Post on 25-Feb-2019
BD FACSCalibur™ flow cytometer
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)
Un citometro a flusso è essenzialmente costituito di:
• Sistema fluidico per il trasporto del campione e la sua focalizzazione idrodinamica
• Sistema ottico • Circuito di rilevazione • Elettronica per l’acquisizione, elaborazione e
presentazione dei dati.
Sample
Sheat pressure regulator
waste Sheat fluid
Air pump
Flow chamber
Air filter
Sample pressure regulator
Filter
The fluidic system
Hydrodynamic focusing
High sample flow rate 60µl/min
Laminar Flow
Laminar Flow
Sheath Sheath Sheath Sheath Sample Sample
Low pressure High pressure
Sample core
Low sample flow rate 12µl/min
LIGHT SCATTER
FSC
SSC
Incident light
source
Diffrazione Proporzionale all’area della cellula. Rilevata lungo l’asse della luce incidente 0°.
Rifrazione e Riflessione proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità. Rilevate a 90° rispetto la luce incidente
LASER
Discrimination of different cell populations in human blood based on light scattering
Sid
e S
catte
r Forward Scatter
lymphocytes
granulocytes
monocytes
Lysed whole blood
Characterization of unstained cells using light scatter
The fluorescence phenomenon
E’ il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa di definita lunghezza d’onda (λ) ne emette un’altra a λ maggiore e ad energia inferiore.
FLUOROCROMI
Molecole fluorescenti che assorbono energia dal laser e rilasciano l’energia assorbita per:
- Vibrazione e dissipazione del calore - Emissione di fotoni di una lunghezza d’onda più lunga. Sono coniugate a ligandi o anticorpi monoclonali specifici per
molecole biologiche con significato antigenico o recettoriale posizionate sulla membrana cellulare, nel nucleo o nel citosol; altri “colorano” direttamente altre sostanze (DNA, RNA, proteine, ioni citoplasmatici).
Anche le cellule non marcate con alcun fluorocromo presentano una debole fluorescenza di fondo, l’autofluorescenza, misurabile.
Absorption and emission spectra of a fluorochrome (Stokes shift)
Ogni fluorocromo presenta una caratteristica banda di λ per l’eccitazione e per l’emissione
I fluorocromi attualmente più usati in citofluorimetria sono:
• FITC • PE • Fluorocromi tandem • APC • PI (Propidium Iodide) • PerCP
Ciascun fluorocromo è caratterizzato da una particolare BRILLANTEZZA.
Absorption and emission spectra of different fluorochromes
RPE APC FITC PerCP PI
400 450 500 550 600 650 700
1000
800
600
400
200
0
400 450 500 550 600 650 700
RPE APC FITC PerCP PI
Wavelenght (nm)
Absorption spectra Emission spectra
Tandem fluorochromes
767 650 APC-Cy7 (PharRed)
670 488 PE-Cy5 (Cy-chrome)
695 488 PerCP-Cy5.5
Composti fluorescenti costruiti unendo fra loro molecole con proprietà fotofisiche complementari, atte a sfruttare il principio di trasferimento dell’energia.
FITC FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Fluorescence intensity
Num
ber o
f eve
nts
Emitted fluorescence intensity ∝ binding sites
Correlation between number of binding sites and fluorescence intensity
Staining of cells with fluorochrome conjugated antibobies specific for surface antigens
Antigen A
Antigen B
anti-B Antibody
anti-A Antibody
fluorochromes
washing Incubation
acquisition
Incubation washing
acquisition
Single and three colours staining
Acquisition and
Analysis
Incubation
washing
Second antibody Goat Anti-Mouse Ig FITC
First unconjugated mouse antibody
Incubation
washing
Indirect staining
Optic system of a flow cytometer
FITC
SSC
PE / PI
PerCP 7-AAD PE-Cy5 FSC
460 500 540 460 500 540 460 500 540
SP 500 LP 500 BP500/50
Longpass Shortpass Bandpass
Optical filters
FL1
SSC
FL3
FL4
670LP
661/16
585/42
488/10
90/10 Beam Splitter
DM 560SP
Fluorescence Collection Lens
DM 640LP
Half Mirror
488/10
. FSC Diode
Focusing Lens
FL2
530/30
Beam Combiner Flow Cell
Flow Cell
Optic system of a BD FACSCalibur flow cytometer, equipped with two lasers
I segnali di fluorescenza emessi dalla cellula vengono raccolti da lenti poste ortogonalmente al fascio di eccitazione, selezionati con opportuni specchi separatori di fascio, specchi dicroici e filtri ottici e portati ciascuno ad un diverso PMT.
FLUORESCENCE MEASUREMENTS
Generation of an electrical pulse
Time
Volta
ge
Time
Volta
ge
Time Vo
ltage
Sensori denominati PMT o detectors trasformano i segnali ottici in intensità di corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale in maniera lineare o logaritmica.
Conversion of electrical pulses in digital values
Time (µSec)
Volts
Pulse area
Puls
e he
ight
pulse
width
40 0
1000
Channels
Analog to digital
converter 0
FSC
SS
C
FL1
FL2
FL3
I segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici, ossia proporzionali in maniera continua alle dimensioni del parametro misurato. Un convertitore “spezzetta” i valori continui rendendoli discreti a seconda del numero di canali a disposizione.
1000 500 0
Num
ero
di C
ells
510 500 490
Incremento di intensità
Histogram plot
Il diagramma ad istogrammi rappresenta graficamente la misura di un singolo parametro. Gli eventi che si accumulano nei vari canali vanno a costruire un diagramma di distribuzione.
Histogram analysis
La statistica si basa sulla impostazione di cursori che definiscono le aree di interesse calcolando gli eventi che cadono al loro interno.
101 FL-1
even
ts
even
ts
101 FL-1
even
ts
even
ts
Unstained sample Stained sample
marker
Background fluorescence
Antibody + cells
Antibody - cells
HISTOGRAM
Dot plot
400 800 1000 0 0 200 400 600 800 1000 0
200
400
600
800
1000
FL1
FL2
840
85
245 638 FL1
FL2
0
200
400
600
800
1000
200 600
Il diagramma di dispersione a punti o dot plot rappresenta la correlazione fra due parametri, in cui ogni punto rappresenta un singolo evento dotato di un particolare valore per ciascuno dei due parametri.
Dot plot analysis
UL
LR LL
UR
CD3 FITC
CD4
PE
UL CD3-/CD4+
UR CD3+/CD4+
LL CD3-/CD4-
LR CD3+/CD4-
Upper Left Single positive
Upper Right Double positive
Low Left Double negative
Low Right Single positive
quadrants
DOT PLOT
Ficoll
stratification
blood centrifuge
erytrocytes +
granulocytes
Plasma +
platelets
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells = PBMC
Ficoll
Isolation of PBMC by ficoll gradient centrifugation
Immunophenotyping technique for determining % of CD4 and CD8 T cells
CD45 PerCp
SSC
CD3 FITC
CD
4 A
PC
CD
8 PE
CD3 FITC
SPT-specimen processing
Vortex Tube with beads
Acquisition and Analysis
50 µL whole blood (EDTA)
20 µL Antibody mix
450 µL FACS Lysing buffer (1x)
Vortex
15 Minutes @ Room Temperature, dark
15 Minutes @ Room Temperature, dark
SPT-sample analysis
No. of events in the bright CD45 region
No. of events in the microfluorosphere region
Total no. of microfluorospheres added
Volume of blood added
X = Absolute no. of CD4
Microfluorosphere
CD3 FITC
CD
4 P
E
CD45 PerCP
Granulocytes
Lymphocytes
Monocytes
Microfluorosphere
Sid
e S
catte
r
ELISpot
Antigens
PBMC
MoAbAnti-IFN-γ
PBMC
Antigen
IFN-γ
Enzymatic reaction
Capture anti-cytokine
antibody
CYTOKINE
Detection anti-cytokine antibody
Chromogen Substrate
insoluble coulored product
ELISpot
Enzyme conjugated to the detection antibody
ELISpot
Simultaneous phenotypic (naive/memory phenotype) and functional (IFN-γ production) characterization of antigen stimulated CD8 T lymphocytes
Naive CD45RA+CCR7+
Memory CD45RA-CCR7+
Pre-Effector CD45RA-CCR7-
Effector CTL CD45RA+CCR7-
CC
R7
CD45RA
CC
R7
CD45RA
IFN
-gam
ma
CD8
R1
R2
IFNγ-positive cells (R1) IFNγ-negative cells (R2)
Forward Scatter
Side
Sca
tter
CD3 APC
CD
8 Pe
rCP
Lymphocytes (R1)
1,11% 0,05% 69,27% 29,56 %
Perforin FITC
IFN
-gam
ma
PE
CD3+ CD8+ Lymphocytes (R1 and R2)
Simultaneous phenotypic and functional (IFN-γ production and cytotoxic potential) characterization of antigen stimulated T lymphocytes
Class I MHC Tetramer
Analysis of proliferation by CFSE labelling
CFSE PHA 1 µg/ml CFSE PHA 0,5 µg/ml
CFSE Not stimulated
No CFSE
Analysis of the proliferation of PHA stimulated CD8 T lymphocytes by CFSE labelling
CD
4
CFSE (Fluorescence intensity FL1)
Proliferation (cell division)
Not stimulated Stimulated with PHA
Analysis of the proliferation of PHA stimulated CD4 T lymphocytes
A B
Analisi del ciclo cellulare
Analisi del ciclo cellulare
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio)
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio + Annessina V)
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio + Annessina V)
http://www.bdbiosciences.com/support/training/itf_launch.jsp