Ensaios de Bioequivalncia

Etapa Analtica

mtodo analtico

validado

Tcnicas de quantificao de frmacos em amostras

biolgicas:

cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE, HPLC highperformance liquid chromatography);

cromatografia gasosa (GC gas chromatography);

imunoensaios (radioimunoensaio, enzimaimunoensaio).

Tipos de amostras:

sangue;

plasma;

soro;

urina;

saliva;

...

Pontos crticos no processo de encaminhamento das

amostras biolgicas:

identificao (estudo, sujeito, fase, data e horrio da coleta);

temperatura durante o transporte;

avaliao das condies das amostras no recebimento;

armazenamento no laboratrio analtico.

Pr-tratamento:

precipitao por protenas;

extrao lquido-lquido;

extrao por fase slida.

fase mvel/fase estacionria;

migrao diferencial/separao;

deteco/cromatograma;

tempo de reteno/rea de pico;

padro interno;

CLAE/GC.

fase mvel lquida;

tipos bsicos:

cromatografia lquido-lquido ou de partio;

cromatografia lquido-slido;

cromatografia de troca inica;

cromatografia de excluso.

Detectores:

absorbncia no ultravioleta e visvel (UV-VIS);

arranjo de diodos (DAD);

fluorescncia;

espectrometria de massas (LC/MSMS).

A CLAE permite separao e quantificao dos

componentes de uma amostra.

reservatriode fase mvel

bomba

manmetro

dreno

injetor

coluna

forno detector

integrador

vlvula injetora

1

2

3

Detector A

fluconazol

Pk #

UV-vis

fluorescncia

LC-MSMS

lorazepam m/z=321

transio: 321>275

bromazepam m/z=318

transio: 318>102

fase mvel gasosa;

fase estacionria lquida ou slida;

volatilizao da amostra;

amostras volteis e termorresistentes.

EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique);

FPIA (fluorescence polarization immunoassay);

alta sensibilidade;

baixa seletividade;

fenobarbital, teofilina, digoxina, etc...

Parmetro importantes:

faixa de linearidade e limite de quantificao;

complexidade do processo de pr-tratamento;

tempo de anlise;

disponibilidade de padro interno;

toxicidade dos solventes e demais reagentes.

A quantificao do frmaco nas amostras biolgicas feita por meio de comparao com amostras padro (curva de calibrao) e controlada por meio de amostras de controle de qualidade. 0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

Concentrao (mg/mL)

rea d

o p

ico

(x 1

04)

preparao das amostras:precipitao de protenasextrao lqido-lqidoextrao por fase slida

anlisepor CLAE/GC/IE

Validao

quantificao do frmaco:curva de calibraocontrole de qualidade

A validao deve garantir que o mtodo atenda s

exigncias das aplicaes analticas, assegurando a

confiabilidade dos resultados.

Abrange os seguintes itens (RDC 27/2012):

seletividade;

efeito residual;

efeito matriz;

curva de calibrao;

preciso;

exatido;

estabilidade.

Outros parmetros (RE 899/03):

recuperao;

limites de deteco e quantificao;

robustez.

Capacidade do mtodo de diferenciar e quantificar os

analitos de interesse (frmaco e PI) na presena de outros

componentes da amostra.

So investigados pela anlise de amostras de plasma branco

(quatro amostras normais, uma lipmica, uma hemolisada)

para verificao da existncia de interferncia por parte de

componentes endgenos.

5% para PI

20% LIQ para analito

Aparecimento ou aumento do sinal do analito ou PI causado

por contaminao proveniente de amostras analisadas

anteriormente.

Devem ser realizadas, no mnimo, 3 (trs) injees da mesma

amostra branco, sendo uma antes e duas logo aps a injeo

de uma ou mais amostras processadas do LSQ.

5% para PI

20% LIQ para analito

Efeito na resposta do analito ou PI causado por componentes

da matriz biolgica.

Devem ser analisadas amostras de matrizes biolgicas

processadas (para plasma: 4 normais, 2 lipmicas, 2

hemolisadas), posteriormente adicionadas de analito e PI, e

solues, nas mesmas concentraes das amostras de CQB e

CQA.

Fator de matriz normalizado (FMN): CV

A curva de calibrao indica a relao entre concentrao de analito e resposta do mtodo, representada, no caso da CLAE, pela razo de reas dos picos cromatogrficos de analito e PI.

definida utilizando-se no mnimo seis concentraes de padro em plasma e trs repeties. Deve-se estabelecer correlao de preferncia linear entre concentrao, considerada varivel independente (x) e rea do pico, considerada varivel dependente (y).

A preciso de mtodos bioanalticos uma medida de erro aleatrio e definida como concordncia entre vrias medidas da mesma amostra, sendo expressa como coeficiente de variao (C.V. %) dessas medidas:

preciso intracorrida: cinco replicatas

preciso intercorridas (3, dias distintos): cinco replicatas

Concentraes: LIQ, CQB, CQM, CQA, CQD.

No deve ser superior a 15% (20% para LIQ).

A exatido de mtodos bioanalticos uma medida de erro sistemtico e definida como concordncia entre o valor determinado e o valor real:

preciso intracorrida: cinco replicatas

preciso intercorridas (3, dias distintos): cinco replicatas

Concentraes: LIQ, CQB, CQM, CQA, CQD.

No deve ser superior a 15% (20% para LIQ).

Dados sobre estabilidade so necessrios para garantir que a concentrao da substncia no sofre alterao entre a coleta da amostra e o momento da anlise.

longa durao;

curta durao

ciclos de congelamento e descongelamento;

Ps-processamento;

solues-padro refrigeradas ou congeladas.

Concentraes: CQA e CQB

A recuperao corresponde ao resultado obtido aps anlise

de amostra de plasma branco acrescida de padro,

submetida a pr-tratamento, expresso como porcentagem do

resultado obtido aps anlise de padro puro, no submetido

a pr-tratamento.

Os limites de deteco e quantificao expressam a capacidade do mtodo analtico em determinar pequenas concentraes de analito:

limite de deteco: representa a menor concentrao que pode ser diferenciada do nvel de rudo;

limite de quantificao: deve apresentar resposta , no mnimo, duas vezes maior que a do limite de deteco, e representa a menor concentrao que pode ser determinada com exatido e preciso aceitveis (20%).

Avalia a suscetibilidade do mtodo analtico a variaes

nas condies analticas, tais como: tempo de extrao;

pH da fase mvel;

composio da fase mvel;

coluna;

temperatura;

fluxo.