คู มือการพิสูจน ความใช ได ของ...

คมอการพสจน ความใชไดของ วธทดสอบ

ตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC สาหรบหองปฏบตการทดสอบดานสารตกคางยาสตว

วธยนยนผล และ วธคดกรอง

Compliant Non compliant

ผลทดสอบ Confirmation

CC confirmation

กรณ สารหามใช

MRPL


ผลทดสอบ

Confirmation

CC confirmation MRL

กรณ สารทอนญาตใหใช

2555

สจตตรา พงศววฒน สพ.บ. วท.ม. สานกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว ๔ ตลาคม ๒๕๕๕

เลขทะเบยนวชาการ: 55-(2)-0304-150

คมอการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC

สารบญ หนา

สารบญภาคผนวก iv

สารบญรปภาพ iv

สารบญตาราง v

คานา 1

บทนา 3

ผงสรปเนอหาการพสจนความใชไดของวธทดสอบ 5

บทท 1 : คานยาม 6

บทท 2 : การพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบยนยนผล 19

2.1 การจาแนกชนดของวธทดสอบ , 19 2.2 การพสจนความใชไดและการหาคณลกษณะแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ, 20 2.2.1 คณลกษณะทวไปแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ (Model-independent performance characteristics), 21 2.2.1.1 ความจาเพาะ/ความสามารถในการแยกสาร (Specificity / Selectivity), 21 2.2.1.2 ความแมน (Trueness) ของวธทดสอบ, 22 2.2.1.3 การใชงานและความทนทานของวธทดสอบ (Applicability / ruggedness minor changes), 23 2.2.1.4 ความเสถยรของสาร (Stability), 24 2.2.1.4.1 การศกษาความเสถยรของสารในรปสารละลาย, 25 2.2.1.4.2 การศกษาความเสถยรของสารในเนอเยอ, 26 2.2.1.5 กราฟมาตรฐาน (Calibration curve), 27 2.2.2 การพสจนความใชไดตามแนวทางเดม (Conventional validation procedure), 28 2.2.2.1 การกลบคน (Recovery), 28 2.2.2.2 การทวนซาได (Repeatability), 29 2.2.2.3 การทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (Within laboratory reproducibility), 29 2.2.2.4 การทาซาได (Reproducibility), 30 2.2.2.5 เกณฑการตดสน (Decision Limit, CC), 30 2.2.2.6 ความสามารถในการวด (Detection capability, CC), 32 2.2.2.7 ความทนทานของวธทดสอบเมอมการเปลยนแปลงของปจจยไปมาก (Ruggedness, major changes), 34 2.2.3 การพสจนความใชไดตามแนวทางใหมโดยหองปฏบตการแหงเดยว (Validation according to alternative method), 34

i


สารบญ (ตอ) หนา

2.2.3.1 แผนการทดลอง (Experimental plan), 34 2.2.3.2 Power curve, 38 2.2.3.3 การทาซาได (Reproducibility), 38 2.3 กราฟแสดงคาเกณฑของวธทดสอบ, 39 2.4 ตวอยางการคานวณ/ความทนทานของวธทดสอบ, 41 2.5 การคานวณการพสจนความใชไดตามแนวทางใหม (โดยหองปฏบตการแหงเดยว), 42 2.6 ตวอยางวธการเตมสารมาตรฐานเพมลงในตวอยางทมสารทสนใจตกคางอยแลว (The standard addition method), 42

บทท 3 : การพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบคดกรอง 43

3.1 การจาแนกวธทดสอบแบบคดกรอง, 43 3.1.1 วธทดสอบคดกรองทจาแนกตามเทคนค/หลกการตรวจ , 43 3.1.1.1 วธทดสอบดวยเทคนคทางชววทยา, 43 3.1.1.2 วธทดสอบดวยเทคนคทางชวเคม, 43 3.1.1.3 วธทดสอบดวยเทคนคทางฟสกสเคม, 43 3.1.2 วธทดสอบคดกรองจาแนกตามลกษณะการวดผล, 44 3.1.2.1 วธทดสอบเชงคณภาพ, 44 3.1.2.2 วธทดสอบเชงการวดปรมาณคราวๆ , 44 3.1.2.3 วธทดสอบเชงการวดปรมาณ, 44 3.2 หลกการพสจนความใชไดวธทดสอบคดกรอง, 45 3.2.1 คณสมบตทดของวธทดสอบแบบคดกรอง, 45 3.2.2 การเลอกชนดสารในการพสจนความใชไดและการเลอกวธทดสอบ (Choice of analytes used for validation and selectivity of the method), 45 3.2.2.1 วธทดสอบสารปฏชวนะตกคางหลายๆกลมดวยเทคนคการยบยงการเจรญเตบโต ของเชอจลนทรย (Multi-class methods using inhibition tests), 45 3.2.2.2 วธทดสอบสารตกคางหลายๆกลมดวยเทคนคทางชวเคมวเคราะห (Multi-class methods using biochemical tests), 46 3.2.2.3 วธทดสอบสารตกคางหลายๆกลมดวยเทคนคทางฟสกสเคม

(Multi-class methods using physicochemical screening techniques), 46 3.2.2.4 สรปเกณฑในการคดเลอกสาร, 47 3.2.3 การเตรยมเนอเยอเลยนแบบ , 47 3.3 ขนตอนการพสจนความใชได (Validation Procedure), 48 3.3.1 การหาคาความจาเพาะและคาความสามารถในการวด (CC) แนวเดม (Conventional/Classical approach), 48

ii


สารบญ (ตอ)

หนา 3.3.1.1 จานวนตวอยาง, 48 3.3.1.2 การหาคาระดบ Cut-off และการคานวณคา CC, 49 3.3.1.3 การใชงาน (Applicability) และความทนทาน (ruggedness) ของวธทดสอบคดกรอง, 51 3.3.1.4 ความเสถยร (Stability), 52 3.3.2 การหาความจาเพาะและคาความสามารถในการวด CC ตามแนวทางใหม, 53 3.4 การถายโอนวธทดสอบเบองตนไปใชทหองปฏบตการอนๆ, 53 3.4.1 เงอนไขการถายโอน วธทดสอบ, 53 3.4.2 การพสจนความใชไดขนตอนเสรม (แบบสน) ตามแนวทางเดม (Classical concept), 54 3.4.3 การพสจนความใชไดขนตอนเสรม (แบบสน) ตามแนวทางใหม (Alternative concept), 54 3.5 การทวนสอบอยางตอเนอง (Continuous verification), 55 3.5.1 ตวอยางเพอควบคมคณภาพ (Quality control samples), 55 3.5.2 การทดสอบความชานาญ (Proficiency tests), 56 3.6 การจดทารายงานการพสจนความใชได (Validation report), 56

บทท 4 : เกณฑในการกากบดแล/เกณฑเพอดาเนนการ 58

4.1 การจาแนกยาสตว, 60 4.1.1 กรณสารทไมสามารถกาหนดคา MRL ได, 60 4.1.2 กรณสารทมการกาหนดคาความเขมขนของสารตกคางใหมไดและผลรวมของ คาความเขมขนสงสดของสารตกคางทใหมได (MRL and Sum MRL), 61 4.1.3 กรณสารทไมจาเปนตองมคา MRL (no MRL required), 63 4.2 เกณฑการตดสนผลทดสอบ, 64 4.2.1 กรณวธทดสอบแบบยนยนผล, 64 4.2.2 กรณวธทดสอบแบบคดกรอง, 65

บทท 5 : เกณฑการประเมนสมรรถนะของวธทดสอบ 66

5.1 เกณฑการประเมนสมรรถนะของวธทดสอบและขอกาหนดอนๆ สาหรบการตรวจวดมวลสารของโมเลกลดวยเทคนค Mass spectrometry, 68 5.1.1 การแยกสารดวยเทคนคโครมาโตกราฟ (Chromatographic separation), 68 5.1.2 การตรวจมวลโมเลกลของสารดวยเทคนค Mass spectrometry, 68 5.2 กราฟมาตรฐาน (Calibration curve), 72 5.3 การควบคมคณภาพผลทดสอบ (Internal quality control), 73

บรรณานกรม 74

iii


สารบญภาคผนวก

หนา ภาคผนวกท 1 ภาพประกอบเพออธบายเกยวกบตวอยางทจดสงเขาหองปฏบตการเพอทดสอบ 78

ภาคผนวกท 2 ตวอยางการพสจนความใชไดของวธทดสอบภาคปฏบต 79

ภาคผนวกท 3 การหาคาระดบ Cut-off และ คา CC ของวธทดสอบคดกรอง เชงการวดปรมาณคราวๆ 112

ภาคผนวกท 4 ตวอยางเกณฑพเศษในการกากบดแลดานสารตกคางยาสตว 120

ภาคผนวกท 5 ตวอยางการประเมนคณลกษณะเฉพาะตามเกณฑ CD 2002/657/EC 138

คาศพท 141

สารบญรปภาพ

หนา ภาพท 1 : แสดงการกาหนดคาสมประสทธในการวด (Detection capability, CCß) 38

ภาพท 2 : แสดงคา CC, CCß ของสารทไมมการกาหนดคา MRL 39 ภาพท 3 : แสดงคา CC, CCß ของสารทมการกาหนดคา MRL 40

iv


v

สารบญตาราง

หนา ตารางท 1 : การจาแนกวธทดสอบและคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะ

ของวธทดสอบทจาเปนตองดาเนนการ ( ) และไมจาเปนตองดาเนนการ ( ) 19 ตารางท 2 : คณลกษณะหรอพารามเตอรแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ

ทขนกบและไมขนกบแนวทางการพสจนความใชได 20 ตารางท 3 : การออกแบบการทดลองเพอหาความทนทานของวธทดสอบ

โดยเปลยนแปลงปจจยเลกนอย 24 ตารางท 4 : แผนการทดลองเพอศกษาความเสถยรของสารทสนใจทอยในรปสารละลาย 26 ตารางท 5 : แผนการทดลองเพอศกษาความเสถยรของสารทสนใจทอยในเนอเยอ 27 ตารางท 6 : ตวอยางปจจยสาคญทสงผลตอวธทดสอบ สาหรบออกแบบ

การพสจนความใชไดตามแนวใหม 35 ตารางท 7 : ตวอยางการวางแผนการทดลองตามปจจยทไดเลอกมา 36 ตารางท 8 : เกณฑการประเมนคาความแมน (Trueness) 66 ตารางท 9 : เกณฑการประเมนคาทวนซาได (Repeatability) 67 ตารางท 10 : เกณฑการประเมนคาการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว

(Within-laboratory reproducibility) 67 ตารางท 11 : คาการยอมรบสงสดสาหรบ relative ion intensity 69 ตารางท 12 : คะแนนการยนยนชนดสาร (Identification point; IP) ของเทคนคการวเคราะห 71 ตารางท 13 : ตวอยางการคานวณคะแนนการยนยนชนดสารของแตละเทคนคการวเคราะห 72 ตารางท 14 : เกณฑการยอมรบของคาสมประสทธสหสมพนธ (r) สาหรบกราฟมาตรฐาน 73

ภาคผนวก ตารางท 1 : สารกลม A1 Stilbenes 120 ตารางท 2 : สารกลม A2 Thyrostats 121 ตารางท 3 : สารกลม A3 Steroids 121 ตารางท 4 : สารกลม A4 Resorcylic acid lactones และสารอนพนธ 124 ตารางท 5 : สารกลม A5 สารกลมเบตาอโกนสต 125 ตารางท 6 : สารกลม A6 สารในภาคผนวก IV 127 ตารางท 7 : สารกลม B2d สารกดประสาท (Sedatives) 128 ตารางท 8 : สารกลม B2e สารตานการอกเสบทไมใชสเตยรอยด (NSAIDs) 129 ตารางท 9 : สารอนๆ 129 ตารางท 10 : ความเขมขนทแนะนาของสารตาง ๆ ในนาผง ทวธทดสอบควรตรวจได 130 ตารางท 11 : ตวอยางเกณฑคา Sum MRL ทกาหนดโดยยโรปเทยบกบ Codex 130 ตารางท 12 : ชอหองปฏบตการอางองดานสารตกคางยาสตวและขอบเขตความรบผดชอบ 135 ตารางท 13 : Residue or substance group to be tested () by type of animal, Their feeding stuffs, including drinking water, and primary animal products 137


คานา วธทดสอบทหองปฏบตการใชนนตองมคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะทผานเกณฑการยอมรบไดและเหมาะสม เชน มความถกตอง แมนยา เทยงตรง มความไว มความจาเพาะตอสารทตองการทดสอบ ซงจะทราบสมรรถนะดงกลาวมานได กโดยการพสจนความใชไดของวธทดสอบ (Method Validation) ซงหองปฏบตการทดาเนนการตามระบบคณภาพ ตามขอกาหนดของ ISO/IEC 17025:2005 ขอ 5.4.5.ไดกาหนดไววาวธทดสอบทหองปฏบตการเลอกใชนน จะตองผานการพสจนความใชได และมสมรรถนะดพอ เหมาะสมกบการใชงาน (Fitness for purpose หรอ fitness for intended use) ดงนนวธทดสอบใดใด ทไดผานการพสจนความใชไดและใหผลทกพารามเตอรผานตามเกณฑยอมรบของสากล กจะใหผลทดสอบทถกตองแมนยา เชอถอได ผใชผลทดสอบมนใจ กจะเลอกใชบรการการตรวจของหองปฏบตการทใชวธทดสอบทผานการพสจนความใชไดแลวและดาเนนการทกขนตอนภายใตระบบคณภาพตามขอกาหนดมาตรฐานหองปฏบตการทดสอบ ISO/IEC 17025:2005 แนวทางการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ทจดทาขนตามมตคณะกรรมาธการยโรปท 2002/657/EC เปนบรรทดฐานและมผลบงคบใหหองปฏบตการของประเทศสมาชกปฏบตตามเพอใหเปนไปในแนวทางเดยวกน เปนการลดความขดแยงโตเถยง การเกดปญหาอปสรรคทางการคาระหวางประเทศ สวนประเทศทสามจะเลอกใชหรอไมกได และเนองจากแนวทางของยโรปน ไดแนะนาการพสจนความใชไดไวคอนขางชดเจนสาหรบวธทดสอบแบบยนยนผลเปนสวนมาก สวนวธทดสอบแบบคดกรอง นนยงไมมคาแนะนาทชดเจนพอ ซงตอมาไดมการจดทาแนวปฏบตการพสจนความใชได เพมเตมสาหรบ วธทดสอบแบบคดกรอง ในเอกสารชอ “Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines” การทมต 2002/657/EC แนะนาการใชคาเกณฑการตดสน (decision limit หรอ CC) ในการพจารณาวาผลทดสอบของตวอยางสอดคลองกบเกณฑหรอไม และใชคาความสามารถในการตรวจวด (detection capability หรอ CC) สาหรบแสดงสมรรถนะของวธทดสอบแบบคดกรอง ซงการใชคา decision limit และ detection capabilityน ไดรวมเอาคาความไมแนนอนของการวดเขามาไวดวยแลว นบวาการใช คา decision limit หรอ CC) เปนประโยชนในการจดการความเสยงของสนคาได (risk management) และ คา detection capability หรอ CC ใชประโยชนในการกาหนดคณลกษณะเฉพาะ สาหรบการพฒนาและ/หรอคดเลอกวธทดสอบแบบคดกรอง อกทงยงกลาวถงการพสจนความใชไดตามแนวเดม (conventional validation) และตามแนวทางเลอกใหม (alternative validation) ทสามารถดาเนนการไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (single laboratory หรอ in-house validation) ซงเหมาะสมและเปนประโยชนมากกบหองปฏบตการทดสอบดานสารตกคางยาสตวในเนอเยอชนดตาง ๆ จากสตวทผลตเปนอาหาร เนองจากเทคโนโลยในการทดสอบสารตกคางยาสตว รดหนาอยางรวดเรว มการผลตเครองมอวเคราะหทกาวลาในดานประสทธภาพออกมามากมาย ดงนนเครองมอทหองปฏบตการเลอกใชจงอาจแตกตางกนไดอยางมาก ถงแมจะใชวธทดสอบในหลกการเทคนคเดยวกนกตาม และเนองจากสหภาพยโรปมการประชมจดทาขอเสนอแนะ แนวทางปฏบต ทาความเขาใจตอทงประเทศสมาชก และประเทศทสาม หรอคคา ทเกยวของ อยาง

หนา 1


ตอเนอง ทาใหมความชดเจนในทางปฏบต จงลดความขดแยงไดบาง โดยพบวาหองปฏบตการของประเทศตาง ๆ ในภมภาคอนๆ นาแนวมต 2002/657/EC นไปใชกนอยางแพรหลาย และดวยเหตผลประกอบเพมเตม คอ กฎระเบยบของสหภาพยโรปคอนขางเขมงวดมากเมอเปรยบเทยบกบของประเทศอน ๆ ดงนนหองปฏบตการงานวเคราะหสารตกคางยาสตวและฮอรโมน กลมตรวจสอบคณภาพเนอสตวและผลผลตจากสตว สานกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว จงไดเลอกใชมต 2002/657/EC นเปนแนวทางในการพสจนความใชไดของวธทดสอบสารตกคางยาสตวดวยเชนกน ดงนนจงไดจดทาคมอการพสจนความใชไดของวธทดสอบสารตกคางยาสตว ทงวธยนยนผล และวธคดกรอง ตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC เพอใหบคลากรของงานวเคราะหสารตกคางยาสตวและฮอรโมน ซงมหนาทใหบรการตรวจสอบสารตกคางยาสตวและฮอรโมนในสนคาปศสตว เพอความปลอดภยของผบรโภค ตลอดจนบคลากรหองปฏบตการภาครฐและเอกชนอน ๆ ททาหนาทเชนเดยวกน ไดนาไปใชประโยชนตอไป เนองจากเปนททราบกนดวากฎเกณฑระเบยบของยโรปคอนขางเขมงวด ดงนนหากสามารถปฏบตตามและผานกฎเกณฑของยโรปได นอกจากจะไดรบการยอมรบจากสหภาพยโรปเองแลว ยอมไดรบการยอมรบจากประเทศอนทมกฎเกณฑททดเทยมดวยเชนกน อนง เนองจากผจดทาคมอเปนภาษาไทย ดวยความมงหวงใหคมอนเปนประโยชนตอผทไมสะดวกใชคมอภาษาองกฤษเปนสาคญ แตเนองจากมศพททางเทคนคมากมาย ทบางคายงไมไดมการบญญตศพทภาษาไทยไวอยางเปนทางการ แตผอานทคนเคยและเขาใจศพททางวชาการเหลานไดดกวาคาแปลภาษาไทย ดงนนเมอผจดทาคมอภาษาไทยจงจะควบคกบคาภาษาองกฤษไวดวย อยางไรกดหากมขอผดพลาดประการใดผจดทาขอนอมรบ และกรณาแจงใหทราบเพอปรบปรง ใหคมอสมบรณและเกดประโยชนสงสด โอกาสน ผจดทาขอขอบคณ สพ.ญ. นรยา ตงศรทรพย คณภทราภา หรงศร และคณจรสศร แกวฝน ทชวยจดเตรยมตนฉบบ จนสาเรจลลวง

สตวแพทยหญง สจตตรา พงศววฒน ผจดทา

สานกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว

Email: [email protected] www.dld.go.th/bqclp

4 ตลาคม 2555

หนา 2

mailto:[email protected]

http://www.dld.go.th/bqclp


บทนา

ปจจบนหลายองคกรไดจดทาแนวปฏบตในการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ขนหลายแนวทางทเปนทยอมรบในระดบสากล เชน AOAC International, CODEX เปนตน ทหองปฏบตการสามารถเลอกใชตามความเหมาะสม สวนใหญเปนแนวปฏบตสาหรบการพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบยนยนผลเทานน ไมคอยพบวามแนวปฏบตสาหรบการพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบคดกรอง ดงนนสาหรบงานวเคราะหสารตกคางยาสตวไดเลอกปฏบตตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC ซงไดพจารณาแลวเหนวาเปนแนวปฏบตทเหมาะสมสาหรบการทดสอบสารตกคางยาสตว ทงแบบวธยนยนผลและวธคดกรอง เนองจากการทดสอบสารตกคางยาสตวนน ตองใชวธทดสอบจากหลากหลายเทคนค เชน เทคนคทางจลชววทยา เทคนคทางภมคมกนวทยา ทางฟสกสเคม ทางโครมาโตกราฟ เปนตน ตลอดจนวตถประสงคของวธทดสอบมทงแบบคดกรอง แบบการวดปรมาณคราว ๆ และแบบยนยนผลทงชนดสารและปรมาณ เปนตน วธทดสอบสารตกคางยาสตวทเปนมาตรฐาน (Official method) มอยนอยมาก และไมทนสมย ในปจจบนเทคโนโลยกาวหนาอยางรวดเรว การใชเทคนคการแยกสารดวยโครมาโตกราฟ ชนดใชของเหลวเปนตวพาผานเขาคอลมนดวยแรงดนสง และคดแยกสารอกชนหนงดวยการวดมวล/ประจ ทเรยกวา LC-MS/MS นน เปนเครองมอทมประสทธภาพในการตรวจยนยนชนดและวดปรมาณสารทตรวจพบไดถกตอง แมนยา อกทงยงมความไวสงมาก เหมาะสาหรบการตรวจสารทไมอนญาตใหใชกบสตวทเปนอาหารและไมมคาทไดรบอนญาต ไดแก คา MRL อยางไรกดวธทดสอบคดกรองกยงคงมความสาคญอยางยง ทจะนามาใชเพอชวยตรวจคดกรองตวอยางจานวนมากโดยใชเวลาไมมาก เนองจากการตรวจสารตกคางยาสตวในอาหารมความสาคญในดานการคมครองผบรโภคไมใหไดรบอนตราย และลดปญหาการโตแยงทางการคาระหวางประเทศ ในปจจบนจงมการพฒนาวธทดสอบสารตกคางขนโดยหองปฏบตการตาง ๆ ทวโลก และไดตพมพเผยแพรวธทดสอบไวในวารสารอยเสมอ ดวยเหตทวธทดสอบสารตกคางยาสตวมรายละเอยดทางเทคนค ขนตอน วธการ เครองมอทแตกตางกนไดมาก ถากาหนดเปนวธมาตรฐาน จะปฏบตตามไดยาก เนองจากตองมการศกษาเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการซงเปนอปสรรค และคาใชจายสง ดงนนจงเกดการพสจนความใชไดของวธทดสอบแนวใหม ซงพฒนาขนและดาเนนการโดยหองปฏบตการแหงเดยว หรอการรบโอนวธทดสอบมาจากหองปฏบตการตนตารบผคดคนพฒนาวธกตาม ตองดาเนนการพสจนความใชไดของวธทดสอบทงสน การประเมนสมรรถนะของวธทดสอบจงตองผานเกณฑคณลกษณะเฉพาะทกาหนดสาหรบวธทดสอบแบบตาง ๆ ทใชในหองปฏบตการแหงเดยว และบรรลวตถประสงคเพอใชงานดวย ดงนน ผจดทาจงไดรวบรวมแนวปฏบตตามมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC การพสจนความใชไดของวธทดสอบทงแบบยนยนผล และแบบคดกรอง ไวในคมอเลมน โดย แบงเปน คานยาม เพออธบายความหมายของศพทเทคนคทเกยวของใหผใชคมอมความเขาใจตรงกน การพสจนความใชไดสาหรบวธทดสอบแบบยนยนผลและแบบคดกรอง โดยมแนวปฏบตสาหรบการพสจนความใชไดแนวเดม (Conventional validation) กบแนวใหม (Alternative หรอSingle laboratory validation) การทดลองเพอศกษาคณลกษณะเฉพาะทตองดาเนนการ การประเมนสมรรถนะของวธทดสอบตามเกณฑ และวตถประสงคการใชงานของวธทดสอบ

หนา 3


สวนการพสจนความใชไดสาหรบวธทดสอบแบบคดกรอง แบงออกเปน ๒ ขนตอน คอ การพสจนความใชไดขนตอนตน (Initial validation) โดยหองปฏบตการตนตารบ (originating laboratory) และการพสจนความใชไดขนตอนเสรม (abridged validation) โดยหองปฏบตการทรบถายโอนวธทดสอบไปใชงาน (receptor laboratory) ใชเปนแนวทางการพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบคดกรอง สาหรบการตรวจสารตกคางยาสตว โดยระบเกณฑหรอเงอนไขทหองปฏบตการตองดาเนนการและบรรล ไดแก

ความตองการขนตาในการพสจนความใชไดขนตอนตน (เตมรปแบบ) โดยหองปฏบตการตนตารบตองดาเนนการใหบรรลผล เกณฑการประเมนทจาเปน เพอพจารณาวาวธทดสอบนจะสามารถถายโอนไปใชใน

หองปฏบตการอน ๆ ได ภายใตเงอนไขทกาหนด ความตองการขนตาทตองบรรลผล ในการพสจนความใชไดขนตอนเสรม โดย

หองปฏบตการรบโอนวธไปใชงาน โดยคมอนประกอบดวย ขนตอนการพสจนความใชได เพอหาคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะสาหรบวธ

ทดสอบแบบคดกรองใหมหรอวธทดสอบทพฒนาขนใหม ภายใตลกษณะเงอนไขใด ทวธทดสอบแบบคดกรองทไดรบการพฒนาขนและได

ผานการพสจนความใชไดโดยหองปฏบตการตนตารบ จะสามารถถายโอนวธไปใชในหองปฏบตการปลายทาง โดยทตองทาการพสจนความใชไดเพมเตมเทาทจาเปน เพอแสดงวาหองปฏบตการปลายทางทรบโอนวธไปใชนนนาไปใชงานไดอยางถกตอง คาแนะนาวธการควบคมคณภาพอยางตอเนองเปนงานประจา เพอเปนการทวน

สอบความใชได ความถกตอง สาหรบวธทดสอบแบบคดกรอง นอกจากน ผจดทาไดนาเสนอเกณฑทใชในการกากบดแลดานสารตกคางยาสตว เพอใหผใชไดตระหนกถงความสาคญของเกณฑตาง ๆ ของสารตกคางยาสตว เพอจะไดเขาใจและสามารถออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบ และ/หรอสามารถเลอกใชวธทดสอบใหเหมาะสมกบสารตกคางทตองการตรวจ ตลอดจนการใช excel spread sheet ในการคานวณคาคณลกษณะเฉพาะทสาคญ เพอประเมนสมรรถนะของวธทดสอบดวย ประการสาคญ คณลกษณะเฉพาะทไดจากการพสจนความใชไดตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC คอ คา/เกณฑการตดสนผลทดสอบ (Decision limit, CC) เพอใชตดสนผลทดสอบวาสอดคลองกบเกณฑหรอไม (compliant/non-compliant result) และ คา/เกณฑแสดงความสามารถในการตรวจของวธทดสอบ (Detection capability, CC) เพอแสดงสมรรถนะของวธทดสอบทระดบความเขมขนทสนใจ ซงนบเปนประโยชนอยางยง ผจดทาเหนวาการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC มความชดเจน มประโยชนมากแตยงไมแพรหลายในประเทศไทย จงเปนทมาของการจดทาคมอ ผจดทาหวงเปนอยางยงวาคมอนจะเปนประโยชนบางและเปนอกทางเลอกหนงตอบคลากรของหองปฏบตการดานสารตกคาง ทจะนาไปใชและจะสงผลใหสมรรถนะการตรวจสารตกคางยาสตวดขน จนเปนทยอมรบไดจากผใชผลทดสอบ

หนา 4


ประเมนตามเกณฑคณลกษณะเฉพาะและบรรลวตถประสงคทกาหนด

แบบยนยนผล Confirmatory

การพสจนความใชได ของวธทดสอบสอบ

แบบคดกรอง Screening

ชนดสารแบงกลมตามคามาตรฐาน

มคา MRL

ไมมคา MRL - สารหามใช - สารปลอดภย

มคา MRPL

ไมมคา MRPL

ใชคา LPL

พารามเตอรทตองดาเนนการ: CC Precision Selectivity/specificity Ruggedness/Robustness Stability Application

เชงคณภาพ Qualitative

เชงการวดปรมาณคราว ๆ Semi-quantitative

เชงการวดปรมาณ Quantitative

เทคนคทาง(จล)ชววทยา Biological methods

วธเทคนคทางชวเคม Biochemical methods

เทคนคทางฟสกสเคม Physicochemical methods

จดทารายงานผลการพสจนความใชได

การยบยงการเตบโตของเชอ

- (Zone/ no zone) - เปลยนส อมมนโนเคม - พบ/ไมพบ - สง/ตากวา คา Cut-off โครมาโตกราฟ HPLC, LC-MS/MS

การยบยงการเตบโตของเชอ - เทยบขนาด Zone กบความเขมขน อมมนโนเคม (ELISA, RIA) - หาปรมาณคราว ๆ ไดจากกราฟมาตรฐาน (ใชไดกบ ELISA ทตรวจสารเดยว) โครมาโตกราฟ HPLC, LC-MS/MS - หาปรมาณคราว ๆ เนองจากกราฟมาตรฐานไมครอบคลมปรมาณสารทตรวจพบในตวอยาง วธฟสกสเคม เชงปรมาณ แตคา

ความเทยง (precision) ไมบรรลเกณฑสาหรบวธยนยน

โครมาโตกราฟ เชนHPLC,

LC-MS/MS - สามารถยนยนชนดสาร - ปรมาณ

จาแนกดวยผลทดสอบ จาแนกดวยเทคนค

ขนตอนตน (Initial validation) โดยหองปฏบตการตนตารบ

ขนตอนเสรม (Abridged validation) โดยหองปฏบตการรบโอนวธไปใช

พารามเตอรทตองดาเนนการ: CC, CC Recovery Precision Selectivity/specificity Ruggedness/robustness Stability Application

วธคดกรอง Screening

พสจนความใชไดตามแนวทางเดม (Conventional Validation)

พสจนความใชไดตามแนวทางใหม (Alternative Validation)

แบงตามแนวทาง (Validation approach)

ผลการพสจนไมผานเกณฑ

กลบไปปรบปรงวธและทดสอบใหม

ผงสรปเนอหาการพสจนความใชไดของวธทดสอบ

หนา 5


บทท 1

คานยาม คาศพททางเทคนค ทปรากฏในคมอเลมน ผจดทาพยายามจะใชคาแปลทมใชกนอยในตารา

เลมอน ๆ กนอยางแพรหลายอยแลว แตบางคากใชคาแปลทตางกนออกไป สวนบางคาทยงไมมการแปลมากอน ผจดทาเปนผแปลและอธบายความหมายประกอบไว เพอใหผอานจะไดเขาใจความหมายไดตรงกน โดยจะกากบภาษาองกฤษไวในวงเลบควบคไปดวย นอกจากน ไดใชสญลกษณ ในการสอความหมายดวย 1.1 Abridged validation:-การพสจนความใชไดขนตอนเสรม (แบบสน) คอกระบวนการพสจนความใชได ดาเนนการโดยหองปฏบตการทรบถายโอนวธทดสอบ ซงไดทราบผลการพสจนความใชไดจากหองปฏบตการตนตารบมาแลว ดงนนกระบวนการการพสจนความใชไดแบบสนเพมเตมอกเทาทจาเปนน เปนการทวนสอบ เพอพสจนสมรรถนะของวธทดสอบวายงคงสามารถใชงานได เชอถอได และบรรลวตถประสงค 1.2 Accuracy:- คาความถกตอง

คอการแสดงความใกล (หรอความหาง) ของคาทวดได จากคาความจรง ตามนยามของปรมาณของสงทตองการวด (คาความจรง ไดจาก คาอางองของวสดอางอง หรอวสดอางองรบรอง) ประเมนไดจาก 2 องคประกอบ คอ ความแมน (Trueness) กบ ความเทยง (Precision) จงมกไดยนคาวา “ความถกตอง แมนยา” อยดวยกนเสมอ โดยคาความแมน ประเมนไดจาก คาความลาเอยง หรอ คาการกลบคน และคาความเทยงประเมนไดจากคาเบยงเบนมาตรฐาน หรอคาสมประสทธความแปรปรวน 1.3 Alpha () error:-

คาความคลาดเคลอนท อลฟา คอ โอกาสความเปนไปไดทตวอยางทมผลทดสอบสอดคลองกบเกณฑ (Compliant) แมวาไดผลทดสอบไมสอดคลองกบเกณฑกตาม (คอ ผลทดสอบไมสอดคลองกบเกณฑ เทยม)

คาความคลาดเคลอนทอลฟา คอคาความเปนไปไดทจะมผลทดสอบผดพลาดจากความจรง (คอจาก ผลลบ เปน ผลบวก) เชน กาหนดใหคาความคลาดเคลอนทอลฟา เทากบ 5 % ดงนน โอกาสทผลทดสอบ เปน “ผลบวกเทยม” ไดไมเกน 5%

ในกรณสารทไมอนญาตใหใช นน จะกาหนดคาความคลาดเคลอนทอลฟา = 1% หมายความวา ใหโอกาสผดพลาดของผลทดสอบ เปน “ผลทดสอบไมผานเกณฑ” (ซงแทจรงแลว เปน “ผลทดสอบไมสอดคลองกบเกณฑ เทยม หรอผลบวกเทยม”) เพยง 1 % เทานน

สวนกรณสารทอนญาตใหใชและมคามาตรฐานสงสดทยอมใหตกคางในอาหารได (Maximum Residue Limit, MRL) นน จะกาหนดคาความคลาดเคลอนอลฟา = 5 % หมายความวา ใหโอกาส

หนา 6


ผดพลาดของผลทดสอบ เปน “ผลทดสอบไมสอดคลองกบเกณฑ” (ซงแทจรงแลวเปน “ผลทดสอบไมสอดคลองกบเกณฑเทยม หรอผลบวกเทยม”) ไดไมเกน 5% 1.4 Analyte:- สารทสนใจ คอ สารทตองการตรวจพบ ทราบชนด และ/หรอ วดปรมาณ และรวมถงอนพนธทเกดขนระหวางการทดสอบดวย 1.5 Beta () error:-

คาความคลาดเคลอนท เบตา คอ โอกาสความเปนไปไดทตวอยางทมผลทดสอบไมสอดคลองกบเกณฑจรง ๆ แมวาไดผลทดสอบทสอดคลองกบเกณฑกตาม (คอเปน ผลทดสอบสอดคลองกบเกณฑ เทยม)

คาความคลาดเคลอนทเบตา คอ คาความเปนไปไดทผลทดสอบจะผดพลาดจากความจรง (คอจาก “ผลไมสอดคลองกบเกณฑ” เปน “ผลสอดคลองตามเกณฑ”) เชน กาหนดให คาความคลาดเคลอนทเบตา = 5 % ดงนน ใหโอกาสผดพลาดของผลทดสอบ เปน “ผลลบเทยม” ไดไมเกน 5%

ในกรณสารทไมอนญาตใหใชนน จะกาหนดคาความคลาดเคลอนทเบตา = 5% หมายความวา ใหโอกาสผดพลาดของผลทดสอบเปน “ผลทดสอบผานเกณฑเทยม หรอ ผลลบเทยม” ไดไมเกน 5 % เทานน

สวนกรณสารทอนญาตใหใชและมคามาตรฐานสงสดทยอมใหตกคางในอาหารได (Maximum Residue Limit, MRL) นน จะกาหนดคาความคลาดเคลอนเบตา = 5 % (เชนเดยวกบสารตองหาม) หมายความวา ใหโอกาสผดพลาดของผลทดสอบ เปน “ผลทดสอบสอดคลองกบเกณฑ เทยม หรอ ผลลบเทยม” ไดไมเกน 5% เชนกน 1.6 Bias:- คาความลาเอยง คอ ผลตางของคาเฉลยทไดจากการวด กบ คาอางอง คาความลาเอยงทไดจากการพสจนความใชไดของวธทดสอบโดยหองปฏบตการแหงเดยว เปนคาความลาเอยงรวม (total bias) ทเกดจาก คาความลาเอยงของวธทดสอบเอง (method bias) ซงเกดจากความคลาดเคลอนเชงระบบ (systematic error) กบคาความลาเอยงของหองปฏบตการ (laboratory bias) ดงนน เมอหองปฏบตการอน นาวธทดสอบไปใช จะไดคาความลาเอยงของวธทดสอบนน ๆ ตดมาดวย สวนคาความลาเอยงของแตละหองปฏบตการจะแตกตางกนไป ซงจะสงผลใหคาความลาเอยงรวมของแตละหองปฏบตการไมเทากน 1.7 Calibration standard:- กราฟมาตรฐาน เปน เครองมอ ในการวด การแสดงคาเชงปรมาณของสารทสนใจ โดยการเชอมโยงหรอ องเขากบคาการตอบสนองของสารมาตรฐาน 1.8 Certified reference material:- วสดอางองรบรอง หมายถง วสดอางองทม คา หรอ ความ ทสามารถสอบกลบไดเชงมาตรวทยา และไดรบการรบรองจากผผลตทนาเชอถอ

หนา 7


การซอ วสดอางอง สงทผซอตองการ คอ คา หรอ ความเขมขน ของสารทสนใจ ทไดรบการรบรอง โดยสวนมาก CRM ทางดานการทดสอบสารตกคางยาสตว จะไมคอยมผผลต ทาให CRM ราคาแพงมาก และหายาก หรอ อาจไมสามารถหา CRM ทม ชนดสาร ความเขมขนของสารทสนใจ หรอชนดเนอเยอ ตรงตามความตองการของผซอไดเลย จงเปนขอจากดของการทดสอบดานสารตกคางยาสตว 1.9 Co-chromatography:- หมายถง ขนตอนการนาสงสกดมาแบงเปนสองสวน โดยนาสารมาตรฐานเตมลงในสงสกดสวนทสอง ผสมใหเขากน นาแตละสวนไปแยกสารดวยเทคนคโครมาโตกราฟ โดยปรมาณสารมาตรฐานทเตมลงในสวนทสองนน ตองเหมอนกนกบปรมาณสารทคาดวาจะมอยในสงสกด ซงวธการน สาหรบใชปรบปรงการตรวจระบชนดสาร ของวธทดสอบทใชเทคนคโครมาโตกราฟ โดยเฉพาะเมอไมสามารถหา สาร Internal standard ทเหมาะสมมาใชได 1.10 Collaborative study:-การเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการ หมายถง การทดสอบตวอยางเดยวกน โดยวธทดสอบเดยวกน เพอหาคาคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ โดยวธการนครอบคลมความคลาดเคลอนของการวดแบบสม และความลาเอยงของหองปฏบตการ 1.11 Confirmatory method:- วธทดสอบแบบยนยนผล หมายถง วธทดสอบ ทใหขอมลทสมบรณ สามารถตรวจและระบชอชนดสารไดถกตอง ไมกากวม และถาจาเปน สามารถวดปรมาณของสาร ในระดบความเขมขนทสนใจได 1.12 Critical concentration หรอ CC:- ความเขมขนทเปนจดสาคญ หมายถง ความเขมขนทเปนจดสาคญ หรอ เปนเกณฑ ในการแปลผลทดสอบ (CCα) หรอ ความเขมขนทใชเปนเกณฑ แสดงความสามารถในการตรวจของวธทดสอบ (CC) 1.13 Cut-Off level:-คอ คาหรอระดบความเขมขนทพบ “การตอบสนอง หรอ สญญาณ” ทวธทดสอบแบบคดกรอง สามารถระบไดวาในตวอยางนนมสารตกคาง เทากบ หรอ มากกวา “คาความเขมขนเปาหมาย” ในการคดกรอง ถาผลทดสอบสงเกนคา Cut-Off ตองดาเนนการทดสอบตอไปดวยวธทดสอบแบบยนยนผล ในขบวนการพสจนความใชไดขนตอนตน (initial validation) คา Cut-Off กาหนดไดจากการทดสอบตวอยางปลอดสาร (matrix blank) และตวอยางทเตมสารทสนใจในตวอยางปลอดสาร (spiked matrix) แลวทาการทดสอบหลาย ๆ ซา ณ ระดบความเขมขนเปาหมายในการคดกรอง 1.14 Decision limit:-เกณฑการตดสน (ผลทดสอบ) หรอ CCα

คอ คาความเขมขนทใชเปนเกณฑ ตดสนผลทดสอบ เมอพบสารตกคางทมความเขมขน เทากบ หรอ สงกวาคา CCα ใหสรปไดวา ทโอกาสความคลาดเคลอนทคาอลฟา ผลทดสอบตวอยางน เปน ผลทดสอบไมสอดคลองกบ เกณฑ

หนา 8


เชน ท α = 1 % หมายความวา ตวอยางทสอดคลองกบเกณฑ เมอผานการทดสอบ 100 ครง ณ ความเขมขน CCα ใหโอกาสผดพลาด 1 % ท ผลทดสอบจะเปน ผลไมสอดคลองกบเกณฑ เทยม 1 ครง และ 99 ครง จะไดผลทดสอบทถกตอง 1.15 Detection capability:- คาความสามารถในการตรวจ (ของวธทดสอบ) หรอ CC หมายถง ปรมาณสารทนอยทสดในตวอยาง ทจะถกตรวจพบได ระบชอชนดสารและวดปรมาณได ดวยโอกาสความคลาดเคลอนทคาเบตา กรณทสารไมมคาทไดรบอนญาต (MRL) คาแสดงความสามารถในการตรวจ CC หมายถง คาความเขมขนตาสด ทวธทดสอบสามารถ ตรวจพบสาร จากตวอยางทมสารตกคางอยจรง ได ทความเชอมนทางสถต เทากบ 1 - สวนกรณทสารมคาทไดรบอนญาต (MRL) คาแสดงความสามารถในการตรวจ CC หมายถง ทคาความเขมขน CC น วธทดสอบจะสามารถตรวจสาร ทคา MRL ไดทความเชอมนทางสถต เทากบ 1 - 1.16 Fortified sample material หรอ Spiked sample:- ตวอยาง/ชนดเนอเยอทถกเตม

สารทสนใจ หมายถง ตวอยางทมการเตมสารทสนใจ และทราบปรมาณความเขมขนในตวอยาง ในคมอบางครงจะใชคาสน ๆ วา “ตวอยางเตมสาร” 1.17 Initial validation:-การพสจนความใชไดขนตอนตน (โดยหองปฏบตการตนตารบ ผ

คดคนพฒนาวธทดสอบคดกรอง) คอกระบวนการพสจนความใชได เพอทดสอบสมรรถนะของวธทดสอบแบบคดกรอง ทพฒนาขนใหมในหองปฏบตการตนตารบและผลการพสจนความใชไดบรรลตามวตถประสงคทกาหนด 1.18 Intra-Laboratory Performance Level (LPL):-ระดบความเขมขนตาสดของสารท

หองปฏบตการวดได คาความเขมขนตาสดทวธทดสอบสามารถวดไดนเปนการแสดงความไวหรอขดความสามารถของวธทดสอบของหองปฏบตการนน นาไปใชแทนคา Minimum Required Performance Limit (MRPL) เพอออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบ 1.19 Interlaboratory study (comparison):- การศกษาสมรรถนะของวธทดสอบและเปรยบเทยบผลทดสอบจากการทดสอบตวอยางเดยวกน โดยหองปฏบตการ 2 แหงหรอมากกวาขนไป ตามเงอนไขทกาหนด และวธการเปรยบเทยบผลทดสอบระหวางหองปฏบตการน โดยการกาหนดวตถประสงค อาจจาแนกไดเปน การเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการ (Collaborative study) หรอการทดสอบความชานาญของหองปฏบตการ (proficiency study)

หนา 9


1.20 Internal standard (IS):- คอสารทไมไดมอยในตวอยางทดสอบ แตมคณสมบตทางฟสกสเคมคลายคลงมากทสดกบ

สารทสนใจ ซงเปนสารทตองการทดสอบยนยนชนด โดยทาการเตมสาร Internal standard (IS) ลงไปในแตละตวอยาง และเตม IS เชนเดยวกนนลงในหลอดสารมาตรฐานทจะเตรยมกราฟทกหลอด 1.21 Laboratory sample:-ตวอยางทเกบสงใหหองปฏบตการเพอทดสอบ 1.22 Level of interest:- ระดบความเขมขน (ของสารตกคาง) ทสนใจ/ทสาคญ คอ ระดบความเขมขนของสารในตวอยาง ทสาคญในการพจารณาการสอดคลองกบเกณฑ หรอคามาตรฐาน ทใชบงคบทางกฎหมาย (Compliance with legislation) ระดบความเขมขนทสนใจ คอ ระดบคาทใชในการกากบดแล (MRL, MRPL) หรอ คาทกาหนดเพอดาเนนการ (Action limit) 1.23 Minimum required performance limit (MRPL):-

ขดความสามารถขนตา(ระดบความเขมขนของสาร) ทตองตรวจได หมายถง คาระดบความเขมขนของสารทสนใจขนตาในตวอยางทวธทดสอบจะตองตรวจพบและยนยนชนดได การกาหนดคาขดความสามารถขนตาขนน โดยสหภาพยโรปมจดประสงคเพอเปนบรรทด

ฐานหรอแนวปฏบตสาหรบหองปฏบตการของประเทศสมาชก ใหเลอกใชวธทดสอบทมประสทธภาพดพอ (ความไว) หรอมขดความสามารถทจะตรวจพบและยนยนสารในการตรวจสารชนดทยงไมมการกาหนดคาความเขมขนทไดรบอนญาต (เชนคา Maximum residue limit, MRL) คา MRPL เปนอกษรยอของ Minimum Required Performance Limit เทานน ไมใช

อกษรยอของ minimum required performance level ซงเปนระดบความเขมขนตาสดของหองปฏบตการทใชออกแบบการพสจนความใชได ดงนนเพอหลกเลยงความสบสน จงใชคาวา intra-laboratory performance level/limit หรอ LPL แทน 1.24 Monitoring Plan:-แผนการตรวจตดตามสารตกคาง คอการออกแบบการสม การเกบตวอยาง จานวนตวอยาง ชวงเวลาในการเกบ แหลงทเกบ เชน จากฟารม จากโรงงานผลต เปนตน เพอนาตวอยางมาทดสอบหาขอมลการตกคางของชนดสารตามแผนทวางไว ทาการประเมนผล ตามระยะเวลาความเรงดวนและดาเนนตามมาตรการทกาหนด เมอตรวจพบสาร และ/หรอประเมนสรปรายงานเมอสนสดแผน และนาผล ปญหา อปสรรค มาออกแบบและวางแผนใหม เพอแกไขปญหาทพบ ใหไดผลลลวง 1.25 National Residues Control Plan (NRCP):-แผนการตรวจตดตามสารตกคางแหงชาตประจาป โดยหนวยงานทมอานาจในการกากบดแล การออกแบบแผนการตรวจตดตาม (monitoring plan) การวางแผนรายป โดยการนาขอมลผลทดสอบ ตลอดจนปญหา อปสรรค ทไดทราบจากแผนปทสนสดไป นามาวางแผนของปใหม เพอแกไขปญหาสารตกคางในสนคาทตรวจพบ ปรบเปลยนตรวจตดตามชนดสาร จากขอมลขาวสารการใชยาในอตสาหกรรมการเลยงสตว หรอการลกลอบใช ให

หนา 10


เหมาะสมกบสถานการณ ทงนเพอเปนการแกไข และปองกนการเกดสารตกคางซงเปนอนตรายตอผบรโภค เปนการคมครองผบรโภค 1.26 Negative Control (Blank matrix) Samples:- ตวอยางควบคมผลลบ ตวอยางควบคมผลลบ คอ ตวอยาง (ชนดเนอเยอ) ทไดจากสตว ททราบประวตการเลยงหรอเจาะจงเลยงสตวโดยไมใหมการรบสมผสกบสารทตองการทดสอบ จงจะไมมการตกคางของสารทตองการทดสอบนน ๆ สาหรบใชในวตถประสงคนเปนการเฉพาะ ซงในทางปฏบตจาเปนตองมความพรอมดานการเลยงสตว จงจะไดเนอเยอทไมมสารตกคางตามตองการ แตถาไมสามารถทาได กสามารถใชตวอยางทไดผานการตรวจยนยนผลดวยเทคนคทางฟสกสเคมทมความไวเหมาะสมและไมพบสารทสนใจ แทนได

ตวอยางทไมมสารตกคาง (ทสนใจ) ในคมอนจะเรยกวา “ตวอยาง/เนอเยอ ปลอดสาร” 1.27 Performance characteristic:- คณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะ (ของวธทดสอบ) คาคณภาพ/คณลกษณะ ทใชแสดงการทาหนาทของวธทดสอบ เชน คาความจาเพาะ ความถกตอง ความแมน ความเทยง การทวนซาได การทาซาได การกลบคน คาแสดงความสามารถในการตรวจ (CC) และความทนทานของวธทดสอบ 1.28 Performance criteria:- เกณฑประเมนสมรรถนะ (ของวธทดสอบ) หมายถง ขอกาหนด หรอ เกณฑ สาหรบประเมนคณลกษณะเฉพาะของวธทดสอบ เพอใชตดสนวธทดสอบวามสมรรถนะบรรลตามวตถประสงคทกาหนดไว และใหผลทดสอบทเชอถอได 1.29 Permitted limit:-เกณฑ/คา (ระดบความเขมขน) ทไดรบอนญาต

หมายถง เกณฑ/คา (ระดบความเขมขน) ของสารตกคางสงสดทใหมได (Maximum Residue Limit, MRL) หรอ เกณฑคาสารปนเปอนสงสดทใหมได (Maximum Level, ML) หรอ เกณฑคากาหนดสงสดทยอมใหมได (maximum tolerance) ซงเกณฑคามาตรฐานเหลานถกกาหนดขนในประชาคมใด ใด กตาม โดยหนวยงานกากบดแล เพอบงคบใชในทางกฎหมาย สาหรบสารตกคางยาสตว และสารกาจดศตรพช คาความเขมขนทไดรบอนญาต คอ คา

MRL สวนสารปนเปอน คาความเขมขนทไดรบอนญาต คอ คา ML 1.30 Precision:- ความเทยง

คาความใกลของผลทดสอบของแตละตวอยางทผานการทดสอบภายใตสภาวะทกาหนดขน คาความเทยง ประเมนไดจากความไมแมนยา คานวณไดจากคาเบยงเบนมาตรฐานของผลทดสอบ ถาคาเบยงเบนมาตรฐานใหญ หมายความวา คาความเทยงนอย 1.31 Proficiency study:- การทดสอบความชานาญ การเปรยบเทยบผลทดสอบ แสดงความชานาญของหองปฏบตการ โดยการทดสอบตวอยางเดยวกน โดยหองปฏบตการสามารถเลอกใชวธทดสอบเองได (สวนใหญเปนวธทใชอยในงานประจา)

หนา 11


โดยการดาเนนการทดสอบความชานาญน ตองปฏบตตามขอกาหนด ISO/IEC 17043 ซงจะสามารถใชขอมลทไดจากการทดสอบความชานาญน ประเมนคาการทาซาไดของวธทดสอบ 1.32 Qualitative method:-วธทดสอบเชงคณภาพ ไดแกวธทดสอบ ทระบชนดสาร/กลมสาร ดวยคณสมบตทาง เคม ชวะ และ ฟสกส 1.33 Quantitative method:- วธทดสอบเชงการวดปรมาณ ไดแกวธทดสอบ ทวดปรมาณ หรอ นาหนกมวล ของสาร และ แสดงคาเปนตวเลขของหนวยทเหมาะสม 1.34 Reagent blank determination:-การทดสอบสารเคมทใชในวธทดสอบ คอการทดสอบ ทกขนตอน โดยไมมตวอยางทดสอบเกยวของ หรอ โดยการใชสารเคมทเหมาะสมในปรมาณทเทากบตวอยางทดสอบเพอแทนทสวนทเปนตวอยางทดสอบ 1.35 Recovery:- การกลบคน

ในการพสจนความใชได กรณทไมสามารถหา วสดอางองรบรอง (Certified Reference Material, CRM) มาใชได การหา คาการกลบคน สามารถใชแทนการหาคาความแมนได โดยการเตมสารลงในตวอยาง ทาการสกดและทดสอบตามขนตอน หาคานาหนกของสารทไดกลบคนมาในสงสกดทไดจากขนตอนสดทาย โดยเปรยบเทยบสารทไดกลบคน (yield) กบสารทเตมลงไป (added) หนวยเปนรอยละ เรยกวา คารอยละการกลบคน ซงอนมานวาจากการสกดสารทไดคน กบสารทเตมลงไป ควรมคาเทากน จงเปนทมาของคาศพททใชคาวา “คาการกลบคน” แตถามการใช กราฟมาตรฐานทเตรยมโดยใชเนอเยอ (matrix calibration curve) หรอ

การใช internal standard คาการกลบคน จะเปน “คาการกลบคนทแกคาเรยบรอยแลว” (corrected recovery) เนองจากการใชกราฟมาตรฐาน ทเตรยมในเนอเยอ และ/หรอ การใช internal standard นนเปนการชดเชยดวยการใชชนดเนอเยอเหมอนกน หรอการใช internal standard จะเปนการคานวณชดเชยคาการกลบคนของแตละตวอยาง ซงการใชทงสองอยางน จะไดผลทดสอบทเปนผลลพธเสรจเรยบรอยและคาทไดถกตองแมนยามาก โดยไมตองนาคารอยละการกลบคนมาคานวณแกคาอก

การแกคา หรอการชดเชยคาดวยคาการกลบคน Corrected recovery คอคาความเขมขนทแกดวยคาการกลบคน ในกรณทใช internal standard และ/หรอ matrix curve (การสรางกราฟโดยการเตมสารทสนใจในสงสงตรวจชนดนน ๆ เชน ปสสาวะ เนอ ตบ เปนตน) 1.36 Reference material;- วสดอางอง หมายถง วสด ทมคณสมบต หนง หรอ หลายคา ทไดรบการตรวจยนยนคา โดยวธทดสอบทผานการพสจนการใชได ดงนนคาของคณสมบต ดงกลาวน สามารถนาไปใชสอบเทยบเครองมอ หรอทวนสอบการวดของวธทดสอบได

หนา 12


1.37 Regulatory/Action limit:-เกณฑในการกากบดแล/เกณฑเพอดาเนนการ เกณฑ (ใชคาความเขมขน) ทกาหนดขนจากการประเมนความเสยง เพอใชในการกากบดแล หรอ ดาเนนการ ใหอาหารปลอดภยเพอคมครองผบรโภคไมใหไดรบอนตราย สาหรบงานดานสารตกคางยาสตว เกณฑในการกากบดแล ไดแกคาความเขมขนสงสดทอนญาตใหตกคางในอาหาร (Maximum Residue Limit, MRL) คาระดบสงสดของสารปนเปอนในอาหาร (Maximum Level, ML) เปนตน มหนวยเปน มลลกรม/กโลกรม (หนงสวนในลานสวน) หรอ ไมโครกรม/กโลกรม (หนงสวนในพนลานสวน) ซงแตละประเทศจะมกฎระเบยบเกยวกบ เกณฑในการกากบดแลดานความปลอดภยของอาหาร เพอปองกนไมใหผบรโภคไดรบอนตราย กฎระเบยบใชในระดบสากล ทกาหนดโดย Codex Alimentarius Commission กฎระเบยบระดบประเทศ เชนของประเทศไทย สหภาพยโรป สหรฐ ญปน ออสเตรเลย นวซแลนด ฮองกง ฯลฯ สหภาพยโรป ไดออกกฎระเบยบใหม (EC) No 470/2009 และ (EU) No 37/2010 แทน (EEC) No 2377/90 ซงถกยกเลกไปแลว โดยกาหนดคาปรมาณสารตกคางสงสดทมไดในอาหารทไดจากสตว (Maximum Residue Limit, MRL) สาหรบยาสตวชนดทอนญาตใหใชกบสตวเพอบรโภคได นอกจากน ยงกาหนดเกณฑ “ขดความสามารถขนตา (คอความไวของวธทดสอบทตองสามารถตรวจสารตองหามได ตามความเขมขนทกาหนด)” (Minimum Required Performance Limit, MRPL) และใชเปน “คาอางองเพอการดาเนนการ” (Reference Point for Action, RPA) เพอการกากบดแล สาหรบกรณสารทไมอนญาตใหใชกบสตว โดยกาหนดไวในมาตรา 4 ของ มตคณะกรรมาธการยโรป EC 2002/657/EC ในมาตรา 2 ของมตคณะกรรมาธการยโรป 2005/34/EC และมาตรา 18/19 ของ กฎระเบยบ (EEC) No 470/2009 1.38 Repeatability:- คาการทวนซาไดของการวด (Sr or SDR)

คอ เปนการตรวจความสามารถในการวดตวอยางเดยวกน หรอ เหมอนกนซาหลาย ๆ ครง เพอแสดงคาความเทยงของการวด (precision) ภายใตเงอนไขของการทวนซา ซงเปนระดบแคบ 1.39 Repeatability conditions:- เงอนไขการทวนซาได

คอ เงอนไขหรอสภาวะทกาหนดระดบแคบในการทดสอบ ไดแก เงอนไขทเหมอน ๆ กน เชน วธทดสอบเดยวกน ตวอยางชนดเดยวกน ในหองปฏบตการเดยวกน โดยนกวเคราะหคนเดยวกน ดวยเครองมอเหมอนกน ในชวงระยะเวลาสน ๆ เปนตน 1.40 Reproducibility:-คาการทาซาไดของการวด คอ เปนการตรวจความสามารถในการวดตวอยางเดยวกน หรอ เหมอนกนซาหลาย ๆ ครง ภายใตเงอนไขการทาซาไดของการวด เพอแสดงคาความเทยงของการวด ภายใตเงอนไขของการทาซาได ซงเปนระดบกวาง

หนา 13


1.41 Reproducibility conditions:- เงอนไขการทาซาได คอ เงอนไขหรอสภาวะทกาหนดระดบกวางใหทาการทดสอบ ไดแกเงอนไขดงน คอ ตวอยางทดสอบทเหมอนกน ใชวธทดสอบเดยวกน หรอ ตางกน แตสภาวะการวเคราะหตางกน ไดแก การเปลยนตวผวเคราะห ใชเครองมอทตางกน สถานทตางกน 1.42 Ruggedness:-ความทนทาน (ของวธทดสอบ):

การถกกระทบกระเทอน/ความออนไหว ของวธทดสอบ เมอเงอนไข หรอสภาวะขนตอนการทดสอบถกเปลยนแปลงไปเพยงเลกนอย เชน ชนดตวอยางทดสอบ ชนดสารททดสอบ สภาวะการเกบรกษา สงแวดลอม และ/หรอ เงอนไขการเตรยมตวอยาง ภายใตเงอนไขการทดสอบตามทกาหนดใหเปลยนแปลงไปเลกนอยจากขนตอนมาตรฐานของวธทดสอบ (SOP) ในทางปฏบต จะทาใหเกดการกระเพอม เชน ความเสถยรของสาร reagent สวนประกอบของตวอยาง คาความเปนกรด-ดาง (pH) และอณหภม เปนตน โดยการออกแบบการทดลองทกาหนดใหทดสอบภายใตตวแปรครงละปจจย และผลการศกษาสามารถทราบไดวาปจจยใดทมอทธพลตอผลการทดสอบ ตองระบตวแปรนนและหองปฏบตการควบคมตวแปรทมผลกระทบ หากตองการทดสอบผลกระทบจากหลายตวแปรในคราวเดยว ผลกระทบจะเกดจากหลายปจจยรวม ๆ กน ซงจะไมสามารถแยกไดวาเกดจากปจจยใด ดงนนหองปฏบตการควรออกแบบการทดลองใหเหมาะสม 1.43 Sample blank determination:- คอการทดสอบตวอยางทไมมสารทสนใจ/สารทตองการตรวจ หรอ “ตวอยางปลอดสาร” 1.44 Screening method:- วธทดสอบแบบคดกรอง คอ วธทดสอบทใชตรวจพบสาร หรอกลมสาร ไดทระดบความเขมขนทสนใจ วธทดสอบเชนนตองสามารถตรวจจานวนตวอยางไดคราวละมาก ๆ วธทดสอบคดกรองทพฒนาไดด ควรมประสทธภาพในการตรวจคดกรองตวอยางทผลทดสอบมแนวโนมไมสอดคลองกบเกณฑ (non-compliant result) ไดมาก และใหผลทดสอบสอดคลองเกณฑ เทยม (false compliant results) ไดนอย (โอกาสพลาด -error ตองไมเกน 5 %) ระดบความเขมขนทสนใจ คอ ระดบคา/เกณฑทใชในการกากบดแล (MRL, MRPL) หรอ คา/เกณฑทกาหนดเพอดาเนนการ (Action limit) 1.45 “Screen Positive Control” Samples:- ตวอยางควบคมผลบวก ไดแก

ตวอยางปลอดสาร (negative control sample) ทเตมสารทตองการทดสอบ ณ ระดบความเขมขนเปาหมายในการคดกรอง (Spiked sample)

ตวอยางจากสตวทไดรบสารทสนใจและมการตกคางอยในเนอเยอ หรอ ในสารเหลวของรางกาย (incurred-positive samples) ไดแก ตวอยางทไดจากสตวทไดรบสมผสกบสาร/ยาสตวทตองการทดสอบ

วสดอางองรบรอง (CRM) ซงเมอทดสอบตวอยางควบคมผลบวก (Screen positive control) และใหผลทดสอบเปน ผลบวก (screen positive) แสดงวาวธทดสอบทางานไดถกตอง

หนา 14


1.46 Screening Target Concentration:- คาเปาหมายในการคดกรอง ผทาการพสจนความใชได ตองการศกษาประสทธภาพหรอสมรรถนะของวธทดสอบ โดยตงเปาหมายเปนคาความเขมขนของสารตกคางในตวอยางทตองการคดกรอง ตอไปนจะเรยกวา “คาเปาหมายในการคดกรอง” การตงเปาหมายเปนโจทยแลวทาการพสจนวา ทความเขมขนเปาหมายทกาหนดขน วธทดสอบนจะสามารถคดกรอง แยกตวอยางทมสารตกคาง ออกจากตวอยางทไมมสารตกคาง ไดหรอไม และบรรลวตถประสงคทตงไวหรอไม ในดานการตรวจสารตกคางยาสตว ตองการวธทดสอบคดกรองสารตกคางทมประสทธภาพ อยางนอยทสดควรสามารถตรวจสารตกคางไดท ความเขมขน ไมเกนเกณฑกากบดแล เชน คา Maximum residue limit นนคอตองมความร และทราบคา MRL ของสารทสนใจในเนอเยอ ทถกตองและเปนปจจบน เพอใชองและตงคาเปาหมายใหสอดคลองกบคาในการกากบดแล “MRL” ของสารทตองการตรวจดวย เพอเลอกใชวธทดสอบทเหมาะสม คอคาความเขมขนเปาหมาย ทวธทดสอบสามารถคดแยกตวอยางไดวา “ตรวจพบสาร” (มแนวโนม หรอ เขาขาย ไมสอดคลองตามเกณฑ (non-compliant) และเมอ “ตรวจพบ” ตองสงตรวจเพอยนยนผลตอไป การตง คาความเขมขนเปาหมาย แบงออก เปน 3 กรณ กรณท 1. สารทอนญาตใหใช:- คาความเขมขนเปาหมายสาหรบการคดกรอง ควร เทากบ หรอ ตากวา คาในการกากบดแล (MRL) ซงหากเปนไปได คาเปาหมาย ควร เทากบ ½ MRL กรณท 2. สารตองหาม หรอ สารทไมไดรบอนญาตใหใช:- คาเปาหมายสาหรบการคดกรอง ตองเทากบ หรอ ตากวา MRPL หรอ RPA กรณท 3. สารทยงไมมการกาหนดคา MRL ตามกฎระเบยบ (EC) No 470/2009 คาเปาหมายสาหรบการคดกรอง หากเปนไปไดควร ตากวา คาความเขมขน ทเสนอแนะโดยหองปฎบตการอางองของสหภาพยโรป” (CRL Guidance Paper) ฉบบลงวนท 7 ธนวาคม ค.ศ. 2007 ใน เอกสารเวยนเรอง “CRL’s view on state of the art analytical methods for national residue control plans” ซงมการแนะนาคาความเขมขนของสารตาง ๆ (recommended concentration) สาหรบคดเลอกหรอพฒนาวธทดสอบใหมความไวเพยงพอ เหมาะสม และเพอเปนแนวปฏบตสาหรบประเทศสมาชกของสหภาพยโรป (ดบทท 4) คาเปาหมายสาหรบการคดกรอง ยงตามาก โอกาสทจะเกด ผลลบเทยม ในตวอยางทมสารตกคาง ณ คาความเขมขนในการกากบดแล กจะยงลดลง 1.47 Single laboratory study (in-house validation):- การพสจนความใชได (ของวธทดสอบ) โดยหองปฏบตการแหงเดยว หมายถง การศกษาสมรรถนะของวธทดสอบโดยหองปฏบตการแหงเดยว โดยใชวธทดสอบเดยว ในการทดสอบตวอยางทดสอบ ทเหมอน หรอ ตางกน ภายใตเงอนไขตาง ๆ ทกาหนด ในชวงระยะเวลาทไมสนจนเกนไป

หนา 15


1.48 Specificity/selectivity:- ความจาเพาะ/ความสามารถในการแยกสาร หมายถง ความสามารถของวธทดสอบในการแยกสารทตองการตรวจวด ออกจากสารอน ๆ ได คณลกษณะเฉพาะนเปนความสามารถสาคญของเทคนคการวดของวธทดสอบซงแปรผนไดตามชนดของกลมสาร หรอ ชนดเนอเยอของตวอยาง 1.49 Spiked sample:- ตวอยางเตมสาร ดคาวา fortified sample 1.50 Standard addition:-การเตมสารเพมลงในตวอยางทมสารชนดเดยวกนนนอยกอนแลว หมายถง ขนตอน การเตมสารมาตรฐานทสนใจ ลงในสวนตวอยางใชทดสอบ ซงแบงออกเปนหลาย ๆ สวน สวนทหนงไมมการเตมสาร สวนอน ๆ เตมสารมาตรฐาน กอนเรมการทดสอบ โดยปรมาณสารทเตม ควรอยในชวง 2 ถง 5 เทา ของปรมาณสารทคาดวามอยในตวอยาง เปนวธหาปรมาณสารในตวอยาง เพอนาไปหาคาการกลบคนของวธทดสอบ 1.51 Standard analyte:- สารมาตรฐาน ทสนใจ หมายถง สารมาตรฐานท ทราบคณสมบต และมการรบรองปรมาณสาร ความบรสทธ ทจะนาไปใชเพออางองในการทดสอบได 1.52 Standard Operating Procedure (SOP) for the method:- ขนตอนปฏบตงานมาตรฐานสาหรบวธทดสอบ ควรจดทาเปนเอกสารเพอเปนมาตรฐาน “SOP” สาหรบใชในหองปฏบตการ หรอ อยางนอยควรม ฉบบราง ไวใหเรยบรอย กรณวธทดสอบแบบคดกรอง กอนดาเนนการพสจนความใชไดขนตอนตน (โดยหองปฏบตการตนตารบ) หรอ ขนปลาย (โดยหองปฏบตการรบโอนวธคดกรอง) โดยตองครอบคลมตามขอกาหนด ISO 17025:2005 ขอ 5.4.4 สาหรบวธทไมเปนมาตรฐาน ระหวางการพฒนาวธทดสอบ ตองหาขอบเขตของวธ คอ ชนดสารทตองการตรวจ ชนดเนอเยอทสามารถตรวจได และปรบแตงพารามเตอรทเกยวของในวธทดสอบทงหมด ตลอดจน ตองระบและควบคมจดวกฤต (เชน อณหภม pH) ดวย หองปฏบตการทรบถายโอนวธทดสอบ กจะตองม SOP ทคลองจองกบ SOP จากหองปฏบตการตนตารบ ซงหากวธทดสอบเปนเทคนคทางฟสกสเคม และใชเครองมอวเคราะหหลก (เชน ยหอ รน กลไกการทางาน) แตกตางจากทหองปฏบตการตนตารบใช จะสงผลกระทบตอสมรรถนะของวธทดสอบไดอยางมาก ดงนนนกวเคราะหของหองปฏบตการรบถายโอนวธทดสอบ จงสามารถดดแปลง ปรบแตง สภาวะ เงอนไข ไดโดยอสระ แตยงตองคงไวซงสมรรถนะของวธทดสอบใหไดตามเกณฑเพอบรรลวตถประสงคของการพสจนความใชไดทกาหนดไว 1.53 Substance:- สาร หมายถง สะสาร หรอ สงทมโครงสรางหรอองคประกอบทางเคม รวมถงอนพนธของสารดวย

หนา 16


1.54 Test portion:-สวนของตวอยาง สาหรบใชในการทดสอบ หมายถง ปรมาณสวนหนงของตวอยาง ตามท SOP กาหนดใหใชในขนตอนการทดสอบ 1.55 Test matrix: - ชนดตวอยาง เพอทดสอบ อาจเปน เนอเยอ หรอ สารเหลว จากรางกายสตว สาหรบนาไปทดสอบ เชน ตบ ไต กลามเนอ ปสสาวะ นานม นาผง นมผง เปนตน ซงชนดตวอยางนตองระบใหชดเจนไวใน หวขอขอบเขต (scope) ของ ขนตอนปฏบตงานสาหรบวธทดสอบแบบคดกรอง (SOP) ยกตวอยาง เชน ชนดตวอยาง ระบวา “เนอโค” หมายถง วธทดสอบใชทดสอบเนอโคไดเทานน แตถาระบวา “เนอ”หมายถง วธทดสอบสามารถใชทดสอบ เนอสตว ของสตวชนดใดกได โดยผลทดสอบไมแตกตาง (หรออาจแตกตางบาง แตไมมนยสาคญทางสถต) ซงชนดสตวทงหลายทวธทดสอบสามารถตรวจไดควรระบไวในขอบเขตของ SOP ใหชดเจนดวย 1.56 Test sample: - ตวอยางทดสอบ หมายถง ตวอยางทเตรยมมาจากตวอยางทสงเขาหองปฏบตการ และเพอจะแบงไปเตรยมเปนปรมาณสวนหนงของตวอยาง (Test portion) ใชในการทดสอบ 1.57 Trueness:-ความแมน

ความใกลกบคาจรง (คอจากคาอางอง) หาไดจากคาความลาเอยง (bias) ระหวางคาเฉลยทไดจากการวดผลทดสอบของตวอยางชดใหญเทยบกบคาอางอง 1.58 Units:- หนวย ของการวด ตามทอธบายใน ISO 31 และ Directive 71/354/EC 1.59 Validation:- การพสจนความใชไดของวธทดสอบ คอการทดสอบเพอยนยน และ แสดงหลกฐานประกอบวา วธทดสอบ มสมรรถนะผานเกณฑ สามารถใชทดสอบและบรรลวตถประสงคการใชงานตามทกาหนด 1.60 With-in laboratory reproducibility:-คาการทาซาไดของการวดโดยหองปฏบตการแหงเดยว

เปนการตรวจความสามารถในการวดตวอยางเดยวกน หรอ เหมอนกนซาหลาย ๆ ครง ภายใตเงอนไขการทาซาไดของการวด เพอแสดงคาความเทยงของการวดโดยหองปฏบตการแหงเดยว ภายใตเงอนไขของการทาซาได ซงเปนระดบกลาง 1.61 With-in laboratory reproducibility condition:-เงอนไขการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว

คอเงอนไขหรอสภาวะทกาหนดระดบกลางใหทาการทดสอบ โดยหองปฏบตการแหงเดยว (Single laboratory) ไดแกเงอนไขดงน คอ ตวอยางทดสอบทเหมอนกน ใชวธทดสอบเดยวกน (เชน in-house method) ผวเคราะหคนเดม หรอ เปลยนคนทมทกษะตางกน เครองมอตางชดกน ในชวงเวลาทดสอบทไมสนนก และเงอนไขอน ๆ ทอาจจะเปลยนแปลงได

หนา 17


1.62 Zero tolerance: - การยอมรบไดเปนศนย หมายความวา ตองไมมการตกคางของสารอนตรายทไมอนญาตใหใชในสตวเพอบรโภค หรอ ระดบความเขมขนของสารตกคางของสารตองหามดงกลาว เทากบ ศนย คอ ไมสามารถยอมรบไดไมวาจะมความเขมขนเพยงนอยนดทสด (Ultra trace level) กตาม

สญลกษณ หมายถง ขอจากด หรอ อปสรรค หมายถง แนวทางเลอก หรอทางออก สาหรบกรณทมปญหา ขอจากด หรอ อปสรรค หมายถง สาระสาคญ ทตองการเนนใหทราบ หมายถง ขอแนะนา หรอ คาอธบายเพม หมายถง ขอควรระวง

หนา 18


บทท 2

การพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบยนยนผล การพสจนความใชไดของวธทดสอบ สามารถตรวจสอบสมรรถนะของวธทดสอบไดจากคณลกษณะเฉพาะ (Performance characteristic) วามประสทธภาพทางานตามวตถประสงคไดหรอไม 2.1 การจาแนกชนดของวธทดสอบ จาแนกตามวตถประสงค ไดแก วธทดสอบเพอคดกรอง เพอยนยนผล (ระบชนดสาร และ/หรอ วดปรมาณ) จาแนกตามการวดผลทดสอบ ไดแก การวดเชงคณภาพ (Qualitative method) การวดเชงปรมาณคราว ๆ (Semi-quantitative method) การวดเชงปรมาณ (Quantitative method) ดงนน วธทดสอบเพอรองรบวตถประสงคทแตกตางกน จาเปนตองหาคณลกษณะเฉพาะเพอแสดงสมรรถนะของวธทดสอบแตกตางกนดงน

ตาราง.1. การจาแนกวธทดสอบ และคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะของวธทดสอบทจาเปนตองดาเนนการ () และ ไมจาเปนตองดาเนนการ () คอ

CC CC

วธทดสอบ (Test method) ความสามารถในการตรวจ

เกณฑการตดสน

ความแมน/คาการกลบคน Trueness/

Recovery

ความเทยง Precision

ความสามารถในการแยก/ความจาเพาะ Selectivity/

การใชงาน/ความทนทาน/ความเสถยร Applicability/

Specificity Ruggedness/

Stability

คดกรอง(Screening)

เชงคณภาพ(Qualitative) ยนยนผล

(Confirmatory)

คดกรอง(Screening)

เชงปรมาณ(Quantitative) ยนยนผล

(confirmatory)

หนา 19


2.2 แนวทางการพสจนความใชได และคณลกษณะแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ การพสจนความใชไดของวธทดสอบ สามารถดาเนนการไดหลายแนวทาง เพอแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ โดยการประเมนผลทดสอบของแตละคณลกษณะ (พารามเตอร) ตามเกณฑการประเมนสมรรถนะของวธทดสอบนน ๆ ไดแก

การศกษาเปรยบเทยบผลทดสอบระหวางหองปฏบตการ (interlaboratory study) ตามแนวทาง CODEX Alimentarius หรอ ISO หรอ IUPAC หรอ การพสจนความใชไดของวธทดสอบทดาเนนการโดยหองปฏบตการแหงเดยว (single laboratory studies หรอ in-house validation) ซงเปนแนวทางใหม/ทางลด (alternative method)

โดยแนวปฏบตตามมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC จะเนนแนวทางการพสจนความใชไดทดาเนนการโดยหองปฏบตการแหงเดยว (single laboratory หรอ in-house validation) ซงชดของคณลกษณะแสดงสมรรถนะหรอพารามเตอรประกอบดวย

ชดคณลกษณะแสดงสมรรถนะโดยทวไป ทใชประเมนวธทดสอบ ทไมขนอยกบแนวทางการพสจนความใชได (Common performance characteristics for model-independent validation) ชดคณลกษณะเฉพาะ (ทเพมขน) ใชประเมนวธทดสอบทขนกบแนวทางการพสจนความใชได คอแนวทางเดม/ทางธรรมดา (Conventional validation approach) และแนวทางเลอกใหม/ทางลด (alternative or in-house validation approach) ดงอธบายในตาราง

ตาราง 2 คณลกษณะหรอพารามเตอรแสดงสมรรถนะของวธทดสอบทขนกบและไมขนกบ แนวทางการพสจนความใชได

1. คณลกษณะทวไปแสดงสมรรถนะ โดยไมขนกบ

แนวทาง

2. คณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะ โดยขนกบแนวทาง

คณลกษณะแสดงสมรรถนะโดยทว ๆ ไป ของวธทดสอบ (Common performance characteristics)

แนวทางเดม (Conventional validation approach)

แนวทางใหม ทดาเนนการโดยหองปฏบตการแหงเดยว (in-house validation approach)

1. ความจาเพาะ (Specificity) 1. คาการกลบคน (Recovery) 1. คาการกลบคน (Recovery)

2. ความแมน (Trueness) 2. คาการทวนซาได 2. คาการทวนซาได

3. ความทนทาน (เมอมการเปลยนแปลงของปจจยเพยงเลกนอย)

3. คาการทาซาไดภายในหองปฏบตการแหงเดยว(Within-laboratory reproducibility)

3. คาการทาซาไดภายในหองปฏบตการแหงเดยว(Within-laboratory reproducibility)

หนา 20


4. ความเสถยรของสาร 4. คาการทาซาได 4. คาการทาซาได

5. เกณฑการตดสน (CC) 5. เกณฑการตดสน (CC)

6. ความสามารถในการตรวจ (CC)

6. ความสามารถในการตรวจ (CC)

7. กราฟมาตรฐาน 7. กราฟมาตรฐาน

8. ความทนทานของวธทดสอบ (เมอมการเปลยนแปลงของปจจยไปมาก)

8. ความทนทานของวธทดสอบ

2.2.1 คณลกษณะทวไปแสดงสมรรถนะของวธทดสอบทตองดาเนนการไมวาการพสจนความใชไดจะเปนแนวทางใดกตาม (Model-independent performance characteristics) ควรออกแบบการทดลองศกษาแตละคณลกษณะเฉพาะใหด โดยควบรวมการทดลอง เพอใหภาระงานลดลงแตไดขอมลของคณลกษณะเฉพาะ หลายพารามเตอรในคราวเดยว 2.2.1.1 ความจาเพาะ/ความสามารถในการแยกสาร (Specificity/Selectivity) ความสามารถของวธทดสอบทมความจาเพาะตอสารทสนใจ สามารถทาการแยกสารทสนใจออกจากสารทมสตรโครงสรางใกลเคยงหรอมความสมพนธกน หรอจากสงสกปรกได เปนสงสาคญ สารหรอสงทกอการรบกวนดงกลาวอาจ ไดแก เมตาบอไลทส ไอโซเมอร สารตาง ๆ ภายในเนอเยอ (endogenous substances) ดงนน การตรวจสอบ การรบกวนของสาร/สงตาง ๆ สามารถทาได 2 แนวทาง คอ แนวทางท 1 ตองเลอกสารชนดตาง ๆ ทคาดวามอทธพลในการรบกวนสารทสนใจมากทสด มาเตมในตวอยางปลอดสาร เพอทดสอบดวาวธทดสอบสามารถแยกสารทสนใจไดดเพยงใด สงรบกวนจะสงผลตอการวดสารทสนใจหรอไม

วธการตรวจสอบ โดยการเตรยมสารทกชนดทคาดวาจะกอสญญาณรบกวน ไดแก สารทมลกษณะสตรโครงสรางใกลเคยง หรอสมพนธกน เชน เมตาบอไลทส สารอนพนธ แลวนาตวอยางปลอดสาร มาเตมสารตาง ๆ (ถาม) ในปรมาณความเขมขนมากพอทอาจกอการรบกวน การยนยนชนดสารและความเขมขนของสารทสนใจ ตรวจประเมนผลการรบกวนจากสารทเตมตาง ๆ

ในทางปฏบต พบวาแนวทางนเปนไปไดยาก เนองจากตองหาซอสารตาง ๆ เชน เมตาบอไลทส อนพนธ isomer ซงอาจราคาแพง หาซอไดยาก หรอหาซอไมไดเนองจากไมมผใดผลตเพอจาหนาย

หนา 21


แนวทางท 2 โดยการเตรยมตวแทนของตวอยางปลอดสาร จานวน 20 ตวอยาง ทาการทดสอบ เปรยบเทยบผลการทดสอบ เชนจากโครมาโตแกรม ของตวอยางทมสารทสนใจ โดยการเตม หรอจากตวอยางทมสารทสนใจอยแลว (incurred matrix) ดวาในชวงเวลาของสารทสนใจ (time window) มการรบกวนเกดขนบางหรอไม เชน สญญาณ พค ไอออน

การประเมนความจาเพาะ จากทง 2 แนวทาง โดยตรวจดวา ม พค รบกวน จนอาจเกดการระบชนดสาร ผดพลาด ไมเหนพคของสารทสนใจ เนองจากถกบดบงโดยสารทกอการรบกวน สงผลตอการคานวณปรมาณ ผดพลาด

2.2.1.2 ความแมน (Trueness) ของวธทดสอบ คาความแมน เปนเพยงหนงองคประกอบของคาความถกตอง (Accuracy) การหาคาความแมน มวธการขนตอนอยางละเอยดดงอธบายไวใน ISO 5725-4 การหาคาความแมน สามารถหาไดจากคาการกลบคน (Recovery) ซงแบงออกเปน 2 กรณ คอ กรณแรก มวสดอางองรบรองใช และกรณท 2 ไมมวสดอางองรบรองใช

กรณท 1 ถามวสดอางองรบรอง (Certified reference material, CRM) วธการหาคาความแมน จากคาการกลบคน ของการทดสอบวสดอางองรบรอง (CRM) โดย ทาการทดสอบ CRM 6 ซา คานวณคาความเขมขน ของแตละซา และหา

คาความเขมขนเฉลย* (mean) คาเบยงเบนมาตรฐาน (SD) คาสมประสทธความแปรปรวน (%CV)

หาคาความแมน (%) ดงสมการ

คาความแมน (%) = คาความเขมขนเฉลย*/คาอางองรบรองของ CRM 100

ในงานดานสารตกคางยาสตว หรองานดานตาง ๆ ทไมสามารถหา CRM ทมคณสมบตใกลเคยงกบตวอยางจรงมากทสดได เชนไมมชนดสารในชนดเนอเยอ ตรงตามความตองการ เนองจากไมมผผลต หรอ มแตราคาแพงมาก สามารถหาคาการกลบคน (recovery) โดยการทดสอบตวอยางทมการเตมสาร (spiked หรอ fortified sample) แทนได ถากรณหาคาความแมนโดยเทยบกบคาอางองรบรอง ตามสตรขางตน และในการทดสอบนนมการทดสอบตวอยางเตมสารดวย ใหใชคาความเขมขนเฉลย* คอคาความเขมขนเฉลยทแกคาโดยการชดเชยดวยคาการกลบคนได ของชดการทดสอบนน

หนา 22


กรณท 2 ถาไมมวสดอางองรบรอง ใหหาคาการกลบคน วธการหาคาความแมน จากคาการกลบคน ของการทดสอบตวอยางเตมสาร ดวยการเตมสารทสนใจในตวอยางปลอดสาร (fortification หรอ spiking) เตรยมตวอยางปลอดสาร จานวน 18 ตวอยาง แบงเปน 6 ตวอยาง ตอระดบความเขมขน

กรณ สารทมคา MRPL เตมสารใหไดความเขมขนในตวอยาง 1, 1.5 และ 2 เทา ของ MRPL

กรณ สารทมคา MRL เตมสารใหไดความเขมขนในตวอยาง 0.5, 1 และ 1.5 เทา ของ MRL

ทดสอบแตละตวอยาง คานวณคาการกลบคน หาคาเฉลยและ สมประสทธความแปรปรวนของแตละความเขมขน

คาการกลบคน (%) = ความเขมขนทวดได/ความเขมขนทเตม 100 2.2.1.3 การใชงานและความทนทานของวธทดสอบ (Applicability/ruggedness minor changes) เปนการศกษาหากปจจยตาง ๆ ของวธทดสอบทถกปรบเปลยนไปเลกนอยวาจะสงผลกระทบตอผลทดสอบ หรอไม ดงนนจงตองมการศกษานารองและเกบขอมลมาบางแลว ถงอทธพลของปจจยตาง ๆ ทอาจกระทบตอผลทดสอบ เชน ขนตอนการเตรยมตวอยาง กาจดสงสกปรก ตวผวเคราะห แหลงและอายใชงานของสารมาตรฐาน สารเคม สงสกด การใหความรอน อณหภม คาความเปนกรด-ดาง ทอาจเกดขน ซงควรปรบเปลยนปจจยตาง ๆ เหลาน ใหเหมาะกบทหองปฏบตการตองเผชญ

ระบปจจย/เงอนไข ตาง ๆ ทกระทบตอผลทดสอบ คอย ๆ ปรบเปลยนแตละปจจย ศกษาความทนทานของวธทดสอบ ตามวธการของ Youden หรอจะใชวธการศกษาแบบอน กได แตวธการ Youden เปน แบบ fractional factorial design ซงจะลดภาระงานและเวลาลงไดมาก แตจากการศกษาหลาย ๆ ปจจยไปพรอม ๆ กน ทาใหทราบผลกระทบจากปจจยเดยวคอนขางยาก

แตถาพบวาปจจยใดมอทธพลตอผลทดสอบมาก ตองทดลองตอไปอกเพอวาจะสามารถยอมรบของตวแปรนไดหรอไม ปจจยใดทกระทบอยางชดเจนตอผลทดสอบตองอธบายไวใน SOP

หนา 23


ตาราง 3 การออกแบบการทดลองเพอหาความทนทานของวธทดสอบโดยเปลยนแปลงปจจยเพยงเลกนอย (โดยวธการคานวณ ดขอ 2.2.3.3) การจบคปจจย กบ ตวอยาง

คาปจจย F ต.ย.ท 1 ต.ย.ท 2 ต.ย.ท 3 ต.ย.ท 4 ต.ย.ท 5 ต.ย.ท 6 ต.ย.ท 7 ต.ย.ท 8

A/a A A A A a a a a

B/b B B b b B B b b

C/c C c C c C c C c

D/d D D d d d d D D

E/e E e E e e E e E

F/f F f f F F f f F

G/g G g g G g G G g

ผลทดสอบ R S T U V W X Y Z

ยกตวอยาง กาหนด ตวแปรจาก 7 ปจจย ดวยตวอกษรใหญ คอ A, B, C, D, E, F, G ทจะกระทบตอผลทดสอบ เมอปรบเปลยนทง 7 ปจจย ไปเพยงเลกนอย ใชสญลกษณแทนเปนอษรตวเลก คอ a, b, c, d, e, f, g ซงจากการออกแบบตาม Fractional factorial design คอ 27 มความเปนไปไดในการจบผสมคตวแปรไดถง 128 โอกาส 2.2.1.4 ความเสถยรของสาร (Stability) หากสารทสนใจทอยในเนอเยอ หรออยในสารละลาย เสอมสลายไปตามเวลาระหวางรอการทดสอบ จะทาใหผลทดสอบผดไปไดอยางมาก ดงนนจงตองตรวจสอบความเสถยรของสารทจะใชสรางกราฟมาตรฐาน โดยตองศกษาความเสถยรของสารทตองการตรวจในสภาพแวดลอมหรอวธการเกบตาง ๆ โดยออกแบบการทดลองใหไดขอมลตามประเดนทตองการทราบ หรอตามความพรอมดานอปกรณของหองปฏบตการในการเกบรกษาสารมาตรฐาน หรอ ตวอยางควบคมผลบวก ไดแกตแชแขง/ตเยน ทอณหภมตาง ๆ เปนตน การศกษาความเสถยรของสารในสารละลาย และ ในเนอเยอ การออกแบบการเกบรกษาเพอทราบเกยวกบความเสถยรของสารในสารละลาย และในเนอเยอ

ทระดบความเขมขนตาง ๆ เชน กรณการศกษาความเสถยรทเตรยมใชเปนสารละลายมาตรฐาน ทระดบความเขมขนสง (stock solution) ระดบกลาง

หนา 24


(intermediate stock solution) และระดบใชงาน (working solution) การศกษาความเสถยรของสารในเนอเยอ ความเขมขนทสนใจคอความเขมขนของสารทใกลเคยงกบคาความเขมขนทใชในการกากบดแล ไดแกความเขมขนทองคาขดความสามารถขนตาทวธทดสอบตองตรวจได (MRPL) หากสารนนเปนสารหามใช หรอ ความเขมขนทองเกณฑความเขมขนสงสดทตกคางไดในอาหาร (MRL) หากเปนสารทอนญาตใหใชได

ทสภาพแวดลอม คอสถานทเกบรกษา และอณหภมทเกบรกษา เชน เกบในตแชแขง (อณหภม -20C) ในตแชเยน (อณหภม +4C) เกบทอณหภมหอง (ประมาณ 25C) เปนตน

ขอมลผลทดสอบ นามาประมวลไดเปนอายใชงานและสภาพการเกบรกษาทเหมาะสม 2.2.1.4.1 การศกษาความเสถยรของสารในรปสารละลาย วธการ เตรยมสารละลายมาตรฐานตงตน (Stock solution) ของสารทสนใจ ใหปรมาณมากพอทจะแบงเปนขวดยอย เชน ประมาณ 40 ขวด หรอมากกวา ของแตละความเขมขน (เชน stock, intermediate และ working solution) สาหรบศกษาความเสถยรของสารตามสภาพและระยะเวลา (ตามตาราง 4) ควรเตรยมสารละลายมาตรฐานเผอสาหรบใชเตมในตวอยางปลอดสาร เพอเตรยม “ตวอยางเตมสาร” ดวย กรณศกษาความเสถยรของสารในเนอเยอ และควรเตรยมสารละลายอนทควรใหความสนใจ เชน สารละลายของสารอนพนธ (derivatised solution) ดวย หากเปนสารทเกยวเนองในการทดสอบดวย

นาสารละลายทเตรยมใหม ไปทดสอบหาปรมาณสาร ตามวธทดสอบ แบงสารละลายทเตรยม ออกเปนขวดยอย ๆ ตดฉลาก และเกบรกษาในสภาพตามทออกแบบแผนการทดลอง (ตามตาราง 4)

ระยะเวลาการเกบและนาออกมาทดสอบ เชน 1, 2, 3, 4 สปดาห หรอนานกวาน เชน 6เดอน 1 ป ตามความตองการศกษา เมอผลทดสอบแสดงการเปลยนแปลง (การเสอมสภาพ) ของสารทงการระบชนดสาร และ/หรอ ปรมาณ ตองบนทกทงสภาพการเกบและระยะเวลาทสามารถเกบรกษาสารไวไดโดยยงไมแสดงการเสอมสลาย

หนา 25


ตาราง 4 แผนการทดลองเพอศกษาความเสถยรของสารทสนใจ ทอยในรปสารละลาย

ในสารละลาย นาออกมาทดสอบเมอ

ถงกาหนด - 20C + 4C + 25C

อณหภมหอง

(10 ขวด) (10 ขวด) (10 ขวด)

สารละลายเตรยมใหม 2 2 2

สปดาหท 1 2 2 2

สปดาหท 2 2 2 2 เกบทมด



- - (10 ขวด)

สารละลายเตรยมใหม 2

สปดาหท 1 2

สปดาหท 2 2 เกบทสวาง



การคานวณความเขมขนของสารทสนใจ ในแตละขวด เปรยบเทยบกบความเขมขนของสารละลายทเตรยมใหมเมอเรมการทดลอง เปน 100 % C1 = ความเขมขนของสาร ณ เวลา (ทนาสารทเกบไวออกมาทดสอบ) Cfresh = ความเขมขนของสารเมอเตรยมใหม (เมอเรมการทดลอง) 2.2.1.4.2 การศกษาความเสถยรของสารในชนดเนอเยอ ถาเปนไปได ควรศกษาความเสถยรของสารทสนใจในตวอยาง/เนอเยอทมสารตกคางอยแลว (incurred matrix) ทดสอบหาความเขมขนในขณะทตวอยาง/เนอเยอยงสดใหม บนทกคาความ

สารทคงเหลออย (%) = C1/Cfresh 100

หนา 26


เขมขนไวเปนคาตงตน คดเปน 100 % จดการแบงตวอยาง/เนอเยอออกเปนสวนยอย ๆ เกบรกษาทอณหภม -20C หรอตากวา กไดถาตองการ และนาออกมาวเคราะหภายหลงเกบได 1, 2, 4 และ 20 สปดาห หรอนานกวา เชน 1 ป แตถาหาไมได ตองเตรยมขนเองโดยการเตมสารทสนใจเขาในเนอเยอปลอดสาร (blank matrix) ทตองการศกษา โดยการเตรยมตวอยางใหเปนเนอเดยวกน แลวแบงเกบเปนสวนยอย ๆ ทาการทดสอบ 1 ขวดทนททเตรยมเสรจ (เปนขอมลความเขมขนของสารของตวอยางสดใหม) เกบรกษาสวนทเหลอไวททอณหภม -20C หรอตากวา กไดถาตองการ และนาออกมาวเคราะหภายหลงเกบไดนาน 1, 2, 4 และ 20 สปดาห หรอนานกวา เชน 1 ป

ตาราง 5 แผนการทดลองเพอศกษาความเสถยรของสารทสนใจ ทอยในเนอเยอ

สารในเนอเยอ แบงตวอยางเปนสวนยอย ๆ ใสขวด 5 ขวด

เรมตน (1 ขวด) หลงจากเกบท- 20C หรอตากวากได (4 ขวด)

ทาการทดสอบหาความเขมขนของสารในเนอเยอ

เนอเยอทมสารอยแลว (incurred) หาคา (เรมตน) จากตวอยางสดใหม

1, 2, 4 และ 20 สปดาห

เนอเยอเตมสาร (spiked) หาคา (เรมตน) จากตวอยางสดใหม

1, 2, 4 และ 20 สปดาห

หมายเหต: หองปฏบตการไมจาเปนตองหาคาความเสถยรของสารในเนอเยอ โดยอางองจากขอมลทมผทาการศกษาไวแลว เชนขอมลจากหองปฏบตการอางองของยโรป เปนตน 2.2.1.5 กราฟมาตรฐาน (Calibration curve) กราฟมาตรฐาน สาหรบหาปรมาณ การสรางกราฟตองใชความเขมขนอยางนอย 5 ระดบ (รวมระดบ 0 ดวย) อธบาย ชวงใชงาน ของกราฟ อธบายสมการการสรางกราฟมาตรฐาน และ ลกษณะความเหมาะสมของกราฟ (Goodness of fit) เชนความสมพนธเชงเสนตรง (linearity) ระบเกณฑการยอมรบของกราฟมาตรฐาน และเกณฑการยอมรบการใชสารละลายมาตรฐานทใชสรางกราฟมาตรฐานสาหรบแตละชดการทดสอบ เพอควบคมคณภาพ เนองจากอาจมการเปลยนแปลงไประหวางชดการทดสอบ

หนา 27


2.2.2 การพสจนความใชไดตามแนวทางเดม (Conventional validation procedure) การหาคาคณลกษณะเฉพาะตาง ๆ ตามแนวทางเดมน โดยทาการทดสอบเพอหาไปทละพารามเตอร เมอปจจยถกเปลยนแปลงไปมาก (Major changes) ดงไดอธบายการหาคาความทนทานของวธทดสอบไวแลวขางตน วธทดสอบสาหรบตรวจสารตกคางหลายชนด ถาสามารถกาจดสงรบกวนออกไปได โดยสามารถทดสอบแยกสารหลายชนดไดในคราวเดยว ไมจาเปนตองทดสอบไปทละสาร และพยายามออกแบบการทดลอง เพอหาคาคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะของวธทดสอบใหไดหลาย ๆ พารามเตอรในคราวเดยว (เชน คาการทวนซา คาการทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยว การทดสอบตวอยางปลอดสาร เพอไดขอมลความจาเพาะของวธดวย เปนตน) เพอลดภาระงาน 2.2.2.1 การกลบคน (Recovery)

ถาไมม CRM ใหหาคาการกลบคน ดวยการเตมสารทสนใจในตวอยางปลอดสาร (fortification หรอ spiking) โดย

เตรยมตวอยางปลอดสารจานวน 18 ตวอยาง แบงเปน 6 ตวอยาง/ระดบความเขมขน

กรณ สารทมคา MRPL เตมสารใหไดความเขมขนในตวอยาง 1, 1.5 และ 2 เทา ของ MRPL กรณ สารทมคา MRL เตมสารใหไดความเขมขนในตวอยาง 0.5, 1 และ 1.5 เทา ของ MRL ทดสอบแตละตวอยาง คานวณคาการกลบคน หาคาเฉลยและ สมประสทธ

ความแปรปรวนของแตละความเขมขน

ดวยการเตมสารเพมเขาในตวอยางทมสารนนอยแลว (standard addition) (ดตวอยาง ขอ 2.6)

โดยตวอยางทมสารทสนใจอยแลว ทาหนาทเปนตวอยางปลอดสาร แตละตวอยางแบงออกเปนสองสวน โดยทคาผลของสารทวดได (yield) และคา

การกลบคน (recovery) ของทงสองสวน เหมอนกน ตวอยางทดสอบมสารนาหนกเทากน และปรมาตรของสงสกดเทากน สารละลายมาตรฐานทเตมในตวอยางสวนทสองเปนตวอยางเตมสาร ปรมาณ

ความเขมขนทเตม คอ xADD (ซง xADD = A.VA)

x1 เปนคาความเขมขนทวดไดจากตวอยางกอนเตมสาร x2 เปนคาความเขมขนทวดไดจากตวอยางสวนท 2 ทมการเตมสารเพมเขาไป

คาการกลบคน (%) = ความเขมขนทวดได/ความเขมขนทเตม 100

หนา 28


ดงนน คาการกลบคน คานวณได ดงสมการ คาการกลบคนของวธทดสอบ ตองนามาใชงานกบทกผลทดสอบ ทงทไดจากการพสจนความใชได หรอจากการใชวธทดสอบทเปนงานประจา โดยการนามาแกคาใหเรยบรอยกอนจงรายงานผล (corrected for recovery) ยกเวน กรณทวธทดสอบนนใชกราฟมาตรฐานในเนอเยอและมการใช internal standard กบทกตวอยาง ซงเปนการชดเชยการแกคาในตวเองแลว ไมจาเปนตองแกคาอก และไมตองนาคาการกลบคนไปใชกบวธทดสอบเชงคณภาพ 2.2.2.2 การทวนซาได (Repeatability) เตรยมตวอยางทเนอเยอเหมอนกน (identical matrices) เตมสารใหไดความเขนขน เทากบ 1, 1.5 และ 2 เทาของ MRPL หรอ 0.5, 1 และ 1.5 เทาของ MRL เตรยมตวอยาง อยางนอย 6 ตวอยาง ตอ ระดบความเขมขน เปน 1 ชดการทดสอบ ทดสอบ คานวณคาความเขมขนของแตละตวอยาง

หาคาเฉลย (mean) คาความเบยงเบนมาตรฐาน (SD) คาสมประสทธความแปรปรวน (% CV)

ทาการทดสอบเชนเดยวกนน อยางนอยอก 2 ชดการทดสอบ (2 ครง) คานวณคาเฉลยรวม (overall mean) และ คาสมประสทธความแปรปรวนรวม ( overall % CV) ของผลทดสอบทงหมดท

ไดจากทกชดการทดสอบ นาคาทไดไปประเมนตามเกณฑการประเมนสมรรถนะของวธทดสอบ (บทท 5) 2.2.2.3 การทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (Within laboratory reproducibility) เตรยมชดตวอยาง ทเนอเยอเหมอนกนหรอตางกนกได เตมสารใหไดความเขนขน เทากบ 1, 1.5 และ 2 เทาของ MRPL หรอ 0.5, 1 และ 1.5 เทาของ MRL เตรยมตวอยาง อยางนอย 6 ตวอยาง ตอ ระดบความเขมขน เปน 1 ชดการทดสอบ ทาการทดสอบเชนเดยวกนน อยางนอยอก 2 ชดการทดสอบ (2 ครง) โดยหากเปนไปได ใหปรบเปลยนปจจย/เงอนไขตาง ๆ เชน เปลยนตวผวเคราะห เปลยนเครองมอวเคราะห ใชสารเคมตางชดการผลต ใชอณหภมตางกน เปนตน เพอหาคาความเทยงของวธทดสอบทกวางขนตามตวแปรทถกปรบเปลยนไป

ทดสอบตวอยาง คานวณความเขมขนของแตละตวอยาง

คาการกลบคน = 100 (x2 – x1)/ xADD

หนา 29


คานวณคาเฉลยรวม (overall mean) และ คาสมประสทธความแปรปรวนรวม ( overall % CV) ของผลทดสอบทงหมดท

ไดจากทกชดการทดสอบ หมายเหต: คาการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (Within laboratory reproducibility) การออกแบบการทดลองทเหมาะสม ทศกษาปจจยทมอทธพลกระทบตอผลทดสอบ สามารถใชประเมนคาความไมแนนอนรวม (combined measurement uncertainty) ทดได โดยไดรวมความคลาดเคลอนของระบบอยในตวแลว และโดยการใชขอมลผลทดสอบทแกคาดวยคาการกลบคน กเปนการนาเอาคาความไมแนนอนของการกลบคนรวมเขาไวดวยแลวเชนกน การคานวณคาความไมแนนอนขยาย (extended uncertainty) จาเปนตองใชคา safety factor คอ ในการหาคา CC ใชคา factor การกระจายแบบ Gaussian ทใหความเชอมน 99 % (สาหรบสารกลม A หรอสารทไมอนญาตใหใช) และทใหความเชอมน 95 % (สาหรบสารกลม B หรอ สารทอนญาตใหใช และมคา MRL) คอ คา factor ของ 2.33 และ 1.64 ตามลาดบ และใชคา factor น ในการคานวณคาความไมแนนอนขยาย ของความเขมขนทใชในการพสจนความใชไดดวยเชนกน ดงนนเกณฑการตดสนผลทดสอบ (Decision limit หรอ CC) คาความไมแนนอนของการวดจงไดถกนามาคดรวมไวแลวในคา CC (คาความไมแนนอนแบบ top-down approach) หมายเหต: คณะกรรมาธการยโรปไดออกระเบยบ 96/23/EC วนท 29 เมษายน ค.ศ. 1996 แบงกลมสารออกเปน 2 กลม คอกลม A ไดแก กลมสารทไมอนญาตใหใช และกลม B คอกลมสารทอนญาตใหใช และกาหนดใหจดทาแผนการตรวจตดตามสารตกคางของทงกลม A และ กลม Bในสตวชนดตาง ๆ (ดภาคผนวกท 4) 2.2.2.4 การทาซาได (Reproducibility) หมายถง ตองมการทวนสอบ พารามเตอร คาการทาซาได โดยหองปฏบตการควรเขารวมโปรแกรมการศกษาเปรยบเทยบผลทดสอบกบหองปฏบตการอน ๆ (collaborative studies) เพอเปรยบเทยบผลทดสอบระหวางหองปฏบตการ ตาม ISO 5725-2 2.2.2.5 เกณฑการตดสน (Decision limit, CC)

เฉพาะวธทดสอบยนยนชนด และ/หรอปรมาณ กาหนดใหตองหาคา CC กรณสารทไมมการกาหนดคา MRL วธการหาคา CC ทาได 2 วธดงน โดย วธท 1 การสรางกราฟเสนตรงตามวธการทแนะนาไวใน ISO 11843 จากการเตรยมตวอยางปลอดสาร ทาการเตมสารใหไดความเขมขน เทากบ หรอ สงกวา คาความเขมขน Minimum Required Performance Level ดวยระยะหางของความเขมขนเทา ๆ กน ทดสอบตวอยาง ยนยนชนดสารทตรวจได นาผลตอบสนอง (signal) ของตวอยางกบคาความเขมขนทเตม มาสรางกราฟเสนตรง ไปตดแกน y

หนา 30


คาความเขมขน CC คอ y-intercept + 2.33 เทา ของคา SD ของ คาการทาซาของหองปฏบตการแหงเดยว ณ จดตดแกน Y (สมการนใชกบวธทดสอบเชงการวดปรมาณของสารทไมกาหนดคา MRL ท -error = 1%) วธท 2 นาตวอยางปลอดสาร อยางนอยทสด 20 ตวอยาง มาทดสอบ คานวณคา ผลตอบสนอง/สญญาณรบกวน (Signal/noise) ตรงชวงเวลาทจะเกดพค/การตอบสนองของสารทตองการตรวจ (time window) คา CC เทากบ 3 เทา S/N ratio (ซงคา CC นใชไดวธทดสอบเชงคณภาพ และเชงปรมาณ) กรณสารทมคา MRL วธการหาคา CC ทาได 2 วธดงน โดย วธท 1 การสรางกราฟเสนตรงตามวธการทแนะนาไวใน ISO 11843 จากการเตรยมตวอยางปลอดสาร ทาการเตมสารใหไดความเขมขน เทากบ และใกลเคยง คา MRL ดวยระยะหางของความเขมขนเทา ๆ กน ทดสอบตวอยาง ยนยนชนดสารทตรวจได นาผลตอบสนอง (signal) ของตวอยางกบคาความเขมขนทเตม มาสรางกราฟเสนตรง คาความเขมขน CC คอ คา MRL + 1.64 เทา ของคา SD ของ คาการทาซาโดยหองปฏบตการแหงเดยว ณ ความเขมขน MRL (สมการนใชกบวธทดสอบเชงวดปรมาณของสารทมคา MRL ท -error = 5 %) วธท 2 นาตวอยางปลอดสาร อยางนอยทสด 20 ตวอยาง มาเตมสารใหมความเขมขนของสาร เทากบ คา MRL ทาการทดสอบ คา CC เทากบ คา MRL + 1.64 เทา ของคา SD ของ คาการทาซาของหองปฏบตการแหงเดยว ณ ความเขมขน MRL (ท -error = 5 %) หมายเหต:- 1. คา MRPL คอ Minimum Required Performance Limit ซงในคมอนแปลวา ขดความสามารถขนตาของวธทดสอบ (ความเขมขนของสารทวธทดสอบควรตรวจวดได) 2. สวน minimum required performance level คอระดบความเขมขนตาทสด ทวธทดสอบแบบคดกรอง ควรตรวจได (detected) หรอ ทวธทดสอบยนยนผล สามารถตรวจยนยนระบชนดสารได

หนา 31


อยางไมกากวม ดงนนสาหรบสารทมการเสนอคา MRPL ในการออกแบบการสรางกราฟ คา minimum required performance level จงตองเปนระดบความเขมขนทนอยกวาขดความสามารถขนตา หรอ MRPL เพอไมใหเกดความสบสน หองปฏบตการอางองบางแหงใชคาวา Intra-laboratory performance level (LPL) แทน minimum required performance level ซงมความหมายเหมอนกน 3. โดยการเตรยมตวอยางปลอดสาร ทาการเตมสารทความเขมขน เทากบ หรอ สงกวา minimum required performance level ซงระดบความเขมขนตาสดของกราฟ ควรเปนจดทวธทดสอบเรมตรวจพบและระบชนดสารได (ซงไมไดหมายความวาจะตองตรวจพบ หรอ ระบชนดสารได 100 %) 4. กรณทตองสรางเปนกราฟเสนตรงเพอหาคา CC จงตองกาหนดเกณฑการยอมรบความเปนเสนตรง และประเมนดวยตองผานเกณฑการเปนเสนตรงทกาหนดเสยกอน จงจะใชวธการนได 5. การสรางกราฟเสนตรง ตามแนวทาง ISO 11843 น บางครงเมอลากเสนกราฟตดแกน y คาทไดตาม ทฤษฎ เปนคาทตาเกนความเปนจรง จนอาจไมสามารถทาการทวนสอบคานได กรณเชนนใหใชคาของความเขมขน (แกน x) ของความเขมขนตาสดของกราฟทไดจากตวอยางเตมสาร แทน 6. การสรางกราฟเสนตรง ตามแนวทาง ISO 11843 น จะใหขอมลสาหรบเนอเยอชนดเดยว/หลายชนดสาร เทานน แตมขอจากดสาหรบวธทดสอบทคละชนดเนอเยอหลายชนด และคละชนดสารหลายชนด 7. ตวอยางปลอดสาร ตอ ชนดเนอเยอ จานวน 20 ตวอยาง เพอเปนตวแทนของกลมประชากรคอชนดเนอเยอนน ๆ ทตองการศกษา และทมาของ 20 ตวอยางทเปนตวแทนควรไดจากสตวตางเพศ ตางอาย ตางสภาพการเลยง ตางภมภาค (ถาเปนไปได) เปนตน 2.2.2.6 ความสามารถในการตรวจ (Detection capability, CC)

สาหรบวธทดสอบคดกรอง วธทดสอบยนยนชนดและ/หรอปรมาณ ตองหาคา CC กรณสารทไมมการกาหนดคา MRL วธการหาคา CC ทาได 2 วธ โดย วธท 1 การสรางกราฟเสนตรงตามวธการทแนะนาไวใน ISO 11843 จากการเตรยมตวอยางปลอดสาร ทาการเตมสารใหไดความเขมขน เทากบ หรอ ตากวา คาความเขมขน Minimum Required Performance Level ดวยระยะหางของความเขมขนเทา ๆ กน ทดสอบตวอยาง ยนยนชนดสารทตรวจได นาผลตอบสนอง (signal) ของตวอยางกบคาความเขมขนทเตม มาสรางกราฟเสนตรง คา CC คอ คาความเขมขน CC + 1.64 เทาของคา SD ของ คาการทาซาโดยหองปฏบตการแหงเดยว ของคาเฉลยของความเขมขน CC (-error = 5 %) วธท 2 นาตวอยางปลอดสาร อยางนอยทสด 20 ตวอยาง มาเตมสารใหมความเขมขนของสาร เทากบ คา CC ทาการทดสอบ ยนยนชนดสาร

หนา 32


คา CC เทากบ คา CC + 1.64 เทาของคา SD ของ คาการทาซาโดยหองปฏบตการแหงเดยว ณ ความเขมขนทวดได (ซง -error = 5 %) สาหรบวธทดสอบแบบคดกรอง ทวธทดสอบไมสามารถวดปรมาณได คา CC หาได โดย นาตวอยางปลอดสาร มาเตมสารทความเขมขน คา CC หรอสงกวา ณ ความเขมขนทใหผลทดสอบเปน “ผลผานเกณฑเทยม” ไมเกน 5 % คาความเขมขนนนใชเปนคา CC นนคอ ตองวเคราะหอยางนอย 20 ตวอยาง ตอ ระดบความเขมขน โดยทใหผลทดสอบ เปน “ผลผานเกณฑเทยม” ไดเพยง 1 จาก 20 ตวอยาง ( -error = 5 %) หมายเหต: การหาคา CC สาหรบสารทไมมการกาหนดคา MRL

1. โดยวธการสรางกราฟ ตามแนว ISO 11843 ใหทาเหมอนการหาคา CC ทไดอธบายไวขางตน ซงใชตวอยางปลอดสาร จานวน 20 ตวอยาง เปนตวแทน โดยเตมสารใหไดความเขมขน เทากบ หรอ สงกวา ความเขมขนตาสดของสารทคาดหมายวาวธทดสอบแบบคดกรองสามารถตรวจพบได หรอ วธทดสอบแบบยนยน สามารถตรวจระบชนดไดอยางถกตอง

2. สาหรบวธทดสอบแบบคดกรอง แนะนาให ใชตวอยางปลอดสาร จานวน 20 ตวอยาง เปนตวแทน โดยเตมสารทความเขมขนอยางนอย 2 ระดบ ทครอบคลมระดบความเขมขนทสนใจ และเปนระดบความเขมขนทสอดคลองกบวธทดสอบแบบยนยนสามารถตรวจไดดวยเชนกน

กรณสารทมคา MRL วธการหาคา CC ทาได 2 วธ โดย วธท 1 การสรางกราฟเสนตรงตามวธการทแนะนาไวใน ISO 11843 จากการเตรยมตวอยางปลอดสาร ทาการเตมสารใหไดความเขมขน เทากบ และใกลเคยง คา MRL ดวยระยะหางของความเขมขนเทา ๆ กน ทดสอบตวอยาง ยนยนชนดสารทตรวจได นาผลตอบสนอง (signal) ของตวอยางกบคาความเขมขนทเตม มาสรางกราฟเสนตรง คาความเขมขน CC คอ คา CC + 1.64 เทา ของคา SD ของ คาการทาซาโดยหองปฏบตการแหงเดยว ณ ความเขมขน CC (-error = 5 %) วธท 2 นาตวอยางปลอดสารอยางนอยทสด 20 ตวอยาง มาเตมสารใหมความเขมขนของสาร เทากบ คา CC ทาการทดสอบ คา CC เทากบ คา CC + 1.64 เทาของคา SD ของ คาการทาซาโดยหองปฏบตการแหงเดยว ณ ความเขมขนทเตม (ซง -error = 5 %)

หนา 33


หมายเหต: - 1. สาหรบสารทมการกาหนดคา MRPL คา CC ตองนอยกวา หรอ เทากบ MRPL (ดงนนคา CC ซงตองนอยกวา MRPL โดยปรยาย) 2. สาหรบสารหามใชทไมมการกาหนดทงคา MRL และ MRPL คา CC ควรเปนคาทตาสดเทาททาได (as low as reasonable achievable, ALARA) 3. เมอหาคา CC และ CC ไดแลว ไมวาจะไดโดยวธการใด จะตองทาการทวนสอบคาทไดมา โดยการเตมสารลงในตวอยางปลอดสาร จานวน อยางนอย 20 ซา ใหไดความเขมขน เทากบ CCและ CC ทไดมา ทดสอบและประเมนคา โดยทคา CC คา -error ตอง 5 % จงถอวาผานเกณฑกาหนดของวธทดสอบ ถาเปนวธทดสอบคดกรอง ตองสามารถตรวจพบสารไดทคา CC ถกตอง 95 % จากทงหมด (เชน 20 ตวอยาง) สวนวธทดสอบแบบยนยน ตองสามารถตรวจระบชนดสารไดทคา CC ถกตอง 95 % เชนเดยวกน และตรวจไดทคา CC 50 % จากทงหมด และถาผลการทวนสอบไมไดตามเกณฑทกาหนดสาหรบวธทดสอบแตละแบบ หมายความวาคา CC และ CC ทคานวณไดมานน ตาเกนไป ตองหาสาเหตและปรบปรงวธทดสอบตอไป 2.2.2.7 ความทนทานของวธทดสอบ เมอมการเปลยนแปลงของปจจยไปมาก (Ruggedness, major changes) คอ การออกแบบทดลองวาวธทดสอบยงมประสทธภาพเหมอนเดมหรอไม ภายใตปจจย หรอ สภาพสงแวดลอมทเปลยนแปลงอยางมาก เชน ชนดเนอเยอตางชนดกน เนอเยอของสตวตางชนด การสมตวอยางในสภาพตาง ๆ เปนตน ควรเลอกประเมนปจจยทเปลยนเงอนไขหรอสภาพไดอยางมาก (major changes) โดยใชวธวางแผนการทดลองของ Youden ควรหาคาคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะของแตละพารามเตอร เมอปจจยทสาคญทกปจจยมการเปลยนแปลง เพอประเมนวาวธทดสอบจะยงคงมประสทธภาพดเหมอนเดม หรอไม 2.2.3 การพสจนความใชไดตามแนวทางใหมโดยหองปฏบตการแหงเดยว (Validation according to alternative method) การดาเนนการพสจนความใชไดของวธทดสอบแนวใหม โดยการใชขอมลเบองตนทไดมาจากการทดสอบนารอง สตรทใชควรระบใหชดเจนไวในขนตอนการพสจนความใชได หรออยางนอยทสดอางองทมาของขอมล ยกตวอยาง เชน การพสจนความใชไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (in-house validation) คณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะทหาภายใตเงอนไขหรอปจจยทเปลยนไปอยางมาก (major changes) ดวยขนตอนการพสจนความใชไดเดยวกน ซงตองมการออกแบบและแผนการทดลองเพอการพสจนความใชไดของวธทดสอบไวใหชดเจน 2.2.3.1 แผนการทดลอง (experimental plan) การออกแบบการทดลองขนกบจานวนชนดสตวทตองการจะทดสอบ และปจจยตาง ๆ ทตองการศกษา ดงนน ประการแรกตองประเมนใหไดกอนวาตองใชจานวนตวอยางเทาไรในการ

หนา 34


ทดลอง ประการตอไป เพอหาวาสตวชนดใด และปจจยใด บางทมอทธพลตอการวดผลทดสอบ ตอจากนนจงออกแบบเลอกชวงความเขมขนใหเหมาะกบวตถประสงคคอระดบความเขมขนทสนใจ ซงมความสาคญ และจาเปนมาก ทจะตองมความร ความเขาใจเกยวกบคาในการกากบดแล เชน MRL MRPL เปนตน (ดบทท 4) ยกตวอยาง

- สามารถทดสอบสารทสนใจไดหลายชนดในคราวเดยว ดวยวธทดสอบทจะพสจนความใชได

- ระบปจจยนา (leading factor) 2 ตวแปร (ระดบ) คอ ตวแปร A และตวแปร B ปจจย

นาจะใชเปนหลก สาหรบจบคกนกบตวประกอบของปจจยอน (ของระดบของตวแปร ปจจยนา) เชน ชนดสตว ชนดเนอเยอ

- จากตวอยางทยกมาน กาหนดปจจยนา มตวแปร 2 ระดบ คอ ชนดสตว เปนปจจยนา ม

ตวแปร 2 ระดบ คอ ชนดสตว A และ B (เชน A คอ สกร B คอ ไก เปนตน) โดยทวไป แตละปจจยนา สามารถกาหนดตวแปรไดมากกวา 2 ระดบ ซงจะทาใหเพมจานวนการทดสอบมากขนตามไปดวย

- ปจจยรองทเลอกมาทดสอบ (ไมควรเกน 7 ปจจย) ในกรณน จะกาหนดท 2 ระดบ (ใช

สญลกษณ + และ -) ตาราง 6 ตวอยางปจจยสาคญ ทสงผลตอวธทดสอบ สาหรบออกแบบการพสจนความใชได ตามแนวทางใหม

ตางเพศ (สตวเพศผ/สตวเพศเมย) ปจจย ท 1

ตางสายพนธ ปจจย ท 2

สภาพการขนสง ปจจย ท 3

สภาพการเกบรกษา ปจจย ท 4

ความสดของตวอยาง ปจจย ท 5

การขนสตว ปจจย ท 6

การเปลยนตวผวเคราะห (ทมประสบการณหรอทกษะตางกน) ปจจย ท 7

หนา 35


ตาราง 7 ตวอยางการวางแผนการทดลองตามปจจยทไดเลอกมา ตามตาราง 3 ชนดสตว

ปจจยท1

ปจจยท2

ปจจยท3

ปจจยท4

ปจจยท5

ปจจยท6

ปจจยท7

ตวอยางท

A (สกร) + + + + - + - 1

A + + - - + - - 2

A + - + - - - + 3

A + - - + + + + 4

A - + + - + + + 5

A - + - + - - + 6

A - - + + + - - 7

A - - - - - + - 8

ชนดสตว

ปจจยท1

ปจจยท2

ปจจยท3

ปจจยท4

ปจจยท5

ปจจยท6

ปจจยท7

ตวอยางท

B (ไก) + + + + + - + 9

B + + - - - + + 10

B + - + - + + - 11

B + - - + - - - 12

B - + + - - - - 13

B - + - + + + - 14

B - - + + - + + 15

B - - - - + - + 16

หนา 36


แตละตวอยาง (ในแตละคของระดบตวแปร) ตองเตมสารลงไป 4 ระดบความเขมขน ในชวงครอบคลมระดบทสนใจ และมตวอยางปลอดสาร 1 ตวอยางดวย (ระดบ ศนย) คอ 5 16 = 80 การทดสอบ ทตองดาเนนการในแผนการพสจนความใชได ซงจะสามารถคานวณคาพารามเตอรไดดงตอไปน

- คาการกลบคน

- คาการทวนซาได ตอ ระดบความเขมขน (Sir)

- คาการทาซาได ของหองปฏบตการแหงเดยว ตอ ระดบความเขมขน (Sir)

- เกณฑการตดสน (CC)

- ความสามารถในการตรวจ (CC)

- Power curve (คา -error กบ ความเขมขน)

- ความทนทานของวธทดสอบ โดยปจจยถกเปลยนแปลงไปมาก

- ความทนทานของวธทดสอบ โดยปจจยถกเปลยนแปลงเพยงเลกนอย

- กราฟมาตรฐาน ทสรางจากขอมลของแตละตวอยาง (16 ตวอยาง)

- กราฟมาตรฐาน โดยรวม

- คาทานายของกราฟมาตรฐาน โดยรวม

- การเบยงเบนทเกดจากชนดเนอเยอ (Smat)

- การเบยงเบนทเกดจากการทดสอบแตละครง (Srun)

- ผลกระทบของแตละปจจยตอผลการวด คาคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะเหลาน ชวยใหประเมนประสทธภาพ หรอ สมรรถนะของวธทดสอบ จากการทดลองจะทราบไดวาปจจยใด หรอปจจยคใดทมอทธพลมากตอผลทดสอบ จากการออกแบบการทดลองจะชวยใหทราบไดวาควรตดปจจยใดออกไปจากกราฟภาพรวม เนองจากจะเหนการเบยงเบนออกไปจากคาเบยงเบนมาตรฐานของปจจยอน ๆ

หนา 37


2.2.3.2 Power curve Power curve ใหขอมลคาความสามารถในการตรวจ (detection capability) ของวธทดสอบในชวงความเขมขนทเลอก แสดงคาความเสยงทจะเกด -error เมอใชวธน สามารถใช Power curve เพอคานวณคาความสามารถในการตรวจ (detection capability) สาหรบวธทดสอบแบบคดกรองหรอวธทดสอบยนยนผล หรอ วธทดสอบเชงคณภาพกบเชงปรมาณของวธทดสอบ ทคา -error (เชน 5 %)

Power curve

ภาพ 1 แสดงการกาหนดคาความสามารถในการตรวจ (detection capability, CC) ของวธทดสอบ ซงเฉพาะวธน โอกาสในการเกด การตดสนผด (false decision) 5 % ทความเขมขน 0.5 ไมโครกรม/กโลกรม และทความเขมขน 0.55 ไมโครกรม/กโลกรม โอกาสในการตดสน เปน “ผลผานเกณฑเทยม” ลดลงเหลอ 1 % 2.2.3.3 การทาซาได (Reproducibility) การหาคา การทาซาได ของวธทดสอบ จากการพสจนความใชไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (in-house or single laboratory validation) ประเมนไดจากการเขารวมโปรแกรมการทดสอบความชานาญ ซงตาม ISO/IEC 17043:2010 นนอนญาตใหหองปฏบตการสามารถเลอกใชวธทดสอบทไมเหมอนกนได เปนวธทดสอบภายใตเงอนไขทหองปฏบตการใชงานอยเปนประจา คาเบยงเบนมาตรฐานของหองปฏบตการททราบจากผลทดสอบความชานาญ สามารถใชประเมนคาคณลกษณะ (พารามเตอร) การทาซาได

หนา 38


2.3 กราฟแสดงคาเกณฑของวธทดสอบ

ภาพ 2 แสดงคา CC, CC ของสารทไมมการกาหนดคา MRL

X s คาเฉลยของผลตอบสนองของตวอยางทมสารตกคาง SB คาเบยงเบนมาตรฐานของตวอยางปลอดสาร (ภายใตเงอนไขการทาซาไดโดย หองปฏบตการแหงเดยว) SS คาเบยงเบนมาตรฐานของตวอยางทมสารตกคาง (ภายใตเงอนไขการทาซาไดโดย หองปฏบตการแหงเดยว) โอกาสการเกด “ผลไมสอดคลองกบเกณฑเทยม” (false non-compliant result) โอกาสการเกด “ผลสอดคลองกบเกณฑเทยม” (false compliant result) CC ผลทดสอบทใหคา -error และ 50 % -error CC ผลทดสอบทใหคา -error เลกมากและ -error

หนา 39


ภาพ 3 แสดงคา CC, CC ของสารทมการกาหนดคา MRL

Concentration X B คาเฉลยของผลตอบสนองของตวอยางปลอดสารตกคาง (blank) X PL คาเฉลยของผลตอบสนองของตวอยางทมสารทความเขมขน MRL X S คาเฉลยของผลตอบสนองของตวอยางทมสารตกคาง SPL คาเบยงเบนมาตรฐานของตวอยางทมสารทความเขมขน MRL (ภายใตเงอนไขการทาซาได ของหองปฏบตการแหงเดยว) SS คาเบยงเบนมาตรฐานของตวอยางทมสารตกคาง (ภายใตเงอนไขการทาซาไดของ หองปฏบตการแหงเดยว) โอกาสการเกด “ผลไมผานเกณฑเทยม” (false non-compliant result) โอกาสการเกด “ผลผานเกณฑเทยม” (false compliant result) CC ผลทดสอบทใหคา -error และ 50 % -error CC ผลทดสอบทใหคา -error เลกมากและ -error

หนา 40


2.4 ตวอยางการคานวณ ความทนทาน ของวธทดสอบ ทปจจยมการเปลยนแปลงเลกนอย ตามแผนการทดลองแบบ Youden การเปรยบเทยบคาเฉลย (A) จากผลทดสอบทเกดจากปจจย 7 ปจจย เปรยบเทยบคาเฉลยของ ตวอกษรใหญ (AA ถง AG) กบ คาเฉลยทไดจาก อกษรตวเลก (Aa ถง Ag) ถาปจจยใดใหผลกระทบมาก คาความแตกตางจะมากกวาคาความแตกตางจากปจจยอน ๆ มาก วธทดสอบทมความทนทาน คอ แมปจจย/เงอนไขเกดการเปลยนแปลงไป ตามทหองปฏบตการตองประสบกตาม แตจะไมสงผลกระทบตอผลการวด ถาไมพบวามความแตกตางอยางเหนไดชด การวดคาความคลาดเคลอนแบบสม (random error ทใกลความเปนจรงทสด คอการวดดวยความแตกตาง 7 ปจจย AA = (Ai)/4 AB = (Bi)/4 AC = (Ci)/4 AD = (Di)/4 AE = (Ei)/4 AF = (Fi)/4 AG = (Gi)/4 Aa = (ai)/4 Ab = (bi)/4 Ac = (ci)/4 Ad = (di)/4 Ae = (ei)/4 Af = (fi)/4 Ag = (gi)/4 คาความแตกตาง (D) คาความแตกตางยกกาลงสอง (Di

2) Da = A – a = (Ai) - (ai) Da

2 = value a Db = B – b = (Bi) - (bi) Db

2 = value b Dc = C – c = (Ci) - (ci) Dc

2 = value c Dd = D – d = (Di) - (di) Dd

2 = value d De = E – e = (Ei) - (ei) De

2 = value e Df = F – f = (Fi) - (fi) Df

2 = value f Dg = G – g = (Gi) - (gi) Dg

2 = value g

หนา 41


คาเบยงเบนมาตรฐานของคาความแตกตาง (SDi) SDi = )7/D(*2 2

i ถาคาเบยงเบนมาตรฐานของคาความแตกตาง (SDi) ใหญกวาคาความเบยงเบนมาตรฐานของวธทดสอบทไดมาภายใตเงอนไขการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว สามารถสรปไดวาทกปจจยรวมกนสงผลกระทบตอผลทดสอบ แมวาปจจยเดยวแตละปจจยจะไมมอทธพลอยางชดเจนกตาม และสรปไดวาวธทดสอบนไมมความทนทานเมอมการปรบเปลยนปจจย/เงอนไขดงกลาว 2.5 การคานวณ การพสจนความใชไดตามแนวทางใหม (โดยหองปฏบตการแหงเดยว) วธการและตวอยางการคานวณ ไดอธบายไวแลว (ดขอ 2.2.3) 2.6 ตวอยางวธการเตมสารมาตรฐานเพมลงในตวอยางทมสารทสนใจตกคางอยแลว (The standard addition method) ตวอยางทดสอบทมสารตกคางปรมาณ T อยแลว แบงตวอยางทดสอบออกเปนสองสวน สวนท 1 ให m1 แทนนาหนกของสวนท 1 และ m2 แทนนาหนกของสวนท 2

นาสวนท 2 เตมดวยสารละลายมาตรฐาน ความเขมขน A ดวยปรมาตร VA ทดสอบตวอยางตามขนตอนวธทดสอบ ปรมาตรของสงสกดจากตวอยางสวนท 1 (V1) และจากสวนท 2 (V2) สมมตคาการกลบคนของวธทดสอบ คอ rc และผลทดสอบวดจากวธทดสอบทมความไว b ความเขมขนทวดไดจากตวอยางสวนท 1 และ 2 เปน x1 และ x2 สมมตวา คา rc และ b ในการสกดสารจากตวอยางทมสารอยกอนแลว (native) กบการสกดสารจากตวอยางทมการเตมสารเพมเขาไปอก มคาเทากน ดงนน ปรมาณสารในตวอยาง (T) คานวณได จากสมการ ดงน

T = x1.V1.A.VA/(x2.V2.m1-x1.V1.m2) การคานวณคาการกลบคน rc จากวธการเตมสารเพมเขาในตวอยางทมสารอยกอนหนาแลว ตามทอธบายไวขางตน นาสงสกดของตวอยางสวนท 1 มาดวยปรมาตร V3 เตมสารตามปรมาณทตองการ B.VB ผลทดสอบทได เปน x3 ดงนน คานวณ rc ไดจากสมการ

rc = x1.V1.V2.B.VB/[x3.V1.V3 (T.m2 + A.VA)-x2.V2.T.m1(V3-V และคานวณคาความไว (Sensitivity): b ไดจากสมการ

B)]

b = x1.V1/rc.T.m1

หนา 42


บทท 3

การพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบคดกรอง

3.1 การจาแนกวธทดสอบแบบคดกรอง สามารถจาแนกออกได ตาม เทคนค/หลกการตรวจ หรอ จาแนกตามลกษณะการวดผลทดสอบ 3.1.1วธทดสอบคดกรอง ทจาแนกตามเทคนค/หลกการตรวจ ได 3 แบบ คอ วธทดสอบดวยเทคนคทางชววทยา (Biological methods) วธทดสอบดวยเทคนคทางชวเคม (Biochemical methods) วธทดสอบดวยเทคนคทางฟสกสเคม (Physicochemical methods) 3.1.1.1 วธทดสอบดวยเทคนคทางชววทยา โดยการตรวจวดผลการตอบสนองของเซลลตอสารตกคาง เชน ผลจากอทธพลฮอรโมนเอสโตรเจน การยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย (Microbiological assay, MA) วธทดสอบดวยเทคนคเหลานไมมความจาเพาะ ผลการทดสอบระบไดในระดบกลมสารเทานน เชน ฮอรโมน สารปฏชวนะ ไมสามารถแยกและระบชนดสารแตละชนดในกลมได 3.1.1.2 วธทดสอบดวยเทคนคทางชวเคม โดยการวดผลทดสอบทเกดจากปฏกรยาตอบสนองระหวางโมเลกลของสาร เชน แอนตเจน กบแอนตบอด หรอ กบโปรตนทเปนตวรบ (receptor proteins) ไดแก เทคนค Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Radio immuno-assay (RIA) ฯลฯ การตดฉลากทางเคมไมวาจะตดฉลากสารทตองการทดสอบ (Analyte) หรอ ท แอนตบอด/ตวรบ กตาม เมอเกดปฏกรยาตอกนจะสามารถตดตามผลตอบสนอง (monitored) และวดผล (measured) ได วธเหลานจงสามารถออกแบบใหมความจาเพาะตรวจสารทงกลมทมสตรโครงสรางคลายกน/เกยวของสมพนธกน หรอ แบบเจาะจงสารชนดเดยวได 3.1.1.3 วธทดสอบดวยเทคนคทางฟสกสเคม นสามารถแยกสตรโครงสรางเคมและลกษณะโมเลกลของสารทสนใจได โดยการแยกโมเลกล ไดแก Thin layer chromatography (TLC), Gas chromatography (GC), High performance liquid chromatography (HPLC) เปนตน และโดยดวยการตรวจจบสญญาณทเกดขนทสมพนธกบคณสมบตของโมเลกลสารนน ๆ ไดแก การตรวจวดผลแบบตาง ๆ เชนวดการดดกลนแสงอลตราไวโอเลต (UV, DAD), การวดสหรอวดการดดกลนแสงชวงทมองเหนได (visible), ฟลออเรสเซนส FID, ECD, MS, tandem MS, trap MS, ToF MS, hybrid MS เปนตน ซงการวดผลดวยเครองมอ/เทคโนโลย ตาง ๆ เหลาน สามารถแยกแยะชนดสารทมสตรโครงสรางทคลายกนได (identification) และสามารถตรวจสารไดหลายสารในคราวเดยว

หนา 43


3.1.2 วธทดสอบ จาแนกตามลกษณะการวดผลทดสอบ ได 3 แบบ คอ วธทดสอบเชงคณภาพ/คณลกษณะ (Qualitative methods) วธทดสอบเชงการวดปรมาณคราว ๆ (Semi-quantitative methods) วธทดสอบเชงการวดปรมาณ (Quantitative methods) 3.1.2.1 วธทดสอบเชงคณภาพ โดยเทคนคนใหผลทดสอบ “พบ/ไมพบ” “ม/ไมม” ซงไมจาเปนตองทราบปรมาณสารทตรวจพบได ยกตวอยางเชน

การยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย ใหผลการวดเปน อาณาเขตบรเวณทเชอจลนทรยเจรญขนไมได (inhibition zone) /เชอขนได (no zone)

การยบยงการเจรญของเชอ โดยวดผลทดสอบจากการเปลยนส เทคนคการเกดปฏกรยาการจบกนทางอมมโนเคมวทยา ซงแสดงผลทดสอบพบสาร หรอ

รวมถงการพบสารอนในกลมทมการสนองตอบปฏกรยาดวยเชนเดยวกน (cross reaction)เปน พบสงกวา/ตากวา คา Cut-off

เทคนคโครมาโตกราฟ (HPLC, LC-MS/MS) ซงแสดงผลทดสอบขนตน เชน โดยการตรวจ พบ peak/ไมพบ peak ของสารทสนใจ ซงทาการพสจนความใชไดแบบวธทดสอบคดกรองอยางคราว ๆ ได โดยยงไมตองทาการวดปรมาณ

3.1.2.2 วธทดสอบเชงการวดปรมาณคราว ๆ วดคาของสารโดยประมาณ และรายงานปรมาณออกมาเปนระดบคะแนนแสดงจากนอย ไป มาก เชน +1, +2, +3, + 4 เปนตน ซงเปนประโยชนตอนกวเคราะหโดยสามารถนาไปใชออกแบบชวงความเขมขนสาหรบการวดปรมาณโดยวธทดสอบแบบยนยนผลเชงการวดปรมาณตอไปได ตวอยางเชน

การยบยงการเจรญของเชอจลนทรย โดยการประมาณคาปรมาณความเขมขนของสารทตรวจพบไดจากการเทยบเคยงกบอาณาเขตทเชอไมเจรญ (inhibitory zone) ทสมพนธกบ คาความเขมขนของสารมาตรฐาน ทไดวดขนาดไวกอน

ผลการทดสอบจากเทคนคทางชวเคมซงไดมการสรางกราฟมาตรฐานไว (calibration curve) เชน ELISA แตจะวดผลเชงปรมาณไดตอเมอชดทดสอบนนมความจาเพาะตอสารชนดเดยวเทานน

เทคนคฟสกสเคม เชน HPLC, LC-MS/MS เมอผลการพสจนความใชไดของวธทดสอบ คา “ความเทยง” ไมผานเกณฑการยอมรบ ของวธทดสอบเชงปรมาณ (แสดงวาการวดปรมาณไมเทยงพอ วธทดสอบตอสารชนดนจงถกจดลาดบเปนเพยงวธทดสอบเชงการวดปรมาณคราว ๆ )

3.1.2.3 วธทดสอบเชงการวดปรมาณ คาพารามเตอร ตาง ๆ เชน ความถกตอง ความเทยง ชวงใชงาน ตองผานเกณฑการยอมรบของวธทดสอบแบบยนยนผล ดงนนจงตองออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบ เปนแบบวธยนยนผล ซงการพสจนความใชไดปฏบตตามแนวมต คณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC หากมวตถประสงคใชวธทดสอบเทคนคดงกลาวนเปนเพยงวธคดกรอง กไมจาเปนตองหาคา identification point ทวธยนยนตองหาคา IP น (ดบทท 5)

หนา 44


3.2. หลกการการพสจนความใชไดของวธทดสอบคดกรอง 3.2.1 คณสมบตทดของวธทดสอบแบบคดกรอง (Key requirements) วธทดสอบทมประสทธภาพในการคดแยกไดทความเขมขนเปาหมาย (Screen target concentration) และใหผลผานเกณฑเทยมตา (false compliant results) เปนคณลกษณะสมรรถนะทตองการ คาความเขมขนเปาหมายในการคดกรองนนควรตาเทาททาใหมนใจไดวาหากตรวจพบสารทสนใจในตวอยาง ไดทความเขมขนสาหรบการกากบดแล (Regulatory Limit) คอสามารถใหผลทดสอบเปน “ผลคดกรอง บวก” หรอ “screen positive” การพสจนความใชไดขนตอนตน (initial validation) และขนตอนเสรม (abridged validation) มวตถประสงคหลกเหมอนกน คอวธทดสอบตองสามารถตรวจสารไดทระดบความเขมขนสาหรบการกากบดแล โดยทขนตอนตนระบวาวธทดสอบสามารถใชตรวจ ชนดตวอยาง ชนดสตว ชนดสาร ไวในขอบเขตของขนตอนปฏบตงานวธทดสอบ (SOP) ดวย อยางไรกตามวตถประสงครองลงมา อาจแตกตางไดบางขนกบวาเปนการพสจนขนตอนตน (initial validation) หรอเปนขนตอนเสรม (abridged validation) 3.2.2 การเลอกชนดสารในการพสจนความใชได และการเลอกวธทดสอบ (Choice of analytes used for validation and selectivity of the method) การเลอกชนดสารทจะทาการศกษา ในการพสจนความใชไดขนกบการกาหนดขอบเขต (Scope) ใน SOP ของวธทดสอบคดกรองทตองการพสจนความใชไดทงขนตอนตน และขนตอนเสรม ถาวธทดสอบคดกรองนน ไมสามารถแยกแยะชนดสาร/ยาในกลมเดยวกนได (เชนกลมเตตราไซคลน กลมเบตาแลคแตม) ตองดาเนนการพสจนความใชไดกบทกชนดสารในกลม หรอโดยใหสอดคลองกบชนดสารทกาหนดไวในแผนการตรวจตดตามสารตกคาง (Monitoring plan) หรอ โดยการศกษาสารทคดเลอกมาเพอเปนตวแทนของกลมทตองการพสจนความใชไดของวธคดกรอง 3.2.2.1 วธทดสอบสารปฏชวนะตกคางหลาย ๆ กลม ดวยเทคนคการยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย (Multi-class methods using inhibition tests) การทดสอบหาสารปฏชวนะตกคางหลาย ๆ กลม ดวยเทคนคการยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย อยางนอยทสดตองเลอกสารหนงชนดเปนตวแทนจากแตละกลม เชน จากกลมเตตราไซคลน กลมซลโฟนาไมดส กลมเบตาแลคแตม กลมอมโนกลยโคไซดส กลมแมคโครไลดส เปนตน และควรทราบและคานงถงคณสมบตของสารหรอยา แมวาจะจดอยในกลมเดยวกนกตาม แตมลกษณะการตอบสนองตอเชอไดไมเหมอนกน (activity profile) ดงนนจงควรตองมการศกษานารองเปนสงสาคญเพอจะไดทราบขอมลลกษณะการตอบสนองของสารแตละชนดในแตละกลมยาคราว ๆ กอน โดยสารตวแทนทจะเลอกมาศกษาควรสอดคลองกบสารทกาหนดไวในแผนการตรวจตดตามสารตกคาง โดยการใชสารละลายมาตรฐาน ทความเขมขนระดบตาง ๆ โดยองกบคา MRL และทาการศกษาลกษณะการตอบสนองโดยคดเลอกสารละลายมาตรฐาน อยางนอย หนง – สองชนด ตอกลมยา เพอใชขอมลวางแผนการพสจนความใชไดตอไป

หนา 45


การเลอกชนดสารเพอเปนตวแทนของกลมควรจะตองเปนสารทมความไวนอยทสด คอ ตงคาเปาหมายในการคดกรอง ใหไดใกลคาในการกากบดแลมากทสด กรณทสารแตละชนดในกลมมคา MRL เทากน เชนกลมเตตราไซคลน ใหเลอกมาหนงชนดทมความไวนอยทสด ยกตวอยาง จากขอมลการศกษาของหองปฏบตการอางองแหงยโรป ทฝรงเศส วธทดสอบคดกรองดวยเทคนคตรวจการยบยงการเจรญของเชอจลนทรยดวยอาหารเลยงเชอหลายชนด (multi-plate method) พบวาสารออกซเตตราไซคลนมความไวนอยทสด สาหรบกรณสารในกลมมคา MRL แตกตางกน เชนกลมเพนนซลลน ควรตองพสจนสารหลายชนด (เนองจากคา MRL ไมเทากน) และตองกาหนดคาเปาหมายในการคดกรองใหสอดคลองกบคา MRL ของแตละสาร ยกตวอยางเชน ในกลมเพนนซลน พบวา แอมพซลน และคลอกซาซลน มความไวนอยทสด จงเลอกสองสารนมาเปนตวแทนของกลม โดยกาหนดคาเปาหมายในการคดกรองตางกนตามคา MRL ของสารทงสอง เปนตน 3.2.2.2 วธทดสอบสารตกคางหลาย ๆ กลม ดวยเทคนคทางชวเคมวเคราะห (Multi-class methods using biochemical tests) สาหรบวธคดกรองดวยเทคนคทางชวเคม เชน ELISA ทตรวจสารหลายชนดในกลม โดยทมการเกดปฏกรยาขามกบสารหลายชนด (cross reactivity) ตาง ๆ กน ถาใน SOP วธทดสอบกาหนดขอบเขตใหครอบคลมทกสาร ดงนนขอมลการพสจนความใชไดขนตอนตนตองเพยงพอทจะแสดงวาวธ (ชดทดสอบ) นสามารถสกดและตรวจพบสารไดทกชนดไดจรงหรอไม โดยทวไป ผผลตชดทดสอบ มกไมใหขอมลวา ปฏกรยาขามระหวาง แอนตเจน กบ แอนตบอด เกดขนในตวกลางอะไร คอจากสารมาตรฐานในสารละลาย (บฟเฟอร) หรอ ในของเหลวจากรางกาย (biological matrix) กรณทมขนตอนการสกดตวอยาง คาการกลบคนจงไมจาเพาะตอสาร ดงนนจงเปนปญหาในการคานวณคาความสามารถในการตรวจ (detection capabilities, CC) ของแตละสารทมปฏกรยาขามตอกนโดยการใชคา CC จากสารทใชเปนตวแทน คาความสามารถในการตรวจ (Detection capabilities, CC) จงควรหาเฉพาะสารเดยว หรอเฉพาะสารทเลอกมาเปนตวแทน (ซงควรเลอกสารทเกดปฏกรยาขามกบสารอน ตาทสด) กรณทชดทดสอบไมจาเพาะตอสารเดยว (เชน ชดทดสอบตรวจกลมซลโฟนาไมดส เปนตน) ควรตองศกษาการเกดปฏกรยาขามตอสารอน ๆ ดวย แลวจงสามารถหาคาความสามารถในการตรวจ (detection capabilities, CC) ของสารอน ๆ ไดโดยคานวณจากคา CC ของสารทเปนตวแทนสมพนธกบคารอยละการเกดปฏกรยาขามกนของแตละสาร 3.2.2.3 วธทดสอบสารตกคางหลาย ๆ กลม ดวยเทคนคทางฟสกสเคม (Multi-class methods using physicochemical screening techniques) การตรวจสารโดยเทคนคทางฟสกสน สามารถแยกระบชนดสารไดโดยคณสมบตทางเคมของสารนน ๆ ดงนนในแตละกลมยา หรอกลมยอย ใหเลอกตวแทนกลมมาอยางนอย 1 สาร (เชน ในกลมควโนโลน แบงกลมยอยออกเปน acidic compound และ amphoteric compound ดงนนจงตองเลอกสารตวแทนของกลมยอย) เพอพสจนความใชได กรณทใชการคดกรอง ดวยเทคนค LC-ToF- MS นน ถงแมสารตาง ๆ จะถกคดแยกและชะออกมาในเวลา (Retention time) ทตางกนกตาม แตกอาจมสารประกอบอน ๆ ทถกชะออกมาพรอมกบสารทสนใจ เปนสาเหตใหเกดผลกระทบหรอสญญาณรบกวนตอไอออนแตกตางกนได เชน

หนา 46


เกดการกดสญญาณไอออน (ion suppression) หรอ การเสรมสญญาณไอออน (ion enhancement) จงแนะนาใหศกษาและทดสอบสารทกชนด แมวาบางสารจะมคณสมบตทางฟสกสเคมทคลายคลงกนกตาม 3.2.2.4 สรป เกณฑในการคดเลอกสารมาเพอพสจนความใชไดของวธทดสอบคดกรอง กรณ วธทดสอบดวยเทคนคการยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย

เลอกสารยบยงเชอตาทสด กรณ วธทดสอบดวยจานอาหารเลยงเชอหลายชนด (multi-plate)

เลอกทดสอบสารปฏชวนะทสนใจกบจานอาหารเลยงเชอทไวกบเชอทสด กรณ วธทดสอบดวยเทคนคทางภมคมกนวทยา (Immunology tests)

เลอกสารทมคาเกดปฏกรยาขามตอกนตาทสด กรณ วธทดสอบเชงการวดปรมาณคราว ๆ ทมขนตอนการสกดดวย

เลอกสารทไดคาการกลบคนตาสด (lowest recovery) ตองทดสอบทกสาร หากพบวาเกดการกดสญญาณไอออน

3.2.3 การเตรยม เนอเยอเลยนแบบ “simulated tissue” สาหรบการพสจนความใชไดของวธทดสอบดวยเทคนคการยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย กรณวธทดสอบดวยเทคนคชวเคม หรอ ฟสกสเคม ตลอดจนวธทดสอบดวยเทคนคการยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย หากมขนตอนการสกดตวอยางกอนนาไปทดสอบนน การเตรยมตวอยางเพอพสจนความใชไดนนไมยงยาก เพราะสามารถใชวธการเตมสารมาตรฐาน (spiking) ใหไดความเขมขนตามตองการลงใน matrix หรอของเหลวทสกดออกมาจากตวอยางไดโดยตรง แตถาวธทดสอบดวยเทคนคการยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย ทใชตวอยางทมลกษณะแขง (solid matrices) เชน ชนสวนแผนเนอเยอ ไดแก กลามเนอ ไต เปนตน วางลงบนจานอาหารเลยงเชอโดยตรง โดยไมมขนตอนการสกดกอน ในกรณเชนน จะมอปสรรค จงจาเปนตองเตรยม “ตวอยางเลยนแบบ หรอ simulated tissue” เพอเลยนแบบใหแสดงพฤตกรรมใกลเคยงเนอเยอทมสารอยจรง ๆ (incurred tissue) ใหมากทสด โดยการเตมสารในระดบความเขมขนทสนใจ ลงในตวอยาง โดยวธนได matrix effect จากเนอเยอจรงทอาจมอทธพลตอผลการทดสอบรวมเขามาดวยแลว โดย วธการเตรยม “ตวอยางเลยนแบบ” สามารถทาได 2 แบบ คอ แบบท 1 โดยบดเนอเยอใหละเอยด เตมสารมาตรฐาน (ใหไดความเขมขนทตองการ) ลงในตวอยาง เตรยมใหเปนเนอเดยวกน (homogeneous) นาไปแชแขง แลวจงนาตวอยางเนอเยอแชแขง มาเจาะเปนแทงทรงกระบอก ฝานเปนชน วางลงบนจานอาหารเลยงเชอโดยตรง ซงวธการนมขอดอย เนองจากเทคนคการทดสอบตองการของเหลวจากเนอเยอ เพอจะหยดลงบนแผนกระดาษ หรอ paper disc จนชม แตเนอบดแชแขงทเตรยมโดยวธดงกลาวนจะใหนาเนอเยอออกมานอย ไมพอทจะทาใหกระดาษชม ทาใหผลทดสอบไมถกตอง หรอ กรณ “ไต” วธการเตรยม

หนา 47


แบบนไมเหมาะ เนองจากระหวางขนตอนการบด สวนประกอบในเนอเยอไต (endogenous components) จะถกปลอยออกมารบกวนผลทดสอบมาก ทาใหเกด ผลบวกเทยม ซงไมตองการ แบบท 2 โดยการใชแผนกระดาษวางบนจานอาหารเลยงเชอ แลวหยดสารละลายมาตรฐานทสนใจ กระดาษจะยงชมอย แลวจงวางชนเนอประกบทบลงไป ในลกษณะแซนวช (อาหารเลยงเชอ-แผนกระดาษ-ชนเนอ) ซงวธการน เปนการเลยนแบบและยงคงรกษาสภาพตวอยางไดใกลเคยงสภาพจรงของเนอเยอมากกวาแบบท 1 3.3. ขนตอนการพสจนความใชได (Validation Procedure) 3.3.1 การหาคาความจาเพาะ และ คาความสามารถในการตรวจ (CC) ตามแนวทางเดม (conventional/classical approach) 3.3.1.1 จานวนตวอยางทตองใชในการพสจนความใชได จานวนตวอยางทตองใช สาหรบเปนตวอยางควบคมการคดกรอง “ผลบวก” คอตวอยางทเตมสารทสนใจทคาความเขมขนเปาหมาย สาหรบสารแตละชนดนน ขนกบระดบความเชอมนของผลทดสอบทตองการ (ในการคดกรองกาหนด -error = 5%) และความสมพนธของคาเปาหมายกบคาในการกากบดแล คอถาคาเปาหมายในการคดกรองตากวาคากากบดแลมาก ใชจานวนซาของตวอยาง นอยกวา (โดยทยงใหผลทดสอบทระดบความเชอมนเทากนในการคดกรอง ทจะใหผลทดสอบทตรวจพบสารในตวอยางไดอยางถกตอง ทระดบคาในการกากบดแล) ดงตวอยางตอไปน ถาเรมตนกาหนดคาเปาหมายในการคดกรองท ½ MRL ทาการทดสอบ จานวน 20 ตวอยางทเตมสารทสนใจ (เรยกวา ตวอยางควบคม ผลบวก) ทคา ½ MRL เมอผลทดสอบคดกรอง เปน ผลบวกทง 20 ตวอยาง หรอ 19 ตวอยาง โดยมเพยง 1 ตวอยางจาก 20 ตวอยางท ผลคดกรอง เปน “ผลสอดคลองกบเกณฑเทยม” (false- compliant) ซงไมเกน 5% สามารถสรปไดวา CC ของวธทดสอบน มคาตากวา คา MRL (regulatory/action limit) และตากวา หรอ เทากบ ½ MRL ถา กาหนดคาเปาหมายในการคดกรองทความเขมขนสงขน คอระหวาง 50 – 90 % ของ MRL จะตองทดสอบ “ตวอยางควบคมผลบวก” เพมขน เปน 40 ตวอยาง ถาผลทดสอบ เปน “ผลสอดคลองกบเกณฑเทยม” ไมเกน 2 ตวอยาง จาก 40 ตวอยาง (หรอ ไมเกน 5 %) สามารถสรปไดวา คา CC เปนคาทนอยกวาคา MRL ได แตถาพบวา คาเปาหมายในการคดกรองตองขยบขนใกลคา MRL มาก (คอ ตากวาคา MRL 10 %) จะตองทดสอบ “ตวอยางควบคมผลบวก” เพมขนถง 60 ตวอยาง โดยทผลทดสอบ เปน “ผลสอดคลองกบเกณฑเทยม” ไดไมเกน 3 ตวอยาง จาก 60 ตวอยาง (ไมเกน 5 %) เพอพสจนวาวธทดสอบนบรรลวตถประสงคในการคดกรองท คาในการกากบดแล (MRL)

หนา 48


การทดสอบตวอยางจานวนมากเชนน ควรแบงทยอยทาการทดสอบ เชน ทดสอบครงแรก 20 ตวอยาง คแรก (20 blank, 20 positive control samples) ถาผลทดสอบไดตากวาคา Cut-off เกน 1 ตวอยาง สรปวาวธทดสอบนใชคดกรองไมได ตองขยบคาเปาหมายในการคดกรองใหสงขน และเรมตนทาการพสจนความใชไดใหม ถาตองการใชวธทดสอบคดกรอง ชนดเนอเยอเดยวกน สมมตเปน “กลามเนอ” แตตองการทดสอบกลามเนอของสตวหลายชนด ใหออกแบบกระจายจานวนตวอยางจากสตวชนดตาง ๆ ดงน คอ จานวน 60 ตวอยาง แบงเปนใช เนอสกร 20 ตวอยาง เนอโค 20 ตวอยาง และ เนอไก 20 ตวอยาง ในการทดสอบ เปนตน 3.3.1.2 การหาคาระดบ Cut-Off และการคานวณคา CC วธทดสอบคดกรองทงแบบเชงคณภาพ/คณลกษณะ หรอ เชงการวดปรมาณคราว ๆ กตาม ตองการทราบคา Cut-off ของวธ เพอใชตดสนวา ถามการตอบสนองเทากบ หรอ สงกวาคา Cut-off รายงานผล เปน “ผลคดกรองบวก” และสงไปทดสอบตอดวยวธทดสอบเทคนคฟสกสเคมเพอยนยนผล การหาคา Cut-off ของวธเชงการวดปรมาณคราว ๆ ทาได 2 แนวทาง สาหรบวธคดกรองดวยเทคนคการยบยงเชอ คา Cut-off ประเมนไดจาก ขนาดความกวางของบรเวณทเชอไมสามารถเจรญขน (inhibition zone) เกณฑตองมากกวา 2 มลลเมตร (จากขอบ) จงตดสน เปน “ผลคดกรอง บวก” และทกตวอยางทเตมสารทความเขมขนเปาหมาย ตองใหขนาด Zone มากกวา 2 มลลเมตร ผลทดสอบคดกรอง จงเปน “ผลบวก” การกาหนดคา cut-off เรมจากการเตมสารทสนใจในตวอยางทคาเปาหมาย (x1)ในการคดกรอง ท ½ MRL ถาผลทดสอบไมผาน (คอ ไดผลทดสอบ “ผลสอดคลองกบเกณฑเทยม” มากกวา 1 ตวอยาง จาก 20 ตวอยาง) แสดงวาตองเปลยนคาความเขมขนใหสงขน โดยเลอกคาเปาหมายระหวาง 50 – 100 % ของคา MRL เลอกตวอยาง (หนงชนดเนอเยอ) เชน เนอโค การหาคา CC และความจาเพาะตอสารทนาเชอถอ ตองทดสอบอยางนอย 60 ตวอยาง โดยการทดสอบ ตวอยางปลอดสาร 60 ตวอยาง และ ตวอยางเตมสาร 60 ตวอยาง ตอ หนงชนดสาร ถาวธทดสอบคดกรองนนตรวจสารไดหลายชนด จะตองทดสอบใหครบทกสาร หรออยางนอยทสดทดสอบแตละสารทคดเลอกเปนตวแทนของกลม วธการ ขนท 1 ตวอยางปลอดสาร จานวน 60 ตวอยาง เตมสารทสนใจ ทความเขมขน x1 ขนท 2 ทดสอบ ตวอยางเตมสาร 60 ตวอยาง และ ตวอยางปลอดสาร 60 ตวอยาง ตาม SOP

หนา 49


วางแผนกระจายแบงการทดสอบตวอยางเหลานไปหลาย ๆ วน โดยผลดเปลยนตวนกวเคราะหดวย และพยายามทดสอบในสภาวะหรอเงอนไขตาง ๆ ใหครบตามทกาหนดใหใชในวธทดสอบ และควรปกปดไมใหนกวเคราะหทราบวากาลงทดสอบตวอยางอะไร (blind sample) ขนท 3 แนวทางท 1 (ดตวอยาง 1 และ 2 ภาคผนวกท 3) ทดสอบตวอยางปลอดสาร 20 ตวอยาง และ ตวอยางเตมสาร 20 ตวอยาง หาคาผลการตอบสนองของตวอยางปลอดสาร และ ตวอยางเตมสาร คาตอบสนองทมคาตาสดจากตวอยางเตมสาร เปนคา cut-off โดยทคาตาทสดนไมคาบเกยวกบคาตอบสนองสงสดจากตวอยางปลอดสาร

แนวทางท 2 (ดตวอยาง 3 ภาคผนวกท 3) ใชเกณฑทางสถต กาหนด -error 5 % โดยใหหาคาผลการตอบสนองของตวอยางปลอดสาร (Bi) แตละตวอยาง แลวคานวณคาเฉลย (B) และคาเบยงเบนมาตรฐาน (SDb) จากนนคานวณคา “ขดเรมเปลยน” (Threshold value) หาคาตอบสนองของตวอยางเตมสาร แตละตวอยาง (Yi) แลวหาคาเฉลย (M) คาเบยงเบนมาตรฐาน (SD) จากนนคานวณคา “cut-off” factor (Fm) คาขดเปลยนเปนผลบวก (Positively threshold, T) และคา “cut-off” factor (Fm) เปนความจาเพาะของแตละชนดเนอเยอ (matrix-specific) ขนท 4 นบจานวนตวอยางเตมสาร ทผลทดสอบตากวาคา cut-off ถามมากกวา 3 จาก 60 ตวอยาง (เกน 5 %) แสดงวาคาความเขมขนเปาหมายทเตมในตวอยางเพอการคดกรองนนตาเกนไป ทงนเนองจากคาความเขมขนเปาหมายในการคดกรองนไมสามารถใหผลตอบสนองสงกวาคา cut-off ทจะใหผลทดสอบเปน “ผลคดกรอง บวก” ได ถา กาหนดคา x1 = คา MRL คอตวอยางเตมสาร ทความเขมขน x1 ถาผลทดสอบปรากฏวา มมากกวา 3 ตวอยางจาก 60 ตวอยาง ไดคาตากวา Cut-off ผลการพสจนความใชไดสรปวาวธทดสอบนใชไมได ไมบรรลวตถประสงคเนองจากไมสามารถคดกรองไดตามเกณฑ (ทคา x1 = MRL) คอ มผลสอดคลองกบเกณฑเทยม เกน 5 % ดงนนจงตองปรบปรงวธทดสอบใหมประสทธภาพดกวาเดม แลวทาการพสจนความใชไดใหม แตถา กาหนดคา x1 = ½ MRL คอตวอยางเตมสาร ทความเขมขน x1 ถาผลทดสอบปรากฏวา มมากกวา 3 ตวอยางจาก 60 ตวอยาง ไดคาตากวา Cut-off ผลการพสจนความใชได แสดงวาควรเพมคาความเขมขนทเตมในตวอยาง (เชน เพมเปน ¾ MRL) แลวทาการทดสอบใหม ขนท 5 การคานวณคา CC จากการทดสอบตวอยางเตมสาร 60 ตวอยาง (หรอ ตวอยางทมสารอยแลว incurred sample) ทเตมสารทสนใจทคาความเขมขนเปาหมายในตวอยาง แลวไดผลทดสอบ เปน “ผลผานเกณฑเทยม” 3 จาก 60 ตวอยาง และทคาความเขมขนในการกากบดแล (MRL) ดวย ดงนน“คาความเขมขนเปาหมายทใชเตมสารในการทดสอบครงน คอ คาความสามารถในการตรวจ (Detection capability, CC) ของวธทดสอบคดกรองน

หนา 50


3.3.1.3 การใชงาน (Applicability) และความทนทาน (ruggedness) ของวธทดสอบคดกรอง การใชงาน (Applicability) โดยทวไป เนอเยอชนดเดยวกน (จากสตวตางชนด) คา MRL เทากน แตคา MRL สาหรบ เนอเยอตางชนด แมในสตวชนดเดยวกน จะแตกตางกน เชนคา MRL ในไต อาจมากกวา ในตบ และ MRL ในตบอาจมากกวา ในกลามเนอของสตวชนดเดยวกน เปนตน ดงนนหากทาการพสจนความใชไดขนตอนตน ยกตวอยาง เมอไดคา CC ของสารทตองการตรวจในชนดเนอโค ของวธทดสอบแลว ไมสามารถยดเอาคา CC สาหรบเนอโค มาเปนคาสาหรบเนอสกรได เนองจากเนอของสตวตางชนดใหสญญาณรบกวน (interfering matrix effect) ไมเหมอนกน จงตองทาการทดสอบใหมเพอหาคา CC สาหรบ “เนอเยอ” ใหม เสมอทกครงไป และสาหรบทกสารทกาหนดไวในแผนการตรวจตดตามสารตกคาง หรออยางนอย ตรวจสารตวแทนของแตละกลมยา การออกแบบการพสจนความใชได ยกตวอยาง: ชนดเนอเยอเหมอนกน เชน กลามเนอ ของสตว 4 ชนด (สกร ไก หาน ปลา) มคา MRL เทากน และเทากนกบเนอเยอของสตวชนดแรก (original matrix) ทไดทาการพสจนวธขนตอนตนไวแลว (สมมตเปนเนอโค) โดยคา CC หาไดจาก 20 ตวอยาง (แบง 5 ตวอยาง ตอ ชนดสตว) โดยทดสอบ ตวอยางปลอดสาร 20 ตวอยาง และตวอยางเตมสาร 20 ตวอยาง ทเตมสารทความเขมขนเปาหมาย เทากบทไดจากการทดสอบไวของขนตอนตน (ในเนอโค) ผลทดสอบของตวอยางปลอดสาร ทง 20 ตวอยาง แสดง “ผลคดกรอง ลบ”ตอสารตกคางทตองการตรวจ ถา ผลทดสอบ ของ 20 ตวอยางเตมสาร ให “ผลคดกรอง บวก” ทงหมด คอ เกนคา Cut-off หรอ มเพยง 1 จาก 20 ตวอยาง มคาตากวา cut-off กตาม แสดงวธทดสอบนสามารถใชงานไดกบเนอของสตวทง 4 ชนดททาการทดสอบ โดยทคา CC คอคาความเขมขนเดยวกนกบทไดจากการพสจนความใชไดของขนตอนตน (ในเนอโค) แตถา ม 2 ตวอยางขนไป จาก 20 ตวอยางเตมสาร (คอเกน 5 %) ให “ผลคดกรอง ลบ” แสดงวา คา CC ของเนอโค ไมสามารถนามาใชกบเนอของสตวอก 4 ชนด และคา CC ของสตวชนดอน ๆ สงกวาของเนอโค โดยตองเพมคาความเขมขนเปาหมายในการคดกรองสงขนอก แลวทาการพสจนความใชไดแบบเตมรปแบบใหมหมด การขยายการใชงานของวธทดสอบไปยงเนอเยออน และ/หรอ สตวชนดอน ๆ เมอไดคา CC สาหรบเนอเยอชนดหนงแลว และตองการขยายไปตรวจชนดเนอเยออน ๆ และ/หรอของสตวชนดอน ๆ ตอไปอกดวย ซงสงรบกวนจากเนอเยอตางชนดยอมแตกตางกน จงไมสามารถใชคา CC ทมอยกบเนอเยอชนดใหมได จงตองทาการพสจนเพม โดยใชวธแบบผสมผสานทกชนดเนอเยอ Matrix-comprehensive ทแนะนาไวในบทท 3.1.3 ในภาคผนวกของแนวมต 2002/657/EC หา CC สาหรบเนอเยอ หรอ ชนดสตวตาง ๆ หรอ โดยทดสอบตวอยางปลอดสาร 20 ตวอยาง (เชนตบสกร 20 ตวอยาง) และตวอยางตบสกร

หนา 51


ทเตมสารท คาเปาหมายในการคดกรอง โดยทดสอบสารแตละชนด หรอสารตวแทนของกลม อานผล ตามทอธบายไวขางตน ในกรณพสจนความใชไดของเนอเยอแรกกบสารทกชนด เมอตองการขยายเพอตรวจเนอเยอตางชนดกตองทาการทดสอบสารใหครบทกชนดอก หรอตรวจเพยงสารทเปนตวแทนของกลมกไดถาไมมการรบกวนจากเนอเยอ (matrix effect) แตถาการพสจนความใชไดครงแรกศกษาเฉพาะรายการสารทเปนตวแทนแตละกลม ดงนนตองศกษารายการชนดสารทเหมอนกนกบการพสจนครงแรก สาหรบในเนอเยอชนดใหม โดยทงสองกรณน การเลอกชนดสารควรตองสอดคลองกบชนดเนอเยอดวย เชน สารชนดหนงทศกษาไวในเนอโค ไมสามารถใชไดกบเนอแกะ เพราะสารทศกษาไวนไมอนญาตใหใชกบแกะ เปนตน ดงนนจงตองมความรความเขาใจเกยวกบกฎระเบยบ หรอเกณฑ คา MRL ในเนอเยอตาง ๆ เชน เนอ ตบ ไต ไขมน นม ไข นาผง ของสตวชนดตาง ๆ เชน สตวปก สกร โค แพะ แกะ ปลา กง เปนตน ทงของภายในประเทศ ตลอดจนประเทศคคาตาง ๆ และ/หรอ ของ CODEX ทเกยวของเปนอยางดเพอใชประกอบการออกแบบ วางแผนการพสจนความใชไดอยางเหมาะสม จะไดไมเสยเวลา เสยทรพยากรหากวางแผนไมด ความทนทาน Ruggedness (minor variations) การศกษาความทนทานของวธทดสอบ โดยศกษาผลกระทบเมอมการทดลองปรบระดบตวแปรเพยงเลกนอย (minor variations) โดยออกแบบการทดลองตามคาแนะนาของมต 2002/657/EC และเนองจากชนดเนอเยอ กเปนตวแปรหนง ดงนนควรควบรวมการศกษาขอบเขตการใชงาน (application) และ ความทนทาน (ruggedness) ของวธทดสอบไปในคราวเดยวกน การศกษาความทนทาน โดยเลอกสารตวแทนมาศกษาชนดเดยวกเพยงพอ ทาการทดสอบตวอยางปลอดสาร อยางนอย 10 ตวอยาง และ ตวอยางเตมสาร 10 ตวอยาง โดยเตมสารทระดบความเขมขนทสนใจ หรอใชตวอยางทมสารตกคางอยแลว (incurred) ศกษาสมรรถนะของวธโดยหาคาความสามารถในการตรวจ (CC) และความจาเพาะตอสารทสนใจ และทาการทดสอบโดยไมใหผทดสอบทราบ (blind test/unknown samples) และถาเปนไปได ควรสลบเปลยนตวผทดสอบ และทาการทดสอบตางวน การคดเลอกตวอยาง ควรพยายามใชตวอยางทแตกตางกน เชนตางแหลงทมา เพศ อายสตว เปนตน เพอเปนตวแทนของ matrix effect ใหไดหลากหลายทสดเทาททาได ถาผลทดสอบแสดงใหเหนวา ตวแปรใดมอทธพลตอผลทดสอบ (CC และ/หรอความจาเพาะ) ตองศกษาคณลกษณะแสดงสมรรถนะของตวแปรนน ๆ และอธบายไวในรายงานการพสจนความใชไดของวธทดสอบดวย 3.3.1.4 ความเสถยร (Stability) ถามขอมลความเสถยรของสาร หรออางองไดจากแหลงวชาการทเคยทาการศกษาไวแลว กไมจาเปนตองศกษาซา แตถาไมม ตองศกษาความเสถยรของสารในสารละลายมาตรฐาน (standard solution) และในสารเหลวของรางกาย (biological matrix) ตามแนวมต CD 2002/657/EC

หนา 52


3.3.2 การหาความจาเพาะ และคาความสามารถในการตรวจ CC ตามแนวทางใหม การออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ทสามารถครอบคลมชนดตวอยางเนอเยอ หลายชนด ตามคาแนะนา บทท 3.1.3 ภาคผนวก ของมต 2002/657/EC โดยทางการเลอกใชปจจยตาง ๆ (factor-level combination) นจะลดจานวนชดการทดสอบในการพสจนความใชไดลงไดมาก วธการ ใชตวอยาง 8 ตวอยาง ออกแบบทดสอบทางสถตในภาคผนวกบทท 3.1.3 ตามแนวมต 2002/657/EC เมอทาการพสจนความใชไดของขนตอนตนเสรจ หลงจากนนตองทา Quality assurance (QA) อยางนอย 20 ตวอยาง/ป ตามวตถประสงคของการพสจนความใชได แตถาทาไมไดจาเปนตองพสจนซาอกโดยใชตวอยาง 8 ตวอยาง และตวอยาง QA มากทสดเทาทเปนไปได เมอไดผลทดสอบของตวอยาง QA ในหนงป เปรยบเทยบผลกบผลรวมของการพสจนความใชไดของหองปฏบตการตนตารบ และ/หรอ กบขอมลการพสจนความใชไดของหองปฏบตการทโอนวธทดสอบไปใช 3.4. การถายโอนวธทดสอบเบองตนไปใชทหองปฏบตการอน ๆ วตถประสงคของการพสจนความใชไดขนตอนเสรม (แบบสน) เพอแสดงวาหองปฏบตการทรบโอนวธทดสอบไปใชงานนนยงคงสามารถใชงานวธทดสอบไดอยางถกตองตาม SOP โดยไมมการเบยงเบนไปจาก SOP ตนตารบ สวนวธทดสอบเทคนคทางฟสกสเคม (LC-MS/MS) และ ทางชวเคมนน (ELISA) เครองมอทใชอาจแตกตางกนได สงผลใหผลทดสอบแตกตางกนไดมาก แมวาการพสจนความใชไดของขนตอนตนกบ ขนตอนเสรม มวตถประสงคหลกเพอทราบสมรรถนะของวธทดสอบจะเหมอนกนกตาม หวขอตอไปนจะเนนขนตอนการพสจนความใชได (แบบสน) โดยหองปฏบตการเมอรบโอนวธทดสอบไปใชงาน 3.4.1 เงอนไขการถายโอนวธทดสอบ เมอหองปฏบตการตนตารบทาการพสจนความใชไดของวธทดสอบ (ขนตอนตน) เสรจแลว หองปฏบตการทรบโอนวธไปใชตอ ใหทาการพสจนความใชไดเพมเตมแบบสน โดยท หองปฏบตการผรบโอน ตองมเครองมอทจาเปนและผทดสอบมความรความสามารถใชวธ

ทดสอบได หองปฏบตการผรบโอน ตองเขาถง SOP วธทดสอบฉบบเตมและขอมล/รายงานผลการ

พสจน ความใชไดท (หองปฏบตการตนตารบ) ทาไวในขนตอนตน ตองใชวธทดสอบและปฏบตตามทระบใน SOP (ชนดเนอเยอ การเตรยมตวอยาง เทคนคการ

วด การกาจดสงรบกวน เครองมอทสาคญ) และใชงาน ทคา cut-off เดยวกน แตถาใชเครองมอวเคราะหจากผผลตแตกตางกบหองปฏบตการตนตารบ หองปฏบตการผรบ

โอนตองตรวจสอบวาการใชเครองมอทตางกนนจะสงผลกระทบมากหรอไม ถาไม และสามารถปฏบตงานไดตรงตามขนตอน SOP ของหองปฏบตการตนตารบ เชน เทคนคชวเคม การใชเครองมอเชน ELISA เครองอาน และเครองลางไมโครเพลททแตกตางกนไมกระทบตอผลการทดสอบ แตควรใชชดทดสอบเหมอนกบทหองปฏบตการตนตารบใช แตถาเครองมอวเคราะห

หนา 53


เปนจดวกฤต อาจปรบเปลยน SOP ไดบางเลกนอย เพอใหไดคณลกษณะทแสดงสมรรถนะเทาเดม ถาหองปฏบตการผรบโอนวธไปใชสามารถปฏบตตามขนตอน SOP ของหองปฏบตการตน

ตารบไดจรง จงทาการพสจนความใชไดของวธทดสอบแบบสนได แตถาไมสามารถปฏบตตามไดกตองทาการพสจนความใชไดเตมรปแบบ การเลอกชนดสารในการพสจนแบบสนตามทไดทาการพสจนไวในขนตอนตน โดย

หองปฏบตการตนตารบ หลกการทวไปใหเลอกใช สารทใหผลไมดทสด (worst-case example) แตถาโอนวธไปใชในตางประเทศซงการใชชนดยาปฏชวนะแตกตางกน ควรตองพสจนยา

ชนดทตางออกไปนเพมดวย ถาขอมลจากหองปฏบตการตนตารบแสดงวามความแปรปรวนของยาในกลมเดยวกน และเพอออกแบบการพสจนวธแบบสนใหเหมาะสม ชนดสารทเลอกตองอยในขอบเขตของวธทดสอบตนตารบ ถาหองปฏบตการผรบโอน ตองการดดแปลงวธทดสอบคดกรองเพอขยายการใชงาน

ตรวจสารอน ในชนดเนอเยออน เพมขนจากเดม จะตองพสจนวธเตมรปแบบ หองปฏบตการทจะรบโอนวธไปใช ศกษาประสทธภาพของวธ หรอ ชดทดสอบ จากขอมล

รายงานผลการทดสอบจากหองปฏบตการตนตารบ หรอบรษทผผลตชดทดสอบ หรอจาก องคกรตาง ๆ ทกากบมาตรฐานระดบชาต และนานาชาต เชน ISO, AOAC, AFNOR กอนทาการพสจนความใชไดแบบสน ผทดสอบควรผานการฝกอบรม มความร ความ

เขาใจ จนมความสามารถทาการทดสอบไดถกตองตามขนตอน SOP และตองทา “ตวอยางควบคมผลลบ” และ “ตวอยางควบคมผลบวก” เพอแสดงความสามารถในการทดสอบตาม SOP ของผทดสอบดวย

3.4.2 การพสจนความใชไดขนตอนเสรม (แบบสน) ตามแนวทางเดม (classical concept) เพอยนยนวาหองปฏบตการผรบโอนวธทดสอบมาใชงานไดอยางถกตองเชอถอได โดยทาการ

พสจนความใชไดเพมเตมเทาทจาเปน (แบบสน) พารามเตอรทตองหา คอ คาความจาเพาะ (specificity) และ คาความสามารถในการตรวจ (detection capability,

CC) เทานน โดยการทดสอบ 20 ตวอยาง ทคาเปาหมายในการคดกรอง แลวเปรยบเทยบคณลกษณะ

แสดงสมรรถนะทงสองนกบคาทไดจากการพสจนไวแลวในขนตอนตน ถาผลทดสอบไดสมรรถนะเหมอนกน แสดงวาวธทดสอบนใชไดตามวตถประสงค แตถาคาแสดงสมรรถนะตางจากตนตารบ แสดงวาการทางานของวธทดสอบไมถกตอง ใหปรกษาขอคาแนะนาเพอแกไขปญหาหรอเพอปรบปรงวธจากหองปฏบตการตนตารบ

3.4.3 การพสจนความใชไดขนตอนเสรม (แบบสน) ตามแนวทางใหม (alternative concept) (ตวอยางท 4 ภาคผนวกท 3) การพสจนความใชไดแบบสนตามหลกการแนวทางเลอกใหม ดวยการรวมขอมลของการ

พสจนในขนตอนตนกบขอมลทเพมขนจากการพสจนความใชไดในขนตอนเสรม (แบบสน) แนวทางนทาใหลดภาระงาน การรวมขอมลจะทาไดตอเมอพบวาขอมลไมแตกตาง ถาคาทาซา

หนา 54


ไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (in house reproducibility) โดยหองปฏบตการผรบโอน มากเกน 1.5 เทาของคา in house reproducibility จากการพสจน ฯ ขนตอนตน หองปฏบตการผรบโอนจะตองตรวจสอบวาไดปฏบตตามขนตอนวธทดสอบ (SOP) ถกตองหรอไม เพอลดภาระงาน ใชการรวมการพสจนความใชได โดยใชหลกสถตออกแบบการพสจน

เพมเตมแบบสนใหไดเทยบเทากบการพสจน ฯ จากขนตอนตน โดยทาการทดสอบทความเขมขนระดบเดยว โดยการใช จานวน 8 ตวอยาง เตมสารทความเขมขน เทากบ หรอ ใกลคา MRL และทาตวอยางเพอความมนใจในคณภาพ (Quality Assurance, QA) เพอบรรล

วตถประสงคของการพสจนวธ อยางนอยทสด 20 ตวอยางตอป แตถาทาไดไมครบ 20 ตวอยาง จาเปนตองทาการพสจนวธดวยการใช 8 ตวอยาง/ป ทกป และ ตวอยาง QA ใหมากทสด

3.5. การทวนสอบอยางตอเนอง (Continuous verification) 3.5.1 ตวอยางเพอควบคมคณภาพ (Quality control samples) การควบคมคณภาพมความจาเปนอยางยง สาหรบวธทดสอบคดกรองทงเชงคณภาพ/คณลกษณะหรอเชงการวดปรมาณคราว ๆ สามารถนาขอมลจากผลการทดสอบตวอยางควบคม มาเสรมรวมกบขอมลจากผลการพสจนความใชได ไมวาจะไดจากหองปฏบตการตนตารบ หรอ จากหองปฏบตการรบโอน กตาม โดยในแตละชดการทดสอบ ตองม ตวอยางควบคมเพอคดกรอง ไดแก “ตวอยางควบคมผลลบ” คอใช ตวอยาง/เนอเยอปลอดสาร (blank matrix) และ “ตวอยางควบคมผลบวก” (คอตวอยางทเตมสารในระดบความเขมขนเปาหมาย) ถา “ตวอยางควบคมผลบวก” ใหผลทดสอบเปน “ลบ” (คอตากวาคา cut-off) ตองทงผลทดสอบของตวอยางทงชดการทดสอบ เนองจากคณภาพผลทดสอบของตวอยางควบคมผลบวก ไมผานเกณฑ ในทานองเดยวกน ถา “ตวอยางควบคมผลลบ” ใหผลทดสอบเปน “บวก” (คอ สงกวาคา cut-off) ผลทดสอบของตวอยางทงชดการทดสอบ กใชไมไดเชนกน จากนนตองสอบหาสาเหต ทาไมผลทดสอบจงไมผานเกณฑ และดาเนนการแกไขขอผดพลาด ทาการบนทกและเกบขอมลทกอยางทเกดขนทกครง อยางตอเนอง เพอประมวลและประเมนสมรรถนะของวธทดสอบในเวลาตอมา โดยการคานวณวาผลการรายงาน เปน “ผลสอดคลองกบเกณฑเทยม” มอตราความผดพลาดเกน 5 % หรอไม เพอเปนการตรวจสอบวาวธทดสอบยงใชงานไดดเปนปกตหรอไม อยางไร การเลอกชนดสารเพอใชในการควบคมคณภาพนน ตองคานงถงและใชเกณฑการเลอกชนดสารแบบเดยวกบทแนะนาไวในการพสจนความใชไดของวธทดสอบทงในขนตอนตน หรอในขนตอนเสรม (แบบสน) คอ การเลอกใชชนดสารทใหผลทดสอบไมดทสด (worst-case analytes) ทระบไวในขอบเขตของ SOP และ/หรอ เปนชนดสารทสอดคลองกบสารทอยในแผนการตรวจตดตาม ตวอยางเตมสาร สามารถนาไปใชงานเปน “ตวอยางควบคมคณภาพ” สาหรบวธทดสอบเชงคณภาพ เชน tube test (Premi Test, Delvoteat, COPAN ฯลฯ) receptor-based

หนา 55


tests (Tetrasensor, Twinsensor) วธทดสอบเชงการวดปรมาณคราว ๆ (เชน ชดทดสอบ ELISA) และวธทดสอบเชงปรมาณ (LC-MS/MS) การใชตวอยางควบคมคณภาพทเปนเนอเยอ มกมปญหามากสาหรบเทคนคการยบยงการเจรญของเชอจลนทรย กรณเชนน อยางนอยตองใช paper disc เตมสารละลายมาตรฐานของสารปฏชวนะแทนการใชเนอเยอ อยางไรกด (ถาสามารถหาได) ควรตองใชตวอยางทมสารอยแลว (incurred sample) มาใชเพอควบคมคณภาพดวย หรอ โดยการใชตวอยางเตมสาร ทเลยนแบบของจรง (simulated tissue) ทเคยผลตใชในการพสจนความใชได การควบคมคณภาพ มเปาหมาย ใหทาการทดสอบ ตวอยางควบคมคณภาพ 20 ตวอยาง/ป (ภายใน 12 เดอน) การผลตตวอยางควบคมคณภาพไวใชระยะยาว ตองคานงถงความเสถยรของชนดสารในชนดเนอเยอทจะใชงานดวย และควรเกบขอมลผลการทดสอบทเกยวของทกอยางไวในตลอดระยะเวลาทยงใชวธทดสอบนอย เพอการตรวจสอบยอนกลบ (ตลอดจนขอมลการใชงานประจาของชดทดสอบทผลตขนทางพาณชย) ผลทดสอบจาก “ตวอยางควบคมคณภาพ” ทไดมา ไวผนวกกบขอมลจากการพสจนความใชไดในขนตอนตน กบขนตอนเสรม เพอวตถประสงค เปนการทวนสอบ

สมรรถนะของวธทดสอบ คณภาพชดทดสอบ แตละชดการผลต คณภาพและความเสถยรของสารเคม ตาง ๆ ทกษะ ความสามารถของผวเคราะหททาการทดสอบ

เมอครบป ใหประเมนผลทดสอบ โดยนาผลทไดจาก การพสจนความใชไดจากตอนตน รวมกบขนตอนเสรม กบ ตวอยางควบคมคณภาพ มาวเคราะหทางสถต ถาตวอยางควบคมคณภาพ นอยกวา 20 ตวอยาง/ป ตองทดสอบตวอยางเพม โดยการนบรวมตวอยางจากการพสจนในขนตอนตน กบขนตอนเสรม และตวอยางควบคมคณภาพผลบวกในระหวางป รวมกนใหได อยางนอย 40 ตวอยาง ในปแรก และ ทาการทดสอบตวอยางควบคมคณภาพผลบวก 20 ตวอยาง ในปถดไป ประมวลผล ถาผลทดสอบผดพลาดเกดขนไมเกนรอยละ 5 (จาก 40 และ 20 ตวอยาง) แสดงวาวธทดสอบนมความทนทาน และยงใหผลทดสอบทเชอถอได (แตถาหองปฏบตการจะไมใชวธทดสอบนแลว กลดจานวน “ตวอยางควบคมคณภาพ” ได) 3.5.2 การทดสอบความชานาญ (Proficiency tests) หองปฏบตการจาเปนตองเขารวมโปรแกรมการทดสอบความชานาญทสอดคลองกบการทดสอบทเกยวของอย เพอเปนการควบคมคณภาพจากภายนอก (external quality control) และตามขอกาหนด 5.9.1 b ของ ISO/IEC 17025:2005 เพอเปนการประเมนสมรรถนะ หากผลทดสอบอยในขายนาสงสย (questionable) หรอ ไมพอใจ (unsatisfactory) ตองสอบหาสาเหต และดาเนนการปรบปรงแกไขปญหาทเกดขน 3.6. การจดทารายงานการพสจนความใชได (Validation report) เมอดาเนนการพสจนความใชได ทงขนตอนตน โดยหองปฏบตการตนตารบ หรอ ขนตอนเสรม (แบบสน) โดยหองปฏบตการผรบโอน ตองจดทารายงานผลการพสจนความใชได

หนา 56


สาหรบหองปฏบตการตนตารบ “รายงานผลการพสจนความใชได” ของขนตอนตน ควรประกอบดวย การระบขอบเขตการใชงานของวธทดสอบ รวมถงอธบายความทนทาน ชวงความเขมขน

ชนดเนอเยอ (Matrices) ชนดสตว (species) สภาพเนอเยอ (matrix conditions) และสภาวะของหองปฏบตการ (laboratory condition) อธบายการออกแบบการพสจนความใชได ตลอดจน การเตรยมความพรอมเบองตน

(Prerequisites) การตงสมมตฐาน และสตรสมการทจะใชในการคานวณตามทออกแบบไวในแผนงาน สรปผลทดสอบโดยยอ สาหรบทกพารามเตอรของการพสจนความใชได การระบเงอนไขหรอสภาวะทเปนขอจากดของวธทดสอบใหชดเจน เชนวธทดสอบไมสามารถ

ทาการทดสอบอะไรไดบาง อธบายดวยวาระหวางการศกษาพสจนความใชไดนนพบวามสงรบกวนใดทอาจเกดขนไดบาง

หรอหากพบในระหวางการทดสอบตวอยางควบคมคณภาพ ในเวลาตอมา ใหนาขอมลทพบจากตวอยางควบคมคณภาพเหลานอธบายเพมเตมในรายงานการพสจนความใชไดในภายหลงดวย

สาหรบเทคนคทดสอบโดยการยบยงเชอจลนทรย ใหแสดงรายการชอชนดสารตาง ๆ แตละชนด หรอชนดสตวบนชนดจานอาหารเลยงเชอแตละจาน ทใหผลทดสอบสงกวาคา cut-off ดวย ถาม ผลการเขารวมโปรแกรมการทดสอบความชานาญ ใหแสดงผลไวในรายงานดวย สาหรบหองปฏบตการผรบโอนวธ ควรเขาถงรายงานผลการพสจนความใชไดของหองปฏบตการตนตารบ และหองปฏบตการผรบโอน ตองจดทารายงานการพสจนความใชได ขนตอนเสรม (ททาเพม) โดย บนทกแหลงทไดมาของวธทดสอบ (รบโอนมาจากทใด) ขอมลอางองเพอตรวจสอบขอมลการพสจนความใชไดจากหองปฏบตการตนตารบ เปรยบเทยบกบขอมลจากแหลงวชาการทตพมพ อน ๆ (cross reference) แสดงผลการพสจนความใชไดขนตอนเสรม (ทเพมขน) ซงการศกษาน เพอทวนสอบวาวธทถายโอนมา นามาใชงานไดอยางถกตอง

หนา 57


บทท 4

เกณฑในการกากบดแล/เกณฑเพอดาเนนการ (Regulatory/Action limit)

หนวยงานทมหนาทในการกากบดแลดานปศสตว ไดแกกรมปศสตว มหนาทผลตสตวเพอการบรโภค ดแลรกษาสตวใหมสขภาพด ไมกออนตรายใดใดเมอนามาเปนอาหารมนษย สานกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตวเปนหนวยงานของกรมปศสตว ทาหนาทตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตวตงแตอาหารสตว ไปจนถงผลตภณฑสตว ใหมความมนใจวา สนคาปศสตวทผลตขนภายใตการกากบดแลของหนวยงานภาครฐมความปลอดภยตอผบรโภคทงภายในและภายนอกประเทศ นอกเหนอจากกรมปศสตวแลว กระทรวงสาธารณสขกเปนหนวยงานทสาคญของประเทศในการดแลสขลกษณะ คณภาพและความปลอดภยของอาหาร เชนกน ปจจบนอตสาหกรรมการเลยงสตวเพอเปนอาหารสาหรบมนษยนน แมจะมระบบคณภาพตาง ๆ มากมาย ถกนามาใชเพอใหไดสนคาปศสตวทมคณภาพดและปลอดภย อยางไรกตาม การใชยาสตวกเปนเรองทตองอยในความควบคมดแลจากหนวยงานของรฐ เชนกน หากมการลกลอบใชสารอนตราย หรอการใชยาสตวผดวธ หรอ ผดวตถประสงค อาจกออนตรายรายแรงตอผบรโภคได แตละประเทศจงตองออกกฎระเบยบเพอควบคมการใชยาสตวอยางถกตอง มประสทธภาพ และปลอดภย แตกระนนกด หนวยงานของรฐยงจะตองมวธการตรวจตดตามการใชยาสตวตาง ๆ ดงกลาวเปนประจา โดยการจดทาแผนการตรวจตดตามสารตกคางแหงชาตประจาป (National Residue Control Plan) เพอตดตามสถานการณวามปญหาสารตกคางทเปนอนตรายตอผบรโภคหรอไมอยางไร และการทประเทศไทยเปนผผลตสนคาปศสตวทสาคญมคณภาพด ไดแก สตวปก สามารถสงออกไปยงตลาดตางประเทศไดมลคามหาศาล ประเทศผนาเขากมกฎระเบยบเกยวกบสารตกคาง เชนกน ทประเทศผสงออกตองปฏบตตามขอกาหนดของประเทศผนาเขา เพอทจะสามารถสงสนคาไปขายได ดงนนบคลากรทมหนาทรบผดชอบและเกยวของงานการตรวจสอบคณภาพความปลอดภยของอาหาร จงจาเปนตองมความร ความเขาใจกฎระเบยบตาง ๆ เกยวกบเกณฑมาตรฐานของประเทศตาง ๆ ทกาหนดขนเพอดแลความปลอดภยของอาหารเปนอยางด เกณฑมาตรฐานทางดานสารตกคางยาสตว คอคาปรมาณสงสดทอนญาตใหมไดในอาหาร หรอ Maximum Residue Limit (MRL) มกใชหนวยของความเขมขน ไดแก มลลกรม/กโลกรม (หรอpart per million, ppm) ไมโครกรม/กโลกรม (หรอpart per billion, ppb) เปนตน หองปฎบตการงานวเคราะหสารตกคางยาสตวและฮอรโมน สานกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว มหนาทตรวจตดตามสารตกคางยาสตวในสนคาปศสตวทกชนด บคลากรจาเปนตอง มความรและเขาใจกฎระเบยบ ตลอดจนเกณฑมาตรฐานทเกยวของอยางถกตอง เพอสามารถคดเลอก หรอ พฒนาวธทดสอบสารตกคางยาสตวได และสามารถออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบทหองปฏบตการตองการใชงานไดอยางมประสทธภาพ ซงจะสงผลใหการกากบดแลความปลอดภยอาหารมประสทธภาพดตามไปดวย เกณฑมาตรฐานคา MRL ทกาหนดขนจากการประเมนความเสยงของหนวยงานระดบสากล และระดบประเทศ เพอใชในการกากบดแล หรอ ดาเนนการ ใหความคมครองผบรโภคไมใหไดรบอนตราย ไดแก

หนา 58


คา MRL ทกาหนดใชในระดบสากล โดย Codex คา MRL ทกาหนดในระดบประเทศ เชนของประเทศไทย สหภาพยโรป สหรฐ ญปน ออสเตรเลย นวซแลนด ฮองกง ฯลฯ กฎระเบยบทเกยวของของประเทศไทย ไดแก ประกาศกรมปศสตว เรอง กาหนดมาตรฐานสารตกคางสาหรบสนคาปศสตว ลงวนท 12 กรกฎาคม พ.ศ. 2549 และประกาศอน ๆ ทเกยวของ ประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 303) เรองอาหารทมยาสตวตกคาง เปนตน สหภาพยโรป ไดออกกฎระเบยบใหม (EC) No 470/2009 และ (EU) No 37/2010 แทน (EEC) No 2377/90 ซงถกยกเลกไปแลว โดยกาหนดคาปรมาณสารตกคางสงสดทมไดในอาหารทไดจากสตว (Maximum Residue Limit, MRL) สาหรบยาสตวชนดทอนญาตใหใชกบสตวเพอบรโภคได และ กาหนดเกณฑ “ขดความสามารถขนตา (คอความไวของวธทดสอบทตองสามารถตรวจสารตองหามได ตามความเขมขนทกาหนด)” (Minimum Required Performance Limit, MRPL) และใชเปน “คาอางองในการดาเนนการ” (Reference Point for Action, RPA) เพอการกากบดแล สาหรบกรณสารทไมอนญาตใหใชกบสตว โดยกาหนดไวในมาตรา 4 ของ มตคณะกรรมาธการยโรป EC 2002/657/EC ในมาตรา 2 ของมตคณะกรรมาธการยโรป 2005/34/EC และมาตรา 18/19 ของ กฎระเบยบ (EEC) No 470/2009 คณะกรรมาธการยโรปยงออกระเบยบท 96/23/EC ไดแบงกลมยาสตวหรอสารออกเปน 2 กลม คอ สารตองหาม กลม A1 ถง A6 และ สารทอนญาตใหใชกบสตวเพอบรโภค กลม B2d กลม B2e โดยไดแนะนาวาสตวชนดใดควรตรวจตดตามสารกลมใดบาง ตลอดจนการสมเกบตวอยางตวแทนของสนคาตามหลกทางสถต (ภาคผนวกท 4) เพอเปนแนวทางใหประเทศสมาชก และประเทศคคาไดจดทาแผนการตรวจตดตามสารตกคางในแนวทางเดยวกน เกณฑมาตรฐานสารตกคางยาสตวในนาผง และผลตภณฑ สาหรบเกณฑดานสารตกคางยาสตวหรอสารเคมทอนญาตใหใชกบผง ของสหภาพยโรป (Commission Regulation No 37/2010) ไดกาหนดคา MRL ของสาร 2 ชนด ทมฤทธกาจดพยาธภายนอก คอ Amitraz และ Coumafos เทานน ไมปรากฏวามการกาหนดคา MRL สาหรบยาปฏชวนะใดใดเลย สวนเกณฑของประเทศญปน โดยกระทรวงสขภาพ แรงงาน และสวสดการ ไดจดทากฎหมาย เรยกวา Positive list system เรมมผลบงคบใช เมอ 29 พฤษภาคม พ.ศ. 2549 พบวา ไดกาหนดคา MRL สาหรบยาสตว มากมายหลายชนด ยกตวอยาง มคา MRL สาหรบยากลมเตตราไซคลน แอมพซลลน อะมอกซซลลน เบนซลเพนนซลลน เปนตน และเกณฑสารตกคางในนาผงของประเทศไทย มประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 211) พ.ศ. 2543 และ (ฉบบท 212) พ.ศ. 2543 เรอง รอยลเยลล และผลตภณฑรอยลเยลล เพอกาหนดใหนาผง รอยลเยลล และผลตภณฑรอยลเยลล เปนอาหารทกาหนดคณภาพหรอมาตรฐาน ซงในรายละเอยดไมอนญาตใหมสารพษจากจลนทรยในปรมาณทอาจเปนอนตรายตอสขภาพ และไมมสารปนเปอน เปนตน โดยสรป กฎระเบยบของหลายประเทศยงไมไดกาหนดคา MRL สาหรบยาปฏชวนะใดใด ในนาผงเลย ดงนนเมอจะทาการพสจนความใชไดของวธทดสอบสาหรบนาผง ควรตรวจสอบคามาตรฐานของประเทศตาง ๆ ทเกยวของ ทเปนปจจบน เพอใชเปนแนวทางในการออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบไดอยางเหมาะสม

หนา 59


4.1 การจาแนกยาสตว แบงออกไดเปน 3 กรณ 4.1.1 กรณ สารทไมสามารถกาหนดคา MRL ได กรณสารทไมอนญาตใหใชกบสตวเพอบรโภค เนองจากกออนตราย จงไมสามารถกาหนดคาทยอมรบใหมได มกใชคาวา “Zero tolerance” หมายความวา คาสารตกคางทยอมใหตกคางได เทากบศนย นนคอ หามมการตกคางของสารทไมอนญาตใหใช ไมวาระดบความเขมขนของสารตกคางจะนอยมากเพยงไร (ultra trace level) กตาม หองปฏบตการอางองของสหภาพยโรป ไดออกเอกสารคาแนะนา (CRL guidance paper 7 Dec 2007) เกยวกบวธทดสอบสาหรบใชในแผนการตรวจตดตามสารตกคาง และแนะนาคาความเขมขนขนตาทหองปฏบตการตองตรวจไดสาหรบสารตาง ๆ ทยงไมมการกาหนดคา Minimum required performance limit, MRPL สารอนตรายตาง ๆ ทไมสามารถกาหนดคา MRL โดยเฉพาะอยางยงเนองดวยสาเหตการออกฤทธไมพงประสงคของสารเหลาน ไดแก สารทออกฤทธกดตอมไธรอยด หรอสารทออกฤทธกระตนตวรบในรางกายมผลตอการเจรญเตบโต เชนฮอรโมน เบตาอโกนสต เปนตน สหภาพยโรปจงไมอนญาตใหใชในสตวเพอบรโภค ตามระเบยบของกรรมาธการยโรปท Council Directive 96/22/EC และเพอใหสามารถปฏบตตามขอกาหนดในแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC ดงนนหองปฏบตการอางองยโรปจงแนะนาคาความเขมขน (recommended concentration) สาหรบสารทไมสามารถกาหนดคา MRL ได และโดยทยงไมมการเสนอคา MRPL อยางเปนทางการดวย (อนงคาความเขมขนทแนะนาน ไมมผลบงคบทางกฎหมาย) วตถประสงคในการเสนอ “คาความเขมขนทแนะนา” เพอใหหองปฏบตการไดปรบปรงสมรรถนะของวธทดสอบใหมความไวดพอ และเพอเปนแนวทางใหหองปฏบตตามในทศทางเดยวกน นอกจากนยงแนะนาตวอยางเปาหมายชนดแรกทควรเกบตรวจสารตกคาง (matrices of choice) เพอวตถประสงคในการกากบดแล ตามแผนการตรวจตดตามสารตกคางในสตวทผลตไดภายในประเทศเอง ไดแก ตบ ไต ไขมน เครองใน ซรม ปสสาวะ อจจาระ เปนตน เนองจากสามารถเกบตวอยางดงกลาวไดเพราะเลยงสตวในประเทศเอง ยอมเลอกเกบตวอยางได สวนตวอยางทตองเกบตรวจสารตกคางเพอวตถประสงคในการควบคมสนคานาเขา จะมขอจากดเพราะไมสามารถไดตวอยางเปาหมายตามตองการได จะเกบไดเฉพาะชนดตวอยางทมการคาขายระหวางประเทศ ไดแก เนอ ไข นม นาผง เปนตน เกณฑพเศษเฉพาะสารมาลาไคท กรน และ ลวโคมาลาไคท กรน สาหรบ สารมาลาไคท กรน และลวโคมาลาไคท กรน น ไมมการกาหนดคา MRL เพราะไมอนญาตใหใชสารน แตมการกาหนดขดความสามารถขนตาของวธทดสอบ (Minimum Required Performance Limit) ใหตรวจผลรวมของสาร (sum – MRPL) ไดท 2 ไมโครกรม /กโลกรม

กรณน คา CC และ CC ของสารประเภทน ตอง “ตากวา” คา MRPL ดงนนหากวธทดสอบสามารถแยกและวดปรมาณของแตละสาร “มาลาไคทกรน” และ “ลวโคมาลาไคทกรน” ได กรณเชนนควรพสจนความใชไดของวธทดสอบ โดย คา CC ของแตละสารควร = ½ ของ “sum – MRPL” นนคอวธทดสอบทใชตรวจสารน ควร ม คา CC ของแตละสาร 1 ไมโครกรม/กโลกรม

หนา 60


หมายเหต: สวนใหญ ในปลา จะพบสารลวโคมาลาไคทกรน > 80 % ของผลรวมมาลาไคทกรน (เปนขอมล สาหรบวธทดสอบทสามารถแยกและวดปรมาณสารแตละชนดได ควรออกแบบการพสจนความใชไดใหสอดคลองกบรปแบบอตราสวนของสารตงตนกบเมตาบอไลทสของสารทสนใจในเนอเยอสตวทตองตรวจ) 4.1.2 กรณสารทมการกาหนดคาความเขมขนของสารตกคางสงสดทใหมได และ ผลรวมของคาความเขมขนสงสดของสารหลายชนดทตกคาง (MRL and Sum MRL) สาหรบยาสตวทไดรบอนญาตใหใชกบสตวเพอบรโภคนน สวนหนงกอนการขนทะเบยนใหใชกบสตว หนวยงานทมอานาจหนาทในการกากบดแลของแตละประเทศจะศกษาขอมลความปลอดภยของยาสตวเพออนญาตใหใช และจะมระเบยบกาหนดคา MRL สาหรบสารตกคางของยาสตวทอนญาตใหใชนน โดยคา MRL สมพนธกบชนดสตวหรอผลผลตจากสตวดวย ซง MRL ของสารตกคางยาสตวกาหนดขนจากขอมลผลการศกษาความเปนพษ และการประเมนความเสยง พบวา MRL ทกาหนดโดย CODEX หรอหนวยงานของประเทศตาง ๆ เชน ยโรป สหรฐอเมรกา ญปน บางครง คา MRL ของสารชนดเดยวกนกเทากน บางครงกแตกตางกน โดยสวนใหญพบวา คา MRL ของยโรป และของประเทศญปน คอนขางตา หรออาจกลาวไดวาเปนเกณฑทคอนขางเขมงวดเมอเปรยบเทยบกบประเทศอน ๆ กรมปศสตวจงมนโยบายทจะคานงถงและใหความสาคญตอเกณฑ “MRL”ของประเทศทตาทสด ซงเปนเกณฑทเขมงวดทสด ทจะนามาใชพจารณาเลอก หรอ กาหนดวธทดสอบ และดาเนนการออกแบบการพสจนความใชไดใหครอบคลม คา MRL ทตาทสด เพอเปาหมายในการคมครองผบรโภคและสงเสรมการคาระหวางประเทศใหประเทศไทยสามารถแขงขนได ในบทท 4 นจะยกตวอยางเฉพาะ ยาสตวทมคา “sum MRL” เนองจากการออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบมรายละเอยดปลกยอยสาหรบสารทมการกาหนดคา MRL ในรปผลรวม หรอ “sum-MRL” ตามคาแนะนาของมตกรรมาธการยโรป 2002/657/EC โดยไดแสดงตารางการเปรยบเทยบคา “sum MRL” ของยโรป Commission Regulation (EU) No 37/2010 กบของ CODEX (ดภาคผนวกท 4) ยกตวอยางยาสตวชนดตาง ๆ ทม คา MRL ของสารทออกฤทธทางเภสชวทยา บางสาร ถกกาหนดเปน “ผลรวม ของ MRL” หรอ “Sum-MRL” เชน กลมซลโฟนาไมดส กลมเตตราไซคลน และ Azaperone เปนตน จะพบวาเกณฑมความแตกตางกนระหวางของ CODEX กบ ของยโรป ดงนนในขอบเขตการพสจนความใชไดควรระบใหชดเจนในเรองเกยวกบคา sum-MRL ดวย รายละเอยดดงปรากฏในตาราง (ดภาคผนวกท 4) วธการพสจนความใชได สาหรบกลมสารทมกาหนด คา “sum – MRL” มคาแนะนาในการพสจนความใชไดของวธทดสอบทตรวจสารกลมดงกลาว ดงน แบบท 1 สาหรบสารตกคางเปาหมายทเปนผลรวมของสารตงตนแตละสาร (ทแยกกนไดเปนชนดเดยว) การพสจนความใชไดของวธทดสอบตองประเมนตอสารเดยวแตละชนด เชน กลมซลโฟนาไมดส ตองออกแบบพสจนความใชไดของยาซลฟาแตละชนด เมอผลทดสอบพบสารตกคางของยา

หนา 61


ซลฟามากกวา 1 ชนด จงคานวณคาเกณฑการตดสนของผลทดสอบรวม (sum - CC) ดงตวอยางในภาคผนวกท 4 แบบท 2 สาหรบสารทมเมตาบอไลทสเปนอตราสวนกบสารตงตน แตยงไมทราบอตราสวนของสารกบเมตาบอไลทสของสารนนในสตวแตละชนด หรอในเนอเยอ เชน กลมเตตราไซคลน ซงสหภาพยโรปกาหนด คา MRL เปนของสารตงตนเดยว ๆ หรอ ผลรวมของสารตงตน กบ epi form ของสารนน (เชน Oxytetracycline และ epi-oxytetracycline) เปนตน การพสจนความใชไดของวธทดสอบตองประเมนตอผลรวมของสารตงตนและสารเมตาบอไลทส หรอ Isomers ของสารนน ๆ ดงนน CC ทได คอ Sum- CC เรยบรอยแลว ในความเปนจรง เนองจากไมสามารถทราบไดวาจะพบสารตกคางใดบาง (มากกวาหนงชนด) ตกคางในตวอยาง ดงนนเมอพบสารตกคางมากกวาหนงชนดในตวอยาง จะประเมนไดอยางไรวาตวอยางนผานเกณฑหรอไม เพราะการพสจนความใชได ไมสามารถหาคา CC ไดถกตองสาหรบสารหลายชนดทไมสามารถลวงหนาไดวาจะพบสารใดรวมกบสารใดบาง ดงนนในทางปฏบตเมอตรวจพบสารหลายชนดตกคางในตวอยาง จงแนะนาใหคานวณและใชคา Sum-CC ของสารตามทตรวจพบจรงเปนเกณฑการประเมน แทนการใชคา CC ของสารเดยวแตละชนด เพราะจะตรงกบสถาณการณจรงทสด ซงการคานวณคา Sum-CC โดยใชคาความไมแนนอนของวธทดสอบ คอคาการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว ทไดมาจากการพสจนความใชได โดยการคานวณคาความไมแนนอนของการวดของระดบความเขมขนของสารในกราฟมาตรฐานทใกลเคยงทสดกบความเขมขนของสารทตรวจพบในตวอยาง แตถาหากตรวจพบสารมความเขมขนอยกงกลางระหวาง 2 ความเขมขนในการพสจนความใชได ใหเลอกใชคาการทาซาไดของความเขมขนทสงกวา และเนองจาก ในทางทฤษฎไมสามารถกาหนดไดวาจะเกดสารตกคางรวมกนมากกวาหนงชนด อยางไร สดสวนเปนอยางไร ดงนนการพสจนความใชไดของสารแตละชนดทระดบความเขมขน คอ 0.5, 1 และ 1.5 เทาของ MRL และใหหาขอมลของวธทดสอบเพม คอ คาความเขมขนตาสดทวธทดสอบตรวจวดได และคาความถกตอง (โดยการหาคาการกลบคน) และความเทยงของวธทดสอบ ทความเขมขนตาสดนดวย กรณทคา “sum – MRL” กาหนด เปน ผลรวมของสารตงตน (parent form) และเมตาบอไลทสของสาร ซงเปนสารเมตาบอไลทสทเกดขน ในอตราสวนทสมพนธกบสารตงตนเหมอนเดมเสมอ การประเมนตวอยางทตรวจพบสารตกคางรปแบบน ไดโดยการบวกเพม (adding) คาสมประสทธความแปรปรวนตามวธการถวงนาหนก เปนการพสจนความใชไดแบบท 2 คอ โดยการรวมคาความเขมขนของสารตงตน + เมตาบอไลทสของสารนน แลวใช “ผลรวม” ของสารในการคานวณทกพารามเตอรของการพสจนความใชได วธการน คา CC จงเปนคา “sum - CC” เรยบรอยแลว ซงคา “sum - CC” กจะไมสามารถนามาใชเพอประเมนสารเดยวได ไมวาจะเปนสารตงตน หรอ เมตาบอไลทส (parent และ individual metabolites)

หนา 62


โดยวธการกระจายคาความไมแนนอนของแตละสารทตรวจพบและการถวงนาหนกคาความไมแนนอนแปรผนตามระดบความเขมขนของสารทตรวจพบ โดยใชคา safety factor = 1.64 ในการคานวณคา CC สาหรบสารทมคา MRL (ตามแนวมต 2002/657/EC ขอ 3.1.2.5) ดงนนการประเมนตวอยางทตรวจพบสารตกคางมากกวาหนงชนด ถาผลรวมของความเขมขนแตละสาร มากกวา คา sum - CC ตดสนวา ตวอยางนไมผานตามเกณฑ (non-compliant) 4.1.3 กรณสารทไมจาเปนตองมคา MRL (no MRL required) ยาสตวบางชนดมความปลอดภยมาก อนญาตใหใชไดกบสตวเพอบรโภคบางชนดได ยกตวอยางเชน กรณ ยาปฏชวนะ Apramycin สหภาพยโรป อนญาตใหใชไดใน โค แกะ สกร ไก และ กระตาย แตไมอนญาตใหใชกบสตวทใหนานม (โคนม แกะนม) และสตวทใหไข เพอบรโภค

โดย Apramycin คา MRL = 1000 ไมโครกรม/กโลกรม ในเนอโค และไขมน = 10,000 ไมโครกรม/กโลกรม ในตบโค และ = 20,000 ไมโครกรม/กโลกรม ในไตโค แตไมจาเปนตองม คา MRL สาหรบ แกะ สกร ไก และ กระตาย แตสาหรบประเทศญปน ไดกาหนดคา Apramycin คา MRL = 500 ไมโครกรม/กโลกรม ในเนอโค MRL = 200 ไมโครกรม/กโลกรม ในเนอไก และ = 60 ไมโครกรม/กโลกรม ในเนอสกร ดงนนแนวทางในการพสจนความใชไดสาหรบ Apramycin คา MRL สาหรบชนดเนอเยอ เนอไก และ เนอสกร ของประเทศญปน เปนคาทเขมงวดทสด จงควรออกแบบการพสจนความใชไดโดยองคา MRL ของประเทศญปน ถาพฒนาวธทดสอบสาหรบตรวจสารตกคางยา Apramycin เนอโค ตบและ ไตของโค ใหออกแบบตามปกต คอ องคา MRL (ของยโรป) หรอ MRL (ของประเทศญปน) ของเนอเยอทตองการตรวจ ซงควรตองตรวจสอบคา MRL ทเปนปจจบน ใหดเสยกอน เพอการพสจนความใชไดทเหมาะสม และไมตองเสยเวลา ทรพยากร หากวางแผนไมด ตองกลบมาเรมตนทางานใหมอก สวนกรณสารทไมตองม คา MRL (no MRL required) ในการกากบดแล สาหรบงานวเคราะหสารตกคางยาสตวและฮอรโมน จะใชคา LPL เปนคาความเขมขนสาหรบออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบ โดยทผลการพสจนความใชไดจะได คาความสามารถในการตรวจ ของวธทดสอบ (CC) ซงแสดงความไวของวธทดสอบทความเชอมนในระดบทกาหนด ( -error) และจะไมตองใช CC ในการตดสนผลทดสอบ เนองจากไมตองการคา MRL ในการกากบดแล

หนา 63


4.2 เกณฑการตดสนผลทดสอบ เมอทาการพสจนความใชไดของวธทดสอบเสรจ และไดคา เกณฑในการตดสน (ผลทดสอบ) หรอ CC เดมท วธทดสอบแบบคดกรอง หรอ วธทดสอบเชงคณภาพ จะใหผลทดสอบ เชน ผลบวก เมอเรมตรวจพบสาร หรอ ผลลบ เมอตรวจไมพบสาร สวนวธทดสอบเชงการวดปรมาณ นอกจากการตรวจพบสาร หรอ ไมพบสารแลว ยงวดปรมาณของสารตกคาง ซงผลทดสอบเชงปรมาณ เชนสงกวา หรอ ตากวา คา MRL เปนการรายงานผล โดยการองเกณฑ/คามาตรฐาน ดงนน ในปจจบน การรายงานผลทดสอบ จงนยมใชคาวา “ผลสอดคลองกบเกณฑ” หรอ “compliant result” แทน การรายงานวา “ผลลบ” และ “ผลไมสอดคลองกบเกณฑ” หรอ (non-compliant result) แทน การรายงานวา “ผลบวก” เนองจากเปนคาทกวางกวา ถกตองและครอบคลมเกณฑมาตรฐานทงหลาย คอผลทดสอบ อง กบเกณฑ ไมวาเกณฑจะเปนอยางไร กใชคานไดหมด

ดงนน ผลทดสอบท CC ตดสนวา “ผลไมสอดคลองกบเกณฑ” และ ผลทดสอบท CC ตดสนวา “ผลสอดคลองกบเกณฑ”

4.2.1 กรณวธทดสอบแบบยนยนผล การตดสนผลทดสอบแบงออกตามกลมสารดงน

กรณสารทไมอนญาตใหใชและไมกาหนดคา MRL (no MRL could be established)



CC confirmation MRPL

กรณ สารหามใช

กรณสารทมคา MRL



CC

confirmation MRL


หนา 64


4.2.2 กรณวธทดสอบแบบคดกรอง การตดสนผลทดสอบแบงออกตามกลมสารดงน

กรณสารทไมอนญาตใหใชและไมกาหนดคา MRL (no MRL could be established)

กรณ สารหามใช Compliant Non compliant

ผลทดสอบ Screening

Cut-off

MRPL

กรณสารทมคา MRL

>


ผลทดสอบ Screening

Cut - off MRL


วธทดสอบคดกรอง ใชคา cut-off ตดสนผลทดสอบ คอ ผลทดสอบ > คา cut-off แสดงวา มแนวโนมเปน ผลไมสอดคลองกบเกณฑ ผลทดสอบ < คา cut-off แสดงวา มแนวโนมเปน ผลสอดคลองกบเกณฑ และตองสงตวอยางตอไป เพอทดสอบซาดวยวธทดสอบยนยนผล

หนา 65


บทท 5

เกณฑการประเมนสมรรถนะของวธทดสอบ

เมอทาการพสจนความใชไดของวธทดสอบ จะตองประเมนคาของคณลกษณะเฉพาะทได กบเกณฑการประเมนสมรรถนะของวธทดสอบ ซงงานวเคราะหสารตกคางยาสตวและฮอรโมน กลมตรวจสอบคณภาพเนอสตวและผลผลตจากสตวใชเกณฑของสหภาพยโรป ซงกาหนดไวในมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC เนองจากเปนเกณฑทคอนขางเขมงวด และพรอมกนนไดนาเสนอเกณฑของหนวยงานตาง ๆ เพอเปรยบเทยบ เชนขององคกรระดบสากล ไดแก CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION และของประเทศสหรฐอเมรกา จะเหนวาเกณฑการประเมนไมแตกตางกนมาก หากผลจากการพสจนความใชไดไมผานเกณฑการยอมรบได จาเปนตองปรบปรงวธทดสอบใหดขนแลวทาการพสจนความใชไดของวธทปรบปรงมาใหม หรอตองคดเลอกและเปลยนวธทดสอบใหมทมคณลกษณะเฉพาะผานเกณฑ ตารางท 8 เกณฑการประเมนคาความแมน (Trueness)

ชวงการยอมรบของคาเฉลยการกลบคน (%) ความเขมขน ของสาร สหภาพยโรป สหรฐอเมรกา

ในตวอยาง (2002/657/EC of 12 August 2002)

(FDA guideline ver. 1.0

2/28/2012)

CODEX (CAC/GL 71 –

2009)

≤ 1 μg/kg 50 – 120 50 – 120 > 1 to 10 μg/kg 70 – 110 70 -125 60 – 120 10 to 100 μg/kg 70 – 120

100 to 1000 μg/kg ≥ 1000 μg/kg

1 μg/g

75 – 125

10 μg/g

80 – 110

80 – 115

70 – 110

หนา 66


ตารางท 9 เกณฑการประเมนคาการทวนซาได (Repeatability)

คาสมประสทธความแปรปรวน (CV, %) ความเขมขน ของสาร สหรฐอเมรกา สหภาพยโรป

ในตวอยาง (CD 2002/657/EC of 12 August

2002)


2/28/2012)

CODEX (CAC/GL 71 – 2009)

≤ 1 μg/kg (*) 35 1 to 10 μg/kg (*) 15 30

10 to 100 μg/kg 15 20 100 to 1000 μg/kg 11 15

≥ 1000 μg/kg - 1 μg/g -

8

10 μg/g - 6 10

หมายเหต: (*) สาหรบทความเขมขนตาๆ คาสมประสทธความแปรปรวนจากการคานวณโดยใช Horwitz Equation มคาสงมากไป ดงนนเกณฑการยอมรบของคาสมประสทธความแปรปรวนสาหรบทความเขมขนตาๆ ควรจะเปนคาตาทสดเทาทจะเปนไปได ตารางท 10 เกณฑการประเมนคาการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (Within – laboratory reproducibility)

คาสมประสทธความแปรปรวน (CV, %) ความเขมขน ของสาร สหรฐอเมรกา สหภาพยโรป

ในตวอยาง (CD 2002/657/EC of 12 August

2002)


2/28/2012)

CODEX (CAC/GL 71 – 2009)

≤ 1 μg/kg (*) 53 1 to 10 μg/kg (*) 32 45

10 to 100 μg/kg 23 32 100 to 1000 μg/kg 16 23

≥ 1000 μg/kg - 1 μg/g -

16

10 μg/g - 11 16

หมายเหต: (*) สาหรบทความเขมขนตาๆ คาสมประสทธความแปรปรวนจากการคานวณโดยใช Horwitz Equation มคาสงมากไป ดงนนเกณฑการยอมรบของคาสมประสทธความแปรปรวนสาหรบทความเขมขนตาๆ ควรจะเปนคาตาทสดเทาทจะเปนไปได

หนา 67


5.1 เกณฑการประเมนสมรรถนะของวธทดสอบ และขอกาหนดอนๆ สาหรบการตรวจวดมวลสารของโมเลกล ดวยเทคนค Mass spectrometry เทคนคการตรวจวดมวลโมเลกล (Mass spectrometric detection) เมอใชรวมกบการแยกสารดวยเทคนคโครมาโตกราฟ (Chromatographic separation) แบบ on-line หรอ off-line กเพยงพอและเหมาะสมทจะใชเปนวธยนยนผล (confirmatory method) 5.1.1 การแยกสารดวยเทคนคโครมาโตกราฟ (Chromatographic separation) สาหรบเทคนค GC-MS การแยกสารดวยเทคนคแกสโครมาโตกราฟ ควรดาเนนการโดยใชคอลมนชนด capillary และเทคนค LC-MS การแยกสารดวยเทคนคโครมาโตกราฟ ควรดาเนนการโดยใชคอลมน HPLC ทเหมาะสม เกณฑชวงเวลาทสารออก (Retention time, Rt, นาท) เรวสดทยอมรบไดของสารทตองการตรวจ คอ ไมนอยกวา 2 เทา ของเวลา (Rt) ทพคของ void volume ของคอลมนออก ยกตวอยางเชน ถาพบพคของ void volume ของคอลมนท 0.5 นาท พคของสารทตองการตรวจ ควรตรวจพบทเวลา 1 นาทขนไป จงจะเปนการแยกพคจาก void volume ทเหมาะสม และเวลาทสารทสนใจออก (retention time) ตองเปนทชวงเวลาเดยวกนกบสารละลายมาตรฐาน โดยคดเทยบกบอตราสวนของ Rt ของสารมาตรฐานกบเวลา Rt ของสาร internal standard เปน เวลาทสารออกสมพทธ (relative retention time; RRT) โดย Rt ของสารทสนใจควรอยในชวง RRT 2.5% สาหรบเทคนค LC และ 0.5% สาหรบเทคนค GC 5.1.2 การตรวจวดมวลโมเลกลของสารดวยเทคนค Mass spectrometry การตรวจวดมวลสารหรอนาหนกประจของโมเลกลสารดวยเทคนค Mass spectrometry นนควรดาเนนการดวยเครองตรวจวดมวล (Mass Spectrometer) ทมประสทธภาพสง มความสามารถในการบนทกการกวาดวดมวลประจไดหลายแบบ ดวยอตราความเรวสง เชน การบนทก full mass spectra (full scans) หรอ Selected Ion Monitoring (SIM) รวมทงเทคนค MS-MSn เชน Selected Reaction Monitoring (SRM) หรอ เทคนค MS หรอ MS-MSn อนๆ ทเหมาะสม รวมกบการแตกตวของประจ (ไอออน) ทเหมาะสม สาหรบเทคนค high-resolution mass spectrometry (HRMS) คา resolution คอคาความละเอยดในการแยกประจของเทคนคควรสงกวา 10,000 ขนไป สาหรบตลอดทงชวงของมวลท 10% ของ valley Full scan: เมอใชเครองตรวจวดมวลของประจดวยเทคนค MS การบนทกแบบ full scan spectra ในการตรวจวดปรมาณสาร การตรวจเจาะจงประจ/ไอออน ของโมเลกล เพอใชในการวนจฉย หรอระบชนดสาร (diagnostic ions หรอ identifier ions) ไดแก ลกษณะการเกด adducts เฉพาะของประจ, (characteristic adducts ของ molecular ion), ลกษณะเฉพาะของประจทแตกตว (characteristic fragment ions) และ isotope ions ทสามารถตรวจวดไดทงหมด โดยเกณฑของคาความเขมสมพทธ (relative intensity) ตองมากกวา 10% ในชวงอางองของ spectrum ของสารมาตรฐานทใชเปรยบเทยบ

หนา 68


SIM: เมอใชเทคนค MS แบบการแตกสวนของโมเลกล (fragmentography) ในการตรวจวดปรมาณสาร นาหนก (ประจ) โมเลกลของสาร (molecular ion) ควรเปนไอออนแบบหนงทใชในการวนจฉย (ไดแก ลกษณะการเกด adducts เฉพาะของประจ, (characteristic adducts ของ molecular ion), ลกษณะเฉพาะของประจทแตกตว (characteristic fragment ions) และ isotope ions) ประจ/ไอออนทใชในการวนจฉยไมควรเกดจากสวนเดยวกนของโมเลกลสาร และอตราสวนของ สญญาณพคของแตละไอออนทใชในการวนจฉยตอสญญาณรบกวน (signal-to-noise ratio) ควร 3:1 Full scan และ SIM: คาความเขมสมพทธ (relative intensity) ของไอออนทตรวจพบ เทยบกบ ความเขมของไอออนหรอ transition ทสงทสด (คดเปน 100 %) และคาความเขมสมพทธควรสอดคลองเมอเทยบกบคาความเขมสมพทธของสารมาตรฐานทในรปสารละลายมาตรฐาน หรอจากตวอยางเตมสาร ทระดบความเขมขนทสามารถเปรยบเทยบกนได ภายใตสภาวะ/เงอนไขการตรวจวดเดยวกน และคา relative intensity ควรอยในชวงเกณฑการยอมรบไดในตารางท 11 ตารางท 11 คาการยอมรบสงสด สาหรบ relative ion intensity

Relative intensity เมอเทยบกบพคทมความเขมสงสด

(คดเปน 100 %) EI-GC-MS CI-GC-MS, GC-MS,

LC-MS, LC-MSn

50% 10% 20% 20% ถง 50% 15% 25% 10% ถง 20% 20% 30%

10% 50% 50% การแปลผลของขอมล mass spectrum: คาความเขมสมพทธ (relative intensity) ของไอออนทใชในการวนจฉย/ระบชนดสาร และ/หรอ คของไอออนตงตนกบไอออนผลผลต (precursor/product ion pair) หรอ (parent/daughter ion pair) ตองยนยนโดยการเปรยบเทยบ spectrum หรอ โดยการ integrate สญญาณพคของ single mass trace และเมอใดกตามททาการหกลบสญญาณรบกวน (background correction) ควรตองกระทาเหมอนกนกบทกตวอยางทงชดทดสอบ และควรระบการกระทาดงกลาวนไวดวย Full scan: เมอมการบนทกผลแบบ full scan spectrum ใน single mass spectrometry ควรเลอกใชอยางนอย 4 ไอออน ทมความเขมสมพทธ 10% ของพคหลก (base peak) โดยคดความเขมของพคหลก เปน 100 % โดยควรนานาหนก (ประจ) โมเลกลของสาร molecular ion มารวมแปลผลรวมดวย ถาพบไอออนดงกลาวใน spectrum อางอง (reference spectrum) โดยท คาความเขมสมพทธ 10% ซงอยางนอยทง 4 ไอออนควรมคาความเขมสมพทธ อยในเกณฑการยอมรบสงสด (ตารางท 11) การทดสอบอาจมการใชฐานขอมลทสรางไวเปนหองสมด

หนา 69


ในคอมพวเตอรชวยในการคนหา (computer-aided library) ซงกรณน การเปรยบเทยบขอมล mass spectrum ของตวอยางทดสอบกบกราฟมาตรฐานทสรางจากสารละลายมาตรฐาน ซงจะตองผานเกนเกณฑปจจยทกาหนด (critical match factor) ตองหาปจจยดงกลาวนระหวางทาการพสจนความใชไดสาหรบทกๆ สาร บนพนฐานของ spectrum ซงตองบรรลเกณฑการประเมนทจะไดอธบายตอไป และควรตรวจสอบการแปรปรวนของ spectrum ทอาจเกดขนไดจากชนดเนอเยอของตวอยาง และประสทธภาพของเครองตรวจวดดวย SIM: เมอมการตรวจวดสวนของมวลทแตกออกจากโมเลกลของสาร (mass fragments) โดยใชเทคนคอนนอกเหนอจากแบบ full scan ใหใชระบบการคดคะแนนเพอการยนยนชนดสาร (Identification point; IP) ในการแปลผลขอมล สาหรบการตรวจยนยนผลสารในกลม A (ในภาคผนวก I ของ Directive 96/23/EC) นน เทคนคทจะนามาใชตรวจสาร ตองการคะแนน IP อยางนอย 4 คะแนน และสาหรบการตรวจยนยนผลสารกลม B เทคนคทจะนามาใชตรวจสาร ตองการคะแนน IP อยางนอย 3 คะแนน ตารางท 12 และ 13 แสดงคะแนน IP ทไดจากวธทดสอบยนยนชนดสารดวยเทคนคพนฐานแตละชนดของ mass spectrometry อยางไรกตาม เพอตรวจคณภาพของคะแนน IP ทตองการในการยนยนชนดสาร และตองรวมของคะแนน IP ทได:

ควรตรวจวดใหไดอยางนอย 1 ion ratio และ

ion ratio ทเกยวของทใชวดทงหมด ควรผานตามเกณฑทไดอธบายไวขางตน

เทคนคการแยกสารทใชในการตรวจสาร สามารถนามาประกอบกนไดสงสดไมเกน 3 เทคนค เพอใหไดคะแนน IP ในการยนยนชนดสาร ถงตามเกณฑ

หนา 70


ตารางท 12 คะแนนการยนยนชนดสาร (Identification point; IP) ของเทคนคการวเคราะห

เทคนคการวเคราะห คะแนนการยนยนชนดสาร (Identification points; IP)

คะแนนทได ตอไอออน Low resolution mass spectrometry (LR) 1.0 LR-MSn เฉพาะไอออนตงตน (precursor ion) 1.0 LR-MSn ไอออนผลผลต (transition products) 1.5 HRMS 2.0 HR-MSn เฉพาะไอออนตงตน (precursor ion) 2.0 HR-MSn ไอออนผลผลต (transition products) 2.5 หมายเหต: 1. แตละไอออน คดคะแนน IP ใหครงเดยวเทานน 2. GC-MS ทใชเทคนคการแตกตวของไอออนโดยใช electron impact ถอเปนเทคนคทแตกตางจาก GC-MS ทใชเทคนคการแตกตวของไอออนโดยใชสารเคม (CI) 3. การใชสารอน เพอเพมคะแนน IP การยนยนชนดสารนนกได ตอเมอใชปฏกรยาทางเคมทตางกนในการเตรยมเปนสารอนพนธ 4. สาหรบสารในกลม A ตามภาคผนวก 1 ของ Directive 96/23/EC ถาใชเทคนคดงตอไปน: HPLC ตอกบ full-scan diode array spectrophotometry (DAD) HPLC ตอกบ fluorescence detection HPLC ตอกบ immunogram two-dimentional TLC ตอเชอมกบ spectrometric detection การยนยนชนดสารดวยเทคนคเหลาน จะไดคะแนน IP สงสด 1 คะแนน/เทคนค โดยเทคนคทใชตองผานเกณฑประเมนสมรรถนะทเกยวของของวธทดสอบนน ๆ ดวย

5. ไอออนผลผลต หมายถงไอออนลก (daughter) และไอออนหลาน (granddaughter) ดวย

หนา 71


ตารางท 13 ตวอยางการคานวณคะแนนการยนยนชนดสาร (IP) ของแตละเทคนคการวเคราะห (n = จานวนเตม) เทคนคการวเคราะห จานวนไอออนทเทคนคสามารถวเคราะหได คะแนนการ

ยนยนชนดสาร (IP)

GC-MS (EI หรอ CI) N n GC-MS (EI และ CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4 GC-MS (EI หรอ CI) สารอนพนธ 2 ชนด

2 (สารอนพนธ A) + 2 (สารอนพนธ B) 4

LC-MS N n GC-MS-MS 1 ไอออนตงตน และ 2 ไอออนลก 4 LC-MS-MS 1 ไอออนตงตน และ 2 ไอออนลก 4 GC-MS-MS 2 ไอออนตงตน โดยทแตละไอออนตงตนประกอบดวย

1 ไอออนลก 5

LC-MS-MS 2 ไอออนตงตน โดยทแตละไอออนตงตนประกอบดวย 1 ไอออนลก

5

LC-MS-MS-MS 1 ไอออนตงตน 1 ไอออนลก และ 2 ไอออนหลาน 5.5 HRMS N 2 n GC-MS และ LC-MS 2 + 2 4 GC-MS และ HRMS 2 + 1 4 5.2 กราฟมาตรฐาน (Calibration curve) เกณฑการประเมนความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐานเชงเสน สวนใหญจะถกกาหนดโดยผใชเอง ตามคณภาพความเปนเสนตรงทพอยอมรบไดทผใชตองการ ตาม Guidance Memo No. 96-007 เรอง Evaluation of Calibration Curve Linearity ของ Department of Environmental Quality Water Operations ระบวา กราฟมาตรฐานไดจากการสรางเสนแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของสารกบผลการตอบสนอง (response) ทไดจากการวดดวยเครองมอวเคราะห ความเขมขนของสารในตวอยางสามารถหาไดจากการวดผลตอบสนองของสารในตวอยาง จากนนนาคาดงกลาว (คาผลตอบสนอง บนแกน y) หาความสมพนธของจดตดแกน y (y-axis intercept) กบกราฟมาตรฐาน เพอใหไดคาความเขมขนทแกน x ผลทดสอบทไดจะแมนยา กตอเมอความสมพนธระหวางความเขมขนของสาร และคาผลตอบสนองเปนเสนตรง (Linear) คาทางสถตทบงบอกความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน คอ คาสมประสทธสหสมพนธ (correlation coefficient) หรอคา r ซงคา r เทากบ 1 บงบอกถงความสมบรณแบบของความสมพนธเสนตรงระหวางขอมลแตละจดกบเสนกราฟ คา r ของกราฟเสนตรงทยอมรบไดนน จะขนกบจานวนของระดบความเขมขนทนามาใชสรางกราฟมาตรฐาน โดยสามารถใชคาสมประสทธสหสมพนธ เปนเกณฑพจารณาการยอมรบความเปนเสนตรงของกราฟเชงเสนได ดงตารางท 14

หนา 72


ตารางท 14 เกณฑการยอมรบของคาสมประสทธสหสมพนธ (r) สาหรบกราฟมาตรฐาน

จานวนของระดบความเขมขน คาสมประสทธสหสมพนธ (r) 4 0.999 5 0.991 6 0.974 7 0.951 8 0.925

งานวเคราะหสารตกคางยาสตวและฮอรโมน สวนมากใชกราฟมาตรฐาน 5 ระดบความเขมขน (รวมระดบ 0) จงไดกาหนดเกณฑการยอมรบของคาสมประสทธสหสมพนธ r 0.995 ดงนนถากราฟมาตรฐานมคาสมประสทธสหสมพนธตากวา 0.995 แสดงวาไมผานเกณฑ ความเปนเสนตรง สงผลใหการวดปรมาณสารทสนใจ ไมแมนยา อาจตองดาเนนการหาสาเหต และปรบปรงแกไข หรอ ทาการทดสอบตวอยางทงชดทดสอบใหมอกครง 5.3 การควบคมคณภาพผลทดสอบ (Internal quality control) ควรมการทดสอบตวอยางเพอความมนใจในผลทดสอบ (Quality assurance, QA) โดยการทดสอบ ตวอยางทมสารตกคางอยแลว หรอ ตวอยางเตมสารทระดบความเขนขนทสนใจ เชน ทระดบคาทไดรบอนญาต (MRL) หรอ ทระดบ เกณฑการตดสน (CC) และควรทดสอบตวอยางปลอดสาร หรอสารเคมทใชในการทดสอบโดยไมมตวอยาง (reagent blank) ควบไปดวยเสมอในทกชดการทดสอบ การเรยงลาดบการฉดเขาเครองตรวจวด ควรเปนดงน

Reagent blank ตวอยางควบคม ผลสอดคลองตามเกณฑ (compliant control sample) ตวอยาง ทตองการทดสอบ (หลายตวอยาง) ตวอยางควบคมผลสอดคลองตามเกณฑ (compliant control sample) ซาอกครง และปดทายดวย ตวอยางควบคม ผลไมสอดคลองตามเกณฑ (non-compliant

control sample) หรอการจดเรยงลาดบเปลยนไปจากนบางกไดตามความเหมาะสม เพอทวนสอบความใชไดตามวตถประสงคของตวอยางควบคม แตละตวอยาง เชน ไมควรตรวจพบสารทสนใจใน Reagent blank หรอ ตวอยางควบคมผลลบ หรอ ไมควรพบปรมาณสารสงเกนเกณฑ ในตวอยางควบคมผลสอดคลองตามเกณฑ และควรตรวจพบสารในปรมาณทผานเกณฑการยอมรบในตวอยางควบคม ผลไมสอดคลองตามเกณฑ เปนตน หากผลไมไดตามทควรจะได แสดงวาเกดเหตผดปกต เชน เกดการปนเปอนในระบบ หรอในตวอยาง หรอการทดสอบลมเหลว ไมสามารถรายงานผลทดสอบได ทงนตองหาสาเหตและทาการแกไข และทาการทดสอบใหม

หนา 73


บรรณานกรม เกษตรและสหกรณ, กระทรวง. ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ พ.ศ. 2545 เรอง กาหนด ชอ ประเภท ชนดหรอลกษณะของอาหารสตวทไมอนญาตใหนาเขาเพอขาย และกาหนด ชอ ประเภท ชนด ลกษณะ คณสมบตและสวนประกอบของวตถทเตมในอาหารสตวท หามใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตว (9 สงหาคม 2545). คณะกรรมการดานวชาการของกรมวทยาศาสตรบรการ. แนวทางการจดทาความสมเหตสมผล ของการวด (Guidelines on Validity of Measurement). พมพครงแรก, กรงเทพฯ : โรงพมพสานกงานพระพทธศาสนาแหงชาต, 2554, 131 หนา. ปศสตว, กรม. กระทรวงเกษตรและสหกรณ. ประกาศกรมปศสตว พ.ศ. 2549 เรอง กาหนด มาตรฐานสารตกคางสาหรบสนคาปศสตว (12 กรกฎาคม พ.ศ. 2549). ชยณรงค เชดช, พลตร. มาตรวทยา - ฉบบยอ. พมพครงท 3, ปทมธาน : มาตรวทยาแหงชาต, 2551 ทพวรรณ นงนอย, แนวปฏบตการทดสอบความถกตองของวธวเคราะหทางเคมโดย หองปฏบตการเดยว. พมพครงแรก, นนทบร : กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวง สาธารณสข, 2549, 124 หนา. สวรรณา จารนช และคณะ, แนวปฏบตการประมาณคาความไมแนนอนของการวดทางเคม. พมพครงแรก, กรงเทพฯ : บรษท ว พลส กรป (ไทยแลนด) จากด, 2550, 118 หนา. สาธารณสข, กระทรวง. ประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 303) พ.ศ. 2550 เรอง อาหารท มยาสตวตกคาง (10 สงหาคม พ.ศ. 2550). สานกงานคณะกรรมการอาหารและยา. กระทรวงสาธารณสข. ประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 268) พ.ศ. 2546 เรอง มาตรฐานอาหารทมสารปนเปอนสารเคมบางชนด (21 เมษายน พ.ศ. 2546). สานกงานคณะกรรมการอาหารและยา. กระทรวงสาธารณสข. ประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 269) พ.ศ. 2546 เรอง มาตรฐานอาหารทมการปนเปอนสารเคมกลมเบตาอะโกนสต (21 เมษายน พ.ศ. 2546). สานกงานคณะกรรมการอาหารและยา. กระทรวงสาธารณสข. ประกาศสานกงานคณะกรรมการ อาหารและยา เรอง หลกเกณฑ เงอนไข และวธการตรวจวเคราะหการปนเปอนสารเคมบาง ชนดในอาหาร (24 เมษายน พ.ศ. 2546)

หนา 74


สจตตรา พงศววฒน. “นาผง และ มาตรฐานดานสารตกคาง [ตอนท 1]”, คมอการตรวจประเมน มาตรฐานฟารมเลยงสตว สาหรบคณะผตรวจรบรอง ฉบบรวม 14 ฟารมปศสตว. พมพ ครงแรก, กรงเทพฯ : สานกพฒนาระบบและรบรองมาตรฐานสนคาปศสตว กรมปศสตว, 2551, หนา 262 -269. Codex Alimentarius Commission. Guideline for the Design and Implementation of National Regulatory Food Safety Assurance Programme Associated with the Use of Veterinary Drugs in Food Producing Animals. CAC/GL 71-2009, 2009, p. 1-38. Codex Alimentarius Commission. Guidelines on Analytical Terminology. CAC/GL 72-2009, 2009, p. 1-18. Codex Alimentarius Commission. Maximum Residue Limits for Veterinary Drugs in Foods updated as at the 34th Session of the Codex Alimentarius Commission July 2011. CAC/MRL 2-2011, 2011, p. 1-36. Community Reference Laboratories Residues (CRLs). CRL Guidance Paper: CRLs view on state of the art analytical methods for national residue control plans, December 7, 2007, p. 1-8. Community Reference Laboratories Residues (CRLs). Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer), January 20, 2010, p. 1-18. European Commission. Council Regulation (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990: laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin, “Official Journal of the European Community”, L224 (1990), p. 1-8. European Commission. Commission Decision 93/256/EEC of 14 April 1993: laying down the methods to be use for detecting residues of substances having a hormonal or a thyrostatic action, “Official Journal of the European Community”, L118 (1993), p. 64-74.

หนา 75


European Commission. Council Directive 96/23/EC of 23 May 1996: laying down analytical methods to be used for detecting certain substances and residues thereof in live animals and animal products (Revision of Commission Decision 93/256/EC), “Official Journal of the European Community”, L125 (1996), p. 10- 32. European Commission. Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 95/23/EC: concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, “Official Journal of the European Community”, L221 (2002), p. 8-36. European Commission. Commission Decision 2003/181/EC of 13 March 2003: amending decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food of animal origin, “Official Journal of the European Community”, L71 (2003), p. 17-18. European Commission. Commission Decision 2004/25/EC of 22 December 2003: amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPL) for certain residues in food of animal origin, “Official Journal of the European Union”, L6 (2003), p. 38-39. European Commission. Commission Decision 2005/34/EC of 11 January 2005: laying down harmonized standards for the testing for certain residues in products of animal origin imported from third countries, “Official Journal of the European Union”, L16 (2005), p. 61-63. European Commission. Guidelines for the Implementation of Decision 2002/657/EC, SANCO/2004/2726-rev, December 4, 2008, p. 1-7. European Commission. Commission Regulation (EU) No 37/2010 of December 2009: on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin, “Official Journal of the European Union”, L15 (2009), p. 1-71. European Commission. Regulation (EC) No 470/2009 of the European Parliament and of the Council of 6 May 2009: laying down Community procedures for the establishment of residues limits of pharmacologically active substances in foodstuffs of animal origin, repealing Council Regulation (EEC) No 2377/90 and

หนา 76


amending Directive 2001/82/EC of the European Parliament and the Council and Regulation (EC) No 726/2004 of the European Parliament and of the Council, “Official Journal of the European Union”, L152 (2009), p. 11-22. International Standard. ISO 11843 - 1, Capability of detection – Part 1: Terms and definitions, July 1, 1997. International Standard. ISO 11843 - 2, Capability of detection - Part 2: Methodology in the linear calibration case, May 1, 2000. International Standard. ISO/IEC 17043, Conformity assessment – General requirements for proficiency testing, February 1, 2010. InterVal bioscreen. Software for in – house validation of biochemical screening methods quo data GmbH, 2009. www.quodata.de Lawson, Larry. Evaluation of Calibration Curve Linearity, Guidance Memo No. 96- 007, Department of Environmental Quality Water Operations, 1996.

หนา 77


ภาคผนวก

ภาคผนวกท 1

ภาพประกอบ เพออธบายคาศพทเกยวกบตวอยางทจดสงเขาหองปฏบตการเพอทดสอบ

ตวอยางเนอสตว ตวอยางไข ตวอยางนาผง

ตวอยางทเกบสง หองปฏ-บตการเพอ

ทดสอบ (Labora-tory

sample)

นาหนกตวอยางประมาณ 500 กรม ตอ ตวอยาง

นาหนกตวอยางประมาณ ปรมาณตวอยางประมาณ 500 กรม ตอ ตวอยาง 500 (ไข 1 ฟอง หนกประมาณ

40 -50 กรม ดงนน 1 ตวอยาง เทากบไข 10 – 12 ฟอง)

มลลลตร หรอ กรม ตอ ตวอยาง

สวนของตวอยาง สาหรบใชในการ

ทดสอบ (Test

portion)

แบงตวอยางออกเปนสวน ๆ สวนละประมาณ 100 – 200 กรม

แบงตวอยางออกเปนสวน ๆ สวนละประมาณ 40 – 50

มลลลตร

ตวอยางทดสอบ (Test

sample)

ชงตวอยางนาหนกตามท ชงตวอยางนาหนกตามท วธทดสอบกาหนด วธทดสอบกาหนด

ชงตวอยางนาหนกตามทวธทดสอบกาหนด

หนา 78



ตวอยาง การพสจนความใชไดของวธทดสอบ ภาคปฏบต 1. หลกการ 1.1 การพสจนความใชไดของวธทดสอบสารตกคางยาสตว เพอใชในการกากบดแลเรองสารตกคาง วธทดสอบสารตกคางยาสตว สามารถแบงออกตามวตถประสงค คอ วธทดสอบแบบคดกรอง และ วธทดสอบแบบยนยนผล ซงชนดสารตกคาง แบงออกเปน ๓ กลม คอสารตกคางทมการกาหนดคา MRL และสารตกคางทยงไมกาหนดคา MRL (เนองจากเปนสารหามใชในสตวเพอบรโภค) และสารทไมตองมคา MRL (เนองจากเปนสารทคอนขางปลอดภย) 1.2 พารามเตอรทตองทดสอบสาหรบวธทดสอบ

สาหรบวธทดสอบแบบยนยนผล สาหรบวธทดสอบแบบคดกรอง 1. CC - 2. CCβ 1. CCβ 3. Recovery - 4. Precision 4.1 Repeatability 4.2 Within-laboratory reproducibility

2. Precision 2.1 Repeatability 2.2 Within-laboratory reproducibility

5. Selectivity 3. Selectivity 6. Robustness 4. Robustness 7. Stability 7.1 In solution 7.2 In matrix

5. Stability 5.1 In solution 5.2 In matrix

8. Application 8.1 Concentration limits 8.2 Matrices/ matrix conditions/ species 8.3 Analytes

6. Application 6.1 Concentration limits 6.2 Matrices/ matrix conditions/ species 6.3 Analytes

1.3 สาหรบวธทดสอบคดกรองนน ไมจาเปนตองมความสามารถระบชนดสารไดอยางไมมขอสงสยใดใด แคเพยงสามารถใหสญญาณ ในตาแหนง ของเวลาทสารออก (Retention time) .ทความยาวคลน หรอ ทนาหนกโมเลกล หรอทความถคลน สอดคลองกบขอมลทไดจากสารมาตรฐาน และใหอตราสวนสญญาณทสงกวาสญญาณเรมตน (noise) 3 เทา กใชไดแลว

หนา 79


1.4 สวนวธทดสอบสาหรบยนยนผลนน จาเปนตองใหผลการแยกและระบชนดสารไดอยางไมมขอสงสย 1.5 วธทดสอบสาหรบตรวจสารตกคางทมคา MRL จะตองออกแบบทาการพสจนความใชได ทระดบความเขมขนองกบคาMRL โดยไมจาเปนตองหาคาตาทสดทวธทดสอบจะสามารถตรวจสารนน ๆ ได 1.6 วธทดสอบสาหรบตรวจสารตกคางทไมมคา MRL จะตองออกแบบการทดสอบใหตรวจไดทความเขมขนตากวาหรอเทากบระดบคา MRPL เพอจะตรวจยนยนวาพบสญญาณหรอระบชนดสารตามเกณฑ มต 2002/657/EC กาหนด 1.7 การพสจนความใชไดของวธทดสอบสามารถทาไดทง 2 แนวทาง คอ แนวทางเดม (Conventional validation) หรอ แนวทางใหม (alternative validation) เชน การพสจนความใชไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว

2. การพสจนความใชไดของวธทดสอบ:- A. ตามแนวทางเดม 2.1 CC การหาคาเกณฑการตดสนใจ (Decision Limit, CC) แบงเปน 3 กรณ กรณ สารทมคา MRL เตมสารใหไดความเขมขน 0.5, 1 และ 1.5 เทา ของคา MRL กรณ สารทไมกาหนดคา MRL (ใหองคา MRPL หรอ LPL)

ก. ม คา Minimum Required Performance Limit (MRPL) เนองจากเปนสารตองหาม เตมสารใหไดความเขมขน 1, 1.5 และ 2 เทา ของคา MRPL

ข. ไมมคา MRPL ตองใชคา LPL (Intra-laboratory performance level) เตมสารใหไดความเขมขน 1, 1.5 และ 2 เทา ของคา LPL

ค. ไมตองมคา MRL (เนองจากเปนสารปลอดภย) ใชคา LPL (Intra-laboratory performance level)

เตมสารใหไดความเขมขน 1, 1.5 และ 2 เทา ของคา LPL 2.1.1 สาหรบสารทมคาMRL วธการท 1: หาคา CC โดยสรางกราฟเสนตรง

หนา 80


การสรางกราฟเสนตรง อยางนอย 5 ความเขมขน สาหรบวดปรมาณ สรางกราฟดวยความเขมขนอยางนอย 5 ระดบ (รวม ระดบ 0 ดวย) คอ 0, 0.5-, 1.0-, 1.5-, 2.0-(และ 2.5)-เทา MRL อธบายชวงการใชงานของกราฟ อธบายสมการการสรางกราฟ เกณฑยอมรบของกราฟ [ตามมตกรรมาธการยโรป 2002/657/EC แตละระดบความเขมขนตองทดสอบอยางนอย 6 ซา คมอนแนะนาใหทาการทดสอบ 7 ซา (ตวอยาง)/ ระดบ] จดหาตวอยางทดสอบทเปนตวแทนเนอเยอ ชดละ (วนละ) 7 ตวอยาง ตอ ระดบความเขมขน ตวอยางทไมเตมสาร 7 ตวอยาง เปน ตวอยางปลอดสาร ตองทดสอบคขนานไปดวย เพอหาขอมลความสามารถในการแยกสารทสนใจจากสงรบกวน (selectivity) ของวธทดสอบ ทาการทดสอบ อก 2 ชด ในโอกาสถดไป ภายใตเงอนไขการทาซาได (reproducibility conditions) ตามทไดกาหนดไว เมอเสรจการทดสอบทง 3 ชด นาขอมลทไดไปประมวลผลทางสถต จะไดคาพารามเตอรดงน คอ

คาความเทยง จากคาการทวนซาได (คอ คาเบยงเบนมาตรฐาน SD R) จากขอมลแตละชด คาความเทยงจากคาการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (คา SD wlR)

ความสามารถในการแยกสารทสนใจจากสงรบกวน/ความจาเพาะ (selectivity/specificity) ของวธทดสอบ ในการทดสอบเพอหาคาความเทยง จากตวอยางเตมสารทเตรยมขนนน หากเปรยบเทยบกบตวอยางปลอดสารไปพรอม ๆ กน จะสามารถนาผลมาใชอธบาย ความสามารถในการแยกสาร/ความจาเพาะ ของวธทดสอบได แตถา ไมไดทาการทดสอบตวอยางปลอดสาร ควบคไปดวย (ในชดทดสอบเพอหาคาความเทยง) จาเปนตองทาการทดสอบเพม เพอพสจน ความสามารถในการแยก โดยตองทดสอบเพมอก 3 ชดทดสอบ โดยเลอกตวอยางปลอดสาร มาทดสอบภายใตเงอนไขของการทาซาใหมได (reproducibility condition) ดงนนจงแนะนาใหทาการทดสอบตวอยางปลอดสารควบคไปพรอมกน การเตรยมตวอยางเตมสาร ใชตวอยางปลอดสาร จานวน 7 ตวอยาง ตอ วน และแตละตวอยางเตมสาร 3 ระดบความเขมขน (โดยอง คา MRL หรอ MRPL หรอ LPL) และนาผลทดสอบไปสรางกราฟเสนตรงเพอหาคา CC ตอไป

หนา 81


วธการท 2:- การหาคา CC โดยการทดสอบตวอยางเตมสาร 20 ตวอยาง คา CC ของสารทมคา MRL หาไดโดยการทดสอบตวอยาง 20 ตวอยาง ทเตมสารทความเขมขน = MRL (ดงนนการออกแบบททาการทดสอบ 3 วน วนละ 7 ตวอยาง จะได เทากบ 21 ตวอยาง) หาคาเฉลยของผลทดสอบ และหาคาเบยงเบนมาตรฐานภายในหองปฏบตการ (SDwlR) ซงไดจากขอมลผลทดสอบ (ของ3 ชดทดสอบ) ทดาเนนการ ใน 3 โอกาส (วน)

คานวณคา CC จากสตร 2.1.2 สาหรบสารทไมมการกาหนดคาMRL (ใหใชคา MRPL หรอ LPL) หองปฏบตการตองหาขอมลเบองตนถงขดความสามารถคราว ๆ ของวธทดสอบมากอน โดยไดมาจากขนตอนการพฒนาวธ ซงจะเรยกคานวา คาขดความสามารถของหองปฏบตการ (Intra-laboratory Performance Limit- LPL) ซงในทานองเดยวกนกเปรยบเทยบไดกบคาขดความสามารถขนตาทตองการ (MRPL) นนเอง กลาวคอ คา LPL ของวธทดสอบ ทเมอตรวจตวอยางทมสารตกคาง ณ ความเขมขน LPL จะใหผลทดสอบทตรวจพบและ/หรอยนยนไดอยางนอย 50 % แตถามคา MRPL กาหนดใหสาหรบสารใดในชนดเนอเยอ ทสนใจ คา LPL จะตองนอยกวา MRPL เพอใหคา CCβ ทนอยกวา หรอ เทากบ MRPL และคา CC ตองนอยกวา MRPL จงเรมทาการพสจนความใชได คา LPL ของวธทดสอบทจะทาการพสจนความใชไดนนโดยการเตมสารทความเขมขนตาทสดเพอหาคาพารามเตอรตาง ๆ เพอความมนใจวา CC หรอ CCβ ทแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ สามารถหาไดและมคานอยกวา MRPL ใหขอมลทกระจายตว CC (หรอ CCβ ตามลาดบนน) คอความเขมขน ทอยางนอย 50 % (หรอ 95 % ตามลาดบ) ของตวอยางทมสารตกคางถกตรวจพบและยนยนได การคานวณคา CC ของสารทไมมการกาหนดคา MRL วธการท 1: โดยการสรางกราฟเสนตรง โดยวธการสรางกราฟมาตรฐาน โดยการเตมสารลงในตวอยางปลอดสาร ใหไดอยางนอยทสด 5 ระดบ (รวมระดบ ศนย) ความเขมขนทแรกควรเทากบความเขมขนตาสดทวธทดสอบตรวจสารได (LPL) ทกตวอยางตองผานกระบวนการเตรยมตวอยางทเหมอนกนทกขนตอน (ตาม SOP) ความเขมขนทควรทดสอบ ดงตอไปน 0, 1.0-, 1.5-, 2.0- และ 2.5- เทาของ LPL หมายเหต: ระยะหางของแตละความเขมขน ของกราฟมาตรฐานทเตรยมในเนอเยอ (matrix calibration curves) หรอ เตรยมในสารละลาย (standard calibration curve) และกราฟมาตรฐานสาหรบพสจนความใชไดของปจจยระดบเดยว ไมจาเปนตองเทากน

CC = คาเฉลยของผลทดสอบ + 1.64 SDwlR

หนา 82


การเตรยมกราฟเสนตรงของตวอยาง แตละชดทดสอบ ประกอบดวย ชดละ 7 ตวอยาง แตละตวอยาง เตมสารใหไดความเขมขนดงน คอ 0 (ไมเตม), 1.0-, 1.5-, 2.0- and 2.5- เทาของ MRPL หรอ LPL ทาการทดสอบ ชดท 1 ชดท 2 และชดท 3 ใน 3 ครง ในวนถดไป ภายใตเงอนไขสภาวะการทาซาไดทกาหนดไวแลว การออกแบบการทดสอบเชนน สาหรบตวอยางปลอดสาร ทง 3 ชด = 21 ตวอยาง จะไดขอมลการแยกสารของวธทดสอบ (selectivity) และขอมลการทดสอบสารทระดบตาง ๆ 7 ซา ตอ ระดบ ตอ ชด ดงนน 3 ชดทดสอบ = 21 ผลทดสอบ ตอ ระดบความเขมขน จากการทดสอบ จะสามารถไดพารามเตอรดงน คาความเทยง (คาเบยงเบนมาตรฐาน SDR) คาการกลบคน คาการทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยว (SDwlR) ไดกราฟจากตวอยางเตมสาร เพอหาคา CC.

ไดกราฟมาตรฐานทสรางในเนอเยอ สาหรบใชหาปรมาณสารของตวอยางเตมสาร CC คานวณไดจากการลากตอจากเสนกราฟไปตดแกน Y (a0) บวก 2.33 เทาของคาการทาซาใหมไดภายในหองปฏบตการ SDwlR ของระดบความเขมขนแรก ซงเปนความเขมขนตาสด (C1) เขยนเปนสตรคานวณ ดงน

โดย B คอ ความเขมขน ทกาหนดขนเพอหาคา a 0 a0 คอ คาความเขมขนบนแกน y ทลากเสนกราฟไปตด (y-axis intercept) SDwlR : คอ คาการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว (Within-laboratory reproducibility) ตวอยางการออกแบบการพสจนความใชไดโดยการควบปจจย 1 การตดสนใจในการออกแบบระดบความเขมขนคละกบปจจยทมผลกระทบ ดงกลาวขางตน ใหอยในดลยพนจของแตละหองปฏบตการ เพอทดสอบใหไดคาพารามเตอรแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ ซงการออกแบบขนอยกบความสามารถของวธทดสอบ ตอไปนแสดงตวอยางการคละปจจย ทา 3 ชดทดสอบ ประกอบดวย 3 ระดบความเขมขน 7 ซา (ตวอยาง) และ 1 กราฟมาตรฐานในเนอเยอ (เพอการวด) ตอ 1 ชดทดสอบ (วน) หรอทา 3 ชดทดสอบ ประกอบดวย 3 ระดบความเขมขน 7 ซา (ตวอยาง) และ 1 กราฟมาตรฐานในเนอเยอ (เพอการวด) ตอ 1 ชดทดสอบ และ 7 ซา ของตวอยางปลอดสาร

CC = B + 2.33 SDwlR, B

หนา 83


หรอ ทา 9 ชดทดสอบ 7 ซา (ตวอยาง) (โดยตวอยางของแตละชดทดสอบ ตองไมซาเดม) หมายเหต: สารมาตรฐานทใชเตรยมกราฟเพอการวดปรมาณ กบสารมาตรฐานทเตรยมในตวอยางทดสอบ ถาเปนไปได ควรมาจากตางแหลง เพอเปนแหลงของคาความไมแนนอน 2. ขอมลจากการทดสอบ 3 ชด จะไดคาเฉลย คาความเบยงเบนมาตรฐานของแตละชด และของทง 3 ชด นามาคานวณหาคาการทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยว (within-laboratory reproducibility SDwlR) 3. แตละชดการทดสอบ ใหหาคา CC จากแตละชดการทดสอบ แลวหาคาเฉลยของทง 3 ชด 4. แตถาพบวาวธการสรางกราฟไปตดแกน Y และไดคา CC ตามาก จนไมนาเปนไปได แนะนาใหใชคาความเขมขนทระดบตาสดทใชสรางกราฟแทน (C1) และคานวณโดยใชคานเปนคา B จากนคานวณ CC ตามสตรเดยวกน คอ 2.2 คาแสดงความสามารถในการตรวจ (Detection Capability CCβ)

คอคาความเขมขนวกฤตท ความคลาดเคลอนเบตา (critical concentration at error) 2.2.1 สาหรบสารทมคา MRL

คา CC β จะหาไดตอเมอ ทราบคา CC แลว โดยหาคาเบยงเบนมาตรฐาน (คอคาการทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยว) ของคา CC หรอ ของคา MRL ของสาร คานวณไดดงสมการน 2.2.2 สาหรบสารทไมมการกาหนดคา MRL (แตมคา MRPL)

คา CC β จะหาไดตอเมอ ทราบคา CC แลว โดยหาคาเบยงเบนมาตรฐาน (คอคาการทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยว) ของคา CC หรอ ของคา MRPL ของสาร คานวณไดดงสมการ คอ ถาการคานวณคาการทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยวไดจาก 3 ระดบความเขมขน แลวการกระจายตวของคาการทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยว ทความเขมขน MRPL (คาเบยงเบน

CC = B + 2.33 SDwlR, B

CCβ = CC + 1.64 SDwlR, CC or MRL

CCβ = CC + 1.64 SDwlR, CC or MRL

หนา 84


มาตรฐาน SDwlR ท MRPL) กบทความเขมขนตาสด (C1) ไมตางกน สามารถใชคา SDwlR ท ความเขมขนตาสด (C1) ไปใชคานวณคา CCβ กได 2.3 คาการกลบคน โดยการหาคาการกลบคน ของแตละระดบความเขมขน และจากการทดสอบเดยวกนน สามารถหาคาความเทยงไปพรอมกนดวยได 1.0, 1.5, 2.0 เทาของ MRPL หรอ 0.5, 1.0, 1.5 เทาของ MRL การหาคาการกลบคน มกแสดง หนวย เปน รอยละ ดงสมการ

รอยละการกลบคน = ความเขมขนของสารทวดได/ความเขมขนทเตม 100 2.4. ความเทยง 2.4.1 คาการทวนซาได SDR ดาเนนการภายใตเงอนไขการทวนซาทกาหนด โดย ทดสอบตวอยาง (ไมซาเดม) จานวน 7 ตวอยาง ทา 3 ระดบความเขมขน คอ 0.5-, 1.0- และ 1.5-เทาของ MRL หรอ 1.0-, 1.5- และ 2.0-เทาของ MRPL คานวณคาความเทยง คาสมประสทธความแปรปรวนแบบปจจยเดยว (single-factorial analysis of variance) จากผลทดสอบ 7 ซาของแตละความเขมขน = 21 คา SDR/conc.1 = (SAQ 1, within/ 1, within) ½ SDR/conc.2 = (SAQ 2, within/ 2, within) ½ ฯลฯ. โดย SAQ 1, within = sum of the square deviations ภายในชด ทระดบความเขมขนแรก SAQ 2, within = sum of the square deviations ภายในชด ทระดบความเขมขนทสอง ฯลฯ

และ 1, within = degree of freedom ของแตละชด (N-k) ทระดบความเขมขนแรก N = จานวนผลทดสอบทงหมด จากทง 3 ชดการทดสอบ k= จานวนทงหมดของชดการทดสอบ

หนา 85


2.4.2 คาการทาซาไดโดยหองปฏบตการแหงเดยว SDwlR ทาการทดสอบภายใตเงอนไขการทาซาได ไดแก ดาเนนการทดสอบแตละชดทดสอบ โดยใชตวอยางทดสอบแตกตางกน เชน จากสตวตางตว สตวตางชนด สภาพตวอยางตางกน เชนตวอยางสด เกา เสอมสภาพ (เนา) หรอ แชแขง เปนตน โดยเปลยนตวผวเคราะห ทาการทดสอบตางวน เปนตน แตละชดทดสอบประกอบดวย 7 ซา (ตวอยาง) ตอ ระดบความเขมขน ภายใตเงอนไขการทาซาไดทกาหนด คานวณคาสมประสทธความแปรปรวน แบบปจจยเดยว (a single-factorial analysis of variance) จากผลทดสอบทง 3 ชด ทแตละความเขมขน (7 3 = 21) ภายใตเงอนไขคาการทาซาไดระหวางชดการทดสอบตามทกลาวขางตน SDR/conc.1 = (MAQ 1, within + MAQ 1, inter) ½

ฯลฯ โดย MAQ 1, within = mean-square deviations ของผลการวดจากใน 3 ชด ทความเขมขนแรก MAQ 1, inter = mean-square deviations ของผลการวดจากระหวาง 3 ชด ทความเขมขนแรก etc. 2.5 ความสามารถในการแยกสาร (Selectivity/specificity) สาหรบวธทดสอบ ความสามารถในการแยกสาร (analyte) ออกจากสารทมความสมพนธกนไดดหรอไม เชน isomers เมตาโบไลทส สารทเกดจากการยอยสลาย (degradation products) สารเกดขนภายใน (endogenous substances) สวนประกอบของเนอเยอ (matrix constituents) การตรวจสอบสงรบกวนทอาจเกดจากสารตาง ๆ ทกลาวมา จาก 2 แนวทาง หาขอมลเพอทราบวาสารใด สงเจอปนใดสงผลรบกวนตอผลทดสอบมาก ใหเลอกสารนนมาทดสอบ ควบคกบการทดสอบตวอยางปลอดสาร เพอตรวจสอบวามการปรากฏสง/สารรบกวน ในชวงทตองอานผลของสารทสนใจหรอไม สงเจอปนเหลาน หรอสารทอาจสงผลรบกวนเชน เมตาโบไลทส อนพนธ เปนตน หรอยาสตว หรอสารปนเปอน อน ๆ อาจผสมหรอปนเปอนมากบสารทสนใจทตองการตรวจ ดงนนตองพยายามเลอกและหาสารเหลานมาทดสอบเพอพสจนวาวธทดสอบนมความสามารถในการแยกสารทสนใจกบสารปนเปอน/สงสกปรก ออกจากกนไดหรอไม แนวทางท 1 โดยการใช ตวอยางปลอดสาร 20 ตวอยาง (เปนตวแทน) ทาการทดสอบ ตรวจดวามพคของสาร หรอสญญาณรบกวนใด ทไมตองการเกดขนในชวงเวลาเดยวกบทสารทสนใจถกชะออกหรอไม แนวทางท 2 ทาการทดสอบเพม โดยเตมสาร หนงชนด หรอ หลายชนด ทความเขมขนทสอดคลองสมพนธกน ลงในตวอยางปลอดสาร ทคาดวาจะเกดสญญาณรบกวนการยนยนชนดสาร และ/หรอ การคานวณปรมาณ

หนา 86


การประเมนจากผล โดยตรวจดวา 1. มสงรบกวนใด ซงอาจจะทาใหรายงานผลทดสอบ เปน ผลบวกเทยม หรอไม 2. มสญญาณรบกวน ทาใหบดบงสญญาณของสารทสนใจตองการทดสอบ ทาใหอาจรายงานผลผด เปน ผลลบเทยม หรอไม 3. มผลกระทบตอการวดปรมาณสารอยางมาก

การพสจนวาวธทดสอบมประสทธภาพในการแยกสารทสนใจได โดยการฉดสารละลายมาตรฐานทความเขมขนใกลเคยงกบสารทอาจตรวจวดไดและแยกสารดวยเทคนคโครมาโตกราฟ ยงไปกวานนการแยกสารโดยเทคนคการเตรยมตวอยางสามารถใชอธบายความสามารถการแยกสารออกของวธทดสอบตงแตขนตอนการเตรยมตวอยางได การพสจนวาวธทดสอบสามารถแยกสารทสนใจออกจากสงรบกวนจากเนอเยอสามารถทาไดโดยเปรยบเทยบ ตวอยางปลอดสาร กบตวอยางเตมสารทเตรยมขนเพอหาคาความเทยง และสามารถใชผลนนมาอธบายได แตถา ไมไดมการทดสอบตวอยางปลอดสาร ในชดทดสอบเพอหาคาความเทยง ตองทาการทดสอบเพมเพอพสจน selectivity โดย ตองทดสอบเพม 3 ชดทดสอบ โดยเลอกตวอยางปลอดสาร มาทดสอบตามเงอนไขของการทาซาได (reproducibility condition) จงแนะนาวาควรทดสอบตวอยางปลอดสารไปพรอมกนจะประหยดเวลา และลดภาระงาน 2.6 ความทนทานของวธทดสอบ ความทนทานของวธทดสอบขนกบ ปจจย ทเปนตวแปรทมผลตอการทดสอบมาก หรอ นอย เชนความแตกตางของชนดเนอเยอ วธการเตรยมตวอยาง หรอ เงอนไขการวด ฯลฯ การตรวจสอบความทนทานของวธทดสอบทาโดยแผนวเคราะหปจจยทมอทธพล (factorial analysis plan) ทเรยกวา Youden-Plan อยางไรกตาม ขอมลนสามารถทราบจากขนตอนการพฒนาวธ การปรบแตงวธ หรอการพสจนความใชไดของวธทดสอบ กไดเชนกน ขนตอนมาตรฐานวธทดสอบ (SOP) ควรอธบายและระบเงอนไขทใช และเงอนไขใดทไมไดใชไวใน SOP ใหชดเจน 2.7 ความเสถยรของสาร ทดสอบเสถยรภาพ หรอ ความเสถยร ของสารทสนใจในสารละลาย หรอ ในเนอเยอ 2.7.1 ในสารละลาย การศกษาความเสถยรของสารทสนใจในสารละลาย โดยการเตรยมสารละลายความเขมขนสง (stock solutions) และแบงใสขวดยอย เกบทอณหภม 20 ๐C, +4 ๐C, +20 ๐C (ในทมด) และ +20 ๐C (ทสวาง) นานอยางนอย 1 ป นาสารละลายออกมาทดสอบเมอเวลาผานไป 1, 2 และ 4 สปดาห และหลงจาก 6 และ 12 เดอน โดยการเจอจางสารละลายความเขมขนสงน ลงใหไดความเขมขนระดบทสนใจ คอ CC หรอ MRL ของสารนน ๆ โดยเทแบงสารละลายทเจอจางออกอยางนอยสองสวน นาแตละสวนไปทดสอบ

หนา 87


หากมการใช Internal standard ใหเตรยมและแบงเกบรกษาแยกไวกอน จะเตมลงในสารละลายตอเมอจะเรมทาการทดสอบ หรอ กอนการเตรยมอนพนธ ถาสาร internal standard ละลายอยในแอลกอฮอล ควรเกบรกษาท -80๐C เพอปองกนสารเสอมสลาย แตถาไมสามารถทาได กใหเตรยมสารละลายความเขมขนสงของ Internal standard ใหมเมอตองการใชในการทดสอบ (freshly prepare) การประเมนความเสถยรของสาร โดยการคานวณพนทพค ถามการใช Internal standard ตองคานวณเปนอตราสวนระหวางพนทพคของสารทสนใจ กบพนทพคของสาร internal standard 2.7.2 ในเนอเยอ (Matrix) การศกษาหาความเสถยรของสารทสนใจในเนอเยอ ควรศกษาจากเนอเยอ (ตวอยาง) ทมสารทสนใจตกคางอยในเนอเยอแลว (incurred material) จดหาตวอยางชนดเนอเยอทมสารทสนใจใหไดปรมาณมากพอสาหรบการทดสอบ นาตวอยางไปบด แบงเปนสวน ๆ เกบรกษาท –20๐C หลงจากบดเนอเยอสด ใหทดสอบทนทเปนขอมลของสาร (คดปรมาณความเขมขนของสารในตวอยางสด เปน 100 % เปนคาเรมตน) และทดสอบตวอยางหลงจากการเกบผานไป 1, 2, 4, 20 และ 52 สปดาห (1 ป) กรณทตองเกบรกษาตวอยางใหแหงในสญญากาศ (lyophilized material) ทตองมขนตอนการเตรยมตวอยางตอไปอก และควรทาการศกษาความเสถยรของสารทงจากตวอยางสดและจากตวอยางทเกบรกษาแบบแหงในสญญากาศดวยเชนกน ตวอยางทบดแลว แบงใสขวดยอย อยางนอย 10 ขวด (aliquots) มาทดสอบหาคาความเปนเนอเดยวกนกอน แลวจงศกษาหาคาความเสถยร ซงอาจทาการทดสอบแยกโดยทดสอบความเปนเนอเดยวกนกอน หรอหากมปรมาณตวอยางมากพอ กทดสอบไปในคราวเดยวกนกได ในกรณน ถาผลการทดสอบแสดงวาตวอยางมความเปนเนอเดยวกน ผลทดสอบของ 10 คา ใชเปนคา ของตวอยางสด (fresh value) กได ถาไมมตวอยางทมสารตกคางอยแลว กตองนาตวอยางปลอดสารเตมสารทสนใจ (spiked) ทดสอบตามทไดอธบายไวขางตน B. การพสจนความใชไดตามแนวทางใหม โดยใชซอฟทแวร InterVal วธการนออกแบบใหสามารถพสจนความใชไดของวธทดสอบโดยศกษาหลาย ๆ ตวแปรไดในคราวเดยว เชน ชนดเนอเยอ ชนดสตว ชนดสาร เปนตน โดยใชจานวนตวอยางไมมาก เมอเทยบกบแนวเดม (conventional or classical method) โดยการแบงเปนชนของการออกแบบไขวทาใหใชตวอยางเพอพสจนความใชไดลดลง คอ ตวอยาง 1 ตวอยาง เตรยม 5 ระดบความเขมขน (คอ 4 ระดบความเขมขน บวก ระดบ 0 คอ ตวอยางปลอดสารตกคาง เปนการตรงปจจย) เตรยมตวอยางและทดสอบในลกษณะสม เชน สาหรบ ตวแปร 2 ระดบ การสมโอกาสจบคตวแปร 2 ระดบทางทฤษฎทตองทาใหครบทกตวแปรตองทางานถง 2 27 = 256 samples จะลดลงเหลอเพยง 16 ตวอยาง โดยการใช InterVal ชวยในการออกแบบ

หนา 88


เมอปอนปจจยตาง ๆ ทตองการใหเปนตวแปร เพอแสดงคณลกษณะของวธทดสอบเขา โปรแกรม InterVal จะสรางแผนการทดลองให ดาเนนการทดสอบตามแผน เมอทดสอบเสรจ ปอนผลทดสอบเขา คานวณผลทดสอบโดยใชโปรแกรม InterVal โดยจะจดทารายงานผลการพสจนความใชได แสดงผลงานคาและกราฟตาง ๆ ของพารามเตอรแสดงสมรรถนะของวธทดสอบ ดงน สรางกราฟของตวอยาง (Sample calibration) กราฟของผลรวม (overall calibration) คารอยละการกลบคน (Recovery) คาความเทยง จากคาทวนซาได SDR คาทาซาไดของหองปฏบตการแหงเดยว SDwlR คาทาซาได SwR คา power function

คา CCα, และ CCβ คาความทนทาน (robustness/ruggedness) ของวธทดสอบ หมายเหต: โปรแกรม InterVal เปน software สาเรจรป ทพฒนาขนโดย Dr. Petra Gowik แหงหองปฏบตการอางองยโรป (BVL) รวมกบ Dr. Steffen Uhlig นกสถต และจดจาหนายในราคาแพง 1. ผงแสดงวธการพสจนความใชได จานวนตวอยาง ทใช เพอหาคาความเทยง (precision) และคาการกลบคน (recovery) ของแตละความเขมขน (WDF, SDR, SDwlR): 21 ตวอยาง ระดบความเขมขน: 3 กราฟเนอเยอเพอหาคา CC: 5 ระดบความเขมขน (รวมระดบ ศนย) จานวนซา: 3 (ถาทาได, ทดสอบคาการแยก: 20 ตวอยางปลอดสาร แบงทา 3 ชด

หนา 89


Conc. 1 P 1 – P 7 + series 1 Blank B 1 – B 7 SDR/conc. 1 Conc. 1 P 1 – P 7 + series 2 Blank B 1 – B 7 SDwlR/conc. 1 Conc. 1 P 1 – P 7 WDFconc. 1 + series 3 Blank B 1 – B 7 โดย SDR = Repeatability SDwlR = Within-laboratory reproducibility WDF = Recovery ความสามารถในการแยกสาร (Selectivity): ศกษาการแยกสารของวธทดสอบ พสจนไดจากการทดสอบ ตวอยางปลอดสารตกคาง 7 ตวอยาง ตอ ชดทดสอบ ทา 3 ชดทดสอบ = 21 ตวอยาง (โดย SANCO/1805/2000; กาหนดวา ตวอยางปลอดสาร 20 ตวอยางตองไดมาจากตางแหลง (เชน ตางตวสตว ตางชนดสตว ตางสภาพ เปนตน) ถาไมสามารถดาเนนการทดสอบภายใน 3 ชดทดสอบนได จะตองดาเนนการ อก 3 ชดทดสอบ ในระยะเวลาไมนานเกนไป ความเสถยรของสาร (Stability): ในสารละลาย: ทดสอบครงละ (วนละ) และ อณหภมละ (condition) 2 ขวด 4 สภาวะการเกบ จานวนครงของการทดสอบ = 2 × 4 × 6 = 48 6 วน ในเนอเยอ:-ทดสอบครงละ 2 ขวด/วน 10 ตวอยาง (ในวนแรกทเตรยม) ทดสอบความเปนเนอเดยวกน จานวนครงของการทดสอบ = 10 + 2 × 5 = 20 5 ครง (1, 2, 4, 20 และ 52 สปดาห)

หนา 90


ความทนทานของวธทดสอบ โดยทดสอบ 2 ตวอยาง/ระดบความเขมขน และ ระดบของปจจยตวแปร 3 ระดบความเขมขน จานวนการทดสอบ = 2 × 3 × 8 = 48 การจบค 8 ระดบปจจย หมายเหต: ถามขอมลเบองตนมากอนแลว เชนไดจากการพฒนาวธทดสอบ หรอจากการปรบแตง หรอจากการพสจนความใชไดของวธทดสอบ กไมมความจาเปนตองศกษาซาอก 2. จานวนตวอยางขนตา ทตองทดสอบในการพสจนความใชไดตามแนวทางเดม 21 × 3 ระดบความเขมขน = 63 ตวอยาง + 3 × 5 ตวอยางเนอเยอ (matrix) = 15 ตวอยาง + 3 × 7 ตวอยางปลอดสารตกคาง = 21 ตวอยาง + 10 + 2 × 5 ความเสถยรของสารในเนอเยอ = 20 ตวอยาง + 2 × 3 × 8 ความทนทาน = 48 ตวอยาง

ผลรวม Σ = 167 ตวอยาง + 2 × 4 × 6 ความเสถยรของสารในสารละลาย = 48 ครง การทดสอบ

หนา 91


ตวอยางท 1 ตวอยางการคานวณคา CC และ CCß ในการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวทางเดมของสารทไมมการกาหนดคา MRL หรอ MRPL ใชคา LPL (ในตวอยางนคอ Kanamycin ในนาผง)

CC and CC

Calculated parameter MRPL or LPL (ug/kg) Analyte / Matrix

Sample ID Concentration Response dx²

10.0 11.9 100

10.0 11.2 100

10.0 11.6 100

10.0 11.7 100

10.0 11.8 100

10.0 10.2 100

10.0 11.2 100

20.0 22.9 0

20.0 19.3 0

20.0 22.1 0

20.0 23.1 0

20.0 20.2 0

20.0 22.1 0

20.0 22.1 0

30.0 33.5 100

30.0 24.5 100

30.0 35.8 100

30.0 34.6 100

30.0 35.7 100

30.0 24.6 100

30.0 34.9 100

10.0 9.0 100

10.0 7.7 100

10.0 8.7 100

10.0 9.4 100

10.0 9.0 100

10.0 6.9 100

10.0 8.1 100

20.0 16.9 0

20.0 16.9 0

20.0 21.4 0

20.0 23.3 0

20.0 22.5 0

20.0 17.5 0

20.0 14.5 0

30.0 35.3 100

30.0 29.6 100

หนา 92


30.0 28.9 100

30.0 33.0 100

30.0 29.7 100

30.0 29.5 100

30.0 27.9 100

10.0 8.2 100

10.0 8.7 100

10.0 8.0 100

10.0 9.0 100

10.0 8.4 100

10.0 7.6 100

10.0 7.4 100

20.0 17.5 0

20.0 23.5 0

20.0 21.5 0

20.0 23.7 0

20.0 21.6 0

20.0 18.9 0

20.0 14.8 0

30.0 33.3 100

30.0 29.0 100

30.0 27.1 100

30.0 32.0 100

30.0 29.1 100

30.0 28.2 100

30.0 27.4 100

Mean x Sum dx²

20 4200

Linest Array to calculate performance characteristics 1.066666667 -1.246031746

0.043148608 0.932116473 0.909241896 2.796349419 611.1162916 61 4778.666667 476.994 error P value 0.99 2.389 ß-error P value 0.95 1.670 Injections per sample K=L 1 Spike levels I 3 Samples per level J 21 Intercept -1.2460317460

Slope 1.066667

SE (y) 2.796349

Yc 5.795811171

CC 6.6 µg/kg CC 11.2 µg/kg

หนา 93


ตวอยางท 2 ตวอยางการคานวณคา CC และ CC ในการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวทางเดม ของสารทมการกาหนดคา MRL (ในตวอยางนคอ Tylosin ในเนอไก)

CC and CC Calculated parameter Operator-entered parameter

Compound Matrix Response parameter Tylosin in chicken Concentration

Concentration Response dx²

25 25.7 625

25 25.3 625

25 25.8 625

25 25.6 625

25 26.8 625

25 23.7 625

25 23.8 625

50 49.8 0

50 50.7 0

50 50.3 0

50 49.7 0

50 46.9 0

50 48.8 0

50 49.6 0

75 79.4 625

75 77.8 625

75 73.6 625

75 79.5 625

75 72.7 625

75 75.1 625

75 71.5 625

25 26.8 625

25 27.7 625

25 24.4 625

25 24.7 625

25 26 625

25 27.2 625

25 27.5 625

50 56.7 0

50 50.8 0

50 50.7 0

50 53.9 0

50 51.6 0

50 56.3 0

50 49.4 0

75 73.8 625

75 76.9 625

หนา 94


75 63.3 625

75 81.2 625

75 62.3 625

75 80.9 625

75 71.1 625

25 27.2 625

25 25 625

25 27.2 625

25 25.9 625

25 26.4 625

25 26.2 625

25 26.9 625

50 47.4 0

50 50.1 0

50 53.2 0

50 54.2 0

50 51.1 0

50 53.7 0

50 53 0

75 82.1 625

75 77.5 625

75 80.5 625

75 79.8 625

75 76.8 625

75 81.9 625

75 82.4 625

Mean x Sum dx²

50.00000 26250.000 Linest Array to calculate performance characteristics

1.004095238 0.966666667 0.022493275 1.214775709 0.970297677 3.644327128 1992.711443 61 26465.44024 810.148 - error P value 0.95 1.670 ß-error P value 0.95 1.670

Injections per sample K=L 1 SPIKE levels I 3 Samples per level J 21 a 0.966666667

b 1.004095238

Sigma 3.644327128

N-2 61 yc 7.382744813

CC 56.4 µg/kg

CC 62.8 µg/kg

หนา 95


ตวอยางท 3 ตวอยางการคานวณคา CC และ CC แบบท 2ในการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวทางเดมของสารทมการกาหนดคา MRL (ในตวอยางนคอ Apramycin ในเนอสกร)

คานวณคา CC ได จากการเตมสารทระดบ MRL

MRL ของ Apramycin ในเนอสกร (ญปน) 60 µg/kg

ซาท ความเขมขน

1 50.1

2 53.9

3 43.9

4 45.3

5 44.0

6 53.5

7 51.4

8 51.0

9 54.3

10 48.5

11 54.3

12 52.3

13 54.5

14 52.8

15 51.9

16 49.1

17 48.9

18 52.5

19 47.2

20 47.0

คาเฉลย 50.3

คาเบยงเบนมาตรฐาน (S.D.) 3.4

MRL 60

CC 65.6

หนา 96


หนา 97

คานวณ CC โดยการเตมสารทระดบความเขมขน CC CC 65.6 µg/kg

ซาท ระดบความเขมขน

1 67.2

2 71.1

3 73.4

4 68.2

5 69.0

6 64.2

7 66.8

8 69.9

9 69.1

10 71.0

11 65.8

12 70.0

13 65.9

14 66.3

15 69.4

16 63.3

17 65.2

18 64.6

19 66.8

20 72.3

คาเฉลย 68

คาเบยงเบนมาตรฐาน 2.8

CC 66

CC 70.2


ตวอยางท 4 ตวอยางการคานวณพารามเตอรตางๆ ในการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวทางเดม ของสารทไมมการกาหนดคา MRL หรอ MRPL ใชคา LPL (ในตวอยางนคอ Kanamycin ในนาผง)

Kanamycin in Honey Overall Summary

Fortification Level

Overall Mean

(µg/kg)

Overall Recovery

(%)

Within Day CV

Between Day CV

Intermediate Precision

CV 10 9.3 93 7.4 18.9 20.3 20 20.3 102 14.0 4.0 14.5 30 30.6 102 11.7 1.7 11.8

CC 6.6 µg/kg

CC 11.2 µg/kg

หนา 98


Fortification level 10 µg/kg Anova: Single Factor Day 1 Day 2 Day 3 SUMMARY Replicate 1 11.9 9.0 8.2 Groups Count Sum Average Variance Replicate 2 11.2 7.7 8.7 Column 1 7 79.6 11.37142857 0.342381 Replicate 3 11.6 8.7 8.0 Column 2 7 58.65 8.378571429 0.759848 Replicate 4 11.7 9.4 9.0 Column 3 7 57.35 8.192857143 0.32799 Replicate 5 11.8 9.0 8.4 Replicate 6 10.2 6.9 7.6 Replicate 7 11.2 8.1 7.4 ANOVA

Source of Variation SS df MS F P-value F crit

Mean 11.4 8.4 8.2 Between Groups 44.555 2 22.2775 46.72886 7.47E-08 3.554561

SD 0.59 0.9 0.6 Within Groups 8.581314 18 0.476739683

CV 5.1 10.4 7.0 % Recovery 114 84 82 Total 53.13631 20

Within Day

Between Day


S.D. 0.6905 1.7648 1.8950 Mean 9.314 9.314 9.314 Overall mean 9.3 RSD 0.074 0.189 0.203

Overall recovery 93

C.V. (RSD%) 7.4 18.9 20.3

หนา 99


Fortification level 20 µg/kg Anova: Single Factor Day 1 Day 2 Day 3 SUMMARY Replicate 1 22.9 16.9 17.5 Groups Count Sum Average Variance Replicate 2 19.3 16.9 23.5 Column 1 7 151.8 21.68571429 1.981429 Replicate 3 22.1 21.4 21.5 Column 2 7 133 19 11.30333 Replicate 4 23.1 23.3 23.7 Column 3 7 141.5 20.21428571 10.82143 Replicate 5 20.2 22.5 21.6 Replicate 6 22.1 17.5 18.9 Replicate 7 22.1 14.5 14.8 ANOVA


Mean 21.7 19.0 20.2 Between Groups 25.32286 2 12.66142857 1.575707 0.234098 3.554561

SD 1.41 3.36 3.29 Within Groups 144.6371 18 8.035396825


Within Day

Between Day



Overall recovery 102

C.V. (RSD%) 14.0 4.0 14.5

หนา 100


หนา 101




SD 5.11 2.6 2.3 Within Groups 230.5114 18 12.80619048


Within Day

Between Day



Overall recovery 102

C.V. (RSD%) 11.7 1.7 11.8


ตวอยางท 5 ตวอยางการคานวณพารามเตอรตางๆ ในการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวทางเดม ของสารทมการกาหนดคา MRL (ในตวอยางนคอ Tylosin ในเนอไก)

Tylosin in chicken Overall Summary

Fortification Level

Overall Mean

(µg/kg)

Overall Recovery

(%)

Within Day CV

Between Day CV

Intermediate Precision CV

25 26.0 104 4.3 1.9 4.7 50 51.3 103 4.5 2.9 5.4 75 76.2 102 6.6 4.2 7.8

CC 56.4 µg/kg

CC 62.8 µg/kg

หนา 102





SD 1.1 1.3 0.8 Within Groups 22.03143 18 1.22396825 CV 4.4 5.1 3.0 % Recovery 101 105 106 Total 27.9181 20

Within

Day Between

Day Intermediate

Precision S.D. 1.1063 0.4956 1.2123 Mean 25.990 25.990 25.990 Overall mean 26.0 RSD 0.043 0.019 0.047 Overall recovery

104 C.V. (RSD%) 4.3 1.9 4.7

หนา 103






Within

Day Between

Day Intermediate


103 C.V. (RSD%) 4.5 2.9 5.4

หนา 104


หนา 105

Fortification level 75 µg/kg Anova: Single Factor Day 1 Day 2 Day 3 SUMMARY Replicate 1 79.4 73.8 82.1 Groups Count Sum Average Variance Replicate 2 77.8 76.9 77.5 Column 1 7 529.6 75.6571429 10.65619 Replicate 3 73.6 63.3 80.5 Column 2 7 509.5 72.7857143 59.56143 Replicate 4 79.5 81.2 79.8 Column 3 7 561 80.1428571 5.069524 Replicate 5 72.7 62.3 76.8 Replicate 6 75.1 80.9 81.9 Replicate 7 71.5 71.1 82.4 ANOVA




Within

Day Between

Day Intermediate


102 C.V. (RSD%) 6.6 4.2 7.8


ตวอยางท 6 รายงานการพสจนความใชไดของวธทดสอบสารตกคางคลอแรมเฟนคอล ตามแนวทางใหม โดยใชซอฟทแวร InterVal ในการวางแผนการทดลอง คานวณผล และทารายงานเบองตนซงผใชปรบแตงได

Validation Parameters

Results of Substance: [Chloramphenicol] Critical Concentrations and Design Parameters

CC 0.14 CC 0.18

Total Number of Measurements: 128 Number of Measurements Confirmed: 128 Samples: 32 Number of Outlier Measurements:0 Unit: ng/gm Threshold: 0.00

หนา 106


หนา 107

Overall Calibration Curve, Measurement Values and Prediction Interval

S_03 S_28 S_24 S_19 S_20 S_15 S_22 S_25 S_31 S_02 S_29 S_04 S_16 S_07 S_09 S_27 S_06S_10 S_11 S_12 S_01 S_32 S_21 S_18 S_08 S_23 S_14 S_05 S_26 S_17 S_30 S_13

Concentration [ng/gm]

Mea

sure

men

t val

ues

[ng/

gm] 0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0


หนา 108

Repeatability, in-house reproducibility and recovery

C O N C E N T R A T I O N sr

1 CV [%] swR2 CV [%] R E C O V E R Y

[ % ]

[µg/kg] [µg/kg] [µg/kg] 0.10 0.01 11.2 0.02 17.7 98.9

0.15 0.01 6.5 0.02 13.3 101.5

0.20 0.01 4.5 0.02 11.6 102.8

0.25 0.01 3.3 0.03 10.9 103.6

0.30 0.01 2.6 0.03 10.5 104.1

0.45 0.01 1.6 0.04 9.9 105.0

0.60 0.01 1.1 0.06 9.8 105.4

Measurement uncertainties within the validated calibration range

Rel. uncertaintyRel. matrix/run s.d.Rel repeat. s.d.Storage condition before analysis (SC)

Concentration [ng/gm]0.60.50.40.30.20.1

%

16

14

12

10

8

6

4

2

0

1 sr : Repeatability standard deviation

2 swR : In-house reproducibility standard deviation


หนา 109

Factorial effects

Matrix-induced deviation of recovery in % + - proport. constant muscle

-4.68 -12.46

egg

10.72 4.94

milk

6.30 2.23

honey

-12.34 -15.99

Chemist/Analyst Team A (Tatsamon) Team B (Mayures)

1.07 -0.55

Storage condition before analysis 2 to 8 C

room temp (25 to 30 C)

1.81 1.72

SPE technique Automatic SPE

Manual SPE -0.07 0.55

Lot Number of cartridge C18, Phenomenex

C18, -0.02 0.72

Storage duration before analysis direct

3 nights -0.69 -0.32

HPLC Column Zorbax SB C18

Luna -0.57 0.65

Interruption during extraction non stop

after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

-1.85 -0.59

Power function

Concentration [ng/gm]0.60.580.560.540.520.50.480.460.440.420.40.380.360.340.320.30.280.260.240.220.20.180.160.140.120.1

Pro

babi

lity

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

คมอการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC Survey parameters

Sample Matrices Chemist/Analyst

Storage condition before analysis

SPE technique

Lot Number of cartridge

Storage duration before analysis

HPLC Column

Interruption during extraction

LEVEL 1 0.1

LEVEL 2 0.2

LEVEL 3 0.3

LEVEL 4 0.6

Beta[1] Beta[2]

S_03 muscle Team A (Tatsamon)


Automatic SPE

C18, direct Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.094 0.185 0.275 0.592 -0.0179 1.0118

S_28 honey Team A (Tatsamon)


Manual SPE C18, Phenomenex

direct Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.075 0.154 0.254 0.526 -0.0219 0.9128

S_24 milk Team B (Mayures)



direct Luna non stop 0.117 0.232 0.339 0.638 0.0244 1.0262

S_19 milk Team A (Tatsamon)


Automatic SPE

C18, direct Zorbax SB C18

non stop 0.115 0.212 0.333 0.671 -0.0057 1.1268



Manual SPE C18, 3 nights Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.109 0.196 0.3 0.679 -0.0352 1.1807

S_15 egg Team B (Mayures)


Automatic SPE

C18, direct Luna non stop 0.112 0.231 0.34 0.69 -0.0031 1.1543


2 to 8 C Manual SPE C18, direct Zorbax SB C18


0.11 0.23 0.336 0.689 -0.0059 1.1566


2 to 8 C Automatic SPE

C18, 3 nights Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.094 0.187 0.277 0.607 -0.0232 1.0444

S_31 honey Team B (Mayures)


Automatic SPE

C18, direct Zorbax SB C18


0.082 0.194 0.264 0.515 0.0129 0.8391


2 to 8 C Manual SPE C18, Phenomenex

3 nights Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.09 0.188 0.276 0.597 -0.0203 1.0244



C18, Phenomenex

direct Luna non stop 0.095 0.186 0.274 0.578 -0.0106 0.9773



Manual SPE C18, 3 nights Zorbax SB C18

non stop 0.088 0.179 0.273 0.584 -0.0213 1.0053



Manual SPE C18, 3 nights Zorbax SB C18


0.112 0.224 0.327 0.697 -0.0157 1.1829

S_07 muscle Team B (Mayures)


Automatic SPE

C18, Phenomenex

3 nights Luna non stop 0.095 0.186 0.283 0.599 -0.0168 1.0229

S_09 egg Team A (Tatsamon)


C18, 3 nights Zorbax SB C18

non stop 0.117 0.222 0.355 0.662 0.0143 1.0849

หนา 110


หนา 111



Automatic SPE

C18, Phenomenex

3 nights Zorbax SB C18

non stop 0.094 0.189 0.27 0.561 -0.0031 0.9373


2 to 8 C Manual SPE C18, direct Luna non stop 0.089 0.188 0.28 0.59 -0.0158 1.0072


2 to 8 C Manual SPE C18, direct Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.113 0.226 0.355 0.715 -0.0109 1.2102



Automatic SPE

C18, Phenomenex

3 nights Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.118 0.224 0.348 0.718 -0.0138 1.2171




direct Zorbax SB C18

non stop 0.12 0.23 0.348 0.718 -0.0095 1.2096



C18, Phenomenex


non stop 0.091 0.178 0.291 0.568 -0.0051 0.9576



Manual SPE C18, 3 nights Luna non stop 0.09 0.172 0.264 0.528 -0.0011 0.8816



C18, 3 nights Luna non stop 0.116 0.234 0.349 0.684 0.0072 1.1295




non stop 0.115 0.234 0.347 0.695 0.0006 1.1573






0.095 0.196 0.289 0.604 -0.0113 1.0229



Automatic SPE

C18, Phenomenex



0.115 0.228 0.32 0.642 0.0113 1.0496



3 nights Luna non stop 0.106 0.213 0.34 0.678 -0.0102 1.1484



C18, 3 nights Zorbax SB C18


0.092 0.193 0.304 0.641 -0.0258 1.1093


2 to 8 C Manual SPE C18, direct Zorbax SB C18

non stop 0.09 0.176 0.262 0.558 -0.0141 0.9496



C18, Phenomenex

direct Luna after elution, collect eluate overnight in 2-8 C

0.117 0.216 0.355 0.714 -0.0138 1.2129





0.109 0.195 0.34 0.612 0.0131 1.0062



C18, Phenomenex



0.12 0.231 0.358 0.71 -0.0009 1.1855


ภาคผนวกท 3 การหาคาระดบCut-Off และ คา CC ของวธทดสอบคดกรองเชงการวดปรมาณคราว ๆ ตวอยาง ท 1

ต.ย.เลขท ตวอยางปลอดสาร ตวอยางเตมสาร 0.5 g/kg 1 0.000 0.355 2 0.000 0.252 3 0.000 0.532 4 0.000 0.554 5 0.000 0.408 6 0.070 0.501 7 0.000 0.524 8 0.015 0.559 9 0.000 0.471 10 0.010 0.661 11 0.070 0.642 12 0.129 0.724 13 0.046 0.596 14 0.034 0.599 15 0.041 0.640 16 0.137 0.750 17 0.112 0.655 18 0.120 0.660 19 0.132 0.695 20 0.063 0.635

คา MRL = 1.0 μg/kg ตองการกาหนดใหคาความเขมขนเปาหมายในการคดกรองได ท 0.5 μg/kg จดหาตวอยางปลอดสาร หรอ negative (ทไดจากตางแหลง เพอใหไดตวอยางทแตกตางกน)

จานวน 20 ตวอยาง แบงออกเปนสวน ๆ (test portion) สาหรบทดสอบ นาตวอยางปลอดสาร ทง 20 ตวอยาง ทแบงสวนมา เตมสารทตองการทดสอบ ใหไดความ

เขมขน = 0.5 μg/kg

หนา 112


ทาการทดสอบตวอยางปลอดสาร และ ตวอยางเตมสาร โดยกระจายตวอยางไปทาการทดสอบหลายวน คานวณผลทดสอบของตวอยางปลอดสาร จดบนทกคาความเขมขนสงสดของตวอยางปลอดสาร ไว กรณทยกตวอยางน คอ คา 0.137 μg/kg และจดบนทกคาความเขมขนตาสดของตวอยางเตมสาร เชนกน ในกรณน คอ คา 0.252 μg/kg

ผลทดสอบทยกตวอยางมาน จะเหนไดวาผลทดสอบของตวอยาง Negative กบผลทดสอบ

ของตวอยางเตมสาร (positive) ไมคาบเกยวกน ดงนนจงอาจกะประมาณไดคราว ๆ วา CC ของวธทดสอบคดกรองน นอยกวา หรอ เทากบ 0.5 μg/kg

ซงจากตวอยางทยกมาน ความเขมขนตาสด ของตวอยาง Positive คอ คา 0.252 μg/kg

ดงนน คา Cut-off ของวธคดกรองน คอ 0.252 μg/kg ดงนนตวอยางใดทไดผลทดสอบสงกวาคา cut-off น แสดงวาผลคดกรองเปน “ผลบวก” และสงเกนคา CC ของวธน

สาหรบวธคดกรองน เกณฑการยอมรบ สาหรบ “ตวอยางควบคมผลบวก”การทดสอบ

ตวอยางชดน (batch) ตอง 0.252 μg/kg ถาไมผานเกณฑน ผลทดสอบของทงชดการทดสอบนใชไมได ทงชด

หนา 113


ตวอยาง ท 2

ต.ย.เลขท ตวอยางปลอดสาร ตวอยางเตมสาร 0.5 g/kg 1 0.000 0.355 2 0.000 0.132 3 0.000 0.532 4 0.000 0.554 5 0.000 0.135 6 0.070 0.501 7 0.000 0.524 8 0.015 0.559 9 0.000 0.471 10 0.010 0.661 11 0.070 0.642 12 0.129 0.724 13 0.046 0.596 14 0.034 0.599 15 0.041 0.640 16 0.137 0.750 17 0.112 0.655 18 0.120 0.660 19 0.132 0.695 20 0.063 0.635

สาร ก มคา MRL = 1.0 μg/kg ตองการกาหนดใหคาความเขมขนเปาหมายในการคดกรองได ท 0.5 μg/kg จากการยกตวอยางน ผลทดสอบของชดตวอยางปลอดสาร ไดคาสงสด = 0.137 μg/kg และ

ตวอยางเตมสาร ไดผลทดสอบคาตาสด = 0.132 μg/kg แสดงวาผลทดสอบของชดตวอยาง negative กบชดตวอยาง positive มคาคาบเกยวกน และพบวามผลทดสอบ 2 คาจากตวอยาง Positive ทตากวาคา 0.137 μg/kg จากตวอยาง negative (คอ 2 ตวอยางใหผลลบเทยม จากตวอยาง positive 20 ตวอยาง คดเปน 10 % ซง > เกณฑยอมรบของวธคดกรอง ให -error ไมเกน 5%)

หนา 114


จากขอมลผลทดสอบทคาบเกยวกนอย ยงไมสามารถกาหนดคา cut-off ได แสดงวาคา CC ตองสงกวา 0.5 μg/kg และวธทดสอบนไมสามารถใหผลทดสอบท ความเขมขนเปาหมาย (ทกาหนดขนท 0.5 μg/kg) คอใหผลทดสอบทยงไมนาเชอถอ

ทางแก คอ ปรบปรงวธทดสอบ หรอ ทาการพสจนความใชไดใหม โดยการปรบระดบคา

เปาหมายในการคดกรองใหสงขนกวาเดม แตควรตองตากวา หรอ เทากบคา MRL

หนา 115


ตวอยางท 3 การหาคา Cut-off และ CC ของวธทดสอบคดกรองเชงการวดปรมาณคราว ๆ (semi-quantitative) โดยการหาคาขดเปลยนระดบ Threshold (T) T = B + 1.64 SDb หรอ technical threshold B คอ คาเฉลยของผลตอบสนอง และ SDb คอ คาเบยงเบนมาตรฐาน ของตวอยางปลอดสาร “Cut-off factor” (Fm): Fm = M – 1.64 SD M คอ คาเฉลยผลตอบสนอง และคาเบยงเบนมาตรฐาน ของตวอยางเตมสาร (กรณ วธทดสอบเทคนค ELISA ผลตอบสนอง คอ คาการดดกลนแสง B/B0 % แลวแปลงเปนคาความเขมขน) ดงนน Fm = M + 1.64 SD คา Threshold (T) และ คา Cut-off factor (Fm) เปนคาจาเพาะตอชนดเนอเยอนน ๆ (matrix-specific) กราฟแสดงคา Threshold (T) และคา “Cut-off” factor (Fm)

หนา 116


ระหวางคาเฉลยของตวอยางปลอดสาร B และ T อตราการเกด “ผลบวก เทยม” มคาสงกวา 5 % ตามแนวมต 2002/657/EC จะพสจนความใชไดของ “คาความสามารถในการตรวจ CC” ตอเมอ คา Fm > B หองปฏบตการตองหา อตราการเกด “ผลบวก เทยม” ของวธทดสอบ ดวยวาสามารถ

ยอมรบไดหรอไม โดยพจารณาจากเกณฑ ถา B < Fm < T อตรา “ผลบวก เทยม” สงเกน 5 % ในกรณท Fm > T อตราของ “ผลบวก เทยม” ตากวา 5 %

หนา 117


ตวอยางท 4 การพสจนความใชไดของวธทดสอบเชงการวดปรมาณ และเชงการวดปรมาณคราว ๆ ตามแนวทางใหม วธการ ตองเลอกตวอยางมาอยางนอย 8 ตวอยาง เพอการทดลองตามการออกแบบไขว

(orthogonal design) แตละตวอยาง แบงออกเปน 5 สวนยอย (aliquots) และ 4 สวนเตมสาร ใหได 4 ระดบ

ความเขมขน ใหครอบคลมและองกบคา MRL และอก 1 สวน ไมเตมสาร ทาหนาทเปน “ตวอยางปลอดสาร” เพอใชศกษาคณสมบต ลกษณะของเนอเยอ และ เพอหาอตราการเกด “ผลบวก เทยม” (เทากบวาตองทดสอบ 8 ตวอยาง คณ 5 ระดบ = 40 ครงของตวอยางยอย) กระจายการทดสอบออกไปทางานตางวนกน เชน 8 วน ๆ ละ 1 ตวอยาง โดยแปรระดบ

ปจจยตามแผนการทดลองทออกแบบดงตาราง

โดยชนดเนอเยอ และ/หรอ ชนดสตว สามารถใชเปนปจจยหลก แตละปจจย กาหนดตวแปร

เปน 2 ระดบ จากนนใหนาเงอนไข หรอสภาวะแวดลอมใดของหองปฏบตการ หรอของขนตอนทใชในวธทดสอบทอาจสงผลกระทบ มาออกแบบเปนปจจยในการทดลองดวย โดยแตละปจจย กาหนดตวแปรเปน 2 ระดบ ใหความหมายดงน เชนระดบ 1 คอมาก/สง ระดบ 2 คอ นอย/ตา ยกตวอยางเชน กาหนดปจจย คออณหภมของการบม 2 ระดบตวแปรในการทดลอง คอระดบ 1 อณหภม 37C และ ระดบ 2 อณหภม 25 C เปนตน ขอสงเกต คอ อทธพลจากเนอเยอ หรอจากทกษะของผทดสอบ จะมอทธพลกระทบตอ

ผลตอบสนองอยางมากจากหลายหนทาง โดยมากจะเหนเดนชดขน (ในบางเงอนไขเฉพาะ เชนกรณ ตวอยางเนอเยอบางชนด ตองการทกษะพเศษในการเตรยม) หรอจากการเปลยนแปลงภายใตเงอนไขของการทวนซา หรอเงอนไขของการทาซา ดงนนพงเขาใจไดวาจากการออกแบบการทดสอบตามแนวทางใหมน ผลการทดสอบยอมเกดจากผลรวมจากการกระจายของปจจย และไมอาจทราบผลกระทบจากปจจยเดยวแตละปจจยได ภายใตการทาซาได ถาทดสอบ 8 ตวอยาง ควรกาหนดปจจยไมเกน 7 ปจจย ทสามารถ

คาดการณผลกระทบได (เชน อณหภมในการบม เวลาในการบม หรอทกษะของผทดสอบ เปนตน) เขาในแผนการทดลอง ถาเพมจานวนตวอยางทดสอบ กเพมปจจยทสามารถคาดการณผล

หนา 118


เพมตามไดอก อยางไรกด การศกษาปจจย 3-7 ปจจย กเพยงพอตอการหาแหลงทสงอทธพลมากตอผลทดสอบแลว ควรศกษาผลกระทบจากปจจยทไมสามารถคาดการณเพมเตมอกดวย (เชนผลจากการ

เปลยนตวผทดสอบทมทกษะทดเทยมกน หรอการใชสารเคมตางชดผลต หรอทาการทดสอบตางวน เปนตน) โดยออกแบบใหมเงอนไขเหลานในแผนการทดลองดวย ปจจยทไมสามารถคาดการณผลได (เชน สารเคม หรอ อาหารเลยงเชอ ตางชดการผลต) ควรแปรปจจยเชนน 8 ครง (ดงตาราง แตถาไมมสารเคม/อาหารเลยงเชอ ถง 8 ชดการผลต กพจารณาลดการทดสอบโดยใช 4 ชดการผลต) และผลการพสจนความใชไดทคานวณไดเปนผลรวมจากทกปจจย เมอกาหนดตวแปรทง 2 แบบไดแลว ใหออกแบบวางแผนการทดลอง ดงตวอยางในตาราง

ขางตน คอ การใช 6 ปจจยทสามารถคาดการณผลกระทบได และ 2 ปจจยทไมสามารถคาดการณผลกระทบได แตละปจจย ใหกาหนดตวแปร 2 ระดบ (เชน สง-ตา) การประเมนผลทางสถต เพอใหไดขอมลทงผลพารามเตอรตาง ๆ และ กราฟมาตรฐานแสดง

ความสมพนธระหวางความเขมขนกบผลตอบสนอง เพอใชหาอตราการเกด “ผลไมสอดคลองกบเกณฑ เทยม” ณ ความเขมขนตาง ๆ การประเมนผลไดจากการสรางความสมพนธเชงเสน (generalized mixed linear model)

ซงมการอธบายไวโดย Gowik/Uhlig 2009 การคานวณผลนสามารถใชซอฟตแวรพเศษ เชน InterVal bioscreen ถาผลการคานวณไมนาพอใจ จากการทไดอตราการเกด “ผลไมสอดคลองกบเกณฑ เทยม”

หรอ “ผลสอดคลองกบเกณฑ เทยม” ตองกาหนดระดบคา cut-off ใหม และทาการคานวณอตรา “ผลไมสอดคลองกบเกณฑ เทยม” หรอ “ผลสอดคลองกบเกณฑ เทยม” ซาใหม

หนา 119



ตวอยาง เกณฑพเศษในการกากบดแลดานสารตกตางยาสตว

หองปฏบตการอางองแหงสหภาพยโรป ไดเสนอ“คาความเขมขนทแนะนา” สาหรบสารทไมกาหนดคา MRL และยงไมมการเสนอคา MRPL ของสารกลมตาง ๆ เพอใชอางองในการออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบ

* คา CC สาหรบวธทดสอบคดกรอง และ คา CC สาหรบวธทดสอบยนยนผล ควรตากวาคาความเขมขนทแนะนาไวในทกตาราง

4.1 กรณสารทไมมการกาหนดคา MRL (no MRL could be established) 4.1.1 สารกลม A1 Stilbenes ชนดตวอยางเปาหมาย: ไดแก ปสสาวะ ตบ เพอจดประสงคของแผนตรวจตดตามสารตกคาง ชนดตวอยาง กลามเนอ เพอการควบคมสนคานาเขา และสาหรบสตวนา/ผลตภณฑสตวนา ไมควรใชตวอยาง “กลามเนอ” สาหรบแผนการตรวจตดตามสารตกคาง เนองจาก ความเขมขนของสารในกลามเนอตามาก ตารางท 1 สารกลม A1 Stilbenes

ชนดสาร ชนดเนอเยอ คาความเขมขนทแนะนา* (ppb)

สาหรบ DES 1

2

2

ปสสาวะ สาหรบ DE

สาหรบ HEX

ตบ 2 สาหรบทกสาร

Diethylstilbestrol (DES)

Dienestrol (DE)

Hexestrol เนอ (รวม ปลา ดวย) 1 สาหรบทกสาร

หนา 120


4.1.2 สารกลม A2 Thyrostats ชนดตวอยางเปาหมาย: ไดแก ปสสาวะ และตอมไธรอยด เพอจดประสงคของแผนตรวจตดตามสารตกคาง ตารางท 2 สารกลม A2 Thyrostats


Thiouracil

Methylthiouracil

Propylthiouracil

Tapazol

ปสสาวะ 10 สาหรบทกสาร

ตอมไธรอยด #

# สาร thiouracil ทความเขมขนตา ๆ สามารถถกตรวจพบได ในโค ทเลยงดวยอาหารทม cruciferous plant ผสม อยางไรกตาม จากขอมลวชาการมหลกฐานแสดงวา คาระดบความเขมขน สงกวา 10 ppb ไมสามารถเชอมโยงกบการปนเปอนทางธรรมชาตโดยการกนพชดงกลาวได 4.1.3 สารกลม A3 Steroids ชนดตวอยางเปาหมาย: ไดแก ปสสาวะ ตบ เพอจดประสงคของแผนตรวจตดตามสารตกคาง สาหรบสาร 17-oestradiol: ตองตรวจจากซรม สาหรบสาร Progestagens: ตองตรวจจากไขมนทไต ชนดตวอยาง: กลามเนอ เพอการควบคมสนคานาเขา และสาหรบสตวนา/ผลตภณฑสตวนา ตารางท 3 สารกลม A3 Steroids

สารเมตาบอไลทสทใชเปน marker สาหรบตรวจการ

ตกคาง ชนดสาร ชนดเนอเยอ คาความเขมขนท

แนะนา* (ppb)

ปสสาวะ 1

ตบ 2 Boldenone 17-Boldenone conjugate

เนอ 1

หนา 121



ตบ 2 17-19-nortestosterone1 (nandrolone)

17-19-nortestosterone2 (epi-nandrolone)

เนอ 1


ตบ 2 Ethinylestradiol

เนอ 1

ซรม 0.1 17-Oestradiol 17-Oestradiol

เนอ 1

10 เพศผ < 6 เดอน

30 เพศผ < 18 เดอน 17-Testosterone 17-Testosterone ซรม

0.5 เพศเมย <18เดอน


ตบ 2 Methyltestosterone

เนอ 1


ตบ 2 17-Trenbolone 17-Trenbolone

เนอ 1


ตบ 2 Stanozolol 16-Hydroxy stanozolol

เนอ 1

หนา 122



Dexamethasone มคา MRL ตบ, เนอ

ถาอนญาตใหใชเพอรกษา

ไขมนทไต 5 Megestrol Megestrol (acetate)

เนอ 1

ไขมนทไต 5 Melengestrol Melengestrol (acetate)

เนอ 1

ไขมนทไต 5 Chlormadinone Chlormadinone (acetate)

เนอ 0.5

ไขมนทไต 1 (MRPL) Medroxyprogesterone

Medroxyprogesterone (acetate) เนอ 1

1 17-19-nortestosterone1 (nandrolone) พบไดในสกร และ มา ทไมไดถกตอน 2 17-19-nortestosterone2 (epi-nandrolone) พบไดในแมโคทตงทอง และ ลกโคเกดใหม

หนา 123


4.1.4 สารกลม A4 Resorcylic acid lactones (RALs) และ สารอนพนธ ชนดตวอยางเปาหมาย: ไดแก ปสสาวะ ตบ เพอจดประสงคของแผนตรวจตดตามสารตกคาง ชนดตวอยาง กลามเนอ เพอการควบคมสนคานาเขา และสาหรบสตวนา/ผลตภณฑสตวนา ตารางท 4 สารกลม A4 Resorcylic acid lactones และ สารอนพนธ





ตบ 2 Zearanol1 Taleranol

เนอ 1

ปสสาวะ 1 Zearalanone

ตบ 2

1 ถาตรวจพบทง Zeranol และ Zearalenone สาร zeranol ทพบนนเปนสารพษจากการปนเปอนของเชอรา 4.1.5 สารกลม A5 สารกลมเบตาอโกนสต ชนดตวอยางเปาหมาย สาหรบการตรวจสารตกคาง ไดแก ปสสาวะ ตบ และเยอชนในสดของลกตา (retina) เพราะเปนแหลงสะสมของสารตกคาง และคงทนอยยาวนาน ขนสตว กเปนตวอยางทด แตมความเสยงเกดการปนเปอนของสารจากภายนอกไดงาย แนะนาวาถาเกบขนสตว ควรตองเกบปสสาวะจากสตวตวเดยวกน ในเวลาเดยวกนมาตรวจดวยเพอเปนการยนยน ชนดตวอยางทดรองลง: ไดแก อจจาระ และพลาสมา และลกตาทงลก ชนดตวอยาง กลามเนอ เพอการควบคมสนคานาเขา และสาหรบสตวนา/ผลตภณฑสตวนา แตความเขมขนในกลามเนอตากวามาก เมอเทยบกบชนดเนอเยอเปาหมายทกลาวมาขางตน

หนา 124


ตารางท 5 สารกลม A5 สารกลมเบตาอโกนสต


ปสสาวะ อจจาระ 0.2

ตบ ไต 0.2

Retina 2

เนอ 0.1

Plasma, นาดม 0.2

Clenbuterol (มคา MRL สาหรบโค และมา)** ดงน 0.1 ppb ในเนอ 0.05 ppb ในนมโค

0.5 ppb ใน ตบ และ ไต

Brombuterol, Chlorbrombuterol

Mabuterol, Mapenterol, Tulobuterol

Hydroxymethylclenbuterol ขนสตว 2

ปสสาวะ อจจาระ 0.5

ตบ ไต 0.5

Retina 5

เนอ 0.5

Plasma, นาดม 0.5

Clenpenterol, Clenproperol

Cimaterol, Cimbuterol

Isoxuprine, Ritrodrin

ขนสตว 5

ปสสาวะ อจจาระ 1

ตบ ไต 1

Retina 10

เนอ 1

Plasma, นาดม 1

Ractopamine

Clencyclohexerol

ขนสตว 10

หนา 125



ตบ ไต 5

Retina 10

เนอ 5

อจจาระ 5


Salbutamol

Salmeterol

Zilpaterol

Fenoterol

ขนสตว 10


ตบ ไต 10

Retina 10

เนอ 10

อจจาระ 10


Terbutaline

ขนสตว 10

ปสสาวะ อจจาระ 10

ตบ ไต 10

Retina 10

เนอ 10


Orciprenaline

ขนสตว 10

สารทกชนดในกลมAll substances อาหารสตว 50

** ตามระเบยบ Council directive 96/22/EC เบตาอโกนสต มขอยกเวนและอนญาตใหใชได กรณรกษาสตว และตามคาสงสตวแพทยอยางเครงครด

หนา 126


4.1.6 สารกลม A6 คอ สารในภาคผนวก IV ของ CR (EEC) No 2377/90 (ซงปจจบน ภาคผนวกท IV เปลยนเปน ตารางท 2 ของ CR (EU) No. 37/2010) ชนดตวอยางเปาหมายแรก: ไดแก ไข พลาสมา ซรม และ retina สาหรบการตรวจหาสารกลม nitroimidazoles ทงนขนกบชนดสตว เพอจดประสงคของแผนตรวจตดตามสารตกคาง ชนดตวอยางอนดบรอง ไดแกกลามเนอ นม นาผง เพอการควบคมสนคานาเขา และ ชนดตวอยาง: สาหรบสตวนาไดแก เนอ และผลตภณฑสตวนา ไดแก ไขกง ไขปลา ตารางท 6 สารทไมอนญาตใหใชในสตวเพอบรโภค ใน ตารางท 2 ของ CR (EU) No. 37/2010)

สารเมตาบอไลทส ทใชเปน marker สาหรบตรวจการ



สตวปก: พลาสมา, ซรม,

Retina** ไข

สกร

(และสตวอน):

พลาสมา ซรม เนอ retina**

สตวนา: เนอ

นม

นาผง

นาดม

3

Nitroimidazoles:

Ronidazole

Dimetridazole

Metronidazol

Hydroxy-metabolites

อาหารสตว 50

เนอ นม ไข

สตวนา Chloramphenicol

ปสสาวะ

0.3 (MRPL)

หนา 127


เนอสตวปก

Nitrofurans

Metabolites:

AMOZ, AHD,

AOZ, SEM

สตวนา

นม

ไข

1 (MRPL)

Dapsone เนอ นม 5

Chlorpromazine ไต 10

** สาหรบ retina เปนตวอยางทดสาหรบตรวจสารตกคาง แตยงไมไดกาหนด “คาความเขมขนแนะนา”ใหได เนองจากยงไมกาหนดวาจะใชเฉพาะสวนใดของตา เชน retina หรอ ดวงตาทงลก 4.1.7 สารกลม B2d สารกดประสาท (Sedatives) ตวอยางเปาหมาย: ไต ตารางท 7 สารกลม B2d สารกดประสาท (Sedatives)


Acepromazine

Propiopromazine

Haloperidol

ไต 50

หนา 128


4.1.8 สารกลม B2e สารตานการอกเสบทไมใชสเตยรอยด ( Non-Steroidal Anti Inflammatory Drugs หรอ NSAIDs) ชนดตวอยางเปาหมายแรก: ไดแก เนอ และ นม ชนดตวอยางอนดบรอง ไดแก ไต ตบ และ พลาสมา ตารางท 8 สารกลม B2e สารตานการอกเสบทไมใชสเตยรอยด (NSAIDs)


Phenylbutazone

Oxyphenylbutazone 5

Ibuprofen

Naproxen

Mefenamic acid

เนอ

นม

ไต

ตบ

พลาสมา

10

Diclofenac (หามใชในสตวผลตนม) นม 5

4.1.9 สารอน ๆ และตวอยางสารทมคา sum – MRPL ตารางท 9 สารอน ๆ




Malachite green (MG) Leucomalachite green (LMG) ปลา: เนอ

2 ppb**

(sum MRPL)

Carbadox quinoxaline-2-carboxylic acid (QCA) เนอ ตบ 10

Olaquindox methylquinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA) เนอ ตบ 10

** ตวอยาง Malachite green + Leucomalachite green มการกาหนดคา “Sum-MRPL”

หนา 129


4.1.10 ความเขมขนทแนะนาสาหรบยาสตวทไมอนญาตใหมการตกคางใน นาผง ตารางท 10 ความเขมของทแนะนาของสารตาง ๆ ในนาผง ทวธทดสอบควรตรวจได

กลมสาร ชนดสาร ชนดตวอยาง คาความเขมขนทแนะนา* (ppb)

Chloramphenicol 0.3 (MRPL) A6

Nitrofurans 1 (MRPL)

Tetracyclines 20

Sulphonamides 50

Streptomycin 40 B1

Macrolides: Erythromycin, Tylosin

นาผง

20

4.2 กรณสารทมการกาหนดคา Maximum Residue Limit (MRL) and Sum MRL ในทนจะยกตวอยางเฉพาะ สารทมคา sum MRL เนองจากเกยวของกบการออกแบบการพสจนความใชไดของวธทดสอบ โดยการเปรยบเทยบคามาตรฐานของยโรป Commission Regulation (EU) No 37/2010 กบของ codex ตวอยางยาสตวชนดตาง ๆ ทม “คา Sum-MRL” ซงแตกตางกน ดงนนในขอบเขตการพสจนความใชไดควรระบใหชดเจนในเรองเกยวกบคา sum-MRL ดวย ตารางท 11 ตวอยางเกณฑ คา Sum-MRL ทกาหนดโดยยโรป เทยบกบ CODEX

ชอสาร

สารตกคางเปาหมาย (Marker

residues)

ชนดสตว

เนอเยอเปาหมาย

EU Sum-MRL

CODEX Sum-MRL

(μg/kg)

หมายเหต

เนอ 100 100 100 100*

60 100 100 60

ผลรวมของ ตบ Azaperone Azaperone สกร ไต ยากลอมประสาท และ ไขมน Azaperol (+หนง)*

หนา 130


ชอสาร สารตกคางเปาหมาย (Marker

residues)

ชนดสตว


EU Sum-MRL

CODEX Sum-MRL

(μg/kg)


เนอ Chlotetracycline Oxytetracycline

Tetracycline

สารตงตนเดยว หรอผลรวม

ของแตละสาร

ตบ สตวปก ไต ไข

200 600 1200 400

Chlortetracycline

ผลรวมของสารตงตน

และ 4 - epimer ของสารนน

(CTC + 4 epi-CTC)

Oxytetracycline OTC + 4 epi-OTC

Tetracycline TTC + 4 epi-TTC

100 300 600 100 200

เนอ ตบ สตวทก

ชนด ไต นม ไข

เนอ

50 50 50

1000 100

Cypermethrin และ alpha-

Cypermethrin (ใชเปนยาสตว เพอเปน insecticides)

ผลรวมของCypermethrin และ alpha-

Cypermethrin

ตบ โค ไต แกะ ไขมน นม*

คา MRL เฉพาะนมโคเทานน

20 20 20 200 20

เนอ

Cypermethrin Cypermethrin

(sum of isomers)

สตวเคยว

เอองทกชนด

ตบ ไต

ไขมน นม

หนา 131


ชอสาร สารตกคางเปาหมาย (Marker

residues)

ชนดสตว


EU Sum-MRL

CODEX Sum-MRL

(μg/kg)


เนอ ตบ ไต โค

ไขมน นม

200 300 300 300 200

200 600 300 300 200

Spiramycin

ผลรวมSpiramycin + Neospira-

mycin 200 400

- 300*

200 600 800 300

เนอ ตบ ไต ไก

ไขมน (+หนง)*

100 100 100 100 100

*เนอ นม สารตงตน ตบ โค กลมซลโฟนาไมดส (ยาซลฟาทกชนด)

(Parent drug) สตว ไต ผลรวมของสารตงตนในกลม

ทกชนด แพะ ไขมน นม* แกะ

เนอ สตว ตบ ไมระบชนด ไต

ไขมน

100 100 100 100

Sulfadimidine (Sulfamethazine) Sulfadimidine

โค นม 25

ซงไดยกตวอยางการคานวณของยากลมซลโฟนาไมดส ทมการกาหนดคา sum-MRL สาหรบสารเดยว หรอ ผลรวมของสารเดยวทตรวจพบ ดงตอไปน หมายเหต: ตวอยางทยกมาน เปนผลทดสอบของวธทดสอบททดสอบเฉพาะสารตงตนเดยว (Sulfathiazole, Sulfamethoxazole และ Sulfamethazine) เทานน

หนา 132


ตวอยางท 1 แสดงตวอยางทผลรวมของสารทตรวจพบ มากกวา คา sum-MRL ของกลมซลโฟนาไมดส การคานวณ:

โดยใชขอมลจากการพสจนความใชไดของวธ คอ คา CC และ SD CC SD = คาความเบยงเบนมาตรฐานทไดมาจากคา reproducibility ภายในหองปฏบตการ ทระดบความเขมขนใกลเคยงทสดกบความเขมขนทตรวจพบในตวอยาง และ ใชหลกการกระจายและถวงนาหนกแตละสาร Sum MRL = 100 g/Kg

สาร 1 (Sulfathiazole): C1 = 15 g/Kg; (SD1 = 3 g/Kg; CC = 133 g/Kg); หาคา w1 = ? สาร 2 (Sulfamethoxazole): C2 = 30 g/Kg; (SD2 = 3.6 g/Kg; CC = 120 g/Kg); หาคา w2 = ? สาร 3 (Sulfamethazine): C3 = 70 g/Kg; (SD3 = 5.6 g/Kg; CC = 113 g/Kg); หาคา w3 = ? C1+C2+C3 = 15+30+70 = 115 คดเปนจานวนเตม 1 ดงนน C1 = 15 คดเปนสดสวนนาหนก w1 = 0.13 ดงนน C1 = 30 คดเปนสดสวนนาหนก w2 = 0.26 ดงนน C1 = 70 คดเปนสดสวนนาหนก w3 = 0.61

สตร Sum CC = MRL + 1.64* SD

√(w1*SD12+w2*SD22+w3*SD32) = ? √(0.13*32+0.26*3.62+0.61*5.62) = 4.86 g/Kg แทนคา MRL & SD Sum CC = 100 + 1.64* 4.86 = 108 g/Kg C1+C2+C3 = 15+30+70 = 115 > 108 C1+C2+C3 > Sum CC = Non-compliant

การรายงานผล = พบสารตกคาง 3 ชนด ปรมาณความเขมขนรวมกนสงเกนคา Sum CC

ผลทดสอบไมสอดคลองกบเกณฑ หรอ ไมผานมาตรฐาน

หนา 133


ตวอยาง 2 แสดงตวอยางทผลรวมของสารทตรวจพบ นอยกวา คา sum-MRL

สาร 1 (Sulfathiazole): C1 = 33 g/Kg; (SD1 = 14.7g/Kg; CC = 133 g/Kg); หาคา w1 = ? สาร 2 (Sulfamethoxazole): C2 = 36 g/Kg; (SD2 = 13.2 g/Kg; CC = 120 g/Kg); หาคา w2 = ? สาร 3 (Sulfamethazine): C3 = 49 g/Kg; (SD3 = 7.2 g/Kg; CC = 113 g/Kg); หาคา w3 = ? C1+C2+C3 = 33+36+49 = 118 คดเปนจานวนเตม 1 ดงนน C1 = 33 คดเปนสดสวนนาหนก w1 = 0.28 ดงนน C2 = 36 คดเปนสดสวนนาหนก w2 = 0.30 ดงนน C3 = 49 คดเปนสดสวนนาหนก w3 = 0.42

สตร Sum CC = MRL + 1.64* SD

√(w1*SD12+w2*SD22+w3*SD32) = ? √(0.28*14.72+0.3*13.22+0.42*7.22) = 11.7 g/Kg แทนคา MRL & SD Sum CC = 100 + 1.64* 11.7 = 119.18 g/Kg C1+C2+C3 = 33+36+49 = 118 < 119 C1+C2+C3 < Sum CC = Compliant

การรายงานผล = พบสารตกคาง 3 ชนด ปรมาณความเขมขนรวมกน ตากวาคา sum CC

หรอ ผลทดสอบสอดคลองกบเกณฑ หรอ ผานมาตรฐาน

หนา 134


ชอหองปฏบตการอางองดานสารตกคางยาสตวและขอบเขตความรบผดชอบ

ตางรางท 12 ชอหองปฏบตการอางองดานสารตกคางยาสตวและขอบเขตความรบผดชอบ

ชอ ทอย ขอบเขตความรบผดชอบ 1 AFRL for VDR ASEAN Food Reference Laboratory for Veterinary Drug Residue หองปฏบตการอางองแหงอาเซยนดานอาหาร สาขาสารตกคางยาสตว งานสารตกคางยาสตวและฮอรโมน กลมตรวจสอบคณภาพเนอสตวและผลผลตจากสตว สานกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว ทอย 91 หม 4 ถนนตวานนท ตาบลบางกะด อาเภอเมอง จงหวดปทมธาน 12000 โทรศพท : +662 967 9705 โทรสาร : +662 963 9217 http://www.dld.go.th/qcontrol

Prohibited substances listed in Table 2 of Commission Regulation (EU) No 37/2010 of 22 December 2009 e.g. Nitrofurans Chloramphenicol Dimetridazole Metronidazole Ronidazole Beta-agonists Antibiotics :- Aminoglycosides Macrolides Quinolones/Fluoroquinolones Sulfonamides Tetracyclines Anticoccidial Substances Steroid/NSAIDs Anthelmintics

2 BVL-CRL Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit ทอย Diedersdorfer Weg 1 D-12277 Berlin, Germany Phone: +49(0)3018-412-2302 Fax: +49(0)3018-412-2300 [email protected] http://fis-vl.bund.de/Public/irc/fis-vl/Home/main?index

Beta-agonists Anthelmintics Anticoccidials including nitroimidazoles Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)

หนา 135


หนา 136

ตารางท 12 ชอหองปฏบตการอางองดานสารตกคางยาสตวและขอบเขตความรบผดชอบ (ตอ)

ชอ ทอย ขอบเขตความรบผดชอบ 3 RIVM-CRL EU CRL for residues RIVM-National Institute for Public Health and the Environment Institute ทอย P.O. Box 1 3720 BA Bilthoven, The Netherlands Phone: +31-30-274911 Fax: +31-30-2749271 [email protected] http://www.rivm.nl/residues

Stilbenes, stilbene derivatives and their salts and esters Antithyroid agent Steroids Resorcylic acid lactones (RALs) including zeranol Sedatives Mycotoxins

4 ANSES-CRL Agence nationale de sécurité sanitaire (French Agency for food, Environmental and Occupational Health & Safety) ทอย Fougères Laboratory La Haute Marche, Jarené BP 90203 3502 FOUGÈRES Cedex Phone: +33(0)2 99 94 78 78 Fax: +33(0)2 99 94 78 80 http://crl.fougeres.afssa.fr

Antibacterial substances, including sulphonamides and quinolones Carbadox and olaquindox Chloramphenicol Dapsone Nitrofurans Dyes


ตารางท 13 Residue or substance group to be tested () by type of animal, their feedingstuffs, including drinking water, and primary animal products Type of animal, feedingstuffs or animal products substance groups Bovine,

Ovine, carprine, porcine, equine animals

Poultry Aquaculture animals

Milk Eggs Rabbit meat and the meat of wild (*) game and farmed game

Honey

Group A Substances having anabolic effect and unauthorized substances

A 1 Stilbenes, stilbene derivatives, and their salts and esters

A 2 Antithyroid agents A 3 Steroids A 4 Resorcylic acid lactones including zeranol A 5 Beta-agonists A 6 Compounds included in Annex IV to Council Regulation (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990 Group B Veterinary drugs and contaminants B 1 Antibacterial substances, including sulphonamides, quinolones Group B 2 Other veterinary drugs B 2a Anthelmintics B 2b Anticoccidials, including nitroimidazoles B 2c Carbamates and pyrethroids B 2d Sedatives B 2e Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) B 2f Other pharmacologically active substances Group B 3 Other substances and environmental contaminants B 3a Organochlorine compounds including PCBs B 3b Organophosphorus compounds B 3c Chemical elements B 3d Mycotoxins B 3e Dyes B 3f Others (*) Only chemical elements are relevant where wild game is concerned

Source: Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996

หนา 137


ภาคผนวกท 5 ตวอยางการประเมนคณลกษณะเฉพาะตามเกณฑ CD 2002/657/EC ตวอยางท 1 ตวอยางการประเมนคณลกษณะเฉพาะของวธทดสอบ (การทวนซาได) ซงผลการทดสอบชดนผานเกณฑ

การหาคาการทวนซา (Repeatability) ของการวเคราะหสาร CTC โดย HPLC MRL 100 μg/kg

0.5 เทา MRL 50 μg/kg 1.0 เทา MRL 100 μg/kg 1.5 เทา MRL 150 μg/kg

ชด/วนท1 ชด/วนท2 ชด/วนท3

ชด/วนท1

ชด/วนท2 ชด/วนท3

ชด/วนท1

ชด/วนท2 ชด/วนท3

Replicate 1 32 35 41 Replicate 1 67 71 73 Replicate 1 105 99 113 Replicate 2 37 37 41 Replicate 2 69 71 73 Replicate 2 113 104 116 Replicate 3 32 35 30 Replicate 3 69 73 70 Replicate 3 96 104 119 Replicate 4 34 35 39 Replicate 4 64 73 73 Replicate 4 99 104 107 Replicate 5 37 37 41 Replicate 5 75 73 73 Replicate 5 102 107 107 Replicate 6 34 36 40 Replicate 6 74 72 71 Replicate 6 100 106 110 Replicate 7 32 35 36 Replicate 7 75 73 70 Replicate 7 102 104 119 Mean 34 36 38 Mean 70 73 72 Mean 102 104 113 S.D. 2.4 1.2 4.2 S.D. 4.2 1.2 1.4 S.D. 5.2 2.4 4.9 C.V. 7.0 3.4 11.1 C.V. 6.0 1.7 1.9 C.V. 5.1 2.3 4.4 % Recovery 67.9 71.4 76.7 % Recovery 70.5 72.5 71.8 % Recovery 68.3 69.5 75.2 ภาพรวมคาเฉลย 36 ภาพรวมคาเฉลย 72 ภาพรวมคาเฉลย 106 ภาพรวม SD 3.3 ภาพรวม SD 2.7 ภาพรวม SD 6.3 ภาพรวมการทวนซา CV 9.2 ภาพรวมการทาซา CV 3.7 ภาพรวมการทาซา CV 5.9 เกณฑการยอมรบ ไมเกน 15 เกณฑการยอมรบ ไมเกน 15 เกณฑการยอมรบ ไมเกน 11 Is the repeatability acceptable? Yes การทาซา ผานเกณฑหรอไม

หนา 138


หนา 139

ตวอยางท 2 ตวอยางการประเมนคณลกษณะเฉพาะของวธทดสอบ (การทวนซาได) ซงผลการทดสอบชดนไมผานเกณฑ

การหาคาการทวนซา (Repeatability) ของการวเคราะหสาร CTC โดย HPLC MRL 100 μ g/kg

0.5 times MRL 50 μg/kg 1.0 times MRL 100 μg/kg 1.5 times MRL 150 μg/kg Day 1 Day 2 Day 3 Day 1 Day 2 Day 3 Day 1 Day 2 Day 3 Replicate 1 32 35 51 Replicate 1 67 61 93 Replicate 1 105 89 93 Replicate 2 37 37 51 Replicate 2 69 71 94 Replicate 2 85 104 130 Replicate 3 32 35 40 Replicate 3 69 84 88 Replicate 3 96 104 143 Replicate 4 34 35 49 Replicate 4 64 73 94 Replicate 4 89 134 137 Replicate 5 37 37 51 Replicate 5 63 73 74 Replicate 5 122 134 91 Replicate 6 34 36 55 Replicate 6 74 58 102 Replicate 6 80 88 129 Replicate 7 32 35 47 Replicate 7 75 73 99 Replicate 7 102 104 133 Mean 34 36 49 Mean 69 70 92 Mean 97 108 122 S.D. 2.2 1.0 4.7 S.D. 4.6 8.6 9.1 S.D. 14.2 19.0 21.2 C.V. 6.6 2.7 9.6 C.V. 6.7 12.3 9.9 C.V. 14.7 17.5 17.4 % Recovery 68.0 71.4 98.3 % Recovery 68.7 70.4 92.0 % Recovery 64.7 72.1 81.5 ภาพรวมคาเฉลย 40 ภาพรวมคาเฉลย 77 ภาพรวมคาเฉลย 109 ภาพรวม SD 7.5 ภาพรวม SD 13.1 ภาพรวม SD 20.4 คาการทวนซาได โดยรวม %CV 19.0 คาการทวนซาได โดยรวม %CV 17.0 คาการทวนซาได โดยรวม %CV 18.7 เกณฑการยอมรบ ไมเกน 15 เกณฑการยอมรบ ไมเกน 15 เกณฑการยอมรบ ไมเกน 11 Is the repeatability acceptable? NO การทาซา ผานเกณฑหรอไม


ตวอยางท 3 ตวอยางการประเมนคณลกษณะเฉพาะของวธทดสอบ (ความแมน) ซงผลการทดสอบชดนผานเกณฑ

การคานวณความแมน Trueness โดยการทดสอบวสดอางองรบรอง (CRM) CRM for CTC in porcine muscle: ผลคารอยละการกลบคน (% Recovery) Recovery 1 64.5 Recovery 2 72.8 Recovery 3 67.3 Recovery 4 68.9

คารอยละการกลบคนเฉลย (Mean Recovery)

68.4

วเคราะห ตวอยาง CRM ความเขมขนทวดได

[Measured content (μg/kg)]

ความเขมขนทชดเชยดวยคารอยละการกลบคนแลว

[Recovery-corrected content (μg/kg)]

ซาท 1 184.6 270.0 ซาท 2 174.3 254.9 ซาท 3 163.4 239.0 ซาท 4 157.4 230.2 ซาท 5 210.9 308.4 ซาท 6 163.4 239.0 คาเฉลย (Mean) 256.92 คาเบยงเบนมาตรฐาน (SD) 28.94 คาสมประสทธความแปรปรวน (%CV) 11.26

การเปรยบเทยบผลทดสอบกบคารบรอง (Comparison with Certified Value)

คารบรอง (Certified value) 290.2 เกณฑยอมรบลาง [Lower tolerance (%)] 20

ระดบความเขมขนเกณฑดานลาง [Lower tolerance (μg/kg)] 232.2

เกณฑยอมรบดานบน [Upper tolerance (%)] 10

ระดบความเขมขนเกณฑดานบน [Upper tolerance (μg/kg)] 319.2

ผลทดสอบทวดไดเมอเทยบกบคาจรงผานเกณฑหรอไม

ผาน / Yes [Is Trueness acceptable]

หนา 140


คาศพท

A Abridged validation = การพสจนความใชไดแบบยอ/ตดตอน ในคมอนใชวา ขนตอนเสรม Accuracy = คาความถกตอง Alpha () error = คาความคลาดเคลอน Alternative method = วธทางลด Applicability = การใชงานวธทดสอบ As low as reasonable achievable ความเขมขนตาสดเทาทสามารถตรวจได B Beta () error = คาความคลาดเคลอน Biochemical method = วธทดสอบดวยเทคนคทางชวเคม Biological method = วธทดสอบดวยเทคนคทางชวภาพ Blank sample/matrix = ตวอยางปลอดสาร/เนอเยอปลอดสาร C Calibration curve = กราฟมาตรฐาน Certified reference material (CRM) = วสดอางองรบรอง Combined measurement uncertainty = คาความไมแนนอนของการวดรวม Confirmatory test = วธยนยนผล Conventional validation = การพสจนความใชไดของวธทดสอบทขนอยกบรปแบบแบบธรรมดา Critical concentration (CC) = ระดบความเขมขนทสาคญ ใชเปนจดเปลยน หรอ เกณฑ Cut-off = เกณฑการคดกรองผลทดสอบ D Decision limit (CC) = เกณฑการตดสน Detection capability (CC) = ความสามารถในการตรวจ Design = ออกแบบ E Experimental plan = แผนการทดลอง Extended uncertainty = ความไมแนนอนขยาย

หนา 141


F False compliant result = ผลสอดคลองกบเกณฑเทยม False negative result = ผลลบเทยม False non-compliant result = ผลไมสอดคลองกบเกณฑเทยม False positive result = ผลบวกเทยม Factor = ปจจย Fragment ion = ประจของโมเลกลสวนหนงทแตกออกจากโครงสรางของสาร G Guideline = แนวปฏบต I Incurred matrix = เนอเยอทมสารตกคางอยแลว Incurred – possitive sample = ตวอยางทมสารตกคางอยจรง Initial validation = การพสจนความใชไดขนตน In-house validation = การพสจนความใชไดทดาเนนการโดยหองปฏบตการแหงเดยว Interlaboratory study = การศกษาเปรยบเทยบกนระหวางหองปฏบตการ Internal quality control (IQC) = การควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ Intra – laboratory performance level (LPL) = คาขดความสามารถของหองปฏบตการ Ion = ประจ L Level = ระดบ Limit = ขดจากด เกณฑ M Maximum residue limit (MRL) = ความเขมขนสงสดทยอมใหตกคางในอาหารได (เกณฑการกากบดแล) Method Validation = การพสจนความใชไดของวธทดสอบ Measurement uncertainty = ความไมแนนอนของการวด Minimum required performance limit (MRPL) = คาขดความสามารถขนตา (ความเขมขนของสาร) ทวธทดสอบตองตรวจได (เกณฑการกากบดแล) Model – independent validation = การพสจนความใชไดของวธทดสอบทไมขนอยกบรปแบบ N Negative control sample = ตวอยางควบคมผลลบ Noise = สญญาณรบกวน

หนา 142


O Originating laboratory = หองปฏบตการตนตารบ P Permitted limit concentration = คาความเขมขนทอนญาต Physicochemical method = วธทดสอบดวยเทคนคทางฟสกสเคม Positive control sample = ตวอยางควบคมผลบวก Precision = ความเทยง Q Quality assurance = กระบวนการทจะทาใหมนใจในคณภาพ มกใชคาวา การประกนคณภาพ Qualitative method = วธทดสอบวดผลเชงคณลกษณะ Quality control sample = ตวอยางควบคมประสทธภาพ Quality system = ระบบคณภาพ Quantitative method = วธทดสอบวดผลเชงปรมาณ R Ratio = อตราสวน Receptor laboratory = หองปฏบตการทรบถายโอนวธทดสอบ Recovery = คาการกลบคน Reference point of action (RPA) = คาอางองเพอใชในการดาเนนการ Regulatory/action limit = คาความเขมขนในการกากบดแล (เกณฑการกากบดแล) Regulator/Regulatory body = หนวยงานทมอานาจ หนาทในการกากบดแล Repeatability = คาการทวนซาได Reproducibility = คาการทาซาได Ruggedness = ความทนทานของวธทดสอบ S Screening test = วธคดกรอง Screen positive control sample = ตวอยางควบคมผลบวก Semi – quantitative method = วธทดสอบวดผลเชงกะปรมาณ Signal = ผลตอบสนอง Signal to noise ratio = อตราสวน ผลตอบสนอง ตอ สญญาณรบกวน Single laboratory studies = การพสจนความใชไดของวธทดสอบโดยหองปฏบตการแหงเดยว Specificity = ความจาเพาะ Spiked/fortified matrix = เนอเยอเตมสาร

หนา 143


หนา 144

Stability = ความเสถยร T Trueness = คาความแมน U Uncertainty = ความไมแนนอน V Validation = การพสจนความใชไดของวธทดสอบ W Within – laboratory reproducibility = คาการทาซาไดภายในหองปฏบตการแหงเดยว X x-axis = แกน x Y Y axis = แกน Y Yield = ผล(สาร)ทสกดได y-intercept = จดตดแกน y Z Zero tolerance = เกณฑการยอมรบเปนศนย

Method Validation Manual According to

Commission Decision 2002/657/EC

Confirmatory and Screening Methods For

Veterinary Drug Residues Testing Laboratories

2012

Sujittra Phongvivat, DVM, MS Bureau of Quality Control of Livestock Products, Department of Livestock Development 4/10/2012

คู มือการพิสูจน ความใช ได ของ...

Documents

Transcript of คู มือการพิสูจน ความใช ได ของ...