This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

MIKROSKOPISCHER VERGLEICH DER ZELLVERMEHRUNG BEI HEFESTÄMMEN 3 0 5

und biologisch getestet. Die erhaltenen Werte wurden zum Trockengewicht der lyophilisierten Nährlösung in Beziehung gesetzt.

Abb. 2.Photoprint eines Aussalzchromatogramms; X: gamonhaltige Bande.

,V

Für das ( + )-Gamon ergibt sich auf diese Art eine insgesamt 10000-fache Anreicherung bei 60-proz. Ausbeute, das ( — )-Gamon konnte bisher nur 4500- fach angereichert werden.

W ährend für das (-f)-G am on die papierchro­matographische Trennung trotz erheblicher Verluste

bei der Elution noch als präparative Methode zu sei­ner Isolierung gelten kann, sind die Verluste an (- ) -G a m o n bei der Elution aus dem Papier so hoch, daß die Aussalzchromatographie für das ( — )- Gamon nur analytischen Wert besitzt.

Die Erkenntnis, daß sich beide Gamone bei dem beschriebenen Aufarbeitungsgang grundsätzlich gleich verhalten und sowohl bei der Verteilungs- als auch bei der Aussalzchromatographie in der gleichen Fraktion bzw. Bande wiedergefunden werden, ent­schädigt zunächst für den Verlust an ( — ) -Gamon. Wir haben uns damit begnügt, den Anreicherungs­grad für das ( — ) -Gamon nach der verteilungschro­matographischen Trennung bei 80-proz. Ausbeute zu bestimmen.

Der gesamte Aufarbeitungsgang mit seinen ex­perimentellen Einzelheiten ist in nebenstehendem Schema wiedergegeben.

Herrn Prof. Dr. A. B u t e n a n d t danken wir für wert­volle Hinweise und großzügige Unterstützung, der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t für finanzielle Förderung.

Die Untersuchungen werden fortgesetzt.

3 G. B r a u n i t z e r , Makromolekulare Chemie XVIII/XIX. 501[1956].

Mikroskopischer Vergleich der Zellvermehrung bei Hefestämmen verschiedenen Ploidiegrades nach UV- und Peroxyd-lnaktivierung

Von W o l f g a n g L a s k o w s k i und W e r n e r S t e in

Aus dem Max-Planck-Institut für vergleichende Erbbiologie und Erbpathologie, Berlin-Dahlem und dem I. Physikalischen Institut der Freien Universität, Berlin(Z. Naturforsdig. 13 b, 305— 314 [1958] ; eingegangen am 23. Januar 1958)

The microscopical pattern of rest-budding in UV or peroxide treated yeast cells was studied in strains of different ploidy. UV-irradiation caused in all investigated strains a very similar pattern, i.e. by a given effective dose, measured by the macroscopical survivals, approximately the same final frequencies of more than one and also of more than three cells in a clone could be observed in all investigated strains. It seems possible to explain these results by a non-strain-depend­ing dose reduction factor of 2.2 : 1 for the frequency of more than one cell, and 1.2 : 1 for the frequency of more than three cells, both related to the commonly used macroscopical survival fre­quency curve. The dose reduction by photoreactivation was approximately 2 : 1 and caused a cor­responding shift of the microscopical pattern. After treatment with organic peroxides the micro­scopical pattern in haploid strains was very similar tc that after UV-treatment, although there was no photoreactivation. In diploid strains there is a diaracteristical different pattern with nearly none rest-budding even in a strain produced by self-diploidization. These results are discussed in their bearing on possible inactivation mechanisms.

Die Bildung von Makrokolonien wird sehr häufig berücksichtigt. Obwohl daher der Informationsgehaltals Kriterium der Inaktivierungsrate bei Mikroorga- dieses Merkmals relativ klein ist, genügt es erfah-nismen angewandt. Dieses Kriterium läßt den Zu- rungsgemäß häufig zur erfolgreichen Bearbeitungstand der nicht makroskopisch sichtbaren Klone un- bestimmter Probleme, wie etwa dem der Resistenz

3 0 6 W. LASKOWSKI UND W. STEIN

gegenüber inaktivierenden Einflüssen. Dieses Kenn­zeichen versagt jedoch weitgehend, wenn es z. B. dar­auf ankommt, die Wirkungen verschiedener inakti­vierender Agenzien an ein und demselben Objekt zu vergleichen, wie etwa Strahlenwirkungen mit Gift­wirkungen. Hier kommt man über die Aussage nicht hinaus, daß diejenige Giftwirkung einer bestimmten Strahlendosis äquivalent ist, die denselben Prozent­satz von Makrokolonien ergibt. Erst die Einführung zusätzlicher Kriterien, wie z. B. das einer Reaktivie­rungsfähigkeit. gestattet, die Inaktivierungswirkun- gen weiter kritisch zu vergleichen und dadurch etwa auf Ähnlichkeit oder Unähnlichkeit des Inaktivie- rungs-Mechanismus zu schließen.

Als ein solches zusätzliches Kriterium kann nun auch die mikroskopische Zellvermehrung nach inakti­vierenden Einflüssen herangezogen werden. Hier kann man auf die zeitliche Entwicklung (Teilungs- bzw. Knospungsrate) achten, und auf die schließlich vorhandene Zellzahl in den makroskopisch nicht sichtbaren Klonen. Ähnliche Inaktivierungs-Mecha- nismen sollten auch in dieser Hinsicht ähnliche E r­gebnisse zeitigen. Darüber hinaus gestattet dieses Kriterium der mikroskopischen Beobachtung, ver­schiedene Dosen des gleichen inaktivierenden Agens an dem gleichen Objekt über den makroskopischen Inaktivierungseffekt hinaus zu analysieren. Auch bei Prüfungen unterschiedlich resistenter Stämme kann es wertvoll sein, das mikroskopische Muster heran­zuziehen. In dieser Arbeit werden solche zusätzlichen mikroskopischen Informationen benutzt, um die In­aktivierung verschiedener Hefestämme nach UV- und Peroxydeinwirkung vergleichend zu diskutie­ren.

1. M aterial und M ethodik

Folgende Hefestämme wurden hauptsächlich benutzt: a-U, ein haploider Stamm von Saccharomyces cerevi- siae; 41, ein diploider Stamm von Saccharomyces cere- visiae, dessen einer Elter a-41 ist; 20G, ein als UY- resistent selektionierter Stamm unbekannten Ploidie- grades, als Cryptococcus diffluens bestimmt. Weitere ge­legentlich benutzte Stämme werden an geeigneter Stelle erwähnt. Die Stämme wurden auf Schrägagar folgender Zusammensetzung bei 4° C im Kühlschrank aufbewahrt: 2% Glucose, 1% Hefeextrakt (Difco-Präparat), 0,5% Pepton und 1°/o Agar. Jeweils 48 Stdn. vor Versuchs­beginn wurde eine Nadelöse von der Schrägagarkultur übertragen in 5 cm3 Bouillon der Zusammensetzung:0.25% Glucose und 1% Hefeextrakt und bei 30° C be­brütet. In einem solchen zuckerarmen Medium war nach 48 Stdn. die stationäre Phase erreicht und der Prozent­

satz sprossender Zellen relativ gering. Während a-41 und 41 in Reagenzgläsern ohne zusätzliche Relüftung kultiviert wurden, wurde das mit 20G beimpfte Reagenz­glas in einer Schüttelmaschine stark geschüttelt und da­mit belüftet, um die in unbelüfteten Kulturen bei diesem Stamm relativ häufigen spontan inaktiven Zellen zu vermeiden. Nach 48 Stdn. wurden so etwa folgende Titer erreicht: a-41 und 41 2 — 4 ■ 107/cm3; 20G 1 — 2 • 108/cm3 Da a-41 als haploider Stamm zur Klumpung neigt, wur­den jeweils vor Versuchsbeginn durch fraktionierte Zen­trifugierung die großen Klumpen eliminiert und die Einzelzellen stark angereichert. Erforderlichenfalls wurde der Einfluß von Zellgruppen auf die Inaktivie- rungsrate für alle Stämme durch rechnerische Korrektur eliminiert1.

Die UV-Inaktivierung wurde mit einer Hg-Nieder- drucklampe (Osram HNS 12) durchgeführt. Die be­strahlten Zellsuspensionen wurden aus der Rouillon kultur durch Abzentrifugieren, wiederholtes Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung und passende Ver­dünnung gewonnen. Die Suspensionen wurden in offe­nen Schälchen von oben bestrahlt und die Schichtdicke so gewählt, daß keine gegenseitigen Abschattungen der Zellen auftraten.

Die zur Inaktivierung benutzten organischen Peroxyd­lösungen (OP) wurden zubereitet, indem H20 2 in be­stimmten Konzentrationen für 24 Stdn. auf 1-proz. Hefe- extraktlösung (Difco) einwirkte. Die Konzentrations­angaben beziehen sich jeweils auf den H20 2-Gehalt. Ein cm3 der Vorkultur wurde in 4 cm3 OP für 30 min bei 30° C aufbewahrt. Darauf wurden die Zellen abzentri­fugiert, gewaschen und in physiologischer Kochsalz­lösung resuspendiert. Die so durch UV oder Peroxyd­bouillon inaktivierten Zellen wurden ohne Zeitverzug nach weiteren geeigneten Verdünnungen parallel zu un­behandelten Kontrollen auf Nähragar (gleiche Zusam­mensetzung wie oben erwähnter Schrägagar) aufge­bracht. Dieser befand sich für die mikroskopische Reob- tung auf einem mit einem Glasrahmen umrandeten Ob­jektträger. Um der Austrocknung zu begegnen, wurden die Platten zwischen den mikroskopischen Reobachtun- gen in einer feuchten Kammer bei 30c C bebrütet.

Auf diesen mikroskopischen Präparaten wurde die Lage von jeweils etwa 50 — 70 Einzelzellen festgelegt und die Klonentwicklung bei 30° C an Hand der Zell­zahl von Zeit zu Zeit festgestellt. Für die Zeit der mikro­skopischen Beobachtung (jeweils etwa 30 min) befanden sich die Präparate auf Zimmertemperatur. In einigen Versuchen wurden auch einzelne Zellen mit Hilfe eines Mikromanipulators aus einer Zellsuspension isoliert und auf Nähragartropfen übertragen. Dieses Verfahren ge­stattet eine einwandfreie Überwachung des Kolonie­wachstums ohne Überwachsungsgefahr und eine Prüfung jeder stationär gewordenen Mikrokolonie auf die An­wesenheit noch aktiver Zellen, die sich in Rouillon wei­ter zu vermehren vermögen. Um Photoreaktivierung zu vermeiden, wrurde die Releuchtungseinrichtung des Mi­kroskops mit einem Filter versehen, das nur für Wellen-

1 W. S t e i n u . W. L a s k o w s k i . Z. Naturforschg. 12 b, 542[1957],

MIKROSKOPISCHER VERGLEICH DER ZELL VERM EHRUNG BEI HEFESTÄMMEN 3 0 7

längen 560 mp durchlässig ist. Die Zahl der Zellen pro Mikrokolonie wurde bei kleinen Zellgruppen ge­zählt, bei größeren geschätzt und bei den größten mit der Größe des Durchmessers des Gesichtsfeldes im Mi­kroskop verglichen. Die so gewonnenen Zellzahlen Z der Mikrokolonie wurden derart zusammengefaßt, daß für 2"<Z<^2/i + 1 — 1 der Entwicklungszustand der Mi­krokolonie der n-ten Zellgeneration zugerechnet wurde. Bei dieser Gruppeneinteilung gehören z. B. die Zellzah­len 2 — 3 zur ersten, 4 — 7 zur zweiten, 8 — 15 zur drit­ten Zellgeneration und so weiter. Hatte eine in ihren Einzelzellen nicht mehr zähl- oder abschätzbare Kolonie1 jp des Durchmessers des mikroskopischen Gesichts­feldes, so wurde diese Größe durch die Zahl p in römi­schen Ziffern ausgedrückt. Dadurch entstand eine Skala im Bereich I —XX, wobei I einem absoluten Kolonie­durchmesser von 0,8 mm und XX von 0,04 mm entsprach. Etwa von p = X (0,08 mm Durchmesser) an sind die Ko­lonien mit zunehmender Deutlichkeit auch ohne optische Hilfsmittel sichtbar und in diesem Sinne „makrosko­pisch“.

Schätzungen der Zellzahl pro Mikrokolonie wurden in der Regel bis etwa zum 250-Zellenstadium unter­nommen. Für eine ungefähre Beurteilung der Anzahl der Zellgenerationen der mit römischen Ziffern bezeich- neten Entwicklungsstadien der Stämme 41 und 20G bietet sich die Entwicklungszeit an. Bei Zugrundelegung einer Zellgenerationszeit von 2 Stdn., die in unseren Experimenten bei den Kontrollen zu beobachten war, kann man XX etwa der 9., X etwa der 11., V etwa der 13. und I —II etwa der 16. Zellgeneration gleichsetzen.

Für Stamm a-41 wurde die Bezeichnung mit römi­schen Ziffern mit derselben Definition übernommen; je­doch haben diese Bezeichnungen hier wegen unterschied­licher Wachstumsrate und Zellgröße nicht dieselben Be­ziehungen zur Generationszahl wie bei 41 und 20G. Die genaue Zuordnung ist aber für die hier vorgetragenen Ergebnisse nicht wesentlich; jedenfalls bedeutet auch hier X den Übergang zur makroskopisch sichtbaren Ko­lonie. Obwohl es sich bei der Vermehrung von Hefe­zellen um Knospungsprozesse handelt, wird hier zur Vereinfachung der Ausdrucksweise von „Teilung“ der Zellen gesprochen.

2. Ergebnisse

a) U V - u n d O P - E m p f i n d l i c h k e i t d e r v e r w e n d e t e n S t ä m m e

Als orientierende Zusammenfassung der zahlrei­chen Inaktivierungs-Versuche findet man in Abb. 1 a und b die Dosiseffektkurven der 3 hauptsächlich ver­wendeten Stämme für UV- und OP-Behandlung. Für die UV-Bestrahlung sind die Bestrahlungszeiten an­gegeben, wobei 1 min etwa einer Bestrahlung von8 • 103 erg/cm2 mit der Linie 253 m u entspricht. Die OP-Dosen sind als Produkt von Behandlungszeit (30 min) und Konzentration angegeben. Diese Form

der Angabe hat dadurch eine tiefere Bedeutung, als sich in allen Nachprüfungen ergeben hat, daß für die Inaktivierung im wesentlichen das Produkt aus die­sen Faktoren maßgebend ist. also ein c • /-Gesetz g ilt2.

Abb. 1 a und b. Dosiseffektkurven für die makroskopisch Überlebenden für UV- (1 a) und OP-Inaktivierung ( l b) .

Für die Zahl der Überlebenden wurden Mittel­werte genommen, die sich sowohl durch Kolonie­zählungen auf N ähragar in Petrischalen als auch auf den mikroskopischen Präparaten ergaben. Zwischen

2 W. L a s k o w s k i u . W. S t e in , Naturwissenschaften 4 4 . 2 3 6[1957] und unveröffentlichte Versuche.

3 0 8 W. LASKOWSKI UND W. STEIN

diesen beiden Ermittlungen waren nur Differenzen vorhanden, die unsystematisch und im allgemeinen im Rahmen der zu erwartenden Schwankungen lagen.

Der haploide Stamm a-41 (LD50 = 1.25 min) war im gesamten UV-Dosisbereich empfindlicher als der diploide Stamm 41 (LZ)50 = 2,5 m in)3, und seine Dosiseffektkurve weist in dieser halblogarithmischen Darstellung eine geringere Krümmung auf. Der Stamm 20G erwies sich als wesentlich UV-resistenter (LD50 = 20 min) als die beiden anderen Stämme und zeigt in halblogarithmischer Darstellung der Do­siseffektkurve einen steileren Abfall bei Dosen über 24 Minuten.

Hinsichtlich der OP-Empfindlichkeit ist der Stamm a-41 (LD50 = 0.21) ebenfalls eher empfindlicher als Stamm 41 (LD50 = 12). Eine gewisse relative Resi­stenz bei der Dosis 48 gegenüber Stamm 41 ist sta­tistisch nicht gesichert, jedoch wird die OP-Empfind­lichkeit beider Stämme in diesem Dosisbereich offen­bar ähnlich. Auffallend ist in der Dosiseffektkurve von a-41 ein Plateau von ca. 25% Überlebenden, das sich über den Dosisbereich 0,6 bis 12 erstredet. Bei Stamm 20G waren die Schwankungen der Über- lebenden-Zahlen nach OP-Inaktivierung besonders groß. Die LD50 läßt sich zu etwa 1,5 extrapolieren. Bei Dosen ^ 12 ist 20G deutlich OP-empfindlicher als a-41 und 41.

Es hat sich herausgestellt, daß die Empfindlichkeit des Stammes 20G gegenüber UV und besonders gegen­über OP offenbar stark von der Belüftung der Vorkultur abhängt. Am unempfindlichsten ist der Stamm bei schlechter Belüftung der Vorkultur (Erlenmeyerkolben ungeschüttelt, wie in 1. c. 2) und bei besonders gut be­lüfteter Vorkultur (Erlenmeyerkolben geschüttelt, unver­öffentlichte Versuche). Eine relativ große Empfindlich­keit tritt bei mittlerer Belüftung der Vorkultur (senk­recht stehendes Reagenzglas, waagerecht geschüttelt) auf, wie sie bei den hier mitgeteilten Versuchen benutzt wurde. Dieses unerwartete Maximum der Empfindlich­keit bei mittleren Belüftungsgraden läßt sich möglicher­weise deuten, wenn man berücksichtigt, daß schlecht belüftete Kulturen eine hohe Zahl spontan inaktiver Zellen aufweisen, die bei zunehmender Belüftung ver­schwinden. Danach wären die in schlecht belüfteten Kul­turen aktiven Zellen relativ resistent, während die bei schlechter Belüftung potentiell inaktiven Zellen durch zunehmende Belüftung aktiviert werden, zunächst aber noch sensibel sind und ihre maximale Resistenz erst bei optimaler Belüftung erhalten. Daß die Empfindlichkeit

3 Nicht beobachtet wrurde ein Kreuzen der Dosiseffektkurven des haploiden und diploiden Stammes wie es von L. R. C a l d a s und T. C o n s t a n t i n für andere Stämme bei etwa 15% Überlebenden angegeben wurde ( C . R. hebd. Seances Acad. Sei. 232, 2356 [1951]).

der Zellen auf einer physiologischen Modifikation beruht und nicht auf Selektion von Mutanten, wurde durch Ver­suche erwiesen, in denen nach 7 Passagen bei schlechter Belüftung die Zellen eine Empfindlichkeit zeigten, die jeweils dem unmittelbar vor dem Einwirken der Noxe angewendeten Belüftungsgrad entsprach.

b) V e r t e i l u n g d e r Z e l l g r u p p e n i m E n d z u s t a n d d e s K l o n w a c h s t u m s

In Versuchen, die bis zu 96 Stdn. ausgedehnt wur­den, zeigte es sich, daß das von der Einzelzelle aus­gehende Klonwachstum nach 48 Stdn. mit den hier benutzten Kriterien abschließend beurteilt werden konnte. Der Zustand nach 48 Stdn. wurde deshalb im allgemeinen zur Kennzeichnung des „Endzustan­des“ verwendet.

7. Unbehandelte Kontrollen

Bei allen 3 Stämmen wuchsen auch in den unbe­handelten Kontrollen nicht alle Zellen zu makrosko­pisch sichtbaren Kolonien aus. Vielmehr blieb im Mittel ein kleiner, aber merklicher Prozentsatz im Einzellenstadium stecken oder vollzog nur wenige Tei­lungen. Der Prozentsatz der gar nicht teilungsfähi­gen Zellen lag für alle 3 Stämme bei 5%; während der Prozentsatz der nur beschränkt teilungsfähigen Zellen bei den Stämmen a-41 und 41 eher noch ge­ringer war (ca. 1 —2%), war er jedoch bei Stamm 20G eher größer (ca. 7%).

2. UV- und OP -behandelte Kulturen

Die Verteilung der Zellgruppen im Endzustand für UV- und OP-behandelte Kulturen zeigen die Diagramme der Abb. 2 a — f. Als Abszisse ist der Prozentsatz der makroskopisch ausgewachsenen Klone, wie er sich nach mindestens 48-stdg. Bebrü­tung auf den mikroskopischen Präparaten ergab, als Kennzeichen der effektiven Dosis gewählt. An der Ordinate ist mit Hilfe der ausgefüllten Symbole der Prozentsatz der nach 48 Stdn. vorhandenen Einzel­zellen und mit Hilfe der offenen Symbole der Pro­zentsatz der Klone mit 1 — 3 Zellen abzulesen. Je e’n solches W ertepaar gehört zur Auswertung eines mikroskopischen Präparates (s. Methodik). Die Dia­gonale gibt per definitionem den Prozentsatz der nicht makroskopischen Klone wieder. Die Differen­zen zwischen geschlossenen und offenen Symbolen ergeben also die Prozentsätze der Zellen in der ersten Generation (2 — 3-Zellenstadium). Die Differenzen zwischen offenen Symbolen und Diagonale des Dia­

MIKROSKOPISCHER VERGLEICH DER ZELLVERMEHRUNG BEI HEFESTÄMMEN 3 0 9

gramms ergeben die Prozentsätze der Klone mit mehr als 3 Zellen, die aber nicht makroskopisch aus- wachsen. Der Prozentsatz der makroskopisch gewor­denen Klone tritt noch einmal als Abstand zwischen Diagonale und oberer Begrenzung des Diagramms auf. Die Hilfslinien, die von 0% bis zu 75, 50 und '25% der Ordinate ansteigen. gestatten, die entspre­chenden Prozentsätze für die 1- und 1 — 3-Gruppen, nunmehr bezogen auf die Zahl der nicht makroskopi­schen Klone, abzulesen. Der Spezialfall, daß durch eine Inaktivierung alternativ einerseits völlig tei­lungsgehemmte Einzelzellen, andererseits unbegrenzt teilungsfähige Zellen auftreten, ergäbe in dieser D ar­stellungsform sich deckende Symbole, die genau auf der Diagonalen lägen.

UV OP100

80

60

W

- § 20 V;

1 00

80

60

V0

20

100

80

60

HO

20

□ \V \- V o \ a-W

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(205)

X v

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V V

- 206 . X - X \ \

■

20 W DO 80 100 20 HO 60 80 100 makroskopische Kiene [% ] ------

Abb. 2. Restteilungsmustcr nach UV- (a, c, e) und OP- Inaktivierung (b. d, f) und mindestens 48-stdg. Bebrütung.

tt- c„i StämmenaungKender a-41, 41, 20G a-41 205

Klone mit ohne mit PhR1 Zelle ■ ▲

1 —3 Zellen o o □ A

Was nun die in Abb. 2 eingetragenen Ergebnisse betrifft, so ist die Ähnlichkeit zwischen den Diagram­men a (a-41, UV), b (a-41, OP) und c (41, UV) sofort auffallend. In allen 3 Fällen gruppieren sich bei mittleren Überlebenden-Zahlen die Häufigkeiten der Einzelzellen um die 25-%-Linie und steigen bei kleineren Überlebenden-Zahlen bis in die Nähe der 75-%-Linie an. In den Fällen a und c liegen bei kleinen UV-Dosen die Häufigkeiten der Einergruppe eher über der 25-%-Linie; im Fall b war es schwie­rig, so kleine effektive Dosen zu erreichen, so daß dieser Punkt hier offen bleibt. Ebenfalls liegen die Häufigkeiten der 1 — 3-Gruppen in den Fällen a — c bei mittleren Überlebenden-Zahlen übereinstimmend in der Nähe der 75-%-Linie und erreichen bei klei­nen Überlebenden-Zahlen Werte über 90 Prozent. Ein zu a — c vielleicht etwas unterschiedliches Bild findet man im Falle des Diagramms e (20G, UV). Die eingetragenen relativen Häufigkeiten der Einzel­zellen streuen bei nicht zu hohen effektiven Dosen, bezogen auf die gesamte Zellzahl, nicht allzuweit um 25%, was bezogen auf die nicht makroskopischen Klone eine Abnahme von 75% bei kleinen Dosen auf 25% bei größeren Dosen entspricht. Ergänzend zu diesen Punkten ist jedoch hier mitzuteilen, daß in einigen Versuchen mit kurzer Beobachtungsdauer (20 — 24 S tdn .), die daher nur beschränkt auswer­tungsfähig waren, auch Häufigkeiten der Einzel­zellen zwischen 5 und 15% beobachtet wurden. Da die Zahl der Einzelzellen bei längerer Beobachtung keinesfalls zunehmen kann, zwingen diese Ergebnisse dazu, die eingetragenen Werte für die 1-Gruppe eher als obere Grenze anzusehen. Dadurch wird die Ähn­lichkeit mit den Fällen a —c bei mittleren Über­lebenden-Zahlen größer. Da bei den höchsten ange­wandten UV-Dosen die Häufigkeiten der Einer­gruppe deutlich ansteigen und auch die Häufigkeiten der 1 — 3-Gruppe den Fällen a —c entsprechen, kann mit den hier gewählten Kriterien im ganzen doch eine Ähnlichkeit des Falles e mit den Fällen a —c festgestellt werden.

Allgemein kann man zu den Fällen a, b, c und e sagen, daß sie von dem oben erwähnten Spezialfall, bei dem die Zellteilung im Falle der Inaktivierung total gehemmt wird, weit entfernt sind. In weiten Dosisbereichen überwiegen unter den Zellen, die im Sinne des makroskopischen Kriteriums als inaktiviert gelten, solche, die noch einen oder mehrere Teilungs­schritte vollzogen haben.

310 W. LASKOWSKI UND W. STEIN

Deutlich unterscheiden sich von den übrigen Dia­grammen die Fälle d (41. OP) und f (20G, O P). In einer gewissen Annäherung ist hier der eben zitierte Spezialfall der Inaktivierung mit totaler Zellteilungs- Hemmung verwirklicht. Jedenfalls liegt die Häufig­keit der Einzelzellen fast durchweg über der 75-%- Linie und höher. Teilungen, die nicht zu makrosko­pisch sichtbaren Klonen führen, spielen eine unter­geordnete Rclle. Damit kann als gesichert angesehen werden, daß hinsichtlich solcher Zellgruppenmuster Unterschiede nicht nur durch verschiedene Inaktivie- rungsnoxen (OP und UV) am gleichen Stamm (41. 20G) erzeugt werden, sondern auch bei Anwendung gleicher Noxe (OP) bei verschiedenen Stämmen (a-41 und 41) auftreten können.

Da in Abb. 2 hinsichtlich der OP-Inaktivierung der Stamm 41 sich von seinem Elternstamm a-41 deutlich unterscheidet, wurde auch sein zweiter Elternstamm a-41 auf OP- und UV-Inaktivierung in einigen Versuchen getestet. Dabei konnten keine systematischen Unterschiede zwischen a-41 und a-41 festgestellt werden (vgl. Abb. 2 a und b ) .

Um zu prüfen, ob das Muster von Abb. 2 d auf einer komplementären Wirkung der Gene der Eltern­stämme a-41 und a-41 beruht, oder aber in anderer Weise auf den höheren Ploidiegrad zurückzuführen ist. wurde in Kulturen von a-41 nach selbstdiploidi- sierten Stämmen gesucht. Tatsächlich gelang es, einen Stamm zu isolieren, dessen Zellen sich in ihrer ova­len Form deutlich von den runden haploiden Zellen unterschieden. Dieser Stamm, 205 genannt, ist mit a-41 in 5 geprüften biochemischen M arkierungsfak­toren identisch und bildet wie a-41 mit einem Test­stamm vom Paarungstyp a Zygoten; auf Sporula- tionsmedium war keine Sporenbildung festzustellen. Daß nicht irrtümlich der haploide Stamm a-41 als Stamm 205 isoliert wurde, geht am deutlichsten aus den in Abb. 2 d eingetragenen Ergebnissen für das Rest-Teilungsmuster hervor. Danach verhält sich Stamm 205 wie der diploide Stamm 41 und nicht wie die haploiden Stämme a-41 und a-41 in Abb. 2 b. Aus der Gesamtheit dieser Tatsachen ziehen wir den Schluß, daß Stamm 205 mit hoher Wahrscheinlich­keit ein auf dem Wege der Endomitose entstandener diploider Stamm ist, der. infolgedessen für alle Gene des haploiden Stammes a-41 homozygot ist 4.

4 Die Erscheinung der Diploidisierung haploider Klone von Saccharomyces, wobei sowohl für die Paarungstyp-Allele homozygote als auch hetrozygote diploide Zellen auftreten können, wurde von H. R om an und S . S a n d s untersucht (Proc. nat. Acad. Sei. USA 39, 171 [1953]).

Die beobachtete Dosisabhängigkeit des Rest- teilungsmusters bei der UV-Inaktivierung legte es nahe, das bekannte Dosisreduktionsprinzip der Photoreaktivierung zu prüfen, d. h. zu testen, ob sich mit der Dosisreduktion für die makroskopisch Über­lebenden auch das Restteilungsmuster entsprechend ändert. Die Photoaktivierung wurde mit Hilfe des Gesamtspektrums einer 500-Watt-Metalldrahtlampe erzeugt, wobei die Zellen in wässeriger Suspension 20 min bei Temperaturen zwischen 25° und 30° C bestrahlt wurden. Der erzielte Dosisreduktionsfak- tor (DRF ) betrug bei den Stämmen a-41 und 41 etwa 2. Die Ergebnisse für Stamm 41 sind in Abb. 2 c eingetragen und zeigen tatsächlich eine ent­sprechende Änderung des Restteilungsmusters. Be­sonders die Häufigkeit der 1 — 3-Gruppe fügt sich gut in die übrigen Ergebnisse mit gleichen effektiven UV-Dosen ein, während die Häufigkeit der 1-Gruppe allein durch die Photoreaktivierung eher stärker er­niedrigt scheint, als es der reduzierten Dosis ent­spricht.

Das ähnliche Restteilungsmuster für Stamm a-41 nach OP-Inaktivierung (Abb. 2 b) war Anlaß, auch hier die Photoreaktivierbarkeit zu prüfen. Diese Ver­suche hatten das Ergebnis, daß keine Vermehrung der makroskopisch sichtbaren Überlebenden auftrat und auch das Restteilungsmuster unverändert blieb (vgl. Abb. 2 b ) .

c) T e i l u n g s g e s c h w i n d i g k e i t d e r E i n z e l z e l l e n n a c h U V - u n d O P - I n a k t i ­

v i e r u n g

In der Tab. 1 sind Daten für die Beurteilung der Teilungsgeschwindigkeit der Einzelzellen der drei Stämme a-41, 41 und 20G nach UV- und OP-Inakti­vierung und für unbehandelte Kontrollen zusam­mengestellt. In den beiden Eingangsspalten sind ge­mäß Abb. 1 a und 1 b die Dosen und der Prozent­satz der danach makroskopisch auswachsenden Zel­len angegeben; die nächste Spalte enthält die Halb­wertszeit, in der die zu makroskopisch sichtbaren Klonen auswachsenden Einzelzellen auf 50% ihrer Häufigkeit abgenommen haben (HW Zm) ; zum Schluß folgt die Halbwertszeit, in der die Häufigkeit aller überhaupt noch teilungsfähigen Einzelzellen auf 50% zurückgegangen war ( HWZ{). Überblickt man diese Ergebnisse, so stellen sich trotz nicht unerheb­licher Schwankungen folgende als gesichert anzu­sehende Resultate heraus. Alle Stämme zeigen für beide Inaktivierungsnoxen mit wachsender Dosis

MIKROSKOPISCHER VERGLEICH DER ZELLVERMEHRUNG BEI HEFESTÄMMEN 3 1 1

UV OP

Stamm

a —41

41

20 G

Dosis[min]

Über­lebende

[%]H W Z m H \V Z t Dosis

c • t

Über­lebende

[%]H W Z m H W Zt

0 100 1 2 0 ± 1 5 1 2 0 ± 1 5 0 100 120±15 120 ± 1 51 60 200-1-30 2 2 0 ± 4 5 0,3 35 1 2 0± 30 170±302 30 2 3 0 ± 4 0 3 3 0 ± 6 0 0,6 25 2 4 0 ± 6 0 300 ± 6 0

4 6 2 1 0 ± 3 0 3 9 0 ± 9 011. o 12 25 2 7 0 ± 9 0 3 9 0 ± 9 0

0 100 5 4 ± 1 2 5 4 ± 1 2 0 100 5 4 ± 1 2 5 4 ± 1 22 65 13 0 ± 5 0 130 ± 5 0 6 70 2 6 0 ± 3 0 2 9 0 ± 3 03 40 18 0 ± 3 0 180 ± 5 0 12 50 3004-120 300 ± 6 05 6,5 300 ± 6 0 3 0 0 ± 1 2 0 48 7 300 ± 1 2 0 3 0 0± 120

0 100 5 4 ± 1 2 54 ± 1 2 0 100 5 4 ± 1 2 54 ± 1 212 65 90 ± 3 0 12 0 ± 3 0 3 35 200 + 6 0 200 ± 6 024 45 2 4 0 ± 3 0 3 0 0 ± 9 0 6 25 165 + 60 2 0 0 ± 6 036 5 3 0 0 + 1 2 0 6 0 0 ± 1 2 0 12 3 2 4 0 + 6 0 2 0 0 + 6 0

Tab. 1. Halbwertszeiten der teilungsfähigen Einzelzellen in Abhängigkeit von UV-oder OP-Dosis. H W Z m= Halbwertszeit der zu makroskopisch sichtbaren Kolonien auswachsenden Einzelzellen. H W Zt = Halbwertszeit aller Einzelzellen, die mindestens

einen Teilungsschritt durchlaufen. (Weitere Erläuterungen im Text.)

eine merkliche Zunahme der HWZ-Werte. Beson­ders stark ist die Zunahme für die //IFZt-Werte bei Stamm 20G nach großer UV-Inaktivierung, die auch wegen der Resistenz dieses Stammes die höchsten absoluten UV-Dosen erforderte. Der Grund für die kaum merklichen Unterschiede zwischen H W Zm und H W Zt nach OP-Inaktivierung von 41 und 20G liegt einfach darin, daß hier die makroskopisch auswach­senden Zellen mit den überhaupt noch teilungsfähi­gen weitgehend identisch sind. Dieser Grund kann nicht für die Gleichheit beider Werte bei Stamm 41 nach UV-Inaktivierung gelten, weil hier die weit­gehende Übereinstimmung beider Gruppen fehlt. Da­gegen scheinen echte Unterschiede zwischen HW Zm und H W Zt bei Stamm a-41 und 20G nach starker UV-Inaktivierung vorzuliegen.

In diesen H W Z-Werten ist die etwaige Latenzzeit eingeschlossen. Unter Latenzzeit wird hier die Zeit zwischen Aufbringung der Zellen auf den Nähragar und den ersten erkennbaren Sprossungsvorgängen verstanden. Sie wurde aus der Abnahme der Einer­zellen extrapoliert. Diese Extrapolation führte bei den Kontrollen aller Stämme auf Zeiten, die nicht erkennbar von 0 verschieden waren, jedoch sind solche bis zu etwa 30 min nicht streng auszuschlie­ßen. Nur bei kleinen UV-Dosen für Stamm 41 und

5 Soweit Pilze betroffen sind, vgl. z. B. S. P o m p e r und K. C .

A t w o o d in A . H o l l a e n d e r „Radiation Biology II“ 431,New York 1955.

20G traten keine größeren Latenzzeiten auf als bei den Kontrollen. In allen sonstigen Fällen ergaben sich Latenzzeiten zwischen 90 und 180 Minuten.

3. Diskussion

Eine Analyse der auf makroskopischen Beobach­tungskriterien beruhenden Dosiseffektkurven ermög­licht zunächst — wie es häufig geschieht — festzu­stellen, ob wenigstens formal ein- oder mehrtreffer­artige Kurvenverläufe vorliegen D. Auch hinsichtlich Abb. 1 a kann man zunächst versuchen, die UV- Dosiseffektkurven im Sinne wachsender Trefferzah­len zu deuten und dafür einen wachsenden Ploidie- grad verantwortlich zu machen. Sicher ist, daß der Ploidiegrad von Stamm a-41 zu 41 von 1 auf 2 steigt. Im Sinne der Treffertheorie ist dann die plau­sibelste Annahme, daß bei nicht zu großen Dosen die Trefferzahl n sich beim Übergang vom haploiden zum diploiden Stamm verdoppelt 6. Die Analyse der hier vorliegenden Dosiseffektkurven ergibt, daß im Sinne dieser Hypothese die Formel für die Über­lebenden h = [ 1 — exp ( — k • D') ] ” mit Trefferzahlen n = 2 für den haploiden und n = 4 für den diploiden Stamm mit unseren Meßergebnissen am besten ver­träglich ist (vgl. Abb. 3 ). Läßt man diese Forderung

6 Mathematische Erläuterungen hierzu beabsichtigen wir indieser Zeitschrift zu publizieren.

der Verdoppelung der Trefferzahl fallen, so sind die aus den Messungen zu ermittelnden Trefferzahlen weniger eindeutig; insbesondere erscheinen die Er­gebnisse für den haploiden Stamm a-41 allenfalls noch mit n = 1 verträglich, während für den diploi­den Stamm 41 Trefferzahlen > 4 nicht auszuschlie­ßen sind.

S a r a c h e k und L u c k e 7 fanden bei Hefestämmen unterschiedlichen Ploidiegrades folgende Variationen und Mittelwerte für eine aus dem exponentiellen Ver­lauf bei großen Dosen extrapolierte formale „Tref­ferzahl“ : haploid 1,5 —3,0 —6,2; diploid: 13 —18 — 33; triploid 50; tetraploid 44 (in den letzten beiden Fällen wurde nur ein Stamm untersucht). U. E. ist es jedoch nicht zweckmäßig, hier von einer „Trefferzahl“ zu sprechen, da man in einer Theorie für die Abtötung durch rezessive Letalmutationen zeigen kann, daß dieser extrapolierte Wert unter bestimmten Voraussetzungen gleich der Größe (t ' p ) m is t6,8. Dabei bedeutet p den Ploidiegrad, m die Zahl der mutablen Gene und t die Zahl der Treffer, die für die Mutationsauslösung an einem Locus notwendig sind. Aus dem eben zitierten Aus­druck und obigen Mittelwerten lassen sich 3 unab­hängige Werte für m (2,6; 2,6; 1,7) und t (1,5; 1.5; 1.9) errechnen 6a. Im Gegensatz zu den Verfas­sern scheinen uns Größe und Ähnlichkeit dieser Werte die von der Theorie geforderte Bedeutung des Ploidiegrades zu bestätigen. Erscheint auch die Zahl der letal beeinflußbaren Loci mit Werten um 2 rela­tiv gering, so muß man berücksichtigen, daß bei diesen Versuchen ein Komplettmedium verwendet wurde, und außerdem diese Loci nur die strahlen­empfindlichsten zu sein brauchen. Weiter ist zu be­rücksichtigen, daß in der obigen Auswertung m = const, gesetzt wurde, was streng nur bei Stäm­men zutrifft, die sich allein in ihrem Ploidiegrad unterscheiden, sonst aber homozygot sind (Ent­stehung durch Endomitose)4. Die oben zitierte Va­riationsbreite der extrapolierten „Trefferzahlen“ läßt sich aus dem Ausdruck (f p ) m durch verhält­nismäßig geringe Variationen von m erklären.

Die Dosiseffektkurve von 20G läßt sich in einfache treffertheoretische Deutungen nicht ohne weiteres ein­beziehen. weil einmal der Ploidiegrad dieses Stam­mes nicht bekannt ist und zum anderen die Kurve

‘ A. S a r a c h e k u . W. H. L u c k e . Arch. Biochem. Biophysics44, 271 [19531.

8 K. C. A t w o o d ii. A . N o r m a n . Proc. nat. Acad. Sei. USA 35.609 [1949],

3 1 2 W. LASKOWSKI

anscheinend keinen einfachen trefferartigen Verlauf hat; denn ihr anfangs eintrefferartiger Verlauf knickt nach höheren Dosen im Sinne höherer Strahlen­empfindlichkeit ab.

Will man die Kurven für OP-Inaktivierung in Abb. 1 b mit denen der UV-Inaktivierung in 1 a ver­gleichen, so besteht die Schwierigkeit, eine vergleich­bare Dosiseinheit für die OP-Inaktivierung anzu­geben. Die hier als OP-Dosis gewählte Größe c * t muß nicht unbedingt mit der UV-Dosis I 't vergleich­bar sein 9. Infolgedessen ist es problematisch, allein aus der hier vorliegenden Unähnlichkeit dieser Kur­ven auf eine Verschiedenartigkeit beider Inaktivie- rungs-Mechanismen zu schließen.

UND W. STEIN

Abb. 3 a und b. Dosiseffektkurven gemäß der Gleichung /i = [ 1 — exp ( ~ k - D ' ) ] n mit A) D' = D , B) D’ = l , 2 D y C) D —2 ,2 -D . Zum Vergleich die Häufigkeiten der aktiven Klone mit dem Aktivitätskriterium x > X (makroskopisch), 0 > 3. • > 1 Zellen für die Stämme a-41 (3 a) und 41 (3 b).

Die vielfältige Problematik von Dosiseffektkurven läßt die Heranziehung weiterer Kriterien empfehlens­wert erscheinen. Die Ergebnisse in Abb. 2 a, c, e legen die mit den Fehlergrenzen verträgliche Inter­pretation nahe, daß bei allen geprüften Stämmen zu der gleichen effektiven UV-Dosis, d. h. zu der glei­chen Zahl makroskopisch Überlebender, weitgehend das gleiche Restteilungsmuster gehört. Dieser empi­rische Tatbestand läßt sich für die Stämme a-41 und 41 in der in Abb. 3 a und b gewählten Form darstel­len. Dort ist zunächst der Prozentsatz der makrosko­pisch Überlebenden (>X -K urve) als formale Tref-

fia Den in Abb. 3 benutzten Mehrtrefferformeln entsprechen formale Werte von t = 2. rn = 1 .

9 W. S t e i n u . W. L a s k o w s k i , Z. Naturforschg. 11 b, 643[1956].

MIKROSKOPISCHER VERGLEICH DER ZELLVERMEHRUNG BEI HEFESTÄMMEN 3 1 3

ferkurve mit n = 2 für a-41 (Abb. 3 a) und n = 4 für 41 (Abb. 3 b) dargestellt. Durch Multiplikation der Dosis mit dem Faktor 2,2 wird in beiden Fällen eine neue Kurve gewonnen, die die Häufigkeit der Zellen mit wenigstens einer Teilung ( > 1-Kurve) in recht guter Näherung wiedergibt. Ebenfalls ergibt sich durch Dosismultiplikation mit dem Faktor 1,2 für beide Stämme eine Kurve, die die Häufigkeit der Klone mit mehr als 3 Zellen (>3-K urve) nicht unbefriedigend beschreibt. Aus der Dosisproportio­nalität folgt, daß wenn man die >X-Kurven für beide Stämme linearisiert und in Deckung bringt, auch die > 1 - und >3-Kurven Geraden werden und für beide Stämme die gleiche Lage bekommen. Das erklärt dann wieder die Ausgangssituation der Abb. 2, nämlich die Gleichheit der Muster für beide Stämme.

Das ähnliche Bild für Stamm 20G in Abb. 2 e läßt sich wohl am leichtesten dahin deuten, daß für die > 1-, > 3 - und >X-Kurven dieses Stammes die glei­chen konstanten Dosisverhältnisse wie für Stamm a-41 und 41 gelten. Diese in Abb. 3 zum Ausdruck kommende Deutungsmöglichkeit legt das einfache Modell nahe, daß ein einheitlicher uv-induzierter Basiseffekt vorliegt, dessen Auswirkungs-Wahrschein­lichkeit („Treffervolumen“ ) für die verschiedenen Stämme in gleicher Weise abnimmt, je weniger Rest­teilungen man als Inaktivitätskriterium annimmt. Dieses Modell läßt offensichtlich keinen Raum für mehrere unabhängige, das Restteilungsmuster be­dingende Strahleneffekte. Entschließt man sich spe­ziell, in der DNS induzierte UV-Wirkungen anzu­nehmen, so entfallen in dieser Vorstellung weit­gehend außerkaryotische Induktionen des Rest- teilungsmusters. Eine Basiswirkung der UV-Strah­lung an der DNS wird besonders seit K e l n e r s

Analyse der Photoreaktivierung10 nahegelegt, der feststellte, daß gerade die Störung der DNS-Synthese photoreaktivierbar ist.

Die Abb. 3 zeigt einen überraschenden Aspekt der oben geschilderten Photoreaktivierung dieser Stämme, die DRF-Werte bei 2 ergab. Diese Dosis­reduktion genügt ersichtlich gerade, um die > 1 - Kurve in die >X -Kurve zu überführen und läßt die Deutung zu, daß gerade die Zellen mit wenigstens einer Teilung, die aber ohne Lichteinwirkung nicht zu Makrokolonien auswachsen. durch die Photoreak­

10 A. K e l n e r , J. Bacteriol. 65, 252 [1953].

tivierung zur Entwicklung makroskopischer Kolonien gebracht werden. Es kann nicht entschieden werden, ob dieser Sachverhalt zufällig oder tiefer begründet ist.

Methodisch weist Abb. 3 darauf hin, daß man die Halbwertsdosis etwa doppelt so groß bestimmt, wenn man als Aktivitätskriterium statt der Makrokolonie das Vorkommen einer einzigen Teilung wählt, und sie sich noch etwa um 20% zu groß ergibt, wenn man als Aktivitätskriterium die Bildung von mehr als3 Zellen pro Klon wählt.

Das Restteilungsmuster nach OP-Inaktivierung der haploiden Stämme a-41 und a-41 in Abb. 2 b ähnelt stark dem Muster nach UV-Inaktivierung, d. h. für eine bestimmte Uberlebenden-Zahl findet man etwa den gleichen Prozentsatz an Einzelzellen und (2 — 3 ) -Gruppen. Ein erster wesentlicher Unter­schied jedoch besteht darin, daß diese OP-Inaktivie- rungseffekte nicht photoreaktivierbar sind. Trägt man zum weiteren Vergleich für a-41 die entspre­chende > 1-Kurve über c • t auf, so findet man, daß diese Kurve der >X -K urve in mancher Hinsicht ähnlich ist, insbesondere weist sie in demselben c • t- Bereich ein Plateau 11 auf. Allerdings geht sie nicht durch einen konstanten „Dosisfaktor“ aus der > X - Kurve hervor, was im wesentlichen auf das Plateau zurückzuführen ist. Die Ähnlichkeit der Resttei- lungsftiuster nach OP-Inaktivierung scheint bei die­sen haploiden Stämmen immerhin so groß zu sein, daß man gleiche oder ähnliche Basiseffekte beider Inaktivierungsarten hierfür nicht ausschließen kann. Insbesondere zeigt die Lage des Plateaus der > 1 - und > X-Kurve im gleichen c * /-Bereich, daß auch hier das Restteilungsmuster anscheinend als Ganzes induziert wird und daß es sich wahrscheinlich nicht um mehrere unabhängige Prozesse handelt. Die feh­lende Photoreaktivierbarkeit nach OP-Inaktivierung müßte dann so gedeutet werden, daß nur der Prozeß zwischen der primären UV-Wirkung und dem Basis­effekt photosensibel ist, OP dagegen diesen Basis­effekt auf einem anderen, z. B. kürzeren Weg indu­ziert 12.

Abb. 2 d und f zeigen nun, daß das Restteilungs­muster der OP-Inaktivierung sich ändert, wenn man von den haploiden Elternstämmen a-41 und a-41 zum diploiden Stamm 41 übergeht. Das dann ent­stehende Restteilungsmuster gleicht sich der Alter-

11 Die Bedeutung derartiger Plateaus bei der OP-Inaktivie­rung wird in 1. c. 9 diskutiert.

12 Vgl. dazu auch 1. c. 9.

3 1 4 MIKROSKOPISCHER VERGLEICH DER ZELLVERMEHRUNG BEI HEFESTÄMMEN

native Einzelzelle/Makrokolonie weitgehend an und unterscheidet sich damit unverwechselbar von dem uv-induzierten Muster für die gleichen Stämme. Diese Prozesse müssen offenbar mit der Diploidie selbst Z u ­

sammenhängen und lassen sich nicht auf komplemen­täre Genwirkung zurückführen, wie die Ergebnisse aus dem total homozygoten diploiden Stamm 205 zei­gen. Wenn man daraus den ungewöhnlichen, aber hier naheliegenden Schluß zieht, daß bestimmte Gene homozygot vorliegen müssen, um dieses Resttei- lungsmuster zu ergeben, so würde weiter daraus fol­gen, daß a-41 und a-41 zufällig die gleichen frag­lichen Allele besitzen und daß andererseits entspre­chend heterozygote Stämme das Resttei lungsmuster der haploiden Stämme (Abb. 2 b) produzieren soll­ten. Dann sollte auch 20G einen Ploidiegrad > 1 be­sitzen und in den entsprechenden Allelen homozygot sein.

UV OP

Abb. 4. PhR = Photoreaktivierung (weitere Erklärung im Text).

Es bleibt die Schwierigkeit zu erklären, warum zwischen UV- und OP-Inaktivierung bei den ha­ploiden Stämmen in den Restteilungsmustern Ähn­lichkeit besteht, bei den diploiden Stämmen aber Un­ähnlichkeit. Will man die Ähnlichkeit bei den Ha- plonten nicht als Zufall ansehen und führt man sie da­mit auf ähnliche Basisprozesse zurück, so muß man bei den Diplonten neben diesen gemeinsamen Basis- effekten bei der OP-Inaktivierung noch einen zusätz-

13 R. E. Z i r k l e u . C. A. T o b i a s . Arch. Biochem. Biophysics 47.286 [1953],

liehen Prozeß annehmen, der durch die oben ver­mutete Homozygotie bestimmter Allele ermöglicht wird. Daß die durch den OP-Einfluß ausgelösten Prozesse nicht voll identisch mit den uv-induzierten sein können ist schon deshalb zu erwarten, weil man sich den Mechanismus der Einwirkung andersartig vorstellen m u ß 1-. In Abb. 4 ist eine solche ad hoc- Deutung in einem Pfeilschema skizziert.

Die in Tab. 1 zusammengestellten Halbwertszeiten für die teilungsfähigen Einzelzellen nach UV- und OP- Inaktivierung lassen erkennen, daß auch die makrosko­pisch auswachsenden Zellen, die im Sinne der üblichen Treffertheorie „nicht betroffen“ sind, eine deutliche Tei­lungsverzögerung zeigen. Auffällig ist weiter, daß abge­sehen von größten UV-Dosen für Stamm a-41 und 20G die HWZm- und //JFZt-Werte sonst innerhalb der Feh­lergrenzen übereinstimmen. Das bedeutet, daß die ma­kroskopisch auswachsenden und — soweit vorhanden — die nicht makroskopisch auswachsenden, teilungsfähigen Einzelzellen dieselbe Teilungsrate besitzen. Ob die bei mittleren Dosen für Stamm a-41 auftretende Ähnlichkeit der HWZ-Werte nach UV- und OP-Inaktivierung und für Stamm 41 und 20G auftretende Unähnlichkeit mit den entsprechenden Feststellungen für das Restteilungs- muster in Abhängigkeit von Stamm und Inaktivierungs- art sachlich korreliert sind, muß offen bleiben.

Die dargestellten Ergebnisse und daraus gewon­nenen Hypothesen erweisen das Kriterium des Rest- teilungsmusters als nützlich zur Beurteilung von In- aktivierungswirkungen. Es erscheint daher lohnend, dieses Kriterium auch auf die inaktivierende W ir­kung ionisierender Strahlen anzuwenden, wobei hier wiederum seine Abhängigkeit von der Ionisierungs­dichte bzw. vom LET-W ert13 besonders interessie­ren würde. Erste Ergebnisse mit Röntgenstrahlen zeigen für den Stamm 41 eher UV- als OP-Ähnlich- keit. obwohl auch systematische Unterschiede zum UV-Muster zu bestehen scheinen14.

Wir sind Fräulein Ch. U m l a u f für wertvolle techni­sche Assistenz und weitgehend selbständige Durchfüh­rung einzelner Versuche zu Dank verpflichtet. Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und dem R u n d e s m i n i s t e r i u m f ü r A t o m f r a g e n danken wir für die Unterstützung dieser Arbeit.

14 A n m . b. d. K o r r. : Weitere Versuche mit Röntgen­strahlen haben inzwischen ergeben, daß vor allem beihohen Inaktivierungsraten der Prozentsatz der im Einzel-zellenstadium verharrenden Klone wesentlich geringer alsnach UV-Bestrahlung ist.