CLAUDINE BANVILLE

EFFLET DE DIPFÉRE~ES M&THODES D ' A ~ D ~ ~ I O I . DE LA WTAMINE D AU LAIT DE FROMAGERIE SUR LA RÉTETION ET LA STABUIT~ DE CETTE WTAMINE LOR8 DE LA PRODWCTIOW ET

DE LA MATURATION DU CHEDDAR.

Mémoire présente

à la Faculté des études supérieures de l'Université U v a l

pour l'obtention du grade de maitre es sciences (M. SC.)

Département de l'alimentation et de la nutrition FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITE LAVAL

O Claudine Banville, 1999

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L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.

Canadâ

Une méthode d'analyse de la vitamine D a été testée, à l'aide de la

spectroscopie en moyen infrarouge, afin de réduire le temps d'analyse et

d'améliorer la précision de l'analyse de la vitamine D. Cependant, la vitamine

D en faible concentration ( 0 , O l pg/rnl) n'a pas pu ëtre détectée de manière

fiable et précise lorsqu'elle est ajoutée a des produits complexes comme le

lait,

La fabrication de fromage cheddar e ~ c h i de vitamine D a été testée avec

trois méthodes d'incorporation différentes de la vitamine D au lait de fromagerie: l'addition de vitamine D sous forme d'une émulsion

hydrosoluble, l'addition de vitamine D homogénéisée dans une portion de

crème et enfui l'addition de vitamine D encapsulée dans les liposomes afin de

maximiser la rétention de la vitamine dans le caillé et ainsi minimiser la

perte de la vitamine D dans le lactosérum. L'encapsulation de la vitamine D

dans les liposomes a permis une meilleure rétention de la vitamine dans le

caillé. La contamination du lactosérum par la vitamine D est inférieure au seuil de détection de la méthode HPLC. L a vitamine D est demeurée rehtivement stable dans les fromages pendant une période d'aflnnage de 4

mois,

AVANT PROPOS

Dans le cadre d'une maîtrise, il y a bien plus que le plan professionnel qui est implique, le pian personnel y joue un rôle très important. Les

connaissances acquises lors d'une maitrise nous permettent de faire face a

d'éventuelles situations problématiques.

L'atteinte des buts f ~ é s ne se fait pas seul, I'aide d'autrui est souvent

nécessaire. Je profite de I'occasion pour remercier tous ceux qui. de près ou

de loin, m'ont aidé et ont contribue à l'aboutissement de ma recherche. Par

crainte d'oubli, je ne nomme personne. J'espère qu'ils se reconnaîtront et

qu'ils seront témoins à leur juste valeur de ma reconnaissance.

TABLE DE8 MATI&RES

=SUME ..................... .... ......................................................... .................................................................................. AVANT PROPOS

TABLE DES MATIÈRES ................................................................... LISTE DES FIGURES .......................................................................... LISTE DES TABLEAUX .......................................................................

.................................................... INTRODUCTION ................... ........ CHAPITRE I - REW E DE LITTÉRATURE ............................................

................................................ 1.0 La vitamine D .............................

l

1 .1 0.2 Cholécalciférol cristalline ........................................

Historique .......................................................................... . . Propnetes chimiques ..........................................................

Sources de vitamine D ................... .. .. .. ....................... Mécanismes d'absorption de la vitamine D ....................... Rôle physiologique de la vitamine D ................................... kvaluation du statut en vitamine D .................................... Hype~taminose ................................................................ Déficience en vitamine D .................................................... Instabilité de la vitamine D ... .............................................. Formes commerciales de vitamine D ..................................

................................................................... 1.10.1 Vitex-D

Fabrication fromagère ................................................................ 2.1 Étapes principales de la transformation du lait en fromage .

......................... 2.1.1 La préparation du lait de nomagerie 2.1.2 La coagulation .......................................................... 2.1.3 L'égouttage du caillé ................................................. 2.1 -4 Le salage du caiile .................................................... 2.1.5 L'affinage du fromage ................... .. .......................

2.2 Traitement et valorisation du lactosérum de fromagerie ......

3 . 0 L'encapsulation dans les liposomes ................... .... ............. 3.1 Défmition des liposomes ....................................................

....... 3.2 Structure et propriétés des liposomes ................ .. 3.3 Prolipo-Duo" ...................... ............. ............................ 3.4 Efficacité d'encapsulation des liposomes ............................ 3.5 Applications et effets protecteurs des liposomes ................

4 . 0 Spectroscopie en moyen infrarouge ......................................... Historique ..........................................................................

4.2 Théorie générale de la spectroscopie infrarouge .................. 4.3 Spectromètre a transformée de Fourier (FT-IR) ................... 4.4 Analyse quantitative par moyen infrarouge .................... 4.5 Uülisations de la spectroscopie en moyen infrarouge dans

..... ....................... le secteur des produits laitiers .... ......................................................... But. hypothèse et objectifs

COMPAMSON OF DIFFERENT METHODS FOR FORTIFICATION OF CHEDDAR CHEESE WITH WTAMIN D

.................................................................................... Abstract Résumé .....................................................................................

....................................... ................... Introduction .............. Materials and methods .............................................................. Results and discussion ..............................................................

................................................................................ Conclusion

CHAPITRE III

D&I'ERMINATION DE LA TENEUR EN VITAMINE D DANS LE LAIT PAR SPECTROSCOPIE EN MOYEN INFRAROUGE (FT-IR)

...................................................................................... Résume Introduction ............................................................................... Matériel et méthodes .................................................................. Résultats et discussion ............................................................... Conclusion .................................................................................

.................................................................. CONCLUSION GÉNERALE BIBLIOGRAPHIE GI~NÉRALE ..............................................................

LISTE DE8 FIGURES

CHAPITRE 1

Figure 1.1

Figure 1.2

Figure 1.3

Figure 1.4

Figure 1.5

Figure 1.6

Figure 1.7

Structures chimiques de la vitamine D2 et D3 ..................... Schéma typique d 'une fabrication de fromage Cheddar.. .... Structure d'un liposome .................. .... .... .... ............ Concept de base de la méthode de production de Pro-

liposomes .......................................................................... Types de vibrations moléculaires ............................. ... ....

Schéma du principe du spectromètre infrarouge a

transformée de Fourier (FT-IR) basé sur I'interféromètre

de Michelson ..................................................................... Relation entre la

infrarouge et la

déterminée par une

concentration prédite par I'anatyse

concentration réelle du compose

méthode de référence.. ........................

CHAPITRE U

Figure 2.1 Microstructure of a liposome Rolipo-Duom ....................... ........ Figure 2.2 Concentrations of vitamin D in experimentai cheeses

CHAPITRE III

Figure 3.1 Spectres de differentes concentrations de vitamine

D dans l'eau déionisée a une longueur d'ondes de .......................................................................... 1643 cm-1

Figure 3.2

Figure 3.3

Figure 3.4

Figure 3.5

Figure 3.6

Relation entre la concentration en vitamine D de

référence et la concentration en vitamine D prédite par

l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait a 3,s % de matière grasse (26/06/97) en ordre croissant de

.................................................................... concentration

Relation entre la concentration en vitamine D de

dference et la concentration en vitamine D prédite par

I'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait

pasteurisé et homogénéisé a 2 % de matière grasse ................ (061 1 1/97) en ordre croissant de concentration

Relation entre la concentration en vitamine D de

référence et la concentration en vitamine D prédite par

l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait

pasteurisé et homogénéisé à 2 % de matière grasse

................ (26 /O 1 /98) en ordre croissant de concentration

Reiation entre la concentration en vitamine D de

référence et la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait

pasteurisé et homogénéisé a 2 % de matière grasse (30 / 0 1 198) en ordre croissant de concentration ................

Relation entre la concentration en vitamine D de

référence et la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen idkarouge (M-IR) dans un lait pasteurisé et homogénéisé à 2 % de matière grasse

................ (22 / 04/98) en ordre croissant de concentration

Figure 3.7 Relation entre la concentration en vitamine D de

référence et la concentration en vitamine D prédite par

l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans un lait

pasteurise et homogénéisé à 2 % de matière grasse

(23/04/98) en ordre croissant de concentration ................ 79

Figure 3.8

Figure 3.9

Figure 3.10

Figure 3.11

Figure 3.12

Concentration en vitamine D de référence en fonction de

la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en

moyen infrarouge (M-IR) dans un lait à 2 % de matière

grasse en ordre croissaqt de concentration ........................ 82

Concentration en vitamine D de référence en fonction de

la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en

moyen infrarouge (M-IR] dans un lait à 2 % de matière

grasse en ordre aléatoire de concentration ...................... ... 83

Concentration en vitamine D de référence en fonction de

la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en

moyen infrarouge (M-IR) dans I'eau déionisée en ordre croissant de concentration ................................................

Concentration en vitamine D de référence en fonction de

la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen infrarouge (M-IR) dans I'eau déionisée en ordre

aléatoire de concentration ................................................. 85

Concentration en vitamine D de référence en fonction de

la concentration en vitamine D prédite par l'analyse en moyen infhmuge (M-IR) dans un lait écrémé en ordre

missan t de concentration .............................m...........-...... 86

Figure 3.13 Concentration en vitamine D de référence en fonction de

la concentration en vitamuie D prédite par l'analyse en

moyen infmuge (M-IR) dans un lait écrémé en ordre 87

aléatoire de concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . .. . . .. . . . . . . . . .. .. . . . . . . .

LISTE DES TABLEAUX

Page

CHAPITRE II

Table 2.1

Table 2.2

Table 2.3

Table 2.4

Table 2.5

Table 2.6

Table 2.7

Table 2.8

..... Protein (Yo) and fat (Yo) composition of milk and whey.. Mass balance of fat (9%) and protein (%) ............................ Characterization of the immobiîization of vitamin D in

liposome prepared with Proiipo-Duom ............................ Chernical composition of cheeses (%) ................... ... .. The effect of different types of methods of addition of

vitamin D on cheese yield and moisture content of ............................ cheese ..................................... ......

Analysis of variance : Significant factors of the cheese

composition ................... ... ................................. .. .... Vitamin D concentrations in milk and cheese for

experimen ta1 cheese productions ..................................... Analysis of variance : Signifcant factors influencing

vitamin D concentration in cheese ..................... ......

CHAPITRE RI

Tableau 3.1 Formulation des échantillons de caübration pour le

dosage de la vitamine D dans le lait pasteurisé dans la

gamme de concentration de O a 10,O pg/ml, pour avoir

un volume de Vitex-D + prémélange fixe dans chaque

....................................................................... échantillon 72

INTRODUCTION

11 est bien connu que chez les marnniifères la vitamine D a deux origines :

l'une endogène résultant de la synthèse épidermique sous l'action des rayons

ultraviolets solaires, l'autre exogène provenant des nutriments. La vitamine D

étant très importante physiologiquement, il est nécessaire d'avoir un apport

en vitamine D par l'alimentation dans les pays nordiques, comme le Canada.

Les aliments naturels non enrichis en vitamine D sont relativement pauvres

en cette vitamine, sauf les huiles de poissons, les œufs crus et certaines

viandes ; il est illusoire d'atteindre un apport important en vitamine D par les

aliments (Miravet, 1989; LaBeil, 1994). Les laits de consommation enrichis

constituent la principale source alimentaire de vitamine D au Canada. Cependant, la consommation de lait a diminue considérablement depuis une

quinzaine d'années (Tanner et COU., 1988). De plus, la consommation de lait

diminue fortement avec l'âge de la population.

Le niveau actuel de vitamine D semble suffire aux besoins des enfants et de

la plupart des adultes. Par contre, les personnes âgées et les très jeunes

enfants sont plus sensibles à des carences vitaminiques ou à des doses trop

élevées. Une carence prolongée en vitamine D provoque le rachitisme

infantile et I'ostéomalacie chez l'adulte alors qu'une dose excessive de

vitamine D résulte en une hypercalcemie (Chesney, 1989).

Le fromage Cheddar est le produit laitier, autre que le kit, qui est le plus

largement consommé au Canada (IDF, 1997). Ann de rejoindre l'ensemble de

la population et en particulier les personnes plus âgées qui consomment peu

de lait, il serait important de trouver un aliment de consommation générale

dont l'enrichissement en vitamine D pourrait être possible. Le but de cette

recherche est de produire un fromage de type Cheddar enrichi en vitamine D.

L a variabilité de la stabilité de la vitamine D étant régulièrement remise en question, il sera donc important de trouver un procédé qui protégera la

vitamine lors de la fabrication fromagère ainsi que durant l'affinage du

fromage, jusqu'à la consommation. Une attention particulière a été portée

sur la mesure de la rétention de la vitamine D dans le caillé et des pertes

dans le lactosérum. Le lactosérum étant la plupart du temps réutiiisé en

industrie, il subit divers traitements de fractionnement-concentration pour

produire des poudres de lactosérum entier, de perméat et de protéines de

lactosérum. La vitamine D du lactosérum sera égaiement éventuellement

concentrée, ce qui risque d'être problématique pour une utilisation

ahmentaire subséquente du lactosérum ou de ses produits séchés, car une

surdose en vitamine D peut être toxique.

L'objectif'de cette recherche a été de comparer da'érentes technologies pour

produire un fromage enrichi en vitamine D, en vue d'en sélectionner une qui

sera simple, économique, efficace et facilement utilisable au niveau

industriel.

L a rétention de la vitamine D dans le CFUIIIé lors de la production fromagère a

été expérimentée en ajoutant la vitamine D sous trois formes différentes au

lait de fromagerie ; sous forme d'un produit commercial de vitamine D

hydrosoluble, encapsulée dans des liposomes et, enfui, homogénéisée dans

une parüe de la crème utilisée pour la standardisation du lait de fromagerie.

CHAPITRE 1

1.0 La vitamine D

1 . 1 Historique

Le rachitisme, maladie causée par une déficience en vitamine D, est apparu

depuis les temps anciens. Les premières descriptions scientifiques du

rachitisme ont été écrites par Daniel Whistler en 1645 et par Francis Glisson

en 1650. Le rachitisme est devenu un problème de santé en Europe du Nord, en Angleterre et aux États-unis durant la révolution industrielle alors que les

gens vivaient en zone urbaine en présence de peu de soleil et beaucoup de

poliution de l'air (Noman, 1979). La distinction entre le facteur

antixérophthalmique, la vitamine A, et le facteur antirachitique, la vitamine D, a été démontrée dès 1922 par l'équipe de McCoUum (McCollum, 1922).

Peu après, deux groupes de recherche (Steenbock et Black, 1924 ; Hess et

Weinstock, 1925) ont remarqué que la lumière semblait produire un

changement chimique permanent à un composé de la diète et de la peau. Ils ont proposé que la provitamine D existe et qu'eue pouvait être convertie en

vitamine D par l'absorption des rayons ultraviolets. L'isolement et la

caractérisation de la vitamine D étaient alors possibles. La structure de la

vitamine D2 a été simultanément déterminée par Windaus en Aliemagne (Windaus et cou., 1932) et par Askew en Angleterre qui la nomma

ergocalcifërol (Askew et coll., 1932). Windaus (1936) identifia la structure de

la vitamine D contenue dans l'huile de foie de morue comme Ia vitamine Dg

ou cholécalcifé5rol. La vitamine D est un stéroïde ou plus spécialement un

sécostéroide. Cependant, la relation entre la stnicture et son mode d'action

ne fut réalisée que 30 ans plus tard (Collins et Noman, 1991).

1.2 Propriétés chimiques

La vitamine D existe sous deux formes de sécostéroides, la vitamine D2

( C ~ ~ H W O ) , et la vitamine D3 (CnH440), ainsi que de certains métabolites à

activité biologique (25-hydroxyvitamine D) que l'on trouve dans les aliments

(Figure 1.1) . Le poids moléculaire est de 384,65 Da. Cette molécule est

insoluble dans l'eau, mais soluble dans les solvants organiques. Elle est

instable a la lumière et peut ahsi subir une oxydation si eue est exposée 3

l'air durant 24-72 heures (Ryan et coll., 1995).

1.3 Sources de vitamine D

L a vitamine D peut être consommée dans la diète ou synthétisée par le corps.

Elle peut être ingérée sous forme de vitamine D2, a partir des plantes, et de vitamine D3. provenant de sources animales. La vitamine D2 (ergocalciférol)

est synthétisée a partir de l'ergostérol de tissus végétaux morts exposés aux

ultraviolets ou au soleil. La vitamine D3 (cholécalciférol) est synthétisëe dans la peau a partir du 7-dehydrocholestéro dans une réaction catalysée par la

lumière ultraviolette. Les dew vitamines ont une activité égale, mais dans la

plupart des cas, c'est la vitamine D3 qui constitue la principale source

d'activité biologique dans l'organisme (Fraser, 1983; Ryan et COU., 1995).

ERGOCALCIFEROL VITAMINE D2

CH OLECALCIFEROL VITAMINE D3

Figure 1.1 Structures chimiques des vitamines D2 et D3. Tiré

de Ryan et cou., 1995.

1.4 Mécanismes d'absorption de la vitamine D

Les vitamines D1 et Da, SOUS leur forme mère, n'ont virtuellement pas

d'activité biologique. Elies su bissent deux transformations qui en font des

composés biologiquement actifs (DeLuca, 1988; Collins et Norman, 199 1).

L'absorption de la vitamine D est semblable a celie des autres lipides, c'est-à-

dire, qu'après une emulsification favorisée par les sels biliaires, la vitamine

est absorbée dans l'intestin et transportée jusqu'au foie par le système

lymphatique où une première hydroxylation génère le 25-hydroxyvitamine D.

Le second site important de transformation est le rein où l'enzyme 1-alpha-

hydroxylase produit le 1'25-dihydroxyvitamine D ( 1,25-(OH) 2D). La vitamine

D et ses métabolites circulent dans le plasma sanguin en étant liés a un

porteur spécifique, la protéine furatrice de vitamine D (DBP). La vitamine D

étant liposoluble est entreposée principalement dans le tissu adipeux oii sa

demi-vie est de plus de 3 mois (Lawson et coli., 1986).

1.5 Rôle physiologique de la vitamine D.

Le rôle de la vitamine D dans le système endocrinien est de garder le calcium

et le phosphore dans le sérum à des concentrations qui assurent la

minéraiisation des os, le fonctionnement neuromuscuIaire ainsi que d'autres

processus cellulaires qui dépendent de ces éléments (DeLuca, 1979 ; Henry

et Norman, 1984). Ces effets sont assurés par l'intermédiaire du 1,25-(OH)2D

qui agit sur un récepteur intracellulaire spécifique. Puisque la vitamine D

appartient a la famille des hormones stéroidiennes et qu'elle peut être

synthétisée dans l'organisme, elle a les propriétés d'une hormone aussi bien

que ceîle d'une vitamine. Le 1,25-(OH)2D annule l'effet ripresseur d'un gène dans le noyau des cellules épithéliales de l'intestin afin d'accroitre la

synthèse d'une protéine fixatrice de calcium qui est nécessaire à l'absorption

active du calcium. Ce composé a égaiement un rôle non encore élucidé dans

l'absorption du phosphore. Conjointement avec la parathormone, ii accroît la

résorption des cellules osseuses et la réabsorption du calcium et du

phosphate au niveau des tubes rénaux (Kutsky, 1981 ; Holick, 1996).

1.6 Évaluation du statut en vitamine D

L'apport en vitamine D est un facteur nutritionnel important surtout en

absence du soleil. En plus des variations en fonction de la localisation

géographique et des saisons, les rayons ultraviolets du soleil peuvent être

bloqués de plusieurs façons. Toutefois, chez les personnes âgées

l'ensoleillement reste un facteur prédominant ; s'il est réduit ou insuffisant,

l'apport alimentaire peut représenter la quasi-totalité de la source

vitaminique (Lawson et cou., 1979).

L a vitamine D peut être produite par le corps et elle peut être emmagasinée

sur une Iongue période dans les tissus; il est alors diffiicile de déterminer la

dose quotidienne requise. L a demande en vitamine D est aussi dépendante

de la concentration en calcium et en phosphore dans l'alimentation, du stade

de développement, de Mge, du sexe, du degré d'exposition au soleil et de la

pigmentation de la peau. La quantité de vitamine D recommandée est de

400 UI/jour ou 1 UI correspond à 0,025 pg de vitamine D2 ou DS (UI = unités

internationales) (Collins et Nonnan, 199 1 ; Rosenberry, 1997).

La concentration circulante de 25-OHD constitue le meilleur indicateur

biochimique du statut en vitamine D de I'individu. Des variations

saisonnières de la concentration ui 25-OHD dans le plasma sanguin ont été

observées. De faibles concentrations en 25-OHD ont été observées chez

certaines personnes âgées qui vivent pourtant dans des pays très ensoleillés

(Gibson et COU., 1986). Cela est généraîement attribué au fait que ces

personnes vivent beaucoup à l'intérieur et qu'elles ingèrent peu d'aliments

enrichis en vitamine D. Lors d'une enquëte effectuée au Canada en 1982,

Gibson et cou. ont constaté qu'un certain nombre de femmes ménopausées

vivant à leur domicile avaient un taux sérique moyen de 25-OHD de

16,s ng/ml. Chez 11 % d'entre eiies, cette concentration était inférieure à

10 ng/ml, mais dans aucun cas elle n'était inférieure à 5 ng/mi. Une

concentration inférieure à 10 ng/ml dans l'organisme est considérée comme

étant une faible concentration en vitamine D, bien qu'une concentration de

5 ng/ml paraisse suffisante pour empêcher la manifestation des symptômes

de rachitisme et d'ostéomalacie.

La marge de sécurité dans l'ingestion de la vitamine D est remarquablement

étroite. L'ingestion de produits surfortifiés en vitamine D a long terme peut

être toxique dans I'organisme entrainant des symptômes comme des

faiblesses, la perte d'appétit, la soif inhabituelle, la nausée, les

vomissements, une pression sanguine élevée et une hypercaicémie. Dans les

premiers stades de l'intoxication, les effets sont réversibles. Chez les enfants,

les effets toxiques sont apparents lorsque la quantité excède 1000-2000 UI

(400 üï 10 pg) par jour alors que chez l'adulte le seuil se situe entre 10 000

et 20 000 UI par jour sur une longue période de temps. L'hypervitaminose est

un problème sérieux qui résulte d'une calcification irréversible du cœur, des

poumons, du foie et d'autres tissus mous. L a mort peut éventuellement

survenir (Collins et Norman, 199 1).

1.8 Déficience en vitamine D

Une déficience en vitamine D peut sumenir lorsque l'absorption intestinale et

la réabsorption du calcium et du phosphore sont inadéquates. Elle se produit

lorsque les niveaux de calcium et de phosphore dans le sérum diminuent et

que l'activité de la phosphatase dcaline augmente. Le niveau de calcium

étant faible, I'hyperparathyroidisme s u ~ e n t . L'hormone parathyroïde et le

1,25(OH)& sont toujours présents au début de la déficience, fi s'ensuit une

déminéraikation des os. L a déficience en vitamine D conduit au rachitisme

infantile et a l'osteomaiacie chez l'adulte. Les principaux symptômes associés

au rachitisme : des jambes arquées, des courbures de la colonne vertébrale

ainsi que des déformations pelviennes et thoraciques sont causées par

l'application des mecanismes normaux du stress ainsi qu'a la

déminéralisation osseuse (Colluis et Norman, 199 1).

1.9 Instabilité de la vitamine D

Il est régulièrement question que la variabilité de la vitamine D peut être due

a un enrichissement inadéquat ou a l'instabilité de la vitamine. Certaines

études sur la stabilité de la vitamine D2 ont démontre que des solutions de

propylène glycol vitaminées étaient instables lorsque diluées dans l'eau, mais

stables lorsque diluées dans le lait (Supplee et coll., 1936). D'autres études

sur la stabilité de solutions de propylène glycol et de vitamine D diluées dans

le lait ont montré, a l'aide d'essais biologiques, qu'il nv avait pas de

détérioration de la vitamine D dans le lait après 8 jours conservé à la

température de réfrigération (Huber et Barlow, 1943). Aucune perte de

vitamine D n'avait été observée dans le lait condensé en conserve entreposé à

40°C durant 6 mois ou à la température de la pièce (23'C) durant 15 mois.

L'instabilité de la vitamine D a été observée par Cremin et Power (1985). La

vitamine D était sensible a l'oxydation, a la lumiere et à l'acide. Kutsky

(1981) a démontré que la vitamine D était sensible à I'oxydation et à la

lumière mais stable à l'acide et aux produits alcalins. En revanche, Pike et

Brown (1984) ont montré que la vitamine D etait sensible à l'irradiation et a

l'acide tandis que ia vitamine était stable a l'oxydation et aux produits

alcalins. Enfin, Kreutler (1980) a démontré que la vitamine D était

remarquablement stable et que l'exposition a la lumière, à la chaleur et à

l'oxygène n'affecte pas son activité. L a stabilité de la vitamine D semble étre

très contreversée. L a variabilité de la vitamine D dans le lait pourrait étre due

a une fortification inexacte ou à l'instabilité de la vitamine D,

Bien que plusieurs études aient été effectuées sur des laits de consommation

enrichis en vitamine D et des formules de lait matemisé (Tanner et COU.,

1988; Holick et coll., 1992), la littérature est peu exhaustive concernant la

stabilité de la vitamine D durant le processus de fabrication du lait de

consommation et de fabrication fromagère.

Lors des différentes étapes de la production de fromage de type Cheddar, la

vitamine D risque d'être déstabilisée par le traitement de chaleur, la lumière

et l'oxygéne lors du brassage du lait. Par conséquent, il est important de

vérifier l'impact de la transformation et de la conservation des aliments sur la

vitamine D lorsqu'ils sont enrichis avec la vitamine D. Il peut éventuellement

ëtre nécessaire de protéger la vitamine D avant son addition au lait de

fromagerie

1.10 Formes commerciales de vitamine D

Le produit commercial de vitamine D : Vitex-D est sous la forme d'une

émulsion hydrosoluble. La vitamine D3 (cholécaidero1) est incorporée avec

du polysorbate 80, du propylène glycol et de l'eau, ce qui lui assure une

certaine protection contre diverses conditions de l'environnement. Le vitex-D

possède une concentration de 205 000 UI/ml de vitamine D (cholécalciférol,

Kingsway Chocolate Limited, Bunge Foods, Mississauga, Ont., Canada). Ce

produit est couramment utilisé dans l'industrie laitière pour supplémenter le

lait en vitamine D.

1.10.2 Cholécaldéroi cristalline

La vitamine D3 SOUS forme cristalline (Sigma Chernical Co, St-Louis, MO) est

utilisée seulement par les laboratoires. Cette forme de vitamine D n'est pas

utilisée à des fins commerciales.

2 .O Fabrication fromagère

Le fromage frais ou afbé est obtenu par la coagulation du lait, de la crème,

du lait écrémé, de babeurre ou d'un mélange de deux ou plusieurs de ces

produits suivie de l'égouttage, au cours duquel le lactosérum se sépare du

caillé. Le lactosérum entraîne la plus grande partie de l'eau et des

constituants solubles du lait, une petite partie restant emprisonnée dans le

caillé. Ainsi, par exemple, a partir de 100 kg de lait, on produit environ 10 kg

de fromage Cheddar et 90 kg de lactosérum.

2.1 Étapes principales de la transformation du lait en fromage

Les dserentes étapes de la production de fromage de type Cheddar sont

schématisées à la figure 1.2.

2.1.1 La préparation du lait de fromagerie

La transformation du lait en fromage exige un lait d'excellente qualité. ii doit

être exempt d'antibiotiques ou d'autres résidus pouvant nuire au

développement des ferments. Une étape de clarification peut parfois être

nécessaire pour débarrasser le lait des particules étrangères (de la poussière,

des leucocytes, de la paille, des cellules épithéliales). La composition en

matières grasses du lait de vache peut varier durant l'année. Le lait peut être

standardisé afim de fmer le rapport graslextrait sec et d'obtenir des fromages

de composition et de qualité uniformes.

Un traitement d'homogénéisation est parfois souhaitable afin de stabiliser

l'émulsion de matières grasses dispersées dans la phase aqueuse.

L'homogénéisation a pour but principal de diminuer le diamètre des

gouttelettes de la phase dispersée, ce qui aura pour conséquence de ralentir

la décantation des globules de gras dans le lait ou la crème. Au cours de

I'hornogénéisation, la membrane du globule de gras est détruite et une

nouvelle membrane composée principalement de caséine est constituée suite

à l'augmentation de la tension interfaciale (Pouliot et coll., 199 1).

L'utilisation de l'homogénéisation dans la fabrication fromagère a été étudiée

dans le but d'augmenter le rendement fromager (Humbert et coll., 1980 ;

Path et coll., 1989) et dans le but d'améliorer la texture du fromage cheddar

fait a partir d'un lait a teneur faible en gras et de lait concentré (Emmons et

COL, 1980 ; Green et COU., 1983). Ces auteurs ont démontre que

Ihomogenéisation augmente la rétention de la matière grasse et lhumidité,

ce qui a pour effet de donner une texture plus moue et moins élastique ainsi

qu'une pâte plus humide à des fromages qui sont habituellement fermes et

élastiques. La formation de complexes entre les caséines et les globules de

matières grasses forme de nouvelles membranes qui diminuent la quantité de

caséines disponibles pour former le coagulum.

Plusieurs types de fromages ont été fabriqués à partir de lait homogénéisé

tels le camembert, l'édam, le suisse, le neufchâtel et le Cheddar (Peters,

1964). Concernant la fabrication de Cheddar, Peters (1956) a remarqué

qu'une augmentation des pressions du lait de O à 14 Mpa diminuait

l'intensité de la couleur jaunâtre. L'homogénéisation occasionne cependant

des problèmes pendant la fabrication, soit : (il la synérèse difficile amenant

un fromage plus humide (Peters, NS6), (ii] l'augmentation des pertes de fmes

dans le lactosérum dues à un caillé friable (Path et coli., 19891, (iii) le

développement de l'acidité raientie (Path et coll., 1989). Les avantages de

I'homogéneisation sont en général : (il la diminution des pertes de gras dans

le sérum (Humbert et coll., 1980)' (ii) l'augmentation des rendements (Peters,

1956), (iii] la diminution des pertes en humidité durant la maturation (Moms

et COL, 1963) et (iv] la diminution de l'exsudation de la matière grasse

lorsque le fromage est exposé a des températures élevées (Peters, 1956).

Le lait peut subir un traitement thermique comme la pasteurisation (72"C,

16 sec], qui permet de détruire la totalité de la fiore microbienne pathogëne

non-sporulante. Elle vise également à détruire le plus grand nombre possible

de microorganismes et d'enzymes susceptibles d'altérer les propriétés

organoleptiques et La durée de vie des produits (Alais, 1984).

2.1.2 La coagulation

La coagulation du lait, se traduit par la formation d2in gel, résulte des

modifications physico-chimiques intervenant au niveau des micelles de

caséines sous l'action d'enzymes protéolytiques (présure) et de I'acidifcation

par les ferments lactiques ajoutes au lait. Le réseau alors forme se

nomme coagulum. La présure est un mélange de chymosine et de pepsine sécrété dans la caillette des jeunes ruminants noums au lait (Scott, 1986 ;

Lawrence et coli., 1987).

2.1.3 L'égouttage du caille

Le gel frais, d'origine acide ou présure, est instable : plus ou moins

rapidement, le lactosérum emprisonné a tendance à se séparer

spontanément ou après une rupture mécanique du coagulum provoquant

l'égouttage du caillé. Ce phénomène se nomme synérèse. Le terme général

d'égouttage réfère à l'ensemble de la synérëse et des opérations d'évacuation

du lactosérum ou égouttage complémentaire, lors de la cuisson, du moulage,

du pressage, du salage et jusqu'au moment de l'affinage (Lawrence et cou.,

1987). La cheddarisation consiste en une série d'opérations visant à

rassembler les grains du caillé, a retourner et à empiler le coagulum de

manière a accroitre I'exsudation du lactosemm (Kosikowski, 1982 ; Lawrence

et cou., 1987).

2.1.4 Le salage du caillé

Le salage est réalisé immédiatement après I'égouttage pour plusieurs

raisons : il compiète l'égouttage du fromage en favorisant le drainage de la phase aqueuse libre du caillé. Il bloque l'acidification par les bactéries

lactiques et permet de contrôler le pH fmal du fromage. 11 dirige l'afllinage

dans son ensemble puisqu'il agit directement sur I'abaissement de l'activité

de l'eau (Aw], sur le développement des microorganismes et l'activité

enzymatique. Ii apporte également un goût caractéristique et a la propriété de

masquer les saveurs de certaines substances apparaissant au cours de la

maturation du fromage (Kowsikowski, 1982). La teneur en sel varie selon le

type de fromage. La teneur finale en sel est généralement de 1,s a 2 % de sel

pour le fromage de type Cheddar, mais peut etre très élevée dans certains

fromages comme les pâtes persillées (4-5 %) ou la feta (10 %) (Lawrence et

coii., 1987).

2.1.5 L'affinage du fromage

Le processus d'affinage correspond a une phase de digestion enzymatique du

caillé. Les transformations biochimiques, graduelles ou plus ou moins poussées, des constituants du fromage lui confèrent une texture particulière,

un aspect et une couleur typiques, ainsi qu'une saveur et un arôme

caractéristiques. Les phénomènes impliqués dans l'aff'inage sont d'une très

grande complexité en raison de la nature du substrat, de la variété des

agents responsables des transformations, de la diversité des modifications

subies par les constituants et du très grand nombre de produits formés. Les

enymes, agents de I'af'flmage, peuvent avoir trois origines : les enzymes

naturels du lait (lipases, protéases], les enzymes coagulantes (présure ou

substituts d'origine microbienne) et les enzymes des microorganismes

(enzymes intraceîlulaires) présents dans le fromage (Kosikowski, 1982 ;

Lawrence et coii., 1987).

2.2 Traitement et valorisation du lactosérum de fromagerie

Autrefois utilisé à l'état naturel pour l'alimentation des animaux de la ferme,

le lactosérum fait maintenant l'objet de traitements et de transformations qui

constituent un domaine important des activités industrielles. En raison de

leur valeur nutritionnelie et de leurs propriétés fonctionnelles, il existe de nombreuses possibilités d'utilisation des protéines du lactosérum.

La fabrication de fmmage produit d'importantes quantités de Iactosénim. ii

représente 80-90 % de la masse originale du lait de fabrication et contient 6

à 6,4 % d'extrait sec, soit la moitié de la matière sèche du lait. De plus, il

renferme des constituants, les protéines solubles, possédant une grande

valeur alimentaire. L'extrait sec du lactoserum est composé principalement

de lactose, protéines et minéraux. L'origine du lactosérum a une grande

importance sur ses traitements. On distingue deux types de lactosérum : le

lactosérum doux provenant de la coagulation par la présure de laits non

acides et consemés dans de bonnes conditions (pas de post-acidification) et le

lactosérum acide, provenant soit de la fabrication de fromage à pâte fraîche

ou à pâte moue, soit de la fabrication de caséine lactique (Kosikowski, 1982).

Le lactosérum est d'abord débarrassé des particules de caillé et de sa matière

grasse. Le lactosérum peut ensuite subir divers traitements en vue de sa

valorisation : la concentration permet d'obtenir un produit à extrait sec (E.S.)

plus élevé. La concentration se fait par évaporation, par combinaison de

l'osmose inverse et de l'évaporation ou par ultrafiltration. La dessiccation est

plus difficile à réaüser que dans le cas du lait, du fait que la teneur en

lactose atteint 70 % de 1'E.S. L'ultrafiltration est l'application majeure des

traitements de séparation par membrane dans l'industrie laitière. 11 permet

de séparer le gras et les protéines concentrées (caséines, protéines de

lactosérum) d2in côté, et le lactose et les sels solubles de l'autre côté. (Aiais,

1984 ; Rosenthal, 199 1).

Préparation du lait de fromagerie

1. Standardisation (teneur en gras et éventuellement ratio gras / protéines] 2. Pasteurisation (par ex, 15 sec a 72°C)

3. Addition de ferments lactiques

4. Addition CaC12

Coamilation . Cor@-

5. Addition de présure

6. Acidification par le ferment lactique

Égouttage

7. Découpage du coagulum

8. Cuisson avec agitation

9. Cheddarisation avec acidification du caillé

10. Découpage du caillé avant salage

Salage a sec , moulage et Dressage

n o m y e

L.ctorénam

Affinane a~rès emballane sous vide RomyerthiC

(SOC, pendant 1 à 12 mois)

Ftpre 1.3 8 c h b i typique d'one fabrication de fiornage Cheddar

3 .O L'encapsulation dans les liposomes

Le concept de liposome est apparu au début des années 1960 avec les

travaux de microscopie électronique effectués par Bangham et Home (1964).

Ils furent les premiers a montrer, à l'aide de lécithine d'œuf, que des

phospholipides purifies se réorganisent spontanément en présence d'eau,

pour former ce qui était nommé alors des ' sphémlites '. Ces structures, plus connues maintenant sous le nom de liposomes, sont le résultats de

l'arrangement de composés amphiphiles qui s'organisent en bicouches

concentriques, séparées par le milieu aqueux (Lasic, 1993). La similitude de

constitution entre une telle bicouche lipidique et une membrane cellulaire

naturelle fut rapidement utilisée pour étudier différentes propriétés de la

membrane cellulaire : permeabilité, potentiel de membrane, mécanisme

d'action des anesthésiques locaux (Arnaud, 1993).

Les liposomes ont été plus particulièrement utilisés dans les produits

cosmétiques et médicaux. L'industrie agroalimentaire commence à découvrir

leurs multiples applications (Arnaud, 1993 ; Arnaud 1995). Plusieurs

composés peuvent être encapsulés comme des enzymes, des saveurs, des

minéraux et des vitamines.

3.1 Définition des liposomes

Les liposomes sont des structures sphériques, dont la taille se situe entre

20 nm et 12 pn, composées de bicouches lipidiques qui peuvent encapsuler

un solvant. Ils peuvent être constitués dkne ou de plusieurs membranes,

l'épaisseur de la membrane étant aux alentours de 2 nm (Lasic, 1993). Les

vésicules se forment dans des conditions de température, de force ionique et

de concentration bien déhies lorsque les lipides sont dispersés dans un

milieu liquide (Delattre et coll., 1993; Lasic, 1993). Les molécules

hydrosolubles sont encapsulées a I'intérieur ou iiees à la surface des

bicouches alors les composés hydrophobes sont locaiisés à l'intérieur des

bicouches.

3.2 Stnicture et propriétés des liposomes

La formation des liposomes est due aux propriétés de certaines molécules

amphiphiles à former des agrégats dans un milieu liquide. Les molécules

contiennent des régions polaires et non polaires qui constituent une tête

hydrophile et une queue hydrophobe (Figure 1.3). Les phospholipides et les

phosphodiglycéndes sont les principaux composés de la stmcture des

liposomes (Lasic, 1993). Les phosphatidylcholines sont les phospholipides les

plus utilisés dans la préparation des liposomes. Les liposomes sont

caractérisés par la taille, la forme et le nombre de membranes lameliaires

concentriques (New, 1990). Les petites vésicules unilamellaires (SW) ont une

taille de 20-50 nm alors que les grandes vésicules unilamellaires (LW)

mesurent entre 150-500 nm. Les vésicules multiiamellaires (MLV) consistent

en une population de vésicules couvrant une large étendue de tailles de

100 nm a 20 pm (Arnaud, 1993).

Figure 1.3 Structure d'un liposome. Tire de Lasic, 1993.

Les Prolipo-Duom (Lucas Meyer, Chelles, France), sont constitués d'un

mélange de phospholipides (phosphatidylcholine] dans un milieu hydrophile

(glycérol/éthanol] .

La préparation de la suspension de liposomes est eflectuée par une dilution en deux étapes (Figure 1.4). La formation des liposomes est déclenchée par

l'addition dhne faible quantité d'eau aux proliposomes. Par la suite, l'ajout

d'eau en excès va favoriser le rapprochement des phospholipides et la

formation de vésicules contenant des multicouches de phospholipides

(Perrett et coll.. 1991 ; Dufour et coll., 1996). Un composé sous forme

liposoluble devrait se situer entre les différentes couches de phospholipides

alors qu'un composé sous la forme hydrosoluble quant a lui devrait se situer

à l'intérieur de la vésicule (Lasic, 19931.

- . . ) ........................................ -a--------------------------------------

- pro-liposomes en couches superposés -

Figure 1.4 Concept de base de la méthode de production de Pro-

liposomes. Tiré de Arnaud, 1993.

3.4 Efficacité d'encapsulation des liposomes

L'efficacité d'encapsulation de la préparation liposomale est mesurée par le

rapport du produit encapsulé dans les liposomes sur la quantité totale du

produit mis en jeu. Des travaux ont démontré que des liposomes, préparés à

l'aide d'un microfiuidisateur, immobilisant du lysozyme et de la trypsine ont

une efficacité d'encapsulation de 20 % et 14 %, respectivement (Koide et

Karel, 1987; Larivière et coll., l99 1). Par contre, des travaux récents

suggèrent que l'optimisation des paramètres d'émulsiflcation peut améliorer

la performance en terme de rendement d'encapsulation par les liposomes

(Laloy et coil., 1994). La performance des pmiiposomes est plus

encourageante. Des travaux utilisant des liposomes encapsulant la 6-

carboxyfiuorescéine ont montré une eficacite d'encapsulation aussi élevée

que 80 % (Penett et coll., 199 1). La chymotrypsine a été encapsulée dans les

Pro-lipo@ 30459 et Pro-lipoû3 3080s avec une eficacite d'encapsulation de

96 % et 68'5 %, respectivement (Dufour et cou., 1996). Les proliposomes

semblent donc très prometteurs du point de vue de l'efficacité

d'encapsulation.

3.5 Applications et effets protecteurs des liposomes

L'encapsulation protège les vitamines de la chaleur, l'humidité, des acides et

de l'oxydation (LaBell, 1994). Des études ont été réalisées dans le but de

démontrer que le temps d'aninage du fromage est remarquablement réduit

par l'addition d'enymes encapsulées dans les liposomes (Kuby et cou.,

1987). ïï a été démontré que la plupart des liposomes sont localisés à

proximité des globules de matières grasses dans la matrice fromagère, ce qui

assure une bonne rétention des liposomes dans le caillé lors de sa

production (Laloy et cou., 1998). Kirby et cou. (1987) ont observé une

rétention liposomale de l'ordre de 90 % pour des Vésicules Déshydratées-

Réhydratées (DRV) contenant de la neutrase. Ces auteurs ont montrés que Ie

taux de rétention dans le caillé etait jpndement aEecté par la taiile des

vésicules ce qui confment les résultats de Piard et COU. (1986) et Laloy et

COU. (1998).

L'encapsulation de saveurs dans les liposomes a été étudiée dans des

biscuits (Nabisco Brands Inc, 1990). La stabilité de l'acide ascorbique a été

améliorée par l'encapsulation dans les liposomes (Kirby et coll., 1991). Près

de 50 % de l'acide ascorbique encapsulé était encore présent après 50 jours a

4'C alors que l'acide ascorbique sous la forme libre était complètement

dégradé après 20 jours (Kirby et coll., 1991). La stabilité a été aussi

améliorée en présence de substances dégradantes (cuivre, oxydase, lysine).

Les auteurs expliquent que la protection serait due aux concentrations plus

élevées en acide ascorbique dans les vésicules lipidiques ainsi que l'effet

baniere des liposomes envers les conditions environnantes (Kirby et cou.,

1991). En plus de leurs actions physiologiques, les liposomes protègent les

molécules labiles de leur milieu environnant dans les formulations

cosmétiques. Les vitamines C et E encapsulées dans les liposomes ont une

vitesse de décomposition réduite et une pénétration améliorée dans la peau

(Suzuki et Sakon, 1990). Même si l'encapsulation des vitamines est très

répandue dans les cosmétiques, les applications agroaiimentaires sont peu

nombreuses jusqu'a maintenant. La protection apportée par l'encapsulation

(liposomes) évite l'addition de quantité excessive de vitamines a f i de

compenser les pertes possibles durant les procédés de transformation ou

l'entreposage (Arnaud, 1993). La stabilité de l'acide ascorbique a été

largement améliorée dans une solution aqueuse simple et spécialement en

présence de composée simple constituants les aliments par l'encapsulation

dans les liposomes.

4.0 Spectroscopie en moyen infrarouge

4.1 Historique

L a spectroscopie infrarouge est certainement l'une des plus importantes

techniques andytiques utilisées par les chimistes d'aujourd'hui. Les

premiers spectromètres infmuges ont été commercialisés dans les années

1940. Dans les premiers temps, les spectromètres utilisaient un prisme afin

de convertir la radiation infrarouge en longueur d'ondes. Le prisme a été

replacé par un grillage de diffraction améliorant ainsi la résolution (Ismaii et

coll, 1997). Le plus grand avancement de la technologie en spectroscopie

infrarouge a été I'introduction des spectromètres à transformée de Fourier

(FT-IR). Ce type d'instrument emploie un interféromètre et un système

d'exploitation bien établi du processus mathématique des transformations de

Fourier. La spectroscopie à transformée de Fourier (FT-IR) a améliore la

qualité des spectres infrarouges et a minimisé le temps requis pour obtenir

les données (Ismail et coll., 1997 ; Stuart, 1996 ; Wilson et Goodfellow.,

1994).

4.2 Théorie générale de la spectroscopie infrarouge

Le spectre infrarouge peut être divisé en trois régions : I'infrarouge lointain

(0-400 cm-'1, le moyen infrarouge (4004000 cm-1) et le proche infrarouge

(4000- 15000 cm-1). La spectroscopie en moyen infrarouge implique

l'absorption par les molécules de radiation de longueur d'ondes comprises

entre 400 et 4000 cm1. L'absorption est transmise aux molécules a travers des états d'énergie transitionnelle, vibrationneiie et rotationneile (van de

Voort, 1992). On décrit les vibrations comme étant des mouvements

d'étirement et de repliement des molécules (Figure 1.5). La position exacte et

i'intensité des bandes d'absorption dépendent de la masse de I'atome et de la

constance de la force des vibrations. Ii est important de noter que ce ne sont

pas toutes les vibrations moléculaires qui donnent des bandes d'absorption

infmouge. Une vibration fondamentale donne un pic d'absorbance

seulement lorsquïl y a un changement dans le mouvement dipolaire de la molécule (Ismail et COU., 1997). Les différents groupes fonctionnels possèdent

des fréquences d'absorption caracténstiques qui leur sont propres, ce qui

permet de distinguer leur présence dans le spectre infrarouge du composé

(Ismail et cou., 1997).

Un spectre infrarouge est obtenu en passant une radiation à travers un

échantillon, et en déterminant ainsi quelle fraction de la radiation incidente

est absorbée avec un certain niveau d'énergie. Le spectre en moyen

infrarouge d'un composé contient d'abondantes informations structurales de

même que des caractéristiques physiques que l'on nomme : empreintes (van

de Voort, 1992).

4.3 Spectromètre a transformée de Fourier (FT-IR)

La méthode est basée sur l'interféromètre de Michelson et utilise le spectre

complet de I'échantillon au lieu des longueurs d'ondes individuelles générées

par un système de prismes utilise par un spectromètre conventionnel (van de

Voort, 1992). La radiation de la source passe a travers Iïnterfi!romètre avant

d'atteindre le détecteur (Figure 1.6). Une fois le signal amplifié, les données

sont converties en format digital par un convertisseur et transmises à l'ordinateur ou les transformations de Fourier sont effectuées (Stuart, 1996).

Il y a quatre principaux types de méthode utiiisée en moyen infrarouge soit A

transmission, en réfiectance spéculaire, diffuse ainsi que la réaectance totale

atténuée (ATR).

La spectroscopie à transmission est la plus vieille méthode et la méthode de

base la plus utilisée. La méthode est basée sur l'absorption des radiations infrarouges à une longueur d'onde spécifique lors du passage ê travers un

échantillon. Il est possible d'analyser des échantillons liquides, solides et des

gaz. Le choix de la cellule infrarouge est très important. Le matériel de la

fenêtre doit ëtre transparent aux radiations infrarouges. Différents types de matériaux sont disponibles : NaCI, KBr CaF2, BaF2, KC1, CsBr, CsI.

t symétrique

agitation torsion

Figure 1.5 Types de vibrations moléculaires : A ) vibrations

d'étirements ; B) vibrations de repliements.

Adapté de Ismail et coll., 1997.

miroir fixe ", position de l'insertion de l'échantillon 1 % détecteur

séparateur de bandes

miroir mobile

Figure 1.6 Schéma du principe du spectromètre infrarouge à

transformée de Fourier (FT-IR) base sur l'interféromètre de Michelson. Tiré de Wilson et Goodfellow, 1994.

Dans la technique de la réflectance totale atténuée, l'échantillon est place en

contact avec un cristal composé de matériau ayant un indice de réfraction

élevé. La lumière de la source infrarouge est émise a travers le cristal avec un

angle permettant la réflexion interne multiple entre la surface supérieure et

inférieure du cristal. L'onde engendré par la réflexion est atténuée lors de

l'absorption de la radiation par l'échantillon. (Ismail et coll., 1997 ; Wilson et

Goodfellow , 1994).

L a dmérence entre l'utilisation de la spectroscopie en ATR et en transmission

est basée sur le fait que l'échantillon ATR n'a pas besoin de transmettre la

lumière ou d'être transparent à la lumiëre. Le principal critère est d'avoir un

bon contact optique avec le cristal. Les matériaux mailéables, humides,

liquides et semi-solides donnent de bons spectres alors que les poudres

donnent des résultats moins satisfaisants (Wilson et Goodfeilow, 1994).

4.4 Analyse quantitative par moyen infrarouge

La spectroscopie IR étant une méthode d'analyse secondaire, le

développement des méthodes d'analyses nécessitent une calibration avec des

échantillons de compositions connues (standards), analyses dans un premier

temps par une méthode chimique de référence a h d'établir la relation entre

l'intensité des bandes infrarouges et la valeur des variables d'intérêts (Ismail

et cou., 1997). Une fois la calibration développée, il est possible d'analyser

des échantillons inconnus à condition de respecter deux exigences : (i) le

spectre de l'échantillon inconnu doit être enregistré dans les mêmes

conditions employées pour la caübration et (ii) la composition des

échantillons de calibration doit bien représenter la composition de

l'échantillon inconnu (Ismail et coii., 1997).

De même que pour les autres types d'absorption spectroscopique (ex : la

spectroscopie W-visible), la base de l'analyse quantitative en spectroscopie

infrarouge est basée sur la loi de Beer et Lambert (Ismail et COU., 1997)

L'absorbante d'un échantillon est directement proportionnelle a l'épaisseur et

la concentration d'un échantillon par la formule :

où (A) est l'absorbance (unité d'absorbance) de l'échantillon à cette fréquence,

(c) la concentration de l'échantillon et (1) le chemin parcouru ( p l . La constante de proportionnalité (E) réfère a l'absorption molaire de l'échantillon

à cette fréquence.

Mi d'obtenir un résultat d'analyse précis, il est préférable de préparer une

série de solutions des dürérentes concentrations, couvrant la région d'intérêt,

et de convertir la valeur d'absorbance a l'aide d'un graphique représentant

l'absorbance en fonction de la concentration du produit à analyser

(Figure 1.7).

4.5 Utilisations de la spectroscopie

des produits laitiers

en moyen infrarouge dans le secteur

Il y a de nombreux types de matériels qui peuvent être analysés par la

spectroscopie infrarouge (Stuart, 1996). Des composés organiques,

inorganiques, des polymères, molécules biologiques, polluants, drogues,

fibres, peintures, huiles et lubrifiants, produits chimiques reliés a

l'agriculture, additifs alimentaires, catalyseurs, minéraux, argiles, produits

organométalliques, produits pétroliers, etc., ont été étudiés par la

spectroscopie infrarouge.

L'application de la spectroscopie en moyen IR aux systèmes alimentaires a

été limitée par l'absorbante massive de l'eau dans le spectre moyen IR. Cette

méthode nécessite des cellules dont le parcours optique est très étroit

(40 pm), ce qui amène des dificultés avec la préparation des échantillons et

la manutention (Manning, 1972).

La spectroscopie infrarouge est utilisée pour le paiement du lait, c'est-à-dire

I'andyse des constituants majeurs du lait (les protéines, la matière grasse et

le lactose). Elle est, de plus, employée pour d'autres produits laitiers tels le

lactosérum et les crèmes (Anderson et Christensen, 1982 ; Ahmed et cou.,

1985). Le plus grand défi en analyse infrarouge est d'établir et d'améliorer la

précision des calibrations (Brown, 1985). Certains facteurs peuvent

influencer les mesures infrarouges. Les sources de vaziation sont inhérentes

aux produits à analyser. Les facteurs peuvent être classifiés en trois

catégories : les facteurs instrumentaux, physico-chimiques et biologiques

(Rémiliard et cou., 1993). Par exemple, le lait est un produit microbiologiquement sensible, vulnérable aux diverses activités etlzymatiques et variable dans sa composition physico-chimique. Malgré une

bonne précision de l'appareil utiîisé, ces facteurs peuvent atTecter la mesure

infiarouge pour les constituants du lait et peuvent interférer sur la

calibration.

L'eau absorbe fortement en spectroscopie infrarouge ; il est difficile d'étudier

des échantillons en solution aqueuse. Tou tefois, grâce a la spectroscopie

infrarouge a transformée de Fourier et à sa grande sensibilité, il est

maintenant possible de soustraire le spectre de l'eau des spectres

d'échantillons avec assez de précision (Samson, 1990)

5.0 But, hypothèse et objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer la stabilité de la vitamine D dans le fromage

Cheddar, selon trois différentes méthodes d'incorporation de la vitamine.

Suite a l'information présentée dans la revue de littérature, l'hypothèse

suivante a été formulée :

L'addition au lait de fromaegrie de vitamine D dans les liposomes (Prolipo-

Duo") permetterait la meilleure rétention de la vitamine D dans le caillé et

améliorait la stabilité de celle-ci dans le fromage Cheddar, durant son

affinage a 4 ' ~ sur une période de conservation minimale de 4 mois,

comparativement a l'addition de la forme hydrosoluble de la vitamine D

(Vitex-D) au lait de fromagerie ou a l'incorporation de la vitamine D dans une

fraction de la matière grasse du lait par un procédé d'homogénéisation.

L'objectif général de ce projet est de développer une nouvelle technologie pour

produire un fromage Cheddar enrichi en vitamine D qui sera simple,

économique, efficace et facilement utilisable au nieau industriel. La méthode

d'ajout de la vitamine D doit être optimisée de manière a réduire la perte de

vitamine D dans le lactosérum et de limiter ainsi sa contamination qui

pourrait affecter les utilisations subséquentes de ce sous-produit de

l'industrie fromagère.

Cette étude comprend deux volets qui visent les objectif's suivants :

Volet A : Réaliser une étude comparée des différentes technologies de

fortification du fromage Cheddar en vitamine D avec des objectifs

spécifiques :

ii)

Encapsuler la vitamine D dans les liposomes et mesurer

I'efEcacité d'encapsulation de la vitamine D.

Comparer les trois méthodes d'incorporation de la vitamine D la

vitamine D sous forme d'émulsion hydrosoluble (Vitex-D), la

vitamine D cristalline incorporée à une fraction de la crème et la

vitamine D hydrosoluble encapsulée dans les liposomes sur la

rétention de la vitamine dans le caillé et sa stabilité dans le

fromage lors de l'afliinage en utilisant un fromage contrôle non

enrichi en vitamine D.

Volet B : Mettre au point d'une méthode de mesure de la teneur en

vitamine D dans le lait, le lactosérum et le fromage par

spectroscopie en moyen infrarouge (FT-IR) . Les objectifs spécifiques de ce volet vont :

il

ii)

Üi)

Localiser le pic d'absorbante de la vitamine D dans le spectre en

moyen infrarouge.

Développer une méthode de calibration de la vitamine D dans le

lait.

Determiner la teneur en vitamine D dans les échantillons de

lait, de lactosérum et de fkomage issus de fabrications

fkomagères.

CHAPITRE II

Cornparoison of Different Methodr for Fortification of Cheddar Cheese with Vitamin D

Vitamin D enriched Cheddar cheeses were produced using these incorporation strategies : Vitamin D was added to milk at a concentration of 400 W/L as follows : addition of a water-soluble emulsion of vitamin D to raw milk before pasteurization, homogenization of crystalline liposoluble vitamin D in a smaii volume of cream used for cheesemiik standardisation and addition of water-soluble vitamin D entrapped into liposomes to raw milk. Recovery of vitamin D in the cheese curd, loss in the whey and stabiiity of vitamin D during cheese making and npening over a 4 months penod were assessed. The production of multilameilar liposomes was obtained with Rolipo-Duom. There was no significant influence of the method of vitamin D incorporation on the composition of the exptrimental cheeses (protein, fat, moisture and salt) which were not different from control cheeses made without vitamin D. A high vitamin D entrapping efficiency of 78 k 3 % was obtahed with Rolipo-Duom. The recovery in cheese of liposome entrapped vitamin D was signifïcantly different from the other processes (61.5 * 5.4 % compared to 40.5 î 2.2 % with vitamin D incorporated in crearn and 42.7 * 1.7 % with the emulsion of vitamin D. The vitamin D was stable in dl cheeses produced over four months of ripening.

Des fromages Cheddar enrichis en vitamine D ont été fabriqués en utilisant

trois méthodes différentes d'incorporation de la vitamine D (400 UI/L) au lait de fromagerie : l'addition sous forme d'une émulsion hydrosoluble de

vitamine D au lait cru avant la pasteurisation, I'homogénéisation de la

vitamine D (liposoluble) sous forme cristalline dans une portion de crème

utilisée pour la standardisation du lait et l'addition au lait cru, de la vitamine D hydrosoluble encapsulée dans les liposomes. Le taux de rétention de la

vitamine D dans le caillé, la perte dans le lactosérum ainsi que la stabilité de

la vitamine D lors de la fabrication fromagère et lors de l'affinage sur une

période de 4 mois ont été analysés. La production de liposomes

multilamellaires a été a l'aide des Rolipo-Duo? Une efficacité

d'encapsulation de 78 * 3 % de la vitamine D dans les Rolipo-Duo TM a été obtenue. Il n l a pas eu d'influence significative de la méthode d'incorporation de la vitamine D sur la composition chimique des fromages

(protéines, matière grasse, humidité et le sel) qui n'était pas différentes de

celle des fromages témoins produits sans addition de vitamine D. Le taux de

rétention dans le fromage de la vitamine D encapsulée dans les liposomes

était significativement différent des autres procedes utilisés. Les fromages

produits avec la vitamine D encapsulée dans les liposomes ont montri un

taux de rétention de la vitamine D de 6 1,s * 5.4 %, comparativement a 42,7 * 1.7 % pour la vitamine D sous forme d'i5muIsion et 40,5 I 2.2 % pour la vitamine D homogénéisée dans la crème. Pour chaque procédé

d'incorporation testé la vitamine D est stable dans le fromage sur une période

d'aar'mage de 4 mois.

INTRODUCTION

Vitamin D is added to foods to prevent rickets and to protect groups, which

rnay be insufficiently exposed to sunlight (Thompson and Plouffe, 1993). In

the diet, fluid rnilk is considered as a main source of vitamin D. However, a

large part of vitamin D in raw rn& is lost during heating (pasteurization or

sterilization) and by removing part of cream at the standardization step

(vitamin D is a liposoluble vitamin). Therefore, fiuid milk is supplemented in

U S and Canada with vitamin D to meet the requirements of 355-465

international unit (IU) per liter (Holick, 1990 ; Renken et Warthesen, 1993).

Vitamin D ingested in excess results in hypercalcernia, which is caused by

excessive absorption of massive quantities of calcium by the intestine and

enhanced bone resorption (Coilins and Norman, 199 1).

However, consumption of fluid rnilk products has gradually declined in the

last 20 years (Tanner et al., 1988), and lactose intolerance is a common

problem in the older adult population (Ryan et al., 1995). The

institutionalized elderly may need vitamin D supplementation to assure

adequate intake. Cheese is a universel consumption product. Cheese

consumption is expected to grow further in the future due to increased purchasing power and a lot of recently developed cheeses (IDF, 1997).

Cheddar cheese, one of the most popular cheese in North America, could be an alternative to fiuid milk, as a source of vitamin D. In addition, hard

cheeses such as Cheddar cheese only contain low traces of lactose and can

be consumrned by lactose intolerant people. in US, reduced fat cheeses are supplemented with pitamin A, but there is no information available on the

fortification with vitarnin D in cheese. Cheese enriched with vitamin D would

be a dietary source of vitamin D for people that takes less fortifed miik, like

older adults. Vitamin D supplementation in cheeses must be controlled to

ensure the desired level in the final cheese and not to exceed the critical

limits. Cheesemaking produces large amount of whey. Cheese whey is nch nutritiomally, retaining approximately 52 percent of solids of the whole milk used in Cheddar cheesemaking (Kowsikowski, 1982). Whey is treated to

improve it9s vdorization. Further uses of whey products could be

contaminated with vitamin D if high level are present in whey.

The aim of this study was to compare different methods for fortifying

Cheddar cheese with vitamin D. To minirnize the loss of vitamin D in whey

during cheese manufacture, liposoluble or hydrosoluble (commercial) vitamin

D was entrapped in m a t or in liposomes, respectively. Retention of vitamin

D in cheese curd and stability of vitamin in experimental cheeses during

npening were measured and compared with data obtained frorn Cheddar

cheeses made with non encapsulated vitamin D, Vitex-D.

Wuter-soîubla emutlon of ottomln D. Raw miik was obtained from Ferme SMA (Quebec, PQ, Canada). Raw rnilk (15 kg) was enriched with a water-

soluble emulsion of vitamin Da (Vitex-D, 205 000 IU/ml = 5 125 pg/ml, Kingsway Chocolate Co. Limited, Bunge Foods, Mississauga, ON, Canada) to

a fmal concentration of 400 IU/L or 0.01 pg/ml prior to pasteurization which

corresponds to vitamin D concentration used in fluid milk.

92tanrin D in ndlk f i Raw whole milk was separated at 53'C (Westfalia

separator, type LWA 205, Centnco Inc., Englewood, N J , USA) into skim rnilk

and cream 33 % m a t . A s m d volume (30 mi) of cream was homogenized

using a Milko-Scan 133B (N. Foss Electric, Houerad, Denmark) with 300pi of

cris taiiine vitamin D (cholecalciferol, Sigma Chemicals, Saint-Louis, MO,

USA) solubilized in ethyl alcohol (1 mg/ml). A volume of 15 ml of fortEed

cream was added to 15 kg raw milk before pasteurization so as obtain a final

concentration of 400 IU of vitamin D per L of cheesemik.

V ' t a m t n D i 1@oromes. The water-soluble vitamin D preparation (Vitex-D)

was entrapped in liposomes according to the method descnbed by Dufour et al. (19%). Half a gram of pro-liposome mixture (Prolipo-Duo", Lucas Meyer,

Chelles, France) was converted to a concentrated liposome suspension by

adding 150 pi, of vîtamin D solution (1 mg/mï), and blended for 2 minutes

at room temperature. The suspension was gradudy diiuted by addition of

5 ml of raw milic. The multilamellar veside (MLV) suspension was directiy

added to 15 kg of raw milk prior to pasteurization (final concentration of

400 IU of vitamin D/L of cheesemilk).

Cheddar ch- making procdiue

A volume of 15 ml of cream was added to milk with Vitex-D, vitamin D in

liposomes and control miIk without vitamin D to standardize the miik fat

concentration before pasteurization to that of milk with vitamin D added in

15 ml of homogeneized cream. The cheesemilks, with or without vitamin D,

were pasteurized (72°C - 15 sec, pasteurbator Alpha-Laval type P20-HB #2235- 19 10, Sweden) and held ovemight at 4°C before cheese manufacture.

Experimental cheddar cheeses made from milk added with Vitex-D,

cristalline vitamin D homogeneized in cream, vitamin D encapsulated in

liposomes at a final concentration of 400 IU/L and f indy control cheeses without vitamin D were rnanufactured from 12 kg of pasteurized mi&, using

a computer-controlled laboratory cheese plant with 4 vats (15 L maximum

capacity) (INRA, Poligny, France).

The pasteurized milks (12 kg) were heated at 32'C in cheese vats before

inoculation. A frozen concentrated direct-to-vat starter (# 91 1, Chr. Hansen

Inc., Mississauga, ON, Canada] was added at 1.92 ml/ 12 kg of milk foiîowed

by 2.16 mi/ 12 kg of 45 % v/v calcium chloride solution. After 30 minutes

npening at 32'C, double-strength remet (Chy-Max II 500, Chr. Hansen Inc.,

Mississauga, ON, Canada) was added to each vat (1.08 ml diluted in 20 ml of water). The mixture was stirred for 60 sec and held for approximatively 45

minutes. The coagulation was monitored by a coagulometer (INRA brevet 8800803, Poligny, France). The pH (Accumet, Mode1 15 pH Meter, Fischer

Scientific, Ottawa, ON, Canada) and temperature were monitored over a

period of approximately 5 hours. The coagulation method allows to visuaiize

the coagulation cinetic and the determination of the floculation tirne. The

cutting time was deterrnined by the relation of a multiplication factor of the

floculation üme, approximatively 45-60 minutes (Laporte, 1996). The curd

was heated h m 32 to 38°C in 40 minutes with stirring (15 rpm) and

temperature was maintained at 38°C for 4 hours. The whey was drained

when pH in the whey was 6.0. The cheddaring process was carrieci out in the

vat heated at 38'C, until a pH of 5.3 was reached in curd. The curd was

milled and dry salted (2.3 % wt/wt). After salting, the curd were pressed at

an applied pressure of 60 Ib/po2 for 16 hours at room temperature. Then 50

g cheese samples were taken for composition analyses. The pressed cheeses

were vacuum-packaged, ripened for 1 month at 13°C and then stored at 4°C

for 4 months. Monthly during 4 months ripening period a portion of 50 g of

cheeses were taken for composition and vitamin D analyses after which the

remaining cheeses were vacuum-packaged. Each cheese manufacture was

repeated 3 times.

Chernicd composition

Fat contents of milk and whey were detennined by the Mojonnier methods

(AOAC, 1990). Cheese fat was measured by the Babcock method (AOAC,

1990). Total proteins in miik, whey and cheeses were deterrnined by the

Kjeldahl method (IDF, 1993). Cheese moisture was measured gravimetrically

(lOO°C for 4 hours) foliowing the AOAC pmcedure (1990). Salt analyses were

performed by using a DicromateO Sait Analyser (Diarnond Cxystal Sait, St-

Clair, MI, USA). A sample of 10 g of cheese was blended with 100 ml of

deionized water for 60 sec. The solution was poured into a filter (Whatman

#4, Whatman international Ltd., Maidstone, England) to retained solids, and

passed throw the column of the salt analyzer. Sait percentage of the product

corresponds to the value indicated on the digitai screen. Ali tests were duplicated.

Cheese samples (50 g) taken after manufacture and monthly during ripening

were vacuum-packaged and stored at -20°C for a maximum period of 2

weeks before analysis. Vitamin D was measured by HPLC (AOAC, 1990) in

an accredited laboratory for vitamin analysis (Oak Park Laboratory Inc.,

hiscola L, USA). Cheese milk (250 ml), whey (250 ml), cream enriched with

vitamin D (150 ml] were also stored at -20°C (one week maximum) before

vitamin D analysis. During transportation, samples were mahtained freezed

in an insolated box filled with dxy ice. Analyses were done in duplicate.

Liposome U y s b

hccrpsuüztton pi[Pdenq @@). The liposome suspension was recovered by

ultracentrifugation (Ultracentrifuge Bechan@, Mode1 L8-70M, Pa10 Alto, CA,

USA) at 100 000 g and 20°C for 1 hour. The supernatant was removed and

the pellets were suspended in 10 O/O (v/v] Triton X- 100 (BDH, Montreal, PQ,

Canada) in deionized watet and sonicated for 30 minutes to break the

liposomes and release the encapsulated vitamin D. Vitamin D content of both

supernatants and pellets was determined. The encapsulation efficiency (EE)

was determined as the percentage of vitamin D encapsulated in liposomes.

Analyses were repeated twice for the 3 liposomes solutions prepared for each

cheese manufacture.

li.cuund#lon 8-n mfcrwcopg. Liposome suspensions were observed

by transmission electmn micmscopy using positive staining. The liposome

suspension was prepared and fixed in 2 % (w/v) glutaradehyde and 0.5 %

tannic acid in 0.1 M phosphate buffer (pH ES), and then pre-coated with a

bovine senun albumin 20 % (v/v) solution and 2-3 drops of glutaidehyde

25 % (w/v) to protect the specirnen. The samples were washed with 0.1 M

phosphate buffer (pH 7.5), and then fked with 1 % (w/v) osmium tetroxide

phosphate buEer (pH 7.5), and then hxed with 1 % (w/v] osmium tetroxide

for 1 h at 22°C. Dehydration was perfomed in graded ethanol series (50, 70,

90 and 99 %) and the dry samples were embedded in Epon 8 12. Ultrathin

sections (75 nm) were cut with an ultramicrotome, collected on formvar-

coated copper jpids and stained with uranyl acetate before observation

(120 K) by transmission electron microscopy (GEOL 10 10, GEOL Canada, St-

Hubert, PQ, Canada] at 60 kV.

The experimentai design was a complete biock factorial design with 3

experimental cheeses (Vitex-D, vitamin D in cream and vitamin D in

liposomes), and a control cheese without vitamin D, which was repeated three times over a period of one month.

The General Linear Mode1 (GLM) procedure of SAS@ (SAS, 1989) was used for

analyses of variance and multiple comparaison tests. The significance of

blocks, treatments, ripening tirne and interaction between treatmen ts and

ripening tirne were tested by analysis of variance of a complete block factorial

design. A multiple comparaison test on means, the protect least significant difference (LSD) test, was used to test for signifi~cance of treatments (Steel

and Tome, 1980). Statistical analyses were made with a level of significance

of P < 0.05.

Fat and protein contents for experimental and control milks and wheys are shown in Table 2.1 There was a smail but signüicant difference in fat between milk containing liposomes, Vitex-D added milk and control milk.

However, no difference in milk protein was observed The protein and fat

content of whey were not signifcantly düferent among the different

treatments (P > 0.05).

Table 2.1 Rotein (96 w/w) and fat (96 w/w) composition of mille and whey

Control Vitex- D Cream Liposome LSD Roducts

Pro tein - x 3.147 3.139 3.143 3.146 0.038 SD 0.011 0.007 0.028 0.001

Fat - x 3.366 3.365 a 3.347 ab 3.284 b 0.066 SD 0.044 0.078 0.065 0.037

Protein / Fat

Rotein - x 0.819 0.815 0.809 0.818 0.022 SD 0.018 0.005 0.005 0.007 Fat - x 0.374 0.393 0.389 0.40 1 0.037

Means (1313) witbin the same row without a c o r n e supm&ipt dinu (P c 0.05). Leck of superscript in a row mdiratcs no m c a n t düfcrrnces among means.

M u r bjuice of protdn and fat in d î k and whey

PiPtdn &&wtcee The actual mass balance of N in whey and curd is shown in Table 2.2 Mass balance for the control and the treatments with different

methods of vitamin D incorporation were very close to 100 % and no

signifiant difference (P > 0.05) was detected in the total mass balance of N

for control and treatments.

F'at bolavuree The actual mass balance of fat in whey and curd is shown in

Table 2.2 Mass balance for the control and treatments with different types of

vitamin D incorporation were in the range from 97.6 to 100 %, and no

signifïicant difference (P > 0.05) was detected for control and treatments.

Table 2.2 M a s s balance of fat P/o) and protein (O/).

Control Vitex-D Cream Liposome LSD

Protein - x 99.88 100.72 100.28 99.8 1 2.17 SD 0.58 1 .O2 1.16 1.1 l

Fat - x 98.15 97.62 98.93 99.97 3.42 SD 2.48 1.57 2.1 1 0. 15

Reportecl data are mean and standard deviation of triplicate cxperimcnts. ~ëans(n=3) wit)iin the same row without a cornmon &perscriit difkr (P c 0.05).

Lack of superacript in a row mdicafts no w c m t diffèrenas among means.

The encapsulation efficiency of vitamin D in Rolipo-Duo TM was measured for ail cheese productions and a relatively high emciency of 78 i 3 % was obsemed (Table 2.3). Dufour et al. (1996), reported that immobilization eficiency of a chymotrypsin solution (1% (w/v)) was 96 % in liposomes 3045

S and 68 % in liposomes 3080 S. The immobilization effciencies of an

aminopeptidase contained in celi-free extracts (CFE) of Lactobatillus casei ssp. psmdoplantarum UL 137 in a Pro-lipo@ S mixture were between 55 and

60% (Laloy et al., 1998). A value of 65 % encapsulation emciency was

reported with imrnobiîized Neutrase in fkeeze-thawed and extnided

multilamellar vesicules (Fresta et al., 1995). Data obtained in this study

confmed the high potentiai of liposomes obtained from pro-liposomes, to

encapsulate dflerent types of materials, as previously reported by Laloy et al., 1998 ; Dufour et al., 1996.

Table 2.3 Characterization of the immobilimtion of vitamin D in liposome prepared with Ro-lipo Duo TM

SD 0.0 12 0.01 1 3.2 4 .O

* Reported data are means and standard deviations of tripiicate ocperimmts. CS = concmtration of vitamin D in supernatant ; CL = Concentration of

cncapsulated vitamin D entrapped inside liposomes; EE = Encapdation effiuency ; VS = vitiunUi D in supernatant

The encapsulation efficiency was not taken into account to adjust the concentration of vitamin D needed to fortitied cheesernilk with 400 IU /L

(request level of fomcation). The total suspension solution was used to

enrich cheesemik. Therefore, the vitamin D entrapped into liposomes (about 80 %) and the hction of about 20 % of hydrosoluble vitamin D (not

encapsulated) were used in the production of experimentai cheese containhg

liposomes.

Electron microscopy observations demonstrated the multiiarneiiar structure

of liposomes obtained from Rolipo-Duon (Figure 2.1). Liposomes behave as

closed microscopic bags able to encapsulate large amount of aqueous medium. Water-solu ble ingredients (vitamin D) dissolved in this medium are

entrapped inside the liposomes. hirthermore, 02-soluble compounds can be

efficiently enclosed in the phospholipid bïiayer (Arnaud, 1995).

Figure 2.1 Microstmcture of a Liposome

obtained from holipo-Duo".

Cheese Composition

The chernical composition of cheeses is shown in Table 2.4 There is no

significant Merences between treatments for protein, fat and salt contents of

the cheeses. However, signifïcant difFerence (P > 0.05) were observed in

pourcentage of moisture between experimental cheeses made with cream containing vitamin D and in cheeses containing liposomes (39.47 and

38.03 % moisture, respectivelyj.

Table 2.4 Chernical composition of cheeses (% w/w). -- - . -

Control Vitex-D Cream Liposome M D

Rotein - x 25.34 25.75 25.34 25.73 0.85 SD 0.63 0.62 0.40 0.09

Fat - x 31.10 30.92 30.83 31.17 1 -00 SD 0.57 0.62 0.96 0.77

Moistue - x 38.47 ab 38.91 ab 39.47 38.03 1-38 SD 0.73 1.25 O. 14 0.73

Salt - x 1.69 1.69 1.62 1.58 0.1 1 SD 0.20 0.18 O. 16 0.15

Reported data arc means and standard deviations of tripkate upriments Means (n=3) within the same row without a common supenaipt mer (P < 0.05). Lack of

superecript in a row indicates no W c a n t ciifferences among means.

In contrast with previous work with liposomes (Laloy et ai., 1998 ; Larivière et al., 1991) which reported a small moisture increase in cheeses containing

liposomes, no difference was detected in moisture between experimental and control cheeses in this study (Table 4). This result could be explained by the low volume of liposome suspension added to cheesern.Uk : 5 mi/12L

compared to 25 mil8 L for Laloy, et al. (1998), and 232 mï/40L for Larivière et al. (199 1). In the latter case, the presence of liposomes greatiy increased the moisture of Cheddar cheeses, modifling the microstructure and the

rheolo@cal characteristics of the ripened cheeses. Cheeses containing liposomes were softer, less cohesive and elastic, and more brittie than control

cheeses. Observations on cheese microstructure showed that some liposomes were included in the casein rnatrix, but most vesicules were located in areas

close to fat globules (Laloy et al., 1998).

mem. The actual cheese yields for experimental and control cheeses are shown in Table 2.5 Mean actual cheese yields for the different treaûnents were in the range fkom 9.40 to 9.63 kg1100 kg. There was no signüicant

difierence for actuai cheese yield among the different cheeses (Vitex-D,

cristalline vitamin D in a cream portion and vitamin D in liposomes) or with

the control cheese.

Table 2.5 The effect o