Claves en el Desarrollo de Métodos LC - ucm.es Developm… · analizando datos MS y UV...

©2014 Waters Corporation 1

Claves en el Desarrollo de Métodos LC

Consejos prácticos


Métodos problemáticos

Consecuencias de un método mal desarrollado

– Calidad

o Datos no fiables, necesidad de re-analizar muestras

o Resultados fuera de especificaciones, investigaciones

o Dificultad para transferir métodos

– Coste

o Solicitudes de registro rechazadas, auditorías

o Retrasos en obtención de resultados/liberación de lote y complejidad adicional en el

proceso regulatorio

o Tiempo necesario para volver a desarrollar el método, para revalidarlo y volver a

solicitar el registro

o Desperdicio de recursos

• tiempo del analista, consumibles y tiempo de funcionamiento del instrumento

Un buen método le

proporciona un

buen resultado,

¡siempre!


Aspectos a considerar

¿Los picos

son puros?

¿El método

cumplirá los

criterios?

¿Dónde están

los datos?

¿Estoy viendo

todos los picos?

¿Estoy identificando

correctamente los

picos?

¡Estoy cansado

de inyectar patrones!

¿Hay alguna forma

mejor de hacer el

seguimiento de los

picos?

¿Es

reproducible?

¿El método

es robusto?

¡Los lotes son

muy largos!

¿Obtendré

resultados

exactos?

Método robusto

Separación Detección Evaluación de datos

¿Fallará

en QC?

¿Se podrá

transferir

fácilmente?

¿Mi sistema es

suficientemente

flexible?

¿Utilizo la

columna

adecuada?

¿Estoy separando

todos los analitos?

¿Mi sistema

funciona

correctamente?

¿La columna está

en buen estado?

Transferencia


Evaluación de datos

Métodos robustos

Separación

Detección

Esquema

Transferencia


Separar todos los analitos… lo más rápido posible

Maximice la selectividad combinando distintas columnas, modificadores orgánicos y pH

Minutes 0.00 1.20 2.40 3.60 4.80

I

A

P

Fl

Fe

D O

I

A

P

Fl

Fe

D

O

CSH C18

pH 3, ACN

CSH Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH

P: 1-pyrenesulfonic acid Fe: fenoprofen D: diclofenac I: Imipramine A: Amitriptyline Fl: Flavone O: Octanophenone

No sabía que podía

trabajar con pH altos…

¡Solo tiene que usar

una columna de

partícula híbrida!


31

1.1

29

5.1

34

8.9

31

3.1

3

28

.1

35

5.1

3

70

.1

AU

0.00

0.05

31

1.0

29

5.1

34

9.1

3

28

.0

34

9.2

32

8.1

3

28

.1 31

3.1

37

0.2

35

5.1

AU

0.00

0.05 3

11

.0

29

5.1

31

1.1

32

8.1

3

13

.1

37

0.2

3

55

.1

AU

0.00

0.05

31

1.1

29

5.1

34

9.0

3

12

.7

32

8.1

31

3.1

37

0.1

35

5.1

AU

0.00

0.05

Minutes

1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60

Una columna C18 genérica no es suficiente

CSH C18

CORTECS™ C18+

CSH Phenyl Hexyl

HSS PFP

Pruebe distintas

columnas, ligandos y

tecnologías de

partícula para

identificar la mejor

separación más rápido

Mayor número de picos resueltos

* Masa principal del pico


¿Qué pasa si hay co-eluciones?

m/z 312.0

m/z 330.1

m/z 344.1

31

2.0

Inte

nsity

0

5x10 8

33

0.1

Inte

nsity

0

5x10 8

34

4.1

Inte

nsity

0

5x10 8

Minutes

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

Detección UV

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

Minutes

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50

Paroxetine + related compounds

Utilice detectores complementarios: la detección de masas combinada con la

detección UV premite identificar coeluciones

rápidamente

Desarrollé un método... Había una coelución y ¡tuve que empezar de

nuevo!



Comprobar si la columna funciona correctamente...

Registrar el historial de la columna e-Cord

Usar un patrón certificado para evaluar el rendimiento de las columnas usadas

Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM)

El mejor procedimiento

es usar una columna

nueva caracterizada

en su propio sistema

AU

0.00

0.02

0.04

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Normal Operation

Failing Column

Ac

eto

ne

Ac

eto

ne

Na

ph

tha

len

eN

ap

hth

ale

ne

Ac

en

ap

hth

en

e

Ac

en

ap

hth

en

e

AU

0.00

0.02

0.04

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Normal Operation

Failing Column

Ace

ton

eA

ceto

ne

Nap

hth

ale

ne

Nap

hth

ale

ne

Ace

nap

hth

en

e

Ace

nap

hth

en

e

AU

0.00

0.02

0.04

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Normal Operation

Failing Column

Ace

ton

eA

ceto

ne

Nap

hth

ale

ne

Nap

hth

ale

ne

Ace

nap

hth

en

e

Ace

nap

hth

en

e


Glucosamina

Altamente polar

Fase reversa

HPLC

Inte

nsity

0

50000

100000

150000

200000

(in void)

Modo HILIC

Inte

nsity

0.0

45000.0

90000.0

135000.0

180000.0 Glucosamina

Altamente polar

Verificar la retención de los compuestos

Minutes

AU

0.00

0.07

0.14

0.21

0.28

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

Vitamina D3

Altamente apolar Fase Reversa

HPLC

Suplemento vitamínico con Glucosamina y Vitamina D3

Utilice el modo de

separación adecuado –

HILIC para compuestos

altamente polares

//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/79/Cholecalciferol.svg


Separación

Detección

Esquema

Métodos robustos


Transferencia


Detectar todos los analitos

La memantina no tiene cromóforos y requiere

técnicas de detección alternativas a la UV

Su

lfa

dim

eth

oxin

e -

31

1.0

0

Re

se

rpin

e -

60

9.2

9

Te

rfe

na

din

e -

47

2.3

1

AU

0.00

0.12

0.24

0.36

0.48

Me

ma

ntin

e -

18

0.1

1

Su

fad

ime

tho

xin

e -

31

1.0

4

Re

se

rpin

e -

60

9.2

7

Te

rfe

na

din

e -

47

2.3

5

Inte

nsity

0

2x107

4x107

6x107

8x107

Minutes0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

Detección UV

Su

lfa

dim

eth

oxin

e -

31

1.0

0

Re

se

rpin

e -

60

9.2

9

Te

rfe

na

din

e -

47

2.3

1

AU

0.00

0.12

0.24

0.36

0.48

Me

ma

ntin

e -

18

0.1

1

Su

fad

ime

tho

xin

e -

31

1.0

4

Re

se

rpin

e -

60

9.2

7

Te

rfe

na

din

e -

47

2.3

5

Inte

nsity

0

2x107

4x107

6x107

8x107

Minutes0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

Detección de masas

No se pierda nada –

utilice técnicas de

detección

complementarias

(UV y MS)


http://en.wikipedia.org/wiki/File:Memantine.svg


Patrones individuales para identificar cada pico secuencias de análisis

largas

me

top

rolo

l - 2

68

.3

pa

pe

ravin

e -

34

0.2

bro

ma

ze

pa

m -

31

6.0

me

da

ze

pa

m -

27

1.2

do

xe

pin

- 2

80

.3

oxa

ze

pa

m -

28

7.0

loa

ze

pa

m -

32

1.0

am

itri

pty

line

- 2

78

.3

tem

aze

pa

m -

30

1.0

clo

mip

ram

ine

- 3

15

.2

dia

ze

pa

m -

28

5.2

AU

0.000

0.008

0.016

0.024

0.032

Minutes

1.90 2.28 2.66 3.04 3.42 3.80 4.18 4.56 4.94 5.32

11 patrones en 11 inyecciones distintas solo con detección UV (1hr 39 min) Ahorro del 91%

de tiempo vs.

11 patrones en una sola inyección con detección UV y MS (9 min)

Ahorre tiempo

obteniendo más

información en una

inyección



Seguir cada compuesto a lo largo del proceso de desarrollo

pH 3

pH 9.5

34

0.3

31

8.0

27

1.1

28

0.2

29

6.2

30

1.1

27

8.2

28

5.1

3

15

.2

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

31

9.0

26

8.3

28

7.1

34

0.3

30

1.1

28

5.1

28

0.2

27

1.1

27

8.2

31

5.2

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Minutes

2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

Realice el

seguimiento de sus

picos de manera

fácil y rápida con

información MS

Los picos se

mueven y no

puedo

indentificarlos



Identificar correctamente los picos

Confirme la identidad de los

picos con Empower®

analizando datos MS y UV

conjuntamente



Evaluación de los datos

Esquema

Métodos robustos

Separación

Detección

Transferencia


Evaluación consistente de los datos

La integración Apex Track de Empower permite realizar una integración

fácil y reproducible de picos coeluidos de manera automática.

Integración tradicional

Integración ApexTrack


Verificar los criterios de calidad de la separación

Observando los cromatogramas creía

haber elegido las mejores condiciones,

pero no lo eran…

¡No haga

suposiciones!

Utilice los campos

personalizados de

Empower para

identificar las mejores

condiciones


Verificar que no hay coeluciones

Los picos parecían

homogéneos pero en

QC detectaron que no lo

eran.

Apex

Trailing

Verifique la

homogeneidad de los

picos utilizando los

datos UV y MS en

Empower Leading


Recuperar los datos

Organice los datos por proyectos

Consultas basadas en cualquier combinación de metadatos

– Comodines

– Rangos de datos

Base de datos relacional

Realicé mis experimentos la semana pasada… ¿cuáles eran las

mejores condiciones?



Esquema

Métodos robustos

Separación

Detección

Transferencia


Transferir métodos: Entre equipos - Entre laboratorios

La clave para una buena transferencia de métodos

son un método robusto y una validación hecha en

distintos instrumentos

Pequeñas diferencias en la configuración o el rendimiento

entre sistemas puede provocar variaciones en los resultados

– El desgaste del instrumento o la columna

– Cambios en el tamaño y la longitud de la tubería

– Contaminación


Verificar el funcionamiento del sistema

AU

0.00

0.05

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Minor LeakSystem Pressure: ~6400 psi

Normal OperationSystem Pressure: ~ 6600 psi

Ac

eto

ne

Ac

eto

ne

Na

ph

tha

len

e

Na

ph

tha

len

e

Ac

en

ap

hth

en

e

Ac

en

ap

hth

en

e

Posibles problemas:

• Fugas

• Conexiones gastadas

• Columnas envejecidas

• Contaminación cruzada

• Celda sucia

• Errores en la fase móvil

• Burbujas de aire

• Otros

Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM)

Desarrolle los métodos y transfiéralos en sistemas

que estén funcionando correctamente


Equipos flexibles Evitar cambios en la

configuración del sistema

ACQUITY® H-Class (como HPLC)

4.6 x 100mm 3.5µm Xterra® MS Phenyl

Flow rate: 1mL/min

Water/Acetonitrile/100mM amm. bicarb. pH 10

UV detection at 280 nm

ACQUITY H-Class (como UPLC) 2.1 x 75mm 1.7 µm ACQUITY UPLC CSH C18

Flow rate: 0.6 mL/min

ACN: MeOH: Water (44:40:28)

UV detection at 254nm

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

Minutes

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

Caffeine metabolites

Tioconazole and

Related Compounds

Reduzca la variabilidad – utilice un solo sistema tanto para métodos

HPLC como para métodos UPLC


Optimizar la robustez para una mejor transferencia de métodos

5 µm – 150 mm

L/dp = 30,000

Flow rate = 0.2 mL/min

Rs (2,3) = 2.28

3.5 µm – 100 mm

L/dp = 28,571


Rs (2,3) = 2.32

1.7 µm – 50 mm

L/dp = 29,412


Rs (2,3) = 2.29

Desarrolle métodos con

químicas escalables

para facilitar las

transferencias de

métodos

Desarrollé un método

en HPLC, y ahora no puedo

transferirlo porque no hay una

columna UPLC equivalente

Las químicas de columna BEH/CSH/HSS son directamente escalables


Métodos robustos

Esquema

Separación

Detección Evaluación de datos

Transferencia


Finalmente… un método robusto

ACQUITY UPLC H-Class ACQUITY CSH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm

Column at 30°C

0.1% Formic acid, pH 2.5

0 – 87.5% ACN in Water over 5 min

Ziprasidone peroxide degradation

Utilice Empower

Method Validation

Manager (MVM) para

automatizar los

ensayos de validación


Validación: un trabajo tedioso

Compilación de

informes

Preparación de

patrones y muestras Gestión de los datos

PNT de validación

de métodos

corporativo

Cálculo de resultados

estadísticos

Creación de la

secuencia de

muestras

Adquisición y procesamiento

de datos

Method Validation

Manager


¿Crear un método robusto es solo cuestión

de aplicar estos trucos y consejos?


Métodos robustos - Equipo fiable

ACQUITY® UPLC H-Class para desarrollos de método rápidos y fiables

Gestor de columnas

— Hasta 6 columnas

— Evite tener que montar y

desmontar columnas

— Químicas de 5µm a sub-2µm

— Diferentes modos de

calentamiento para minimizar

problemas de transferencia

Detectores ACQUITY

— PDA, TUV, FLR, ELSD, RI,

QDa™

— Flexibilidad modular

— Facilidad de uso

Sistema fiable y de calidad

Métodos HPLC o UPLC

Bomba cuaternaria

— Composiciones de fase móvil

constantes con la tecnología

Auto•Blend™

— Válvula selectora de solvente

opcional (hasta 9 líneas)


Fiabilidad en el control de las condiciones cromatográficas

Pequeños cambios en la preparación de la fase móvil

pueden afectar a la robustez del método

pH 3.0

pH 3.2

268.2

340.3

318.0

271.1

280.2

301.1

278.2

285.1

315.2

AU

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

268.2

340.3

316.0

271.1

280.2

287.1

278.2

315.2

285.1

AU

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

Minutes

1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40

* Masa en la base del pico

Inyección #1

Injección #2


Agua

1% NH4OH 1% FA

Acetonitrilo Agua

1% NH4OH 1% FA

Acetonitrilo

95%

5%

0%

0%

45%

5%

50%

0%

100% Agua

0% Acetonitrilo

0.05% Ácido Fórmico

50% Agua

50% Acetonitrilo

0.05% Ácido Fórmico

El sistema debe controlar la composición de la fase móvil de manera exacta

La tecnología Auto•Blend está integrada en el sistema ACQUITY H-Class


Incorporar un detector de masas

QDa

PDA

Detector ACQUITY QDa

Detección de masas

m/z 30 a 1250

Mantenimiento mínimo

ESI ± Pre-optimizado

Mínima intervención del usuario

Pulsar el botón de encendido

Rápida puesta a punto

¡Listo!

Si puede usar un PDA, ¡puede usar un QDa!

Modular, ocupa poco espacio


Evaluar la columna a elegir

Waters es fabricante

primario de partículas de

sílice e híbridas – desde la

materia prima hasta el

producto acabado

Se fabrican lotes pequeños

de 1 - 2 Kg para monitorizar

cuidadosamente los

parámetros que tienen un

impacto en la variabilidad

del proceso

ACQUITY UPLC BEH C18 Coverage

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Batch

Liga

nd

De

nsi

ty [

µm

ol/

m2

]

UCL

LCL

Base/Neutral Selectivity

0.100

0.105

0.110

0.115

0.120

0.125

0.130

0.135

0.140

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Batch

Pro

pra

no

lol/

ace

nap

hth

en

e [

Alp

ha]

UCL

LCL

Gráfico del proceso de control de 85 lotes de columnas ACQUITY

UPLC BEH C18

¡Minimice el riesgo de variabilidad de un método

desarrollando columnas de calidad!


Métodos válidos a largo plazo A

U

-0.010

0.000

0.010

AU

-0.010

0.000

0.010

AU

-0.010

0.000

0.010

Minutes

1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20

Lote 101

Lote 103

Lote 109

Pruebe tres columnas con el mismo relleno, de lotes distintos,

utilizando los kits de validación de métodos para validar a fiabilidad

del método a largo plazo


Proceso: Optimizar el desarrollo de métodos robustos

Protocolo clásico: Un factor cada vez

- Columna arbitraria

- Para una separación rápida

y poco desarrollada

- Rápido

- Fácil de configurar

- Puede no ser robusto

- Poca trazabilidad del proceso

Protocolo sistemático

- Configuración predefinida

- Explorar/probar/optimizar

- Proceso controlado

- Equilibrio rapidez / robustez

- Pueden no probarse las mejores condiciones

- Puede necesitar más optimización

Quality by Design (QbD)

- Enfoque estadístico

- Para métodos rutinarios

- Exhaustivo

- Conocimiento de la robustez

- Gestión del riesgo

- Necesidad de software QbD

- Más procesamiento

- Los resultados se tienen que confirmar

Pros

Contras

Mayor garantía sobre la robustez del método


¿Qué es un protocolo sistemático?

pH ácido

pH básico

Exploración rápida CSH C18

Gradiente estándar

pH ácido/básico

Optimización Gradiente Temperatura Otros

parámetros

Screening 4-6 Columnas

ACN y MeOH

CORTECS C18+

HSS T3

CSH Phenyl-Hexyl

BEH C18

CORTECS C18+

HSS T3

CSH Phenyl-Hexyl

BEH C18

Procesar de datos en Empower

Elija el mejor resultado basado en los criterios

Defina la muestra y los criterios de separación

(ACN) (MeOH)

¿No se retienen?

Utilizar método HILIC

Procesar de datos en Empower

Elija el mejor resultado basado en los criterios

HSS C18

HSS PFP

opcional

Preparación de muestras


¿Qué hace Quality by Design?

Software Fusion Method Development

Enfoque estadístico en el diseño de

experimentos para el desarrollo de

métodos

Plantillas sencillas

Automatiza la creación de sample sets y

method sets en Empower

Facilita el análisis de los datos

Beneficios:

– Identifique las áreas de cumplimiento

del rendimiento del método y las

limitaciones (riesgo)

– Robustez del modelo

– Descubra los parámetros de

variabilidad y los límites de

cumplimiento

[3] Establece el espacio de diseño

Define las condiciones óptimas

Identifica un espacio de operación robusto

[2] Desarrolla el espacio de conocimiento

Genera el diseño del experimento

Identifica el rendimiento medio del

método

[1] Defina el experimento

Seleccione las variables

experimentales

Pre-defina los objetivos de separación


El método

funciona en estas

dos regiones

COndiciones de máximo rendimiento del método

El gráfico muestra las

regiones donde se

cumplen los criterios

especificados de

rendimiento del

método


Espacio de diseño

de la robustez del

método

Rendimiento y robustez del método óptimos


AU

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

Minutes

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00

1.59

1

2.22

9

2.83

3

3.28

6

3.73

3

4.12

5

4.31

0

4.48

24.

594

Imp

A -

4.73

8

Imp

B -

4.94

7

AP

I 1 -

5.18

9

AP

I 2 -

5.66

1

Last

peak

- 6.

128

ACQUITY UPLC con software Fusion - 3 columnas

- Gradientes

- Composiciones de la fase móvil

- pH

- Flujo

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

0.050

0.060

0.070

Minutes

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00

HPLC -10 columnas

- Gradientes

- Composiciones de la fase móvil

HPLC:

45 días

UPLC:

2 días

El proceso de desarrollo de métodos es muy largo…

¡Combine UPLC y Fusion para obtener la máxima información en el

mínimo tiempo!


Transferencia

Evaluación de los datos

TRATAMIENTO, EVALUACIÓN Y

RECUPERACIÓN DE DATOS:

Empower3

FLEXIBILIDAD INSTRUMENTAL:

Sistema H-Class y químicas

escalables

Métodos robustos

Separación

Detección

Optimizar los elementos clave

SOLUCIONES INTEGRALES DE

Waters - - -

Métodos robustos y más

rápidos

QUÍMICAS ROBUSTAS Y

FIABLES:

Máxima selectividad

COMBINAR UV y MS PARA

OBTENER LA MÁXIMA

INFORMACIÓN:

ACQUITY QDa


Waters Xevo TQ MS

Claves en el Desarrollo de Métodos LC - ucm.es Developm… · analizando datos MS y UV...

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