Post on 17-Apr-2015
Molecular markers closely linked Molecular markers closely linked to fusarium resistance genes in to fusarium resistance genes in
chickpea show siginificant chickpea show siginificant alignments to pathogenes-alignments to pathogenes-related genes located on related genes located on
arabidopsisarabidopsis chromosomes 1 and chromosomes 1 and 55
Theoretical Applied Genetics 2003
Benko-Iseppon, A.M.; Winter, P.; Huettel, B.; Staginnus, C.; Kahl, G.
Marcadores moleculares ligados a Marcadores moleculares ligados a genes de resistência a genes de resistência a fusariumfusarium
em grão-de-bico mostram em grão-de-bico mostram alinhamentos significativos a alinhamentos significativos a
genes relacionado à patogênese genes relacionado à patogênese localizados em cromossomos 1 e localizados em cromossomos 1 e
5 de 5 de arabidopsisarabidopsis
Luiz NaliLuiz Nali
Isaac FariasIsaac Farias
Ferreira NetoFerreira Neto
ResumoResumoPopulações resistentes
e suscetíveis (F7-F8)
Seleção de primers
(DAF +BSA)
Produto amplificado
Excisão
Clonagem
Seqüenciamento
SCAR
BLAST-X
Busca de Homologia
Alinhamento significativo
(cromossomo 1 e 5 de
Arabidopsis)
IntroduçãoIntrodução
• Importância econômicaImportância econômica
• Distribuição geográfica do Grão-de-bicoDistribuição geográfica do Grão-de-bico
• Fatores limitantes de produçãoFatores limitantes de produção
• Situação atual do melhoramento e Situação atual do melhoramento e perspectivasperspectivas
ObjetivoObjetivo
Mapeamento genético direcionado a Mapeamento genético direcionado a regiões de resistência a regiões de resistência a fusariumfusarium em em populações de grão-de-bico através populações de grão-de-bico através de análise de de análise de bulksbulks segregantes segregantes
Material e MétodosMaterial e Métodos
• ICC-4978 (parental resistente) X ICC-4978 (parental resistente) X Cicer Cicer reticulatumreticulatum PI489777 (parental PI489777 (parental suscetível) suscetível)
• 131 plantas de populações F7-F8 (RILs)131 plantas de populações F7-F8 (RILs)
• Extração e quantificação de DNAExtração e quantificação de DNA
• Análise de bulks segregantes (BSA)Análise de bulks segregantes (BSA)
Amplificação de DNAAmplificação de DNA
35 ºC
95 ºC
DAF SCAR
Volume da reação
15 µL 50 µL
Tampão 10x
1,5 µL 5 µL
MgCl2 2,5 mM 1,5 mM
dNTP-mix 10 mM 200 mM
Taq polimerase
0,4 U 0,5 U
Primers 40 pmol 250 pmol
Temp. de anelamento
35 ºC 62-65 ºC
DNA 15 ng 12 ng
Análise de ligaçõesAnálise de ligações
Isolamento e clonagemIsolamento e clonagem
Qiaquick Kit
Vetor pGEM -T
E. Coli DH10-B, DH5-α ou SURE
Eletroporação
Seleção de plasmídeos
Seqüenciamento dos Seqüenciamento dos fragmentosfragmentos
Análise das seqüências Análise das seqüências (BLAST-X e BLAST-N)(BLAST-X e BLAST-N)
ResultadosResultados
1ª Etapa (12 indivíduos)
432 primers
BSA + DAF
BR Bs
174 primers polimórficos
2ª Etapa
174 primers
Parentais 7RI 7SI
24 primers
19 primers selecionados
(Grupo de ligação 2 do Foc-4 e foc-5)
Primers selecionados Primers selecionados
BLAST-X de seqüências BLAST-X de seqüências clonadasclonadas
Mapa de ligação Mapa de ligação (Mapmaker)(Mapmaker)
Primers SCAR derivados de Primers SCAR derivados de marcadores DAF a partir do PRIMER 3marcadores DAF a partir do PRIMER 3
ConclusõesConclusões• Os marcadores produzidos aumentaram a densidade de marcas Os marcadores produzidos aumentaram a densidade de marcas
nos flancos do gene de resistência Foc-4;nos flancos do gene de resistência Foc-4;
• O fragmento oriundo do primer OP-P15-3 obteve similaridade à O fragmento oriundo do primer OP-P15-3 obteve similaridade à proteína N-hidroxicinamol/benzotransferase (regulador de proteína N-hidroxicinamol/benzotransferase (regulador de fitoalexina) encontrado no cromossomo 5 na fitoalexina) encontrado no cromossomo 5 na A. thaliana;A. thaliana;
• Encontrou-se no fragmento do primer OP-P15-3 uma pequena Encontrou-se no fragmento do primer OP-P15-3 uma pequena seqüência com função similar a uma proteína de resistência seqüência com função similar a uma proteína de resistência (semelhante a um retrotransposon) presente em (semelhante a um retrotransposon) presente em A. thaliana A. thaliana e e Tabacum Tabacum as quais são ricasas quais são ricas em seqüências de leucinaem seqüências de leucina;;
• O fragmento oriundo do primer OP-M20-3 possui similaridade ao O fragmento oriundo do primer OP-M20-3 possui similaridade ao gene de reparo MutS2 existente no cromossomo 5 da gene de reparo MutS2 existente no cromossomo 5 da A. thaliana;A. thaliana;
• Alguns marcadores moleculares presentes no mesmo grupo Alguns marcadores moleculares presentes no mesmo grupo de ligação do gene de resistência ao de ligação do gene de resistência ao FusariumFusarium, , apresentaram alinhamentos significativos a genes apresentaram alinhamentos significativos a genes relacionados a patogenicidade localizados nos relacionados a patogenicidade localizados nos cromossomos 1 e 5 da cromossomos 1 e 5 da A. thaliana;A. thaliana;
• Por outro lado, não foi possível localizar nenhum marcador Por outro lado, não foi possível localizar nenhum marcador suficientemente próximo aos loci de resistência (Foc-4 e suficientemente próximo aos loci de resistência (Foc-4 e Foc-5) para permitir uma clonagem baseado no mapa.Foc-5) para permitir uma clonagem baseado no mapa.
Etapas futurasEtapas futuras
Está sendo gerado uma biblioteca de Está sendo gerado uma biblioteca de BAC para mapeamento físico com BAC para mapeamento físico com utilização de SCARs, onde irá utilização de SCARs, onde irá permitir a clonagem dos genes de permitir a clonagem dos genes de resistência.resistência.
Obrigado!!! Merci!!!Obrigado!!! Merci!!!
Thanks!!! Thanks!!! Grazie!!!Grazie!!!
謝謝謝謝 !!! σας !!! σας ευχαριστούμε!!!ευχαριστούμε!!!
dank u!!! dank u!!! ありがとうありがとう !!!!!!
Danke!!! Gracias!!! Danke!!! Gracias!!! Brigado macho!!!Brigado macho!!!