DNA-SYNTHESEHEMMUNG DURCH 5-FUDR 1475

DNA-Synthesehemmung durch 5-FUDR bei Sinapis alba (L.)

Inhibition of DNA-Synthesis by 5-FUDR in Sinapis alba (L.)

I n g r id C a p e s iu s u nd M a r t in B o p p

Botanisches Institut der Universität Heidelberg

(Z. Naturforsch. 25 b, 1475— 1477 [1970] ; eingegangen am 30. Ju li 1970)

In Sinapis alba seedlings the cell elongation is inhibited by 5-FUDR. At a concentration of 10-5 M FUDR reduces the incorporation of 3H-cytidine into the DNA of the hypocotyl by 50% in24 hours; if, however, the labeling begins two hours after application of FUDR the inhibition amounts to 63 per cent. In the cotyledons the corresponding values are 73 and 79 per cent. On the contrary, FUDR enhances the incorporation of 14C-thymidine into DNA by 48% and 44% in the hypocotyl and cotyledons, respectively. These experiments suggest that FUDR inhibits DNA syn­thesis by blocking the thymidine pool (or thymidine-5-phosphate pool).

5-FUDR * hemmt das etiolementbedingte Strek-

kungswachstum2 und andere morphogenetische

Schritte3 bei Blütenpflanzen. Mehrfach wurde eine

Verminderung des gesamten DNA-Gehalts in ge­

hemmten Geweben gegenüber der Kontrolle nach­

gewiesen 4. Häufig wird daher FUDR zur Blockie­

rung von Zellteilungen verwendet5. Ein direkter

Nachweis der Beeinflussung der DNA-Synthese

durch 5-FUDR in Pflanzenorganen, deren Zellstrek-

kung durch diese Substanz gehemmt wird, liegt

dagegen bisher nicht vor. Auf autoradiographischem

Wege haben B e l l und W o l f 6 gezeigt, daß in den

Meristemen von Wurzelspitzen durch FUDR — aber

auch durch hohe Thymidingaben — der Einbau von

3H-Desoxycytidin in die Zellkerne verhindert wird.

Die verwendete Methodik und der gleichsinnige Ef­

fekt hoher Thymidindosen erlauben jedoch zunächst

keine Verallgemeinerung dieses Resultats.

Um eine Änderung der DNA-Syntheserate durch

5-FUDR direkt zu erfassen, markierten wir Keim­

pflanzen von Sinapis alba mit 14C-Thymidin bzw.

3H-Cytidin. Die Neusynthese wurde dann anhand

des Einbaus in Kotyledonen und Hypokotyle ge­

trennt bestimmt.

Sonderdruckanforderungen an Dr. I. Capesius, Prof. Dr. M. Bopp, D-6900 Heidelberg, Bot. Institut, Hofmeister­weg 4.

* Der Firma Hofmann-La Roche, Grenzach/Baden, danken wir für die Überlassung des 5-FUDR.

1 M. Bopp, Z. Pflanzenphysiol. 57,173 [1967].2 M. Bopp u. I. Capesius, Planta 96, 35 [1914].

3 I. Z e e v a a r t , Plant Physiol. 37, 296 [1962] ; D. E. F o s k e t ,

Proc. nat. Acad. Sei. USA 59, 1089 [1968] ; M. Bopp,

Nature [London] 207, 83 [1965].

Experimentelles

Den nach standardisierten Bedingungen7 im Dun­keln bei 25 °C angezogenen Keimlingen wurde 36 Stdn. nach Aussaat die Samenschale entfernt. Gleichzeitig wurden sie auf neues vorbehandeltes Filtrierpapier überführt, das mit Knop- Nährlösung, radioaktivem Thymidin oder Cytidin und FUDR (10-5 bzw. 10~6 m )

getränkt war. Die Konzentration von 14C-Thymidin (Boehringer, Mannheim) betrug 0,25 //Ci/ml, die von 3H-Cytidin (The Radiochemical Centre Amersham)2,5 ^Ci/ml Lösung. Die intakten Keimlinge verblieben 24 Stdn. auf diesem Substrat. Danach wurden sie mit eisgekühltem destilliertem Wasser 3-mal gewaschen und auf eisgekühlter Platte in Kotyledon, Hypokotyl und Wurzel getrennt. Die Wurzeln wurden verworfen. Die weitere Verarbeitung erfolgte wie früher angegeben7. Einige Hypokotyle wurden in Alkohol : Eisessig 3 : 1 fixiert und für autoradiographische Zwecke bestimmt.

Die Extrakte aus thymidinmarkierten Pflanzen wur­den auf MAK-Säulen getrennt und die ausschließlich im DNA-Gipfel befindliche Aktivität im Scintillations- zähler (Tricarb) in Toluol, dem PPO und POPOP zugesetzt war, gemessen. Die Extrakte aus den cytidin- markierten Pflanzen wurden zur Entfernung der mar­kierten RNA entweder einer Behandlung mit RNase (5 //g/ml, 30 min bei 37°) unterzogen8, danach un­mittelbar an einer MAK-Säule adsorbiert und chromato- graphiert oder die Gesamt-Nucleinsäuren an einer Sepharose 4 B (Pharmacia) -Säule (2,5 x 65 cm) chro- matographiert, bei welcher die DNA vollständig ge­trennt von der RNA eluiert wird 8> 9.

4 I. N it s a n and A. L a n g , Plant Physiol. 41, 965 [1966] ; R. E. H o lm and I. L . K ey, Plant Physiol. 44, 1295 [1969].

5 M. Bopp u . L. B ö h r s , Planta 67, 357 [1965] ; W . S a c h ­

senm a ie r , in: Problem der Biol. Reduplikation, p. 139,

Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1966.

6 S. B e l l and S. W o l f , Exp. Cell Res. 42, 403 [1966].

7 I. Capesius u . M. Bopp, Planta 94, 220 [1970].

8 I. Capesius u . G. R ic h t e r , Z. Naturforsch. 23, 570 [1968].9 R . B e id e rbe ck u . G. R ic h t e r , Arch. Mikrobiol. 67, 256

[1969].

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Imp

/min

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1476 I. CAPESIUS UND M. BOPP

Ergebnisse

Rechromatographie des DNA-Peaks an MAK

zeigt, daß sich nach Sepharosetrennung die Radio-

KONTROLLE

25 F ra k tio n

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M AK j •-2000 i i

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-1000i i' I 0.3-j Ä\ 0.2-\J « 0,1-

10 15 20 25 30

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10 15 20 25 ' '

b

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-1000f\1 \ 0,3- 1 0.2-

10 15 20 25 30

b

-2000

DNA

-1000 i \ 0.3- ! d 0.2-JAs-'-

10 15 20r i i

25 30

Abbn. 1 — 3. Chromatographische Auftrennung der Nuclein- säuren nach Einbau von 3H-Cytidin (spez. Aktiv. 2,5 ,aCi/ml) in Hypokotyle von Sinapis alba, von Std. 36 — 60 nach Aus­saat. O — O UV-Absorption, • — • Radioaktivität (Imp/min/ ml). 1. Chromatographie an Sepharose 4 B. a) Kontrolle, b) mit 10—5 M FUDR. 2. Rechromatographie der an Sepharose getrennten DNA an einer MAK-Säule. a) Kontrolle, b) mitIO-5 M FUDR. 3. Chromatographie an MAK nach RNase-Ab­

bau. a) Kontrolle, b) mit 10~5 m FUDR.

aktivität nur in der DNA-Region befindet und tat­

sächlich von den restlichen Nucleinsäurekompo-

nenten abgetrennt wurde. Beide Methoden lieferten

völlig übereinstimmende Resultate (Abbn. 1—3).

Absorption und Aktivität zeigen den gleichen typi­

schen Verlauf wie bei B e id e r b e c k und R i c h t e r 9.

Die Ergebnisse der Markierungsversuche sind in

Tab. 1 für Hypokotyle, in Tab. 2 für Kotyledonen

zusammengefaßt. Die cytidinmarkierten Experi­

mente sind unmittelbar vergleichbar. Die Thymidin-

Versuche bei denen es sich um 14C-Markierung han­

delt, können dagegen nur in bezug auf die Hem­

mung bzw. Förderung verglichen werden.

Bei den mit 3H-Cytidin markierten Pflanzen ist

der Einbau bei gleichzeitiger FUDR-Zugabe in Ab­

hängigkeit von der Konzentration in den Hypokoty-

len bis zu 50% in den Kotyledonen bis zu 70% ge­

hemmt. Der Einbau vermindert sich noch weiter,

wenn die Pflanzen bereits 2 Stdn. vor der Markie­

rung (34 —36 Stdn. nach Aussaat) FUDR bekom­

men. In diesem Falle ist die Hemmung schon zu

Beginn des Cytidineinbaus wirksam. Die Gesamt-

DNA-Menge ist in allen Experimenten nicht signifi­

kant verändert7.

14C-Thymidin wird bei gleichzeitiger FUDR-

Applikation (die etwa zu einer Streckungshemmung

von 25% führt) in Hypokotylen etwa 50% in den

Kotyledonen über 40% stärker eingebaut als in der

Kontrolle. Die Aktivität findet sich fast ausschließ­

lich in den Zellkernen, wie durch Autoradiographie

festgestellt Averden konnte.

Die Ergebnisse der Tabn. sind zu erwarten, wenn

FUDR auch in den Geweben mit geringer Zelltei­

lung aber fortgesetzter DNA-Synthese2 die Thymi-

dilatsynthetase 6 hemmt. Auch geringe Mengen von

14C-Thymidin können dann infolge des durch die

FUDR konz.

[M]

Zeitp. d. Behand­lung, Stdn nach Aus­

saat

Markiertmit

Kontrolle spez. Aktivität

beh. Pflanzen spez. Aktivität

Hemmung bzw. För­derung der DNA- Synthese in % der

Kontrolle

IO"6 36-60 3H-Cyt. 82,5 • 104 * 46,6 • 104 - 4 410~5 36-60 3H-Cyt. 82,5 • 104 b 41,8 ■ 104 - 5010~5 34—60a 3H-Cyt. 84,5 • 104 c 31,4 • 104 - 6310-6 36—60 14C-Thym. 5,7 • 106 d 8,45 •• 106 + 48

Tab. 1. Änderung des Einbaus von 3H-Cytidin bzw. 14C-Thymidin innerhalb 24 Stdn. in Hypokotyle von Sinapis alba bei gleichzeitiger Gabe von 5-FUDR. Der Einbau beginnt immer 36 Stdn. nach Aussaat. a Zugabe von FUDR 2 Stdn. vor der radioaktiven Lösung, b Behandlung des Extraktes mit RNase (5 /ug/ml, 30 min, bei 37 °C) und Trennung an einer MAK- Säule. c Trennung des Extrakts auf Sepharose 4 B (Pharmacia, Stockholm) und anschließender Rechromatographie an MAK. Die Kontrollen von b und c ergeben identische Werte. Angegeben ist die spezifische Aktivität des DNA-Peaks nach chromato

graphischer Trennung an einer MAK-Säule. d Bestimmung der spezifischen Aktivität nach Chromatographie an MAK.

TETRAPHENYLBORAT UND FEINSTRUKTUR VON ZELLEN 1477

FUDRKonz.

[M]

Zeitp. d. Behand­lung, Stdn. nach

Aussaat

Markiertmit

Kontrolle spez. Aktivität

beh. Pflanzen spez. Aktivität

Hemmung bzw. För­derung der DNA- Synthese in % der

Kontrolle

IO"6 36-60 3H-Cyt. 42,3 • IO4* 13,2 -IO4 - 69IO“5 36-60 3H-Cyt. 42,3 • 104b 11,6 -IO4 - 73IO"5 34—60a 3H-Cyt. 42,7 • 104c 8,85 • 104 - 79IO“6 36-60 14C-Thym. 3,4 • IO6* 4,9 -IO6 + 44

Tab. 2. Änderung des Einbaus von 3H-Cytidin und 14C-Thymidin in die Kotyledonen von Sinapis alba. (Für Versuchsdurch­führung und Bezeichnung siehe Tab. 1.)

Hemmung verringerten Thymidinpools bzw. Thy-

midin-5-Phosphatpools in hohem Maße eingebaut

werden.

Die Markierung mit Cytidin, das direkt in Des-

oxycytidin umgewandelt wird, aber die Blockierung

der Thymidilatsynthetase nicht umgehen kann, zeigt

die durch FUDR bedingte verminderte Syntheserate

der DNA unmittelbar an.

Damit ist gezeigt, daß auch in den Objekten,

deren Zellstreckung durch FUDR (direkt oder in­

direkt 2) gehemmt wird, während der Zeit der stärk­

sten Streckungshemmung1 eine beträchtliche Hem­

mung der DNA-Synthese erfolgt. Ob FUDR seine

morphogenetische Wirkung auf diesem Wege aus­

übt, ist damit zwar noch nicht endgültig geklärt aber

wahrscheinlich geworden, zumal die Hemmung durch

FUDR ausschließlich durch Thymidin10 reversibel

ist.

Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemein­schaft. Fräulein M. K e s t e n danken wir für sorgfältige Hilfe bei der Durchführung der Versuche.

10 M . B o p p , Physiol, veg. 8, 215 [1970].

Einfluß von Tetraphenylborat auf die Feinstruktur von Zellen

der Maiswurzelspitze

Influence of Tetraphenylboron on Fine Structure of Cells of Corn Root Tips

Ch a r l o t t e H e c h t -Bu c h h o l z und H o rst M a r s c h n e r

Institut für Pflanzenernährung der Technischen Universität Berlin

(Z. Naturforsch. 25 b, 1477— 1479 [1970] ; eingegangen am 17. Ju li 1970)

Treatment (1 — 3 h) of corn root tips with 5 x 10_5 m tetraphenylboron (TPB) caused charac­teristic changes of the membrane structure in the outer layers of the root cortex cells. The mito­chondria had lost their inner structure. At the double membrane of the mitochondria and at the membrane plasmalemma, tonoplast, and endoplasmatic reticulum there appeared numerous osmio- philic globuli (ca. 50 nm). The permeability of the membranes seemed to be increased extremely. It is suggested that the lipoproteine complex of the membranes was destroyed by interaction of TPB with ammonium groups of the membrane constituents.

Tetraphenylborat (TPB) — auch als „Kalignost“

bezeichnet — ist als Fällungsmittel für Kalium be­

kannt. TPB wurde auch eingesetzt, um Rückschlüsse

auf die Rolle von Kalium im Stoffwechsel zu

ziehen1’2. Auch für Untersuchungen über Ver-

Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. H. M a r s c h n e r ,

Institut f. Pflanzenernährung d. T.U. Berlin, D-1000 Ber- lin-33, Lentzeallee 55 — 57.

1 K. U ts u m i u . L. P a c k e r , Arch. Biochem. Biophysics 122, 509 [1967].

änderungen der Feinstruktur von Maiswurzelzellen

bei Entzug von Kalium3 wurde u. a. TPB ange­

wandt. Dabei traten charakteristische Veränderungen

der Feinstruktur auf, über die hier berichtet werden

soll.

2 A. A. H o r t o n u . L. P a c k e r , Arch, biochem. Biophysics 128, 820 [1968].

3 C h . H e c h t - B u c h h o l z u . H . M a r s c h n e r , Z. Pflanzen- physiol., im Druck.