดงภาพท 20 จะเหนวาสเปกตรมมการดดกลนแสงทชดเจนกวาสเปกตรมสารละลายคอลลาเจน โดยจะพบพคการดดกลนแสงทชดเจนทเลขคลน 4396, 4485, 4592, 4779, 4868, 4975, 5135, 5402, 5767, 5883, 6035, 6658, 8448 แ ละ 9721 cm-1 ซงมความสมพนธกบพนธะ C=O, C-H, O-H, N-H และ เอไมด ทมในโครงสรางคอลลาเจน และสอดคลองกบงานวจยของ Ingle และคณะ (2016) ใชเทคนค NIRS ในการตดตามปรมาณโปรตนในเวยโปรตน พบพคการดดกลนท 8424 (C-H), 6684 (N-H), 5973 (C-H), 5737 (C-H), 5050 (N-H), 4866 (ROH หรอ N-H) และ 4614 (N-H) cm-1 ซงคณสมบตการดดกลนเหลานสอดคลองกบพนธะภายในโครงสรางโปรตน ซงสมพนธกบโครงสรางคอลลาเจนเชนกน

7400-6600 cm-1 C-H first overtone O-H first overtone N-H first overtone

5500-4880 cm-1 N-H sym.str-amide II C=O str. Second overtone

4700-4200 cm-1 N-H sym.+amide III Amide I+amide III O-H str.

56

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g 1/R

)

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 20 สเปกตรมคอลลาเจน

4.1.3 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน

คาสถตของสารละลายคอลลาเจนส าหรบสรางสมการและทวนสอบสมการเทยบมาตรฐานมความเขมขนอยในชวง 500-10,000 มลลกรมตอลตร แสดงดงตารางท 7 และจากตารางท 8 แสดงคา R2, RMSEC, RMSEP, Bias, RPD และจ านวนปจจยทเกยวของของสมการท านายคาดวยเทคนค NIRS โดยในการศกษานเลอกชวงในการสรางสมการจากสารละลายคอลลาเจน โดยเมอน าสเปกตรมสารละลายคอลลาเจน มาปรบแตงดวยวธอนพนธอนดบสอง จะเหนความแตกตางของสเปกตรมในชวง 7486-6896, 5500-4998 และ 4701-3999 cm-1 โดยสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะสมทสดในการศกษาน ไดแก สมการทไมผานการปรบแตงสเปกตรม ซงใหคาสมประสทธการตดสนใจ (R2) เทากบ 0.976 คาความคลาดเคลอนในการท านาย (RMSEP) เทากบ 474 มลลกรมตอลตร คาความคลาดเคลอนเฉลย (bias) เทากบ 155 มลลกรมตอลตร คาสดสวนระหวางสวนเบยงเบนมาตรฐานกบคาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมทวนสอบสมการ (RPD) เทากบ 6.94 และมปจจยทเกยวของ 9 ปจจยตามล าดบ ซงโดยทวไปการเลอกสมการทเหมาะสมทสดจะเลอกจากสมการทใหคาการท านายในชดของการทวนสอบทดทสด (Keawsorn และ Sirisomboon, 2014)

4396 4592

4868 4975

4485 5767 5402

5135

6035 5883

9721

8448

6658

57

ตารางท 7 คาสถตของสารละลายคอลลาเจนส าหรบสรางสมการและส าหรบทวนสอบสมการดวย เทคนค NIRS

*หนวย มลลกรมตอลตร

จ านวนตวอยาง

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) จ านวนตวอยาง

สมการทวนสอบ (30%) คาต าสด-คาสงสด*

คาเฉลย สวนเบยงเบน

มาตรฐาน คาต าสด-คาสงสด*

คาเฉลย สวนเบยงเบน

มาตรฐาน

77 500-

10,000 5,500.00 3,232.23 33

500-10,000

4,177.41 2,491.81

58

ตารางท 8 คาทางสถตของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS

ชวงเลขคลน (cm-1) การปรบแตงสเปกตรม PLS

factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทวนสอบ (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L)

R2 RMSEP (mg/L)

Bias

6476-5446* SNV 4 0.981 435 0.981 442 -13.7 7.32 7502-5446* 46001-4246

SNV 6 0.993 266 0.985 376 -64.8 8.30

4701-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

8 0.947 526 0.977 437 -95.4 6.74

SNV 6 0.956 677 0.957 621 286 5.44 MSC 6 0.956 677 0.950 652 199 4.70

7486-6896 5500-4998 4701-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

9 0.987 373 0.976 474 155 6.94

SNV 5 0.942 768 0.966 587 77.9 5.48 หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction,

RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction SNV: Standard Normal Variate และ * หมายถง สมการทไดจากการ optimize

59

-140000-120000-100000-80000-60000-40000-20000

020000400006000080000

40004500500055006000650070007500

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 21 แสดงคาสมประสทธการถดถอย (regression coefficient) ของสารละลายคอลลาเจนทไมผานการปรบแตงสเปกตรม ซงคา regression coefficient ถกใชเปนพนฐานในการตรวจสอบความยาวคลนหรอเลขคลนทมความส าคญตอแบบจ าลอง (X-vaiable) ในการท านายตวแปรตาม (Y) ซงถา regression coefficient มคาสงชถงความส าคญของอทธพลความยาวคลนนนตอแบบจ าลองอยางมนยส าคญ ซงจากภาพท 21 จะสงเกตเหนตวแปรทมอทธพลและความส าคญตอแบบจ าลองอยทเลขคลน 7344, 7014, 7146, 5237, 5264, 5487, 5153, 5076, 4730, 4600, 4432, 4252, 4172, 4062, 4040 และ 4032 cm–1 ซงสอดคลองกบการดดกลนของการสนพนธะ O-H C-H N-H และเอไมด ทมความสมพนธกบกรดอะมโนและโปรตนในโครงสรางคอลลาเจน (Osborne และคณะ, 1993)

จากภาพท 22 แสดงการกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS พบวามความสมพนธทดในเชงเสนตรงขอมลมการกระจายตวใกลเสนทแยงมม (target line) บงบอกถงการท านายไดอยางถกตอง โดย Zornoza และคณะ (2008) เสนอแนะวา คา R2 มากกวา 0.90 และ RPD มากกวา 3 แบบจ าลองใหคาการท านายทด ซงสามารถน ามาประยกตใชในการท านายคอลลาเจนทใชเปนวตถดบในการผลตเครองดมเพอสขภาพไดในอตสาหกรรม

ภาพท 21 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนทไมผานการปรบแตงสเปกตรม

4032

4600 5076

5264

5237

7146 7014

7344

5153

60

-2000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(ม

ลลกร

มตอล

ตร)

ปรมาณคอลลาเจนทเตรยมได (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐาน

สมการทวนสอบ

0

2

4

6

8

10

500 2000 4000 6000 8000 10000

ความ

ถ

ปรมาณคอลลาเจน สมการเทยบมาตรฐาน สมการทวนสอบ

ภาพท 22 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน ทไดจากการสราง

สมการเทยบมาตรฐานและทวนสอบสมการดวยเทคนค NIRS

สมการเทยบมาตรฐานทสรางขนจากขอมลปรมาณคอลลาเจนในสารละลายมาตรฐาน ทวเคราะหได แสดงการกระจายตวของขอมลดงภาพท 23 พบวาขอมลมการกระจายตวอยางสม าเสมอ ท าใหสมการเทยบมาตรฐานทสรางขนใหผลการท านายทแมนย า ซงสอดคลองกบคา R2 กบ RPD ทสง และคา SEC ทต า

ภาพท 23 การกระจายตวของปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน

R2 =0.976 RMSEP = 474 mg/L Bias = 155 RPD = 6.94

61

แตเมอน าตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาดมาท านายดวยสมการสารละลายคอลลาเจน พบวา ไมสามารถท านายได เนองจากมองคประกอบภายในตวอยางทตางกน เมอพจารณาจากขดจ ากดของคาระยะหางมาหาลาโนบสเฉลย (Average Mahalanobis Distance) คอ ความแตกตางระหวางสเปกตรมของตวอยางกบคาเฉลยของทกสเปกตรมในกลมสมการเทยบมาตรฐาน โดยการค านวณจะพจารณาบนพนฐานการกระจายของสเปกตรมในกลมสมการเทยบมาตรฐานทงหมด ซงจะตองค านวณคาเฉลยและคาเบยงเบนมาตรฐาน ถาพบวาเกนขดจ ากดกจะเปน Outlier และจากการศกษาน พบวาตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทน ามาท านายมคาระยะมาหาลาโนบสเฉลยเกนขดก าจด โดยสามารถสงเกตจากคารอยละความคลาดเคลอนเฉลยทสงมาก ถงรอยละ 558.96 แสดงดงตารางท 9 และแสดงวธการค านวณดงภาคผนวก ก

62

ตารางท 9 การเปรยบเทยบคาจรงและคาท านายของปรมาณคอลลาเจนในน าผลไมเสรมคอลลาเจนท จ าหนายในทองตลาด ดวยสมการสารละลายคอลลาเจนทเหมาะสมทสด รหสตวอยาง คาจาก HPLC (mg/L) คาท านาย (mg/L) คาความคลาดเคลอน (%)

E 2500 7,358.83 30,822.00 318.84 E 2500 7,631.08 31,655.00 314.82 E 2500 6,832.46 32,453.00 374.98 E 3000 8,589.62 42,236.00 391.71 E 3000 9,567.76 42,601.00 345.26 E 3000 10,540.23 42,262.00 300.96 E 3000 10,795.67 40,610.00 276.17 D 2000 8,479.10 27,774.00 227.56 D 2000 7,488.83 28,702.00 283.26 D 2000 8,701.97 28,121.00 223.16 D 2000 5,324.39 60,395.00 1,034.31 A 2000 5,559.34 60,562.00 989.37 A 2000 3,112.83 60,776.00 1,852.43 A 2000 4,460.97 61,107.00 1,269.81 A 2000 4,804.04 62,432.00 1,199.57 A 2000 3,847.76 62,338.00 1,520.11 I 5000 98,666.92 134,340.00 36.16 I 5000 86,087.14 135,570.00 57.48 H 5000 79,547.64 120,820.00 51.88 H 5000 57,526.49 121,530.00 111.26 คาเฉลย 21,746.15 61,355.30 558.96

63

4.2 การศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารตอการวดปรมาณคอลลาเจนดวยเทคนคสเปกโทร สโกปอนฟราเรดยานใกลในสารละลายคอลลาเจนทมความบรสทธรอยละ 95.10

4.2.1 ลกษณะสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปนอาหาร

4.2.1.1 สารละลายและผงวตถเจอปนอาหารบรสทธ

ตวอยางสเปกตรมของสารละลายวตถเจอปนอาหารทความเขมขนแตกตางกน ดงแสดงดงภาพท 24, 27, 30 และ 32 พบวา สเปกตรมสารละลายน าตาลซโครส (ภาพท 24) ทความเขมขนแตกตางกน มลกษณะสเปกตรมทคลายกนและคลายกบสเปกตรมของน ากลน พบพคการดดกลนแสงทชดเจนอยทบรเวณ 6900 และ 5200 cm-1 ซงต าแหนงนมความสมพนธกบการสนแบบโอเวอรโทนอนดบหนงของพนธะ O-H และคอมบเนชนของพนธะ O-H (Rodriguez-Saona และคณะ, 2001; Xie และคณะ, 2009) ของโมเลกลของน า และสอดคลองกบสเปกตรมสารละลายน าตาลซโครส ดงงานวจยของ Rodriguez-Saona และคณะ (2001) (ภาพท 26) ซงแสดงลกษณะพคทคลายกน พบพคทชดเจนคอ พคน าเชนกน และเมอวดสเปกตรมของน าตาลซโครส (ของแขง) พบการดดกลนท เลขคลน 4191, 4298, 4512, 4806, 5367, 5776, 5928, 6311, 6605, 6952, 7272, 8368, 10184 และ 10896 cm-1 (ภาพท 25) โดยเลขคลนดงกลาวมความสอดคลองกบการดดกลนของน าตาลซโครสและแปง (Osborne และคณะ, 1993)

64

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1) สารละลายน าตาลซโครส 1 % สารละลายน าตาลซโครส 5%สารละลายน าตาลซโครส 10 % น ากลน

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 24 สเปกตรมสารละลายน าตาลซโครส

ภาพท 25 สเปกตรมน าตาลซโครส

6900 cm-1 O-H overtone

5200 cm-1 O-H combination

4191

5367 4806

4512 4298 5928 5776 6605

6311

8368

7272 6952

10896

10184

65

ภาพท 26 สเปกตรมสารละลายน าตาลซโครสจากเอกสารอางอง (ก) สเปกตรมดงเดม (ข) สเปกตรมท ปรบแตงดวยอนพนธอนดบสอง

สเปกตรมสารละลายวตามนซ แสดงดงภาพท 27 ทความเขมขนแตกตางกน มลกษณะ

สเปกตรมทคลายกนและคลายกบสเปกตรมของน ากลน เนองจากพคน ามลกษณะกวางเตย ท าใหไมสามารถเหนพคอนไดอยางชดเจน พบพคการดดกลนแสงทชดเจนอยทบรเวณ 6900 และ 5200 cm-1 ซงต าแหนงนมความสมพนธกบการสนแบบโอเวอรโทนอนดบหนงของพนธะ O-H และคอมบเนชนของพนธะ O-H (Osborne และคณะ, 1993) นอกจากนเมอวดสเปกตรมวตามนซผง ดงภาพท 28พบวา ใหลกษณะสเปกตรมทคลายกบงานวจยของ Liu และคณะ (2006) ดงภาพท 29 พบการดดกลนทเลขคลน 4031, 4450, 5714, 6872, 7388, 7860, 8270 และ 10059 cm-1 โดยเลขคลนดงกลาวมความสอดคลองกบการดดกลนของพนธะ O-H str. second overtone และ C-H str. second overtone ของโครงสรางวตามนซ (Osborne และคณะ, 1993)

(ก) (ข)

7500–6700 cm-1 O-H stretching 6000–4000 cm-1 C-H combination

66

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1) สารละลายวตามนซ 1% สารละลายวตามนซ 5%สารละลายวตามนซ 10% น ากลน

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 27 สเปกตรมสารละลายวตามนซ

ภาพท 28 สเปกตรมวตามนซ

6900 cm-1 O-H overtone

5200 cm-1 O-H combination

5714

4450 4031

7388 6872

7860 8270

10059

67

ภาพท 29 สเปกตรมวตามนซจากเอกสารอางอง

สเปกตรมสารละลายซงคกลโคเนต แสดงดงภาพท 30 พบวา สเปกตรมสารละลายซงคกลโคเนต ทความเขมขนแตกตางกนมลกษณะคลายกน และคลายกบสเปกตรมน ากลน โดยพคน าทมขนาดใหญไปบดบงพคขององคประกอบอนๆ ท าใหไมสามารถเหนองคประกอบอนๆได พบพคการดดกลนแสงทชดเจนอยทบรเวณ 6900 และ 5200 cm-1 ซงต าแหนงนมความสมพนธกบการสนแบบโอเวอรโทนอนดบหนงของพนธะ O-H และคอมบเนชนของพนธะ O-H (Osborne และคณะ , 1993) นอกจากนเมอวดสเปกตรมของซงคกลเนต (ของแขง) ดงภาพท 31 พบการดดกลนทเลขคลน 4485, 4717, 5759, 6320, 8323 และ 9997 cm-1 มความสอดคลองกบการดดกลนของพนธะ C-H str. second overtone O-H str. first overtone และ second overtone ในโครงสรางซงคกลโคเนต (Osborne และคณะ, 1993)

68

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1) สารละลายซงคกลโคเนต 1% สารละลายซงคกลโคเนต 5%สารละลายซงคกลโคเนต 10% น ากลน

ภาพท 30 สเปกตรมสารละลายซงคกลโคเนต

ภาพท 31 สเปกตรมซงคกลโคเนต

6900 cm-1 O-H overtone

5200 cm-1 O-H combination

6320

9997

8323

5759

4717 4485

69

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1) สารละลายโซเดยมเบนโซเอท 1% สารละลายโซเดยมเบนโซเอท 5%

สารละลายโซเดยมเบนโซเอท 10% น ากลน

สเปกตรมสารละลายโซเดยมเบนโซเอท แสดงดงภาพท 32 พบวา สเปกตรมสารละลายโซเดยมเบนโซเอท ทความเขมขนแตกตางกนมลกษณะคลายกน และคลายกบสเปกตรมน ากลน โดยพบพคการดดกลนแสงทชดเจนอยทบรเวณ 6900 และ 5200 cm-1 ซงต าแหนงนมความสมพนธกบการสนแบบโอเวอรโทนอนดบหนงของพนธะ O-H และคอมบเนชนของพนธะ O-H (Osborne และคณะ, 1993) นอกจากนเมอวดสเปกตรมโซเดยมเบนโซเอท (ของแขง) ดงภาพท 33 พบพคการดดกลนทต าแหนง 4067, 4200, 4370, 4663, 5233, 5500, 5661, 6008, 7059, 8804 และ 11520 cm-1 ซงต าแหนงดงกลาวมความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ O-H def. second overtone, O-H str. First overtone, C-H str. และ first overtone และ C-O str. ในโครงสรางของโซเดยมเบนโซเอท (Osborne และคณะ, 1993)

ภาพท 32 สเปกตรมสารละลายโซเดยมเบนโซเอท

6900 cm-1 O-H overtone

5200 cm-1 O-H combination

70

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g 1/R

)

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 33 สเปกตรมโซเดยมเบนโซเอท

เมอปรบแตงสเปกตรมสารละลายวตถเจอปนอาหารชนดตางๆ ดวยวธอนพนธอนดบสอง แสดงดงภาพท 34 พบวาให ลกษณะสเปกตรมทตางกน ทชวงเลขคลน 4700-4000 cm-1 มความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ N-H str.+amide III, C-H str. และ O-H str. ทมในโครงสรางคอลลาเจน และชวงเลขคลน 6200-5800 cm-1 มความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ O-H str. first overtone และ C-H str. first overtone ทมในโครงสรางวตถเจอปนอาหาร (Osborne และคณะ, 1993)

4200 4067 5233

4663 4370

6008 5661

5500

8804

7059

11520

71

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2 (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)สารละลายคอลลาเจน สารละลายซงคกลโคเนตสารละลายวตามนซ สารละลายน าตาลซโครสสารละลายโซเดยมเบนโซเอท

ภาพท 34 สเปกตรมของสารละลายชนดตางๆ ทปรบแตงดวยวธอนพนธอนดบสอง

4.2.1.2 สารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปนอาหาร

สเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปนอาหาร วดสเปกตรมในชวงเลขคลน 12500-4000 cm-1 แสดงดงภาพท 35, 36, 37 และ 38

ภาพท 35 พบวาสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทเตมน าตาลซโครสความเขมขนตางๆ กนมลกษณะคลายกน และคลายกบสารละลายคอลลาเจน พบการดดกลนทชดเจนทบรเวณ 7200-6900 cm-1 มความสมพนธกบการดดกลนของหม –OH (Nicolaï และคณะ, 2007; Omar และคณะ, 2012a; Omar และคณะ, 2012b) ในขณะเดยวกนทบรเวณ 5200-4900 cm-1 ซงเปนชวงคลนยาว มความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ C-H และ O-H (Büning-Pfaue, 2003; Oliveira และคณะ, 2014) Segtnan และ Isaksson (2002) พบพคการดดกลนของน าตาลซโครสทเลขคลน 6756 , 6329, 5717, 4716, 4358 และ 4291 cm-1 Tewari และคณะ (2003) พบการดดกลนทชวงเลขคลน 6060-5740 cm-1 และ 4650-4350 cm-1 มความสมพนธกบการดดกลนของน าตาลซโครสเชนกน

4700-4000 cm-1 N-H str.+amide III C-H str. O-H str.

6200-5800 cm-1 C-H str. first overtone O-H str. first overtone

72

ภาพท 35 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมน าตาลซโครสทความเขมขน แตกตางกน ภาพท 36 พบวาสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทเตมวตามนซทความเขมขนตางๆ กน

มลกษณะคลายกน และคลายกบสารละลายคอลลาเจน โดยพบการดดกลนทชดเจนบรเวณ 7200-6900 cm-1 เชนเดยวกน ซงมความสมพนธกบการดดกลนของหม –OH และทบรเวณ 5200-4900 cm-1 มความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ C-H และ O-H เนองจากสารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปนอาหารมน าเปนองคประกอบหลก ซงพคน ามลกษณะเปนพคทกวางเตยและมลกษณะเหลอมซอนกนกบวตถเจอปนอาหาร จงไมสามารถเหนพคเหลานนไดอยางชดเจน ซงการดดกลนในลกษณะนสามารถพบไดในสเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของน าเบยเบอรร (Xie และคณะ, 2009) นอกจากนยงพบในเนกตาฝรงและเนกตามะมวงหมพานต (Caramês และคณะ , 2017) และMalegori และคณะ (2016) พบพคการดดกลนทเลขคลน 7200-6700 cm-1 ซงมความสมพนธกบวตามนซ

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+น าตาลซโครส 2% สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+น าตาลซโครส 5%สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+น าตาลซโครส 10% สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L

73

ภาพท 36 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมวตามนซทความเขมขน แตกตางกน

ภาพท 37 พบวาสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทเตมซงคกลโคเนตทความเขมขน

แตกตางกน มลกษณะคลายกบสารละลายคอลลาเจน มการดดกลนของพคน าทชดเจนทชวงเลขคลน 7200-6900 cm-1 สมพนธกบการดดกลนของหม -OH ทชวงคลน 5200-4900 cm-1 สมพนธกบการดดกลนของพนธะ C-H และ O-H เนองจากซงคเปนกรดอนนทรยจงไมพบการดดกลนดวยรงส NIRS แตเมอสรางพนธะกบโมเลกลของน าตาล จงท าใหวดการดดกลนของซงคกลโคเนตได โดยการดดกลนกจะสมพนธกบโมเลกลของน าตาล

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+วตามนซ 0.01% สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+วตามนซ 0.05%สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+วตามนซ 0.10% สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L

74

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+ซงคกลโคเนต 0.01%สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+ซงคกลโคเนต 0.05%สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+ซงคกลโคเนต 0.10%สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L

ภาพท 37 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมซงคกลโคเนตทความเขมขน

แตกตางกน

ภาพท 38 พบวาสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทเตมโซเดยมเบนโซเอททความเขมขนแตกตางกน มลกษณะสเปกตรมคลายกบสารละลายคอลลาเจน และจะพบการดดกลนของน าทบรเวณเลขคลน 7200-6900 cm-1 และบรเวณเลขคลน 5200-4900 cm-1 ซงมความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ C-H และ O-H โดยโซเดยมเบนโซเอทเปนสารจ าพวกเกลอโซเดยมกบกรดเบนโซอก ซงโครงสรางหลกเปนวงแหวนอะโรมาตก โดยมต าแหนงการดดกลนทเลขคลน 8748, 7057, 6915 และ 5934 cm-1 (Osborne และคณะ, 1993)

75

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

สารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+โซเดยมเบนโซเอท 200 mg/Lสารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+โซเดยมเบนโซเอท 500 mg/Lสารละลายคอลลาเจน 500 mg/L+โซเดยมเบนโซเอท 1,000 mg/Lสารละลายคอลลาเจน 500 mg/L

ภาพท 38 สเปกตรมสารละลายคอลลาเจน 500 มลลกรมตอลตร ทเตมโซเดยมเบนโซเอททความ

เขมขนแตกตางกน

เนองจากสารละลายวตถเจอปนอาหารมน าเปนองคประกอบหลกจงท าใหไมสามารถมองเหนพคของวตถเจอปนอาหารได ดงนนจงตองท าการปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง เพอแยกจดยอดทเหลอมซอนกนในสเปกตรมออกจากกน และลดผลกระทบทท าใหสเปกตรมมขนาดเพมขนตลอดชวงความยาวคลน นอกจากนการใชอนพนธอนดบสองยงใหผลดกบตวอยางทมขนาดอนภาคตางๆ ผสมผสานอย แสดงดงภาพท 39 ซงจะเหนวาสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจน และสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปนอาหารใหลกษณะสเปกตรมทแตกตางกนในชวงคลนยาว ซงเปนชวงคลนทมความสามารถในการดดกลนพนธะสงหรอม molar absorptivity สง จงท าใหเหนพคมความแตกตางกนมากในชวงน

76

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2(lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)สารละลายคอลลาเจน สารละลายคอลลาเจน+น าตาลซโครสสารละลายคอลลาเจน+วตามนซ สารละลายคอลลาเจน+ซงคกลโคเนตสารละลายคอลลาเจน+โซเดยมเบนโซเอท

ภาพท 39 สเปกตรมของสารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปนอาหารชนดตางๆทปรบแตงดวยวธ อนพนธอนดบสอง

4.2.2 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน คาสถตของสารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปนอาหาร ส าหรบสรางสมการเทยบ

มาตรฐานและทวนสอบสมการดวยเทคนค NIRS แสดงดงตารางท 10 ผลการสรางสมการเทยบมาตรฐานในการศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารแตละชนดไดแก น าตาล วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และ ซงคกลโคเนต และองคประกอบโดยรวม ตอการวดสเปกตรมคอลลาเจน แสดงรายละเอยดดงน

ส าหรบการสรางสมการเทยบมาตรฐานเพอศกษาอทธพลของน าตาลในสารละลาย คอลลาเจน แสดงดงตารางท 11 โดยในการศกษาน ท าการเปรยบเทยบสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนกบสเปกตรมสารละลายน าตาลซโครสทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง แสดงดงภาพท 40 พบวา ชวง 5203-3999 cm-1 ใหลกษณะสเปกตรมทตางกน ซงชวงดงกลาวมความสมพนธกบการดดกลนของน าตาล มความสอดคลองกบสเปกตรมน าตาลซโครสดงภาพท 25 และ 26 (ข) และสอดคลองกบงานวจยของ Oliveira และคณะ (2014) พบวาทเลขคลน 5411 4728 4721 และ 4370 cm-1 มความสมพนธกบการดดกลนองคประกอบของ กลโคส ฟรกโตส และซโครสในเสาวรส

4700-4200 cm-1 N-H sym.+amide III amide+amide III O-H str.

77

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2(lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

สารละลายคอลลาเจน สารละลายน าตาลซโครส

ภาพท 40 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลายน าตาล ซโครสทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง

การสรางสมการเทยบมาตรฐานพบวา สมการทเหมาะทสดคอ สมการการทผานการปรบแตง

สเปกตรมดวยวธ SNV ทชวงคลน 5203-3999 cm-1 โดยท าใหคา R2 ในกลมเทยบมาตรฐานเพมขน จาก 0.924 เปน 0.935 ซงชวงคลนดงกลาวเปนชวงทมความสมพนธกบพนธะ N-H และหมเอไมดของโครงสรางกรดอะมโนดวยเชนกน ดงนนจากการศกษานจะเหนไดวา สารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปนอาหารตาง ๆ เปนตวรบกวนทเตมน าตาลซโครสความเขมขนแตกตางกน พบวาน าตาลซโครสไมมผลตอการท านายปรมาณคอลลาเจน เมอสงเกตจากโครงสรางน าตาล น าตาลมสวนวงแหวนตอกบออกซเจน ซงตางจากวงแหวนของกรดอะมโนไฮดรอกซโพรลนทเปนตวบงชปรมาณคอลลาเจน นอกจากน น าตาลไมมหม N-H อยในโครงสราง ท าใหสามารถตรวจวดคอลลาเจนไดโดยไมมอทธพลของน าตาลเขามารบกวน แตในชวงคลนดงกลาวเปนชวงทมความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ C-H และ O-H เปนหลก จงชวยสงเสรมประสทธภาพการท านายของสมการใหสงขนได (Rungpichayapichet และคณะ, 2015) โดยชวงความยาวคลน 5203-3999 cm-1 ทรวมการดดกลนของน าตาล จะใหผลการท านายทสงกวาชวง 4701-3999 cm-1

5203-3999 cm-1 O-H def. second overtone C-H str.+C=O str. C-H str. first overtone

78

ตารางท 10 คาสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของวตถเจอปนอาหารส าหรบสรางสมการเทยบมาตรฐานและทวนสอบสมการดวยเทคนค NIRS

วตถเจอปนอาหาร สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทวนสอบ (30%)

จ านวนตวอยาง

คาต าสด-คาสงสด (มลลกรมตอลตร)

คาเฉลย สวนเบยงเบน

มาตรฐาน จ านวนตวอยาง

คาต าสด-คาสงสด (มลลกรมตอลตร)

คาเฉลย สวนเบยงเบน

มาตรฐาน น าตาลซโครส 147 500-5,000 2,397.95 1,795.10 63 500-5,000 2,412.05 1,752.01 วตามนซ 98 500-5,000 2,438.77 1,808.15 42 500-5,000 2,355.26 1,770.28 โซเดยมเบนโซเอท 98 500-5,000 2,489.79 1,810.59 42 500-5,000 2,153.84 1,698.11 ซงคกลโคเนต 98 500-5,000 2,413.26 1,800.66 42 500-5,000 2,269.23 1,693.04 รวมทกองคประกอบ 441 500-5,000 2,464.85 1,802.90 189 500-5,000 2,259.77 1,729.89

79

79

ภาพท 41 แสดงขอมลการกระจายตวของปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจน ทเตมวตถเจอปนอาหารชนดตางๆ (ก) น าตาลซโครส (ข) วตามนซ (ค) โซเดยมเบนโซเอท (ง) ซงคกลโคเนต และ (จ) รวมทกตว ในกลมสมการเทยบมาตรฐานและทวนสอบสมการ ซงจะเหนไดวาขอมลมการกระจายตวไมคอยสม าเสมอ ท าใหมผลตอการสรางสมการเทยบมาตรฐาน โดยคาทางเคมทไดจากการวเคราะหตองมการกระจายตวอยางสม าเสมอจงจะท าใหสมการเทยบมาตรฐานใหผลการท านายทแมนย า ดงนนขอมลจงตองมจ านวนมากและมกระจายครอบคลมตวอยางในอนาคต รวมทงตองมความถทใกลเคยงกนจงจะท าใหสมการเทยบมาตรฐานทสรางขนมความสมพนธกนสง

80

80

0

5

10

15

20

25

30

35

500 1000 2000 3000 4000 5000

ความ

ถ

0

10

20

30

40

500 1000 2000 3000 4000 5000

ความ

ถ

ปรมาณคอลลาเจน

ภาพท 41 การกระจายตวของปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปน อาหาร (ก) น าตาลซโครส (ข) วตามนซ (ค) โซเดยมเบนโซเอท (ง) ซงคกลโคเนต และ (จ) รวมทกตว

0

10

20

30

40

50

500 1000 2000 3000 4000 5000

ความ

ถ

0

10

20

30

40

500 1000 2000 3000 4000 5000

ความ

ถ

ปรมาณคอลลาเจน

020406080

100120140

500 1000 2000 3000 4000 5000

ความ

ถ

ปรมาณคอลลาเจนสมการเทยบมาตรฐาน สมการทวนสอบ

ปรมาณคอลลาเจน ปรมาณคอลลาเจน

(ก) (ข)

(ค) (ง)

(จ)

81

ตารางท 11 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของน าตาลซโครสตอการวดคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS

วตถเจอปนอาหาร ชวงเลขคลน (cm-1) การปรบแตงสเปกตรม

PLS factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทดสอบความแมนย า (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L)

R2 RMSEP (mg/L)

Bias

น าตาลซโครส

9403-5446* 4601-4246

SNV 7 0.937 459 0.940 425 25.3 4.1

4701-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

9 0.898 590 0.910 521 34.4 3.34

SNV 8 0.911 549 0.927 467 64.5 3.74 MSC 8 0.911 549 0.927 467 65 3.74

5203-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

10 0.924 510 0.918 480 85.1 3.56

SNV 9 0.935 471 0.920 472 48.4 3.56 MSC 9 0.934 474 0.917 480 57.7 3.51

หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction, RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction SNV: Standard Normal Variate และ * หมายถง สมการทไดจากการ optimize

82

82

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(ม

ลลกร

มตอล

ตร)

ปรมาณคอลลาเจนทเตรยมได (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐานสมการทวนสอบ

จากภาพท 42 แสดงการกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาลซโครส ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS และภาพท 43 แสดงคาสมประสทธการถดถอย (regression coefficient) ของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาลซโครส ทผานการปรบแตงดวยวธ SNV ซงจะสงเกตเหนตวแปรทมอทธพลและความส าคญตอแบบจ าลองอยทเลขคลน 4023, 4036, 4093, 4328, 4422, 4484, 4382, 4569, 4599, 4617, 4723, 4746, 4779, 4833, 4867, 4869, 4998, 4976, 5034, 5085, 5171, 5074 และ 5094 cm–1 ซงสอดคลองกบการดดกลนของการสนพนธะ O-H C-H N-H และ เอไมดทมความสมพนธกบกรดอะมโนและโปรตนในโครงสรางคอลลาเจน (Osborne และคณะ, 1993) จากภาพท 43 สามารถคดเลอกเลขคลนเฉพาะทมความสมพนธกบการดดกลนแสงของโครงสรางคอลลาเจนได และสามารถลดคาใชจายเพอใชในการพฒนาเครองมอตอไปในอนาคต

ภาพท 42 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาล

ซโครส ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS

R2 = 0.920 RMSEP = 472 mg/L Bias = 48.4 RPD = 3.56

83

83

-2500000-2000000-1500000-1000000-500000

0500000

100000015000002000000

4000420044004600480050005200

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 43 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาลซโครส ทผาน

การปรบแตงดวยวธ SNV

ส าหรบการสรางสมการเทยบมาตรฐานเพอศกษาอทธพลของวตามนซในสารละลายคอลลาเจน แสดงดงตารางท 12 โดยในการศกษาน ท าการเปรยบเทยบสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนกบสารละลายวตามนซ ทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง แสดงดงภาพท 44 พบวา ชวง 6896-5199 cm-1 ใหลกษณะสเปกตรมทตางกน ซงชวงเลขคลนดงกลาวมความสมพนธกบการดดกลนของวตามนซ สอดคลองกบสเปกตรมวตามนซ ดงภาพท 28 และ 29 นอกจากนยงสอดคลองกบงานวจยของ Malegori และคณะ (2016) พบพคการดดกลนทเลขคลน 7200-6700 cm-1 ซงมความสมพนธกบวตามนซ และงานวจยของ Liu และคณะ (2006) พบพคทมความสมพนธกบโครงสรางของวตามนซ ทเลขคลน 6920, 6860, 6720 cm−1 ในการสรางสมการเทยบมาตรฐานพบวา สมการทเหมาะทสดคอ สมการทผานการปรบแตงสเปกตรมดวยวธ SNV ทชวงคลน 6896-5199 และ 4701-3999 cm-1 โดยใหคา R2 ในกลมสมการท านายเทากบ 0.930 RMSEP เทากบ 464 Bias เทากบ 42.4 และม RPD เทากบ 3.81 ตามล าดบ ซงชวงเลขคลน 6896-5199 มความสมพนธกบพนธะ O-H ทมในโครงสรางวตามนซ

4328

4422

4617 4569

4382

4746

4998 5034

5085

4723 4484

4023 4090

84

84

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2(o

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)สารละลายคอลลาเจน สารละลายวตามนซ

ภาพท 44 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลายวตามนซ ท

ปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง

6896-5199 cm-1 O-H str. second overtone O-H str. first overtone C-H str. first overtone

85

ตารางท 12 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของวตามนซตอการวดคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS วตถเจอปน

อาหาร ชววงเลขคลน

(cm-1) การปรบแตงสเปกตรม

PLS factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทดสอบความแมนย า (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L)

R2 RMSEP (mg/L)

Bias

วตามนซ

6102-4246* 1st derivative+MSC 9 0.947 436 0.952 382 42.5 4.59

4701-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

8 0.871 676 0.901 539 52.6 3.20

SNV 8 0.874 661 0.922 485 2.35 3.60 MSC 6 0.874 661 0.922 485 3.27 3.60

6896-5199 4701-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

9 0.932 494 0.909 529 -87.7 3.37

SNV 9 0.963 363 0.930 464 42.4 3.81 MSC 9 0.962 369 0.925 485 88.6 3.73

หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction, RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction SNV: Standard Normal Variate และ * หมายถง สมการทไดจากการ optimize

86

86

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(มลล

กรมต

อลตร

)

ปรมาณคอลลาเจนทเตรยมได (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐานสมการทวนสอบ

จากภาพท 45 แสดงการกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของวตามนซทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS และภาพท 46 แสดงคาสมประสทธการถดถอย (regression coefficient) ของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของวตามนซทผานการปรบแตงดวยวธ SNV ซงจะสงเกตเหนตวแปรทมอทธพลและความส าคญตอแบบจ าลองอย ทเลขคลน 4702, 4276, 4036, 5270, 5960, 6884, 6866, 5823, 5540, 5340, 5288, 4437, 4151, และ 4081 cm–1 ซงสอดคลองกบการดดกลนของการสนพนธะ N-H และเอไมด ของโครงสรางกรดอะมโนและโปรตน และการสนของพนธะ C-H และ O-H ทเปนสวนประกอบในโครงสรางกรดอะมโน ทมความสมพนธกบกรดอะมโนและโปรตนในโครงสรางคอลลาเจน (Osborne และคณะ, 1993)

ภาพท 45 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของวตามนซ

ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS

R2 = 0.930 RMSEP = 464 mg/L Bias = 42.4 RPD = 3.81

87

87

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

2000000

4000450050005500600065007000

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 46 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของวตามนซทผาน

การปรบแตงดวยวธ SNV

ส าหรบการสรางสมการเทยบมาตรฐานเพอศกษาอทธพลของโซเดยมเบนโซเอทในสารละลายคอลลาเจน แสดงดงตารางท 13 โดยในการศกษาน ท าการเปรยบเทยบสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนกบสารละลายโซเดยมเบนโซเอททปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง แสดงดงภาพท 47 พบวาทชวงเลขคลน 6005-5415 และ 4863-4273 cm-1 มสเปกตรมทตางกน ซงเลขคลนดงกลาว มความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ C-H และ O-H โดยเกลอเบนโซเอทมโครงสรางหลกเปนวงแหวนอะโรมาตก โดยมต าแหนงการดดกลนทเลขคลน 5934 cm-1 (Osborne และคณะ, 1993)

การสรางสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะทสดคอ สมการทผานการปรบแตงสเปกตรมดวยวธ SNV ทชวงคลน 6005-5415 และ 4863-4273 cm-1 โดยใหคา R2 ในกลมสมการท านายเทากบ 0.927 RMSEP เทากบ 445 Bias เทากบ 41.1 และม RPD เทากบ 3.73 ตามล าดบ

5823 6866 4702 4276

5270 5288

4437 4151

88

88

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2(lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

สารละลายคอลลาเจน สารละลายโซเดยมเบนโซเอท

ภาพท 47 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลายโซเดยมเบน

โซเอททปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง

6005-5415 cm-1 C-H str. first overtone O-H str. first overtone C-O str.

4863-4273 cm-1

N-H sym.+amide III amide+amide III O-H str.

89

ตารางท 13 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของโซเดยมเบนโซเอทตอการวดคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS

วตถเจอปนอาหาร

ชวงเลขคลน (cm-1) การปรบแตงสเปกตรม

PLS factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทดสอบความแมนย า (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L)

R2 RMSEP (mg/L)

Bias

โซเดยม เบนโซเอท

9403-5446* 4601-4246

SNV 7 0.980 265 0.947 383 -89.5 4.50

4700-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

7 0.882 645 0.852 664 -111 2.64

SNV 5 0.864 685 0.846 679 -85.3 2.57 MSC 5 0.864 685 0.848 658 -124 2.62

6005-5415 4863-4273

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

7 0.939 461 0.936 417 22.2 3.96

SNV 5 0.940 454 0.927 445 41.1 3.73 MSC 5 0.954 398 0.921 464 -0.07 3.57

หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction, RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction SNV: Standard Normal Variate และ * หมายถง สมการทไดจากการ optimize

90

90

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 2000 4000 6000

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(มลล

กรมต

อลตร

)

ปรมาณคอลลาเจนทเตรยมได (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐานสมการทวนสอบ

จากภาพท 48 แสดงการกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของโซเดยมเบนโซเอททไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS และภาพท 49 แสดงคาสมประสทธการถดถอย (regression coefficient) ของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของโซเดยมเบนโซเอททผานการปรบแตงดวยวธ SNV ซงจะสงเกตเหนตวแปรทมอทธพลและความส าคญตอแบบจ าลองอยทเลขคลน 4302, 4337, 4357, 4384, 4430, 4468, 4512, 4595, 4619, 4867, 4732, 5473, 5878, 5981, 5941 และ 5788 cm–1 ซงสอดคลองกบการดดกลนของการสนพนธะ O-H C-H N-H และเอไมด ทมความสมพนธกบกรดอะมโนและโปรตนในโครงสรางคอลลาเจน (Osborne และคณะ, 1993) ดวยการสนของพนธะสารในแตละเลขคลนเฉพาะ ท าใหสามารถเลอกเลขคลนทเกยวของกบสารตางๆ ทมอยในตวอยางและน ามาสรางสมการเพอท านายได

ภาพท 48 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของโซเดยม

เบนโซเอททไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS

R2 = 0.927 RMSEP = 445 mg/L Bias = 41.1 RPD = 3.73

91

91

-1500000-1200000-900000-600000-300000

0300000600000900000

12000001500000

42004400460048005000520054005600580060006200

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 49 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของโซเดยมเบนโซเอททผาน

การปรบแตงดวยวธ SNV

4302

4384

4430

4468 4512

4595 4867

4732 5878 5941

5788

92

92

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2(lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)

สารละลายคอลลาเจน สารละลายซงคกลโคเนต

ส าหรบการสรางสมการเทยบมาตรฐาน เพอศกษาอทธพลของซงคกลโคเนตในสารละลายคอลลาเจน แสดงดงตารางท 14 ท าการเปรยบเทยบสเปกตรมสารละลายคอลลาเจนกบสารละลายซงคกลโคเนตทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง แสดงดงภาพท 50 พบวาทชวงเลขคลน 5126-4258 cm-1 มสเปกตรมทตางกน ซงชวงเลขคลนดงกลาว มความสมพนธกบการดดกลนของพนธะ C-H และ O-H โดยการดดกลนของซงคกลโคเนตจะใกลเคยงกบบรเวณของน าตาล เนองจากซงคสรางพนธะกบโมเลกลของน าตาลจงท าใหวดการดดกลนของซงคกลโคเนตได และการสรางสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะทสดคอ สมการทไมผานการปรบแตงสเปกตรมทชวงคลน 5126-4258 cm-1 โดยใหคา R2 ในกลมสมการท านายเทากบ 0.932 RMSEP เทากบ 448 Bias เทากบ 5.53 และม RPD เทากบ 3.85 ตามล าดบ

ภาพท 50 สเปกตรมการดดกลนแสง NIRS ของสารละลายคอลลาเจนเทยบกบสารละลายซงคกลโค เนตทปรบแตงสเปกตรมดวยวธอนพนธอนดบสอง

5126-4258 cm-1 C=O str. C-H str.

93

ตารางท 14 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของซงคกลโคเนตตอการวดคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS

วตถเจอปนอาหาร ชวงเลขคลน (cm-1) การปรบแตงสเปกตรม

PLS factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทดสอบความแมนย า (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L)

R2 RMSEP (mg/L)

Bias

ซงคกลโคเนต

9403-5446* 4601-4246

SNV 10 0.980 263 0.947 383 -14.3 4.36

4700-4000 สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

10 0.945 445 0.923 497 -13.7 3.61

SNV 7 0.938 464 0.910 529 -22.4 3.35

5126-4258

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

9 0.966 346 0.932 448 5.53 3.85

SNV 7 0.960 372 0.928 441 -61.7 3.77 MSC 7 0.960 374 0.928 442 -59.6 3.76

หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction, RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction SNV: Standard Normal Variate และ * หมายถง สมการทไดจากการ optimize

94

94

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(มลล

กรมต

อลตร

)

ปรมาณคอลลาเจนทเตรยมได (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐานสมการทวนสอบ

จากภาพท 51 แสดงการกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของซงคกลโคเนต ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS และภาพท 52 แสดงคาสมประสทธการถดถอย (regression coefficient) ของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของซงคกลโคเนตทไมผานการปรบแตงสเปกตรม ซงจะสงเกตเหนตวแปรทมอทธพลและความส าคญตอแบบจ าลองอยทเลขคลน 5123, 5116, 5084, 5045, 4973, 4952, 4963, 4918, 4906, 4886, 4760, 4638, 4614, 4590, 4572, 4494, 4431, 4378 และ 4313 cm–1 ซงสอดคลองกบการดดกลนของการสนพนธะ N-H ของโครงสรางโปรตนและ CONH2 กบเอไมดของโครงสราง CONH CONH2 และโปรตน พนธะ C-H ของโครงสราง CH3 และ CH2 ซงมความสมพนธกบโครงสรางคอลลาเจน (Osborne และคณะ, 1993)

ภาพท 51 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของซงคกลโค เนตทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS

R2 = 0.932 RMSEP = 448 mg/L Bias = 5.53 RPD = 3.85

95

95

-500000-400000-300000-200000-100000

0100000200000300000400000

42004300440045004600470048004900500051005200

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 52 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของซงคกลโคเนตทไมผาน

การปรบแตงสเปกตรม ส าหรบการสรางสมการเทยบมาตรฐานเพอศกษาอทธพลของรวม น าตาลซโครส วตามนซ

โซเดยมเบนโซเอท ซงคกลโคเนตในสารละลายคอลลาเจน แสดงดงตารางท 15 พบวาสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะทสดคอ สมการทผานการปรบแตงสเปกตรมดวยวธ MSC ทชวงคลน 7000-4000 cm-1 ซงเปนชวงคลนยาว มคาการดดกลนของพนธะทางเคมสง โดยใหคา R2 ในกลมสมการท านายเทากบ 0.946 RMSEP เทากบ 400 Bias เทากบ -62.7 และม RPD เทากบ 4.38 ตามล าดบ

4918

4752

5045 5084

4886

4638 4614

4950

4494

4378 4313

96

ตารางท 15 คาทางสถตของแบบจ าลองทศกษาอทธพลของน าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และซงคกลโคเนตตอการวดคอลลาเจนดวยเทคนค NIRS

วตถเจอปนอาหาร ชวงเลขคลน (cm-1) การปรบแตงสเปกตรม

PLS factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทดสอบความแมนย า (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L)

R2 RMSEP (mg/L)

Bias

รวม น าตาล วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท ซงคกลโคเนต

9403-5446* 4601-4246

SNV 10 0.980 263 0.947 383 -14.3 4.36

12493-3999 สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

10 0.825 762 0.797 761 -56.1 2.23

SNV 10 0.929 484 0.872 612 -18.8 2.81

7000-4000

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

10 0.912 545 0.918 496 -82.0 3.54

SNV 10 0.950 405 0.945 402 -66 4.34 MSC 10 0.951 405 0.946 400 -62.7 4.38

หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction, RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction SNV: Standard Normal Variate และ * หมายถง สมการทไดจากการ optimize

97

97

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(ม

ลลกร

มตอล

ตร)

ปรมาณคอลลาเจนทเตรยมได (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐานสมการทวนสอบ

จากภาพท 53 แสดงการกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาลซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และซงคกลโคเนต ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS และภาพท 54 แสดงคาสมประสทธการถดถอย (regression coefficient) ของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาล วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และซงคกลโคเนต ทผานการปรบแตงสเปกตรมดวยวธ MSC ซงจะสงเกตเหนตวแปรทมอทธพลและความส าคญตอแบบจ าลองอยทเลขคลน 4056, 4113, 4210, 4434, 4613, 4787, 4897, 5281 และ 5460 cm–1 ซงสอดคลองกบการดดกลนของการสนพนธะ O-H C-H เอไมด และ N-H ของโครงสราง CONHR CONH2 ROH ของกรดอะมโนและโปรตน (Osborne และคณะ, 1993) ภาพท 53 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาล

ซโครส วตามนซ โซเดยมเบนโซเอท และซงคกลโคเนต ทไดจากการสรางสมการเทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS

R2 = 0.946 RMESP = 400 mg/L Bias = -62.7 RPD = 4.38

98

98

-150000-100000-50000

050000

100000150000200000250000

4000450050005500600065007000

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 54 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนกบอทธพลของน าตาลซโครส วตามนซ

โซเดยมเบนโซเอท และซงคกลโคเนต ทผานการปรบแตงดวยวธ MSC

นอกจากนเมอน าตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาดมาท านายดวยสมการสารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปนอาหาร เพอใหมความคลายกบเครองดมทมจ าหนายในทองตลาด พบวา ไมสามารถท านายไดเชนกน เนองจากเครองดมทวางจ าหนาย นอกจากมการเตมวตถเจอปนอาหารแลว ยงมการเตมส กลน และสารใหความขน สงผลใหมองคประกอบภายในตวอยางทตางกน และเมอพจารณาจากขดจ ากดของคาระยะหางมาหาลาโนบสเฉลย (Average Mahalanobis Distance) คอ ความแตกตางระหวางสเปกตรมของตวอยางกบคาเฉลยของทกสเปกตรมในกลมสมการเทยบมาตรฐาน โดยการค านวณจะพจารณาบนพนฐานการกระจายของสเปกตรมในกลมสมการเทยบมาตรฐานทงหมด ซงจะตองค านวณคาเฉลยและคาเบยงเบนมาตรฐาน ถาพบวาเกนขดจ ากดกจะเปน Outlier และจากการศกษานพบวาตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทน ามาท านายมคาระยะมาหาลาโนบสเฉลยเกนขดก าจด จะเหนไดจากคารอยละความคลาดเคลอนเฉลย ทมคาสงรอยละ 122.97 ซงมคารอยละความคลาดเคลอนเฉลยทนอยกวาการศกษาท 1 แสดงวา ตวอยางมองคประกอบภายในทใกลเคยงกนมากขน แสดงดงตารางท 16

4210 4787

5460 5344 4897

4613

4056

4437

99

99

ตารางท 16 การเปรยบเทยบคาจรงและคาท านายของปรมาณคอลลาเจนในน าผลไมเสรมคอลลาเจน ทจ าหนายในทองตลาด ดวยสมการสารละลายคอลลาเจนทท าการเตมวตถเจอปนอาหารทเหมาะสมทสด

รหสตวอยาง คาจาก HPLC (mg/L) คาท านาย (mg/L) คาความคลาดเคลอน (%) E 2500 7,358.83 9,050.80 22.99 E 2500 7,631.08 8,424.10 10.39 E 2500 6,832.46 8,426.30 23.33 E 3000 8,589.62 14,649.00 53.11 E 3000 9,567.76 14,635.00 38.85 E 3000 10,540.23 15,235.00 41.12 E 3000 10,795.67 15,210.00 79.38 D 2000 8,479.10 12,711.00 69.73 D 2000 7,488.83 12,765.00 46.69 D 2000 8,701.97 12,609.00 136.82 D 2000 5,324.39 17,230.00 209.93 A 2000 5,559.34 16,482.00 429.49 A 2000 3,112.83 16,920.00 279.29 A 2000 4,460.97 17,246.00 258.99 A 2000 4,804.04 16,767.00 335.76 A 2000 3,847.76 16,617.00 83.16 I 5000 98,666.92 149,820.00 74.03 I 5000 86,087.14 151,210.00 90.09 H 5000 79,547.64 84,648.00 47.15 H 5000 57,526.49 86,811.00 129.19 คาเฉลย 21,746.15 34,873.31 122.97

100

100

4.3 การศกษาความเปนไปไดของการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลในการ ตดตามปรมาณคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาด

4.3.1 สมเกบตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมจ าหนายในประเทศ

กอนท าการศกษาการใชเทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล ในการตรวจสอบคอลลาเจนจะท าการสงเกตลกษณะปรากฏและภาพถายแสดงดงตารางท 17 ซงตวอยางแตละยหอทสมมา เปนเครองดมชนดพรอมดมและเครองดมชนดสกดเขมขนทมจ าหนายในประเทศไทย เมอวเคราะหคาสดวยวธการทางสถตพบวา สามารถแบงสของผลตภณฑไดเปน 9 ระดบ ไดแก สขาวใส สขาวใสและมของแขงแขวนลอย สขาวใสอมเหลอง สขาวใสอมชมพ สชมพเขม สเหลองใส สเหลองอมสม สเหลองอมน าตาล และสมวงเขม เปนตน โดยสวนมากผลตภณฑชนดพรอมดมจะมสขาวใส หรอสขาวเหลอง เนองจากใชน าองนขาวหรอน าแอปเปลในการผลต และเครองดมชนดเขมขนจะมสทเขมกวา เนองจากเปนน าผลไมสกดเขมขน เชน น าองนแดง หรอบางชนดอาจมการเตมสผสมอาหาร เปนตน

101

101

ตารางท 17 ลกษณะปรากฏของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทใชในการศกษา

รหสตวอยาง ลกษณะปรากฏ ภาพถายตวอยาง

A2000 สขาวใสอมเหลอง

B1700 สขาวใสและมของแขงแขวนลอย

C2000 สขาวใสและมของแขงแขวนลอย

D2000 สขาวใสและมของแขงแขวนลอย

E2500 สขาวใสอมชมพ

E3000 สขาวใสอมชมพ

E4000 สเหลองใส

102

102

ตารางท 17 ลกษณะปรากฏและภาพถายของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทใชในการศกษา (ตอ)

รหสตวอยาง ลกษณะปรากฏ ภาพถายตวอยาง

F1000 สชมพเขม

G8000 สเหลองอมสมและมของแขงแขวนลอย

H5000 สมวงเขมและมของแขงแขวนลอย

I5000 สเหลองอมน าตาลและมของแขงแขวนลอย

4.3.2 วเคราะหคณลกษณะทางเคมเบ องตนของเครองดมน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนทวางจ าหนายในประเทศ

เมอน าผลตภณฑน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนมาวดคาคณภาพ พบวาผลตภณฑน าผลไมท

มการเสรมคอลลาเจนมคาปรมาณของแขงทละลายน าทงหมด อยในชวง 4.84-25.1 องศาบรกซ (ºBrix) มคาความเปนกรด-ดาง อยในชวง 3.22-4.65 ซงประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 144 (พ.ศ. 2535) เรอง อาหารในภาชนะบรรจทปดสนท จดอาหารในภาชนะบรรจทปดสนทเปนอาหารควบคมเฉพาะ ก าหนดใหมคาความเปนกรด-ดาง ตงแต 4.6 ลงมา เพอควบคมการเจรญของยสตและเชอรา และจากการวเคราะหคาความหนดในผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนพบวา ตวอยาง E4000, H5000 และ I5000 มความแตกตางทางสถตอยางมนยส าคญ (P≤0.05) โดยตวอยาง H5000 ใหคาความหนดทมากทสด เทากบ 8.24 เซนตพอยส (Centipoise) เนองจากเปนเครองดมชนดสกด

103

103

เขมขน และมของแขงแขวนลอยอยในตวอยาง และตวอยาง A2000, B2000, C2000, E2500 และ E3000 ไมมความแตกตางกนทางสถตอยางมนยส าคญ (P>0.05) เนองจากเปนเครองดมชนดพรอมดมทมความขนหนดนอย นอกจากนคาความหนดทเพมขนมความสอดคลองกบปรมาณคอลลาเจนทเตมลงในเครองดม แสดงรายละเอยดดงตารางท 18 ตารางท 18 คณลกษณะทางเคมเบองตนของผลตภณฑน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนทใชใน

การศกษา

รหสตวอยาง จ านวนตวอยาง

คณลกษณะทางเคมเบองตน ปรมาณของแขงทละลายน า

ทงหมด (องศาบรกซ) ความเปน กรด-ดาง

ความหนด (เซนตพอยส, cps)

A2000 3 12.10±0.16 3.22±0.01 2.32±0.02e B1700 3 9.69±0.07 4.22±0.01 2.28±0.02e C2000 3 7.77±0.13 3.80±0.02 2.25±0.00e D2000 3 4.84±0.05 4.22±0.03 2.39±0.01de E2500 3 5.73±0.06 4.02±0.01 2.29±0.01e E3000 3 7.46±0.13 4.04±0.05 2.35±0.01e E4000 3 17.90±0.05 4.32±0.00 2.70±0.06c F1000 3 11.30±0.08 3.48±0.00 2.46±0.02cde G8000 3 10.80±0.37 4.14±0.01 2.66±0.04cd H5000 3 24.90±0.13 4.08±0.01 8.24±0.51a I5000 3 25.10±0.20 4.65±0.15 3.84±0.13b

*โดยตวอกษร a, b, c, d และ e หมายถง ตวอกษรทแตกตางกนแสดงความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (p≤0.05) เปรยบเทยบในคอลมนเดยวกน

จากการวเคราะหคาความสวาง (L*) ในผลตภณฑน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจน พบวา ตวอยาง E2500, E3000, E4000, F1000, G8000, H5000 และ I5000 มความแตกตางทางสถตอยางมนยส าคญ (P≤0.05) สวนตวอยาง A2000, C2000 และ D2000 ใหคาความสวางสงทสดและไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (P>0.05) เนองจากทงสามตวอยางเปนเครองดมทผลตจากน าองนขาว แสดงดงตารางท 19 ซงคาสทปรากฏในแตละผลตภณฑเปนไปตามชนดของน าผลไมทแตละ

104

104

ยหอใชในการผลต เชน น าองนขาว น าสตรอวเบอรร และน าสบปะรด เปนตน เชนเดยวกบการวเคราะหคาสแดง (a*) คาสเหลอง (b*) ความอมตวของส (C*) และคามมของส (h°) ตารางท 19 คณลกษณะทางเคมเบองตนของผลตภณฑน าผลไมทมการเสรมคอลลาเจนทใชใน

การศกษา

รหสตวอยาง

จ านวนตวอยาง

คณลกษณะทางเคมเบองตน L* a* b* C* hº

A2000 15 59.1±0.20a 1.4±0.10h 3.6±0.50h 3.9±0.40gh 69.4±3.40d B1700 15 58.3±0.20bc 2.0±0.10f 4.1±0.30h 4.6±0.20g 63.6±1.80e C2000 15 59.1±0.10a 1.9±0.00fg 1.9±0.20i 2.7±0.10h 45.0±3.30g D2000 15 58.8±0.30ab 0.9±0.20i 8.1±0.60g 8.1±0.60f 83.6±1.40b E2500 15 57.7±0.40c 0.9±0.10i 12.5±2.10e 12.5±2.10e 85.7±0.80a E3000 15 54.3±2.00d 1.6±1.00gh 20.9±3.50d 20.9±3.60c 86.0±1.70a E4000 15 44.4±0.40e 7.0±0.40e 43.7±0.40a 44.3±0.40a 80.9±0.50c F1000 4 37.6±0.30f 33.2±0.60a 27.1±0.40c 42.8±0.30b 39.2±0.80h G8000 5 25.9±1.70g 22.5±0.30b 38.0±2.00b 44.2±1.70a 59.3±1.50f H5000 5 8.3±0.40i 18.7±0.60c 7.5±0.30g 20.1±0.50c 21.8±1.30i I5000 5 16.1±0.80h 13.7±0.90d 10.8±1.10f 17.5±1.30d 38.2±2.00h

*โดยตวอกษร a, b, c, d, e, f, g, h และ i หมายถง ตวอกษรทแตกตางกนแสดงความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (p≤0.05) เปรยบเทยบในคอลมนเดยวกน

โดย L* แสดงคาความมด-สวาง มคาอยระหวาง 0 - 100 a* แสดงคาสแดง เมอ a* เปน + a* แสดงคาสเขยว เมอ a* เปน –

b* แสดงคาสเหลอง เมอ b* เปน + b* แสดงคาสน าเงน เมอ b* เปน -

105

105

0.0

20000.0

40000.0

60000.0

80000.0

100000.0

120000.0

A B C D E1 E2 F G E3 H I

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทระ

บบนฉ

ลาก

บรรจ

ภณฑ

(มลล

กรมต

อลตร

)

ยหอ

คาทวเคราะหไดจาก HPLC คาตามฉลาก

จากการศกษาการวเคราะหปรมาณคอลลาเจนในเครองดมเพอสขภาพ จ านวน 114 ตวอยางโดยอาศยการเกดปฏกรยากบ NBD-Cl ภายใตสภาวะทเปนเบส เพอใหไดสารอนพนธทสามารถเกดการเรองแสงได จากนนแยกสารทสนใจโดยใชเทคนค HPLC และตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหตามมาตรฐาน AOAC (1993) แสดงผลดงภาพท 55

ภาพท 55 ปรมาณคอลลาเจนทวเคราะหไดจากวธ HPLC เทยบกบปรมาณคอลลาเจนทระบบน

ฉลากบรรจภณฑ จากภาพท 55 พบวา ยหอ H มคาปรมาณคอลลาเจนแตกตางกนมาก ระหวางคาทวเคราะห

ไดจากวธ HPLC เทยบกบปรมาณคอลลาเจนทระบบนฉลากบรรจภณฑ เมอเทยบกบยหออนๆ เนองมาจากชนดของคอลลาเจนทใช ซงมผลมาจากวตถดบทใชในการสกดคอลลาเจน สตวแตละชนดจะมองคประกอบของกรดอะมโนทแตกตางกน ซงองคประกอบของกรดอะมโนในคอลลาเจนจะมผลตอสมบตทางเคมกายภาพของคอลลาเจน เชน สมบตการละลาย ความสามารถในการเกดพนธะขามและความคงตวตอความรอน ซงปรมาณโฮดรอกซโพรลนมความสมพนธกบความคงตวตอความรอนของคอลลาเจน เนองจากไฮดรอกซโพรลนจะชวยใหโครงสรางของโทรโปรคอลลาเจนมความคงตวมากขน ดงนนคอลลาเจนจากสตวบก เชน สกร โค จะมความคงตวตอความรอนทสงกวาคอลลาเจนจากสตวน า นอกจากนปรมาณไฮดรอกซโพรลนยงขนอยกบสภาพแวดลอมทปลาอาศยอย โดยคอลลาเจนจากปลาทอยในเขตน าเยนจะมปรมาณไฮดรอกซโพรลนทต ากวาและมความคงตวตอความรอนทต ากวาปลาเขตน าอน (Wasswa และคณะ, 2007)

106

106

ผลการพฒนาการวเคราะหปรมาณคอลลาเจนในเครองดมเพอสขภาพ มประสทธภาพด พบวาทระดบความเขมขนของสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน 20 mg/L, 50 mg/L และ 80 mg/L พบ % Recovery เฉลยเทากบ 87.49 85.06 และ 90.67 ตามล าดบ

นอกจากนใหคาสมประสทธสหสมพนธ (Correlation coefficient, r) มคาเทากบ 0.9993 ซงมคามากกวาเกณฑการยอมรบคอ 0.995 และการพสจนขดจ ากดของการตรวจพบ (Limit of detection, LOD) พบวามคาเทากบ 4.96 mg/L (นอยกวา LOD หมายถง ตรวจไมพบ) และขดจ ากดของการวดเชงปรมาณ (Limit of quantitation, LOQ) พบวามคาเทากบ 13.17 mg/L (4.9<ผลทวเคราะห<13.1 หมายถง พบแตรายงานผลไมได) (Miller และ Miller, 1988; Huber, 1999)

จากนนน าคาทางเคมทวเคราะหไปค านวณหาคา standard error of laboratory (SEL) แสดงการค านวณดงภาคผนวก ก เพอหาความคลาดเคลอนของการวเคราะหคาทางเคม พบวาคาความคลาดเคลอนของการวเคราะหคาทางเคม มคาเทากบ 12,221.62 mg/L ซงมคามากกวาคาความคลาดเคลอนของการวเคราะหดวย NIRS โดยสมการเทยบมาตรฐานของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมจ านวนตวอยาง 114 และ 109 ตวอยางทเหมาะสมทสด มคาเทากบ 3,574 และ 2,266 mg/L ตามล าดบ เนองจากคอลลาเจนทใชเปนวตถเจอปนอาหารจะตองผานการยอยใหมน าหนกโมเลกลต า เพอปองกนการตกตะกอนและปญหาการขนในเครองดม ทงนไมสามารถมองเหนสายคอลลาเจนไดดวยตาเปลา จงวดคาความหนดและคาความขนของตวอยาง พบวา ใหคาการท าซ าทแตกตางกนจงอาจท าใหคา SEL ของการวเคราะหทางเคม มคามากกวา NIRS

4.3.3 ลกษณะสเปกตรมของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมจ าหนายในประเทศ

ลกษณะสเปกตรมของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนแตละยหอมลกษณะสเปกตรมทคลายกนและคลายกบสารละลายคอลลาเจน แสดงดงภาพท 56 เมอพจารณาสเปกตรมจะพบวา สเปกตรมมความเดนชดทเกดจากการดดกลนของน าทความยาวคลน 6900 cm-1มความสมพนธกบโอเวอรโทนอนดบหนงของพนธะ O-H (first overtone) และ 5200 cm-1 มความสมพนธกบคอมบเนชนของ O-H (combination) (Caramês และคณะ, 2017; Rodriguez-Saona และคณะ, 2001) ซงเปนลกษณะของพคทพบไดในตวอยางทมน าเปนองคประกอบ เชน เครองดม เปนตน และดวยอทธพลของน า ท าใหไมสามารถเหนพคอนไดอยางชดเจน เนองจากเปนพคทมขนาดใหญไปบดบงพคขององคประกอบอนๆ สงผลใหการจ าแนกองคประกอบทางเคมนนเปนไปไดยาก ดงนนกอนท าการสรางสมการเทยบมาตรฐาน จงจ าเปนตองมการใชวธการทางคณตศาสตร เพอชวยในการปรบแตงสเปกตรมกอนการวเคราะห เพอท าใหเกดการแยกพค หรอองคประกอบอนๆ ทเราสนใจออกมาดวย

107

107

0

0.5

1

1.5

2

2.5

400050006000700080009000100001100012000

คากา

รดดก

ลนแส

ง (lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1) A2000 B1700C2000 D2000E2500 E3000E4000 F1000G8000 H5000I5000 สารละลายคอลลาเจน 1,000 มลลกรมตอลตร

วธการอนพนธอนดบทสอง ซงวธนชวยใหสเปกตรมเหนพคทชดเจนมากขน โดยทต าแหนงพคนนยงเหมอนเดม แตพคจะมลกษณะกลบหว (อนพนธ, 2552; Nicolaï และคณะ, 2007) สเปกตรมทผานการปรบแตงดวยอนพนธอนดบทสองของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน แสดงดงภาพท 57

โดยตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทสมมานน เปนตวอยางเครองดมในภาชนะบรรจปดสนททมชวงคาทครอบคลมปรมาณคอลลาเจนทต าสดและสงสดทมจ าหนายในทองตลาด ซงกลมตวอยางทดจะตองมตวอยางทงในปจจบนและตวอยางทจะน ามาวเคราะหในอนาคตมคาครอบคลมปรมาณทงต าสดและสงสดของตวอยาง โดยจะตองมการสมตวอยางทถกตองเพยงพอเพอเปนตวแทนของตวอยางในกลมนนๆ ซงถอเปนขนตอนทส าคญทจะไดสมการท านายปรมาณองคประกอบทางเคมทด นอกจากนควรพจารณาวธวเคราะหทางเคม ซงควรเปนวธทเปนมาตรฐานและมความแมนย าเพอใหไดขอมลทถกตอง เนองจากสงผลตอสมการทสรางตอไป (Ozaki และคณะ, 2006)

ภาพท 56 ตวอยางสเปกตรมของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทใชในการศกษา

6900 cm-1 O-H overtone

5200 cm-1 O-H combination

108

108

-0.003

-0.002

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

400050006000700080009000100001100012000

D2(lo

g1/R

)

เลขคลน (cm-1)A2000 B1700C2000 D2000E2500 E3000E4000 F1000G8000 H5000I5000 สารละลายคอลลาเจน 1,000 มลลกรมตอลตร

จากการศกษาปรมาณคอลลาเจนในสารละลายมาตรฐาน สารละลายคอลลาเจนทมการเตมวตถเจอปนอาหาร และผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน พบวา ทงสเปกตรมของสารละลายคอลลาเจน สารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปนอาหาร และผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทไมไดผานการปรบแตงสเปกตรม มลกษณะคลายกน ทงชวงคลนสนและชวงคลนยาว โดยจะเหนพคทไดมการดดกลนของพคทชดเจน โดยพคดงกลาวเปนพคทเกดจากการดดกลนของน า ซงพบไดทวไปในตวอยางทมน าเปนองคประกอบหลก ดงนน เพอลดอทธพลดงกลาวและแยกพคอนๆ ทถกบดบงใหชดเจนขนไดดวยการหาความชนของสเปกตรมแบบอนพนธอนดบสองพบวา สารละลายคอลลาเจนและวตถเจอปนอาหารใหลกษณะพคทตางกน โดยเฉพาะชวงคลนยาวจะสงเกตเหนไดชดเจน แตเมอเปรยบเทยบสารละลายคอลลาเจนทเตมวตถเจอปนอาหารและผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน พบวาใหลกษณะทคลายกน

ภาพท 57 สเปกตรมผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทปรบแตงดวยวธอนพนธอนดบสอง

7400-6600 cm-1 C-H first overtone O-H first overtone N-H first overtone

5500-4880 cm-1 N-H sym.str-amide II C=O str. second overtone

4700-4200 cm-1 N-H sym.+amide III Amide I+amide III O-H str.

109

109

4.3.4 การสรางสมการเทยบมาตรฐาน

4.3.4.1 การสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ PLSR

ตารางท 20 แสดงขอมลทางสถตของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน โดยแบงเปน 2 กลม คอกลมสมการเทยบมาตรฐานและกลมสมการทวนสอบ โดยมคาอยในชวง 1,418.47-98,666.90มลลกรมตอลตร ตารางท 21 และ 22 แสดงคาทางสถตของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม ดวยวธการถดถอยก าลงสองนอยทสดบางสวน (PLSR) พบวา สมการทเหมาะสมทสด ส าหรบท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม ดวยเครอง NIRS ไดมาจากการพฒนาสเปกตรม ดวยวธ SNV ท ชวงค ลน 7486-6896, 5500-4998 และ 4701-3999 cm-1 โดยม คาสมประสทธการตดสนใจ (R2) เทากบ 0.973 คาความคลาดเคลอนในการท านาย (RMSEP) เทากบ 3,510 mg/L คาความคลาดเคลอนเฉลย (bias) เทากบ 13.1 คาสดสวนระหวางสวนเบยงเบนมาตรฐานกบคาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมทวนสอบสมการ (RPD) เทากบ 6.13 และมปจจยทเกยวของ 8 ปจจยตามล าดบ

นอกจากน เมอท าการตดตวอยาง ยหอ H ซงเปนยหอทมความแตกตางระหวางคาทางเคมทวเคราะหดวยวธ HPLC และคาปรมาณคอลลาเจนทระบบนฉลากบรรจภณฑมาก ดงภาพท 55 พบวา สมการเทยบมาตรฐานมคาความคลาดเคลอนในการท านายเทากบ 2,260 mg/L ซงมคานอยลงเมอเทยบกบสมการขางตน โดยสมการนสามารถตรวจวดตวอยางไดแมนย าทมปรมาณคอลลาเจนมากกวา 2,500 mg/L และแสดงการตรวจสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐานผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนดงภาคผนวก ค

แตเนองจากสมการมคาในชวงความเขมขนต ากระจกตวกนอยบรเวณลางกราฟ และเครองดมชวงความเขมขนสงมกลมตวอยางทนอยกวา จงท าใหมคา RMSEE และ RMSEP สง ดงนนสามารถปรบปรงสมการได โดยการเกบคาทวเคราะหเพมเตม เพอท าใหสมการทไดมประสทธภาพมากขน จากผลทไดชใหเหนวามความเปนไปไดทจะวดปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมโดยใชเทคนค NIRS และสามารถสรปไดวาจากตวอยางทกชนด พบวามปรมาณคอลลาเจนไมเกน 10 กรม ซงปรมาณคอลลาเจนไฮโดรไลเซททควรบรโภคก าหนดใหไมเกน 10 กรมตอวน (Food and drug administration, 1999)

110

ตารางท 20 คาสถตของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน ส าหรบสรางสมการและส าหรบทวนสอบสมการดวยเทคนค NIRS

จ านวนตวอยางทงหมด กลมตวอยาง จ านวนตวอยาง คาเฉลย คาต าสด-คาสงสด* สวนเบยงเบนมาตรฐาน

114 สมการเทยบมาตรฐาน (70%) 82 16,951.98 1,418.47-98,666.90 26,344.24 สมการทวนสอบ (30%) 32 13,838.84 2,001.52-80,562.20 21,902.26

109 สมการเทยบมาตรฐาน (70%) 81 16,179.20 1,418.47-98,666.90 25,725.22 สมการทวนสอบ (30%) 28 9,096.80 2,001.52-72,810.40 13,851.41

*หนวย มลลกรมตอลตร

111

05

101520253035404550

1,000

10,00

0

20,00

0

30,00

0

40,00

0

50,00

0

60,00

0

70,00

0

80,00

0

90,00

0

100,0

00

ความ

ถ

ปรมาณคอลลาเจน

สมการเทยบมาตรฐาน สมการทวนสอบ

จากผลการทดลอง สมการทไดใหผลการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนไดไมแมนย านก ทงนเนองจากปรมาณคอลลาเจนทสมมาในทองตลาดทงหมดในประเทศทน ามาสรางสมการเทยบมาตรฐานไมมการกระจายตวอยางสม าเสมอ แสดงดงภาพท 58 ดงนนจงตองมการเพมจ านวนตวอยางเพอใหมคาการวเคราะหทกระจายครอบคลม รวมทงตองมความถทใกลเคยงจงจะท าใหสมการเทยบมาตรฐานทสรางขนมามความสมพนธกนสง

ภาพท 58 การกระจายตวของปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน

112

ตารางท 21 คาทางสถตของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม จ านวน 114 ตวอยาง

ชวงเลขคลน (cm-1) การปรบแตงสเปกตรม PLS

factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทดสอบความแมนย า (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L) R2 RMSEP (mg/L)

Bias

12500-4000 SNV 3 0.951 5,980 0.931 5,013 -371 3.83

7486-6896 5500-4998 4701-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

7 0.972 4,640 0.957 5,650 -876 4.88

SNV 8 0.986 3,230 0.973 3,510 13.1 6.13 MSC 6 0.981 3,780 0.965 4,700 148 5.41

7000-4000

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

7 0.984 3,430 0.972 4,230 109 6.01

SNV 5 0.980 3,800 0.975 4,040 -423 6.42 MSC 5 0.980 3,800 0.966 4,620 -864 5.60

หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction, RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction และ SNV: Standard Normal Variate

113

ตารางท 22 คาทางสถตของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม จ านวน 109 ตวอยาง

ชวงเลขคลน (cm-1) การปรบแตงสเปกตรม PLS

factor

สมการเทยบมาตรฐาน (70%) สมการทดสอบความแมนย า (30%) RPD

R2 RMSEE (mg/L) R2 RMSEP (mg/L)

Bias

12500-4000 SNV 8 0.990 2,600 0.923 3,690 -286 3.62

7486-6896 5500-4998 4701-3999

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

10 0.989 2,770 0.971 2,260 434 6.08

SNV 8 0.989 2,830 0.972 2,260 403 6.11 MSC 6 0.985 3,180 0.966 2,500 478 5.52

7000-4000

สเปกตรมทไมผานการปรบแตง

10 0.992 2,460 0.963 2,530 82.3 5.26

SNV 7 0.985 3,220 0.968 3,620 -28.3 5.61 MSC 8 0.990 2,590 0.963 2,530 85.3 5.26

หมายเหต: R2: coefficients of determination, RMSEE: root mean square error of estimation, RMSEP: root mean square error of prediction, RPD: ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP, MSC: multiplicative scatter correction และ SNV: Standard Normal Variate

114

-4000000-3000000-2000000-1000000

010000002000000300000040000005000000

40004500500055006000650070007500

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ผลการทดสอบ paired t –test ของสมการเทยบมาตรฐานของตวอยางจ านวน 114 ตวอยาง และสมการเทยบมาตรฐานของตวอยางจ านวน 109 ตวอยาง พบวาคาปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน ทท านายดวยวธ NIRS ไมแตกตางจากคาปรมาณคอลลาเจนจรงอยางมนยส าคญทระดบความเชอมน 95% โดยสมการท านายปรมาณคอลลาเจนทสรางดวยวธ PLSR จะแสดง regression coefficient ของสมการทพฒนาขน แสดงดงภาพท 59 ซงมเลขคลนทมอทธพลตอสมการเทยบมาตรฐาน ซงสอดคลองกบต าแหนงโปรตนและกรดอะมโนซงเปนโครงสรางของคอลลาเจน (Osborne และคณะ 1993)

ภาพท 59 สมประสทธการถดถอยของสารละลายคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมทผานการปรบแตง

ดวยวธ SNV

จากภาพท 60 จะเหนไดวาคาท านายปรมาณคอลลาเจนทไดนน อยใกลเสนทแยงมม (target line) บงบอกถงการท านายไดอยางถกตอง และแมนย า นอกจากนจะเหนไดวาลกษณะการกระจายจดบนกราฟการกระจาย (scatter plots) มกลมของขอมลสวนมากกระจกตวอยบรเวณดานลางกราฟ เนองมากจากตวอยางเครองดมผสมคอลลาเจนในทองตลาดมการเตมคอลลาเจนสวนมากทความเขมขนใกลเคยงกนอยในชวง 1,000-3,000 มลลกรมตอหนงหนวยบรโภค และเครองดมผสมคอลลาเจนชนดสกดเขมขนจะมการเตมปรมาณคอลลาเจนอยในชวง 4,000 –8,000 มลลกรมตอหนงหนวยบรโภคและจะมราคาสงกวาชนดแรก

4435

5185 5060

5136 4702 4406

5247

7157 7098

115

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0

10,00

0

20,00

0

30,00

0

40,00

0

50,00

0

60,00

0

70,00

0

80,00

0

90,00

0

100,0

00

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(ม

ลลกร

มตอล

ตร)

ปรมาณคอลลาเจนทวเคราะหดวยวธ HPLC (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐานสมการทวนสอบ

ภาพท 60 การกระจายตวของคาปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมทไดจากการสรางสมการ

เทยบมาตรฐานและสมการทวนสอบดวยเทคนค NIRS

นอกจากนเมอน าตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทมวางจ าหนายในทองตลาดมาท านายดวยสมการทเหมาะสมทสด ส าหรบท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม พบวา สามารถท านายตวอยางกลมใหมในทองตลาดได เนองจากตวอยางมองคประกอบภายในทคลายกนและเมอพจารณาจากขดจ ากดของคาระยะหางมาหาลาโนบสเฉลย (Average Mahalanobis Distance) พบวาตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนทน ามาท านายมคาระยะมาหาลาโนบสเฉลยต ากวาขดก าจด แสดงดงตารางท 23

จากตารางท 23 เมอน าตวอยางกลมใหมมาท านายดวยสมการเทยบมาตรฐานทเหมาะสมทสด พบวา ตวอยางมคาความคลาดเคลอนเฉลยรอยละ 17 ซงถอวามคาทสง กลาวคอสมการมรอยละความถกตองของการท านายเทากบรอยละ 80 ดงนนจงตองลดคาความคลาดเคลอนของสมการดงกลาวดวยการเพมชวงของตวอยาง เพอใหขอมลมการกระจายมากขน ซงจะชวยใหสมการทพฒนาขนมความแมนย าและนาเชอถอมากขน

R2 = 0.973 RMSEP = 3,510 mg/L Bias = 13.1 RPD = 6.13

116

ตารางท 23 การเปรยบเทยบคาจรงและคาการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมดวย สมการทเหมาะสมทสด

รหสตวอยาง คาจาก HPLC (mg/L) คาท านาย (mg/L) คาความคลาดเคลอน (%) E 2500 7,358.83 7,398.30 0.54 E 2500 7,631.08 8,000.10 4.84 E 2500 6,832.46 4,433.90 35.11 E 3000 8,589.62 10,433.00 21.46 E 3000 9,567.76 9,386.90 1.89 E 3000 10,540.23 8,396.80 20.34 E 3000 10,795.67 6,912.20 35.97 A 2000 8,479.10 7,450.60 12.13 A 2000 7,488.83 7,564.60 1.01 A 2000 8,701.97 7,381.00 15.18 A 2000 5,324.39 4,285.00 19.52 A 2000 5,559.34 4,041.90 27.30 A 2000 3,112.83 2,480.80 20.30 D 2000 4,097.60 4,487.80 9.52 D 2000 5,439.77 6,530.90 20.06 D 2000 4,125.47 5,583.50 35.34 I 5000 91,719.77 94,079.00 2.57 I 5000 98,666.92 90,273.00 8.51 H 5000 68,681.76 56,510.00 17.72 H 5000 80,562.24 56,374.00 30.02 คาเฉลย 22,663.80 20,100.20 17.00

117

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1000

0

1100

0

1200

0

x-loa

ding

คลนเลข (cm-1)

4.3.4.2 การสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ Multiple Linear Regression (MLR)

กราฟ X-loading ของผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน แสดงดงภาพท 61 โดยแสดงเลข

คลนทม X-loading สง ซงแสดงอทธพลทส าคญตอเลขคลนนน ซงสอดคลองกบคาสมประสทธการถดถอย ซงแสดงดงภาพท 62 จากนนจะท าการคดเลอกเลขคลนทส าคญมาใชในการวเคราะหดวยวธ MLR

ในการศกษานเลอกใชเลขคลนจ านวน 18 เลขคลน โดยพจารณาเลขคลนส าคญจากกราฟสมประสทธการถดถอยรวมกบเลขคลนอางองจากหนงสอหรอเปรยบเทยบกบสเปกตรมขององคประกอบทตองการศกษาทเปนสารบรสทธ ซง เลขคลนทงหมดทเลอกมาเปนเลขคลนทมความสมพนธกบพนธะ C-H, O-H, C=O และ N-H ซงอยในโครงสรางกรดอะมโนทเปนสวนประกอบของคอลลาเจน แสดงดงตารางท 24 จากนนน าเลขคลนจ านวน 18 เลขคลนไปวเคราะหดวยวธ MLRจากนนเลขคลนจะถกตดออกอยางเปนระบบ ดวยการก าจดเลขคลนทมความส าคญนอยทสดออกดวยวธ forward-backward elimination ซงเปนการก าจดเลขคลนออกอยางเปนขนตอนจนกวาจะเหลอจ านวนเลขคลนนอยทสดและเพยงพอทจะท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน า ผลไมเสรมคอลลาเจนได ซงสงเกตจาก การลดลงของคา R2 ในกลมสรางสมการเทยบมาตรฐาน และการเพมขนของ RMSECV ในขณะทลดจ านวนเลขคลนแตละชด แสดงดงตารางท 25

ภาพท 61 คา X-loading ของแบบจ าลองคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไมดวยเทคนคสเปกโทรสโกป

อนฟราเรดยานใกล

5172

5284 4914 7093

6595

4705 4401

118

-50000-40000-30000-20000-10000

01000020000300004000050000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1000

0

1100

0

1200

0

สมปร

ะสทธ

การถ

ดถอย

เลขคลน (cm-1)

ภาพท 62 สมประสทธการถดถอยของสมการท านายปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑน าผลไม

ในชวงคลน 12500-4000 cm-1 ตารางท 24 แสดงการเลอกเลขคลนทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR โดย

ดจากคา X-loading ซงมทงหมด 18 เลขคลน ไดแก 4215, 4246, 4354, 4374, 4451, 4748, 4878, 4968, 4971, 5191, 5303, 6341, 6622, 6726, 6989, 7057, 7166 และ 7351 cm-1 จากนนน าเลขคลนทงหมด มาวเคราะหความแปรปรวน (Analysis of variance, ANOVA) จนกวาจะเหลอจ านวนเลขคลนนอยทสดและเพยงพอทจะท านายปรมาณคอลลาเจน แตทงนตองดการสนของพนธะภายในโมเลกลควบคกนดวยในการเลอกสมการท านาย

4354 5303

5191

4748

4451

6989 7166

4215

4971

6622 6726

7351

4374

4246

4878

6341

7057

119

ตารางท 24 การเลอกเลขคลนในการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR

เลขคลน 12500-4000 cm-1

จ านวนเลขคลนทเลอกออก สมการเทยบมาตรฐาน

Cross validation

R2 RMSEC R2 RMSECV Bias 18* - 0.962 5,331 0.935 6,962 19.86

9* 4246 4354 4374 4948 6341 6588 6726 6989 7058

0.955 5,765 0.939 6,697 31.2

5* 4968 4971 7166 7351 0.941 6,625 0.929 7,260 4.24 4* 4215 0.940 6,673 0.929 7,254 4.66

18* คอ 4215, 4246, 4354, 4374, 4451, 4748, 4878, 4968, 4971, 5191, 5303, 6341, 6622, 6726, 6989, 7057, 7166 และ 7351 cm-1

9* คอ 4215, 4451, 4748, 4878, 4971, 5191, 5303, 7166 และ 7351 cm-1 5* คอ 4215, 4451, 4748, 5191 และ 5303 cm-1 4* คอ 4451, 4748, 5191 และ 5303 cm-1 ตารางท 25 คาจดตดแกน y (intercept) และคาสมประสทธของเลขคลนทเลอกใชในการสราง

สมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR เลขคลน 12500-4000 cm-1

R2C = 0.955

coefficient

intercept -2.81 x 105 7351 7166

-2.91 x 105 1.40 x 106

5303 -2.49 x 106 5191 5.09 x 105 4971 4968 4748 4451 4215

3.65 x 106 -3.31 x 106

-3.94 x 106

2.39 x 106

2.16 x 106 R2

C : coefficient of determination

120

สมการเทยบมาตรฐานในการท านายปรมาณคอลลาเจนในน าผลไมและสมประสทธของแตละตวแปร แสดงดงสมการตอไปน สมการคอลลาเจน (mg/L) = -28100000–29100000A7351 + 140000000A7166 -2490000000A5303+50900000A5191+365000000A4971 -331000000A4968 -394000000A4748+239000000A4451 +216000000A4215 โดย Ax คอ คาของการดดกลนแสงทความยาวคลน X cm-1 จากสมการดงกลาวจะเหนวาตวแปรทสมพนธกบการดดกลนแสงของกรดอะมโนทอยในโครงสรางคอลลาเจนทง 9 ต าแหนง ซงเปนต าแหนงใกลเคยงกบการดดกลนแสงของการสนแบบโอเวอรโทนอนดบทสองของ C=O การสนของพนธะ O-H และการสนของพนธะ N-H และเอไมดซงเปนหมฟงกชนทมในกรดอะมโนไฮดอรอกซโพรลน ซงเปนตวบงชปรมาณคอลลาเจนในตวอยาง สาเหตทคาการดดกลนแสงของคอลลาเจนในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนมต าแหนงเบยงเบนไป เนองจากมการดดกลนแสงขององคประกอบอนๆ ทางเคมรวมดวย เชน น า น าตาล สารแตงกลนรส และสผสมอาหาร เปนตน และจากการทดสอบ paired t-test ทระดบความเชอมน 95% พบวาไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต ระหวางคาคอลลาเจนทวเคราะหไดทจรงและคาคอลลาเจนทท านายไดดวยเทคนค NIRS แตอยางไรกตาม เมอพจารณาชดขอมล พบวา ตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจนมคาทางเคมทกระจกตวและมชวงหางของคาทางเคมทกวาง แสดงดงภาพท 63 ท าใหสมการขางตนมคาความผดพลาดทไดจากการท านายสง สมการนจงไมสามารถท านายกลมตวอยางเครองดมทมความเขมขนต าได แตสามารถใชในการท านายคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมน าผลไมเสรมคอลลาเจนไดในชวงความเขมขนสง ซงมผลตอการสรางสมการและการน าไปประยกตใชจรง การเพมจ านวนของตวอยางและการหาตวอยางทมคากระจายเพมมากขนจะชวยสรางสมการทมความแมนย าเพมขนได

121

-100000

100002000030000400005000060000700008000090000

100000

0

10,00

0

20,00

0

30,00

0

40,00

0

50,00

0

60,00

0

70,00

0

80,00

0

90,00

0

100,0

00

110,0

00

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายด

วยวธ

NIRS

(ม

ลลกร

มตอล

ตร)

ปรมาณคอลลาเจนทวเคราะหดวยวธ HPLC (มลลกรมตอลตร)

สมการเทยบมาตรฐานสมการทวนสอบ

ภาพท 63 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณคอลลาเจนทวดไดจรงกบปรมาณคอลลาเจนท

ท านายไดดวยวธ MLR

R2 = 0.939 RMSEP = 6,697 mg/L Bias = 31.2

122

บทท 5

สรปผลการทดลอง

จากการศกษาพบวา เทคนคสเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกลมความเปนไปไดในการตดตามปรมาณคอลลาเจนในผลตภณฑเครองดมเพอสขภาพ และสามารถน าไปประยกตใชในอตสาหกรรมได โดยคาทางสถตในการท านายปรมาณคอลลาเจน จากเทคนค NIRS ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญกบคาทไดจากการวเคราะหทางเคมดวยเทคนค HPLC ทระดบความเชอมน 95% ดงนนจงมความเปนไปไดในการน าเทคนค NIRS น มาใชท านายปรมาณคอลลาเจนในเครองดมเพอสขภาพทมวางจ าหนายในทองตลาดแทนการวเคราะหทางเคมโดยวธมาตรฐานดวยเครอง HPLC

อยางไรกตามวธการวเคราะหคอลลาเจนดวย HPLC ยงใหคาความคลาดเคลอนของการวเคราะหทสงกวาวธ NIRS เนองจาก NIRS สามารถวเคราะหหมฟงกชนของคอลลาเจนไดโดยตรง แตเนองดวยยงไมมวธวเคราะหทเปนมาตรฐานไดรบการยอมรบระดบสากล ส าหรบทดสอบคอลลาเจนทเปนสารเตมแตงอาหาร ทมการเตมลงในเครองดมเพอสขภาพ ซงปจจบนวธทไดรบการยอมรบวธเดยวทใชในการทดสอบคอลลาเจนคอ AOAC ป 2000 ซงเปนการวเคราะหปรมาณกรดอะมโนไฮดรอกซโพรลน ในเนอหมและผลตภณฑ โดยการค านวณปรมาณกรดอะมโนไฮดรอกซโพรลน และคณปจจย 8 ซงวธดงกลาวอาจยงไมครอบคลมตวอยางทตองการวเคราะหจรง

โดยวธวเคราะหคอลลาเจนจ าเปนตองมการพฒนาอยางตอเนอง เพอใหไดผลการวเคราะหทด มความนาเชอถอและจ าเพาะตอการวเคราะหมากทสด

123

รายการอางอง

สถาบนอาหาร กระทรวงอตสาหกรรม. 2560. ตลาดวตามนและผลตภณฑเสรมอาหารในประเทศ ไทย. [ออนไลน]. เขาถงเมอวนท 21 มนาคม 2560. เขาถงไดจาก http://fic.nfi.or.th

สถาบนอาหาร กระทรวงอตสาหกรรม. 2556. ตลาดเครองดมฟงกชนนลในประเทศไทย. [ออนไลน]. เขาถงเมอวนท 21 เมษายน 2559. เขาถงไดจาก http://fic.nfi.or.th ส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา. 2549. “ประกาศส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา.

เรอง ขอก าหนดการใชสวนประกอบทส าคญของผลตภณฑเสรมอาหารชนดวตามนและแรธาต.” 1 มถนายน.

วรยา การพานช. 2552. กรดเบนโซอก; วตถกนเสยทนยมใชในอาหาร สถาบนโภชนาการ มหาวทยาลยมหดล. [ออนไลน]. เขาถงเมอวนท 5 เมษายน 2560. เขาถงไดจาก http://www.thaitox.org/media/upload/file/Benzoic-Acid.pdf.

อนพนธ เทอดวงศวรกล. 2552. การปรบแตงสเปกตรมกอนการวเคราะห. ใน เทคโนโลย อนฟราเรดยานใกลในอตสาหกรรมเกษตร. กรงเทพฯ. หนา 1-23.

Aaby, K., Mazur, S., Nes, A. and Skrede, G. 2012. Phenolic compounds in strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) fruits: Composition in 27 cultivars and changes during ripening. Food Chemistry. 132(1): 86-97.

Afara, I., Sahama, T. and Oloyede, A. 2013. Near infrared for non-destructive testing of articular cartilage. In Nondestructive Testing of Materials and Structures (pp. 399-404). Springer, Netherlands.

Alamar, P.D., Caramês, E.T., Poppi, R.J. and Pallone, J.A. 2016. Quality evaluation of frozen guava and yellow passion fruit pulps by NIR spectroscopy and chemometrics. Food Research International. 85: 209-214.

Annenkov, V.V., Verkhozina, O.N., Shishlyannikova, T.A. and Danilovtseva, E.N. 2015. Application of 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazole in analysis: fluorescent dyes and unexpected reaction with tertiary amines. Analytical Biochemistry. 486: 5-13.

Arend, G.D., Adorno, W.T., Rezzadori, K., Di Luccio, M., Chaves, V.C., Reginatto, F.H. and Petrus, J.C.C. 2017. Concentration of phenolic compounds from strawberry (Fragaria X ananassa Duch) juice by nanofiltration membrane. Journal of Food Engineering. 201: 36-41.

124

AOAC. 1993. Peer Verified Methods Program, Manual on Policies and Procedures, Arlington, VA, Nov. Gaithersburg, Md.

AOAC. 2000. Official Methods of Analysis of AOAC International. 17th ed. Maryland: USA. Gaithersburg, Md. Bai, W., Yoshimura, N. and Takayanagi, M. 2014. Quantitative analysis of ingredients

of blueberry fruits by near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 22: 357-365.

Basu, A. and Penugonda, K. 2009. Pomegranate juice: a heart-healthy fruit juice. Nutrition Reviews. 67(1): 49-56. Beaulieu, J.C. and Obando-Ulloa, J.M. 2017. Not-from-concentrate pilot plant ‘Wonderful’cultivar pomegranate juice changes: Volatiles. Food Chemistry. 229: 553-564. Benito-Ruiz, P., Camacho-Zambrano, M.M., Carrillo-Arcentales, J.N., Mestanza-Peralta,

M.A., Vallejo-Flores, C.A., Vargas-López, S.V. and Zurita-Gavilanes, L.A. 2009. A randomized controlled trial on the efficacy and safety of a food ingredient, collagen hydrolysate, for improving joint comfort. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 60(2), 99-113.

Bilek, S.E. and Bayram, S.K. 2015. Fruit juice drink production containing hydrolyzed collagen. Journal of Functional Foods. 14: 562–569.

Bonjour, J.P. 2005. Dietary protein: An essential nutrient for bone health. Journal of the American College of Nutrition. 24: 526-536.

Büning-Pfaue, H. 2003. Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Food Chemistry. 82: 107-115.

Caramês, E.T., Alamar, P.D., Poppi, R.J. and Pallone, J.A.L. 2017. Quality control of cashew apple and guava nectar by near infrared spectroscopy. Journal of Food Composition and Analysis. 56: 41-46.

Caramês, E.T., Alamar, P.D., Poppi, R.J. and Pallone, J.A.L. 2016. Rapid assessment of total phenolic and anthocyanin contents in grape juice using infrared spectroscopy and multivariate calibration. Food Analytical Methods. 1-7.

125

Cen, H. and He, Y. 2007. Theory and application of near infrared reflectance spectroscopy in determination of food quality. Journal of Food Science and Technology. 18(2): 72-83.

Chen, J., Li, L., Yi, R., Xu, N., Gao, R. and Hong, B. 2016. Extraction and characterization of acid-soluble collagen from scales and skin of tilapia (Oreochromis niloticus). LWT-Food Science and Technology. 66: 453-459.

Chen, S., Zhang, F., Ning, J., Liu, X., Zhang, Z. and Yang, S. 2015. Predicting the anthocyanin content of wine grapes by NIR hyperspectral imaging. Food Chemistry. 172: 788-793.

Chen, Q., Zhao, J., Chaitep, S., and Guo, Z. 2009. Simultaneous analysis of main catechin contents in green tea (Camellia sinensis (L.)) by Fourier transform near infrared reflectance (FT-NIR) spectroscopy. Food Chemistry. 113: 1272-1277.

Chuaychan, S., Benjakul, S. and Kishimura, H. 2015. Characteristics of acid-and pepsin soluble collagens from scale of seabass (Lates calcarifer). LWT-Food Science and Technology. 63(1): 71–76.

Cozzolino, D., Kwiatkowski, M.J., Parker, M., Cynkar, W.U., Dambergs, R.G., Gishen, M. and Herderich, M.J. 2004. Prediction of phenolic compounds in red wine fermentations by visible and near infrared spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 513(1): 73-80.

Colgrave, M.L., Allinghama, P.G, and Jones, A. 2008. Hydroxyproline quantification for the estimation of collagen in tissue using multiple reaction monitoring mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1212: 150–153.

Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. and Wu, G. 2014. Analysis of amino acid composition in proteins of animal tissues and foods as pre-column o-phthaldialdehyde derivatives by HPLC with fluorescence detection. Journal of Chromatography B. 964: 116-127.

Deák, K., Szigedi, T., Pék, Z., Baranowski, P. and Helyes, L. 2015. Carotenoid determination in tomato juice using near infrared spectroscopy. International Agrophysics. 29(3): 275-282.

126

Del Rio, D., Rodriguez-Mateos, A., Spencer, J.P., Tognolini, M., Borges, G. and Crozier, A. 2013. Dietary (poly) phenolics in human health: structures, bioavailability, and evidence of protective effects against chronic diseases. Antioxidants and Redox Signaling. 18(14): 1818-1892. Ding, X., Guo, Y., Ni, Y. and Kokot, S. 2016. A novel NIR spectroscopic method for

rapid analyses of lycopene, total acid, sugar, phenols and antioxidant activity in dehydrated tomato samples. Vibrational Spectroscopy. 82: 1-9.

Downey, G. and Kelly, J.D. 2003. Detection and quantification of apple adulteration in diluted and sulphited strawberry and raspberry purées using visible and near infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52(2): 204–209.

Duan, R., Zhang, J., Du, X., Yao, X. and Konno, K. 2009. Properties of collagen from skin, scale and bone of carp (Cyprinus carpio). Food Chemistry. 112(3): 702–706.

Escuredo, O., Seijo, M.C., Salvador, J. and González-Martín, M.I. 2013. Near infrared spectroscopy for prediction of antioxidant compounds in the honey. Food Chemistry. 141: 3409–3414.

Food and drug Administration. 1999. Food. [ออนไลน]. เขาถงเมอวนท 25 มนาคม 2559. เขาถงไดจาก http://www.fda.gov.

Fernández, B., Andres, S., Prieto, N., Mantecón, A.R. and Giráldez, F.J. 2008. Prediction of chemical composition of sugar beet pulp by near infrared reflectance spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 16(2): 105.

Fernandez-Novales, J., Lopez, MI., Sanchez, M.T., and Morales, J. and Gonzalez- Caballero, V. 2009. Shortwave-near infrared spectroscopy for determination of reducing sugar content during grape ripening, winemaking, and aging of white and red wines. Food Research International. 42: 285-291.

Gelse, K., Poschl, E. and Aigner, T. 2003. Collagens-structure, function and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews. 55(12): 1531-1546.

127

Guillerminet, F., Beaupied, H., Fabien-Soulé, V., Tomé, D., Benhamou, C.L., Roux, C. and Blais, A. 2010. Hydrolyzed collagen improves bone metabolism and biomechanical parameters in ovariectomized mice: an in vitro and in vivo study. Bone. 46(3): 827-834.

González-Martín, M.I., Bermejo, C.F., Hierro, J.M.H. and Sánchez González, C.I. 2009. Determination of hydroxyproline in cured pork sausages and dry cured beef products by NIRS technology employing a fibre–optic probe. Food Control. 20: 752–755.

Gómez-Guillén, M.C., Giménez, B., López-Caballero, M.E. and Montero, M.P. 2011. Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review. Food Hydrocolloids. 25(8): 1813–1827.

Han, Z., Cai, S., Zhang, X., Qian, Q., Huang, Y., Dai, F. and Zhang, G. 2017. Development of predictive models for total phenolics and free p-coumaric acid contents in barley grain by near-infrared spectroscopy. Food Chemistry. 227: 342-348.

Hofman, K., Hall, B., Cleaver, H. and Marshall, S. 2011. High-throughput quantification of hydroxyproline for determination of collagen. Analytical Biochemistry. 417: 289–291.

Huang, H., Yu, H., Xu, H. and Ying, Y. 2008. Near infrared spectroscopy for on/in-line monitoring of quality in foods and beverages: A review. Journal of Food Engineering. 87: 303–313.

Huang, L., Zhou, Y., Meng, L., Wu, D. and He, Y. 2017. Comparison of different CCD detectors and chemometrics for predicting total anthocyanin content and antioxidant activity of mulberry fruit using visible and near infrared hyperspectral imaging technique. Food Chemistry. 224: 1-10.

Huber, L. 1999. Validation and Qualification in Analytical Laboratories (Vol. 547). Buffalo Grove: Interpharm Press. Taylor and Francis Group, LLC.

Hu, J., Li, T., Liu, X. and Liu, D. 2016. Seasonal variation of acid soluble collagens extracted from the swim bladders and skins of bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis) and grass carp (Ctenopharyngodon idella). Food Bioscience. 15: 27–33.

128

Ingle, P.D., Christian, R., Purohit, P., Zarraga, V., Handley, E., Freel, K. and Abdo, S. 2016. Determination of protein content by NIR spectroscopy in protein powder mix products. Journal of AOAC International. 99(2): 360-363.

Iwai, K., Hasegawa, T., Taguchi, Y., Morimatsu, F., Sato, K., Nakamura, Y. and Ohtsuki, K. 2005. Identification of food-derived collagen peptides in human blood after oral ingestion of gelatin hydrolysates. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53(16): 6531-6536.

Jeevithan, E., Bao, B., Zhang, J., Hong, S. and Wu, W. 2015. Purification, characterization and antioxidant properties of low molecular weight collagenous polypeptide (37 kDa) prepared from whale shark cartilage (Rhincodon typus). Journal of Food Science and Technology. 52(10): 6312-6322.

Johanningsmeier, S.D. and Harris, G.K. 2011. Pomegranate as a functional food and nutraceutical source. Annual Review of Food Science and Technology. 2: 181-201. Kaewsorn, K. and Sirisomboon, P. 2014. Determination of the gamma-aminobutyric

acid content of germinated brown rice by near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 22(1): 45-54.

Khodabakhshian, R., Emadi, B., Khojastehpour, M., Golzarian, M.R. and Sazgarnia, A. 2017. Non-destructive evaluation of maturity and quality parameters of pomegranate fruit by visible/near infrared spectroscopy. International Journal of Food Properties. 20(1): 41-52.

Kittiphattanabawon, P., Benjakul, S., Visessanguan, W., Nagai, T. and Tanaka, M. 2005. Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthus tayenus). Food Chemistry. 89: 363–372.

Kim, H.K., Kim, Y.H., Park, H.J. and Lee, N.H. 2013. Application of ultrasonic treatment to extraction of collagen from the skins of sea bass Lateolabrax japonicus. Fisheries Science. 79(5): 849–856.

129

Koyama, Y.I., Hirota, A., Takahara, H., Kuwaba, K., Kusubata, M., Matsubara, Y. and Kasugai, S. 2001. Ingestion of gelatin has differential effect on bone mineral density and body weight in protein undernutrition. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 47(1): 84-86.

Kozlowska, J., Sionkowska, A., Skopinska-Wisniewska, J. and Piechowicz, K. 2015. Northern pike (Esox lucius) collagen: Extraction, characterization and potential application. International Journal of Biological Macromolecules. 81: 220–227.

Krähmer, A., Engel, A., Kadow, D., Ali, N., Umaharan, P., Kroh, L.W. and Schulz, H. 2015. Fast and neat–determination of biochemical quality parameters in cocoa using near infrared spectroscopy. Food Chemistry. 181: 152-159.

Lareu, R.R., Zeugolis, D.I., Abu-Rub, M., Pandit, A. and Raghunath, M. 2010. Essential modification of the Sircol Collagen Assay for the accurate quantification of collagen content in complex protein solutions. Acta Biomaterialia. 6: 3146–3151.

Liang, Q., Wang, L., He, Y., Wang, Z., Xu, J. and Ma, H. 2014a. Hydrolysis kinetics and antioxidant activity of collagen under simulated gastrointestinal digestion. Journal of Functional Foods. 11: 493–499.

Liang, Q., Wang, L., Sun, W., Wang, Z., Xu, J. and Ma, H. 2014b. Isolation and characterization of collagen from the cartilage of Amur sturgeon (Acipenser schrenckii). Process Biochemistry. 49(2): 318–323.

Lin, Y.K. and Kuan, C.Y. 2010. Development of 4-hydroxyproline analysis kit and its application to collagen quantification. Food Chemistry. 119: 1271-1277.

Liu, H., Xiang, B. and Qu, L. 2006. Structure analysis of ascorbic acid using near- infrared spectroscopy and generalized two-dimensional correlation spectroscopy. Journal of Molecular Structure. 794(1): 12-17.

Liu, X., Tao, L., Du, W., Jin, Y. and Wu, Y. 2015. Quality control of Ginkgo biloba leaves by real time release testing in combination with near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 23(6): 381-389.

Liu, R., Qi, S., Lu, J. and Han, D. 2015. Measurement of soluble solids content of three fruit species using universal near infrared spectroscopy models. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 23(5): 301-309.

130

Liu, F., He, Y., Wang, L. and Sun, G. 2011. Detection of organic acids and pH of fruit vinegars using near-infrared spectroscopy and multivariate calibration. Journal of Food Bioprocess Technology. 4: 1331-1340.

Liu, D.S., Liang, L., Regenstein, J.M. and Zhou, P. 2012. Extraction and characterization of pepsin-solubilised collagen from fins, scales, skins, bones and swim bladders of bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis). Food Chemistry. 133: 1441-1448.

Liu, D., Zhanga, X., Li, T., Yang, H., Zhang, H., Regenstein, J.M. and Zhou, P. 2015. Extraction and characterization of acid-and pepsin-soluble collagens from the scales, skins and swim-bladders of grasscarp (Ctenopharyngodon idella). Food Bioscience. 9: 68-74.

Lu, Y., Thomas, L. and Schmidt, S. 2017. Differences in the thermal behavior of beet and cane sucrose sources. Journal of Food Engineering. 201: 57-70.

Magalhães, L.M., Machado, S., Segundo, M.A., Lopes, J.A. and Páscoa, R.N. 2016. Rapid assessment of bioactive phenolics and methylxanthines in spent coffee grounds by FT-NIR spectroscopy. Talanta. 147: 460-467.

Malegori, C., Grassi, S., Marques, E.J.N., de Freitas, S.T. and Casiraghi, E. 2016. Vitamin C distribution in acerola fruit by near infrared hyperspectral imaging. Journal of Spectral Imaging. 5(1): a6.

Manley, M., Joubert, E. and Botha, M. 2006. Quantification of the major phenolic compounds, soluble solid content and total antioxidant activity of green rooibos (Aspalathus linearis) by means of near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 14(4): 213-222.

Manfredi, M. and Vignali, G. 2015. Comparative life cycle assessment of hot filling and aseptic packaging systems used for beverages. Journal of Food Engineering. 147: 39-48. Mareta, W. and Sandstead, H.H. 2006. Zinc requirements and the risks and benefits

of zinc supplementation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 20: 3–18.

131

Maroulis, M., Monemvasios, I., Vardaka, E. and Rigas, P. 2008. Determination of domoic acid in mussels by HPLC with post-column derivatization using 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazole (NBD-Cl) and fluorescence detection. Journal of Chromatography B. 876(2): 245-251.

Mariani, N.C.T., de Almeida Teixeira, G.H., de Lima, K.M.G., Morgenstern, T.B., Nardini, V. and Júnior, L.C.C. 2015. NIRS and iSPA-PLS for predicting total anthocyanin content in jaboticaba fruit. Food Chemistry. 174: 643-648.

Martelo-Vidal, M.J. and Vázquez, M. 2014. Determination of polyphenolic compounds of red wines by UV–VIS–NIR spectroscopy and chemometrics tools. Food Chemistry. 158: 28-34.

Matsumoto, H. 2006. Clinical effects of fish type I collagen hydrolysate on skin properties. ITE Letter. 7: 386-390.

Mahboob, S. 2015. Isolation and characterization of collagen from fish waste material skin, scales and fins of Catla catla and Cirrhinus mrigala. Journal of Food Science and Technology. 52(7): 4296–4305.

Matmaroh, K., Benjakul, S., Prodpran, T., Encarnacion, A.B. and Kishimura, H. 2011. Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish (Parupeneus heptacanthus). Food Chemistry. 129(3): 1179–1186.

Miller, J.C. and Miller, J.N. 1988. Statistics for Analytical Chemistry. John Wiley and Sons, New York, NY.

Momeni, L., Mahmodian, S., Shareghi, B., Saboury, A.A. and Farhadian, S. 2017. The functional and structural stabilization of trypsin by sucrose. International Journal of Biological Macromolecules. 99: 343-349.

Moncada, G.W., Martín, M.I.G., Escuredo, O., Fischer, S. and Míguez, M. 2013. Multivariate calibration by near infrared spectroscopy for the determination of the vitamin E and the antioxidant properties of quinoa. Talanta. 116: 65-70.

Moskowitz, R.W. 2000. Role of collagen hydrolysate in bone and joint disease. Seminars in Arthritis and Rheumatism. 30(2): 87-99.

132

Munera, S., Besada, C., Aleixos, N., Talens, P., Salvador, A., Sun, D.W. and Blasco, J. 2017. Non-destructive assessment of the internal quality of intact persimmon using colour and VIS/NIR hyperspectral imaging. LWT-Food Science and Technology. 77: 241-248.

Nagai, T., Suzuki, N. and Nagashima, T. 2008. Collagen from common minke whale (Balaenoptera acutorostrata) unesu. Food Chemistry. 111: 296–301.

Ncama, K., Opara, U.L., Tesfay, S.Z., Fawole, O.A. and Magwaza, L.S. 2017. Application of Vis/NIR spectroscopy for predicting sweetness and flavour parameters of ‘Valencia’orange (Citrus sinensis) and ‘Star Ruby’grapefruit (Citrus x paradisi Macfad). Journal of Food Engineering. 193: 86-94.

Nicolai, B.M., Beullens, K., Bobelyn, E., Peirs, A., Saeys, W., Theron, K.I. and Lammertyn, J. 2007. Nondestructive measurement of fruit and vegetable quality by means of NIR spectroscopy: A review. Postharvest Biology and Technology. 46: 99–118.

Niu, L., Zhou, X., Yuan, C., Bai, Y., Lai, K., Yang, F. and Huang, Y. 2013. Characterization of tilapia (Oreochromis niloticus) skin gelatin extracted with alkaline and different acid pretreatments. Food Hydrocolloids. 33: 336–341.

Nordey, T., Joas, J., Davrieux, F., Chillet, M. and Léchaudel, M. 2017. Robust NIRS models for non-destructive prediction of mango internal quality. Scientia Horticulturae. 216: 51-57.

Núñez-Sánchez, N., Martínez-Marín, A.L., Polvillo, O., Fernández-Cabanás, V.M., Carrizosa, J., Urrutia, B. and Serradilla, J.M. 2016. Near Infrared Spectroscopy (NIRS) for the determination of the milk fat fatty acid profile of goats. Food Chemistry. 190: 244-252.

Oliveira, G.A., Castilhos, F., Renard, C.M.G.C. and Bureau, S. 2014. Comparison of NIR and MIR spectroscopic methods for determination of individual sugars, organic acids and carotenoids in passion fruit. Food Research International. 60: 154-162.

Omar, A.F., Atan, H. and MatJafri, M.Z. 2012a. NIR spectroscopic properties of aqueous acids solutions. Molecules. 17(6): 7440-7450.

133

Omar, A.F., Atan, H. and MatJafri, M.Z. 2012b. Peak response identification through near-infrared spectroscopy analysis on aqueous sucrose, glucose, and fructose solution. Spectroscopy Letters. 45(3): 190-201.

Osborne, B.G., Fearn, T. and Hindle, P.H. 1993. Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis. 2nd. Longman Scientific and Technical. UK.

Osborne, B.G. 2007. Flours and breads. Near Infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. 281-295.

Ozaki, Y., McClure, W.F. and Christy, A.A. (Eds.). 2006. Near-Infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. John Wiley and Sons, Inc. New Jersey.

Pal, G.K. and Suresh, P.V. 2016. Sustainable valorisation of seafood by-products: Recovery of collagen and development of collagen-based novel functional food ingredients. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 37: 201–215.

Pal, G.K., Nidheesh, T. and Suresh, P.V. 2015. Comparative study on characteristics and in vitro fibril formation ability of acid and pepsin soluble collagen from the skin of catla (Catla catla) and rohu (Labeo rohita). Food Research International. 76: 804–812.

Pasquini, C. 2003. Near infrared spectroscopy: Fundamentals, practical aspects and analytical applications. Journal of the Brazilian Chemical Society. 14(2): 198-219.

Prevolnik, M., Škrlep, M., Janeš, L., Velikonja-Bolta, S., Škorjanc, D. and Čandek- Potokar, M. 2011. Accuracy of near infrared spectroscopy for prediction of chemical composition, salt content and free amino acids in dry-cured ham. Meat Science. 88: 299–304.

Privalov, P.L. and Tiktopulo, E.I. 1970. Thermal conformational transformation of tropocollagen. I. Calorimetric study. Biopolymers. 9(2): 127-139. Prockop, D.J. and Udenfriend, S. 1960. A specific method for the analysis of

hydroxyproline in tissues and urine. Analytical Biochemistry. 1(3): 228-239. Rahim, R. and Raman, A.A.A. 2015. Cleaner production implementation in a fruit juice production plant. Journal of Cleaner Production. 101: 215-221.

134

Ran, X.G. and Wang, L.Y. 2014. Use of ultrasonic and pepsin treatment in tandem

for collagen extraction from meat industry by-products. Journal of the Science of Food and Agriculture. 94(3): 585-590.

Redaelli, R., Alfieri, M. and Cabassi, G. 2016. Development of a NIRS calibration for total antioxidant capacity in maize germplasm. Talanta. 154: 164-168.

Rodriguez-Saona, L.E., Fry, F.S., McLaughlin, M.A. and Calvey, E.M. 2001. Rapid analysis of sugars in fruit juices by FT-NIR spectroscopy. Carbohydrate Research. 336(1): 63-74.

Rodríguez-Bernaldo, A., Fernández-Arias, M. and López-Hernández, J. 2009. A screening method for the determination of ascorbic acid in fruit juices and soft drinks. Food Chemistry. 116: 509–512.

Reich, G. 2005. Near-infrared spectroscopy and imaging: Basic principles and pharmaceutical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 57: 1109-1143.

Rungpichayapichet, P., Mahayothee, B., Khuwijitjaru, P., Nagle, M. and Müller, J. 2015.

Non-destructive determination of β-carotene content in mango by near-infrared spectroscopy compared with colorimetric measurements. Journal of Food Composition and Analysis. 38: 32-41.

Scalzo, J., Politi, A., Pellegrini, N., Mezzetti, B. and Battino, M. 2005. Plant genotype affects total antioxidant capacity and phenolic contents in fruit. Nutrition. 21(2): 207-213.

Segtnan, V.H. and Isaksson, T. 2000. Evaluating near infrared techniques for quantitative analysis of carbohydrates in fruit juice model systems. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 8(2): 109-116.

Schmutzler, M. and Huck, C.W. 2016. Simultaneous detection of total antioxidant capacity and total soluble solids content by Fourier transform near-infrared (FT-NIR) spectroscopy: a quick and sensitive method for on-site analyses of apples. Food Control. 66: 27-37.

Shafie, K.A., Künnemeyer, R., McGlone, A., Talele, S. and Vetrova, V. 2015. An optimised six-wavelength model for predicting kiwifruit dry matter. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 23(2): 103-109.

135

Shao, Y. and He, Y. 2007. Nondestructive measurement of the internal quality of bayberry juice using Vis/NIR. Journal of Food Engineering. 79: 1015–1019.

Shi, J.Y., Zou, X.B., Zhao, J.W. and Holmes, M. 2012. Near infrared quantitative analysis of total flavonoid content in fresh Ginkgo biloba leaves based on different wavelength region selection methods and partial least squares regression. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 20(2): 295-305.

Shoulders, M.D. and Raines, R.T. 2009. Collagen structure and stability. Annual Review of Biochemistry. 78: 929-958.

Simon, A., Gast, J. and Keens, A. 1994. U.S. Patent No. 5,309,217. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.

Sobral, P.J.A., Menegalli, F.C., Hubinger, M.D. and Roques, M.A. 2001. Mechanical, water vapor barrier and thermal properties of gelatin based edible films. Food Hydrocolloids. 15(4-6): 423–432.

Soltanikazemi, M., Abdanan Mehdizadeh, S. and Heydari, M. 2016. Non-destructive evaluation of the internal fruit quality of black mulberry (Morus nigra L.) using visible-infrared spectroscopy and genetic algorithm. International Journal of Food Properties. 1-11.

Spinelli, A.C.N., Sant'Ana, A.S., Pacheco-Sanchez, C.P. and Massaguer, P.R. 2010. Influence of the hot-fill water-spray-cooling process after continuous pasteurization on the number of decimal reductions and on Alicyclobacillus acidoterrestris CRA 7152 growth in orange juice stored at 35º C. International Journal of Food Microbiology. 137(2): 295-298. Subedi, P.P., Walsh, K.B. and Hopkins, D.W. 2012a. Assessment of titratable acidity in

fruit using short wave near infrared spectroscopy. Part A: establishing a detection limit based on model solutions. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 20: 449-457.

Subedi, P.P., Walsh, K.B. and Hopkins, D.W. 2012b. Assessment of titratable acidity in fruit using short wave near infrared spectroscopy. Part B: intact fruit studies. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 20(4): 459-463.

136

Tewari, J., Mehrotra, R. and Irudayaraj, J. 2003. Direct near infrared analysis of sugar cane clear juice using a fibre-optic transmittance probe. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 11(5): 351-356.

Tahir, H.E., Xiaobo, Z., Tinting, S., Jiyong, S. and Mariod, A.A. 2016a. Near-Infrared (NIR) Spectroscopy for rapid measurement of antioxidant properties and discrimination of Sudanese honeys from different botanical origin. Food Analytical Methods. 9:2631–2641.

Tahir, H.E., Xiaobo, Z., Jiyong, S., Mariod, A.A. and Wiliam, T. 2016b. Rapid determination of antioxidant compounds and antioxidant activity of Sudanese Karkade (Hibiscus sabdariffa L.) using near infrared spectroscopy. Food Analytical Methods. 9:1228–1236.

Tanaka, M., Koyama, Y.I. and Nomura, Y. 2009. Effects of collagen peptide ingestion on UV-B-induced skin damage. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73(4): 930-932.

Torres, I., Pérez-Marín, D., De la Haba, M.J. and Sánchez, M.T. 2017. Developing universal models for the prediction of physical quality in citrus fruits analysed on-tree using portable NIRS sensors. Biosystems Engineering. 153: 140-148.

Usha, R. and Ramasami, T. 2004. The effects of urea and n-propanol on collagen denaturation: using DSC, circular dicroism and viscosity. Thermochimica Acta. 409(2): 201-206. Vazquez-Ortiz, F.A, Moron-Fuenmayor, O.E. and Gonzalez-Mendez, N.F. 2005.

Hydroxyproline measurement by HPLC: Improved method of total collagen determination in meat samples. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies. 27(17): 2771-2780.

Viegas, T.R., Mata, A.L., Duarte, M.M. and Lima, K.M. 2016. Determination of quality attributes in wax jambu fruit using NIRS and PLS. Food Chemistry. 190: 1-4.

Walrand, S., Chiotelli, E., Noirt, F., Mwewa, S. and Lassel, T. 2008. Consumption of a functional fermented milk containing collagen hydrolysate improves the concentration of collagen-specific amino acids in plasma. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56(17): 7790-7795.

137

Wang, H., Liang, Y., Wang, H., Zhang, H., Wang, M. and Liu, L. 2014a. Physical– chemical properties of collagens from skin, scale, and bone of grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Journal of Aquatic Food Product Technology. 23(3): 264–277.

Wang, L., Liang, Q., Chen, T., Wang, Z., Xu, J. and Ma, H. 2014b. Characterization of collagen from the skin of Amur sturgeon (Acipenser schrenckii). Food Hydrocolloids. 38: 104–109.

Wang, S., Zhao, J., Chen, L., Zhou, Y. and Wu, J. 2014c. Preparation, isolation and hypothermia protection activity of antifreeze peptides from shark skin collagen. LWT-Food Science and Technology. 55(1): 210–217.

Wasswa, J., Tang, J. and Gu, X. 2007. Utilization of fish processing by-products in the gelatin industry. Food Reviews International. 23(2): 159-174.

Wolf, K.L., Sobral, P.J.A. and Telis, V.R.N. 2009. Physicochemical characterization of collagen fibers and collagen powder for self-composite film production. Food Hydrocolloids. 23: 1886–1894.

Williams, P. 2007. Grains and seeds. Near-Infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. 165-217.

Wu, X., Cai, L., Cao, A., Wang, Y., Li, T. and Li, J. 2016. Comparative study on acid- soluble and pepsin-soluble collagens from skin and swim bladder of grass carp (Ctenopharyngodon idella). Journal of Science and Food Agriculture. 96: 815–821.

Wu, X., Liu, Y., Liu, A. and Wang, W. 2017. Improved thermal-stability and mechanical properties of type I collagen by crosslinking with casein, keratin and soy protein isolate using transglutaminase. International Journal of Biological Macromolecules. 98: 292-301. Xiaowei, H., Xiaobo, Z., Jiewen, Z., Jiyong, S., Xiaolei, Z. and Holmes, M. 2014.

Measurement of total anthocyanins content in flowering tea using near infrared spectroscopy combined with ant colony optimization models. Food Chemistry. 164-536–543.

Xie, L., Ye, X., Liu, D. and Ying, Y. 2009. Quantification of glucose, fructose and sucrose in bayberry juice by NIR and PLS. Food Chemistry. 114(3): 1135-1140.

138

Xie, L., Ye, X., Liu, D. and Ying, Y. 2011. Prediction of titratable acidity, malic acid, and citric acid in bayberry fruit by near-infrared spectroscopy. Food Research International. 44(7): 2198-2204.

Yang, H., Wang, Y., Jiang, M., Oh, J., Herring, J. and Zhou, P. 2007. 2-Step optimization of the extraction and subsequent physical properties of channel catfish (Ictalurus punctatus) skin. Journal of Food Science. 72: 188–195.

Yang, M., Guo, Z., YU, Q. and Li, R. 2013. Ultrasonic-assisted extraction of collagen. Journal of Gansu Agricultural University. 3: 024.

Zague, V. 2008. A new view concerning the effects of collagen hydrolysate intake on skin properties. Archives of Dermatological Research. 300(9): 479-483.

Zhang, M.H., Luypaert, J., Pierna, J.F., Xu, Q.S. and Massart, D.L. 2004. Determination of total antioxidant capacity in green tea by near-infrared spectroscopy and multivariate calibration. Talanta. 62(1): 25-35.

Zhang, C., Shen, Y., Chen, J., Xiao, P. and Bao, J. 2008. Nondestructive prediction of total phenolics, flavonoid contents, and antioxidant capacity of rice grain using near-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56(18): 8268-8272.

Zhang, G. and Ma, Y. 2013. Spectroscopic studies on the interaction of sodium benzoate, a food preservative, with calf thymus DNA. Food Chemistry. 141(1): 41-47.

Zhou, C., Li, Y., Yu, X., Yang, H., Ma, H., Yagoub, A.E.A., Cheng, Y., Hu, J. and Out, P.N.Y. 2016. Extraction and characterization of chicken feet soluble collagen. LWT-Food Science and Technology. 74: 145-153.

Zornoza, R., Guerrero, C., Mataix-Solera, J., Scow, K.M., Arcenegui, V. and Mataix- Beneyto, J. 2008. Near infrared spectroscopy for determination of various physical, chemical and biochemical properties in Mediterranean soils. Soil Biology and Biochemistry. 40(7): 1923-1930.

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก

141

การวเคราะหและค านวณความถกตองของสมการมาตรฐาน

1. Residuals (error)

ei = yi − yi

เมอ yi คอ คาทไดจากวธมาตรฐาน

yi คอ คาทไดจากการท านายดวยสมการ

2. Standard error of calibration (SEC)

SEC = [∑ di

2

nc − p − 1]

1/2

เมอ nc คอ จ านวนของตวอยางในกลม calibration set p คอ จ านวน terms หรอจ านวนตวแปรทใชในการสรางสมการเทยบมาตรฐาน

3. Bias (systematic error)

สามารถเกดขนไดเนองจากการเปลยนตวอยางใหมทไมเคยพบในสมการเทยบมาตรฐาน การ

เปลยนแปลงของเครองมอการวเคราะหทางเคม หรอการเปลยนกระบวนการผลต การเตรยมตวอยาง คา bias ค านวณไดจาก

e = 1

n∑ ei

เมอ n คอ จ านวนตวอยาง

ei คอ คา residual Bias เปน + หากคาทไดจากการท านายมคาต ากวาคามาตรฐาน

142

4. การตรวจสอบ bias (pair t-test)

การตรวจสอบคาความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตของคา bias สามารถท าไดโดยการใช t-test โดยค านวณคา bias confidence limits (BCLs), Tb ซงเปนขดจ ากดการยอมรบหรอปฏเสธประสทธภาพการท านายของสมการค านวณตามสตรคอ

Tb = ± t(1−∝/2) × SEP

√n

เมอ ∝ คอ probability of making a type I error, 5% n คอ จ านวนตวอยางในกลมทวนสอบ t คอ t-value for two-tailed test with deg. of freedom associated SEP

5. Coefficient of determination (R2)

R2=[1 −∑ (YTi−YPi)2N

i=1

∑ (YTi−Ym)2Ni=1

]

เมอ yTi คอ คาทไดจากวธมาตรฐาน

ypi คอ คาทไดจากสมการท านาย

ym คอ คาเฉลยทไดจากวธมาตรฐาน

6. Standard error of prediction (SEP)

SEP = [∑(di − bias)2

nv − 1]

1/2

เมอ nv คอ จ านวนตวอยางในชดขอมลส าหรบตรวจสอบสมการ

di คอ คาความแตกตางระหวางคาคณลกษณะทางเคมทไดจากการท านายดวยสมการ ท านายกบคาทไดจากการวเคราะหดวยวธมาตรฐาน

143

7. Ratio of standard deviation of reference data in validation set to SEP (RPD)

RPD = SDval

SEP

8. The unexplained error confidence limits (UECLS) (F-test, ratio of 2 variances)

SEP checking

TUE = SEC√F(∝,v,M)

SEC = √∑ ei

2

nc − p − 1

เมอ TUE คอ The unexplained error confidence limit (UCELS)

∝ คอ probability of making a type I error, 5% V คอ n-1 (degree of freedom associated with SEP)

M คอ nc-p-1 (degree of freedom associated with SEC)

SEP<TUE ; SEP is accepted (at 95% confidence)

Slope checking

Tobs = |b − 1|√Sy

2(n − 1)

Sres2

Sres = √∑(yi − a + byi)2

n − 2

144

เมอ Sy2 คอ variance of the n predicted values

Sres คอ residual standard deviation a คอ intercept b คอ slope

9. การค านวณรอยละความคลาดเคลอน (% error)

% error = 𝑑𝑖𝑓𝑓

คาจรง × 100

เมอ diff คอ คาความแตกตางระหวางคาจรงทวเคราะหดวยวธมาตรฐานและคาท านายทไดจาก การวดดวยเทคนค NIRS

10. Standard error of the laboratory (SEL) (ส าหรบการวเคราะห 2 ซ า)

SEL = [∑ (x1 − x2)2

i

n]

1/2

เมอ x1-x2 คอ ผลตางระหวางคาทางเคมทวเคราะหซ าของตวอยาง i

n คอ จ านวนตวอยางทงหมด

ภาคผนวก ข

146

การวเคราะหคณลกษณะทางเคมเบ องตนและคาทางเคมของผลตภณฑ เครองดมเพอสขภาพเสรมคอลลาเจน

1. การวเคราะหปรมาณของแขงทละลายไดท งหมด (total soluble solids, TSS)

โดยใชมาตรดชน หกเห โดยน าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลาเจนมา มาหยดลงบน Digital refractometer (ภาพท 64) และบนทกคา

ภาพท 64 เครอง Digital refractometer

2. การวเคราะหคาความเปนกรด - ดาง โดยใชเครองวดความเปนกรด - ดาง (pH meter) น าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลา

เจนมาวดคา pH ดวยเครองวดความเปนกรดดาง (pH meter) โดยจะใชตวอยาง 10 มลลลตรใสลงในบกเกอร และน าหว probe จมลงในตวอยางใหทวม บนทกคา

3. การวเคราะหคาส โดยใชเครอง Tintometer น าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลาเจน วดคาส (L*,a*,b*,

C* และ hº) ดวยเครอง Tintometer โดยจะใชตวอยางใสลงในควเวท และบนทกคาดงภาพท 65

147

ภาพท 65 เครองวดส (Tintometer) ทใชในการวดเครองดมทมการเสรมคอลลาเจน

ขนตอนการใชงานเครองวดสส าหรบตวอยางทเปนของเหลวเรมจาก 1. เปดเครองโดยการกดปมดานขางของเครองมอคางไว

2. จากนน calibration เครองมอทกครงทใช โดยการเลอนแถบดานหลงเครอง เพอปดชองแสง

แลวกดปมดานขางเครองคางไวเพอใหเครอง calibrate

3. เทตวอยางลงในควเวท ปรมาตร 3 มลลลตร

4. เปดชองแสงดานหลงเครอง วางเครองมอและตวอยางลงในอปกรณดงภาพท 66 แลวกดปม

ดานขางเครอง เพอท าการวด โดยท าการกดวด 3 ครง จากนนบนทกคาทไดจากการเฉลย

ภาพท 66 การวางเครองมอและตวอยางของเครองวดส

148

4. การวเคราะหคาความหนด โดยใชเครอง Brookfield Viscometer น าตวอยางเครองดมทมการเสรมคอลลาเจน วดคา

ความหนด โดยใชเครอง Brookfield Viscometer ดงภาพท 67 โดยจะใชตวอยาง 16 มลลลตร ใสลงในภาชนะใสตวอยาง จากนนน าหว probe ชนด UL ใสในตวอยาง วดคา และบนทกคา แสดงดงภาพท 68

ภาพท 67 เครอง Brookfield Viscometer

ภาพท 68 ภาชนะใสตวอยางและหว probe ชนด UL ทใชในการวดความหนดผลตภณฑน าผลไมเสรม คอลลาเจน

149

ขนตอนการใชเครองเรมจาก 1. ปรบลกน า ใหอยทจดกงกลางของกรอบ เพอตงเครองใหสมดล 2. กอนเปดเครองใหถอด guard ทเครองวด 3. เปด switch ซงอยดานหลงฐานของเครองทางขวามอ 4. เปดโปรแกรมคอมพวเตอร RC จากนนกด next ทเครอง Brookfield จนถงหนา

configure viscosity test จากนนกดเครองหมายรปบาน แลวเลอก external mode เลอก communication แลวไปท port เลอก corn 3 เลอก connect และเลอก dashboard

5. ตออปกรณเขากบเครอง เชน UL Adapter ใชปรมาตร 16 มลลลตร (ความหนดต า นอยกวา 15 cp)

6. ใสตวอยางใหเรยบรอย (ใสตวอยางปรมาตร 16 มลลลตร จมเขมลงในตวอยางจนถงระดบขด Mark ทกงกลางเขม โดยใชมอดานหนงจบแกนของมอเตอรใหนง ตอเขมเขากบแกนของมอเตอร หมนตามเขมนาฬกาจนแนน)

7. กด new ทหนา test จากนนเลอก spindle เลอก LV1-3 (ตามเบอรทหววดนนๆ) 8. จมตววดอณหภม 9. ก าหนด speed เพอก าหนดความเรวรอบในการหมน โดยจะตองก าหนดคาเรมตนทคา

นอยๆ กอน เชน 10 rpm แลวกด set speed อกครง เพอใหเครองบนทก การเลอกความเรวรอบในการหมนควรจะใหมคาใกล 100 % TORQUE (ความเรวรอบสงสดทใชจะมคาไมเกน 250 rpm) ตงอณหภมตามเครอง เลอกบนทกขอมลแบบ multiple point ก าหนดความถในการแสดงขอมล เชน 30 วนาท หรอ 1 นาท จากนนก าหนดเวลาในการวด (end) เลอก collect point at step end เมอก าหนดคาตางเรยบรอยแลว กด run เพอเรมวดตวอยาง

10. การเปลยนความเรวรอบ ใหกลบไปท าตามขอ 9 ใหม การเปลยนความเรวรอบจะตองเพมคาครงละนอยๆ เชน 10 rpm จนกวาคา torque จะมคาเขาใกลหรอเทากบ 100%

- ถาคา TORQUE ขน error แสดงวาใชความเรวรอบมากเกนไปตองลดความเรวรอบลง - ถาคา TORQUE มคาต า ทงทตงคาความเรวรอบ (rpm) สงสดแลว แสดงวาเขมทใช

ไมเหมาะสม ใหเปลยนหวเขมใหม หลงจากนน ท าตามขนตอนท 7 ใหมอกครง เพอเลอกหววดทเหมาะสม

11. เมอวดตวอยางเสรจ ใหน าตวอยางออก เลอก return แลวกด OK แลวจะปรากฏหนา main menu แลวปด switch ซงอยดานหลงฐานของเครองทางขวามอ และปดโปรแกรมทเครองคอมพวเตอร ท าความสะอาดเครองมอและอปกรณใหเปนระเบยบและถกตอง

150

5. การวเคราะหปรมาณคอลลาเจน ดวยวธ HPLC (ดดแปลงจาก Vazquez-Ortiz และคณะ, 2005)

การเตรยมสารเคม

การเตรยม 6 M HCl ตวงกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 37% ปรมาตร 49.69 มลลลตร จากนนปรบปรมาตรดวยน ากลนในขวดปรบปรมาตร (Volumetric Flask) ขนาด 100 มลลลตร

การเตรยม 1 M HCl ตวงกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 37% ปรมาตร 8.28 มลลลตร จากนนปรบปรมาตรดวยน ากลนในขวดปรบปรมาตร (Volumetric Flask) ขนาด 100 มลลลตร

การเตรยม 1 M NaOH ปรมาตร 100 มลลลตร โดยชง NaOH หนก 4.00 กรม ลงในบกเกอร เตมน า ละลายสารลงในบกเกอรขนาด 100 มลลลตร กวนจนสารละลายหมด จากนนปรบปรมาตรดวยน ากลนในขวดปรบปรมาตร (Volumetric Flask) ขนาด 100 มลลลตร การเตรยมสดสวนของเฟสเลอนท การเตรยม 0.053 M Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4-H2O) pH 7.8 ปรมาตร 1 ลตร โดยชง NaH2PO4-H2O หนก 7.3135 กรม ลงในบกเกอร เตมน ากลน ละลายสารลงในบกเกอรขนาด 1,000 มลลลตร และเตมน ากลนเพมลงใหไดประมาณ 800 มลลลตร ปรบ pH ใหได 7.8 ดวย 4 M Potassium hydroxide (KOH) จากนนเทสารละลายทไดลงในขวดปรบปรมาตรขนาด 1,000 มลลลตร และปรบปรมาตรดวยน ากลน การเตรยม 4 M Potassium hydroxide (KOH) 250 มลลลตร โดยชง KOH หนก 56.1056 กรม ลงในบกเกอรขนาด 250 มลลลตร กวนจนสารละลายหมด จากนนปรบปรมาตรดวยน ากลนในขวดปรบปรมาตร (Volumetric Flask) ขนาด 250 มลลลตร

เฟสเคลอนทแบบ Gradient เฟสเคลอนท A : potassium dihydrogen phosphate pH 7.8

เฟสเคลอนท B : MeOH : ACN : น ากลน ในอตราสวน 45 : 40 : 15 (v/v/v) จากนนกรองโมบายเฟสดวย Nylon filter membranes ขนาด 47 มลลลตร 0.22 µm

การเตรยมสารท าอนพนธ (เกบท 4 oC) การเตรยม 0.4 M Borate buffer pH 10.4 ประกอบดวย Boric acid 2.47 กรม ลงในบกเกอรขนาด 100 มลลลตร เตมน ากลน 80 มลลลตร กวนจนสารละลายหมด ปรบ pH ใหได 9.3 ดวย 4 M Potassium hydroxide (KOH) แลวถายสารละลายทไดลงในขวดปรบปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 100 มลลลตร และปรบปรมาตรใหไดดวยน ากลน

151

การเตรยม 0.2% 4–chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) ในเมทานอล โดยชง NBD-Cl 0.02 กรม ลงในขวดปรบปรมาตรขนาด 10 มลลลตร เตมเมทานอล (HPLC grade) ปรบปรมาตรใหได 10 มลลลตร การเตรยมสารละลายคอลลาเจน

การเตรยมสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน ชงสารมาตรฐาน 4-Hydroxyproline ดวยเครองชงละเอยดทศนยม 4 ต าแหนง จ านวน 0.1000±0.0005 กรม ละลายและปรบปรมาตรในขวดปรบปรมาตรขนาด 100 มลลลตร ดวยน ากลน (Distilled Water) (pH 7.0) ใหไดความเขมขน 1,000 mg/L

การเตรยมสารมาตรฐาน โดยการปเปตสารละลาย Stock solution ปรมาตร 50 100 200 500 800 และ 1,000 ไมโครลตร ลงในขวดปรบปรมาตรขนาด 10 มลลลตร แตละขวดปรบปรมาตรดวยน ากลน จะไดสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน ความเขมขน 5 10 20 50 80 และ 100 mg/L ตามล าดบ การเตรยมตวอยาง ชงตวอยางประมาณ 5.0000±0.0010 กรม ดวยเครองชงละเอยด 4 ต าแหนง ใสในขวดสชาปรมาตร 25 มลลลตร ทมฝาปด เพอปองกนการสมผสกบอากาศ จากนนเตม 6 M HCl 5 มลลลตร เขยาเบาๆ ใหเขากนดวย Vortex mixer เปนเวลา 10 วนาท แลวน าไปยอยดวย Autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท แสดงอณหภมและเวลาทใชในการยอยตวอยาง ดงภาพท 69 ทงไวใหเยนทอณหภมหอง น าสารละลายตวอยางทผานการยอย มาระเหยตวท าละลาย ดวยเครองระเหยสญญากาศทอณหภม 60 องศาเซลเซยส ความเรวรอบ 150 rpm เปนเวลา 10 นาท จนสารละลายแหงสนท น าสารละลายทแหงแลวมาปรบปรมาตรดวยน ากลน 5 มลลลตร ดวยขวดปรบปรมาตร 5 มลลลตร เขยาใหเขากน และกรองสารละลายดวย Nylon Syringe Filter ขนาด 13 มลลลตร 0.22 ไมโครเมตร (µm) เกบสวนใสของตวอยางไว เพอใชในการวเคราะหตอไป

152

ภาพท 69 อณหภมและเวลาทใชในการยอยตวอยางดวยเครอง Autoclave การท าอนพนธตวอยาง

น าสารละลายสวนใสจากขางตน ปเปตสารละลาย 1,250 ไมโครลตร จากนนเจอจางใหเปน 5 มลลลตร ดวย 0.4 M Borate buffer pH 10.4 จากนน ปเปต 250 ไมโครลตร ของสารละลายตวอยาง ผสมกบ 250 ไมโครลตร ของ 0.2% 4–chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) ผสมใหเขากน น าไปใหความรอนท 60±1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท จากนนหยดปฏกรยา โดยเตม 50 ไมโครลตร 1 M HCl จากนนท าใหเยนทนทท 0±1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท กรองสารละลายดวย Nylon Syringe Filter ขนาด 13 มลลลตร 0.22 ไมโครเมตร แลวน าสารละลายปรมาตร 10 ไมโครลตร มาวเคราะหดวยเครอง HPLC ตามสภาวะดงตารางท 26

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 40 60 80 100 120

อณหภ

ม (อ

งศาเซ

ลเซย

ส)

เวลา (นาท)

153

ตารางท 26 สภาวะส าหรบการวเคราะหหาปรมาณคอลลาเจนดวย HPLC ตวแปร สภาวะทเหมาะสม คอลมน คอลมน Luna C18 (2) 100 องสตรอม ขนาด 250x4.6

มลลเมตร (column, Phenomenex, Torrance, USA) ความยาวคลนทใหพลงงานกบสาร ความยาวคลนทสารดดกลน ประเภทของเครองตรวจวด

465 นาโนเมตร 535 นาโนเมตร fluorescence detector

อณหภมททดสอบ 30 องศาเซลเซยส ปรมาตรของสารทฉดเขาเครอง 10 ไมโครลตร (µl) อตราการไหล 0.8 มลลลตรตอนาท (ml/min) ระยะเวลาในการฉด 65 นาท (min) สดสวนของเฟสเคลอนท

เฟสเคลอนท A : โพแทสเซยม ไดไฮโดรเจนฟอสเฟต pH 7.8 เฟสเคลอนท B : เมทานอลตออะซโตไนไตรลตอน ากลน ในอตราสวน 45 : 40 : 15 (v/v/v)

การตรวจสอบความแมนย าของวธวเคราะห

การพสจนชวงของการวด (Working Range) และ ความเปนเสนตรง (Linearity) โดยเตรยมสารละลายมาตรฐานความเขมขนอยางนอย 6 ระดบ ความเขมขนละ 3 ซ า น าไปวเคราะหแบบ pre-column HPLC และวดสญญาณหรอ พน ทใตกราฟ (peak area) ดวยเครองตรวจวดแบบ Fluorescent detector จากนนหาความสมพนธเชงเสนตรงระหวางพนทใตกราฟ (แกน y) และความเขมขน (แกน x) สรางกราฟมาตรฐาน แสดงดงภาพท 70

ประเมนความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน โดยการค านวณหาคาสมประสทธสหสมพนธ (Correlation coefficient, r) ซงคาทไดควรเขาใกล 1 และ ภาพท 71 แสดงโครมาโตแกรมผลการวเคราะห 4-ไฮดรอกซโพรลน โดยใช NBD-Cl และการเตรยมอนพนธ ในตวอยางเครองดมในภาชนะบรรจปดสนททผสมคอลลาเจน

ตารางท 27 แสดงความเขมขนของสารมาตรฐานทชวงความเขมขน 5 10 20 50 80 และ 100 mg/L ตามล าดบ น ามาวเคราะหหาปรมาณ โดยเทยบระยะเวลาทพบสาร (Retention time) เดยวกน เพอยนยนวาเปนสารชนดเดยวกน โดยท าการวเคราะหความเขมขนละ 2 ซ า ซงแสดงใหเหนวาพนทใตกราฟ (Peak area) ของสารมาตรฐานแตละความเขมขนมความเทยงทอยในเกณฑการยอมรบ

154

ตารางท 27 พนทใตกราฟของสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน ทความเขมขนตางๆ

ความเขมขนสารมาตรฐาน (mg/L)

พนทใตกราฟ (Peak Area) SD %RSD

ครงท 1 ครงท 2 คาเฉลย

5 5.811 4.809 5.310 0.709 13.345 10 8.539 10.284 9.411 1.234 13.107 20 19.160 19.374 19.267 0.151 0.786 50 52.865 51.069 51.967 1.270 2.443 80 80.357 78.030 79.194 1.646 2.078 100 97.017 102.686 99.852 4.008 4.014

ภาพท 70 กราฟมาตรฐานสาร 4-ไฮดรอกซโพรลน

จากสมการเสนตรง y = 296,056X-212,892 พบวาคาสมประสทธสหสมพนธ (Correlation coefficient, r) มคาเทากบ 0.9993 ซงมคามากกวาเกณฑการยอมรบคอ 0.995 ดงนนชวงของการวเคราะห (Working Range) ทมความเปนเสนตรง (Linearity) ในชวงของการใชงานสารมาตรฐาน 5-100 mg/L

y = 296,056.0024x - 212,892.9382R² = 0.9993

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

0 20 40 60 80 100 120

พนทใ

ตกรา

ฟ

ความเขมขนของสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน (mg/L)

155

พสจนความแมน (Accuracy) โดยคดเลอกตวอยางเครองดมในภาชนะบรรจปดสนท มาวเคราะหหาปรมาณคอลลาเจน (C2 : unspiked sample) เตมสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน ททราบความเขมขน 20, 50 และ 80 mg/L (C3) วเคราะหหาปรมาณคลอลาเจน ความเขมขนละ 3 ซ า (C1 : spiked sample) แลวค านวณคาเฉลยโดยน า % Recovery ทไดมาเปรยบเทยบกบเกณฑการยอมรบของตามมาตรฐาน AOAC (1993) ค านวณ % Recovery ดงน

% Recovery =(C1 − C2)

C3× 100

พบวาหลงจากทเตมสารละลายมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน ทระดบความเขมขน 20, 50

และ 80 (ต า กลาง และสง) ลงในตวอยางทเปนเครองดมในภาชนะบรรจปดสนท และน ามาวเคราะหหาเปอรเซนตการคนกลบ (% Recovery) พบวาทระดบความเขมขนของสารมาตรฐาน 4-ไฮดรอกซโพรลน 20 mg/L, 50 mg/L และ 80 mg/L พบ % Recovery เฉลยเทากบ 87.49 85.06 และ 90.67 ตามล าดบ ซงอยในชวงเกณฑการยอมรบ คอ 80-110% ทระดบของสารทสนใจไมเกน 100 mg/L จงสามารถสรปไดวาวธการวเคราะหนมความแมนย าในชวงของการใชงานสารมาตรฐาน 5-100 mg/L

156

-200000

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Inten

sity (

mV)

Retention time (min)

เครองดมเสรมคอลลาเจน 4-ไฮดรอกซโพรลน

ภาพท 71 โครมาโตแกรมผลการวเคราะห 4-ไฮดรอกซโพรลน โดยใช NBD-Cl ในการเตรยมอนพนธ

ในตวอยางผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน

4-ไฮดรอกซโพรลน

NBD-Cl

ภาคผนวก ค

158

ตรวจสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐาน

เมอท าการตรวจสอบความแมนย าของสมการท านายตามมาตรฐาน ISO 12099 ไดแก การตรวจสอบ Bias SEP และ Slope โดยตรวจสอบคาความผดพลาดเฉลยในการท านาย (bias) โดยการเปรยบเทยบคาทางเคมหรอคาทวเคราะหไดจากวธมาตรฐานกบคาทท านายไดจากสมการท านายดวยการทดสอบ pair t-test ตามสตรทแสดงไวในภาคผนวก ก โดยคา bias ทไดตองมคานอยกวา Tb ซงหมายถงคาทท านายไดจากสมการท านายไมแตกตางจากคาทางเคมอยางมนยส าคญ ทระดบความเชอมน 95% หรอ P นอยกวาหรอเทากบ 0.05 พจารณาคาความผดพลาดมาตรฐานในการท านายของกลมตวอยางทวนสอบสมการ (SEP) ซงการตรวจสอบคา unexplained error confidence limits (UECLs, TUE) ค านวณไดจาก F-test โดยคา SEP ทไ ดควรม คานอยกวาคา TUE และตรวจสอบคาความชน (slope) ของกราฟการกระจาย ตามสตรในภาคผนวก ก พจารณาคา tobs โดย คา tobs ทไดตองนอยกวาคา t-value โดยคาความชนทดทสดควรมคาเทากบ 1 เพอใหไดสมการทมความแมนย าตอการน าไปใชวเคราะหไดดทสด ดงตารางท 28 ตารางท 28 การตรวจสอบความแมนย าของสมการเทยบมาตรฐานผลตภณฑน าผลไมเสรมคอลลาเจน

สมการ bias checking SEP checking Slope checking ความสามารถในการน าไปใชจรง

114 ตวอยาง √ √ √ √

109 ตวอยาง √ √ √ √

ชวงความเขมขนต า √ √ √ √

ชวงความเขมขนสง √ √ √ √

159

30,000

40,000

50,000

60,000

70,000

80,000

90,000

100,000

30,00

0

40,00

0

50,00

0

60,00

0

70,00

0

80,00

0

90,00

0

100,0

00

ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายไ

ดดวย

วธ N

IRS

(มลล

กรมต

อลตร

)

Calibration setValidation set

ภาพท 72 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณคอลลาเจนทวดไดจรงกบปรมาณคอลลาเจนท ท านายไดทชวงความเขมขนต า

ภาพท 73 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณคอลลาเจนทวดไดจรงกบปรมาณคอลลาเจนท

ท านายไดทชวงความเขมขนสง

1,0002,0003,0004,0005,0006,0007,0008,0009,000

10,00011,000

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

8,000

9,000

10,00

0

11,00

0ปรมา

ณคอล

ลาเจ

นทท า

นายไ

ดดวย

วธ N

IRS(ม

ลลกร

มตอล

ตร)

Calibration setValidation set

ปรมาณคอลลาเจนทวเคราะหดวยวธ HPLC (มลลกรมตอลตร)

R2 = 0.780 RMSEP = 898 mg/L Bias = -96 mg/L RPD = 2.14

R2 = 0.309 RMSEP = 11,700 mg/L Bias = 193 mg/L RPD = 1.20

ปรมาณคอลลาเจนทวเคราะหดวยวธ HPLC (มลลกรมตอลตร)

ภาคผนวก ง

161

ข นตอนการสรางสมการเทยบมาตรฐานดวยวธ MLR

1. เรยงขอมลคาการดดกลนแสงใหอยในไฟล excel เดยวกน จากนน save ไฟลเปน excel 2003

2. เปดโปรแกรม The Unscrambler (Camo, Oslo, Norway) โหลดไฟล excel โดยเลอกท flie import excel ดงภาพ

3. จากนนจะขนหนาตางเหมอนดงภาพท แลวกด ok

162

4. เมอกด ok แลว จะแสดงเปนหนาตางดงภาพ โดยจะแสดงเปนคาปรมาณคอลลาเจนทแตละเลขคลน (แกนนอน) และคาการดดกลนแสง (แกนตง)

5. กลบแกน โดยไปท modify transform transpose เพอสลบแกนนอนและแกนตง

คาปรมาณคอลลาเจน

คาการดดกลนแสง

163

6. หนาตางทกลบแกนเรยบรอยแลวแสดงดงภาพ เพอทจะกรอกคาทางเคม

7. โดยขนตอนนจะท าการกรอกคาทางเคมในคอลมนสดทาย โดยจะคลกขวาทคอลมนสดทายและเลอก Insert Variable

164

8. จะไดตารางดงภาพ จากนนท าการกรอกขอมลทางเคมไดทน

9. เมอมคาการดดกลนแสงและคาทางเคมแลว จะสรางสมการเทยบมาตรฐาน โดยไปท Task และเลอก Regression

165

10. แสดงหนาตางดงภาพ จากนน กดเลอกการสรางสมการแบบ MLR จากนนจะก าหนดคา X-valiables และ Y-valiables โดย X-valiables จะเปน คาการดดกลนแสง และ Y- valiables เปนคาทางเคม

11. ก าหนดคา X-valiables และ Y-valiables โดยกดท Define จะแสดงหนาตางดงภาพ

166

12. จากนนกด Add เพอกรอกขอมล X-valiables และ Y-valiables โดยจะกรอกคาทชอง Interval โดยในการเลอกคา X- valiables จะตองท าการคดเลอกความยาวคลนทมความสมพนธกบตวแปรตามทจะท านาย โดยพจารณาเลขคลนส าคญจากกราฟสมประสทธการถดถอยรวมกบเลขคลนอางองจากหนง สอหรอเปรยบเทยบกบสเปกตรมขององคประกอบทตองการศกษาทเปนสารบรสทธ เมอกรอกคาดงกลาวเรยบรอยแลวกด ok จากนนจะกรอกคา Y- valiables (คาทางเคม) โดยท าเหมอนขอ 11

167

13. เมอกรอกขอมล X-valiables และ Y-valiables แลวจะเลอก Validation method โดยในการศกษานเลอกใช Full-cross validation จากนน กด ok

14. เมอกด ok แลวจะแสดงหนาตางดงภาพ จากนนกด view

168

15. แสดงหนาตางดงภาพ โดยจะแสดงเปนสมการและ regression coefficient

16. จากนนเลขคลนจะถกตดออกอยางเปนระบบ ดวยการก าจดเลขคลนทมความส าคญนอยทสดออกดวยวธ forward-backward elimination ซงเปนการก าจดเลขคลนออกอยางเปนขนตอนจนกวาจะเหลอจ านวนเลขคลนนอยทสดและเพยงพอทจะท านายปรมาณคอลลาเจนได โดยไปท Plot เลอก Analysis of variance

169

17. แสดงหนาตางดงภาพ จากนนกด ok

18. แสดงตาราง ANOVA จากนนเลอกเลขคลนทมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมน 95% ออก (p>0.05) จนเหลอเลขคลนทมอทธพลสงสดในการสรางสมการ

170

19. จากนนน าเลขคลนทเหลอ ไป RUN ตามขอ 13 จนกวาจะเหลอเลขคลนทไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมน 95% (p≤0.05) สามารถดคาทางสถตของกลม Calibration และ Validation ไดโดย คลกขวา กด View และไปท source ดงภาพ

171

ประวตผวจย

ชอ-สกล (ภาษาไทย) นางสาวปยะพร เนยมมณ (ภาษาองกฤษ) MISS PIYAPORN NEAMMANEE

ทอย 35 หมท 1 ต าบลตลาดจนดา อ าเภอสามพราน จงหวดนครปฐม รหสไปรษณย 73110

ประวตการศกษา พ.ศ. 2555 ส าเรจการศกษาปรญญาวทยาศาสตรบณฑต

สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร

พ.ศ. 2556 ศกษาตอระดบปรญญามหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

การน าเสนอผลงาน ปยะพร เนยมมณ บศรากรณ มหาโยธ และ ปราโมทย ควจตรจาร. 2559. การศกษาความ

เปนไปไดในการตรวจสอบคอลลาเจนในสารละลายและระบบจ าลองดวยเทคนค สเปกโทรสโกปอนฟราเรดยานใกล. โครงการประชมวชาการ บณฑตศกษาระดบชาตและนานาชาต ครงท 6 เรอง “สหวทยาการสรางสรรคเพอการพฒนาทยงยน” 11-12 กรกฎาคม 2559, ณ ศนยสนสกฤตศกษา มหาวทยาลยศลปากร เขตทววฒนา กรงเทพฯ (ภาคบรรยาย)