Quantitative Polymerase Chain Reaction in Real‐Time (qPCR)

Natalia Ogorodnikova

• Introduction• PCR Principle • Application• qPCR • My example• Interactive element

A Couple Words about Genetics

Central Dogma of Genetics

Purpose of PCR is to have a huge ammount of target  DNA

PCR Principle

/www.biologydiscussion.com

PCR Principle_Video

• https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo

Questionary

1. What happens during step1 at 94’C?2. What happens during step2 at 60’C?3. What happens during step3 at 72’C?4. How many cycles are required for PCR 

amplification?

PCR HISTORY

Let’s prepare PCR

• DNA sample• Primers• DNA Polymerase Mg2+

• Deoxynucleotides (A, T, G and C)• Polymerase buffer

PCR Application

What applications does PCR have?

PCR Application

• Medical Application– Genetic testing, Mutation Analysis(Breast Cancer Test, 

Hyperbilirubinemia, Prenatal Testing)

– Virus identification (HIV, tuberculosis)– Forensic medicine (genetic fingerprinting)– DNA paternity

PCR Application

• Research Application– In DNA Sequencing– In DNA cloning– Phylogenic analysis– Gene expression study

PCR Analitics

Or Real‐Time PCR

Fluorescent Probes for q PCR Analysis

• Non‐specific detection: Sybr Green dye, BEBO, BOXTO, EvaGreen

• Specific Detection: TaqMan Probe, Molecular Beacon, Scorpion primer….

Specific Detection

• Molecular Beacon

• Hybridization Probe

Data Analysis_ Amplification Curves

• Amplification Curve Analysis

Data Analysis_Analysis_Melting Curve Analysis

What was amplified?

• Melting Curve Analyses

Data Analysis_Standard Curve Analysis

Quantification!!!

My Example_miRNA122 Quantification

My Project: Synthesis of micro RNA inhibitors.I use qPCR for microRNA quantification in cells

Data Analysis

Data Analysis

Results

ΔΔCt=(Ct target gene- Ct reference gene)treated-(Ct target gene-Ct reference gene)control

DA8 5µM -2,46 **10µM -4,60 *20µM -5,35 ***

DA40 5µM -2,87 ***10µM -4,30 **20µM -27,87 ***

miR122 Change due to treatment 2^-∆∆Ct

Significance :p‐value‐*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,005)

Puzzle

• Gene target chose, Primer Design and Primer Order

• DNA Extraction or RNA extraction (for RNA extraction ‐ cDNA synthesis)

• PCR preparation (DNA Sample, Primers, Deoxynucleotides (A, T, G and C), DNA Polymerase(Mg2+), Dye)

• PCR run• Data Analysis (delta Ct method)

Take‐Home Message

1. Gene Target and primer design. Choose thestrategy of detection in qPCR

2. Select controls and standards for reaction3. Sample preparation (DNA or RNA, sourse of

sample)4. Chose right DNA polymerase (long fragments, 

precise amplification of short fragments, 5‘‐3‘ endonuclease activity)