4 Obtencion y Manejo de Muestras Romy

Las pruebas de laboratorio forman parte de la medicina de pequeños animales; se hanconvertido en una parte habitual de la exploración de bienestar, la exploración preope-ratoria y los procesos diagnósticos, y valoran la eficacia de un tratamiento o la pro-

gresión de la enfermedad. A menudo, se asume que los resultados de las diferentes pruebas realizadas son exactos y que los resultados anómalos indican un cambio fisiológico en elpaciente. Por desgracia, esta idea no siempre es cierta. Los resultados poco exactos, por muchascausas, son parte inherente de las pruebas diagnósticas (aunque se puede minimizar una parte).Los resultados poco exactos son, habitualmente, peores que no disponer de resultados, ya quepueden llevar a un diagnóstico erróneo o conducir a una prueba innecesaria y a pérdida de losrecursos económicos del cliente (o a la exposición del paciente a riesgos innecesarios) en labúsqueda de la causa de una anomalía que no existe. La exactitud de los resultados de las prue-bas es extremadamente importante, y limitar la frecuencia de los resultados no válidos es unobjetivo que se debe cumplir.

Aunque los resultados anómalos se señalan bajo el título de «error de laboratorio», haymuchas posibles fuentes de error a lo largo del proceso de la prueba. Éste comienza con cómoobtener la muestra, continúa con cómo manejarla hasta que se realiza la prueba y, finalmente,surge la mecánica de cómo se procesa la prueba (por un laboratorio externo o en la propia clí-nica). Si se utilizan los servicios de un laboratorio externo para procesar las muestras, es res-ponsabilidad del laboratorio garantizar que los métodos por los que se obtienen resultados con las muestras sean exactos. Si elige pruebas de laboratorio en su clínica, pasa a ser su res-ponsabilidad. La gente tiende a creer en las cifras que surgen de los instrumentos de laborato-rio (especialmente, de los instrumentos caros); sin embargo, por desgracia, esto no siempre escorrecto. Cuando se intenta mantener un laboratorio en la clínica, supone un importante esfuer-zo garantizar resultados exactos. Existen dos artículos en esta publicación que describen los ana-lizadores de química y hematológicos actualmente disponibles por el clínico (artículo de Wei-ser et al) y el proceso del control de calidad para garantizar resultados exactos en estosanalizadores (artículo de Weiser y Thrall) en caso de que decida manejar estas pruebas en su

Vet Clin Small Anim 37 (2007) 203-219

CLÍNICAS VETERINARIASMEDICINA DE PEQUEÑOS ANIMALES

Obtención y manejo de muestras: cómo conseguir resultados exactosJames H. Meinkoth, DVM, PhD*, y Robin W. Allison, DVM, PhDDepartment of Veterinary Pathobiology, Center for Veterinary Health Sciences, Oklahoma State University, 250 McElroy Hall, Stillwater, OK 74078, USA

*Autor para la correspondencia. Dirección electrónica: [email protected] (J.H. Meinkoth).

clínica. Cuanto mayor es la experiencia que se tiene con los resultados de laboratorio, más pro-bable es que se los cuestione, especialmente si no parecen coincidir con el contexto clínico delpaciente que tiene enfrente (cuadro 1).

JAMES H. MEINKOTH Y ROBIN W. ALLISON204

Cuadro 1. Concepto general

Las pruebas de laboratorio siempre deben interpretarse en el contexto de lo que ya sesabe sobre el paciente (p. ej., queja, hallazgos en la exploración física). Si los resultadosde laboratorio no encuadran en este contexto, no es inadecuado un poco de escepticis-mo. La primera actuación es, habitualmente, repetir la prueba de la que se duda con unanueva muestra.

Incluso si elige un laboratorio profesional, sigue siendo responsabilidad del clínico reco-ger las muestras adecuadas y garantizar que se manejan adecuadamente hasta que las recibeel laboratorio. A menudo, las muestras que llegan al laboratorio no tienen la calidad sufi-ciente para originar resultados exactos. A veces, se identifican estas muestras y no se proce-san hasta que se contacta con el clínico; muchas veces, sin embargo, incluso así se procesany se generan resultados. Por desgracia, los resultados no válidos cuestan tanto como losresultados validados, y esto puede ser una gran fuente de frustración. Dado el precio eleva-do de muchas pruebas, hay que tener esto en cuenta. Un pequeño esfuerzo y cuidado en estepunto puede eliminar gran parte la frustración generada cuando los resultados obtenidosno pueden ser interpretados o no responden a las preguntas que provocaría la recogida dela muestra.

El objetivo de este artículo es comentar algunos de los problemas frecuentes (y cómo evi-tarlos) relacionados con la realización de las pruebas solicitadas con mayor frecuencia:recuentos de células sanguíneas (CBC) en sangre completa, perfiles bioquímicos, pruebas decoagulación y muestras citológicas. El artículo presenta un comentario general sobre la obten-ción y el manejo de la muestra, y algunas consideraciones sobre el manejo de las pruebas antesmencionadas.

CONCEPTOS GENERALES SOBRE LA OBTENCIÓN Y EL MANEJO DE LA MUESTRA SANGUÍNEAObtención de la muestraLo ideal es que el paciente ayune 12 horas antes de realizar la extracción de sangre, para evi-tar la lipemia sérica (la lipemia supone un aspecto blanco lechoso del suero o del plasma,provocado por el aumento de las concentraciones de lípidos). La lipemia transitoria es nor-mal tras la ingesta de comida grasa, pero la magnitud y la duración varían. La lipemia enayunas puede producirse en ciertas enfermedades sistémicas que afectan al metabolismo delos lípidos (p. ej., diabetes mellitus, pancreatitis, hipotiroidismo), y ser así inevitable. Enestos casos, el laboratorio aún podría originar resultados útiles reduciendo la lipemia con laultracentrifugación o la adición de sustancias diseñadas para eliminar la lipemia de la mues-

tra (p. ej., LipoClear; StatSpin, Norwood, Massachusetts) [1]. El uso de sustancias que eli-minar los lípidos puede producir artefactos si los analitos que se miden están unidos a lipo-proteínas y se separan de ellas [2]. Por el contrario, la lipemia pospandrial se resuelve mejorcon la obtención de una nueva muestra. A menudo, el animal es traído a la clínica sin ayu-nar debido a que la necesidad de obtener muestras para las pruebas de laboratorio no esta-ban previstas. Muchas veces, la muestra es satisfactoria según la cantidad y el tipo de comidaingerida y el intervalo de tiempo transcurrido. Si se quiere obtener un perfil bioquímico, espreferible dejar que la muestra coagule, y centrifugarla entonces; de este modo se puedeanalizar el suero para garantizar que es claro y no lipémico (o hemolizado) antes de enviar-lo al laboratorio. Si la muestra es lipémica, se debe informar al propietario de que su animaldebe ayunar y volver más tarde, o si el animal va a ser hospitalizado, se obtendrá otra mues-tra más tarde.

La hemólisis es otra fuente habitual de artefacto. Se reconoce la hemólisis por una deco-loración roja del suero o del plasma, resultado de un filtrado de los componentes intracelula-res procedentes de los eritrocitos lisados. La hemólisis de la muestra puede ser el resultadode un proceso patológico del paciente (p. ej., anemia hemolítica intravascular), pero es másfrecuente que sea el resultado de la lisis in vitro de los glóbulos rojos. La hemólisis puedeconducir a artefactos en diferentes analitos y por diferentes mecanismos. Primero, la hemó-lisis puede aumentar la concentración en suero de cualquier sustancia que esté presente enconcentraciones mayores en los eritrocitos que en el suero. Este tipo de artefacto no dependedel analizador ni de la metodología empleada, pero varía según las especies e incluso la razaanalizada. Un ejemplo clásico es el efecto de la hemólisis sobre el potasio sérico. Los caba-llos tienen una concentración de potasio más alta dentro de los glóbulos rojos, mientras queno es así en perros y gatos. Así, la hemólisis puede inducir a una hipercalemia artefactal enmuestras equinas, pero no en las muestras caninas o felinas. Se sabe que algunas razas deperros (p. ej., Akita, Shiba Inu) tienen un potasio eritrocitario alto, y así, puede aparecer elmismo artefacto que en las muestras equinas debido a una hemólisis importante. En segundolugar, la hemoglobina libre liberada por los eritrocitos puede interferir con un analito si lametodología empleada mide longitudes de onda a las cuales también absorbe de maneraimportante la hemoglobina. Por otro lado, las sustancias liberadas por los eritrocitos puedeninterferir con las reacciones químicas intermedias empleadas para determinar la concentra-ción del analito. Estas últimas formas de interferencia son bastante variables según el anali-zador y la metodología.

Como se comentó previamente, la hemólisis es, con mayor frecuencia, el resultado de unalisis in vitro que sucede durante la obtención de la muestra o el transporte de ésta al tubo de san-gre, o al laboratorio. Las buenas noticias son que la lisis in vitro puede evitarse empleando cali-bres de agujas más grandes para obtener la muestra; así se evita demasiada presión negativadurante la venopunción; rellenando los tubos de sangre con suavidad sin forzar la muestra en eltubo; protegiendo la muestra de temperaturas extremas, y minimizando el tiempo de transpor-te al laboratorio, o, para las muestras de perfil bioquímico, separando el suero o el plasma de losglóbulos rojos antes del transporte al laboratorio.

Ya que los efectos de la lipemia y la hemólisis dependen a menudo del analizador y delmétodo empleado, es difícil sugerir guías rápidas del efecto sobre un analito en particular.Los laboratorios profesionales pueden aportar información respecto al efecto de estosartefactos en determinadas pruebas para sus analizadores y metodología. En general, los ana-

OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS 205

lizadores de química seca resultan mucho menos afectados por la lipemia que los analizado-res químicos que emplean reactivos líquidos. Muchos instrumentos en la clínica emplean laquímica seca (véase el artículo de Weiser et al en esta publicación) y ofrecen un buen resul-tado frente a una lipemia o hemólisis moderadas. Además, la forma más fiable de garantizarque un resultado no se ha visto afectado artificialmente es evitar la hemólisis o la lipemiacuando sea posible.

La venopunción debería ser limpia, con un mínimo de «pesca alrededor» de la vena. Es difícil obtener cantidades adecuadas de sangre en un tiempo razonable (frecuente en gatos y otros animales con venas pequeñas), y la muestra puede coagularse antes de introducirse en los tubos. La existencia de pequeños coágulos en la muestra es más un problema para los resultados hematológicos (p. ej., recuento plaquetario) que para los resul-tados químicos.

Los tubos de muestra (tubos de sangre) deben rellenarse de forma adecuada. General-mente, el grado de vacío en el tubo lo llena automáticamente a un nivel adecuado, pero esuna buena idea comprobar y asegurarse de que los tubos se rellenan con facilidad. Los tubospueden no llenarse adecuadamente si la muestra ha comenzado a coagularse en la jeringa ytapona la aguja, o si se ha destapado el tubo y liberado el vacío. Muchos tubos tienen una«línea de llenado» trazada a través de la etiqueta para mostrar cuánta sangre debe introdu-cirse en el tubo. Hay que permitir a los tubos de vacío que se rellenen naturalmente, oextraer el tapón del tubo y la aguja, y suavemente rellenar el tubo directamente desde lajeringa. No se debe forzar la sangre a través de la aguja con demasiada presión, porquepuede producir hemólisis. Si se extrae el tapón del tubo, hay que asegurarse de que se colo-ca bien de nuevo en el tubo. También parece sensato emplear una jeringa y una aguja quecreen el vacío en el tubo, para evitar que el tapón se salga durante el proceso (fig. 1). Si seobtienen muestras de diferentes tubos, hay que rellenar los tubos anticoagulantes primero ylos tubos de suero (coagulación) al final.

Manejo de la muestra: tubos de obtención de sangreExisten diferentes tubos disponibles en el mercado que pueden emplearse para recoger lasmuestras. La principal diferencia entre ellos es que contengan o no anticoagulante para evitarque la muestra se coagule, y si lo tienen, de qué anticoagulante se trata. La mayoría son tubosde vacío con un tapón. El color del tapón suele indicar el tipo de anticoagulante añadido, y esbastante constante en los diferentes fabricantes, aunque existen ciertas diferencias. El siguien-te apartado comenta los tubos de sangre empleados con mayor frecuencia y algunos factoresque se deben tener en cuenta cuando se emplean.

Tubos de coagulación (tubos de suero, tubos de «tapón rojo»)Cuando se coloca la sangre en un tubo de suero, puede derivarse al laboratorio «tal y comoestá» o puede centrifugarse, recoger el suero y transferirlo a otro tubo para el transporte allaboratorio. Se recomienda separar el suero si el transporte es prolongado (al día siguienteo más) para evitar cambios por artefacto en ciertos analitos, y lo que es aún más importan-te, evitar la hemólisis de la muestra. Esto se comenta posteriormente en el apartado de per-files bioquímicos. Para recoger el suero, es importante dejar que la sangre repose durante 15 o 20 minutos (preferentemente, a 37 ºC en un bloque de calor o baño de agua calentada)antes de la centrifugación. Esto permite tiempo suficiente para que el coágulo se forme y


se retraiga bien. Si se centrifuga la muestra antes de la retracción adecuada del coágulo, sepuede formar un coágulo de fibrina en el suero, originando un gel en vez de suero líquido.En este momento, es difícil conseguir suficiente suero, y siempre se tendrá que obtener una nueva muestra. Algunos tubos de tapón rojo contienen un «activador de la coagula-ción» para acelerar el proceso de coagulación y reducir el tiempo necesario para procesar la muestra.

El suero es la muestra estándar para los perfiles bioquímicos, aunque también puedeemplearse para títulos serológicos, electroforesis de proteínas séricas y algunas pruebasendocrinas, entre otras. Los tubos de tapón rojo se emplean a veces para muestras de cultivos.En estos casos, es importante observar que algunos tubos de tapón rojo tienen un interiorestéril, aunque otros no.

Tubos de ácido etilendiaminotetraacético (tubos de «tapón morado»)El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es un anticoagulante que actúa uniendo calcio (yotros cationes divalentes), lo que requiere muchas de las reacciones enzimáticas de la casca-da de la coagulación. La mayoría de los anticoagulantes, excepto la heparina, funcionan deeste modo.

El EDTA es el anticoagulante de elección para la mayoría de la hematología ordinaria.Además de sus efectos anticoagulantes, el EDTA ayuda a conservar la morfología celu-lar (ideal para los frotis sanguíneos) e inhibe la proliferación bacteriana. Por ello, el EDTA


Fig. 1. Muestra remitida para CBC. Se extrajo el tapón para rellenar el tubo y no se volvió acolocar adecuadamente hasta que se envió la muestra. (Esta figura se encuentra en color alfinal del libro)

debería emplearse cuando se requiere un análisis citológico de la muestra. Además de los CBC, ejemplos frecuentes son la valoración de los derrames pleurales, pericárdicos operitoneales.

El plasma de las muestras con EDTA puede emplearse para ciertos parámetros bio-químicos, como el nitrógeno de urea sanguíneo (BUN), la glucosa y las proteínas totales. Aunque se prefieren las muestras séricas o heparinizadas para perfiles bioquímicos comple-tos, muchas «pruebas de rápida valoración» básicas pueden realizarse en plasma EDTAen pacientes en los que la obtención de grandes volúmenes de sangre es difícil (p. ej., ga-tos pequeños). Esto puede ser suficiente para un examen prequirúrgico en un paciente sano joven.

Obviamente, el plasma de las muestras anticoaguladas con el EDTA no puede emplearsepara medir la concentración de calcio (Ca++) sérico. Además, la concentración de potasio (K+)no puede medirse con exactitud, ya que el EDTA en los tubos con anticoagulante está en formade sal de potasio (K2-EDTA o K3-EDTA). La concentración de potasio está muy aumentada sise compueba la muestra con EDTA (p. ej., a veces > 20 mEq/l) [3]. El EDTA también puedeinterferir con las actividades enzimáticas, provocando resultados falsamente disminuidos parala fosfatasa alcalina, la lipasa y la creatina cinasa [3]. Por tanto, el EDTA no es adecuado enestas pruebas. A diferencia de Ca++ y K+, los efectos sobre los ensayos enzimáticos parecendepender del analizador y de la metodología empleada [3].

Tubos de heparina (tubos de «tapón verde»)La heparina es otro anticoagulante, y es el único anticoagulante común que no funciona que-lando el calcio. La heparina potencia la actividad de la antitrombina, un anticoagulante naturalque se encuentra en la sangre. La antitrombina se une e inactiva no sólo a la trombina (factor II)sino también a la mayoría de los factores enzimáticos de la coagulación. La heparina no quelael calcio, y no interfiere con el calcio ni con las enzimas que requieren cationes divalentes. Así, elplasma heparinizado puede emplearse para un perfil bioquímico completo. Aunque el plasmaheparinizado y el suero producen resultados parecidos en la mayoría de analitos, en un perfilbioquímico ordinario se observan algunas diferencias, como el aumento de albúmina y la dis-minución del potasio y del calcio ionizados [3].

La principal ventaja de emplear plasma heparinizado en vez de suero es que la sangre obte-nida en el tubo de tapón rojo debe reposar aproximadamente 20 minutos para garantizar la for-mación del coágulo, mientras que el plasma heparinizado puede ser centrifugado inmediata-mente y extraído el plasma, permitiendo un proceso más rápido. Existen varias sales de heparina(p. ej., heparina sódica, heparina de litio) que se emplean comercialmente en los tubos de san-gre. Se prefiere la heparina de litio para la mayoría de indicaciones, ya que no altera la concen-tración de los electrólitos que se valoran normalmente.

Aunque el EDTA se emplea típicamente para los CBC, ya que conserva mejor la morfologíacelular, EDTA provoca hemólisis en las muestras sanguíneas de algunas especies de pájaros yreptiles. En estos casos, las muestras sanguíneas para los CBC se recogen con heparina.

Tubos de citrato (tubos de «tapón azul»)El citrato es otro anticoagulante habitual que también actúa mediante su unión al calcio. Elcitrato se emplea para la obtención de muestras para pruebas de coagulación ordinarias que sebasan en la medición del tiempo de formación del coágulo, ya que sus efectos anticoagulantes


son fácilmente reversibles cuando se añade calcio a la muestra [4]. Estas pruebas incluyen eltiempo de protrombina (PT), el tiempo parcial de tromboplastina (PTT), el tiempo de trombina(TT), y la determinación cuantitativa de fibrinógeno. El plasma con citrato puede emplearsetambién en ensayos para las concentraciones de dímero-D, factores de coagulación específicos(p. ej., la concentración de factor VIII), o el factor de Von Willebrand. Cuando se obtiene san-gre para cualquier prueba de coagulación es importante realizar una venopunción limpia, deforma que la sangre no se contamine con el factor tisular de los tejidos que rodean la vena. Lacontaminación de las muestras con el factor tisular puede iniciar la coagulación y acortar lostiempos de coagulación.

En comparación con otros tubos, existe una cantidad relativamente mayor de anticoagulan-te en los tubos de citrato. Por ello, es fundamental que estos tubos se rellenen hasta un nivel ade-cuado. Debe existir una ratio de 9:1 de sangre respecto a citrato. Si estos tubos se rellenanmenos de lo adecuado, existe un relativo exceso de anticoagulante en la muestra, lo que podríaprolongar el PT y el PTT.

Un fenómeno parecido aparece en animales con policitemia (eritrocitosis). Si un pacien-te tiene un hematocrito muy elevado, existe menos plasma para un determinado volumen desangre total. Un menor volumen de plasma provoca de nuevo un exceso relativo de anticoa-gulante. Se observan ligeras prolongaciones de PT y PTT en animales con un hematocritoaumentado.

Tubos de tiempo de coagulación o activación de la coagulación (tubos de «tapón gris»)ACT representa el tiempo de coagulación activado, una prueba de coagulación relativamentesencilla. Los tubos de ACT contienen tierra de diatomeas, que activa la cascada de coagulaciónintrínseca. Al colocar sangre en un tubo de ACT y midiendo cuánto tiempo tarda en coagular,se están valorando los factores de las vías intrínseca y común de la coagulación. El tubo de ACTcomprueba fundamentalmente los mismos factores que el PTT, pero puede realizarse en la clí-nica sin requerir instrumentos especializados.

Como en cualquier prueba de coagulación, es importante realizar una venopunción limpia.El fabricante recomienda un método de dos tubos empleando un sistema de tubo de vacío en elque los primeros 2 ml de sangre se guardan en un tubo que se descarta, y un segundo tubo serellena entonces con 2 ml de sangre para la valoración de ACT. El motivo de descartar los pri-meros 2 ml de sangre es eliminar cualquier sangre que se haya contaminado con factor tisulardurante la venopunción. Un estudio en gatos no encontró diferencias en el ACT empleando elsistema de un tubo (en el que la primera muestra de sangre se valora) respecto al sistema de dostubos [5]. El sistema de un tubo es más sencillo de realizar técnicamente, especialmente enpacientes poco colaboradores o pacientes pequeños.

Dado que el tubo de ACT inicia la vía de coagulación intrínseca, esta prueba debe llevarse acabo inmediatamente tras la obtención de la muestra sanguínea. El tubo debe mantenerse a37 ºC, colocándolo idealmente en un bloque de calor o en un baño de agua, aunque puede seruna alternativa mantenerlo bajo la axila del profesional. Tras la incubación inicial de 45 a 60 segundos, el tubo se vuelca cada 10 segundos y se comprueba la formación del coágulo. Un perro normal coagula en menos de 120 segundos [6]. Los gatos normales coagulan enmenos de 165 segundos [5].


Tubos de fluoruro de sodio (tubos de «tapón gris»)Estos tubos contienen fluoruro de sodio (NaF) y oxalato de potasio (Ox). El Ox es un anti-coagulante que funciona quelando el calcio. El NaF es un producto químico que inhibemuchas de las enzimas involucradas en la glucólisis, lo que paraliza el metabolismo de laglucosa por las células de la muestra de sangre. Las muestras sanguíneas obtenidas en tubosde NaF se emplean para obtener una medición exacta de la glucosa sanguínea sin tener queseparar el suero o el plasma de las células. Además de inhibir el empleo de glucosa, el NaFinhibe la producción de lactato. Por tanto, los tubos de NaF/Ox también se emplean cuandose busca una determinación de lactato sérico. La sangre obtenida en un tubo de fluoruromantiene una concentración de glucosa estable durante por lo menos 24 horas a temperatu-ra ambiente, y 48 horas en el frigorífico [4]. El lactato mostró ser estable a temperaturaambiente en muestras felinas durante por lo menos 8 horas [7]. Los tubos de fluoruro sonmás útiles para realizar una curva de glucosa en un paciente diabético. Se pueden obtenervarias muestras en un período de horas, y enviarlas entonces al laboratorio para las deter-minaciones de glucosa de una sola vez.

Es importante fijarse en que aunque las concentraciones de glucosa permanecen establesen los tubos de NaF, las concentraciones de glucosa medidas en los tubos de fluoruro son arti-ficialmente menores que las concentraciones medidas en el suero de muchas especies [7]. Laobtención de sangre en tubos de fluoruro origina una reducción y lisis de los eritrocitos. Elpaso de líquido intraeritrocítico a plasma origina una disminución en el hematocrito y, conse-cuentemente, la dilución de algunos analitos séricos, como la glucosa. En un estudio en gatos,las concentraciones de glucosa medidas en plasma con NaF/Ox fueron un 12% inferiores a lasobtenidas en muestras séricas de animales normoglucémicos [7]. La magnitud de esta dife-rencia fue mayor en los animales hiperglucémicos, con una media del 14% inferior en el grupode gatos diabéticos [7]. Esta diferencia debe tenerse en cuenta cuando se emplean tubos deNaF/Ox. Las concentraciones de glucosa en muestras obtenidas del mismo paciente en variasveces no deberían emplearse para comparaciones, si se emplearon diferentes tipos de muestrapara la glucosa.

Manejo de la muestra: derivaciónEs importante garantizar que el tubo esté debidamente etiquetado. Generalmente, debeincluirse el nombre y apellidos del paciente, y el nombre de la clínica o del clínico. La fechaen que se obtuvo la muestra también debe registrarse, y la forma de derivación en caso de queexista un retraso en la entrega al laboratorio. A menudo, se reciben en el laboratorio muestrasetiquetadas sólo con el nombre del paciente o incluso sin ninguna etiqueta, lo cual aumentala posibilidad de confusión o de resultados mal informados. Si se separa el plasma anticoa-gulado de los glóbulos rojos y se transfiere a un tubo de suero, el tipo de anticoagulanteempleado debería marcarse para evitar artefactos inducidos por el anticoagulante en las bio-químicas del suero.

Cuando la muestra de suero o de plasma se envía a un laboratorio exterior, es preferible cen-trifugar la muestra y extraer el suero o el plasma y colocarlo en un tubo limpio aparte, para evi-tar cambios artificiales. Para algunas pruebas, las muestras deben congelarse o enviarse en unbloque de hielo. Es mejor comprobar con el laboratorio las instrucciones específicas cuando sesolicite un resultado que no se realiza de forma ordinaria.


Se aconseja buena calidad en los frotis sanguíneos para los CBC. Pueden producirse cam-bios celulares con el tiempo, incluso si se recogen en EDTA. Conseguir frotis sanguíneos seca-dos con aire fresco evita estos artefactos. Se comentan en un apartado posterior los CBC (véaseel artículo de Allison y Meinkoth en esta publicación). Si va a existir un retraso importantedesde que se obtiene la muestra hasta que se deriva al laboratorio, el tubo de EDTA debe con-servarse en el frigorífico (pero no congelarlo nunca). Los frotis sanguíneos no deben conser-varse en el frigorífico. La calidad de los frotis no fijados no cambia de forma importante duran-te días o semanas.

Si se envían las muestras a través de un servicio de correo, se debe garantizar un empaque-tado correcto para garantizar que las muestras lleguen al laboratorio sin que se rompan. Losporta de cristal deben colocarse en contenedores de plástico rígido (fig. 2) o en espuma depoliestireno (fig. 3). Los guardaporta de cartón plano normal (fig. 4) no protegen adecuada-mente los porta, y éstos suelen llegar al laboratorio rotos, a menos que se hayan empaquetadoen un contenedor rígido. De forma parecida, los tubos de sangre deben guardarse en un conte-nedor rígido, como una caja de cartón o de espuma de poliestireno.


Fig. 2. Los contenedores rígidos de porta de plástico pueden contener de cinco a seis porta ysuponer una protección adecuada durante el envío.

La mayoría de los servicios de correo tiene formas de empaquetado específicas para mane-jar muestras biológicas, como la sangre animal. El empaquetado debe consistir en un recep-táculo principal a prueba de fuga (a menudo el tubo sanguíneo), un segundo empaquetado aprueba de fuga, y un empaquetado externo rígido. Además, las muestras de líquido deben ro-dearse con suficiente material absorbente para que absorba totalmente el contenido en caso deque suceda cualquier fuga o liberación del líquido. La mayoría de servicios de correo de más de24 horas tienen sobres de plástico claro marcado con «muestra clínica» o «muestra biológica»que deben emplearse en vez de los sobres normales utilizados para material impreso. Es mejorcontactar con el transportista en el caso de necesidades específicas.

OBTENCIÓN DE MUESTRA Y MANEJO PARA PRUEBAS ESPECÍFICASRecuentos completos de células sanguíneasCoágulos y agregados plaquetariosComo se indicó previamente, es fundamental evitar coágulos y agregados de plaquetas paraobtener unos resultados de CBC exactos. Las agregaciones plaquetarias y los microcoágulospueden alterar de forma importante los resultados de los CBC. El artefacto más habitual es unrecuento plaquetario falsamente disminuido (que puede estar muy reducido). Cuando existeun recuento plaquetario bajo (especialmente en los gatos), el recuento plaquetario cuantitativo


Fig. 3. Los contenedores de espuma de poliestireno suponen una protección adecuada para losporta o los tubos durante el envío, y pueden contener hasta 10 porta (2 porta pueden colocar-se en cada hueco). Estos contenedores también son lo suficientemente grandes para guardartubos de EDTA pequeños o de suero que contengan una muestra líquida.

Fig. 4. Los guardaporta de cartón finos no suponen una protección correcta durante el envío.Los porta suelen llegar rotos.

del analizador automático debe compararse con cifras plaquetarias estimadas procedentes de unfrotis sanguíneo bien realizado, además de una valoración de la presencia de agregados pla-quetarios (este proceso se describe en el artículo de Allison y Meinkoth en esta publicación).Los microcoágulos en la muestra pueden originar un recuento de glóbulos rojos falsamentereducido, lo que disminuye el hematocrito (el hematocrito se calcula con el recuento de glóbu-los rojos y el volumen celular medio en la mayoría de los analizadores automáticos). Los coá-gulos mayores invalidan el recuento leucocitario, o peor aún, bloquean el tubo de hematologíadel analizador. Si se llevan a cabo recuentos celulares completos en la clínica con un analizadorautomático, hay que comprobar siempre con cuidado la muestra, desplazando suavemente eltubo hacia atrás y hacia delante mientras se observa si hay presencia de coágulos, antes de intro-ducir la muestra en el instrumento.

Para evitar estos problemas, la muestra para recuento celular completo debe obtenerse conuna venopunción limpia, en un período de tiempo mínimo, el tubo de EDTA debe rellenarse pri-mero si la sangre se ha obtenido para varios tubos mediante una jeringa en vez de con tubos devacío directamente, y la mezcla debe mezclarse total pero suavemente con el anticoagulantejusto después de rellenar el tubo. Es fácil recomendar una venopunción limpia, pero puede serdifícil o imposible de conseguir en pacientes no colaboradores o pequeños. Además, puede ocu-rrir un importante agregado plaquetario en recuentos celulares felinos incluso con las mejoresvenopunciones. En un artículo, el 71% de los recuentos celulares felinos realizados empleandoun contador de impedancia durante un año tenían los recuentos plaquetarios reducidos, mien-tras se creía que sólo el 3,1% de dichos animales era realmente trombocitopénico, según la esti-mación de los recuentos plaquetarios de los frotis sanguíneos [8]. Dada la alta tasa de artefac-tos, la estimación del recuento plaquetario con frotis sanguíneo es una medida de control decalidad importante en las muestras felinas (véase el artículo de Allison y Meinkoth en estapublicación). Si la sangre se tiene que obtener tanto para química clínica como para hematolo-gía, pero el proceso de obtener la sangre suficiente nos lleva más tiempo de lo esperado, puedeser beneficioso acabar la venopunción cuando exista suficiente sangre tan sólo para el recuen-to celular completo. El tubo de EDTA puede llenarse, y la muestra para bioquímica clínica sepuede obtener de una venopunción diferente. Finalmente, es importante una mezcla adecuadade la sangre con el anticoagulante. Los tubos de EDTA pueden contener EDTA líquido o EDTAen polvo esparcido sobre la superficie interior del tubo. La mezcla debe realizarse varias vecespor inversión del tubo, o si se han obtenido pequeñas cantidades, debe hacerse rodar el tubo deforma que la muestra recorra toda la superficie interior del tubo. Esto debe hacerse suavemen-te; nunca debe agitarse el tubo.

Tubos con llenado insuficienteEl llenado inadecuado de los tubos de EDTA es un problema frecuente, especialmente cuandose obtiene sangre de perros pequeños o gatos. Los tubos disponibles en el mercado puedenvariar de capacidad desde menos de 1 ml hasta 10 ml. Si se llena menos de lo adecuado un tubo,pueden provocar cambios artificiales en varios parámetros. Con los tubos de EDTA, existe cier-to grado de artefacto en la dilución. Además, el EDTA es hipertónico y hace que el agua aban-done los glóbulos rojos, provocando una reducción de las células. Esto puede originar unareducción importante del volumen celular aglomerado aparente (PCV) si el tubo se rellena sólocon una parte de la cantidad requerida. La reducción celular provocada por el tubo poco llenopuede originar una disminución de PCV en las concentraciones del hematocrito y en el volu-


men corpuscular medio (MCV) junto con un incremento de la concentración de hemoglobinacorpuscular media (MCHC). La mayoría de los laboratorios necesita que los tubos de EDTA serellenen hasta el 50% por lo menos del volumen posible. Se han diseñado microcontenedorespara tan sólo 0,25 ml (250 µl) de toda la sangre disponible. Éstos se recomiendan si el tamañode la muestra es limitado, para evitar los artefactos previamente comentados. La tabla 1 mues-tra el efecto de varios grados de llenado insuficiente en un tubo de EDTA con sangre de un perronormal. Los efectos son aún más evidentes en un animal anémico.


Volumen de la muestra (en un tubo de 4 ml)Cambio

Parámetro 4 ml 1 ml 0,5 ml (en muestra de 0,5 ml)

Hct (%) 56,3 52,8 51,9 7,8%RBC (3 106 células/µl) 7,61 7,30 7,36 3,2%Hgb (g/dl) 18,3 17,8 17,7 3,2%MCV (fl) 74 72,3 70,5 4,7%MCHC (g/dl) 32,5 33,7 34,2 5,2%

Hct: hematocrito; Hgb: hemoglobina; MCHC: concentración de hemoglobina corpuscular media; MCV:volumen corpuscular medio; RBC: glóbulos rojos. aLa muestra sanguínea era de un perro donante con sangre clínicamente normal, y el análisis se realizóen un analizador de hematología automático Cell-Dyn 3500 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois).Obsérvese que la concentración del hematocrito calculado está relativamente más afectada que elrecuento de RBC o la concentración de Hgb, ya que la concentración del Hct se afecta por la dilución dela muestra en el EDTA y la reducción de los RBC, debido a la hipertonicidad de la solución de EDTA,mientras que el recuento RBC y la concentración de Hgb se afectan sólo por la dilución de la muestra.

Tabla 1 Efecto del infrallenado de un tubo de ácido K3-etilendiaminotetraacético líquido sobre ciertos parámetrosa

Artefacto por la antigüedad de la muestraSi las muestras de hematología se procesan en 1 o 2 horas tras su obtención, no suele ser unproblema el artefacto del procesado de una muestra retrasada. Pero si las muestras se envíancon un correo nocturno, o aún peor, por correo normal, pueden suceder importantes cambiosdurante este tiempo. Si las muestras no van a procesarse en una hora, los frotis sanguíneosdeben prepararse y el resto de la muestra debe mantenerse en el frigorífico. Los frotis san-guíneos no fijados secados al aire deben enviarse sin teñir al laboratorio, obteniéndose unamuestra con buena morfología celular incluso si se retrasa el proceso. Los frotis sanguíneosno deben mantenerse en el frigorífico. Si esto ocurriera, puede aparecer condensación en losporta y provocar la lisis celular.

Los artefactos relacionados con un procesado retrasado son especialmente llamativos en lavaloración cuantitativa del frotis sanguíneo. Los leucocitos sufren un artefacto de la edad que,cuando es ligero, puede hacer difícil la evolución de cambios tóxicos y desviaciones a laizquierda, pero cuando son pronunciados, puede imposibilitar la identificación de leucocitos.El ritmo al que degeneran las células varía mucho, y parece depender del tipo de células exis-

tentes, además de la temperatura ambiente. Los blastocitos inmaduros de un animal con neo-plasia hematopoyética pueden sufrir una importante degeneración en tan sólo 24 horas. La figu-ra 5 muestra este efecto en un animal con un linfoma en estadio V. Este animal tenía un recuen-to de células nucleadas total de 74.000 células/µl. En los frotis realizados justo después de laobtención, se veían muchos linfoblastos grandes en cada campo. En frotis realizados cuando serecibió la muestra sanguínea con EDTA (menos de 24 horas después), existían neutrófilos ymuchas células degeneradas, pero ya no se apreciaban células neoplásicas.


Fig. 5. Los frotis sanguíneos de un perro con linfoma en estadio V (recuento leucocitario= 74.000 células/µl) muestran la importancia de enviar portas prefabricados junto con mues-tras de CBC (o muestras citológicas fluidas). (A) Porta realizado por el clínico a la vez que seobtuvo la muestra. La mayoría de los leucocitos son células linfoides grandes inmaduras. (B) Porta realizado cuando la misma muestra llegó al laboratorio mediante un correo del díasiguiente (< 24 horas más tarde). Se identifican neutrófilos, pero las células neoplásicas apa-recen sólo como núcleos de células rotas (flechas). (Esta figura se encuentra en color al final dellibro)

Cabe destacar otro artefacto que aparece con el almacenamiento de sangre: ciertos hemo-parásitos se disocian de los glóbulos rojos. La figura 6 muestra frotis sanguíneos realizadosinmediatamente y 24 horas después de la obtención de sangre de un gato con una infección porMycoplasma haemofelis (Hemobartonella felis). En los frotis inmediatos a la obtención de lamuestra, se pueden relacionar las clásicas cadenas y anillos de parásitos basofílicos conmuchos de los eritrocitos. En los frotis realizados cuando la muestra de sangre con EDTA serecibió en el laboratorio, los parásitos no sólo se habían «desprendido» de los eritrocitos sinoque también habían cambiado su aspecto. Aunque pueden producirse muchos otros cambiosmorfológicos, estos ejemplos muestran el beneficio de preparar frotis sanguíneos en cuanto seobtiene la sangre. Mantener en el frigorífico la muestra sanguínea con EDTA enlentece perono evita estos cambios.

Además de los cambios morfológicos, pueden aparecer cambios cuantitativos con eltiempo. Las plaquetas pueden agregarse, provocando un recuento plaquetario falsamentedisminuido. Además, los eritrocitos pueden hincharse mucho, aumentando el MCV y elhematocrito y disminuyendo la MCHC en 24 horas [9,10]. Los cambios en los leucocitos

10 µm 10 µm

son más variables, pero los leucocitos viejos pueden lisarse, originando recuentos leucoci-tarios bajos.

Perfiles bioquímicosSi el suero no se separa de las células del coágulo, pueden aparecer cambios artefactales con eltiempo. Uno de los más habituales es que la concentración de glucosa disminuye debido alempleo de la glucosa por parte de los eritrocitos y los leucocitos para obtener energía. La con-centración de glucosa disminuye aproximadamente un 10% por hora a temperatura ambiente sise deja el suero en contacto con las células sanguíneas [4]. El Pi sérico (fosfato inorgánico, fós-foro) puede aumentar con el tiempo cuando las células metabolizan el ATP a ADP y Pi, siendoliberado el Pi formado al suero. También pueden aparecer otros cambios, pero son más variables.

Otro problema importante relacionado con dejar en contacto el suero con las células san-guíneas es que los eritrocitos se lisan, originando la hemólisis de la muestra. Dado que la mayo-ría de los ensayos se basan en la absorbancia de la luz transmitida a través de la muestra, lahemólisis puede interferir de forma importante con muchas pruebas, dependiendo del tipo deanalizador y de la metodología empleada. La hemólisis casi siempre se produce en muestras noseparadas a tiempo, pero ocurre más rápidamente cuando la temperatura ambiente es alta (p. ej.,en las muestras enviadas en verano). La hemólisis también parece suceder más rápidamente enalgunos animales gravemente enfermos. En general, es mejor separar el suero nosotros mismosy transferirlo a otro tubo de tapón rojo si la muestra se va a enviar al laboratorio. No sólo seayuda a evitar la hemólisis asociada al transporte de la muestra sino que se puede valorar la lipe-mia de la muestra y la hemólisis previa en la obtención de la muestra.


Fig. 6. Frotis sanguíneos de un gato con una infección por Mycoplasma haemofelis que mues-tra el artefacto relacionado con el tiempo de almacenamiento de la muestra en algunos hemo-parásitos. (A) Frotis sanguíneos realizados inmediatamente después de la obtención de lamuestra, que evidencian numerosos parásitos, incluyendo anillos (punta de flecha) y cadenas(flechas) asociadas con los eritrocitos. (B) Frotis sanguíneo realizado de la misma muestra,cuando se recibió en el laboratorio en menos de 24 horas después de haberse obtenido. No seevidencian parásitos en los eritrocitos. Se observan organismos extracelulares como agrega-dos de material granular rosa (flechas). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

10 µm 10 µm

Si se separa el suero de los glóbulos rojos y se mantiene en el frigorífico, la mayoría de losanalitos de un perfil bioquímico ordinario se mantienen estables de 24 a 48 horas.

Prueba de coagulaciónDos recomendaciones relacionadas con el manejo de muestras para las pruebas de coagulaciónson un llenado adecuado del tubo y, de nuevo, el procesamiento a tiempo de las muestras. Comose comentó previamente, los tubos de citrato tienen un volumen relativamente grande de anti-coagulante. Es importante que los tubos de citrato se rellenen hasta el volumen adecuado paraevitar una prolongación artificial de los resultados de la prueba.

Los factores de coagulación también son lábiles, y se degradan in vitro con el tiempo. Serecomienda con frecuencia que el plasma con citrato empleado para la prueba de coagulaciónse mantenga frío, separado de los glóbulos rojos, y que se estudie de 30 minutos a 4 horas trasla obtención [11-13]. Si no se puede realizar el estudio en este tiempo, se debe congelar el plas-ma separado (nunca hay que congelar la sangre completa) y enviar al laboratorio en un paque-te frío.

Aunque estas recomendaciones son de sentido común y son probablemente la forma mássegura de garantizar la calidad de la muestra de todas las especies, varios estudios de muestrashumanas y caninas sugieren que la mayoría de las muestras para PT y PTT pueden permanecerestables durante períodos mucho más largos [14-17]. Los estudios en muestras caninas sugie-ren que se pueden obtener resultados válidos de PT y PTT con plasma con citrato (separado delos glóbulos rojos) almacenados menos de 48 horas si se mantiene en el frigorífico [14] o inclu-so a temperatura ambiente [15].

Muestras citológicasExiste actualmente un auténtico debate respecto a la obtención y derivación de muestras cito-lógicas. Otros comentarios más detallados están disponibles en la publicación anterior de Clí-nicas Veterinarias de Norteamérica: Medicina de pequeños animales [18]. Sin embargo, pocospuntos merecen ser comentados.

Los porta secados al aire para la valoración citológica ordinaria obtenidos con aspiracióncon aguja fina o impresión de frotis se mantienen relativamente estables durante varios días sinningún manejo especial. Los porta no deben fijarse con calor o alcohol antes de ser derivadosal laboratorio. La principal recomendación respecto al manejo de muestras es la protección delos porta durante el transporte, como se ha comentado previamente. Además, es importante quelas muestras no teñidas (de cualquier tipo) se protejan de los gases de la formalina, lo que puedeevitar una tinción adecuada y hacer que la valoración de la muestra sea imposible. Por ello, losporta no teñidos nunca deben guardarse en el mismo paquete que la muestra fijada con forma-lina, incluso cuando está dentro de supuestos contenedores «de aire comprimido».

Las muestras líquidas para citología (peritoneal, pleural y pericárdicas) tienen una mayortendencia a artefactarse que los porta obtenidos de lesiones tisulares sólidas. Todos los líquidosprevistos para el análisis citólogico deben derivarse en EDTA y mantenerse en el frigoríficohasta que sean enviados. Muchas muestras líquidas derivadas en los tubos de suero son ininter-pretables. La valoración de muestras líquidas comprende la determinación del recuento de célu-las nucleadas, la concentración proteica y el análisis citológico. Si la lesión es inflamantoria, loslíquidos colocados en los tubos de suero pueden coagular, invalidando los recuentos celulares.Además, sin conservantes, pueden aparecer importantes cambios morfológicos en tan sólo


24 horas (dependiendo de varios factores, como el tipo de células existente o la temperaturaambiente). Incluso si las células no se han lisado abiertamente, la valoración de las célulaspara los criterios neoplásicos puede dificultarse por los artefactos debidos al envejecimientode la muestra que pueden aparecer en las células existentes. Finalmente el EDTA puede ayu-dar a evitar el sobrecrecimiento bacteriano (patógenos o contaminantes) durante el transpor-te. Si se desea realizar un cultivo bacteriano, una parte de la muestra debe mantenerse en untubo estéril o medio de transporte, además de la parte destinada a la citología colocada enel tubo con EDTA.

Incluso cuando las muestras se colocan con EDTA, las células se degeneran con el tiempo.Como con las muestras sanguíneas, conseguir frotis desde el fluido en el momento de la obten-ción es la mejor forma de conservar la morfología celular. A diferencia de la sangre completa,la celularidad de las muestras de citología puede ser extremadamente variable, y esto afecta acómo realizar los porta. Las muestras que son turbias probablemente tienen una mayor celula-ridad. En este ejemplo, es adecuado realizar frotis directos (igual que con los frotis sanguíneos),ya que la densidad celular debe ser suficiente para la valoración. Si la muestra es relativamen-te clara, sin embargo, probablemente la celularidad de la muestra es baja, y es importante reali-zar algún método para concentrar las células. Si se obtiene suficiente líquido, las preparacionesconcentradas pueden conseguirse centrifugando una parte de la muestra a baja velocidad, tras-vasando la mayoría del sobrenadante, resuspendiendo el sedimento, y realizando entoncesfrotis directos con la suspensión obtenida (similar a la preparación del sedimento urinario).Es importante obtener uno o dos frotis directos desde los que se pueda valorar la celularidad dela muestra. Los recuentos celulares obtenidos con analizadores hematológicos automáticos de muestras de derrames en cavidades corporales son a veces equívocos debido a las propiedadesfísicas de la muestra, y siempre es importante comparar los recuentos celulares automáticos conuna valoración de la celularidad a partir de un frotis directo. Los frotis directos y concentradosdeberían derivarse al laboratorio sin teñir, junto con el fluido en EDTA.

RESUMENLos resultados de muchos estudios ordinarios de laboratorio proporcionan información diag-nóstica importante y son una parte importante del cuidado del paciente en muchas situaciones.Garantizar la precisión de estos resultados no sólo es importante desde el punto de vista diag-nóstico, sino que puede evitar la frustración tras el esfuerzo de obtener y derivar muestras queno producen resultados interpretables. Afortunadamente, la mayoría de las fuentes habitualesde artefactos son fácilmente evitables. Las recomendacionas más importantes comentadas sonla selección de los tubos adecuados en los que derivar la muestra, minimizar el tiempo de trans-porte, y realizar los pasos adecuados (mantener en frío, preparación de frotis prefabricados,empaquetado adecuado) para minimizar los artefactos cuando un tiempo de transporte prolon-gado no es evitable. Finalmente, la valoración de la calidad de la muestra (p. ej., comprobar loscoágulos en las muestras con EDTA, valorar la hemólisis o lipemia en suero) puede ayudar a laobtención de muestras extras mientras el paciente aún está disponible.

Bibliografía


4 Obtencion y Manejo de Muestras Romy

Documents

Transcript of 4 Obtencion y Manejo de Muestras Romy