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Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACB
PRÁCTICA 1 MEDIDA DEL pH. PODER REGULADOR Y DETERMINACIÓN DEL pH DE LA CASEÍNA INTRODUCCIÓNLa medida del pH es una de las determinaciones más utilizadas en Bioquímica. Este parámetro influye en las características estructurales y funcionales de proteínas y ácidos nucleicos, por la presencia de grupos ionizables en dichas macromoléculas.El pH se define como -log [H+]. Su medida es, por tanto, reflejo inverso de la concentración de protones en escala logarítmica. A mayor concentración, menor pH. La medida se realiza con electrodos combinados de vidrio, que miden valores de conductancia relativa. Mediante ajuste del pHmetro con unas disoluciones patrón de pH conocido, que se utilizan de referencia, se puede conocer con bastante exactitud el pH.En el hombre, el pH sanguíneo, alrededor de 7,4, es ligeramente superior al del citosol intracelular, y su margen de variación es muy estrecho, no más de 1 unidad (entre 6,8 y 7,8). Por ello, la sangre posee sistemas tampón o reguladores del pH, que no permiten grandes variaciones, incluso cuando se viertan a ella cantidades considerables de ácidos o bases como consecuencia de la actividad metabólica celular. Los tampones están formados por un ácido y su base conjugada. El principal par sanguíneo es el CO2/CO3H-1, pero también participa el par PO4H2
-1/PO4H-2 y residuos de las proteínas, como las histidinas.La ecuación fundamental para determinar teóricamente el pH de un tampón es la ecuación de Henderson-Hasselbalch:
pH = pK + log [Base conjugada]/[Ácido]
Las experiencias de esta práctica van encaminadas a utilizar un pHmetro, a observar el poder regulador del pH de un sistema tampón comparándolo con el agua y a determinar el pI de una proteína. La caseína es la principal proteína de la leche, con una concentración aproximada entre 22 y 28 g/l en leche bovina. Por contener grupos fosfato, tiene carácter ácido, y un pI<7. Su punto isoeléctrico, en el que la carga de las moléculas es nula, y por tanto las fuerzas de repulsión mínimas, puede determinarse mediante estimación de la turbidez de la disolución. MATERIAL*pH-metro con electrodo de vidrio combinado *20 viales 20 ml, boca ancha*2 vasos de 50 ml *Papel "científico"*3 pipetas de 1, 5 y 10 ml *Pipetas Pasteur*Colorímetro *Cubetas de b=1 cm REACTIVOS*Disoluciones patrón de pH 4 y 7 *HCl 1N*Tampón fosfato 0.1M, pH=7 *NaOH 1N*Ácido acético 0.1 y 0.01N *Caseína 3 mg/ml*Acetato potásico 0.1N PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALPRECAUCIONES EN EL USO DEL ELECTRODO:a) Antes de cualquier medida, limpiar el electrodo.
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBb) La membrana porosa del lateral del electrodo debe quedar siempre sumergida en la disolución a medir.c) En vasos con agitación magnética, cuidado con los movimientos excéntricos de la barra agitadora que pueden golpear el electrodo.
1.CALIBRACIÓN DEL ELECTRODOa )Secar el electrodo con papel "científico".b) Lavarlo con agua destilada de un frasco lavador. Volver a secar con papel.c) Tomar la disolución patrón de pH 7 e introducir en ella el electrodo.d) Conectar el pH-metro y esperar hasta estabilizar la lectura (aprox. 30 seg)e) Si la medida es distinta de 7, ajustarla a ese pH 7.f) Desconectar la medida, sacar el electrodo, lavarlo y secarlo. g) Tomar la disolución patrón de pH 4 y repetir los pasos c,d,e (ajustando a pH=4) y f. h) El electrodo queda listo para medir. 2. MEDIDAS DE pH. PODER TAMPONANTE DEL FOSFATONumerar 2 series de 3 tubos como 1A-3A y 1B-3B. A la serie A añadir 10 ml de agua por tubo, y a la serie B 10 ml de tampón fosfato de pH 7. A los tubos 2A y 2B añadir 5 gotas de HCl 1N, y a los tubos 3A y 3B añadir 5 gotas de NaOH 1N. No utilizar la misma pipeta para el HCl y el NaOH, o lavar muy bien antes. Medir el pH en todos los tubos, calcular las variaciones producidas en el agua y el tampón fosfato y comparar. 3. DETERMINACIÓN DEL pI DE LA CASEÍNAPreparar una serie de 10 tubos, según la Tabla adjunta. Una vez preparados:
Medir experimentalmente el pH de todos los tubos, que debe cubrir un rango aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso crecientes.
Añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo. Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos. Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetría de 1 cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de cada tubo para obtener una solución/suspensión homogénea antes de verter una parte en la cubeta. Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar el pI aproximado de la caseína. TABLA DE DISOLUCIONESTUBO Acetato 0.1N Acético 0.1N Acético 0.01 N pH resultante (aprox.) 1 0.5 9.5 - 3.2 2 1 9 - 3.6 3 1.5 8.5 - 3.8 4 2 8 - 4.0 5 3 7 - 4.2 6 4 6 - 4.5 7 6 4 - 4.7 8 8 2 - 5.1 9 6 - 4 5.5 10 8 - 2 6.1
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACB CUESTIONES1) ¿En qué rango de pH considera efectivo un sistema tamponante en relación con el pK de la pareja ácido/base conjugada?2) ¿Por qué el sistema bicarbonato/carbónico tiene características especiales que lo hacen bueno en la sangre y malo en un sistema "in vitro"?3) Representar A640 frente al pH de cada tubo en el apartado 3. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia?4) Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI?5) Por qué el agua destilada no presenta un pH igual a 7?
PRÁCTICA 3
TECNICAS CROMATOGRAFICAS PARA SEPARACION Y/O IDENTIFICACION DE BIOMOLECULAS La cromatografía es una técnica muy empleada para separar e identificar los componentes de una mezcla. La separación se basa en la diferente interacción de cualquier soluto con dos fases, una conocida como fase estacionaria, generalmente sólida, y otra denominada fase móvil, que puede ser líquida o gaseosa. Debido a procesos como adsorción en la fase sólida, solubilización y arrastre por la fase móvil etc., cada soluto se distribuye entre las dos fases con un coeficiente de reparto característico. Este coeficiente depende de la naturaleza de las fases y de los solutos, o componentes de la mezcla a separar.
A. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)Es una de las más sencillas. Se denomina así porque la fase estacionaria es una capa fina de una sustancia hidrofílica (sílice, alúmina o acetato de celulosa) colocada sobre un soporte inerte. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones que migra por la fase estacionaria en base a capilaridad dentro de una cubeta cerrada y que se encuentra saturada de vapor de la fase móvil.En este tipo de cromatografía se utiliza un parámetro relacionado con el coeficiente de reparto, que se denomina Rf. Se define como la relación entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por la fase móvil. En el caso de esta práctica, es directamente proporcional con la solubilidad de la sustancia en la fase móvil. Sus valores oscilan entre 0, para las sustancias insolubles, y 1 para las sustancias muy solubles en la fase móvil y que no interacciona con la fase estacionaria.En esta práctica, la cromatografía en capa fina se utiliza para separar e identificar aminoácidos. Estos se revelarán en la placa mediante reacción con ninhidrina, de acuerdo con la reacción descrita en la Práctica 2. MATERIALPlaca fina (Ac. de celulosa) Micropipetas y cánulas Estufa a 105ºC Cubeta de cromatografíaLapiz y regla SecadorCubeta de revelado y pinzas
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACB REACTIVOS*Fase móvil (n-butanol/acetona/acético/agua, 35/35/20/10 en volumen).*Ninhidrina 1 mg/ml en acetona.*Asp 0.5% *Leu 0.5%*Lis 0.5% *Ala 0.5%*Aminoácido o mezcla de aminoácidos problema. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
IMPORTANTE: Tomar la placa solamente por los bordes, y no poner los dedos sobre su superficie, para evitar manchas debido a los aminoácidos y/o proteínas presentes en la piel.
1. Colocar aprox. 25 ml de la fase móvil en la cubeta, que debe permanecer cerrada para saturar su atmósfera en esos disolventes.2. Utilizando el lápiz, sin presionar para no rascar el acetato de celulosa, trazar débilmente una línea a 1 cm del extremo inferior de la placa, tal como indica la figura. Marcar en esta línea 5 puntos equidistantes y aplicar en cada uno de ellos 5 l gota de cada aminoácido, teniendo cuidado de que la gota se extienda lo menos posible, con la ayuda del secador.3. Colocar la placa en la cubeta, con los puntos de aplicación en el borde superior y en contacto con la fase móvil. El nivel no debe cubrir la línea trazada. Cerrar y esperar una aproximadamente una hora, vigilando que el frente de la fase móvil no llegue al extremo superior de la placa. Realizar en ese tiempo el otro apartado de la práctica.4. Sacar la placa y cerrar la cubeta. Marcar rascando un borde el extremo superior donde llegó la fase móvil. Secar la placa 1 minuto en la estufa e introducirla en la cubeta de revelado con ninhidrina hasta que se impregne. Sacarla y meter en la estufa durante 3-5 min a 105ºC.5. Observar las manchas aparecidas, su forma, intensidad y color.
CUESTIONES1. Calcular el Rf de cada aminoácido patrón y del problema.2. Identificar el aminoácido(s) problema(s)3. Que entiende por cromatografía en placa fina bidimensional?4. Como afectaría al Rf de los aminoácidos la sustitución de n-butanol por etanol en la fase móvil?
B. CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GELEste tipo de cromatografía, también llamado de tamizado molecular, se utiliza para separar biomoléculas, principalmente proteínas, en base al distinto peso molecular de sus componentes, y no en base a la hidrofobicidad, como en TLC. Como los aminoácidos son
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBsemejantes en tamaño, no se pueden separar en este tipo de cromatografía. Las sustancias de tamaño muy diferente sí.La fase estacionaria suele ser un dextrano polimérico denominado Sephadex, de tamaño de poro controlado. Como es un polisacárido, sus propiedades hidrofílicas le permiten un hinchado fácil que le da el aspecto de un gel con el que se pueden rellenar las columnas de cromatografía.
Físicamente, la separación se produce cuando la mezcla disuelta en la fase móvil fluye a través de la fase estacionaria y se encuentra con los poros del gel. De forma simplista, las moléculas más grandes no pueden entrar por esos poros y por tanto pasan por la columna a través del espacio vacío entre las partículas de gel, que se denomina volumen muerto de la columna. Las moléculas pequeñas si pueden entrar por esos poros, por lo que se adentran en el entramado de microcanales de cada partícula de gel, recorriendo un camino mayor y retrasándose respecto a las moléculas de tamaño mayor. Así pues, existe una relación inversa entre tamaño molecular y volumen de elución de cada sustancia desde la columna.Los parámetros más importantes para tratar este tipo de cromatografía desde un punto de vista cuantitativo son:
a) Volumen muerto (Vo): Es el volumen de la columna que no ocupa las partículas del gel, y por tanto no tiene poder separador. Puede determinarse experimentalmente con una sustancia que por su gran tamaño sea excluída de todos los poros de las partículas del gel.
b) Volumen total (Vt): Es el volumen total de lecho, es decir el que ocupan las partículas mas el volumen muerto. Puede calcularse geométricamente o bien con una sustancia de peso molecular pequeño, que se introduzca en todos los poros.
c) Volumen de elución (Ve): Es el volumen al que eluye una sustancia desde que se introduce en el gel.Obviamente, Vo y Vt son constantes de la columna, mientras que Ve depende de cada sustancia. En función de estos parámetros se puede definir el Kav, que es semejante al coeficiente de reparto de la sustancia, y cuya expresión matemática es:Kav = (Ve - Vo) / (Vt - Vo)Para cada tipo de Sephadex, existe un rango de peso moleculares donde la relación entre Kav y el logaritmo de estos pesos es lineal. Por tanto, una columna de este tipo puede servir para separar sustancias, y también para determinar su peso molecular si se compara con otras de peso molecular conocido en ese rango lineal. MATERIAL Y REACTIVOS1 Columna de cromatografía BioRad de 1 cm de diámetro y 20 cm de largo4 probetas de 10 ml2 pipetas de 1 y 5 ml2 pipetas PasteurNaCl al 0.9% con azida sódica al 0.02% (TOXICO, NO PIPETEAR CON LA BOCA).Mezcla de azul dextrano y vitamina B12 para separar.Micropipeta P200 para aplicación de muestra (entre 100 y 200 l). PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBColocación de la muestra y recogida de muestras:1. Desconectar el tubo capilar que une el eluyente con la columna, destapando ésta.2. Quitar el tapón inferior de la columna hasta que eluya todo el volumen encima del lecho. Volver a tapar.3. Pipetear 0.1 ml de mezcla colocándola suavemente encima del lecho de gel.4. Destapar de nuevo la parte inferior de la columna, con una probeta (A) situada debajo para empezar a medir volúmenes. Tapar cuando la muestra se introduzca en la columna.5. Llenar de eluyente la parte superior de la columna, suavemente con la ayuda de una pipeta Pasteur.6. Conectar el capilar desde el reservorio de eluyente a la columna y quitar el tapón inferior, siguiendo la recogida en la probeta A hasta que llegue la primera gota azul. 7. Cambiar a la probeta B, recogiendo todo el eluído azul.8. Cambiar a la probeta C, recogiendo todo el eluído incoloro hasta la aparición de la primera gota rosa.9. Cambiar a la probeta D, recogiendo todo el eluído de vitamina B12, hasta nueva aparición de eluyente incoloro.10. Tapar la columna en su parte inferior y dejar lista para la cromatografía siguiente.Suponiendo que el proceso de elución da lugar a picos simétricos, el máximo de concentración de cada sustancia coloreada se encontrará en el centro de los volúmenes medidos, por lo que los volúmenes de elución serán:Ve (Azul Dextrano) = A + B/2Ve (Vitamina B12) = A + B + C + D/2
PRÁCTICA 4ENZIMAS DIGESTIVOS. AMILASA SALIVAL Y LIPASA PANCREATICA INTRODUCCIONEl proceso digestivo se realiza sobre los alimentos para su degradación en moléculas más sencillas que puedan ser absorbidas y transportadas para su utilización celular. Dicho proceso tiene lugar en diferentes partes del tubo digestivo, y se lleva a cabo por diferentes clases de enzimas que actúan sobre los componentes de la dieta. El primero en actuar es la -amilasa salival, que degrada almidones en una mezcla de dextrinas y carbohidratos mas sencillos, pudiendo llegar según el nivel de actividad a maltosa o glucosa. El contenido de -amilasa en saliva varía entre 0 y 3 mg/ml, existiendo individuos que no poseen tal actividad.No obstante, el proceso digestivo más importante ocurre en el intestino delgado. De la mezcla de enzimas digestivos intestinales, la lipasa pancreática será también utilizada en la práctica, mediante seguimiento de la hidrólisis de triacilglicéridos a ácidos grasos libres. 1. HIDROLISIS DEL ALMIDONEl almidón es un polisacárido compuesto por unidades de glucosa con dos componentes: la -amilosa, mayoritaria y de estructura lineal, y la amilopectina, minoritaria y de estructura ramificada. La amilosa forma un complejo azul con el iodo. Esta propiedad será aprovechada para observar su hidrólisis por la -amilasa.2. HIDROLISIS DE TRIACILGLICERIDOS
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBEn este caso se utiliza como fuente de enzima la pancreatina bovina, una mezcla de enzimas que contiene lipasa. Como sustrato fuente de triacilglicéridos se utilizará leche de vaca. Al hidrolizarse los triacilglicéridos aparecen ácidos grasos libres que disminuyen el pH de la disolución. Mediante fenolftaleína, un indicador ácido/base, es posible visualizar esa disminución.La leche se basifica con carbonato en presencia de unas gotas de fenolftaleína hasta coloración rosa (pH>7) y se puede detectar la disminución del pH por decoloración del indicador (pH<7). MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS2 Gradillas Almidón hervido al 1 y al 0.5 % 30 Tubos de ensayo Fenolftaleína 1% en etanolPipetas vidrio de 5 y 10 ml Iodo 1 mM 1 Vaso de 50 o 100 ml Pancreatina 2%1 Varilla de agitación Carbonato sódico 0.2 M1 Baño termostático a 37ºC Bilis 2% (o DOC sódico al 2%)1 Embudo Reactivo de BenedictFiltros precortados 1 Termobloque hasta 100ºC.Agitatubos Vortex Suero fisiológico ClNa 0.9%Leche entera Saliva (o -amilasa 0.2 mg/ml)Pipeta P1000 y cánulas PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. HIDROLISIS DEL ALMIDON a) Obtención de la -amilasa salivalSe prepara un tubo de ensayo limpio sobre el que se coloca un embudo con un filtro de papel. Este filtro se humedece con suero fisiológico hasta aparición de alguna gota de filtrado en el tubo de ensayo de recogida. Activar en lo posible la secreción de saliva y depositar sobre el embudo un poco de saliva escupiendo suavemente. Para facilitar la filtración y fluidificación de dicha saliva, añadir 12 ml de suero fisiológico en el embudo y esperar que el volumen de filtrado sea de unos 10 ml sobre el tubo de ensayo.b) Elección de la cantidad de -amilasa adecuada.En 5 tubos marcados como A, B, C, D y E se pipetean las cantidades que se indican a continuación (expresadas en ml):REACTIVO nº tubo A B C D EAlmidón 0.5% 5 5 5 5 5Agua destilada 0 0.9 0.8 0.7 0.4Disolución de -amilasa (saliva diluida) 0 0.1 0.2 0.3 0.6AGITAR. Es INDISPENSABLE que se produzca una buena mezcla. Incubar 5 min a 37ºC e INMEDIATAMENTE añadir el iodo.Iodo al 1% 3 3 3 3 3Agitar y observar el color que aparece, azul o amarillento. Seleccionar el tubo en el que se haya producido -amilasa.digestión total del almidón con la menor cantidad de c) Seguimiento de la cinética de desaparición de almidón y la aparición de azúcares reductores.
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBPreparar 6 tubos con 1 ml de disolución de iodo en cada uno y otros 2 tubos con 3 ml de disolución de Benedict. Una vez preparados los tubos anteriores, pipetear en un tubo provisto de tapón 10 ml de disolución de almidón preatemperada a 37ºC y añadir el doble de la cantidad de -amilasa elegida en el apartado anterior. Agitar lo más rápidamente posible e inmediatamente, pipetear 1 ml de dicha mezcla a uno de los tubos con iodo y otro ml a uno de los tubos con reactivo de Benedict. Después, cada minuto, pipetear 1 ml sobre los sucesivos tubos de iodo hasta el último tubo, donde se pipeteará 1ml sobre iodo y otro ml sobre el segundo tubo que contiene reactivo de Benedict. Acabada la serie del iodo, anotar resultados e interpretarlos mientras se ponen los tubos con el Reactivo de Benedict al baño maría durante 10min. Anotar las variaciones de color producidas en cada tubo y discutir los resultados obtenidos.NOTA: Caso de que la hidrólisis del almidón ocurra de forma muy rápida, repetir la experiencia con intervalos de 30 s entre tubo y tubo, mientras que si el proceso ocurre lentamente, puede esperarse 2 minutos entre cada extracción de la mezcla de hidrólisis.
2. ACCION DE LA LIPASA PANCREATICAAñadir unos 30 ml de leche al vaso de precipitados y adicionar unas gotas de fenolftaleína. Agitar e ir adicionando disolución de carbonato sódico 0.2 M gota a gota con agitación continua hasta adquirir un color rosa permanente y claramente visible. Se marcan 4 tubos de ensayo y se les añade los siguientes reactivos (cantidades expresadas en ml) REACTIVO tubo A B C DLeche basificada 5 5 5 5Agua destilada 2 1.5 0.5 0Sales biliares 0 0.5 0 1.5Pancreatina 0 0 1.5 1.5Agitar todos los tubos hasta homogenización total y situarlos en el baño de agua a 37ºC, observando lo que sucede con los tubos a lo largo del tiempo y agitándolos ocasionalmente para homogenizar los cambios de color que posiblemente se produzcan. Anotar las decoloraciones y a quÉ tiempo tienen lugar desde el inicio de la reacción e interpretar resultados. CUESTIONES1) Cual es el color original que se obtiene en los tubos donde se mezcla almidón con iodo? Porqué?2) Porqué la -amilasa hace desaparecer el color?3) Nombre dos productos que pueden estar presentes cuando el iodo no produzca la coloración típica con el almidón.4) A que pH fisiológico actúan las lipasa?5) Que producto de la acción de la lipasa es el responsable del cambio de color de la fenolftaleína.6) Cual es el efecto de las sales biliares sobre la digestión?
PRÁCTICA 5ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS EN GELES DE AGAROSA
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACB INTRODUCCIONLa electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa. Los ácidos nucleicos son macromoléculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas condiciona la carga de un ácido nucleico, que es aproximadamente igual al número de grupos fosfato.La electroforesis en geles de agarosa se realiza en cubetas apropiadas, generalmente horizontales, y requiere dos elementos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La fase móvil es el medio amortiguado que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria o soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa con un tamaño de poro homogéneo que se haya sumergido y embebido en la fase móvil. El polímero utilizado para el análisis electroforético de ácidos nucleicos de gran tamaño (100pb-10kb) es la agarosa.La migración de los fragmentos de ácidos nucleicos (ADN o ARN) en un gel de agarosa sometido a un campo eléctrico depende tanto del voltaje del campo, como del tamaño de poro del gel de agarosa. La separación efectiva de los fragmentos de ADN o ARN (resolución) depende tanto de la masa como de la carga de los distintos fragmentos, en realidad de la relación carga/masa. Transcurrida la electroforesis, la localización relativa de los fragmentos se determina mediante distintos métodos de detección. La tinción con bromuro de etidio, una sonda fluorescente tras iluminación con luz UV, es un método generalizado de detección de fragmentos de ADN, ya que la sonda se intercala entre la doble hélice de ADN y emite luz.Por otro lado, las moléculas de ADN tienen en su estructura secuencias de 4-8 pb generalmente, palindrómicas, que son secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción. Las endonucleasas de restricción son enzimas bacterianas que reconocen de forma específica los palíndromos y cortan el ADN en un sitio concreto (siempre el mismo). Actualmente se conocen alrededor de 300 enzimas de restricción y sus secuencias dianas. Existen varios tipos de enzimas de restricción, pero son las de tipo II las más empleadas en el laboratorio. Las endonucleasas cortan las dos cadenas de la doble hélice de ADN y por lo tanto, constituyen una herramienta muy útil para la manipulación molecular del ADN, ya que permiten fragmentarlo en secuencias más cortas y fáciles de estudiar. La electroforesis en gel de agarosa del ADN fragmentado es una técnica muy habitual, que permite separar los fragmentos, localizarlos en función de su peso molecular por comparación con la movilidad de unos estándares de tamaño conocido, y si fuera preciso, extraer de nuevo el fragmento de interés para posteriores aplicaciones (amplificación, clonación, secuenciación, transfección, etc).En esta práctica, vamos a digerir un plásmido (ADN circular), el pBKS modificado. Se trata de un ácido nucleico de aproximadamente 4500 pb que se utiliza frecuentemente en el laboratorio como vector de clonación de fragmentos de ADN. Posee varios sitios de reconocimiento para distintas enzimas de restricción, pero sólo dos de ellos corresponden a la diana de la enzima Hind III (AAGCTT)*. También tiene una diana para la enzima EcoR1 (GAATTC). Por lo tanto, tras la digestión completa del pBKS con Hind III, debemos obtener dos moléculas de ADN lineal, y tras una separación en gel de agarosa, detectaremos dos bandas correspondientes a un peso molecular de 620 pb y 3.9 Kb aproximadamente. La digestión con EcoR1 linearizará el plásmido en un fragmento de ADN de 4500 pb aproximadamente.
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBEsquemáticamente:
MATERIAL Y REACTIVOSHorno microondas Vector pBKS modificadoCubeta de electroforesis horizontal Endonucleasas Hind III &EcoRIFuente de corriente Tampón de la endonucleasa Micropipetas (P100 y P1000) AgarosaFrascos de vidrio TAE 50XPapel de pesada Tampón de muestraTermobloque Estándares de peso molecularBaño termostático AguaTransiluminador de luz UVGafas protectorasTubos eppendorfGuantes PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALa) Digestión del vector pBKS:Mezclar en dos tubos eppendorf limpios los siguientes componentes:1º- Digestión con HindIII 2º- Digestión con EcoRI17 ml de vector pBKS (aprox. 200 ng) 17 ml de vector pBKS2 ml de tampón 10 X 2 ml de tampón 10 X1 ml de endonucleasa Hind III (15 U/ml) 1 ml de endonucleasa EcoR1Incubar a 37 ºC durante 45 min.b) Durante el tiempo de digestión, preparar un gel de agarosa de 1.2%. Para ello, pesar 0.6 g de agarosa en un papel de pesada, añadir 50 ml de agua y llevar a ebullición. Dejar enfriar la disolución hasta aproximadamente 50 ºC en un baño de agua a esa temperatura. Añadir 1 ml de TAE 50X y agitar. Verter la disolución de agarosa en el molde apropiado, sellado por los extremos y con el peine puesto. Dejar polimerizar (20 min. aproximadamente).c) Mientras polimeriza, preparar 1 litro de tampón TAE 1X. Una vez polimerizado el gel, llenar la cubeta de electroforesis con tampón 1X y quitar el peine con cuidado de no romper los pocillos. Cuando se cumpla el tiempo de incubación con la enzima de restricción, añadir a los tubos 5 ml de tampón de muestra y colocar el volumen completo en los pocillos del gel. Llenar también un pocillo con 10 ml de estándares de peso molecular. Aplicar la fuente de
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBcorriente, y correr la electroforesis a 120 V durante 30 min. Finalizada la electroforesis, sumergir el gel en una disolución de bromuro de etidio durante 15 min y visualizar el resultado con un transiluminador en una cámara oscura, tomando las precauciones adecuadas (guantes de látex, gafas o pantalla protectora), ya que se trata de un compuesto tóxico por inhalación y por contacto, debido a su fuerte carácter mutagénico y teratogénico. PROBLEMA TEORICO (para resolver durante la electroforesis)La intolerancia hereditaria a la fructosa (IHF) es una enfermedad de transmisión recesiva causada por la deficiencia de una enzima del metabolismo de la fructosa, la aldolasa B. La aldolasa B se expresa de forma selectiva en el hígado, los riñones y el intestino delgado. Los síntomas característicos de este trastorno son hipoglucemia, dolores abdominales y vómitos, tras haber ingerido alimentos ricos en fructosa y hexosas relacionadas. La enfermedad llega a ser mortal, y la supervivencia depende de la exclusión de la fructosa en la dieta y se asocia con el desarrollo de una fuerte aversión por los alimentos y bebidas azucaradas. Por lo tanto, la IHF responde favorablemente al tratamiento dietético de exclusión, aunque la intolerancia persiste. Esta última, junto con los antecedentes familiares de la enfermedad, sugiere el diagnóstico.El análisis molecular del gen de la aldolasa B en pacientes con IHF ha demostrado que diversas mutaciones causan la enfermedad. Una de ellas puede detectarse por análisis directo del ADN genómico. El procedimiento es el siguiente: obtención del ADN genómico de los individuos susceptibles de poder desarrollar la enfermedad. Amplificación por PCR del exón 2 del gen de la aldolasa B (fragmento de 201 pb). Digestión del fragmento de 201 pb con la enzima de restricción NcoI y análisis electroforético de los posibles fragmentos.
Cuando el individuo es sano, el fragmento amplificado de 201 pb posee una diana de restricción NcoI, y tras la digestión, se obtienen dos fragmentos de 145 pb y 56 pb. Cuando el individuo está afectado por la enfermedad, la mutación en el exón 2 elimina la diana de restricción, y por eso, tras la digestión con la endonucleasa, se obtiene el fragmento intacto de 201 pb. Es por ello que la digestión y posterior separación electroforética de muestras de individuos potencialmente susceptibles de desarrollar la enfermedad, se utiliza como valor diagnóstico de la misma.
Analizar en función de la explicación anterior, el resultado de la electroforesis en agarosa al 3% que se obtuvo cuando se analizó el ADN de una familia en la que alguno de sus miembros presentaba aversión a los alimentos azucarados. Determinar cúales de ellos podrían desarrollar la enfermedad, y si son homocigotos o heterocigotos para la misma.
Secuencia completa y mapa de digestión del vector Bluescript II KS+
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACB pBluescript II KS(+), 2961 bp version 122001 1 CTAAATTGTA AGCGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT 51 AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT 101 AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA 151 CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA 201 CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CTAATCAAGT 251 TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG 301 CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG 351 AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG 401 GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA 451 GGGCGCGTCC CATTCGCCAT TCAGGCTGCG CAACTGTTGG GAAGGGCGAT 501 CGGTGCGGGC CTCTTCGCTA TTACGCCAGC TGGCGAAAGG GGGATGTGCT 551 GCAAGGCGAT TAAGTTGGGT AACGCCAGGG TTTTCCCAGT CACGACGTTG 601 TAAAACGACG GCCAGTGAGC GCGCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGAAT 651 TGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GGCCGCTCTA GAACTAGTGG ATCCCCCGGG 701 CTGCAGGAAT TCGATATCAA GCTTATCGAT ACCGTCGACC TCGAGGGGGG 751 GCCCGGTACC CAGCTTTTGT TCCCTTTAGT GAGGGTTAAT TGCGCGCTTG 801 GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC 851 AATTCCACAC AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG 901 CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT 951 TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG 1001 CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA 1051 CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC 1101 TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA 1151 GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG 1201 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA 1251 AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA 1301 CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC 1351 TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG 1401 CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG 1451 CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG 1501 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA 1551 TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT 1601 AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA 1651 GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA 1701 AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG 1751 TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC 1801 AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA 1851 AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC 1901 CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT 1951 ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT 2001 ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT 2051 CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG 2101 CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA 2151 AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC 2201 CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT 2251 CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG 2301 GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG 2351 ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT 2401 CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA 2451 CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT 2501 AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT 2551 AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT 2601 ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC 2651 TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA 2701 TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC 2751 AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG 2801 AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACB2851 ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT 2901 GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG 2951 AAAAGTGCCA C #Enzima número de dianas Posición Acc65I 1 755 AccI 1 734 AflIII 1 1153 AhdI 1 2041 Alw44I 2 1467, 2713 AlwI 10 689, 690, 1720, 1794, 1806 1891, 1904, 2368, 2671, 2689 AlwNI 1 1564 ApaI 1 749 ApoI 3 417, 428, 707 AvaI 2 695, 740 AvaII 2 2184, 2406 BamHI 1 689 BanI 4 193, 755, 897, 1994 BanII 3 159, 653, 749 BciVI 2 1362, 2889 BfaI 6 81, 678, 684, 1648, 1901 2236 BglI 2 466, 2160 BpmI 1 2131 BsaAI 1 232 BsaHI 1 2582 BsaI 1 2113 BsaJI 6 575, 661, 694, 695, 892 1313 BsaWI 3 1359, 1506, 2337 BseMII 4 1428, 1837, 2003, 2543 BsiEI 6 497, 670, 1066, 1490, 2413 2562 BsiHKAI 4 653, 1467, 2628, 2713 BslI 8 9, 335, 739, 995, 1169 1187, 1353, 1632 BsmAI 2 2113, 2878 Bsp120I 1 749 Bsp1286I 6 159, 653, 749, 1467, 2628, 2713 BspHI 2 1873, 2881 BspLU11I 1 1153 BsrBI 5 88, 673, 843, 1084, 2885 BsrDI 2 2100, 2282 BssHII 2 619, 792 BssSI 2 1326, 2710 BstF5I 4 542, 2026, 2207, 2494 BstXI 1 658 Cfr10I 2 129, 2126 ClaI 1 725 Csp6I 2 756, 2525 DdeI 4 1428, 1837, 2003, 2543 DraI 3 1910, 1929, 2621 DraIII 1 232 DrdI 2 275, 1255 DsaI 1 661 EaeI 4 609, 670, 992, 2434 EarI 3 511, 1031, 2835 Ecl136II 1 653 Eco52I 1 670 Eco57I 2 1680, 2728 EcoO109I 1 748 EcoRI 1 707 EcoRII 5 575, 892, 1180, 1301, 1314 EcoRV 1 713 FauI 5 33, 87, 505, 945, 1002 FokI 4 542, 2026, 2207, 2494
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACB FspI 2 477, 2266 HaeII 4 75, 83, 1027, 1397 HgaI 4 3, 1255, 1833, 2583 HincII 1 734 HindIII 1 719 HinfI 8 282, 304, 632, 988, 1053 1128, 1524, 2041 HphI 6 222, 1897, 2124, 2520, 2746 2761 KpnI 1 755 MaeII 8 123, 233, 276, 288, 595 1856, 2272, 2645 MboII 8 103, 512, 1032, 1803, 1894 2649, 2727, 2836 MslI 4 659, 2294, 2453, 2812 MspA1I 6 527, 661, 975, 1493, 1738 2679 MvaI 5 575, 892, 1180, 1301, 1314 NaeI 1 129 NciI 6 695, 696, 752, 1532, 2228 2579 NgoMIV 1 129 NlaIII 8 808, 1154, 1874, 2365, 2375 2453, 2489, 2882 NotI 1 669 NspI 1 1153 PleI 6 282, 304, 632, 1053, 1524 2041 Psp1406I 2 2271, 2644 PstI 1 701 PvuI 2 497, 2413 PvuII 2 527, 975 RsaI 2 756, 2525 SacI 1 653 SacII 1 661 SalI 1 734 SapI 1 1030 Sau96I 8 240, 507, 749, 750, 2088 2167, 2184, 2406 ScaI 1 2524 SchI 6 282, 304, 632, 1053, 1524 2041 SfaNI 4 1241, 2293, 2503, 2733 SfcI 6 11, 638, 701, 1418, 1609 2287 SmaI 1 695 SmlI 5 740, 1259, 1521, 1798, 2666 SpeI 1 683 SspI 2 440, 2848 TaaI 8 258, 483, 731, 1115, 1186 1656, 1969, 2484 TaiI 8 123, 233, 276, 288, 595 1856, 2272, 2645 TaqI 7 199, 711, 726, 735, 741 1253, 2697 TatI 1 2524 TfiI 2 988, 1128 Tsp45I 4 57, 589, 2303, 2514 TspRI 10 613, 940, 1049, 1555, 1568 1839, 1988, 2093, 2440, 2467 VspI 3 923, 982, 2217 XbaI 1 677 XhoI 1 740 XhoII 7 689, 1794, 1805, 1891, 1903 2671, 2688 XmaI 1 695 XmnI 1 2641
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PRÁCTICA 02AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS Las proteínas son las biomoléculas mas abundantes de la materia viva. Sus propiedades fisico-químicas pueden diferir drásticamente, y así una queratina del pelo se parece poco a una proteína plasmática o a la insulina. Sin embargo, todas tienen en común su composición, basada en -aminoácidos unidos por enlaces peptídicos dando lugar a cadenas lineales.Para que las proteínas cumplan su función biológica tiene que adoptar una estructura espacial determinada, denominada nativa. La pérdida de esta estructura tridimensional conlleva la perdida de su actividad biológica, y el proceso se denomina desnaturalización. Las propiedades fisico-químicas cambian drásticamente, y en el caso de las proteínas globulares solubles, generalmente se produce una insolubilización. Agentes desnaturalizantes típicos son el calor, valores extremos de pH, disolventes orgánicos y agentes caotrópicos.Las proteína pueden determinarse por una gran cantidad de métodos, entre los que se encuentran:ENSAYO DE BIURET: Compuestos con enlaces peptídicos producen un cambio de color del azul al púrpura cuando reaccionan con Cu(II) en medio alcalino. El compuesto más sencillo que da la reacción es el biuret, un dímero de la urea que da el nombre al ensayo, de estructura CONH2-NH-CONH2. El ensayo es bastante específico para proteínas pero poco sensible, requiriendo de 1 a 10 mg de proteína.ENSAYO DE LOWRY: Es más sensible que el Biuret, pero mas tedioso de realizar. Puede detectar cantidades del orden de 0.1 mg de proteína. Se basa en la reacción de proteínas con el Cu(II) en medio alcalino y también de la reacción de grupos fenólicos (mayoritariamente tirosina en proteínas) con un reactivo denominado de Folin-Ciocalteau que contiene fosfomolibdato y fosfowolframato.Los aminoácidos pueden detectarse con reactivos que reaccionen con sus grupos característicos, el carboxilo, el amino u otros de la cadena lateral. Aunque el número de ensayos es muy grande, con características particulares en cada caso, uno de los mas utilizados es la detección con ninhidrina, que produce un color púrpura que en algunos casos puede ser rosa o rojizo, y en el caso de los iminoácidos amarillo.MATERIALES20 tubos de ensayo GradillaPipetas de 1 y 5 ml. Mechero Bunsen1 probeta de 10 y otra de 50 ml EspátulaBaño de agua calefactor Albúmina, 5 mg/ml5 Pinzas de maderaREACTIVOSDisolución de albúmina 10 mg/ml Tampón fosfato pH 7, 10 mMOHNa 2,5 N Acido Tricloroacético (TCA) 10%Acetona Acetato de plomo 0.2 MReactivo de Biuret Reactivos A, B y C de LowryNinhidrina 1 mg/ml en fosfato Prolina 0.5%Leucina 0.5% Aspártico 0.5% PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALExtracción de la ovoalbúmina.
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBDe una clara de huevo de gallina, tomar entre 1-2 g con la ayuda de una espátula o una pipeta Pasteur. De esa cantidad, el 10% aprox. es ovoalbúmina, la proteína mas abundante en la clara. Diluir 20 veces con tampón fosfato (añadiendo 19 a 38 ml de tampón según el peso de clara obtenido). Agitar hasta obtener una disolución homogenea. Caso de que existan flóculos, eliminarlos mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 min. Con ello se obtiene una disolución de aprox. 5 mg/ml de proteína.Caso de suministrar una disolución de albúmina de 5 mg/ml, no es necesario realizar la extracción.1. PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS POR VARIOS AGENTESRealizar el apartado con la disolución de albúmina obtenida. Para ello, pipetear en 5 tubos de ensayo, rotulados del 1 al 5, 1 ml de disolución de albúmina por tubo, realizando los siguientes tratamientos:a) Calor: Colocar el tubo nº 1 al baño maría durante unos minutos. Observar resultados.b) Medio ácido: Añadir al tubo nº 2 1 ml de TCA gota a gota. Agitar.c) Medio básico: Añadir al tubo nº 3 1 ml de NaOH sódico gota a gota. Agitar.d) Disolventes orgánicos: Añadir al tubo nº 4 2 mls de acetona gota a gota. Agitar.e) Cationes pesados: Añadir al tubo nº 5 1 ml de acetato de plomo gota a gota. Agitar.Anotar, comentar y justificar los resultados obtenidos. 2. ENSAYO DEL BIURET Preparar 5 ml de disolución de albúmina de 2 mg/ml por dilución de la anterior. Para ello, se ha de calcular la dilución necesaria. Con ella realizar el siguiente protocolo en 4 tubos de ensayo:REACTIVO nº tubo 1 2 3 4AGUA DESTILADA 2 1.8 1 -ALBUMINA 2 mg/ml - 0.2 1 2REACTIVO DE BIURET 3 3 3 3Una vez agitados todos los tubos, esperar 10 min y observar resultados. Optativamente, medir absorbancia a 500 nm. Relacionar la cantidad de proteína existente en cada tubo con la sensibilidad del ensayo. 3. ENSAYO DE LOWRYPreparar 10 ml de otra disolución de albúmina de 0.2 mg/ml por nueva dilución de la anterior solución de 2 mg/ml. Rotular 4 tubos bien limpios y adicionar los siguientes reactivos, en el orden establecido:REACTIVO nº tubo 1 2 3 4Agua destilada 2 1.5 1 -Albúmina 0.2 mg/ml - 0.5 1 2Reactivo A (AGITAR Y ESPERAR 5 min) 1 1 1 1Reactivo B (AGITAR Y ESPERAR 5 min) 1 1 1 1Reactivo C (FOLIN-CIOCALTEAU) (Agitar) 3 3 3 3Calcular la cantidad de proteína existente en cada tubo y relacionarla con el color desarrollado. Observar y comentar los resultados obtenidos. Optativamente, medir absorbancia a 650 nm. 4. ENSAYO DE LA NINHIDRINAPreparar 4 tubos de acuerdo con la Tabla siguiente. Calentar al baño María durante 10 min y observar resultados, anotando cuando y qué color aparece en cada caso.REACTIVO nº tubo 1 2 3 4
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado Daniel Alcides Carrión / Farmacia / Bioquímica / ACBASPARTICO 3 - - -LEUCINA - 3 - -PROLINA - - 3 -ALBUMINA 0.2 mg/ml - - - 3NINHIDRINA 1 1 1 1 CUESTIONES1) Expresar los cálculos realizados para llevar a cabo las diluciones efectuadas en las disoluciones de ovoalbúmina.2) Cual es la sensibilidad del ensayo de Biuret y la del Lowry. Compárelas.3) Buscar en la bibliografía la estructura y la reacción entre la ninhidrina y los aminoácidos.