7 Effects of Antibiotics on Quorum Sensing in Pseudomonas Aeruginosa 2008

Naciones Unidas NTIMICROBIAL La SEÑORES Y C Hemoterapia,octubre de 2008, p. 3648-3663 Vol. 52, N ° 10

0066-4804 / 08 / $ 08,00 0 doi: 10.1128 / AAC.01230-07 Copyright © 2008, Sociedad Americana de Microbiología. Todos Los Derechos Reservados.

Efectos de los antibióticos sobre Quorum Sensing en

Pseudomonas aeruginosa

Mette E. Skindersoe, 1 † Morten Alhede,

1 Richard Phipps,

1 Liang Yang,

1 Pedro O. Jensen,

3

Thomas B. Rasmussen, 2 Thomas Bjarnsholt, 1 Tim Tolker-Nielsen, 1

Niels Høiby, 3 y Michael Givskov

1 *

Biomédica Microbiología, BioSys, Bldg. 227, de la Universidad Técnica de Dinamarca, Kgs. Lyngby DK-2800,

1 Fisiología, culturas y División de enzimas, Chr-Hansen A / S, Bøge Alle' 10-12, Hørsholm DK-2970,

2 y el

Departamento de Microbiología Clínica, Rigshospitalet, Universidad de Copenhague, Copenhague DK-2100, 3

Dinamarca

Recibido 19 de septiembre 2007 / devueltos para el 23 de octubre de 2007 de modificación / Aceptado 11 de

junio 2008

Durante la Infección, Pseudomonas aeruginosa Emplea la Comunicación bacteriana (deteccion de quórum [QS]) Parr Coordinar la Expresión de Factores Que Danan los Tejidos. La expresión génica controlada-QS juega un papel fundamental en la virulencia de P. aeruginosa, y los mutantes-QS deficientes causan infecciones menos graves en modelos de

infección animal.El tratamiento de la fibrosis quística (FQ) infección crónica con P. aeruginosa con el antibiótico azitromicina macrólido (AZM) se ha demostrado para mejorar el resultado clínico.Varios estudios indican que AZM puede cumplir su acción beneficiosa en los pacientes con FQ al impedir QS, reduciendo así la patogenicidad de P. aeruginosa. Esto nos llevó a investigar si

la inhibición de QS es una característica común de los antibióticos. Se presentan los resultados de una investigación de 12 antibióticos por sus actividades QS-inhibitorias mediante un selector descrito previamente inhibidor QS 1 cepa. Tres de los antibióticos probados, AZM, ceftazidima (CFT) y ciprofloxacina (CPR), eran muy activos en el ensayo y se examinaron más por sus efectos

sobre la producción de factor de virulencia regulados por QS en P. aeruginosa.Los efectos de los tres antibióticos administrados a concentraciones subinhibitorias se investigaron mediante el uso de micromatrices de ADN. Resultados consistentes de las pruebas de factor de virulencia, transcriptasa reversa-PCR, y los microarrays de ADN apoyan la conclusión de que AZM, CFT, y

RCP disminuir la expresión de una serie de factores de virulencia regulados por QS. Los datos sugieren que el mecanismo subyacente puede ser mediada por cambios en la permeabilidad de la membrana, lo que influye en el flujo de N -3-oxo-dodecanoyl- lactona L -homoserina.

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El patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa causa infecciones graves, sobre todo en inmunodeprimidos indi-

UALs y pacientes con fibrosis quística (FQ).El progresivo deterioro de los pulmones causada por P. crónica infecciones

aeruginosa y, por lo tanto, la inflamación persistente son actualmente las principales causas de morbilidad y mortalidad

en los pacientes con FQ (55).Tratamiento antipseudomónica Intensivos (mantenimiento del ther-APY) ha mejorado en

gran medida las perspectivas de los pacientes con FQ (26, 29, 72). Un efecto secundario grave de la terapia antibiótica es

el desarrollo de resistencia a los antibióticos utilizados (3, 15, 28, 54). P. aeruginosa biofilms forma durante el proceso

de infección, que se suma a las dificultades de la erradicación de las infecciones por la intervención anti-bióticos, ya que

las células bacterianas que viven como biopelículas son mucho más tolerantes a los antibióticos que sus contrapartes ses-

planctónicos (4, 14, 17).Cuando la infección entra en un estado crónico, los domina, el fenotipo de alginato

superproductoras mucoides (22). Los macrólidos tales como eritromicina, claritromicina, eritromicina y la azitromicina

derivado (AZM) han sido demostrado que inhibe la actividad enzimática de guanosina-diphosphoman nariz

deshidrogenasa en la ruta biosintética de alginato de mucoide P. aeruginosa cepas en concentraciones muy por debajo de

la MIC (44, 49).Alginato induce una reacción antígeno-anticuerpo continua localmente en las vías respiratorias pequeñas.

Por lo tanto, un menor nivel de

* Autor para correspondencia. Dirección postal: Biomédica Microbiología, BioSys, Bldg 227, de la Universidad Técnica de

Dinamarca, Kgs. Lyngby DK-2800, Dinamarca. Teléfono: 45 4525 2769. Fax: 45 4593 2809. E-mail: [email protected].

† Dirección actual: ChemoMetec A / S, Gydevang 43, DK-3450 Al-leroed, Dinamarca. Publicado antes de impresión el 21 de julio de 2008.

la producción de alginato no sólo reduce la viscosidad de la SPU-tum, pero también puede conducir a una menor

inflamación y, por lo tanto, la mejora de la función pulmonar (8, 41, 49). Varios estudios clínicos han demostrado que el

tratamiento a largo plazo con AZM mejora la función pulmonar y el peso corporal en los pacientes con FQ (27, 43, 76).

AZM generalmente no se considera que muestra una actividad antipseudomónica debido a su MIC para P. aeruginosa en

el intervalo de 128 a 512 g / ml (43).Las mayores concentraciones de AZM se encuentran en el esputo de los pacientes

que recibieron terapia de dosis alta (250 mg diarios AZM) es 0,6 a 79,3 g / ml, con la concentración AZM mediana de 9,5

g / ml (6). Se ha sugerido que el tratamiento AZM inhibe el reclutamiento de neutrófilos al pulmón mediante la reducción

de los niveles de expresión de citoquinas proinflamatorias y la inhibición de la migración neu-trophil, resultando en una

reducción significativa en la inflamación de las vías respiratorias-específico (88).

También se ha sugerido que la inhibición de la célula-célula com-municación es el modo de acción por el cual AZM

ejerce su actividad en P. infecciones aeruginosa (60, 84).En las bacterias gram-negativas, la comunicación celular,

también conocido como quórum sens-ción (QS), se basa en pequeñas moléculas señalizadoras difusibles (lactonas N acilo

L -homoserina [AHL]), que interactúan con activadores-TRANSCRIP cional a pareja la expresión de genes con la

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densidad de población de células.El sistema QS de P. aeruginosa se organiza JERAR-chically, con los componentes

RhlI-RHLR estar subordinada a los componentes Lasi-LASR.LASI dirige la síntesis de N -3-oxo-dodecanoyl- lactona L -

homoserina (OdDHL), mientras que RhlI sintetiza N -butanoil-L-homoserina lactona (BHL).P. células aeruginosa son

permeables a BHL, que se difunde libremente a través de la membrana celular, se requiere mientras que el eflujo activo

para el transporte de OdDHL (67).Además de la AHL

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V OL. 52, 2008 EFECTOS ANTIBIÓTICOS EN DETECCIÓN DE QUORUM EN P. AERUGINOSA 3649

moléculas señal BHL y OdDHL, tercera señal intercelular, 2-heptil-hidroxi-4-quinolona (designado la señal de quinolona

Pseudomonas [PQS]), se ha encontrado para ser parte del regulón QS en P. aeruginosa (70).Todos ellos función en

concierto para controlar la expresión de una serie de genes, incluidos los genes que codifican exoproductos que dañan los

tejidos (31, 51, 62, 66). En ad-condición para el control de la producción de factores de virulencia, se ha informado de las

moléculas señal QS PQS y OdDHL poseer efectos inmunomoduladores, y de esta manera, contribuyen directamente a la

patogénesis de P. aeruginosa (24, 42, 85).

Varios estudios han demostrado los efectos de AZM en la ex-presión de los genes de virulencia regulados por QS in

vitro (40, 60, 84). La aplicación de un modelo de ratón CF, hemos demostrado recientemente que el tratamiento AZM

mejoró significativamente el aclaramiento de bacterias pulmonares, reduce el grado de abscesos pulmonares y la

disminución de la gravedad de la patología pulmonar, y reducido el nivel de la producción de alginato in vivo y también

en experimentos in vitro , a pesar de que no tuvo efecto sobre el crecimiento de las bacterias que infectan (40). Desde QS

parece jugar un papel clave en la expresión de la virulencia y la interacción con la protección del huésped, los inhibidores

de QS se han sugerido para ser componentes importantes de terapias antipseudomonal futuros (37). Ejemplos de

compuestos que pueden bloquear QS en P. aeruginosa son los halofuranones (32, 38), que se originan a partir de un

macroalgas bentónicas y el de hongos metabolitos patulina y ácido penicillic (74).Furanona C-30 inhibe específicamente

QS durante un intervalo de concentración de 1 a 10 M; pero cuando se administra en exceso, es decir, en Concentra-ciones

10 veces mayor, el compuesto afecta el crecimiento y Exhib-sus propiedades antibióticas. Además de QS-inhibitoria

actividad (QSI), los halofuranones bioactivos exhiben una multitud de actividades, incluidas las propiedades antibióticas y

anti-incrustantes, y por lo tanto pueden considerarse compuestos multifuncionales en-amordazada en la comunicación, así

como la competencia (para una revisión reciente, véase la referencia 21). Se ha demostrado recientemente que en las sub-

MICS antibióticos afectan ampliamente los patrones de-la trascripción en las bacterias y parecen funcionar como

mediadores de señalización en lugar de la función por la orientación del crecimiento de rivales (35). Esto plantea la

cuestión de si otros compuestos identificados previamente por sus propiedades antibióticas pueden llegar a propiedades-

pos sess que interfieren con la comunicación y, poten-cialmente, la actividad QSI. Para tratar de responder a esta pregunta,

se presentan los resultados de una investigación de 12 antibióticos para sus activ-dades QSI. Se identificaron tres

antibióticos, AZM, ciprofloxacina (CPR), y ceftazidima (CFT), que presentan fuertes QSI activ-dades en el ensayo de

selección. Los efectos de estos tres antibi-antibióti- se investigaron adicionalmente por medio de ensayos de transcriptoma

anal-analysis y fenotipo.

MATERIALES Y METODOS

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Cepas bacterianas aplicadas en este estudio. El secuenciado P. aeruginosa PAO1 de tipo salvaje cepa se obtuvo del Genetic Stock Center

Pseudomonas (cepa PAO0001; www.pseudomonas.med.ecu.edu).El mutante lasI-rhlI se construyó mediante el uso de un sistema de eliminación se informó

anteriormente (7).El QSI selector QS deformación selector inhibidor 1 (QSIS1) fue descrito previamente (73). Pantalla bacteriana para la inhibición de QS. QSIS1 Strain se ha descrito previamente en detalle (73).El elemento de QS se deriva del sistema QS

regulado LuxR de Vibrio fischeri y se clonó en Escherichia coli, donde se responde a una amplia gama de AHL y los inhibidores de QS (2, 73, 74).QSIS1

alberga plásmido pUC18Not- luxR- P luxI -RBSII- pHLA T -T 0 1 Ap r mantenido en CSH37 (59), una E. coli cepa que constitutivamente expresa galactosidasa.El concepto general de la

selector

sistema implica la presencia de un regulador de QS (luxR o un homólogo) gen y un promotor QS-controlado fusionado a un gen que codifica un producto

génico tóxico.En la presencia de moléculas de señal, el gen bajo control QS se expresa, causando la muerte celular. Sin embargo, en presencia de un

compuesto QSI, la producción del producto del gen tóxico está apagado y las bacterias son rescatados y capaz de crecer normalmente. El producto del gen

tóxico del sistema selector QSIS1 es citolítica fosfolipasa A, que se origina a partir de Serratia liquefaciens MG1 (33, 34).Ser causa moléculas señal se

añaden al ensayo de una fuente externa, QSIs dirigidas a la sintetasa AHL no están identificados, mientras que los compuestos que en-Hance la degradación

de AHL, impide la absorción de AHL, o bloquear la interacción de AHL con la proteína luxR son encontrado.

Se añadió BT me-Dium (medio B [16] más 2,5 mg de tiamina por litro) que contiene 2% de agar (peso / vol) se fundió, 10% A10 tampón (16):

Brevemente, la preparación de pantallas de QSIS1 se realizó como sigue , y la mezcla se enfrió a 45 ° C. Para el agar ABT resultante entonces se añadieron

N -3-oxo-hexanoil- lactona L -homoserina (Sigma-Aldrich, Alemania), ampicilina (VepiDan, Dinamarca), 5-bromo-4-cloro-3-indoxyl- - D -

galactopiranósido (X-Gal; Apolo Scientific, Reino Unido), y 1-metil-2-pyrrelidon (Merck, Alemania) a concentraciones finales de 100 nM, 100 g / ml, 40 g /

ml, y 0,2% (vol / vol ), respectivamente; y el medio fue suplementado con 0,5% (peso / vol) de glucosa y 0,5% (peso / vol) casaminoácidos.Un cultivo de

una noche de QSIS1 (cultivados en medio ABT-sup complementado con 0,5% [peso / vol] de glucosa, 0,5% [peso / vol] Casamino Acids, y 100 g / ml de

ampicilina) se añadió a una concentración final de 0,4%.

Placas para el ensayo de selección fueron posteriormente hicieron vertiendo la mezcla en una caja para dar un espesor de 5 mm de agar. Wells con

diámetros de 5 mm se hicieron en las placas de agar. Tras la solidificación, 50 l de un 1 a 10 g / ml solución del antibiótico a ser probado para la actividad

QSI se añadió a los pocillos. La placa se incubó a 30 ° C durante 16 h. La aparición de una zona circular de crecimiento (que apareció azul debido a la

presencia de hidrolizado X-Gal) indicó la presencia de compuestos con actividad QSI en la muestra ensayada.

Preparación de la muestra para P. análisis aeruginosa GeneChip.Se inoculó ABT medio sup-complementado con 0,5% de casaminoácidos con

crecimiento exponencial Células de P. aeruginosa PAO1 a una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0,05, y el las células se cultivaron a 37 ° C y 200 rpm en cinco matraces de

500 ml que contenían 100 ml cada uno. Cuando el OD 600 fue de 0,3, AZM (8 y 2 g / ml; Zithromax, Pfizer), CPR (0,04 g / ml; Fluka), o CFT (0,25 g / ml; Fortum, GlaxoSmithKline) se

añadió.Estas concentraciones de antibióticos no afectaron el crecimiento de P. aeruginosa. Se recuperaron muestras cuando el OD 600 alcanzó 2,0,

inmediatamente transferido a 2 volúmenes de RNAlater (Ambion), y se almacenaron a 80 ° C. Se aisló el ARN con un kit de purificación RNeasy Mini

(Qiagen), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante, incluyendo el tratamiento de ADNasa en columna.La síntesis de ADNc se realizó con

12 g de RNA, 300 ng / l cebadores aleatorios (Invitrogen), 1500 U superíndice III transcriptasa inversa (Invitrogen), y 30 U SUPERase En inhibidor de

RNasa (Ambion), de acuerdo con el análisis Affymetrix expres-sion protocolo. El ADNc sintetizado se purificó con un kit de purificación QIAquick PCR

(Qiagen), y de 3 a 4 g de cDNA fue fragmentado con 0,2 U FPLC puro DNasa I (Amersham Bioscience) por g de ADNc. El cDNA fragmentado se marcó en

el extremo con biotina-ddUTP (Enzo kit de marcaje terminal de Bioarray) y se hibridó durante 18 h a 55 ° C a una P. aeruginosa microarrays genoma

GeneChip (Affymetrix).Los chips se lavaron y se tiñeron según el protocolo de Affymetrix. La intensidad de la señal de microarrays de hibridación se redujo

a un promedio general de la señal de 500; y el microarray se evaluó la presencia, la presencia marginal, o la ausencia de la sonda fija (en representación de

diferentes genes o marcos de lectura abiertos) por el uso de Affymetrix GeneChip sistema (versión 1.4) de software que operan. Los valores de la expresión

única de la sonda fija esti acoplado-como "presente" se incluyeron en los análisis posteriores. Los experimentos de microarrays se llevaron a cabo dos veces

por los cultivos tratados con antibióticos (dos matrices de 2 g / ml AZM, dos conjuntos de 8 g / ml AZM, dos matrices de 0,04 g / ml CPR, y dos matrices de

0,25 g / ml CFT) , mientras que los controles no tratados (referencias) se ensayaron en cuatro repeticiones. Los datos aquí p resentados están basados en el

promedio de cada serie.

La cuantificación de mRNA por PCR en tiempo real. (I) Primer diseño. Los cebadores usados para la amplificación del ARNm (Tabla 1) fueron

diseñados por el uso de software integrado de ADN Tecnologías Primer Quest (http://www.idtdna.com). Brevemente, los tamaños del amplicón diseñados

variaron de 80 a 200 pb, y las temperaturas de fusión de cebadores fueron diseñados para 60 ° C, con una diferencia de temperatura de fusión de menos de 2

° C para cada par de cebadores.Las secuencias de los cebadores también se sometieron a un análisis BLAST contra la P. aeruginosa PAO1 secuencia del

genoma para eliminar la posibilidad de unión no específica.

(Ii) PCR en tiempo real. Cada tiempo real mezcla de PCR (volumen final, 20 l) con-contenida 9 l de ADNc, 10 l de verde SYBR 2 cuantitativa mezcla

maestra de PCR (Fermentas), y 0,5 M de cada uno hacia adelante y cebador inverso.PCR en tiempo real se realizó con un detector en tiempo real Chromo4

(Bio-Rad [anteriormente MJ Research

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TABLA 1. Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo

real Gene Adelante Reverse

rhlA 5 -TCT GTT GGT ATC 5 -ACA GCA CCA CGT GGT TTG CAA GGG-3 TGA CGG AAT GTT-3 PPRA 5 -TGC TGT TGG GCA 5 -AGA CGC GAA AGG TGG ACA TCT-3 ATC AGC TT-3 ppRb 5 -TCA AGT ACG AGG 5 -TAT CTG GTA GTT TAC ACG ACG ACA-3 GGT CAG GCC CTT-3 rpoD 5 -ACA TGC GTG AAA 5 -ATG CGC TTG GCG TGG GTA CCG T-3 ATT TCG ATC T-3

http://aac.asm.org/

búsqueda]) utilizando los siguientes parámetros de ciclación: una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min antes de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s,

60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s. Los datos se analizaron por el método de cuantificación relativa eficiencia corregida (71). La expresión de los

genes diana se normalizó a la expresión de referirse-cia gen rpoD, como el análisis de microarrays de ADN mostró que la expresión de este gen era estable

en todas las condiciones.Además, Savli et al. (77) han encontrado que entre los genes de limpieza, este gen tiene la expre-sión más estable. Para controlar las

variaciones entre carreras, la limpieza de genes y los diversos genes diana para cada tratamiento individual se amplificaron al mismo tiempo en una placa de

96 pocillos. Los cambios en los niveles de expresión de los genes diana en las muestras tratadas se calcularon en relación con el nivel medio de expresión del

gen respectivo en la muestra no tratada. La eficiencia de la transcripción inversa-PCR (RT-PCR) para los pares de genes (bajo tratados frente a condiciones

no tratados) varió de menos de 5%.

Por consiguiente, las eficiencias promedio de cada gen en este estudio fueron muy similares para las condiciones en comparación, lo que permite un

análisis preciso. Los sobrenadantes de pruebas de factor de virulencia. P. aeruginosa Culturas PAO1 eran

crecido ya sea para 16 a 20 h (para el ensayo de hemólisis) o a un OD 600 de 2,0 (para la proteasa, quitinasa, y los ensayos de elastasa), como se describe

anteriormente, con 8 o 2 g / ml AZM, 0,04 g / ml CPR, 0,25 g / ml CFT, o ningún antibiótico (control). Las P. aeruginosa PAO1 QS mutante lasI - rhlI también se cultiva junto con el

tratado y sin tratar P. culturas aeruginosa PAO1.Las células se recogieron por-ción centrifuga, y los sobrenadantes se filtraron esterilizados (filtro de jeringa

de TPP; tamaño de poro, 0,22 m). Los sobrenadantes se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 20 ° C.

Ensayo de hemólisis. Los sobrenadantes de filtro esterilizado se trataron en autoclave para destruir actividad enzimática y se mezcla con la sangre venosa

de un individuo sano en una relación volumétrica de 30: 1 (sobrenadante a la sangre), observado para la hemólisis después de 20 min, y se dejó a temperatura

ambiente durante 4 h para permitir la sedimentación de eritrocitos intactos.Actividad hemolítica se observó como un claro y una coloración rojo-ing

nonprecipitat de la solución de sangre, mientras que la falta de actividad hemolítica se caracteriza por la precipitación de los eritrocitos intactos. El

experimento se llevó a cabo cuatro veces con sobrenadantes de cuatro crecimiento individual expe-mentos.

Ensayo de la proteasa. Los sobrenadantes de filtro esterilizado (300 l cada uno) se añadieron a los pocillos de placas de agar (medio ABT ABT

suplementado con 2% de agar) 5% de leche desnatada con-que contiene, y las placas se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las zonas de aclaramiento

(radios) se midieron en las fotografías de las placas mediante el uso de una regla.El experimento se realizó tres veces como cuatro repeticiones con los

sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento individuales. Los valores de las cuatro réplicas se promediaron y se utilizan como un valor para

representar cada uno de los tres experimentos.

Ensayo de elastasa. Los sobrenadantes de filtro esterilizado se mezclaron 2: 1 con tampón de phos-fosfato (0,1 M, pH 6,3), y se añadieron 2 mg / ml

elastina rojo Congo (Sigma). La mezcla se incubó a 37 ° C con agitación (200 rpm) durante 1 semana. Después de la centrifugación, la absorbancia del

sobrenadante a 495 nm se midió con un espectrofotómetro a cero en una muestra de rojo Congo elastina se incubaron con medio solo. El procedimiento se

modificó del descrito previamente (63). El experimento se realizó tres veces por triplicado con los sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento

individuales. Los valores de los experimentos por triplicado se promediaron y se utilizan como un valor para representar cada uno de los tres experimentos.

Ensayo de quitinasa. La quitinasa se midió mediante un ensayo de azul de quitina modificado (30, 36).Los sobrenadantes de filtro esterilizado se

mezclaron 2: 1 con tampón de citrato de sodio (0,1 M, pH 4,8), y se añadieron 0,5 mg / azul quitina ml (Sigma). Las mezclas azules-quitina sobrenadantes se

incubaron a 37 ° C con agitación (200 rpm) durante 1 semana. Las muestras se centrifugaron a 15.000 g durante 10 min, y la absorbancia a 570 nm se

determinó.Las muestras se compararon con espacios en blanco incubadas con medio solamente. El experimento se realizó tres veces por triplicado con los

sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento individuales. Los valores de la Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.

experimentos por triplicado se promediaron y se utilizan como un valor para representar cada uno de los tres experimentos.

Cuantificación de ramnolípido. Una curva estándar para B ramnolípido (concen tración frente a la corriente total de ionización) se calculó a partir de

datos líquidos chromatogra-PHY-electrospray-espectrometría de ionización de masas (MS). Para reducir al mínimo las posibles diferencias en los niveles de

ionización de ramnolípido entre las muestras, los estándares ramnolípido utilizados para calcular la curva de concentración se analizaron inmediatamente

antes, así como después se analizaron las muestras. La corriente total de ionización se determinó sobre la ion [M NH 4] a lo largo de los 7 668,4 s sobre el

cual ramnolípido B se eluyó.Cromatografía líquida de alta presión (LC) -MS análisis se realizó con una serie 1100 cromatógrafo líquido de alta presión

Agilent conectado a un tiempo de vuelo de masa spec-espectrómetro Micromass LCT. La concentración de ramnolípido en el cultivo sin tratar se ajusta igual

a un valor de índice de 100.

Soporte de AZM, CFT, y RCP en contra del LBD de la proteína LasR. La De rayos X estructura cristalográfica del dominio de unión al ligando

(LBD) de la proteína LasR (Protein Data Bank adhesión no.2UV0) se utilizó para el atraque de AZM, CFT, y RCP para el sitio receptor LasR mediante el

programa Molegro Docker virtual (86) y el modelo de acoplamiento plantilla con la configuración predeterminada. OdDHL se estableció como el ligando

plantilla en el LBD de la proteína LasR. Los ligandos se clasificaron mediante el uso de la puntuación rerank func-ción Molegro Docker virtual.

Análisis de datos y estadísticas. Se utilizó el análisis unidireccional de varianza seguido por la prueba de Dun-Nett para evaluar los efectos de AZM,

CFT, y el tratamiento CPR y el efecto de la mutación lasI-rhlI sobre la expresión de las elastasas, quitinasa, y proteasa en comparación con su expresión en

sin tratar cepa de tipo salvaje P. aeruginosa PAO1.Las pruebas se realizaron con el programa de software Graph-Pad InStat (versión 3) (San Diego, CA).

Las diferencias se consideraron significativas si el valor de p fue de 0,05 o menos.

Microarray número de acceso de datos. Los datos de microarrays de ADN (CHP, CEL, y archivos CAD) se han presentado a la base de datos de la

Expresión Génica Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y puede ser encontrado con el número serie de experimentos GSE8953.

RESULTADOS

La detección de actividad QSI. AZM se ha demostrado que inhibe la expresión de una subfracción de genes

controlados QS-(60, 84).Junto con AZM, hemos investigado otros 11 antibióticos (incluyendo un compuesto antifúngico,

griseofulvina) por sus habilidades para interferir con QS bacterianas utilizando una sencilla pantalla de difusión en placa

basado en QSIS1 (73). Mediante el empleo de nuestras condiciones stan-dard (73), se encontró que el cloranfenicol,

genta-micin, griseofulvina, kanamicina, piperacilina, spectinamycin, tet-racycline, tobramicina y la estreptomicina mostró

bajos niveles de o ninguna actividad QSI, mientras AZM, de conformidad con investigaciones previas, era muy activo. La

CPR fluoroquinolona y la cefalosporina CFT también mostraron actividades QSI fuertes en el ensayo con QSIS1 (Fig. 1).

RCP y CFT se emplean en la clínica como tratamientos antipseudomonas, mientras AZM exhibe un bajo nivel de, en su

caso, bactericida o efecto bacteriostático contra P. aeruginosa.RCP apunta ADN girasa (topoisomerasa II) y por lo

tanto inhibe la síntesis de ADN bacteriano.CFT es una beta-lactama y funciones mediante la interrupción de la síntesis de

la capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana. El modo de acción de AZM es para unirse a la subunidad 50S del

ribosoma bacteriano, inhibiendo así la traducción de ARNm. Por tanto, estos tres antibióticos exhiben diversos

mecanismos de acción antimicrobiana, y que son estructuralmente muy diferente. Elegimos seguir investigando los

efectos en P. aeruginosa QS-gen regulado ex-presión y la producción de factor de virulencia con AZM, CPR, y CFT

como representantes de estos muy diversos grupos de antibióticos.Las curvas de crecimiento para P. aeruginosa PAO1

cultivar en la presencia o ausencia de AZM, CPR, y CFT a diferentes concentraciones (incluyendo concentraciones con

efectos ligeramente inhibidoras del crecimiento) y para el mutante lasI rhlI se presentan

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FIG. 1. Proyección de los antibióticos por el ensayo QSIS1. (A) Piperacil-lin; (B) la azitromicina; (C) cloranfenicol; (D)

ciprofloxacina; (E) gen-tamicin; (F) spectinamycin; (G) griseofulvina; (H) a la kanamicina; (I) tetra-ciclina; (J) tobramicina; Ceftazidima

(k); (L) estreptomicina.

en la Fig. 2. Hemos encontrado que la adición de 8 g / ml AZM, 0,25 g / ml CFT, o 0,04 g / ml CPR no afectó el

crecimiento de P. culturas aerugi-nosa cuando se añadió la droga cuando el OD 600 fue de 0,1. Se encontró que las CIMs

de los tres antibióticos para ser 800 g / ml (AZM), 8 g / ml (CFT), y 12.5 g / ml (CPR) en las condiciones de crecimiento

especificados. Por lo tanto, para la siguiente serie de experimentos, las concentraciones aplicadas fueron de 30 a 300 veces

menor que las MICs.

Termoestable hemolisina. Se investigaron los efectos de AZM, CPR, y CFT en la producción de hemolisina

termoestable.P. aeruginosa produce al menos dos hemolisinas, el calor-lábil fosfolipasa C (PHLC, PA0844) y el ramno

lípidos termoestable (rhlA, RHLB, rhlC y rhlG; PA3479, PA3478, PA1130 y PA3387, respectivamente) (9, 46,

83).Síntesis ramnolípido está activado en fase estacionaria temprana de P. culturas aeruginosa PAO1 (62, 89).Después

de 14 a 20 h de crecimiento (bajo las con-diciones descritas en Materiales y Métodos), la concentración de ramnolípido en

el sobrenadante excede 50 g / ml, que es suficiente para lisar los eritrocitos dentro de 20 min (Ob-observa- no publicados).

La lisis de los eritrocitos por ramnolípido puede ser utilizado como un simple ensayo para la detección de ramnolípido por

FIG. 2. Las curvas de crecimiento para el lasI - mutante rhlI () y PAO1 cepa cultivadas sin antibióticos () o PAO1 cultivaron en

presencia de 2 g / ml AZM (), 8 g / ml AZM (‰), 16 g / ml AZM (OE) , 0,04 g / ml CPR (E), 0,08 g / ml CPR (F), 0,25 g / ml CFT (), o

0,5 g / ml CFT (}).

FIG. 3. La hemólisis de los sobrenadantes de autoclave de P. culturas aeruginosa PAO1 cultivaron durante 20 h.PAO1 se cultivó sin

antibióticos (a) y en presencia de 2 g / ml AZM (b), 8 g / ml AZM (c), 0,25 g / ml CFT (d), o 0,04 g / ml CPR (e). También se muestran

mutante rhlI de PAO1 (f) - Los resultados para la lasI.

la mezcla de sobrenadante en autoclave con sangre e incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min. El

autoclave elimina la actividad de la enzima fosfo-lipasa lábil al calor. Un claro y una coloración rojo nonprecipitating de

la solución de sangre sobrenadante indica que ramnolípido está presente a una concentración muy por encima de 50 g /

ml, mientras que una falta de actividad hemolítica (caracterizado por la precipitación de células de la sangre intactas)

indica que poco (menos de 50 g / ml) o no ramnolípido está presente en el sobrenadante. La investigación de los

sobrenadantes de automóviles-claved de P. aeruginosa cultivar en la presencia o la ausencia de AZM, CPR, y CFT y los

sobrenadantes a partir del mutante QS lasI - rhlI, se encontró que sólo el tipo salvaje sin tratar produce suficiente

ramnolípido para causar la rápida hemólisis de los glóbulos rojos.Sin embargo, el tratamiento con CFT no abolió

completamente la actividad hemolítica (Fig. 3).

AZM en sub-PRM ha sido previamente informado para afectar a una fusión de genes rhlAB :: lacZ (84).Decidimos

cuantificar directamente el efecto de AZM así como los efectos de CFT y CPR en la producción de ramnolípido.De este

modo se determinó la concentración-ción de ramnolípido en los sobrenadantes de P. tratada y tratada por la ONU células

aeruginosa por LC-MS. Cuando las células se cultivaron en presencia de 8 g / ml AZM, la concentración de ramnolípido

se redujo en un 85% en comparación con el que en los cultivos no tratados, y 2 g / ml AZM redujo el contenido de

ramnolípido de los sobrenadantes por 80% en comparación con que en los cultivos no tratados, mientras que la RCP (0,04

g / ml) y CFT (0,25 g / ml) redujo la concentración de ramnolípido de 55 a 65% de que en los cultivos no tratados.El

mutante QS lasI - rhlI no produjo ninguna cantidad medible de ramnolípido (Fig. 4).

Proteasa. La producción de proteasa extracelular en P. culturas PAO1 aeruginosa cultivan en la ausencia o la pres-cia

de AZM, CPR, o CFT y en lasI - rhlI cultivos mutantes se ensayó mediante la adición de sobrenadantes de filtro

esterilizado de más-noche culturas para pozos realizados en placas de agar que contienen 5% de leche desnatada .La

actividad de la proteasa se redujo por AZM, CPR, y CFT (Fig. 5).

Elastasa. Las actividades de elastasa extracelular en los super-sobrenadantes de P. culturas aeruginosa PAO1 (no

tratados o cultivados con AZM, RCP o CFT) se cuantificaron mediante el uso de un procedimiento descrito Previ-ormente

(63).El QS mutante lasI - rhlI fue ensayada por el mismo procedimiento.AZM tratamiento redujo la actividad de la

elastasa de PAO1 casi hasta el nivel de que para la

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3652 SKINDERSOE ET AL. Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.

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FIG. 4. Contenidos ramnolípido, en unidades relativas (RU), en Superna-tantes de P. culturas aeruginosa crecen bien sin

antibióticos (barra de color negro) o en presencia de 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales), 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).El lasI - mutante rhlI de PAO1 también fue incluido en el experimento, pero no produjo una concentración medible de ramnolípido (última ranura [ninguna columna-visi ble]).La concentración de ramnolípido en el cultivo sin tratar se ajusta igual a un valor de índice de 100. El gráfico está basado en el promedio de

los índices de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de Dunnett).

lasI - rhlI mutante.RCP y CFT también redujeron la elastasa actividad (Fig. 6). Quitinasa. Las actividades de quitinasa en los sobrenadantes de P. culturas aeruginosa PAO1 (no tratados o

cultivados con AZM, CPR, o CFT) y QS mutantes lasI - culturas rhlI se quan-tificado mediante la medición de la

degradación de la quitina azul.AZM y CPR reducción de la actividad quitinolítica de PAO1 casi hasta el nivel de que para

el lasI - mutante rhlI.CFT no disminuir la actividad quitinasa tanto como lo hicieron AZM y RCP, aunque todavía tenía un

efecto (Fig. 7).

El análisis de microarrays de ADN de la expresión génica en presencia de AZM, CFT, y CPR. Con el fin de

obtener el conocimiento de la mecanismo por el cual la producción del factor de virulencia fue alterada por la presencia de

los tres antibióticos, se realizó análisis de microarrays de ADN con P. culturas aeruginosa tratados con AZM, CPR, y

CFT en concentraciones que no afectan

FIG. 6. Actividades elastolíticas de sobrenadantes de cultivos PAO1 cultivaron hasta una DO 600 de 2,0, ya sea sin antibióticos (bar

negro) o en la presencia de: 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales) , 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).La actividad elastolítico del lasI - mutante rhlI de PAO1 también se muestra

(barra blanca).El gráfico está basado en los resultados medios de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de

Dunnett).

crecimiento. El medio con crecimiento exponencial P. culturas aeruginosa (OD 600, 0,1) se suplementó con cualquiera

AZM (2 y 8 g / ml), CFT (0,25 g / ml), o CPR (0,04 g / ml) o el medio se dejó sin tratar como un control.Mediante la

aplicación de las condiciones de crecimiento se describe en Materiales y Métodos, una DO 600 de 2,0 corresponde a la

transición de la fase exponencial a la fase estacionaria, y en este punto una fracción sustancial de genes regulados-QS

están regulados al máximo (inducido o re- presionado) (80). Por lo tanto, una DO 600 de 2,0 fue elegido como el punto de muestra para el análisis transcriptómica.ARN total fue extraído de las muestras y se sometió a síntesis de ADNc. Los valores absolutos de expresión de cultivos crecidos en

presencia de antibióticos se compararon con los de los cultivos tratados con la ONU, y se presentan los cambios en la

expresión. Como se ha descrito previamente (38, 89), se tuvieron en cuenta cambios en la expresión de menos de cinco

veces. Sonda fija Sólo que estaban presentes, como validado con Affymetrix GeneChip operativo sys-tem (versión 1.4) de

software, se incluyeron en los análisis. Ac-acuerdo con estos criterios, las concentraciones no inhibidoras del crecimiento

de AZM alterada la expresión de 477 (8 g / ml) y 323 (2 g / ml) genes, con la mayoría de genes (419 y 277,

respectivamente) se downregulated. Concentraciones no inhibidoras del crecimiento de

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FIG. 5. Actividades de proteasa de los sobrenadantes de P. aeruginosa cul-turas cultivan ya sea sin antibióticos (barras negro) o en

presencia de 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales), 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro ), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).El lasI - mutante rhlI de PAO1 también se incluyó en el experimento, pero no produjo una concentración medible de la proteasa (última ranura [columna no visible]).El gráfico está basado en los resultados medios de tres

experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (prueba de Dunnett).

FIG. 7. Actividades quitinasa de sobrenadantes de cultivos PAO1 cultivaron hasta una DO 600 de 2,0, ya sea sin antibióticos (bar

negro) o en la presencia de: 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales) , 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).La actividad quitinasa del lasI - mutante rhlI de PAO1 también se muestra

http://aac.asm.org/

(barra blanca).El gráfico está basado en los resultados medios de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de

Dunnett).


TABLA 2. Efecto sobre la expresión génica

No. de genes No. de No. (%) de

genes Genes QS un

Especificidad Compuesto

(concentracion) downregulated

upregulated afectado

más que (%) B

cinco veces más que más que

cinco veces cinco veces

AZM (8 g / ml, 427 61 121 (70) 28

11 M)

AZM (2 g / ml, 227 49 81 (47) 35

2,7 M)

CFT (0,25 g / ml, 136 10 49 (28) 36

0,4 M)

CPR (0,04 g / ml, 223 58 89 (51) 40

0,1 M)

C30 c (2,5 g / ml, 260 0 125 (72) 48

10 mM)

un Genes pertenecientes a la regulon QS, tal como se define en otra parte (74).

b Especificidad está indicado por el número de genes reprimidos QS / número total de genes reprimidos.

c Los datos para el QSI furanona C30 se obtuvieron a una DO 600 de 2,0 y se incluyen para la comparación.Los datos provienen de un informe anterior

(38).

CFT (0,25 g / ml) y la RCP (0,04 g / ml) afectó a la expre-sión de 122 (114 reprimidos) y 271 genes (215 reprimidos),

respectivamente (Tabla 2).

AZM, CFT, y RCP afectan a la expresión de los genes regulados por QS. El regulón QS ha sido definido por (entre

otros) Rasmussen et al.(74). Genes que estudio en particular (74) considera que ser regulados por QS si sus niveles de

expresión en tanto lasI- rhlI y LASR - mutantes RHLR fueron alterados constantemente más de cinco veces en

comparación con los niveles de expresión en su homólogo de tipo salvaje.La mayoría de todos los genes regulados-QS

definidas de esta manera son inducibles con AHLs exógenos en un lasI - fondo rhlI.Sólo un gen (PA1556, un probable

citocromo c oxidasa subunidad) es upregulated constantemente tanto en la lasI - rhlI y la LASR - mutantes RHLR y es así

reprimible QS.El uso de este regulon QS, analizamos la frac-ción de los genes regulados por QS entre los genes

reprimidos por los tres antibióticos. Estos análisis mostraron que AZM (8 g / ml) reprimida 71% de los 174 genes QS-

regulada en P. aeruginosa PAO1 y que el 29% de todos los genes están reprimidos por AZM eran miembros de la

regulon QS.La reducción de la concentración de AZM a 2 g / ml provocó un alivio en la inhibición de QS de los genes

regulados (47% de todos los genes reprimidos QS), y el número total de genes downregulated cayó a 277, mientras que el-

dad específica hacia la QS regulon aumentó ligeramente a 30%. CPR tuvo la mayor especificidad para el regulón QS

(48%) y dirigido 49% de todos los genes QS en P. aeruginosa, mientras que la especificidad para CFT fue de 39% y

CFT reprimida sólo el 25% de todos los genes QS.Para la comparación, la especificidad de C30 fue del 48%, y el regulado

72% de todos los genes QS en P. aeruginosa (datos brutos de C30 son de un informe anterior [38] y han sido sometidos

al mismo tratamiento de datos y criterios que los datos en bruto para AZM, CFT, y RCP).Los efectos de AZM, CFT, y

CPR en la expresión de genes pertenecientes a la regulon QS se muestran en la Tabla 3.

Los datos de la matriz de ADN muestran que los miembros de la regulon QS están sobrerrepresentados entre los genes

reprimidos por sub-CIM de AZM, CFT, y RCP. Esto sugiere que estos antibióticos presentan alguna especificidad para

QS-regula la expresión génica a través de una interacción con o un efecto sobre QS regulador

componentes. La investigación de los perfiles de expresión de genes REG-ulados por LasR, RHLR o LasR-RHLR, que

tuvo como objetivo más para dilucidar el destino QS potencial (s) de los antibióticos. Los genes QS-regulada se pueden

dividir en cuatro grupos. Grupo A contiene 44 genes LasR-dependientes, es decir, genes downregulated tanto en un

mutante LASR y LASR - RHLR mutante.Grupo B consta de genes-RHLR dependientes (14 genes), es decir, genes

regulados tanto en un mutante RHLR y LASR - RHLR mutante.Grupo C comprende la fracción principal de QS-

regulados los genes (102 genes en total) y se compone de los genes que son downregu-RELAClONADAS en los tres tipos

de mutantes:. LASR, RHLR y LASR - RHLR Por último, el grupo D se compone de 14 LasR -RhlR-dependiente genes,

que sólo se downregulated si tanto LasR y RHLR son eliminados, como en el LASR - mutante RHLR.Curiosamente,

parece que AZM, CFT, y RCP tenían menos de una preferencia por los genes del grupo B (los genes RHLR específicos)

(Fig. 8).

A pesar de que todos los tres antibióticos exhiben un mayor grado de especificidad para los genes-LASR regulado que

para los genes RHLR-dependientes, ninguno de estos antibióticos downregulated los genes de la sintetasa de AHL. AZM,

sin embargo, causó la downregu-mento de siete veces LASR, que también puede contribuir al efecto de QSI AZM. Esto

está de acuerdo con la observación de que AZM (2 g / ml) ha sido reportada para disminuir el nivel de expresión de un

gen de fusión LASR :: lacZ (84).

Entre los genes afectados por AZM, CFT, y RCP, muchos codificar previamente identificado genes QS-regulados como

chiti-nase (Chic, PA2300) y la proteína de unión a quitina (CBPD, PA0852) (30, 80, 89).Otros genes conocidos QS-

inducidas, tales como los genes que codifican la proteína osmóticamente inducible (OSMC, PA0059) y citocromo c

oxidasa (coxAB y COIII, PA0105 a PA0108), son downregulated por la presencia de los tres antibióticos (38, 80).El gen

de PIV endoproteasa

(también conocido como prpl [PA4175]) también se downregulated por AZM, CFT, y RCP. Esta proteasa es capaz de

elastina degradantes, decorina, y la familia de la transferrina de las proteínas, incluyendo lactoferrina (92).PA5099 (un

transportador probable), que pertenece a la regulon QS, se downregulated más de 300 veces por AZM y CPR y 50 veces

por CFT. El regulón contiene sólo un gen, PA1556, que está reprimida por QS. Este gen, que codifica el citocromo c

oxidasa, se reguló por los tres antibióticos, y así fue el PA1557 gen vecino, un probable cito-cromo oxidasa

subunidad.Muchos de los genes de la región de PA2134 a PA2190 del genoma se downregulated por AZM, CFT, y RCP.

Esta región se ha encontrado que sea tan-ciado con crecimiento estacionario y estar bajo QS / rpoS con-trol (79, 80, 89,

90).De los 57 genes en esta región 60,69 kpb, 46 se encontró que estar presente en todos los arrays. De los 46 genes, 35

genes fueron reprimidos más de cinco veces por AZM y RCP. RCP y especialmente AZM parecía exhibir mayor objetivo

especí-ficities para genes QS que CFT, que está de acuerdo con los resultados de los ensayos de factores de virulencia

descritos anteriormente en esta sección. Muchos factores de virulencia QS-regulados, como la metaloproteinasa alcalina

(APRA, PA1249), la proteasa PfpI (pfpI, PA0355), la proteasa LASA (LASA, PA1871), elastasa B (lasB, PA3724), el

citotóxico lectina galactophilic (PA -IL; Leca, PA2570) y ramnolípido (rhlA y RHLB; PA3478 y PA3479,

respectivamente), fueron reprimidos más de cinco veces por AZM y RCP pero no por CFT. Estos resultados fueron

confirmados por RT-PCR, que demostró que AZM downregulated expresión rhlA 45 veces,

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TABLA 3.Efectos de la sub-CIM de AZM, CFT y RCP en P. aeruginosa genes

pertenecientes a la regulon QS una

Génica en

P. Regulació

n

Expresión

relativa

Gene ppR

b

b Reg

.

d Descripció

n

AZM AZM

aeruginos

a por AZM c CF

T RC

P LASL

-rhlI LASR-RHLR

LASR

RHLR

(2 g /

ml) (8 g /

ml)

PA0059 OSMC C

19.

8 63.

4 8.6 16.8 22.0 31.8 44.0 25.8 Proteínas osmóticamente

inducible OSMC

PA0105 coxB C 20.

0 25.

3 8.3 10.5 11.5 13.5 18.7 7.9 El citocromo c oxidasa, subunidad II

PA0107 C 91.

9 29.

0 11.0 17.0 17.4 14.1 18.6 11.4 Hipotética proteína

conservada

PA0108 colII C 14.

2 33.

8 13.2 12.2 27.8 8.5 15.8 6.3 Citocromo oxidasa,

subunidad III

PA0122 C 3.0 14.


conservada

PA0188 C 2.9 32.


PA0355 pfpl C 7.5 12.

5 3.6 6.6 11.8 21.5 17.7 11.6 Proteasa Pfpl

PA0567 C 9.2 22.


conservada

PA0572 La 3.5 6.0 2.3 3.4 10.4 13.7 8.2 1.1 Hipotética proteína

PA0737 C 3.3 3.4 4.1 4.3 9.4 7.7 94.4 5.8 Hipotética proteína

PA0843 PLCR La 4.7 7.8 2.7 3.3 7.1 6.2 25.0 4.6 Proteína accesoria

fosfolipasa PLCR

7.0 35.

0 5.0 10.1 63.7 74.4 33.2 8.3

precursor

PA0852 CBPD C

Proteína precursora

CBPD vinculante

quitina-

http://aac.asm.org/


conservada

PA0996 pqsA La 2.0 1.7 1.3 1.3 7.0 20.8 34.5 3.3 Coenzima A Probable

ligasa

PA0997 pqsB La 1.2 1.2 1.1 1.0 12.6 15.4 59.2 3.1 Homóloga a beta-ceto-

acil-acilo

1.3

1.1 8.2 13.9 29.9

proteína transportadora

sintasa

PA0998 pqsC La 1.2 1.2 2.8 Homóloga a beta-ceto-

acil-acilo

proteína transportadora

sintasa

PA0999 PQSD La 1.6 1.2 1.0 1.3 8.2 9.8 20.2 2.6 3-Oxoacyl- proteína

portadora de acilo

7.9 12.0 28.9

sintasa III

PA1000 pqsE La 2.1 1.1 1.4 1.3 3.6 Proteína de respuesta de

señal quinolona

PA1001 phnA La 1.9 1.0 1.0 1.6 6.6 9.7 20.9 3.2 Componente antranilato

sintasa I

PA1002 phnB La 1.5 1.1 1.2 1.3 7.3 5.2 6.3 5.5 Componente antranilato

sintasa II

PA1131 B 1.9 5.2 1.4 2.4 5.9 11.1 2.9 6.

6 Probables gran

superfamilia facilitadora

6.5 8.1 3.8 3.3 21.5 19.1 26.6 3.9

transportador

PA1168 La Hipotética proteína

PA1190 C 19.

2 26.


conservada

PA1242 C 5.7 10.


PA1249 ap D 23.

5 54.

2 3.5 5.3 7.3 8.4 4.1 2.7 Precursor de

metaloproteinasa alcalina

PA1250 Aprl D 1.2 1.5 1.1 1.5 9.7 5.5 3.0 1.0 Inhibidor de proteinasa

alcalina Aprl

PA1323 C 11.

2 35.


PA1324 C 10.

5 23.


PA1412 C 5.5 11.


PA1431 Rsal La 2.6 2.2 1.3 2.2 3,619.

1 3,441.

9 3,038.0 1.9 Rsal proteína reguladora

PA1432 LASL La 1.9 1.2 1.8 1.7 97.0 133.1 39.0 1.5 Autoinductora síntesis de

proteínas Lasi


PA1556 C 15.6 17.

5 9.9 9.2 7.9 6.0 7.8 5.3 C citocromo oxidasa

subunidad probable

PA1625

C

Hipotética proteína conservada

3.7 5.1 3.7 7.4 6.6 9.0 6.5 5.5


conservada

PA1662 D 1.5 3.5 2.3 1.4 5.7 9.0 4.3 4.4 Probables ClpA / tipo B

proteasa




PA1669 B 6.3 2.8 2.0 1.4 28.6 12.7 3.8 10.3 Hipotética proteína

PA1784 La 5.5 14.


PA1869 C 1.2 3.2 1.0 2.7 137.1 287.9 23.6 25.1 Proteína portadora de

acilo probable

PA1870 C 4.3 11.


PA1871 Lasa C 10.

3 32.

9 2.9 9.0 105.4 147.8 31.3 7.1 Lasa proteasa precursora

3654 S

KIN

DE

RS

OE

ET

AL

.

Un N

TIM

ICR

OB

. Un

HE

MO

TH

ER

SE

ÑO

RE

S C.

Descargado de org.asm.aac por el 18 de octubre 2009


PA1875 La 7.5 16.7 12.3 20.5 34.2 9.0 6.7 1.1 Probables proteína de

membrana externa

1.4 27.6 3.1 4.1 21.8 25.3 19.1 51.2

precursor

PA1901 phzC2 C Biosíntesis de proteínas

fenacina PhzC

PA1902 phzD2 C 1.3 42.9 3.5 4.5 133.5 132.0 97.7 91.0 La biosíntesis de

proteínas fenacina PhzD

PA1903 phzE2 C 1.3 20.0 2.7 4.5 17.2 24.4 18.6 19.7 La biosíntesis de

proteínas fenacina PhzE

PA1904 phzF2 C 1.1 20.8 3.5 3.8 134.0 61.6 77.4 44.7 Biosíntesis fenacina

probable

proteína

PA1905 phzG2 C 1.2 15.9 2.6 4.4 14.1 32.7 20.8 30.0 Piridoxamina probable

5-fosfato

24.0 31.9 5.5 6.8 92.8 15.1 100.0 1.4

oxidasa


conservada



PA2067 La 3.5 13.4 2.1 5.9 6.0 5.7 5.3 4.2 Hidrolasa probable

PA2068 C 3.2 13.4 1.8 5.5 8.5 19.4 18.5 25.0 Probables gran


4.2 70.4 2.3 6.7 29.3 72.9 26.1 26.8

transportador

PA2069 C Transferasa carbamoíl

probable




PA2142 C 27.1 18.9 12.3 19.5 13.4 16.4 18.2 26.8

Probables

deshidrogenasa de

cadena corta


PA2144 glgP

La 11.0 22.1 6.9 7.4 7.3 20.8 11.4 4.8 La glucógeno fosforilasa


conservada


conservada



conservada

PA2153 glgB C 15.0 30.0 4.2 6.4 6.9 11.3 19.1 9.2 Enzima de ramificación

de 1,4-alfa-glucano

PA2158 C 23.8 68.3 12.3 43.9 65.0 10.3 35.9 52.4 Probable alcohol

deshidrogenasa (Zn

9.0 9.6 3.9 7.9 8.2 8.2 6.9 5.3

dependiente)

PA2163 C Hipotética proteína

PA2165 C 16.5 19.7 7.5 14.4 8.7 5.4 6.2 7.5 Glucógeno sintasa

probable



PA2170

C 4.1 5.1 3.1 8.6 8.2 14.1 5.4 6.5 Hipotética proteína



PA2178 D 7.0 3.6 3.6 21.9 11.2 6.3 4.3 4.9 Hipotética proteína

PA2184

C 5.0 6.7 4.7 7.3 15.5 13.9 17.5 20.8 Hipotética proteína

conservada


conservada

PA2193 HCNA B 3.5 1.5 1.7 1.4 262.2 256.6 3.0 9.1 El hidrógeno de cianuro

sintasa HCNA

PA2194 hcnB B 2.3 3.9 1.1 1.3 123.1 43.1 2.3 8.3 El hidrógeno de cianuro

sintasa HcnB

PA2195 HCNC

B 1.7 4.3 1.1 1.5 20.5 38.9 2.7 6.9 El hidrógeno de cianuro

sintasa HCNC

PA2300 elegante C 20.2 45.4 8.1 20.7 33.8 66.7 82.8 34.0 Quitinasa

PA2302 La 3.3 9.6 1.8 3.3 13.2 17.5 10.1 1.2 Péptido no ribosomal

probable

3.1 10.5 1.5 2.1 87.9 212.8 59.2 1.3 sintetasa



PA2305 La 1.7 2.8 1.1 1.5 6.5 16.7 8.8 1.1 Péptido no ribosomal

probable

12.2 51.7 4.6 11.3 32.2 17.6 16.4 7.7

sintetasa

PA2414 C L -Sorbosone

deshidrogenasa


Continúa en la página siguiente V O

L. 5

2, 2

008

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655


TABLA 3 Continuación

Génica en

P.

Regulación

Expresión

relativa

Gene ppRb b

Reg. d

Descripción

AZM AZM

aeruginosa por AZM c CFT RCP

LASL-rhlI

LASR-RHLR LASR RHLR

(2 g /

ml) (8 g /

ml)






conservada

PA2570 Leca C 25.9 76.4 4.5 14.9 45.4 49.2 27.2 30.3 Leca

PA2587 pqsH La 1.6 2.1 1.6 2.3 46.1 36.1 20.4 1.3 FAD dependientes

probable mono

3.3 4.5 2.4 4.3 6.7 34.3 87.8 2.4

oxigenasa

PA2588 La Regulador transcripcional

probable

PA2591 D 1.1 1.2 1.1 1.3 7.1 14.8 2.2 1.1 Regulador transcripcional

probable

PA2592 D 1.3 1.2 1.4 1.1 6.7 17.9 3.8 1.6 Espermidina periplásmico

probable /

4.1 4.7 4.2 6.1 5.8 7.8 8.7 12.5

proteína de unión

putrescina-

PA2708 C Hipotética proteína



conservada


conservada


conservada



PA2939 La 10.6 38.6 3.5 6.5 39.8 9.1 12.7 1.8 Aminopeptidasa probable




PA3326 D 1.5 4.2 1.3 1.0 12.3 11.0 2.4 4.1 Probables dependiente de

ATP familia Clp

1.4 5.0 1.0

5.4 12.7 5.0 9.8

proteasa

PA3327 C 1.3 Péptido no ribosomal

probable

1.3 4.5 1.1 1.2 6.5 26.0 3.2 12.4

sintetasa

PA3328 B FAD dependientes

probable mono

3.8

54.9 173.5 6.1 69.3

oxigenasa

PA3329 C 1.3 1.9 1.3 Hipotética proteína

PA3330 B 4.3 1.1 1.7 1.3 62.4 179.6 4.4 19.5 Probables deshidrogenasa

de cadena corta

PA3331 B 1.1 4.1 1.8 1.6 19.8 62.0 3.8 23.8 Citocromo P450


conservada

PA3333 fabH2 B 1.3 7.4 1.0 1.2 17.0 33.4 4.1 10.4 3-Oxoacyl- proteína

portadora de acilo

3.8

42.8 17.4 5.1 11.2

sintasa III

PA3334 C 1.2 1.8 1.7 Proteína portadora de acilo

probable


PA3336 B 9.3 2.4 1.5 1.3 8.2 9.3 4.3 22.8 Probables gran


1.4 12.3 1.6 2.5 22.4 28.9 13.2 15.3

transportador

PA3361 lecB C Lectina de unión a PA-IIL

fucosa




PA3460 La 12.9 28.0 2.0 3.2 5.0 6.0 7.0 4.7 Acetiltransferasa probable

PA3476 rhIL D 1.6 2.0 1.2 1.6 19.0 41.4 2.4 1.8 Autoinductora síntesis de

proteínas RHLL

PA3478 RHLB C 7.3 31.7 2.4 6.3 120.2 122.7 19.5 53.0 Ramnosiltransferasa

cadena B

PA3479 rhlA C 5.0 28.3 1.8 5.3 320.2 196.0 14.5 55.0 Una cadena de

ramnosiltransferasa


3656 S

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DE

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Un N

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HE

MO

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S C.


PA3581 GlpF C 163.4 43.8 14.0 99.3 61.0 88.9 19.1 35.1 Proteína facilitador

captación glicerol

PA3584 glpD C 9.2 12.2 8.1 6.3 5.7 20.4 12.0 8.4 El glicerol-3-fosfato

deshidrogenasa


PA3692 C 7.9 26.7 3.1 4.4 30.7 16.8 37.5 12.3 Probables proteína de

membrana externa

3.5 22.8 2.5 6.1 167.2 224.3 15.1 5.2

precursor

PA3724 lasB C Elastasa LasB




conservada

PA3888 La 2.5 3.2 2.1 3.5 5.8 10.2 10.5 4.6 Permeasa probable de

ABC transportador

PA3890 C 3.8 5.1 2.6 6.7 17.8 87.2 64.7 31.8 Permeasa probable de

ABC transportador





PA4078 * La 6.2 15.8 4.3 6.4 5.6 11.0 7.4 4.8 Péptido no ribosomal

probable

1.9 1.3

9.6 6.2 3.3

sintetasa

PA4130 D 1.4 1.1 1.5 Sulfito probable o nitrito

reductasa

PA4133 La 2.6 1.8 2.1 1.1 57.4 13.0 6.1 1.6 El citocromo c oxidasa

subunidad (cbb3

3.3 3.3 1.8 12.0 5.6 18.0 1.2

Tipo)

PA4134 La 1.9 Hipotética proteína



PA4142 C 2.1 11.7 2.1 4.2 27.2 71.7 25.6 26.4 Proteínas de secreción

probable

PA4143 C 2.6 14.4 2.1 3.4 8.1 15.3 7.3 9.0 Transportador de toxina

probable

PA4171 C 7.4 10.0 4.9 6.3 5.4 15.5 13.6 9.5 Proteasa probable

PA4175 prpl La 12.0 25.4 6.7 15.8 28.4 47.1 30.4 1.6 PVDS reguladas

endoproteasa, lisil

10.8 1.9 1.9 9.8 18.8 11.9 7.5

clase

PA4209 phzM C 1.8 -Fenacina específica

probable

1.0 11.8 2.3 5.6 65.1 123.9 79.7 20.2

metiltransferasa

PA4210 phzA1 C Biosíntesis fenacina

probable

15.5 2.2 2.3 51.0 61.2 59.7 46.1

proteína

PA4211 phzB1 C 1.4 Biosíntesis fenacina

probable

9.6 2.2 2.2 11.4 12.9 8.9 10.9 proteína

PA4217 phzS C 1.4 Flavin que contienen

mono-oxigenasa

PA4290 C 23.4 19.0 26.8 25.3 7.2 6.0 14.2 15.9 Transductor quimiotaxis

probable





conservada


conservada

PA4876 osme C 5.3 10.4 3.4 4.8 18.2 9.1 10.8 6.7 Lipoproteína

osmóticamente inducible

6.8 17.3 4.5 4.4 6.0 29.6 12.9 12.9

Osme

PA4880 C Bacterioferritina probable

PA5097 D 4.2 18.2 12.5 5.8 9.5 5.2 3.4 4.8 Permeasa de aminoácidos

probables

PA5099 C 188.0 353.2 54.1 450.6 16.2 14.7 40.5 39.9 Transportador probable



PA5235 GLPT B 4.3 2.7 2.6 5.0 15.2 32.4 2.8 13.9 Transportador de glicerol-

3-fosfato

PA5297 poxB D 3.1 9.4 2.0 3.5 17.8 6.0 3.8 2.8 Piruvato deshidrogenasa

(citocromo)


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Regulación byAZM c

b

Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.

mientras que la RCP y CFT reducen el nivel de expresión rhlA de 10 y 3 veces, respectivamente.

AZM, CFT, y CPR alterar la expresión de una variedad de genes. A pocos genes se upregulated consistentemente

por AZM, CFT, y RCP. El genes reprimibles QS PA1556 (cito-oxidasa subunidad cromo c) y PA1557 se indujeron más

de cinco veces.PA2260 (una proteína hipotética previamente identificados [89] para ser un gen represible QS) fue

inducida por AZM y CFT pero no por RCP.

Varios genes fueron inducidos solamente por AZM. Una alta proporción-ción de estos genes han previamente también

ha informado de que AZM inducible (60), aunque hubo una serie de diferir-cias en el montaje experimental entre el

estudio y el estudio anterior (60). Por ejemplo, el estudio anterior (60) utiliza la P. aeruginosa PAO1 cepa DSM 1707 en

lugar del P. aeruginosa cepa PAO1 del Pseudomonas genética Stock Center utiliza aquí.Por otra parte, el estudio de

Nalca et al. (60) también aplicó el medio de infusión cerebro corazón complejo y rico en vez de medio mínimo. Muchos

de los genes inducidos por subunidades ribosomales codifican AZM, tales como PA3742 (RPL) y PA4671 (proteína

ribosomal probable).La sobreexpresión de genes ribosomales puede ser un mecanismo que compensa el efecto de AZM,

que apunta a la subunidad ribosomal 50S. El factor de iniciación de

INFA (PA2619) también se indujo en la pres-cia de AZM, de acuerdo con los resultados anteriores (60).De acuerdo con

los resultados de dos estudios recientes (12, 53), se encontró que la RCP induce la expresión de los genes pyocin S

(PA0985 para pyocin S5, PA1150 para pyocin S2 y PA3866 para el pyocin proteína S3-like). Los piocinas de tipo S son

bacteriocinas sensibles a la proteasa y tienen estructuras colicina similares y modos de acción.

El factor de modulación ribosoma (RMF, PA4296) fue re-presionado por AZM pero no se vio afectada por el

tratamiento con CFT o CPR. Análisis del transcriptoma anteriores (60) también mostraron que rmf es reprimida por AZM.

El rmf de P. aeruginosa muestra alto grado de homología con el rmf de E. coli (similitud, 66%). rmf mutantes de E. coli

se ha demostrado que poco a poco pierden su viabilidad en cultivos de fase estacionaria (61); Sin embargo, un estudio

reciente concluyó que rmf (en E. coli) puede ser necesaria sólo en condiciones de crecimiento de la competencia (13).

AZM induce la expresión de genes relacionados con T3S. En Accor-dance con los resultados anteriores (60),

también encontramos que AZM induce la expresión de genes implicados en la secreción de tipo III (T3S).P. aeruginosa

utiliza su sistema T3S para entregar varios productos citotóxicos en el citosol de las células eucariotas.La expresión de

T3S incrementa la patogenicidad de P. aeruginosa y se asocia con infecciones más graves y mayores tasas de mortalidad

en modelos animales (1, 75, 78).QS se ha demostrado que modulan negativamente la expresión del sistema T3S en P.

aeruginosa (10), lo que significa que el sistema T3S es downregu-RELAClONADAS bajo condiciones de alta densidad

celular y por lo tanto presumiblemente juega un papel principalmente en las primeras etapas de la infección.Los genes en

el sistema T3S, como PA1700 y PA1701 (hipotético proteínas conservadas en T3S), pcrGV (regulador PA1705 en T3S y

PA1706), exsB (PA1712, S exoenzima síntesis de proteínas B), exsD (PA1714, parte de la JCSP a pscl operón), y la

proteína aparato de exportación pscBCEO (PA1715, T3S; PA1716, T3S proteína de membrana externa; PA1718,

proteína de exportación T3S; PA1696, proteína de translocación en T3S), se upregulated por

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FIG. 8. LASR, RHLR y LasR-RHLR especificidades de AZM (barras blancas), CFT (barras negras), CPR (barras de color gris claro) y

C30 (barras de color gris oscuro). Ver el texto para las definiciones de los grupos (Gr.) A, B, C, y D.

AZM. Ni CFT ni CPR, sin embargo, inducida por los genes en el grupo de genes sistema T3S de PA1690 a PA1725.

AZM, CPR, CFT, y la pprAB sistema regulador de dos componentes. El PA4290 transductor quimiotaxis inducida

QS-era downregulated por AZM, CFT, y RCP. AZM y RCP también reprimieron la parte principal de los genes en la

región de PA4290 a PA4306.Muchos de estos genes se ha demostrado en estudios previos para ser regulados por QS. En

esos estudios, los genes QS fueron identificados por la cartografía de genes downregulated en lasI - mutantes rhlI y

restaurados a niveles de tipo salvaje por adi-ción de moléculas de señal (38, 80, 89).El sistema de dos componentes

pprAB reg-lador (PA4293, PA4296) se downregulated por AZM y CPR pero no por CFT. PPRA se downregulated 16 y 6

veces por AZM y CPR, respectivamente, y ppRb el regulado 10 y 5 veces por AZM y RCP, respectivamente.Estos

resultados obtenidos por el análisis de microarrays de ADN fueron con-se afirmaron por RT-PCR, que mostró que AZM

http://aac.asm.org/

reduce los niveles de PPRA y ppRb expresión 19 y 15 veces, respec-tivamente, mientras que la RCP downregulated el

nivel de PPRA expres-sion 11 -fold y el nivel de expresión ppRb 18 veces.RT-PCR confirmó también que el efecto de

CFT en la expresión pprAB era insignificante.

Soporte de AZM, CFT, y RCP en contra del LBD de la proteína LasR. Con el fin de explorar la posibilidad de que

AZM, CFT, y RCP interactúan directamente con la proteína LasR, se realizó in silico de acoplamiento de los tres

antibióticos con el LBD recientemente publicado de la proteína LasR (11).Ninguno de los tres antibióticos dio una

puntuación alta afinidad en el acoplamiento ex perimento. Por el contrario, se informó anteriormente compuestos QSI (por

ejemplo, C30, patulina, furanona, y 4-nitropyridine- N-óxido) marca ex-prohibida alta afinidad (Tabla 4).El análisis in

silico indica que AZM, CFT, y CPR no encajan dentro de la cavidad sitio-ción se unen de LasR debido a que presentan

enfrentamientos estéricos con el objetivo de proteínas. Esto sugiere que los efectos de AZM, CFT, y CPR en QS puede ser

debido a un mecanismo de acción distinto de una interacción directa con la proteína LasR.

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se presentan los resultados de la-ción de pantalla de 12 antibióticos para la actividad QSI

obtenido con QSIS1. Tres de los 12 antibióticos, AZM, CFT, y RCP, mostró fuertes resultados positivos en el sistema de

selección y se investigaron más por sus efectos sobre la producción de factores de virulencia en P. aeruginosa.AZM,

CFT, y RCP exhibir diversa

mecanismos de acción antimicrobiana y son estructuralmente muy diferente. Por tanto, es intrigante que los tres

antibióticos eran activos en QSIS1. Tanto CFT y piperacilina son lactámicos que se dirigen a la proteína de unión a la

penicilina (PBP 3 3); sin embargo, sólo CFT mostró que la actividad real en el sistema de cribado QSI, lo que indica que

la actividad QSI es probable que no PBP 3 dependiente. Nos preocupamos-totalmente seleccionaron las concentraciones

de los tres antibióticos que no tenían ningún efecto sobre el crecimiento. Nuestra experiencia de la proyección de un gran

número de compuestos a partir de bibliotecas de compuestos es que los compuestos tóxicos o inhibidores del crecimiento

pueden mostrar-QSI como ac-actividades (observaciones no publicadas). Esto es probable que sea causada por efectos

similares al estrés en lugar de "true" actividad QSI (tal como una interacción con el receptor de QS), ya que el efecto

sobre la QS-expresión de genes controlados desaparece cuando la concentración del compuesto se reduce a un nivel que

permite que las bacterias para alcanzar la tasa de crecimiento óptimo en un medio dado. Además, más, ya que la

obstrucción de la QS (ya sea por mutación o por las drogas antagónicas) no inhibe el crecimiento, consideramos que es

esencial para investigar las posibles actividades QSI de los tres antibióticos en condiciones que no afectan el crecimiento.

Cuando se administraron a tales concentraciones, AZM, CPR, y CFT inhibieron la producción de la virulencia importante

factores de quitinasa, proteasa, y la elastasa y la producción de la hemolisina ramnolípido estable al calor. Nuestra reciente

de datos sug-gest que ramnolípido funciona como un escudo para proteger contra las biopelículas el comportamiento

depredador de los neutrófilos, y ramnolípido pueden así ser un factor de virulencia pivote (45). Las investigaciones han

demostrado que los biofilms de P. mutantes aeruginosa QS han reducido la tolerancia a los antibióticos en comparación

con la de sus padres de tipo salvaje, y la inhibición de QS ha sido demostrado para promover la erradicación de

biopelículas por tratamientos antimicrobianos y hacer que el biofilm más susceptibles a la fagocitosis por los neutrófilos

(20, 38, 73 ).Ramnolípido y la lectina adhesiva Leca se downregulated más de cinco veces por AZM y RCP. Ambos

productos están regulados por QS y están involucrados en la biopelícula mat-ración (19, 23, 52, 65). La represión de estos

genes puede con-contribuir al desarrollo de la biopelícula sensible menos estructurado y más antibiótico visto en mutantes

QS. Por otra parte, se ha informado de rh-amnolipid y lectina Leca tener efectos cito-tóxicos en células de mamíferos,

incluyendo los neutrófilos y macrófagos, y también son importantes en la P. proceso aeruginosa en infecciosa (5, 45, 57,

58, 81, 82, 95).

Otro componente importante de virulencia de P. aeruginosa es el sistema T3S, que está regulada negativamente por

QS en P. aeruginosa.Los datos de microarrays de ADN presentados aquí sugieren AZM que aumenta el nivel de

expresión de genes T3S, en

TABLA 4. En silico de acoplamiento

Nombre del ligando Puntuación

Rerank OdDHL (plantilla) ..............................................

....................... 107.3

3-Oxo-C 12 ............................................ .......................................... 94.5 2-Heptylthioacetyl homoserina lactona .................................... 88.8 BHL .................................................

.............................................. 82.2 La patulina .................................................

.......................................... 69.8 4-N-óxido Nitropyridine- ........................................... ................... 62.9 C30 .................................................

............................................... 50.4 RCP .................................................

.............................................. 317.3 CFT .................................................

.............................................. 373.5 AZM .................................................

............................................. 3,316.2

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acuerdo con las propiedades inhibidoras de QS-AZM re-portado aquí y por otros. Curiosamente, un estudio anterior (50)

mostró que el tratamiento de P. aeruginosa con sub-CIM de mac-rolides (AZM, claritromicina, eritromicina) anteriores

al desafío en-intranasal de ratones mejora de forma significativa la tasa de mortalidad (de 0% a 80 a 100%).En el mismo

estudio, sin embargo, los antibióticos macrólidos también fueron administrados a ratones después de la inoculación de P.

aeruginosa PAO1, y en ese caso, la tasa de mortalidad entre los ratones no aumentó (50).Por lo tanto, parece que la

activación de genes por los macrólidos causa virulencia mejorada sólo si los macrólidos se aplican de forma profiláctica y

no como una parte del tratamiento. Sin embargo, el riesgo potencial, junto con los beneficios potenciales, de la inducción

de la virulencia y la citotoxicidad a través del sistema T3S debe ser considerado cuando los pacientes infectados con P.

aeruginosa son tratados con AZM (y posiblemente otros macrólidos).

Como se mencionó anteriormente, el sistema de dos componentes regulador de pprAB (PA4293 y PA4296,

respectivamente) se downregulated más de cinco veces por AZM y RCP pero no por CFT; Estos resultados fueron

confirmados por RT-PCR. La expresión de pprAB ha demostrado ser regulada por QS (80, 89), pero los productos de los

genes también se han identificado a tener actividades que Ulate QS-mod, que representan todavía otro sistema

autofeedback de QS en P. aeruginosa (25).El golpe de gracia de ppRb conduce a afluencia reducida de la P.

aeruginosa QS señal OdDHL, por lo tanto globalmente influir en la expresión de genes regulados QS (25); pero ppRb

también está involucrada en la regulación de la sensibilidad a los antibi-antibióti-.La sobreexpresión de los resultados en

el aumento de ppRb-dad sensitiv a los antibióticos, especialmente aminoglucósidos, probablemente debido a una

disminución de la permeabilidad de la membrana (91).En vivo y en estudios in vitro han demostrado que P. aeruginosa

desarrolla aumentando tol-rancia a los aminoglucósidos tras el tratamiento previo con estos antimicrobianos (18, 47,

93).Curiosamente, las células de P. biofilms aerugi-nosa expuestos a sub- y Concentra-ciones suprainhibitory de CPR

han también recientemente se han demostrado para mostrar aumento de los niveles transitorios de resistencia a la RCP

(64).Nos Spec-Ulate que el mecanismo subyacente por el cual AZM y RCP (y quizás también CFT) ejercen su acción

sobre QS es por medio de una respuesta adaptativa que regula a la baja y por ppRb-quizás también otros reguladores o

transportadores de membrana, como PA5099.Esto hace que la permeabilidad de la membrana para disminuir,

proporcionando de ese modo las células con protección transitoria contra los efectos tóxicos de los antibióticos. Sin

embargo, al mismo tiempo, la permeabilidad de la membrana inferior disminuye el nivel de afluencia OdDHL, lo que

resulta en una reducción en los niveles de expresión de genes regulados-QS. El apoyo a esta hipótesis se puede encontrar

en la observación de que los tres antibióticos tienen mayores Spec-ificities para genes -regulated las que los genes -

regulated BSR (grupo B).La molécula señal rhl BHL es capaz de difundir libremente sobre la membrana y es, a diferencia

de OdDHL, no depende de transporte activo.

Un estudio anterior (25) identificó 53 genes que se redujeron reguladas más de cinco veces por una inserción Tn 5 en

ppRb. En comparación, tal como se describe en el presente informe, se encontró que los niveles de expresión de 38 de

esos ppRb -regulated genes que fueron regulados a la baja más de cinco veces en el estudio mencionado anteriormente

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(25) se redujeron a la mitad de ese nivel o menos en presencia de AZM. Esto incluye 21 genes que se downregulated más

de cinco veces.Encontramos que la RCP el regulado 23 de los 53 genes más del doble, incluyendo 6

FIG. 9. Los inhibidores de la y moléculas de señal para P. aeruginosa QS. (A) N-óxido 4-Nitropyridine- (73); (B) C30 (38); (C) 2-

heptylthioacetyl homoserina lactona (69a); (D) 3-oxo-C 12 -2-aminofenol (83a); (E) BHL; (F) la patulina (74); (G) OdDHL.

genes que se downregulated más de cinco veces. CFT causó una regulación a la baja de 15 de los 53 genes downregulated

por la mutación ppRb, pero ninguno de los genes se-RELAClONADAS downregu más de cuatro veces.Los genes

reportados a ser afectados por ppRb incluyen genes de factores de virulencia como lasB, rhlAB, Leca, y prpl (25), que

también se downregulated por AZM y RCP. Los niveles de expresión de la QS transcripcional regu-lador RHLR y los

genes sintetasa AHL Lasi y rhlI también se redujeron por el JP-knockout mutación (25).Esto no es sorprendente, ya que

la BSR está subordinado al sistema de las y los genes sintetasa AHL están bajo control QS, que puede proporcionar una

retroalimentación negativa que aumenta el efecto QS-represoras de la mutación ppRb.

Se espera que QSIs construido con andamios AHL para enlazar con el homólogo LuxR sin activarlo, bloqueando así la

unión y la activación por AHLs. Por lo tanto, estos QS Antago-agonistas tienen un alto grado de similitud estructural con

AHL. Otros QSIs que comparten el (5 H) -furanona fracción 2, tales como las furanonas halogenados que ocurren-nat

ural, y las micotoxinas pat-Ulin y ácido penicillic parecen ejercer sus efectos por-destabi lizing LuxR y induciendo con

ello la rotación de QS proteínas reguladoras (56, 74).La Figura 9 muestra las estructuras de BHL, OdDHL, y compuestos

QSI previamente publicados.

Los tres antibióticos AZM, CFT, y CPR son estructuralmente muy diferente de todos QSIs descrito hasta ahora; por

otra parte, al igual que muchos otros antibióticos, son moléculas muy voluminosas (Fig. 10). En silico de acoplamiento de

AZM, CFT, y CPR a la LBD de la proteína LasR mostró que los antibióticos tienen una baja afinidad para el sitio receptor

LasR, debido principalmente a penas espaciales. Esto apoya la idea de que estos antibióticos pueden ejercer sus efectos

reguladores QS a través de mecanismos diferentes de los de la otra QSIs, abriendo así nuevas e interesantes posibili-dades

para la terapia de combinación con QSIs con diferentes modos de acción. La utilidad de la combinación de QSIs y

compuestos bactericidas-tradi cional ha sido demostrado por varios experimentos in vitro (20, 38, 74). La comprensión de

la doble línea de acción algunos antibióticos 'puede tener el potencial de

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FIG. 10. Estructuras de los tres antibióticos investigados para el potencial de percepción de quórum de actividades inhibidoras. (A)

AZM; (B) CFT; (C) RCP.

añadir además a terapias contra los agentes patógenos en la que el elemento clave atenúa en lugar de mata directamente

las bacterias. Esta estrategia tiene por objeto permitir que el sistema de defensa del huésped para eliminar las bacterias

atenuadas. La mayoría de los antibióticos se originan a partir de fuentes naturales, tales como los microorganismos del suelo, o son

derivados de compuestos procedentes de la naturaleza. Un punto de vista general ha sido que los efectos de eco-lógico de

los antimicrobianos en el medio ambiente es luchar contra los competidores. Sin embargo, las concentraciones de

antibióticos libres en el suelo es probable que sean muy por debajo de los PRM.

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Como se describe en este documento y por otros (53, 94), sub-MIC de antibióticos pueden tener diversos efectos sobre

las bacterias que son totalmente diferentes a los efectos de dosis altas; por ejemplo, pueden mejorar la formación de

biopelículas, alterar los patrones de motilidad, aumentar la citotoxicidad, y provocar cambios en la expresión de factores

de virulencia (39, 53, 60). Se ha sugerido que los antibióticos en la naturaleza pueden funcionar como señales

intermicrobial no como balas destinadas a matar a los enemigos para defender nichos o los alimentos (53). Esta hipótesis

ofrece una explicación evolutiva de por qué algunos antibióticos pueden ser capaces de inter-sufri- con la expresión de

genes controlados por el QS. De acuerdo con los resultados presentados en el presente informe, se ha demostrado

recientemente que OdDHL (y otros 3-oxo-AHL), así como su producto de degradación del ácido tetrámico exhibe

actividades contra bacterias gram-positivas (48), lo que sugiere que la señal topo-cules, como algunos antibióticos, poseen

actividades duales. Además, más, nuestros datos sugieren que los antibióticos que funcionan para abajo-regulan QS en P.

aeruginosa puede administrarse en sub-MICs (donde hay una presión de selección reducido para la unificación de

desarrollar resistencia) para bloquear QS y con ello atenuar la actividad del patógeno.Tales propiedades interesantes

destacan el enorme potencial inexplorado de la utilización de compuestos derivados de los andamios naturales en la

búsqueda de nuevos fármacos con una variedad de objetivos (es decir, antimicrobianos multifuncionales). Parece que no

hemos explorado y explotado el po-tencial de las drogas que hoy conocemos.

Las actividades duales de algunos antibióticos (por ejemplo, AZM, CFT, y RCP, investigado aquí) puede ayudar a

explicar por qué CFT ha demostrado ser superior a la comparada, regímenes de antibi ótica antipseudomonas para los

pacientes con FQ en el centro CF danés (69). Se debe tener cuidado, sin embargo. El cambio posterior al CFT como el

antibiótico antipseudomónica predominante en el centro danés CF llevó a la propagación de la epidemia de una cepa

nonmucoid-multiresis tante (68). Un estudio anterior (35) mostró que la sub-CIM de antibióticos pueden todavía modular

la transcripción pat-charranes en los miembros de la flora humana beneficiosos, causando una

variedad de efectos no deseados. Asimismo, se ha demostrado que el uso a largo plazo de AZM por pacientes con CF y P.

crónica

infecciones aeruginosa pueden provocar resistencia a los macrólidos en Staphylococcus aureus en estos pacientes

(87).Esto pone de relieve la exigencia de un mayor desarrollo de QSIs sin bactericida clásica o actividad bacteriostática.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por becas de la ev alemán Mukoviszidose, Deutsche Forschungsgemeinshaft, y el Consejo Danés de

Investigación (STF concesión no. 2052-03-0013) para MG

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7 Effects of Antibiotics on Quorum Sensing in Pseudomonas Aeruginosa 2008

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