Post on 20-Oct-2020
CLAUDINE BANVILLE
EFFLET DE DIPFÉRE~ES M&THODES D ' A ~ D ~ ~ I O I . DE LA WTAMINE D AU LAIT DE FROMAGERIE SUR LA RÉTETION ET LA STABUIT~ DE CETTE WTAMINE LOR8 DE LA PRODWCTIOW ET
DE LA MATURATION DU CHEDDAR.
Mémoire présente
à la Faculté des études supérieures de l'Université U v a l
pour l'obtention du grade de maitre es sciences (M. SC.)
Département de l'alimentation et de la nutrition FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITE LAVAL
O Claudine Banville, 1999
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Canadâ
Une méthode d'analyse de la vitamine D a été testée, à l'aide de la
spectroscopie en moyen infrarouge, afin de réduire le temps d'analyse et
d'améliorer la précision de l'analyse de la vitamine D. Cependant, la vitamine
D en faible concentration ( 0 , O l pg/rnl) n'a pas pu ëtre détectée de manière
fiable et précise lorsqu'elle est ajoutée a des produits complexes comme le
lait,
La fabrication de fromage cheddar e ~ c h i de vitamine D a été testée avec
trois méthodes d'incorporation différentes de la vitamine D au lait de fromagerie: l'addition de vitamine D sous forme d'une émulsion
hydrosoluble, l'addition de vitamine D homogénéisée dans une portion de
crème et enfui l'addition de vitamine D encapsulée dans les liposomes afin de
maximiser la rétention de la vitamine dans le caillé et ainsi minimiser la
perte de la vitamine D dans le lactosérum. L'encapsulation de la vitamine D
dans les liposomes a permis une meilleure rétention de la vitamine dans le
caillé. La contamination du lactosérum par la vitamine D est inférieure au seuil de détection de la méthode HPLC. L a vitamine D est demeurée rehtivement stable dans les fromages pendant une période d'aflnnage de 4
mois,
AVANT PROPOS
Dans le cadre d'une maîtrise, il y a bien plus que le plan professionnel qui est implique, le pian personnel y joue un rôle très important. Les
connaissances acquises lors d'une maitrise nous permettent de faire face a
d'éventuelles situations problématiques.
L'atteinte des buts f ~ é s ne se fait pas seul, I'aide d'autrui est souvent
nécessaire. Je profite de I'occasion pour remercier tous ceux qui. de près ou
de loin, m'ont aidé et ont contribue à l'aboutissement de ma recherche. Par
crainte d'oubli, je ne nomme personne. J'espère qu'ils se reconnaîtront et
qu'ils seront témoins à leur juste valeur de ma reconnaissance.
TABLE DE8 MATI&RES
=SUME ..................... .... ......................................................... .................................................................................. AVANT PROPOS
TABLE DES MATIÈRES ................................................................... LISTE DES FIGURES .......................................................................... LISTE DES TABLEAUX .......................................................................
.................................................... INTRODUCTION ................... ........ CHAPITRE I - REW E DE LITTÉRATURE ............................................
................................................ 1.0 La vitamine D .............................
l
1 .1 0.2 Cholécalciférol cristalline ........................................
Historique .......................................................................... . . Propnetes chimiques ..........................................................
Sources de vitamine D ................... .. .. .. ....................... Mécanismes d'absorption de la vitamine D ....................... Rôle physiologique de la vitamine D ................................... kvaluation du statut en vitamine D .................................... Hype~taminose ................................................................ Déficience en vitamine D .................................................... Instabilité de la vitamine D ... .............................................. Formes commerciales de vitamine D ..................................
................................................................... 1.10.1 Vitex-D
Fabrication fromagère ................................................................ 2.1 Étapes principales de la transformation du lait en fromage .
......................... 2.1.1 La préparation du lait de nomagerie 2.1.2 La coagulation .......................................................... 2.1.3 L'égouttage du caillé ................................................. 2.1 -4 Le salage du caiile .................................................... 2.1.5 L'affinage du fromage ................... .. .......................
2.2 Traitement et valorisation du lactosérum de fromagerie ......
3 . 0 L'encapsulation dans les liposomes ................... .... ............. 3.1 Défmition des liposomes ....................................................
....... 3.2 Structure et propriétés des liposomes ................ .. 3.3 Prolipo-Duo" ...................... ............. ............................ 3.4 Efficacité d'encapsulation des liposomes ............................ 3.5 Applications et effets protecteurs des liposomes ................
4 . 0 Spectroscopie en moyen infrarouge ......................................... Historique ..........................................................................
4.2 Théorie générale de la spectroscopie infrarouge .................. 4.3 Spectromètre a transformée de Fourier (FT-IR) ................... 4.4 Analyse quantitative par moyen infrarouge .................... 4.5 Uülisations de la spectroscopie en moyen infrarouge dans
..... ....................... le secteur des produits laitiers .... ......................................................... But. hypothèse et objectifs
COMPAMSON OF DIFFERENT METHODS FOR FORTIFICATION OF CHEDDAR CHEESE WITH WTAMIN D
.................................................................................... Abstract Résumé .....................................................................................
....................................... ................... Introduction .............. Materials and methods .............................................................. Results and discussion ..............................................................
................................................................................ Conclusion
CHAPITRE III
D&I'ERMINATION DE LA TENEUR EN VITAMINE D DANS LE LAIT PAR SPECTROSCOPIE EN MOYEN INFRAROUGE (FT-IR)
...................................................................................... Résume Introduction ............................................................................... Matériel et méthodes .................................................................. Résultats et discussion ............................................................... Conclusion .................................................................................
.................................................................. CONCLUSION GÉNERALE BIBLIOGRAPHIE GI~NÉRALE ..............................................................
LISTE DE8 FIGURES
CHAPITRE 1
Figure 1.1
Figure 1.2
Figure 1.3
Figure 1.4
Figure 1.5
Figure 1.6
Figure 1.7
Structures chimiques de la vitamine D2 et D3 ..................... Schéma typique d 'une fabrication de fromage Cheddar.. .... Structure d'un liposome .................. .... .... .... ............ Concept de base de la méthode de production de Pro-
liposomes .......................................................................... Types de vibrations moléculaires ............................. ... ....
Schéma du principe du spectromètre infrarouge a
transformée de Fourier (FT-IR) basé sur I'interféromètre
de Michelson ..................................................................... Relation entre la
infrarouge et la
déterminée par une
concentration prédite par I'anatyse
concentration réelle du compose
méthode de référence.. ........................
CHAPITRE U
Figure 2.1 Microstructure of a liposome Rolipo-Duom ....................... ........ Figure 2.2 Concentrations of vitamin D in experimentai cheeses
CHAPITRE III
Figure 3.1 Spectres de differentes concentrations de vitamine
D dans l'eau déionisée a une longueur d'ondes de .......................................................................... 1643 cm-1
Figure 3.2
Figure 3.3
Figure 3.4
Figure 3.5
Figure 3.6
Relation entre la concentration en vitamine D de
référence et la concentration en vitamine D prédite par
l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait a 3,s % de matière grasse (26/06/97) en ordre croissant de
.................................................................... concentration
Relation entre la concentration en vitamine D de
dference et la concentration en vitamine D prédite par
I'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait
pasteurisé et homogénéisé a 2 % de matière grasse ................ (061 1 1/97) en ordre croissant de concentration
Relation entre la concentration en vitamine D de
référence et la concentration en vitamine D prédite par
l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait
pasteurisé et homogénéisé à 2 % de matière grasse
................ (26 /O 1 /98) en ordre croissant de concentration
Reiation entre la concentration en vitamine D de
référence et la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait
pasteurisé et homogénéisé a 2 % de matière grasse (30 / 0 1 198) en ordre croissant de concentration ................
Relation entre la concentration en vitamine D de
référence et la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen idkarouge (M-IR) dans un lait pasteurisé et homogénéisé à 2 % de matière grasse
................ (22 / 04/98) en ordre croissant de concentration
Figure 3.7 Relation entre la concentration en vitamine D de
référence et la concentration en vitamine D prédite par
l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait
pasteurise et homogénéisé à 2 % de matière grasse
(23/04/98) en ordre croissant de concentration ................ 79
Figure 3.8
Figure 3.9
Figure 3.10
Figure 3.11
Figure 3.12
Concentration en vitamine D de référence en fonction de
la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en
moyen infrarouge (M-IR) dans un lait à 2 % de matière
grasse en ordre croissaqt de concentration ........................ 82
Concentration en vitamine D de référence en fonction de
la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en
moyen infrarouge (M-IR] dans un lait à 2 % de matière
grasse en ordre aléatoire de concentration ...................... ... 83
Concentration en vitamine D de référence en fonction de
la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en
moyen infrarouge (M-IR) dans I'eau déionisée en ordre croissant de concentration ................................................
Concentration en vitamine D de référence en fonction de
la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans I'eau déionisée en ordre
aléatoire de concentration ................................................. 85
Concentration en vitamine D de référence en fonction de
la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen infhmuge (M-IR) dans un lait écrémé en ordre
missan t de concentration .............................m...........-...... 86
Figure 3.13 Concentration en vitamine D de référence en fonction de
la concentration en vitamuie D prédite par l'analyse en
moyen infmuge (M-IR) dans un lait écrémé en ordre 87
aléatoire de concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . .. . . .. . . . . . . . . .. .. . . . . . . .
LISTE DES TABLEAUX
Page
CHAPITRE II
Table 2.1
Table 2.2
Table 2.3
Table 2.4
Table 2.5
Table 2.6
Table 2.7
Table 2.8
..... Protein (Yo) and fat (Yo) composition of milk and whey.. Mass balance of fat (9%) and protein (%) ............................ Characterization of the immobiîization of vitamin D in
liposome prepared with Proiipo-Duom ............................ Chernical composition of cheeses (%) ................... ... .. The effect of different types of methods of addition of
vitamin D on cheese yield and moisture content of ............................ cheese ..................................... ......
Analysis of variance : Significant factors of the cheese
composition ................... ... ................................. .. .... Vitamin D concentrations in milk and cheese for
experimen ta1 cheese productions ..................................... Analysis of variance : Signifcant factors influencing
vitamin D concentration in cheese ..................... ......
CHAPITRE RI
Tableau 3.1 Formulation des échantillons de caübration pour le
dosage de la vitamine D dans le lait pasteurisé dans la
gamme de concentration de O a 10,O pg/ml, pour avoir
un volume de Vitex-D + prémélange fixe dans chaque
....................................................................... échantillon 72
INTRODUCTION
11 est bien connu que chez les marnniifères la vitamine D a deux origines :
l'une endogène résultant de la synthèse épidermique sous l'action des rayons
ultraviolets solaires, l'autre exogène provenant des nutriments. La vitamine D
étant très importante physiologiquement, il est nécessaire d'avoir un apport
en vitamine D par l'alimentation dans les pays nordiques, comme le Canada.
Les aliments naturels non enrichis en vitamine D sont relativement pauvres
en cette vitamine, sauf les huiles de poissons, les œufs crus et certaines
viandes ; il est illusoire d'atteindre un apport important en vitamine D par les
aliments (Miravet, 1989; LaBeil, 1994). Les laits de consommation enrichis
constituent la principale source alimentaire de vitamine D au Canada. Cependant, la consommation de lait a diminue considérablement depuis une
quinzaine d'années (Tanner et COU., 1988). De plus, la consommation de lait
diminue fortement avec l'âge de la population.
Le niveau actuel de vitamine D semble suffire aux besoins des enfants et de
la plupart des adultes. Par contre, les personnes âgées et les très jeunes
enfants sont plus sensibles à des carences vitaminiques ou à des doses trop
élevées. Une carence prolongée en vitamine D provoque le rachitisme
infantile et I'ostéomalacie chez l'adulte alors qu'une dose excessive de
vitamine D résulte en une hypercalcemie (Chesney, 1989).
Le fromage Cheddar est le produit laitier, autre que le kit, qui est le plus
largement consommé au Canada (IDF, 1997). Ann de rejoindre l'ensemble de
la population et en particulier les personnes plus âgées qui consomment peu
de lait, il serait important de trouver un aliment de consommation générale
dont l'enrichissement en vitamine D pourrait être possible. Le but de cette
recherche est de produire un fromage de type Cheddar enrichi en vitamine D.
L a variabilité de la stabilité de la vitamine D étant régulièrement remise en question, il sera donc important de trouver un procédé qui protégera la
vitamine lors de la fabrication fromagère ainsi que durant l'affinage du
fromage, jusqu'à la consommation. Une attention particulière a été portée
sur la mesure de la rétention de la vitamine D dans le caillé et des pertes
dans le lactosérum. Le lactosérum étant la plupart du temps réutiiisé en
industrie, il subit divers traitements de fractionnement-concentration pour
produire des poudres de lactosérum entier, de perméat et de protéines de
lactosérum. La vitamine D du lactosérum sera égaiement éventuellement
concentrée, ce qui risque d'être problématique pour une utilisation
ahmentaire subséquente du lactosérum ou de ses produits séchés, car une
surdose en vitamine D peut être toxique.
L'objectif'de cette recherche a été de comparer da'érentes technologies pour
produire un fromage enrichi en vitamine D, en vue d'en sélectionner une qui
sera simple, économique, efficace et facilement utilisable au niveau
industriel.
L a rétention de la vitamine D dans le CFUIIIé lors de la production fromagère a
été expérimentée en ajoutant la vitamine D sous trois formes différentes au
lait de fromagerie ; sous forme d'un produit commercial de vitamine D
hydrosoluble, encapsulée dans des liposomes et, enfui, homogénéisée dans
une parüe de la crème utilisée pour la standardisation du lait de fromagerie.
CHAPITRE 1
1.0 La vitamine D
1 . 1 Historique
Le rachitisme, maladie causée par une déficience en vitamine D, est apparu
depuis les temps anciens. Les premières descriptions scientifiques du
rachitisme ont été écrites par Daniel Whistler en 1645 et par Francis Glisson
en 1650. Le rachitisme est devenu un problème de santé en Europe du Nord, en Angleterre et aux États-unis durant la révolution industrielle alors que les
gens vivaient en zone urbaine en présence de peu de soleil et beaucoup de
poliution de l'air (Noman, 1979). La distinction entre le facteur
antixérophthalmique, la vitamine A, et le facteur antirachitique, la vitamine D, a été démontrée dès 1922 par l'équipe de McCoUum (McCollum, 1922).
Peu après, deux groupes de recherche (Steenbock et Black, 1924 ; Hess et
Weinstock, 1925) ont remarqué que la lumière semblait produire un
changement chimique permanent à un composé de la diète et de la peau. Ils ont proposé que la provitamine D existe et qu'eue pouvait être convertie en
vitamine D par l'absorption des rayons ultraviolets. L'isolement et la
caractérisation de la vitamine D étaient alors possibles. La structure de la
vitamine D2 a été simultanément déterminée par Windaus en Aliemagne (Windaus et cou., 1932) et par Askew en Angleterre qui la nomma
ergocalcifërol (Askew et coll., 1932). Windaus (1936) identifia la structure de
la vitamine D contenue dans l'huile de foie de morue comme Ia vitamine Dg
ou cholécalcifé5rol. La vitamine D est un stéroïde ou plus spécialement un
sécostéroide. Cependant, la relation entre la stnicture et son mode d'action
ne fut réalisée que 30 ans plus tard (Collins et Noman, 1991).
1.2 Propriétés chimiques
La vitamine D existe sous deux formes de sécostéroides, la vitamine D2
( C ~ ~ H W O ) , et la vitamine D3 (CnH440), ainsi que de certains métabolites à
activité biologique (25-hydroxyvitamine D) que l'on trouve dans les aliments
(Figure 1.1) . Le poids moléculaire est de 384,65 Da. Cette molécule est
insoluble dans l'eau, mais soluble dans les solvants organiques. Elle est
instable a la lumière et peut ahsi subir une oxydation si eue est exposée 3
l'air durant 24-72 heures (Ryan et coll., 1995).
1.3 Sources de vitamine D
L a vitamine D peut être consommée dans la diète ou synthétisée par le corps.
Elle peut être ingérée sous forme de vitamine D2, a partir des plantes, et de vitamine D3. provenant de sources animales. La vitamine D2 (ergocalciférol)
est synthétisée a partir de l'ergostérol de tissus végétaux morts exposés aux
ultraviolets ou au soleil. La vitamine D3 (cholécalciférol) est synthétisëe dans la peau a partir du 7-dehydrocholestéro dans une réaction catalysée par la
lumière ultraviolette. Les dew vitamines ont une activité égale, mais dans la
plupart des cas, c'est la vitamine D3 qui constitue la principale source
d'activité biologique dans l'organisme (Fraser, 1983; Ryan et COU., 1995).
ERGOCALCIFEROL VITAMINE D2
CH OLECALCIFEROL VITAMINE D3
Figure 1.1 Structures chimiques des vitamines D2 et D3. Tiré
de Ryan et cou., 1995.
1.4 Mécanismes d'absorption de la vitamine D
Les vitamines D1 et Da, SOUS leur forme mère, n'ont virtuellement pas
d'activité biologique. Elies su bissent deux transformations qui en font des
composés biologiquement actifs (DeLuca, 1988; Collins et Norman, 199 1).
L'absorption de la vitamine D est semblable a celie des autres lipides, c'est-à-
dire, qu'après une emulsification favorisée par les sels biliaires, la vitamine
est absorbée dans l'intestin et transportée jusqu'au foie par le système
lymphatique où une première hydroxylation génère le 25-hydroxyvitamine D.
Le second site important de transformation est le rein où l'enzyme 1-alpha-
hydroxylase produit le 1'25-dihydroxyvitamine D ( 1,25-(OH) 2D). La vitamine
D et ses métabolites circulent dans le plasma sanguin en étant liés a un
porteur spécifique, la protéine furatrice de vitamine D (DBP). La vitamine D
étant liposoluble est entreposée principalement dans le tissu adipeux oii sa
demi-vie est de plus de 3 mois (Lawson et coli., 1986).
1.5 Rôle physiologique de la vitamine D.
Le rôle de la vitamine D dans le système endocrinien est de garder le calcium
et le phosphore dans le sérum à des concentrations qui assurent la
minéraiisation des os, le fonctionnement neuromuscuIaire ainsi que d'autres
processus cellulaires qui dépendent de ces éléments (DeLuca, 1979 ; Henry
et Norman, 1984). Ces effets sont assurés par l'intermédiaire du 1,25-(OH)2D
qui agit sur un récepteur intracellulaire spécifique. Puisque la vitamine D
appartient a la famille des hormones stéroidiennes et qu'elle peut être
synthétisée dans l'organisme, elle a les propriétés d'une hormone aussi bien
que ceîle d'une vitamine. Le 1,25-(OH)2D annule l'effet ripresseur d'un gène dans le noyau des cellules épithéliales de l'intestin afin d'accroitre la
synthèse d'une protéine fixatrice de calcium qui est nécessaire à l'absorption
active du calcium. Ce composé a égaiement un rôle non encore élucidé dans
l'absorption du phosphore. Conjointement avec la parathormone, ii accroît la
résorption des cellules osseuses et la réabsorption du calcium et du
phosphate au niveau des tubes rénaux (Kutsky, 1981 ; Holick, 1996).
1.6 Évaluation du statut en vitamine D
L'apport en vitamine D est un facteur nutritionnel important surtout en
absence du soleil. En plus des variations en fonction de la localisation
géographique et des saisons, les rayons ultraviolets du soleil peuvent être
bloqués de plusieurs façons. Toutefois, chez les personnes âgées
l'ensoleillement reste un facteur prédominant ; s'il est réduit ou insuffisant,
l'apport alimentaire peut représenter la quasi-totalité de la source
vitaminique (Lawson et cou., 1979).
L a vitamine D peut être produite par le corps et elle peut être emmagasinée
sur une Iongue période dans les tissus; il est alors diffiicile de déterminer la
dose quotidienne requise. L a demande en vitamine D est aussi dépendante
de la concentration en calcium et en phosphore dans l'alimentation, du stade
de développement, de Mge, du sexe, du degré d'exposition au soleil et de la
pigmentation de la peau. La quantité de vitamine D recommandée est de
400 UI/jour ou 1 UI correspond à 0,025 pg de vitamine D2 ou DS (UI = unités
internationales) (Collins et Nonnan, 199 1 ; Rosenberry, 1997).
La concentration circulante de 25-OHD constitue le meilleur indicateur
biochimique du statut en vitamine D de I'individu. Des variations
saisonnières de la concentration ui 25-OHD dans le plasma sanguin ont été
observées. De faibles concentrations en 25-OHD ont été observées chez
certaines personnes âgées qui vivent pourtant dans des pays très ensoleillés
(Gibson et COU., 1986). Cela est généraîement attribué au fait que ces
personnes vivent beaucoup à l'intérieur et qu'elles ingèrent peu d'aliments
enrichis en vitamine D. Lors d'une enquëte effectuée au Canada en 1982,
Gibson et cou. ont constaté qu'un certain nombre de femmes ménopausées
vivant à leur domicile avaient un taux sérique moyen de 25-OHD de
16,s ng/ml. Chez 11 % d'entre eiies, cette concentration était inférieure à
10 ng/ml, mais dans aucun cas elle n'était inférieure à 5 ng/mi. Une
concentration inférieure à 10 ng/ml dans l'organisme est considérée comme
étant une faible concentration en vitamine D, bien qu'une concentration de
5 ng/ml paraisse suffisante pour empêcher la manifestation des symptômes
de rachitisme et d'ostéomalacie.
La marge de sécurité dans l'ingestion de la vitamine D est remarquablement
étroite. L'ingestion de produits surfortifiés en vitamine D a long terme peut
être toxique dans I'organisme entrainant des symptômes comme des
faiblesses, la perte d'appétit, la soif inhabituelle, la nausée, les
vomissements, une pression sanguine élevée et une hypercaicémie. Dans les
premiers stades de l'intoxication, les effets sont réversibles. Chez les enfants,
les effets toxiques sont apparents lorsque la quantité excède 1000-2000 UI
(400 üï 10 pg) par jour alors que chez l'adulte le seuil se situe entre 10 000
et 20 000 UI par jour sur une longue période de temps. L'hypervitaminose est
un problème sérieux qui résulte d'une calcification irréversible du cœur, des
poumons, du foie et d'autres tissus mous. L a mort peut éventuellement
survenir (Collins et Norman, 199 1).
1.8 Déficience en vitamine D
Une déficience en vitamine D peut sumenir lorsque l'absorption intestinale et
la réabsorption du calcium et du phosphore sont inadéquates. Elle se produit
lorsque les niveaux de calcium et de phosphore dans le sérum diminuent et
que l'activité de la phosphatase dcaline augmente. Le niveau de calcium
étant faible, I'hyperparathyroidisme s u ~ e n t . L'hormone parathyroïde et le
1,25(OH)& sont toujours présents au début de la déficience, fi s'ensuit une
déminéraikation des os. L a déficience en vitamine D conduit au rachitisme
infantile et a l'osteomaiacie chez l'adulte. Les principaux symptômes associés
au rachitisme : des jambes arquées, des courbures de la colonne vertébrale
ainsi que des déformations pelviennes et thoraciques sont causées par
l'application des mecanismes normaux du stress ainsi qu'a la
déminéralisation osseuse (Colluis et Norman, 199 1).
1.9 Instabilité de la vitamine D
Il est régulièrement question que la variabilité de la vitamine D peut être due
a un enrichissement inadéquat ou a l'instabilité de la vitamine. Certaines
études sur la stabilité de la vitamine D2 ont démontre que des solutions de
propylène glycol vitaminées étaient instables lorsque diluées dans l'eau, mais
stables lorsque diluées dans le lait (Supplee et coll., 1936). D'autres études
sur la stabilité de solutions de propylène glycol et de vitamine D diluées dans
le lait ont montré, a l'aide d'essais biologiques, qu'il nv avait pas de
détérioration de la vitamine D dans le lait après 8 jours conservé à la
température de réfrigération (Huber et Barlow, 1943). Aucune perte de
vitamine D n'avait été observée dans le lait condensé en conserve entreposé à
40°C durant 6 mois ou à la température de la pièce (23'C) durant 15 mois.
L'instabilité de la vitamine D a été observée par Cremin et Power (1985). La
vitamine D était sensible a l'oxydation, a la lumiere et à l'acide. Kutsky
(1981) a démontré que la vitamine D était sensible à I'oxydation et à la
lumière mais stable à l'acide et aux produits alcalins. En revanche, Pike et
Brown (1984) ont montré que la vitamine D etait sensible à l'irradiation et a
l'acide tandis que ia vitamine était stable a l'oxydation et aux produits
alcalins. Enfin, Kreutler (1980) a démontré que la vitamine D était
remarquablement stable et que l'exposition a la lumière, à la chaleur et à
l'oxygène n'affecte pas son activité. L a stabilité de la vitamine D semble étre
très contreversée. L a variabilité de la vitamine D dans le lait pourrait étre due
a une fortification inexacte ou à l'instabilité de la vitamine D,
Bien que plusieurs études aient été effectuées sur des laits de consommation
enrichis en vitamine D et des formules de lait matemisé (Tanner et COU.,
1988; Holick et coll., 1992), la littérature est peu exhaustive concernant la
stabilité de la vitamine D durant le processus de fabrication du lait de
consommation et de fabrication fromagère.
Lors des différentes étapes de la production de fromage de type Cheddar, la
vitamine D risque d'être déstabilisée par le traitement de chaleur, la lumière
et l'oxygéne lors du brassage du lait. Par conséquent, il est important de
vérifier l'impact de la transformation et de la conservation des aliments sur la
vitamine D lorsqu'ils sont enrichis avec la vitamine D. Il peut éventuellement
ëtre nécessaire de protéger la vitamine D avant son addition au lait de
fromagerie
1.10 Formes commerciales de vitamine D
Le produit commercial de vitamine D : Vitex-D est sous la forme d'une
émulsion hydrosoluble. La vitamine D3 (cholécaidero1) est incorporée avec
du polysorbate 80, du propylène glycol et de l'eau, ce qui lui assure une
certaine protection contre diverses conditions de l'environnement. Le vitex-D
possède une concentration de 205 000 UI/ml de vitamine D (cholécalciférol,
Kingsway Chocolate Limited, Bunge Foods, Mississauga, Ont., Canada). Ce
produit est couramment utilisé dans l'industrie laitière pour supplémenter le
lait en vitamine D.
1.10.2 Cholécaldéroi cristalline
La vitamine D3 SOUS forme cristalline (Sigma Chernical Co, St-Louis, MO) est
utilisée seulement par les laboratoires. Cette forme de vitamine D n'est pas
utilisée à des fins commerciales.
2 .O Fabrication fromagère
Le fromage frais ou afbé est obtenu par la coagulation du lait, de la crème,
du lait écrémé, de babeurre ou d'un mélange de deux ou plusieurs de ces
produits suivie de l'égouttage, au cours duquel le lactosérum se sépare du
caillé. Le lactosérum entraîne la plus grande partie de l'eau et des
constituants solubles du lait, une petite partie restant emprisonnée dans le
caillé. Ainsi, par exemple, a partir de 100 kg de lait, on produit environ 10 kg
de fromage Cheddar et 90 kg de lactosérum.
2.1 Étapes principales de la transformation du lait en fromage
Les dserentes étapes de la production de fromage de type Cheddar sont
schématisées à la figure 1.2.
2.1.1 La préparation du lait de fromagerie
La transformation du lait en fromage exige un lait d'excellente qualité. ii doit
être exempt d'antibiotiques ou d'autres résidus pouvant nuire au
développement des ferments. Une étape de clarification peut parfois être
nécessaire pour débarrasser le lait des particules étrangères (de la poussière,
des leucocytes, de la paille, des cellules épithéliales). La composition en
matières grasses du lait de vache peut varier durant l'année. Le lait peut être
standardisé afim de fmer le rapport graslextrait sec et d'obtenir des fromages
de composition et de qualité uniformes.
Un traitement d'homogénéisation est parfois souhaitable afin de stabiliser
l'émulsion de matières grasses dispersées dans la phase aqueuse.
L'homogénéisation a pour but principal de diminuer le diamètre des
gouttelettes de la phase dispersée, ce qui aura pour conséquence de ralentir
la décantation des globules de gras dans le lait ou la crème. Au cours de
I'hornogénéisation, la membrane du globule de gras est détruite et une
nouvelle membrane composée principalement de caséine est constituée suite
à l'augmentation de la tension interfaciale (Pouliot et coll., 199 1).
L'utilisation de l'homogénéisation dans la fabrication fromagère a été étudiée
dans le but d'augmenter le rendement fromager (Humbert et coll., 1980 ;
Path et coll., 1989) et dans le but d'améliorer la texture du fromage cheddar
fait a partir d'un lait a teneur faible en gras et de lait concentré (Emmons et
COL, 1980 ; Green et COU., 1983). Ces auteurs ont démontre que
Ihomogenéisation augmente la rétention de la matière grasse et lhumidité,
ce qui a pour effet de donner une texture plus moue et moins élastique ainsi
qu'une pâte plus humide à des fromages qui sont habituellement fermes et
élastiques. La formation de complexes entre les caséines et les globules de
matières grasses forme de nouvelles membranes qui diminuent la quantité de
caséines disponibles pour former le coagulum.
Plusieurs types de fromages ont été fabriqués à partir de lait homogénéisé
tels le camembert, l'édam, le suisse, le neufchâtel et le Cheddar (Peters,
1964). Concernant la fabrication de Cheddar, Peters (1956) a remarqué
qu'une augmentation des pressions du lait de O à 14 Mpa diminuait
l'intensité de la couleur jaunâtre. L'homogénéisation occasionne cependant
des problèmes pendant la fabrication, soit : (il la synérèse difficile amenant
un fromage plus humide (Peters, NS6), (ii] l'augmentation des pertes de fmes
dans le lactosérum dues à un caillé friable (Path et coli., 19891, (iii) le
développement de l'acidité raientie (Path et coll., 1989). Les avantages de
I'homogéneisation sont en général : (il la diminution des pertes de gras dans
le sérum (Humbert et coll., 1980)' (ii) l'augmentation des rendements (Peters,
1956), (iii] la diminution des pertes en humidité durant la maturation (Moms
et COL, 1963) et (iv] la diminution de l'exsudation de la matière grasse
lorsque le fromage est exposé a des températures élevées (Peters, 1956).
Le lait peut subir un traitement thermique comme la pasteurisation (72"C,
16 sec], qui permet de détruire la totalité de la fiore microbienne pathogëne
non-sporulante. Elle vise également à détruire le plus grand nombre possible
de microorganismes et d'enzymes susceptibles d'altérer les propriétés
organoleptiques et La durée de vie des produits (Alais, 1984).
2.1.2 La coagulation
La coagulation du lait, se traduit par la formation d2in gel, résulte des
modifications physico-chimiques intervenant au niveau des micelles de
caséines sous l'action d'enzymes protéolytiques (présure) et de I'acidifcation
par les ferments lactiques ajoutes au lait. Le réseau alors forme se
nomme coagulum. La présure est un mélange de chymosine et de pepsine sécrété dans la caillette des jeunes ruminants noums au lait (Scott, 1986 ;
Lawrence et coli., 1987).
2.1.3 L'égouttage du caille
Le gel frais, d'origine acide ou présure, est instable : plus ou moins
rapidement, le lactosérum emprisonné a tendance à se séparer
spontanément ou après une rupture mécanique du coagulum provoquant
l'égouttage du caillé. Ce phénomène se nomme synérèse. Le terme général
d'égouttage réfère à l'ensemble de la synérëse et des opérations d'évacuation
du lactosérum ou égouttage complémentaire, lors de la cuisson, du moulage,
du pressage, du salage et jusqu'au moment de l'affinage (Lawrence et cou.,
1987). La cheddarisation consiste en une série d'opérations visant à
rassembler les grains du caillé, a retourner et à empiler le coagulum de
manière a accroitre I'exsudation du lactosemm (Kosikowski, 1982 ; Lawrence
et cou., 1987).
2.1.4 Le salage du caillé
Le salage est réalisé immédiatement après I'égouttage pour plusieurs
raisons : il compiète l'égouttage du fromage en favorisant le drainage de la phase aqueuse libre du caillé. Il bloque l'acidification par les bactéries
lactiques et permet de contrôler le pH fmal du fromage. 11 dirige l'afllinage
dans son ensemble puisqu'il agit directement sur I'abaissement de l'activité
de l'eau (Aw], sur le développement des microorganismes et l'activité
enzymatique. Ii apporte également un goût caractéristique et a la propriété de
masquer les saveurs de certaines substances apparaissant au cours de la
maturation du fromage (Kowsikowski, 1982). La teneur en sel varie selon le
type de fromage. La teneur finale en sel est généralement de 1,s a 2 % de sel
pour le fromage de type Cheddar, mais peut etre très élevée dans certains
fromages comme les pâtes persillées (4-5 %) ou la feta (10 %) (Lawrence et
coii., 1987).
2.1.5 L'affinage du fromage
Le processus d'affinage correspond a une phase de digestion enzymatique du
caillé. Les transformations biochimiques, graduelles ou plus ou moins poussées, des constituants du fromage lui confèrent une texture particulière,
un aspect et une couleur typiques, ainsi qu'une saveur et un arôme
caractéristiques. Les phénomènes impliqués dans l'aff'inage sont d'une très
grande complexité en raison de la nature du substrat, de la variété des
agents responsables des transformations, de la diversité des modifications
subies par les constituants et du très grand nombre de produits formés. Les
enymes, agents de I'af'flmage, peuvent avoir trois origines : les enzymes
naturels du lait (lipases, protéases], les enzymes coagulantes (présure ou
substituts d'origine microbienne) et les enzymes des microorganismes
(enzymes intraceîlulaires) présents dans le fromage (Kosikowski, 1982 ;
Lawrence et coii., 1987).
2.2 Traitement et valorisation du lactosérum de fromagerie
Autrefois utilisé à l'état naturel pour l'alimentation des animaux de la ferme,
le lactosérum fait maintenant l'objet de traitements et de transformations qui
constituent un domaine important des activités industrielles. En raison de
leur valeur nutritionnelie et de leurs propriétés fonctionnelles, il existe de nombreuses possibilités d'utilisation des protéines du lactosérum.
La fabrication de fmmage produit d'importantes quantités de Iactosénim. ii
représente 80-90 % de la masse originale du lait de fabrication et contient 6
à 6,4 % d'extrait sec, soit la moitié de la matière sèche du lait. De plus, il
renferme des constituants, les protéines solubles, possédant une grande
valeur alimentaire. L'extrait sec du lactoserum est composé principalement
de lactose, protéines et minéraux. L'origine du lactosérum a une grande
importance sur ses traitements. On distingue deux types de lactosérum : le
lactosérum doux provenant de la coagulation par la présure de laits non
acides et consemés dans de bonnes conditions (pas de post-acidification) et le
lactosérum acide, provenant soit de la fabrication de fromage à pâte fraîche
ou à pâte moue, soit de la fabrication de caséine lactique (Kosikowski, 1982).
Le lactosérum est d'abord débarrassé des particules de caillé et de sa matière
grasse. Le lactosérum peut ensuite subir divers traitements en vue de sa
valorisation : la concentration permet d'obtenir un produit à extrait sec (E.S.)
plus élevé. La concentration se fait par évaporation, par combinaison de
l'osmose inverse et de l'évaporation ou par ultrafiltration. La dessiccation est
plus difficile à réaüser que dans le cas du lait, du fait que la teneur en
lactose atteint 70 % de 1'E.S. L'ultrafiltration est l'application majeure des
traitements de séparation par membrane dans l'industrie laitière. 11 permet
de séparer le gras et les protéines concentrées (caséines, protéines de
lactosérum) d2in côté, et le lactose et les sels solubles de l'autre côté. (Aiais,
1984 ; Rosenthal, 199 1).
Préparation du lait de fromagerie
1. Standardisation (teneur en gras et éventuellement ratio gras / protéines] 2. Pasteurisation (par ex, 15 sec a 72°C)
3. Addition de ferments lactiques
4. Addition CaC12
Coamilation . Cor@-
5. Addition de présure
6. Acidification par le ferment lactique
Égouttage
7. Découpage du coagulum
8. Cuisson avec agitation
9. Cheddarisation avec acidification du caillé
10. Découpage du caillé avant salage
Salage a sec , moulage et Dressage
n o m y e
L.ctorénam
Affinane a~rès emballane sous vide RomyerthiC
(SOC, pendant 1 à 12 mois)
Ftpre 1.3 8 c h b i typique d'one fabrication de fiornage Cheddar
3 .O L'encapsulation dans les liposomes
Le concept de liposome est apparu au début des années 1960 avec les
travaux de microscopie électronique effectués par Bangham et Home (1964).
Ils furent les premiers a montrer, à l'aide de lécithine d'œuf, que des
phospholipides purifies se réorganisent spontanément en présence d'eau,
pour former ce qui était nommé alors des ' sphémlites '. Ces structures, plus connues maintenant sous le nom de liposomes, sont le résultats de
l'arrangement de composés amphiphiles qui s'organisent en bicouches
concentriques, séparées par le milieu aqueux (Lasic, 1993). La similitude de
constitution entre une telle bicouche lipidique et une membrane cellulaire
naturelle fut rapidement utilisée pour étudier différentes propriétés de la
membrane cellulaire : permeabilité, potentiel de membrane, mécanisme
d'action des anesthésiques locaux (Arnaud, 1993).
Les liposomes ont été plus particulièrement utilisés dans les produits
cosmétiques et médicaux. L'industrie agroalimentaire commence à découvrir
leurs multiples applications (Arnaud, 1993 ; Arnaud 1995). Plusieurs
composés peuvent être encapsulés comme des enzymes, des saveurs, des
minéraux et des vitamines.
3.1 Définition des liposomes
Les liposomes sont des structures sphériques, dont la taille se situe entre
20 nm et 12 pn, composées de bicouches lipidiques qui peuvent encapsuler
un solvant. Ils peuvent être constitués dkne ou de plusieurs membranes,
l'épaisseur de la membrane étant aux alentours de 2 nm (Lasic, 1993). Les
vésicules se forment dans des conditions de température, de force ionique et
de concentration bien déhies lorsque les lipides sont dispersés dans un
milieu liquide (Delattre et coll., 1993; Lasic, 1993). Les molécules
hydrosolubles sont encapsulées a I'intérieur ou iiees à la surface des
bicouches alors les composés hydrophobes sont locaiisés à l'intérieur des
bicouches.
3.2 Stnicture et propriétés des liposomes
La formation des liposomes est due aux propriétés de certaines molécules
amphiphiles à former des agrégats dans un milieu liquide. Les molécules
contiennent des régions polaires et non polaires qui constituent une tête
hydrophile et une queue hydrophobe (Figure 1.3). Les phospholipides et les
phosphodiglycéndes sont les principaux composés de la stmcture des
liposomes (Lasic, 1993). Les phosphatidylcholines sont les phospholipides les
plus utilisés dans la préparation des liposomes. Les liposomes sont
caractérisés par la taille, la forme et le nombre de membranes lameliaires
concentriques (New, 1990). Les petites vésicules unilamellaires (SW) ont une
taille de 20-50 nm alors que les grandes vésicules unilamellaires (LW)
mesurent entre 150-500 nm. Les vésicules multiiamellaires (MLV) consistent
en une population de vésicules couvrant une large étendue de tailles de
100 nm a 20 pm (Arnaud, 1993).
Figure 1.3 Structure d'un liposome. Tire de Lasic, 1993.
Les Prolipo-Duom (Lucas Meyer, Chelles, France), sont constitués d'un
mélange de phospholipides (phosphatidylcholine] dans un milieu hydrophile
(glycérol/éthanol] .
La préparation de la suspension de liposomes est eflectuée par une dilution en deux étapes (Figure 1.4). La formation des liposomes est déclenchée par
l'addition dhne faible quantité d'eau aux proliposomes. Par la suite, l'ajout
d'eau en excès va favoriser le rapprochement des phospholipides et la
formation de vésicules contenant des multicouches de phospholipides
(Perrett et coll.. 1991 ; Dufour et coll., 1996). Un composé sous forme
liposoluble devrait se situer entre les différentes couches de phospholipides
alors qu'un composé sous la forme hydrosoluble quant a lui devrait se situer
à l'intérieur de la vésicule (Lasic, 19931.
- . . ) ........................................ -a--------------------------------------
- pro-liposomes en couches superposés -
Figure 1.4 Concept de base de la méthode de production de Pro-
liposomes. Tiré de Arnaud, 1993.
3.4 Efficacité d'encapsulation des liposomes
L'efficacité d'encapsulation de la préparation liposomale est mesurée par le
rapport du produit encapsulé dans les liposomes sur la quantité totale du
produit mis en jeu. Des travaux ont démontré que des liposomes, préparés à
l'aide d'un microfiuidisateur, immobilisant du lysozyme et de la trypsine ont
une efficacité d'encapsulation de 20 % et 14 %, respectivement (Koide et
Karel, 1987; Larivière et coll., l99 1). Par contre, des travaux récents
suggèrent que l'optimisation des paramètres d'émulsiflcation peut améliorer
la performance en terme de rendement d'encapsulation par les liposomes
(Laloy et coil., 1994). La performance des pmiiposomes est plus
encourageante. Des travaux utilisant des liposomes encapsulant la 6-
carboxyfiuorescéine ont montré une eficacite d'encapsulation aussi élevée
que 80 % (Penett et coll., 199 1). La chymotrypsine a été encapsulée dans les
Pro-lipo@ 30459 et Pro-lipoû3 3080s avec une eficacite d'encapsulation de
96 % et 68'5 %, respectivement (Dufour et cou., 1996). Les proliposomes
semblent donc très prometteurs du point de vue de l'efficacité
d'encapsulation.
3.5 Applications et effets protecteurs des liposomes
L'encapsulation protège les vitamines de la chaleur, l'humidité, des acides et
de l'oxydation (LaBell, 1994). Des études ont été réalisées dans le but de
démontrer que le temps d'aninage du fromage est remarquablement réduit
par l'addition d'enymes encapsulées dans les liposomes (Kuby et cou.,
1987). ïï a été démontré que la plupart des liposomes sont localisés à
proximité des globules de matières grasses dans la matrice fromagère, ce qui
assure une bonne rétention des liposomes dans le caillé lors de sa
production (Laloy et cou., 1998). Kirby et cou. (1987) ont observé une
rétention liposomale de l'ordre de 90 % pour des Vésicules Déshydratées-
Réhydratées (DRV) contenant de la neutrase. Ces auteurs ont montrés que Ie
taux de rétention dans le caillé etait jpndement aEecté par la taiile des
vésicules ce qui confment les résultats de Piard et COU. (1986) et Laloy et
COU. (1998).
L'encapsulation de saveurs dans les liposomes a été étudiée dans des
biscuits (Nabisco Brands Inc, 1990). La stabilité de l'acide ascorbique a été
améliorée par l'encapsulation dans les liposomes (Kirby et coll., 1991). Près
de 50 % de l'acide ascorbique encapsulé était encore présent après 50 jours a
4'C alors que l'acide ascorbique sous la forme libre était complètement
dégradé après 20 jours (Kirby et coll., 1991). La stabilité a été aussi
améliorée en présence de substances dégradantes (cuivre, oxydase, lysine).
Les auteurs expliquent que la protection serait due aux concentrations plus
élevées en acide ascorbique dans les vésicules lipidiques ainsi que l'effet
baniere des liposomes envers les conditions environnantes (Kirby et cou.,
1991). En plus de leurs actions physiologiques, les liposomes protègent les
molécules labiles de leur milieu environnant dans les formulations
cosmétiques. Les vitamines C et E encapsulées dans les liposomes ont une
vitesse de décomposition réduite et une pénétration améliorée dans la peau
(Suzuki et Sakon, 1990). Même si l'encapsulation des vitamines est très
répandue dans les cosmétiques, les applications agroaiimentaires sont peu
nombreuses jusqu'a maintenant. La protection apportée par l'encapsulation
(liposomes) évite l'addition de quantité excessive de vitamines a f i de
compenser les pertes possibles durant les procédés de transformation ou
l'entreposage (Arnaud, 1993). La stabilité de l'acide ascorbique a été
largement améliorée dans une solution aqueuse simple et spécialement en
présence de composée simple constituants les aliments par l'encapsulation
dans les liposomes.
4.0 Spectroscopie en moyen infrarouge
4.1 Historique
L a spectroscopie infrarouge est certainement l'une des plus importantes
techniques andytiques utilisées par les chimistes d'aujourd'hui. Les
premiers spectromètres infmuges ont été commercialisés dans les années
1940. Dans les premiers temps, les spectromètres utilisaient un prisme afin
de convertir la radiation infrarouge en longueur d'ondes. Le prisme a été
replacé par un grillage de diffraction améliorant ainsi la résolution (Ismaii et
coll, 1997). Le plus grand avancement de la technologie en spectroscopie
infrarouge a été I'introduction des spectromètres à transformée de Fourier
(FT-IR). Ce type d'instrument emploie un interféromètre et un système
d'exploitation bien établi du processus mathématique des transformations de
Fourier. La spectroscopie à transformée de Fourier (FT-IR) a améliore la
qualité des spectres infrarouges et a minimisé le temps requis pour obtenir
les données (Ismail et coll., 1997 ; Stuart, 1996 ; Wilson et Goodfellow.,
1994).
4.2 Théorie générale de la spectroscopie infrarouge
Le spectre infrarouge peut être divisé en trois régions : I'infrarouge lointain
(0-400 cm-'1, le moyen infrarouge (4004000 cm-1) et le proche infrarouge
(4000- 15000 cm-1). La spectroscopie en moyen infrarouge implique
l'absorption par les molécules de radiation de longueur d'ondes comprises
entre 400 et 4000 cm1. L'absorption est transmise aux molécules a travers des états d'énergie transitionnelle, vibrationneiie et rotationneile (van de
Voort, 1992). On décrit les vibrations comme étant des mouvements
d'étirement et de repliement des molécules (Figure 1.5). La position exacte et
i'intensité des bandes d'absorption dépendent de la masse de I'atome et de la
constance de la force des vibrations. Ii est important de noter que ce ne sont
pas toutes les vibrations moléculaires qui donnent des bandes d'absorption
infmouge. Une vibration fondamentale donne un pic d'absorbance
seulement lorsquïl y a un changement dans le mouvement dipolaire de la molécule (Ismail et COU., 1997). Les différents groupes fonctionnels possèdent
des fréquences d'absorption caracténstiques qui leur sont propres, ce qui
permet de distinguer leur présence dans le spectre infrarouge du composé
(Ismail et cou., 1997).
Un spectre infrarouge est obtenu en passant une radiation à travers un
échantillon, et en déterminant ainsi quelle fraction de la radiation incidente
est absorbée avec un certain niveau d'énergie. Le spectre en moyen
infrarouge d'un composé contient d'abondantes informations structurales de
même que des caractéristiques physiques que l'on nomme : empreintes (van
de Voort, 1992).
4.3 Spectromètre a transformée de Fourier (FT-IR)
La méthode est basée sur l'interféromètre de Michelson et utilise le spectre
complet de I'échantillon au lieu des longueurs d'ondes individuelles générées
par un système de prismes utilise par un spectromètre conventionnel (van de
Voort, 1992). La radiation de la source passe a travers Iïnterfi!romètre avant
d'atteindre le détecteur (Figure 1.6). Une fois le signal amplifié, les données
sont converties en format digital par un convertisseur et transmises à l'ordinateur ou les transformations de Fourier sont effectuées (Stuart, 1996).
Il y a quatre principaux types de méthode utiiisée en moyen infrarouge soit A
transmission, en réfiectance spéculaire, diffuse ainsi que la réaectance totale
atténuée (ATR).
La spectroscopie à transmission est la plus vieille méthode et la méthode de
base la plus utilisée. La méthode est basée sur l'absorption des radiations infrarouges à une longueur d'onde spécifique lors du passage ê travers un
échantillon. Il est possible d'analyser des échantillons liquides, solides et des
gaz. Le choix de la cellule infrarouge est très important. Le matériel de la
fenêtre doit ëtre transparent aux radiations infrarouges. Différents types de matériaux sont disponibles : NaCI, KBr CaF2, BaF2, KC1, CsBr, CsI.
t symétrique
agitation torsion
Figure 1.5 Types de vibrations moléculaires : A ) vibrations
d'étirements ; B) vibrations de repliements.
Adapté de Ismail et coll., 1997.
miroir fixe ", position de l'insertion de l'échantillon 1 % détecteur
séparateur de bandes
miroir mobile
Figure 1.6 Schéma du principe du spectromètre infrarouge à
transformée de Fourier (FT-IR) base sur l'interféromètre de Michelson. Tiré de Wilson et Goodfellow, 1994.
Dans la technique de la réflectance totale atténuée, l'échantillon est place en
contact avec un cristal composé de matériau ayant un indice de réfraction
élevé. La lumière de la source infrarouge est émise a travers le cristal avec un
angle permettant la réflexion interne multiple entre la surface supérieure et
inférieure du cristal. L'onde engendré par la réflexion est atténuée lors de
l'absorption de la radiation par l'échantillon. (Ismail et coll., 1997 ; Wilson et
Goodfellow , 1994).
L a dmérence entre l'utilisation de la spectroscopie en ATR et en transmission
est basée sur le fait que l'échantillon ATR n'a pas besoin de transmettre la
lumière ou d'être transparent à la lumiëre. Le principal critère est d'avoir un
bon contact optique avec le cristal. Les matériaux mailéables, humides,
liquides et semi-solides donnent de bons spectres alors que les poudres
donnent des résultats moins satisfaisants (Wilson et Goodfeilow, 1994).
4.4 Analyse quantitative par moyen infrarouge
La spectroscopie IR étant une méthode d'analyse secondaire, le
développement des méthodes d'analyses nécessitent une calibration avec des
échantillons de compositions connues (standards), analyses dans un premier
temps par une méthode chimique de référence a h d'établir la relation entre
l'intensité des bandes infrarouges et la valeur des variables d'intérêts (Ismail
et cou., 1997). Une fois la calibration développée, il est possible d'analyser
des échantillons inconnus à condition de respecter deux exigences : (i) le
spectre de l'échantillon inconnu doit être enregistré dans les mêmes
conditions employées pour la caübration et (ii) la composition des
échantillons de calibration doit bien représenter la composition de
l'échantillon inconnu (Ismail et coii., 1997).
De même que pour les autres types d'absorption spectroscopique (ex : la
spectroscopie W-visible), la base de l'analyse quantitative en spectroscopie
infrarouge est basée sur la loi de Beer et Lambert (Ismail et COU., 1997)
L'absorbante d'un échantillon est directement proportionnelle a l'épaisseur et
la concentration d'un échantillon par la formule :
où (A) est l'absorbance (unité d'absorbance) de l'échantillon à cette fréquence,
(c) la concentration de l'échantillon et (1) le chemin parcouru ( p l . La constante de proportionnalité (E) réfère a l'absorption molaire de l'échantillon
à cette fréquence.
Mi d'obtenir un résultat d'analyse précis, il est préférable de préparer une
série de solutions des dürérentes concentrations, couvrant la région d'intérêt,
et de convertir la valeur d'absorbance a l'aide d'un graphique représentant
l'absorbance en fonction de la concentration du produit à analyser
(Figure 1.7).
4.5 Utilisations de la spectroscopie
des produits laitiers
en moyen infrarouge dans le secteur
Il y a de nombreux types de matériels qui peuvent être analysés par la
spectroscopie infrarouge (Stuart, 1996). Des composés organiques,
inorganiques, des polymères, molécules biologiques, polluants, drogues,
fibres, peintures, huiles et lubrifiants, produits chimiques reliés a
l'agriculture, additifs alimentaires, catalyseurs, minéraux, argiles, produits
organométalliques, produits pétroliers, etc., ont été étudiés par la
spectroscopie infrarouge.
L'application de la spectroscopie en moyen IR aux systèmes alimentaires a
été limitée par l'absorbante massive de l'eau dans le spectre moyen IR. Cette
méthode nécessite des cellules dont le parcours optique est très étroit
(40 pm), ce qui amène des dificultés avec la préparation des échantillons et
la manutention (Manning, 1972).
La spectroscopie infrarouge est utilisée pour le paiement du lait, c'est-à-dire
I'andyse des constituants majeurs du lait (les protéines, la matière grasse et
le lactose). Elle est, de plus, employée pour d'autres produits laitiers tels le
lactosérum et les crèmes (Anderson et Christensen, 1982 ; Ahmed et cou.,
1985). Le plus grand défi en analyse infrarouge est d'établir et d'améliorer la
précision des calibrations (Brown, 1985). Certains facteurs peuvent
influencer les mesures infrarouges. Les sources de vaziation sont inhérentes
aux produits à analyser. Les facteurs peuvent être classifiés en trois
catégories : les facteurs instrumentaux, physico-chimiques et biologiques
(Rémiliard et cou., 1993). Par exemple, le lait est un produit microbiologiquement sensible, vulnérable aux diverses activités etlzymatiques et variable dans sa composition physico-chimique. Malgré une
bonne précision de l'appareil utiîisé, ces facteurs peuvent atTecter la mesure
infiarouge pour les constituants du lait et peuvent interférer sur la
calibration.
L'eau absorbe fortement en spectroscopie infrarouge ; il est difficile d'étudier
des échantillons en solution aqueuse. Tou tefois, grâce a la spectroscopie
infrarouge a transformée de Fourier et à sa grande sensibilité, il est
maintenant possible de soustraire le spectre de l'eau des spectres
d'échantillons avec assez de précision (Samson, 1990)
5.0 But, hypothèse et objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer la stabilité de la vitamine D dans le fromage
Cheddar, selon trois différentes méthodes d'incorporation de la vitamine.
Suite a l'information présentée dans la revue de littérature, l'hypothèse
suivante a été formulée :
L'addition au lait de fromaegrie de vitamine D dans les liposomes (Prolipo-
Duo") permetterait la meilleure rétention de la vitamine D dans le caillé et
améliorait la stabilité de celle-ci dans le fromage Cheddar, durant son
affinage a 4 ' ~ sur une période de conservation minimale de 4 mois,
comparativement a l'addition de la forme hydrosoluble de la vitamine D
(Vitex-D) au lait de fromagerie ou a l'incorporation de la vitamine D dans une
fraction de la matière grasse du lait par un procédé d'homogénéisation.
L'objectif général de ce projet est de développer une nouvelle technologie pour
produire un fromage Cheddar enrichi en vitamine D qui sera simple,
économique, efficace et facilement utilisable au nieau industriel. La méthode
d'ajout de la vitamine D doit être optimisée de manière a réduire la perte de
vitamine D dans le lactosérum et de limiter ainsi sa contamination qui
pourrait affecter les utilisations subséquentes de ce sous-produit de
l'industrie fromagère.
Cette étude comprend deux volets qui visent les objectif's suivants :
Volet A : Réaliser une étude comparée des différentes technologies de
fortification du fromage Cheddar en vitamine D avec des objectifs
spécifiques :
ii)
Encapsuler la vitamine D dans les liposomes et mesurer
I'efEcacité d'encapsulation de la vitamine D.
Comparer les trois méthodes d'incorporation de la vitamine D la
vitamine D sous forme d'émulsion hydrosoluble (Vitex-D), la
vitamine D cristalline incorporée à une fraction de la crème et la
vitamine D hydrosoluble encapsulée dans les liposomes sur la
rétention de la vitamine dans le caillé et sa stabilité dans le
fromage lors de l'afliinage en utilisant un fromage contrôle non
enrichi en vitamine D.
Volet B : Mettre au point d'une méthode de mesure de la teneur en
vitamine D dans le lait, le lactosérum et le fromage par
spectroscopie en moyen infrarouge (FT-IR) . Les objectifs spécifiques de ce volet vont :
il
ii)
Üi)
Localiser le pic d'absorbante de la vitamine D dans le spectre en
moyen infrarouge.
Développer une méthode de calibration de la vitamine D dans le
lait.
Determiner la teneur en vitamine D dans les échantillons de
lait, de lactosérum et de fkomage issus de fabrications
fkomagères.
CHAPITRE II
Cornparoison of Different Methodr for Fortification of Cheddar Cheese with Vitamin D
Vitamin D enriched Cheddar cheeses were produced using these incorporation strategies : Vitamin D was added to milk at a concentration of 400 W/L as follows : addition of a water-soluble emulsion of vitamin D to raw milk before pasteurization, homogenization of crystalline liposoluble vitamin D in a smaii volume of cream used for cheesemiik standardisation and addition of water-soluble vitamin D entrapped into liposomes to raw milk. Recovery of vitamin D in the cheese curd, loss in the whey and stabiiity of vitamin D during cheese making and npening over a 4 months penod were assessed. The production of multilameilar liposomes was obtained with Rolipo-Duom. There was no significant influence of the method of vitamin D incorporation on the composition of the exptrimental cheeses (protein, fat, moisture and salt) which were not different from control cheeses made without vitamin D. A high vitamin D entrapping efficiency of 78 k 3 % was obtahed with Rolipo-Duom. The recovery in cheese of liposome entrapped vitamin D was signifïcantly different from the other processes (61.5 * 5.4 % compared to 40.5 î 2.2 % with vitamin D incorporated in crearn and 42.7 * 1.7 % with the emulsion of vitamin D. The vitamin D was stable in dl cheeses produced over four months of ripening.
Des fromages Cheddar enrichis en vitamine D ont été fabriqués en utilisant
trois méthodes différentes d'incorporation de la vitamine D (400 UI/L) au lait de fromagerie : l'addition sous forme d'une émulsion hydrosoluble de
vitamine D au lait cru avant la pasteurisation, I'homogénéisation de la
vitamine D (liposoluble) sous forme cristalline dans une portion de crème
utilisée pour la standardisation du lait et l'addition au lait cru, de la vitamine D hydrosoluble encapsulée dans les liposomes. Le taux de rétention de la
vitamine D dans le caillé, la perte dans le lactosérum ainsi que la stabilité de
la vitamine D lors de la fabrication fromagère et lors de l'affinage sur une
période de 4 mois ont été analysés. La production de liposomes
multilamellaires a été a l'aide des Rolipo-Duo? Une efficacité
d'encapsulation de 78 * 3 % de la vitamine D dans les Rolipo-Duo TM a été obtenue. Il n l a pas eu d'influence significative de la méthode d'incorporation de la vitamine D sur la composition chimique des fromages
(protéines, matière grasse, humidité et le sel) qui n'était pas différentes de
celle des fromages témoins produits sans addition de vitamine D. Le taux de
rétention dans le fromage de la vitamine D encapsulée dans les liposomes
était significativement différent des autres procedes utilisés. Les fromages
produits avec la vitamine D encapsulée dans les liposomes ont montri un
taux de rétention de la vitamine D de 6 1,s * 5.4 %, comparativement a 42,7 * 1.7 % pour la vitamine D sous forme d'i5muIsion et 40,5 I 2.2 % pour la vitamine D homogénéisée dans la crème. Pour chaque procédé
d'incorporation testé la vitamine D est stable dans le fromage sur une période
d'aar'mage de 4 mois.
INTRODUCTION
Vitamin D is added to foods to prevent rickets and to protect groups, which
rnay be insufficiently exposed to sunlight (Thompson and Plouffe, 1993). In
the diet, fluid rnilk is considered as a main source of vitamin D. However, a
large part of vitamin D in raw rn& is lost during heating (pasteurization or
sterilization) and by removing part of cream at the standardization step
(vitamin D is a liposoluble vitamin). Therefore, fiuid milk is supplemented in
U S and Canada with vitamin D to meet the requirements of 355-465
international unit (IU) per liter (Holick, 1990 ; Renken et Warthesen, 1993).
Vitamin D ingested in excess results in hypercalcernia, which is caused by
excessive absorption of massive quantities of calcium by the intestine and
enhanced bone resorption (Coilins and Norman, 199 1).
However, consumption of fluid rnilk products has gradually declined in the
last 20 years (Tanner et al., 1988), and lactose intolerance is a common
problem in the older adult population (Ryan et al., 1995). The
institutionalized elderly may need vitamin D supplementation to assure
adequate intake. Cheese is a universel consumption product. Cheese
consumption is expected to grow further in the future due to increased purchasing power and a lot of recently developed cheeses (IDF, 1997).
Cheddar cheese, one of the most popular cheese in North America, could be an alternative to fiuid milk, as a source of vitamin D. In addition, hard
cheeses such as Cheddar cheese only contain low traces of lactose and can
be consumrned by lactose intolerant people. in US, reduced fat cheeses are supplemented with pitamin A, but there is no information available on the
fortification with vitarnin D in cheese. Cheese enriched with vitamin D would
be a dietary source of vitamin D for people that takes less fortifed miik, like
older adults. Vitamin D supplementation in cheeses must be controlled to
ensure the desired level in the final cheese and not to exceed the critical
limits. Cheesemaking produces large amount of whey. Cheese whey is nch nutritiomally, retaining approximately 52 percent of solids of the whole milk used in Cheddar cheesemaking (Kowsikowski, 1982). Whey is treated to
improve it9s vdorization. Further uses of whey products could be
contaminated with vitamin D if high level are present in whey.
The aim of this study was to compare different methods for fortifying
Cheddar cheese with vitamin D. To minirnize the loss of vitamin D in whey
during cheese manufacture, liposoluble or hydrosoluble (commercial) vitamin
D was entrapped in m a t or in liposomes, respectively. Retention of vitamin
D in cheese curd and stability of vitamin in experimental cheeses during
npening were measured and compared with data obtained frorn Cheddar
cheeses made with non encapsulated vitamin D, Vitex-D.
Wuter-soîubla emutlon of ottomln D. Raw miik was obtained from Ferme SMA (Quebec, PQ, Canada). Raw rnilk (15 kg) was enriched with a water-
soluble emulsion of vitamin Da (Vitex-D, 205 000 IU/ml = 5 125 pg/ml, Kingsway Chocolate Co. Limited, Bunge Foods, Mississauga, ON, Canada) to
a fmal concentration of 400 IU/L or 0.01 pg/ml prior to pasteurization which
corresponds to vitamin D concentration used in fluid milk.
92tanrin D in ndlk f i Raw whole milk was separated at 53'C (Westfalia
separator, type LWA 205, Centnco Inc., Englewood, N J , USA) into skim rnilk
and cream 33 % m a t . A s m d volume (30 mi) of cream was homogenized
using a Milko-Scan 133B (N. Foss Electric, Houerad, Denmark) with 300pi of
cris taiiine vitamin D (cholecalciferol, Sigma Chemicals, Saint-Louis, MO,
USA) solubilized in ethyl alcohol (1 mg/ml). A volume of 15 ml of fortEed
cream was added to 15 kg raw milk before pasteurization so as obtain a final
concentration of 400 IU of vitamin D per L of cheesemik.
V ' t a m t n D i 1@oromes. The water-soluble vitamin D preparation (Vitex-D)
was entrapped in liposomes according to the method descnbed by Dufour et al. (19%). Half a gram of pro-liposome mixture (Prolipo-Duo", Lucas Meyer,
Chelles, France) was converted to a concentrated liposome suspension by
adding 150 pi, of vîtamin D solution (1 mg/mï), and blended for 2 minutes
at room temperature. The suspension was gradudy diiuted by addition of
5 ml of raw milic. The multilamellar veside (MLV) suspension was directiy
added to 15 kg of raw milk prior to pasteurization (final concentration of
400 IU of vitamin D/L of cheesemilk).
Cheddar ch- making procdiue
A volume of 15 ml of cream was added to milk with Vitex-D, vitamin D in
liposomes and control miIk without vitamin D to standardize the miik fat
concentration before pasteurization to that of milk with vitamin D added in
15 ml of homogeneized cream. The cheesemilks, with or without vitamin D,
were pasteurized (72°C - 15 sec, pasteurbator Alpha-Laval type P20-HB #2235- 19 10, Sweden) and held ovemight at 4°C before cheese manufacture.
Experimental cheddar cheeses made from milk added with Vitex-D,
cristalline vitamin D homogeneized in cream, vitamin D encapsulated in
liposomes at a final concentration of 400 IU/L and f indy control cheeses without vitamin D were rnanufactured from 12 kg of pasteurized mi&, using
a computer-controlled laboratory cheese plant with 4 vats (15 L maximum
capacity) (INRA, Poligny, France).
The pasteurized milks (12 kg) were heated at 32'C in cheese vats before
inoculation. A frozen concentrated direct-to-vat starter (# 91 1, Chr. Hansen
Inc., Mississauga, ON, Canada] was added at 1.92 ml/ 12 kg of milk foiîowed
by 2.16 mi/ 12 kg of 45 % v/v calcium chloride solution. After 30 minutes
npening at 32'C, double-strength remet (Chy-Max II 500, Chr. Hansen Inc.,
Mississauga, ON, Canada) was added to each vat (1.08 ml diluted in 20 ml of water). The mixture was stirred for 60 sec and held for approximatively 45
minutes. The coagulation was monitored by a coagulometer (INRA brevet 8800803, Poligny, France). The pH (Accumet, Mode1 15 pH Meter, Fischer
Scientific, Ottawa, ON, Canada) and temperature were monitored over a
period of approximately 5 hours. The coagulation method allows to visuaiize
the coagulation cinetic and the determination of the floculation tirne. The
cutting time was deterrnined by the relation of a multiplication factor of the
floculation üme, approximatively 45-60 minutes (Laporte, 1996). The curd
was heated h m 32 to 38°C in 40 minutes with stirring (15 rpm) and
temperature was maintained at 38°C for 4 hours. The whey was drained
when pH in the whey was 6.0. The cheddaring process was carrieci out in the
vat heated at 38'C, until a pH of 5.3 was reached in curd. The curd was
milled and dry salted (2.3 % wt/wt). After salting, the curd were pressed at
an applied pressure of 60 Ib/po2 for 16 hours at room temperature. Then 50
g cheese samples were taken for composition analyses. The pressed cheeses
were vacuum-packaged, ripened for 1 month at 13°C and then stored at 4°C
for 4 months. Monthly during 4 months ripening period a portion of 50 g of
cheeses were taken for composition and vitamin D analyses after which the
remaining cheeses were vacuum-packaged. Each cheese manufacture was
repeated 3 times.
Chernicd composition
Fat contents of milk and whey were detennined by the Mojonnier methods
(AOAC, 1990). Cheese fat was measured by the Babcock method (AOAC,
1990). Total proteins in miik, whey and cheeses were deterrnined by the
Kjeldahl method (IDF, 1993). Cheese moisture was measured gravimetrically
(lOO°C for 4 hours) foliowing the AOAC pmcedure (1990). Salt analyses were
performed by using a DicromateO Sait Analyser (Diarnond Cxystal Sait, St-
Clair, MI, USA). A sample of 10 g of cheese was blended with 100 ml of
deionized water for 60 sec. The solution was poured into a filter (Whatman
#4, Whatman international Ltd., Maidstone, England) to retained solids, and
passed throw the column of the salt analyzer. Sait percentage of the product
corresponds to the value indicated on the digitai screen. Ali tests were duplicated.
Cheese samples (50 g) taken after manufacture and monthly during ripening
were vacuum-packaged and stored at -20°C for a maximum period of 2
weeks before analysis. Vitamin D was measured by HPLC (AOAC, 1990) in
an accredited laboratory for vitamin analysis (Oak Park Laboratory Inc.,
hiscola L, USA). Cheese milk (250 ml), whey (250 ml), cream enriched with
vitamin D (150 ml] were also stored at -20°C (one week maximum) before
vitamin D analysis. During transportation, samples were mahtained freezed
in an insolated box filled with dxy ice. Analyses were done in duplicate.
Liposome U y s b
hccrpsuüztton pi[Pdenq @@). The liposome suspension was recovered by
ultracentrifugation (Ultracentrifuge Bechan@, Mode1 L8-70M, Pa10 Alto, CA,
USA) at 100 000 g and 20°C for 1 hour. The supernatant was removed and
the pellets were suspended in 10 O/O (v/v] Triton X- 100 (BDH, Montreal, PQ,
Canada) in deionized watet and sonicated for 30 minutes to break the
liposomes and release the encapsulated vitamin D. Vitamin D content of both
supernatants and pellets was determined. The encapsulation efficiency (EE)
was determined as the percentage of vitamin D encapsulated in liposomes.
Analyses were repeated twice for the 3 liposomes solutions prepared for each
cheese manufacture.
li.cuund#lon 8-n mfcrwcopg. Liposome suspensions were observed
by transmission electmn micmscopy using positive staining. The liposome
suspension was prepared and fixed in 2 % (w/v) glutaradehyde and 0.5 %
tannic acid in 0.1 M phosphate buffer (pH ES), and then pre-coated with a
bovine senun albumin 20 % (v/v) solution and 2-3 drops of glutaidehyde
25 % (w/v) to protect the specirnen. The samples were washed with 0.1 M
phosphate buffer (pH 7.5), and then fked with 1 % (w/v) osmium tetroxide
phosphate buEer (pH 7.5), and then hxed with 1 % (w/v] osmium tetroxide
for 1 h at 22°C. Dehydration was perfomed in graded ethanol series (50, 70,
90 and 99 %) and the dry samples were embedded in Epon 8 12. Ultrathin
sections (75 nm) were cut with an ultramicrotome, collected on formvar-
coated copper jpids and stained with uranyl acetate before observation
(120 K) by transmission electron microscopy (GEOL 10 10, GEOL Canada, St-
Hubert, PQ, Canada] at 60 kV.
The experimentai design was a complete biock factorial design with 3
experimental cheeses (Vitex-D, vitamin D in cream and vitamin D in
liposomes), and a control cheese without vitamin D, which was repeated three times over a period of one month.
The General Linear Mode1 (GLM) procedure of SAS@ (SAS, 1989) was used for
analyses of variance and multiple comparaison tests. The significance of
blocks, treatments, ripening tirne and interaction between treatmen ts and
ripening tirne were tested by analysis of variance of a complete block factorial
design. A multiple comparaison test on means, the protect least significant difference (LSD) test, was used to test for signifi~cance of treatments (Steel
and Tome, 1980). Statistical analyses were made with a level of significance
of P < 0.05.
Fat and protein contents for experimental and control milks and wheys are shown in Table 2.1 There was a smail but signüicant difference in fat between milk containing liposomes, Vitex-D added milk and control milk.
However, no difference in milk protein was observed The protein and fat
content of whey were not signifcantly düferent among the different
treatments (P > 0.05).
Table 2.1 Rotein (96 w/w) and fat (96 w/w) composition of mille and whey
Control Vitex- D Cream Liposome LSD Roducts
Pro tein - x 3.147 3.139 3.143 3.146 0.038 SD 0.011 0.007 0.028 0.001
Fat - x 3.366 3.365 a 3.347 ab 3.284 b 0.066 SD 0.044 0.078 0.065 0.037
Protein / Fat
Rotein - x 0.819 0.815 0.809 0.818 0.022 SD 0.018 0.005 0.005 0.007 Fat - x 0.374 0.393 0.389 0.40 1 0.037
Means (1313) witbin the same row without a c o r n e supm&ipt dinu (P c 0.05). Leck of superscript in a row mdiratcs no m c a n t düfcrrnces among means.
M u r bjuice of protdn and fat in d î k and whey
PiPtdn &&wtcee The actual mass balance of N in whey and curd is shown in Table 2.2 Mass balance for the control and the treatments with different
methods of vitamin D incorporation were very close to 100 % and no
signifiant difference (P > 0.05) was detected in the total mass balance of N
for control and treatments.
F'at bolavuree The actual mass balance of fat in whey and curd is shown in
Table 2.2 Mass balance for the control and treatments with different types of
vitamin D incorporation were in the range from 97.6 to 100 %, and no
signifïicant difference (P > 0.05) was detected for control and treatments.
Table 2.2 M a s s balance of fat P/o) and protein (O/).
Control Vitex-D Cream Liposome LSD
Protein - x 99.88 100.72 100.28 99.8 1 2.17 SD 0.58 1 .O2 1.16 1.1 l
Fat - x 98.15 97.62 98.93 99.97 3.42 SD 2.48 1.57 2.1 1 0. 15
Reportecl data are mean and standard deviation of triplicate cxperimcnts. ~ëans(n=3) wit)iin the same row without a cornmon &perscriit difkr (P c 0.05).
Lack of superacript in a row mdicafts no w c m t diffèrenas among means.
The encapsulation efficiency of vitamin D in Rolipo-Duo TM was measured for ail cheese productions and a relatively high emciency of 78 i 3 % was obsemed (Table 2.3). Dufour et al. (1996), reported that immobilization eficiency of a chymotrypsin solution (1% (w/v)) was 96 % in liposomes 3045
S and 68 % in liposomes 3080 S. The immobilization effciencies of an
aminopeptidase contained in celi-free extracts (CFE) of Lactobatillus casei ssp. psmdoplantarum UL 137 in a Pro-lipo@ S mixture were between 55 and
60% (Laloy et al., 1998). A value of 65 % encapsulation emciency was
reported with imrnobiîized Neutrase in fkeeze-thawed and extnided
multilamellar vesicules (Fresta et al., 1995). Data obtained in this study
confmed the high potentiai of liposomes obtained from pro-liposomes, to
encapsulate dflerent types of materials, as previously reported by Laloy et al., 1998 ; Dufour et al., 1996.
Table 2.3 Characterization of the immobilimtion of vitamin D in liposome prepared with Ro-lipo Duo TM
SD 0.0 12 0.01 1 3.2 4 .O
* Reported data are means and standard deviations of tripiicate ocperimmts. CS = concmtration of vitamin D in supernatant ; CL = Concentration of
cncapsulated vitamin D entrapped inside liposomes; EE = Encapdation effiuency ; VS = vitiunUi D in supernatant
The encapsulation efficiency was not taken into account to adjust the concentration of vitamin D needed to fortitied cheesernilk with 400 IU /L
(request level of fomcation). The total suspension solution was used to
enrich cheesemik. Therefore, the vitamin D entrapped into liposomes (about 80 %) and the hction of about 20 % of hydrosoluble vitamin D (not
encapsulated) were used in the production of experimentai cheese containhg
liposomes.
Electron microscopy observations demonstrated the multiiarneiiar structure
of liposomes obtained from Rolipo-Duon (Figure 2.1). Liposomes behave as
closed microscopic bags able to encapsulate large amount of aqueous medium. Water-solu ble ingredients (vitamin D) dissolved in this medium are
entrapped inside the liposomes. hirthermore, 02-soluble compounds can be
efficiently enclosed in the phospholipid bïiayer (Arnaud, 1995).
Figure 2.1 Microstmcture of a Liposome
obtained from holipo-Duo".
Cheese Composition
The chernical composition of cheeses is shown in Table 2.4 There is no
significant Merences between treatments for protein, fat and salt contents of
the cheeses. However, signifïcant difFerence (P > 0.05) were observed in
pourcentage of moisture between experimental cheeses made with cream containing vitamin D and in cheeses containing liposomes (39.47 and
38.03 % moisture, respectivelyj.
Table 2.4 Chernical composition of cheeses (% w/w). -- - . -
Control Vitex-D Cream Liposome M D
Rotein - x 25.34 25.75 25.34 25.73 0.85 SD 0.63 0.62 0.40 0.09
Fat - x 31.10 30.92 30.83 31.17 1 -00 SD 0.57 0.62 0.96 0.77
Moistue - x 38.47 ab 38.91 ab 39.47 38.03 1-38 SD 0.73 1.25 O. 14 0.73
Salt - x 1.69 1.69 1.62 1.58 0.1 1 SD 0.20 0.18 O. 16 0.15
Reported data arc means and standard deviations of tripkate upriments Means (n=3) within the same row without a common supenaipt mer (P < 0.05). Lack of
superecript in a row indicates no W c a n t ciifferences among means.
In contrast with previous work with liposomes (Laloy et ai., 1998 ; Larivière et al., 1991) which reported a small moisture increase in cheeses containing
liposomes, no difference was detected in moisture between experimental and control cheeses in this study (Table 4). This result could be explained by the low volume of liposome suspension added to cheesern.Uk : 5 mi/12L
compared to 25 mil8 L for Laloy, et al. (1998), and 232 mï/40L for Larivière et al. (199 1). In the latter case, the presence of liposomes greatiy increased the moisture of Cheddar cheeses, modifling the microstructure and the
rheolo@cal characteristics of the ripened cheeses. Cheeses containing liposomes were softer, less cohesive and elastic, and more brittie than control
cheeses. Observations on cheese microstructure showed that some liposomes were included in the casein rnatrix, but most vesicules were located in areas
close to fat globules (Laloy et al., 1998).
mem. The actual cheese yields for experimental and control cheeses are shown in Table 2.5 Mean actual cheese yields for the different treaûnents were in the range fkom 9.40 to 9.63 kg1100 kg. There was no signüicant
difierence for actuai cheese yield among the different cheeses (Vitex-D,
cristalline vitamin D in a cream portion and vitamin D in liposomes) or with
the control cheese.
Table 2.5 The effect o