Post on 04-Jun-2018
©2014 Waters Corporation 2
Métodos problemáticos
Consecuencias de un método mal desarrollado
– Calidad
o Datos no fiables, necesidad de re-analizar muestras
o Resultados fuera de especificaciones, investigaciones
o Dificultad para transferir métodos
– Coste
o Solicitudes de registro rechazadas, auditorías
o Retrasos en obtención de resultados/liberación de lote y complejidad adicional en el
proceso regulatorio
o Tiempo necesario para volver a desarrollar el método, para revalidarlo y volver a
solicitar el registro
o Desperdicio de recursos
• tiempo del analista, consumibles y tiempo de funcionamiento del instrumento
Un buen método le
proporciona un
buen resultado,
¡siempre!
©2014 Waters Corporation 3
Aspectos a considerar
¿Los picos
son puros?
¿El método
cumplirá los
criterios?
¿Dónde están
los datos?
¿Estoy viendo
todos los picos?
¿Estoy identificando
correctamente los
picos?
¡Estoy cansado
de inyectar patrones!
¿Hay alguna forma
mejor de hacer el
seguimiento de los
picos?
¿Es
reproducible?
¿El método
es robusto?
¡Los lotes son
muy largos!
¿Obtendré
resultados
exactos?
Método robusto
Separación Detección Evaluación de datos
¿Fallará
en QC?
¿Se podrá
transferir
fácilmente?
¿Mi sistema es
suficientemente
flexible?
¿Utilizo la
columna
adecuada?
¿Estoy separando
todos los analitos?
¿Mi sistema
funciona
correctamente?
¿La columna está
en buen estado?
Transferencia
©2014 Waters Corporation 4
Evaluación de datos
Métodos robustos
Separación
Detección
Esquema
Transferencia
©2014 Waters Corporation 5
Separar todos los analitos… lo más rápido posible
Maximice la selectividad combinando distintas columnas, modificadores orgánicos y pH
Minutes 0.00 1.20 2.40 3.60 4.80
I
A
P
Fl
Fe
D O
I
A
P
Fl
Fe
D
O
CSH C18
pH 3, ACN
CSH Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
P: 1-pyrenesulfonic acid Fe: fenoprofen D: diclofenac I: Imipramine A: Amitriptyline Fl: Flavone O: Octanophenone
No sabía que podía
trabajar con pH altos…
¡Solo tiene que usar
una columna de
partícula híbrida!
©2014 Waters Corporation 6
31
1.1
29
5.1
34
8.9
31
3.1
3
28
.1
35
5.1
3
70
.1
AU
0.00
0.05
31
1.0
29
5.1
34
9.1
3
28
.0
34
9.2
32
8.1
3
28
.1 31
3.1
37
0.2
35
5.1
AU
0.00
0.05 3
11
.0
29
5.1
31
1.1
32
8.1
3
13
.1
37
0.2
3
55
.1
AU
0.00
0.05
31
1.1
29
5.1
34
9.0
3
12
.7
32
8.1
31
3.1
37
0.1
35
5.1
AU
0.00
0.05
Minutes
1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60
Una columna C18 genérica no es suficiente
CSH C18
CORTECS™ C18+
CSH Phenyl Hexyl
HSS PFP
Pruebe distintas
columnas, ligandos y
tecnologías de
partícula para
identificar la mejor
separación más rápido
Mayor número de picos resueltos
* Masa principal del pico
©2014 Waters Corporation 7
¿Qué pasa si hay co-eluciones?
m/z 312.0
m/z 330.1
m/z 344.1
31
2.0
Inte
nsity
0
5x10 8
33
0.1
Inte
nsity
0
5x10 8
34
4.1
Inte
nsity
0
5x10 8
Minutes
1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
Detección UV
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
Minutes
1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50
Paroxetine + related compounds
Utilice detectores complementarios: la detección de masas combinada con la
detección UV premite identificar coeluciones
rápidamente
Desarrollé un método... Había una coelución y ¡tuve que empezar de
nuevo!
* Masa principal del pico
©2014 Waters Corporation 8
Comprobar si la columna funciona correctamente...
Registrar el historial de la columna e-Cord
Usar un patrón certificado para evaluar el rendimiento de las columnas usadas
Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM)
El mejor procedimiento
es usar una columna
nueva caracterizada
en su propio sistema
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Normal Operation
Failing Column
Ac
eto
ne
Ac
eto
ne
Na
ph
tha
len
eN
ap
hth
ale
ne
Ac
en
ap
hth
en
e
Ac
en
ap
hth
en
e
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Normal Operation
Failing Column
Ace
ton
eA
ceto
ne
Nap
hth
ale
ne
Nap
hth
ale
ne
Ace
nap
hth
en
e
Ace
nap
hth
en
e
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Normal Operation
Failing Column
Ace
ton
eA
ceto
ne
Nap
hth
ale
ne
Nap
hth
ale
ne
Ace
nap
hth
en
e
Ace
nap
hth
en
e
©2014 Waters Corporation 9
Glucosamina
Altamente polar
Fase reversa
HPLC
Inte
nsity
0
50000
100000
150000
200000
(in void)
Modo HILIC
Inte
nsity
0.0
45000.0
90000.0
135000.0
180000.0 Glucosamina
Altamente polar
Verificar la retención de los compuestos
Minutes
AU
0.00
0.07
0.14
0.21
0.28
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00
Vitamina D3
Altamente apolar Fase Reversa
HPLC
Suplemento vitamínico con Glucosamina y Vitamina D3
Utilice el modo de
separación adecuado –
HILIC para compuestos
altamente polares
©2014 Waters Corporation 10
Separación
Detección
Esquema
Métodos robustos
Evaluación de datos
Transferencia
©2014 Waters Corporation 11
Detectar todos los analitos
La memantina no tiene cromóforos y requiere
técnicas de detección alternativas a la UV
Su
lfa
dim
eth
oxin
e -
31
1.0
0
Re
se
rpin
e -
60
9.2
9
Te
rfe
na
din
e -
47
2.3
1
AU
0.00
0.12
0.24
0.36
0.48
Me
ma
ntin
e -
18
0.1
1
Su
fad
ime
tho
xin
e -
31
1.0
4
Re
se
rpin
e -
60
9.2
7
Te
rfe
na
din
e -
47
2.3
5
Inte
nsity
0
2x107
4x107
6x107
8x107
Minutes0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Detección UV
Su
lfa
dim
eth
oxin
e -
31
1.0
0
Re
se
rpin
e -
60
9.2
9
Te
rfe
na
din
e -
47
2.3
1
AU
0.00
0.12
0.24
0.36
0.48
Me
ma
ntin
e -
18
0.1
1
Su
fad
ime
tho
xin
e -
31
1.0
4
Re
se
rpin
e -
60
9.2
7
Te
rfe
na
din
e -
47
2.3
5
Inte
nsity
0
2x107
4x107
6x107
8x107
Minutes0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Detección de masas
No se pierda nada –
utilice técnicas de
detección
complementarias
(UV y MS)
* Masa principal del pico
©2014 Waters Corporation 12
Patrones individuales para identificar cada pico secuencias de análisis
largas
me
top
rolo
l - 2
68
.3
pa
pe
ravin
e -
34
0.2
bro
ma
ze
pa
m -
31
6.0
me
da
ze
pa
m -
27
1.2
do
xe
pin
- 2
80
.3
oxa
ze
pa
m -
28
7.0
loa
ze
pa
m -
32
1.0
am
itri
pty
line
- 2
78
.3
tem
aze
pa
m -
30
1.0
clo
mip
ram
ine
- 3
15
.2
dia
ze
pa
m -
28
5.2
AU
0.000
0.008
0.016
0.024
0.032
Minutes
1.90 2.28 2.66 3.04 3.42 3.80 4.18 4.56 4.94 5.32
11 patrones en 11 inyecciones distintas solo con detección UV (1hr 39 min) Ahorro del 91%
de tiempo vs.
11 patrones en una sola inyección con detección UV y MS (9 min)
Ahorre tiempo
obteniendo más
información en una
inyección
* Masa principal del pico
©2014 Waters Corporation 13
Seguir cada compuesto a lo largo del proceso de desarrollo
pH 3
pH 9.5
34
0.3
31
8.0
27
1.1
28
0.2
29
6.2
30
1.1
27
8.2
28
5.1
3
15
.2
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
31
9.0
26
8.3
28
7.1
34
0.3
30
1.1
28
5.1
28
0.2
27
1.1
27
8.2
31
5.2
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Minutes
2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
Realice el
seguimiento de sus
picos de manera
fácil y rápida con
información MS
Los picos se
mueven y no
puedo
indentificarlos
* Masa principal del pico
©2014 Waters Corporation 14
Identificar correctamente los picos
Confirme la identidad de los
picos con Empower®
analizando datos MS y UV
conjuntamente
* Masa principal del pico
©2014 Waters Corporation 15
Evaluación de los datos
Esquema
Métodos robustos
Separación
Detección
Transferencia
©2014 Waters Corporation 16
Evaluación consistente de los datos
La integración Apex Track de Empower permite realizar una integración
fácil y reproducible de picos coeluidos de manera automática.
Integración tradicional
Integración ApexTrack
©2014 Waters Corporation 17
Verificar los criterios de calidad de la separación
Observando los cromatogramas creía
haber elegido las mejores condiciones,
pero no lo eran…
¡No haga
suposiciones!
Utilice los campos
personalizados de
Empower para
identificar las mejores
condiciones
©2014 Waters Corporation 18
Verificar que no hay coeluciones
Los picos parecían
homogéneos pero en
QC detectaron que no lo
eran.
Apex
Trailing
Verifique la
homogeneidad de los
picos utilizando los
datos UV y MS en
Empower Leading
©2014 Waters Corporation 19
Recuperar los datos
Organice los datos por proyectos
Consultas basadas en cualquier combinación de metadatos
– Comodines
– Rangos de datos
Base de datos relacional
Realicé mis experimentos la semana pasada… ¿cuáles eran las
mejores condiciones?
©2014 Waters Corporation 20
Evaluación de datos
Esquema
Métodos robustos
Separación
Detección
Transferencia
©2014 Waters Corporation 21
Transferir métodos: Entre equipos - Entre laboratorios
La clave para una buena transferencia de métodos
son un método robusto y una validación hecha en
distintos instrumentos
Pequeñas diferencias en la configuración o el rendimiento
entre sistemas puede provocar variaciones en los resultados
– El desgaste del instrumento o la columna
– Cambios en el tamaño y la longitud de la tubería
– Contaminación
©2014 Waters Corporation 22
Verificar el funcionamiento del sistema
AU
0.00
0.05
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Minor LeakSystem Pressure: ~6400 psi
Normal OperationSystem Pressure: ~ 6600 psi
Ac
eto
ne
Ac
eto
ne
Na
ph
tha
len
e
Na
ph
tha
len
e
Ac
en
ap
hth
en
e
Ac
en
ap
hth
en
e
Posibles problemas:
• Fugas
• Conexiones gastadas
• Columnas envejecidas
• Contaminación cruzada
• Celda sucia
• Errores en la fase móvil
• Burbujas de aire
• Otros
Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM)
Desarrolle los métodos y transfiéralos en sistemas
que estén funcionando correctamente
©2014 Waters Corporation 23
Equipos flexibles Evitar cambios en la
configuración del sistema
ACQUITY® H-Class (como HPLC)
4.6 x 100mm 3.5µm Xterra® MS Phenyl
Flow rate: 1mL/min
Water/Acetonitrile/100mM amm. bicarb. pH 10
UV detection at 280 nm
ACQUITY H-Class (como UPLC) 2.1 x 75mm 1.7 µm ACQUITY UPLC CSH C18
Flow rate: 0.6 mL/min
ACN: MeOH: Water (44:40:28)
UV detection at 254nm
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
Minutes
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00
Caffeine metabolites
Tioconazole and
Related Compounds
Reduzca la variabilidad – utilice un solo sistema tanto para métodos
HPLC como para métodos UPLC
©2014 Waters Corporation 24
Optimizar la robustez para una mejor transferencia de métodos
5 µm – 150 mm
L/dp = 30,000
Flow rate = 0.2 mL/min
Rs (2,3) = 2.28
3.5 µm – 100 mm
L/dp = 28,571
Flow rate = 0.3 mL/min
Rs (2,3) = 2.32
1.7 µm – 50 mm
L/dp = 29,412
Flow rate = 0.6 mL/min
Rs (2,3) = 2.29
Desarrolle métodos con
químicas escalables
para facilitar las
transferencias de
métodos
Desarrollé un método
en HPLC, y ahora no puedo
transferirlo porque no hay una
columna UPLC equivalente
Las químicas de columna BEH/CSH/HSS son directamente escalables
©2014 Waters Corporation 25
Métodos robustos
Esquema
Separación
Detección Evaluación de datos
Transferencia
©2014 Waters Corporation 26
Finalmente… un método robusto
ACQUITY UPLC H-Class ACQUITY CSH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm
Column at 30°C
0.1% Formic acid, pH 2.5
0 – 87.5% ACN in Water over 5 min
Ziprasidone peroxide degradation
Utilice Empower
Method Validation
Manager (MVM) para
automatizar los
ensayos de validación
©2014 Waters Corporation 27
Validación: un trabajo tedioso
Compilación de
informes
Preparación de
patrones y muestras Gestión de los datos
PNT de validación
de métodos
corporativo
Cálculo de resultados
estadísticos
Creación de la
secuencia de
muestras
Adquisición y procesamiento
de datos
Method Validation
Manager
©2014 Waters Corporation 28
¿Crear un método robusto es solo cuestión
de aplicar estos trucos y consejos?
©2014 Waters Corporation 29
Métodos robustos - Equipo fiable
ACQUITY® UPLC H-Class para desarrollos de método rápidos y fiables
Gestor de columnas
— Hasta 6 columnas
— Evite tener que montar y
desmontar columnas
— Químicas de 5µm a sub-2µm
— Diferentes modos de
calentamiento para minimizar
problemas de transferencia
Detectores ACQUITY
— PDA, TUV, FLR, ELSD, RI,
QDa™
— Flexibilidad modular
— Facilidad de uso
Sistema fiable y de calidad
Métodos HPLC o UPLC
Bomba cuaternaria
— Composiciones de fase móvil
constantes con la tecnología
Auto•Blend™
— Válvula selectora de solvente
opcional (hasta 9 líneas)
©2014 Waters Corporation 30
Fiabilidad en el control de las condiciones cromatográficas
Pequeños cambios en la preparación de la fase móvil
pueden afectar a la robustez del método
pH 3.0
pH 3.2
268.2
340.3
318.0
271.1
280.2
301.1
278.2
285.1
315.2
AU
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
268.2
340.3
316.0
271.1
280.2
287.1
278.2
315.2
285.1
AU
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
Minutes
1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40
* Masa en la base del pico
Inyección #1
Injección #2
©2014 Waters Corporation 31
Agua
1% NH4OH 1% FA
Acetonitrilo Agua
1% NH4OH 1% FA
Acetonitrilo
95%
5%
0%
0%
45%
5%
50%
0%
100% Agua
0% Acetonitrilo
0.05% Ácido Fórmico
50% Agua
50% Acetonitrilo
0.05% Ácido Fórmico
El sistema debe controlar la composición de la fase móvil de manera exacta
La tecnología Auto•Blend está integrada en el sistema ACQUITY H-Class
©2014 Waters Corporation 32
Incorporar un detector de masas
QDa
PDA
Detector ACQUITY QDa
Detección de masas
m/z 30 a 1250
Mantenimiento mínimo
ESI ± Pre-optimizado
Mínima intervención del usuario
Pulsar el botón de encendido
Rápida puesta a punto
¡Listo!
Si puede usar un PDA, ¡puede usar un QDa!
Modular, ocupa poco espacio
©2014 Waters Corporation 33
Evaluar la columna a elegir
Waters es fabricante
primario de partículas de
sílice e híbridas – desde la
materia prima hasta el
producto acabado
Se fabrican lotes pequeños
de 1 - 2 Kg para monitorizar
cuidadosamente los
parámetros que tienen un
impacto en la variabilidad
del proceso
ACQUITY UPLC BEH C18 Coverage
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Batch
Liga
nd
De
nsi
ty [
µm
ol/
m2
]
UCL
LCL
Base/Neutral Selectivity
0.100
0.105
0.110
0.115
0.120
0.125
0.130
0.135
0.140
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Batch
Pro
pra
no
lol/
ace
nap
hth
en
e [
Alp
ha]
UCL
LCL
Gráfico del proceso de control de 85 lotes de columnas ACQUITY
UPLC BEH C18
¡Minimice el riesgo de variabilidad de un método
desarrollando columnas de calidad!
©2014 Waters Corporation 34
Métodos válidos a largo plazo A
U
-0.010
0.000
0.010
AU
-0.010
0.000
0.010
AU
-0.010
0.000
0.010
Minutes
1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20
Lote 101
Lote 103
Lote 109
Pruebe tres columnas con el mismo relleno, de lotes distintos,
utilizando los kits de validación de métodos para validar a fiabilidad
del método a largo plazo
©2014 Waters Corporation 35
Proceso: Optimizar el desarrollo de métodos robustos
Protocolo clásico: Un factor cada vez
- Columna arbitraria
- Para una separación rápida
y poco desarrollada
- Rápido
- Fácil de configurar
- Puede no ser robusto
- Poca trazabilidad del proceso
Protocolo sistemático
- Configuración predefinida
- Explorar/probar/optimizar
- Proceso controlado
- Equilibrio rapidez / robustez
- Pueden no probarse las mejores condiciones
- Puede necesitar más optimización
Quality by Design (QbD)
- Enfoque estadístico
- Para métodos rutinarios
- Exhaustivo
- Conocimiento de la robustez
- Gestión del riesgo
- Necesidad de software QbD
- Más procesamiento
- Los resultados se tienen que confirmar
Pros
Contras
Mayor garantía sobre la robustez del método
©2014 Waters Corporation 36
¿Qué es un protocolo sistemático?
pH ácido
pH básico
Exploración rápida CSH C18
Gradiente estándar
pH ácido/básico
Optimización Gradiente Temperatura Otros
parámetros
Screening 4-6 Columnas
ACN y MeOH
CORTECS C18+
HSS T3
CSH Phenyl-Hexyl
BEH C18
CORTECS C18+
HSS T3
CSH Phenyl-Hexyl
BEH C18
Procesar de datos en Empower
Elija el mejor resultado basado en los criterios
Defina la muestra y los criterios de separación
(ACN) (MeOH)
¿No se retienen?
Utilizar método HILIC
Procesar de datos en Empower
Elija el mejor resultado basado en los criterios
HSS C18
HSS PFP
opcional
Preparación de muestras
©2014 Waters Corporation 37
¿Qué hace Quality by Design?
Software Fusion Method Development
Enfoque estadístico en el diseño de
experimentos para el desarrollo de
métodos
Plantillas sencillas
Automatiza la creación de sample sets y
method sets en Empower
Facilita el análisis de los datos
Beneficios:
– Identifique las áreas de cumplimiento
del rendimiento del método y las
limitaciones (riesgo)
– Robustez del modelo
– Descubra los parámetros de
variabilidad y los límites de
cumplimiento
[3] Establece el espacio de diseño
Define las condiciones óptimas
Identifica un espacio de operación robusto
[2] Desarrolla el espacio de conocimiento
Genera el diseño del experimento
Identifica el rendimiento medio del
método
[1] Defina el experimento
Seleccione las variables
experimentales
Pre-defina los objetivos de separación
©2014 Waters Corporation 38
El método
funciona en estas
dos regiones
COndiciones de máximo rendimiento del método
El gráfico muestra las
regiones donde se
cumplen los criterios
especificados de
rendimiento del
método
©2014 Waters Corporation 39
Espacio de diseño
de la robustez del
método
Rendimiento y robustez del método óptimos
©2014 Waters Corporation 40
AU
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
Minutes
1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
1.59
1
2.22
9
2.83
3
3.28
6
3.73
3
4.12
5
4.31
0
4.48
24.
594
Imp
A -
4.73
8
Imp
B -
4.94
7
AP
I 1 -
5.18
9
AP
I 2 -
5.66
1
Last
peak
- 6.
128
ACQUITY UPLC con software Fusion - 3 columnas
- Gradientes
- Composiciones de la fase móvil
- pH
- Flujo
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
0.060
0.070
Minutes
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00
HPLC -10 columnas
- Gradientes
- Composiciones de la fase móvil
HPLC:
45 días
UPLC:
2 días
El proceso de desarrollo de métodos es muy largo…
¡Combine UPLC y Fusion para obtener la máxima información en el
mínimo tiempo!
©2014 Waters Corporation 41
Transferencia
Evaluación de los datos
TRATAMIENTO, EVALUACIÓN Y
RECUPERACIÓN DE DATOS:
Empower3
FLEXIBILIDAD INSTRUMENTAL:
Sistema H-Class y químicas
escalables
Métodos robustos
Separación
Detección
Optimizar los elementos clave
SOLUCIONES INTEGRALES DE
Waters - - -
Métodos robustos y más
rápidos
QUÍMICAS ROBUSTAS Y
FIABLES:
Máxima selectividad
COMBINAR UV y MS PARA
OBTENER LA MÁXIMA
INFORMACIÓN:
ACQUITY QDa