UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA
“DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA EN HPLC PARA ESTANDARIZAR UN EXTRACTO DE BUDDLEJA GLOBOSA
HOPE, BUDDLEJACEAE Y EVALUACIÓN DE LA CESIÓN DEL EXTRACTO DESDE UN GEL DERMATOLÓGICO”
PROFESOR PATROCINANTE DIRECTORES DE TESIS DRA. CARLA DELPORTE VERGARA PROF. OLOSMIRA CORREA BRIONES Depto. De Química Farmacológica y Depto. De Ciencias y Tecnología Toxicológica Farmacéutica. DIRECTORES DE TESIS PROF. EDDA COSTA CASTRO Depto. De Ciencias y Tecnología Farmacéutica.
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
GABRIELA VALENZUELA BARRA
SANTIAGO – CHILE 2009
AGRADECIMIENTOS
Primero que todo agradezco a Dios por todas las bendiciones que me ha
otorgado durante toda mi vida.
Además deseo expresar mi máxima gratitud, admiración y respeto hacia la
profesora Carla Delporte, una persona que representa un ejemplo de profesionalismo,
humanidad y un gran modelo a seguir. Para ella infinitas gracias por todo el apoyo,
aprecio y los hermosos momentos compartidos.
De igual forma quisiera agradecer a las profesoras Nadine Backhouse, Edda
Costa, Olosmira Correa y Silvia Erazo por todo el apoyo e interés brindado durante mi
carrera y la realización de mi memoria.
A mi madre le debo agradecer por ser el gran pilar de mi vida, nada de esto
hubiera sido posible sin su gran ejemplo de esfuerzo, sacrificio y amor. A mi hermano
mi más sincera gratitud por el apoyo e incondicionalidad.
También debo hacer un gran reconocimiento a Diego López una persona muy
especial que me ha apoyado durante todo este período y a la cual amo profundamente.
A mi gran amiga Karina Toledo y mis queridos compañeros y amigos de carrera
Nidia Zamorano, Angelina Rivas, Claudia Zúñiga, María José Reiman, Marta Samur,
Leslie Escobar José Luis García y Claudio Méndez, mi más sincero respeto por todo el
apoyo, aprecio y ayuda entregada durante todo este proceso.
Finalmente toda mi gratitud y cariño a la hermosa familia del Laboratorio de
Productos Naturales y en especial a Carlos Cartagena, María José Queupil, León
Goîty, Valentina Toro, Nicolás Cavas, Cindy Silva, Andrea Orellana, Marcelo Peña,
Pamela Zapata y David Aravena, por la ayuda incondicional y los hermosos momentos
atesorados en mi corazón. Sinceramente gracias.
I
INDICE GENERAL
RESUMEN ......................................................................................................... VIII
ABSTRACT .......................................................................................................... X
I.- INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
II.-HIPÓTESIS ....................................................................................................... 4
III.- OBJETIVOS
1.- Objetivos Generales ................................................................................ 4
2.- Objetivos Específicos .............................................................................. 5
IV. ANTECEDENTES PREVIOS
1.- Descripción botánica de la planta ............................................................. 6
2.- Usos en la medicina tradicional ................................................................ 7
3.- Estudios previos de B. globosa
3.1.- Estudios químicos anteriores .......................................................... 7
3.2.- Estudios farmacológicos anteriores ............................................... 11
V.- MATERIALES Y MÉTODOS
1.- Reactivos ............................................................................................. 13
II
2.- Estudios químicos
2.1.-Obtención de los diferentes extractos de B. globosa ......................... 13
2.2.-Estudios cromatográficos
2.2.1. Análisis cualitativo por c.c.f del EET .................................... 14
2.2.2.-Defecación y fraccionamiento
2.2.2.1.- Defecación del EET ....................................... 14
2.2.2.2.- Fraccionamiento del EET. ............................. 15
3.- Análisis cuantitativo del EET
3.1.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico obtenido del
EET por metodología HPLC ................................................................ 22
3.2.- Preparación de las soluciones para HPLC ...................................... 22
4.- Evaluación de la cesión de los principios activos desde el gel de EET
4.1.- Elaboración de los geles
4.1.1.- Gel de EET al 1% ............................................................. 23
4.1.2.- Vehículo gel de carbomer ultra ........................................... 24
4.1.3.- Gel de ácido cafeico al 1% ................................................ 24
4.1.4.-Gel de 7-O-glucósido de luteolina al 1% .............................. 24
4.2.- Equipo de disolución .................................................................... 24
4.3.- Sistema de incorporación de las muestras al equipo de disolución...25
4.4.- Toma de muestras ....................................................................... 26
5.- Ensayo de inhibición de la enzima glicógeno fosforilasa (GPa) .................. 27
5.1.- Preparación de los reactivos ......................................................... 27
5.2.-Protocolo del ensayo de evaluación de la actividad inihibidora de la
GPa ................................................................................................... 30
III
VI.- RESULTADOS Y DISCUSIONES
1.- Estudio químico
1.1.- Obtención del EET ....................................................................... 34
1.2.- Defecación y fraccionamiento del EET
1.2.1.- Defecación del EET .......................................................... 35
1.2.2.- Fraccionamiento del EET .................................................. 36
2.- Análisis cuantitativo del EET
2.1.- Diseño de la metodología HPLC .................................................... 36
2.2.- Perfil cromatográfico del EET (HPLC) ........................................... 37
2.3.-Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico por
metodología HPLC
2.3.1.-Curva de calibración del ácido cafeico ................................. 38
2.3.2.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico ...... 40
3.- Evaluación de la cesión de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina
3.1.- Determinación de la cesión del verbascósido .................................... 40
3.2.- Determinación de la cesión del 7-O-glucósido de luteolina ................ 44
4.- Ensayo de inhibición de la enzima Glicógeno fosforilasa (GPa) ............................. 44
VII.- CONCLUSIONES .......................................................................................... 46
VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 47
IV
INDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: Flores y hojas de B. globosa Hope .......................................................... 6
FIGURA 2: Infrutescencia y arbusto de B. globosa Hope ........................................... 7
FIGURA 3: Equipo de disolución Pharma test (type PTW S III) ............................... 25
FIGURA 4: Sistema de incorporación del gel al equipo de disolución ...................... 26
FIGURA 5: Esquema comparativo de los rendimientos de los diferentes extractos
activos seriados de matico ..................................................................... 35
FIGURA 6: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en Padre Las Casas (EET
1,58 mg/mL, en MeOH 100% a 365 nm) ................................................ 37
FIGURA 7: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en el campus Antumapu
(EET 1, 87 mg/mL, en MeOH 100% a 365 nm)...................................... 38
FIGURA 8: Curva de calibración del ácido cafeico ................................................... 40
FIGURA 9: Cromatogramas patrón ácido cafeico y gel vehículo carbomer ultra .... 42
FIGURA 10: Cromatogramas gel de EET al 1% y gel de ácido cafeico al 1% ........... 43
V
INDICE DE TABLAS
TABLA 1: Compuestos aislados e identificados desde B. globosa .......................... 8
TABLA 2: Algunos constituyentes químicos de B. globosa ................................... 9
TABLA 3: Resumen de las actividades farmacológicas encontradas en diferentes
extractos e infusiones de B. globosa ...................................................... 11
TABLA 4: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC1Sil…..……………16
TABLA 5: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC2Sil…..……………17
TABLA 6: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC3Sil ...................... 18
TABLA 7: Resumen concentrado de fracciones CC3Sil …………………………. ... 19
TABLA 8: Resumen concentrado de fracciones de CC4Seph y CC55eph…….…...21
TABLA 9: Formulación gel de EET al 1%…………………………. ....................... …23
TABLA 10: Disposición de las muestras en el equipo de disolución ........................ 27
TABLA 11: Protocolo de trabajo del ensayo de inhibición de la enzima GPa……....32
VI
TABLA 12: Valores de concentración versus área empleados en la curva de
calibración del ácido cafeico .................................................................. 39
TABLA 13: Resultados del ensayo de Inhibición de la GPa…………………………45
VII
ABREVIATURAS
A : absorbancia
AcOEt : acetato de etilo
B : HEPES 50 mM (pH 7,2)
BS : buffer + sales (pH 7,2)
CC : columna cromatográfica
c.c.f : cromatografía en capa fina
CN : control negativo
CNE : control no enzimatico
DCM : diclorometano
DMSO : dimetilsulfóxido
DPPH radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo hidratado
EDCM : extracto de diclorometano
EET : extracto etanólico seriado de hojas secas y molidas recolectadas
en verano de B.globosa
EHEX : extracto de hexano
EtOH : etanol
Fase 4A : Acetato de etilo: ác. fórmico: ác. acético: agua = 10: 1,1: 1,1: 2,6
Gli : glicógeno
GPa : glicógeno fosforilasa
G1P : glucosa-1-fosfato
HEX : hexano
HPLC : cromatografía líquida de alta resolución
MeOH : metanol
NP : 2-aminoetil difenilborinato al 1% en metanol
Rpm : revoluciones por minuto
SD : medio de detención
TPA : 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato
UV : ultravioleta
VIII
RESUMEN
Existen diversos antecedentes de las propiedades farmacológicas de B.
globosa tanto de su actividad analgésica como antiinflamatoria en trabajos anteriores
realizados en nuestro laboratorio, como también en publicaciones científicas, esto
condujo a continuar con el estudio farmacológico y químico de esta especie.
Uno de los objetivos de nuestro trabajo consistió en aislar el verbascósido y el
7-O-glucósido de luteolina, además de comparar los rendimientos de los diferentes
extractos obtenidos a partir de hojas recolectadas en la localidad de Padre Las Casas,
IX Región, Temuco, en relación a los extractos obtenidos en el sector del Campus
Antumapu, RM, Santiago. Los extractos fueron fraccionados con solventes de
polaridad creciente. El seguimiento cromatográfico se realizó mediante cromatografía
en capa fina (c.c.f.) en gel de sílice, usando como fase móvil acetato de etilo: ácido
fórmico: ácido acético: agua en proporción 10: 1,1: 1,1: 2,6, (4A) revelando con 2-
aminoetil difenilborinato al 1% en metanol (NP) y comparando con sus
correspondientes patrones.
Se estableció la metodología analítica mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) para cuantificar el contenido de verbascósido presente en el
extracto etanólico bioactivo (EET).
El estudio dermatológico consistió en la evaluación de la cesión de los geles de
EET al 1% y 10%, gel de 7-O-glucósido de luteolina 1% y gel de ácido cafeico al 1% a
través de una membrana semipermeable. Los resultados fueron analizados por
metodología HPLC
.
En la evaluación farmacológica se utilizó el ensayo de inhibición de la enzima
glicógeno fosforilasa (GPa), en el cual se evalúo el porcentaje de inhibición de la
enzima por parte del EET.
IX
Los resultados de esta investigación permitieron demostrar que no existe una
variación significativa entre los rendimientos de los extractos obtenidos en distintas
regiones, sin embargo esto no implica que la variación geográfica no influya en la
abundancia de los metabolitos secundarios activos.
En relación a la evaluación de la cesión de los geles, los resultados
demostraron que el verbascósido no es capaz de penetrar la membrana in vitro, lo
mismo ocurrió para el 7-O-glucósido de luteolina a diferencia del ácido cafeico que sí
pudo atravesar la membrana, esto nos llevó a postular que in vivo ocurre una hidrólisis
del verbascósido, mediada por enzimas cutáneas, liberándose ácido cafeico, quien
sería el responsable de generar las propiedades terapéuticas del gel.
En el ensayo de inhibición de la enzima GPa, el EET demostró ser capaz de
inhibir a la enzima en un 51%, presumiendo un posible efecto hipoglicemiante.
X
ABSTRACT
“DESIGN OF THE ANALYTICAL METHODOLOGY IN HPLC TO STANDARDIZE AN EXTRACT OF GLOBULAR BUDDLEJA HOPE, BUDDLEJACEAE AND
EVALUATION OF THE TRANSFER OF THE EXTRACT FROM A DERMATOLOGICAL GEL”.
Different antecedents of the pharmacological proprieties of B. globosa, about
analgesic and anti-inflammatory activities in previous experiments carried out in our
laboaratory, together with scientific publications led to continue whith the
pharmacological and chemical study of this species.
One of the aims of our study was to isolate verbascoside and luteolin-7-O-
glycoside and to compare the performance of the different extracts obtained from
leaves collected in Padre Las Casas, IX Region, Temuco, with those obtained from the
the Campus Antumapu, of the University of Chile, RM, Santiago specimens. The
extracts were fractionated with increasing polarity solvents. Chromatographic
monitoring was carried out with silica gel thin layer chromatography (TLC), using as
mobile phase ethyl acetate: formic acid: acetic acid: water 10: 1,1: 1,1: 2.6, (4A)
revealing with 2-aminoetil difenilborinato 1% in metanol (NP) and comparing with their
corresponding patterns.
Analytical methodology was established by high performance liquid
chromatography (HPLC) to quantify the content of present verbascoside in the bioactive
ethanolic extract (EET).
The dermatological study was the assessment of transfer of 1% and 10% EET
gel and 1% luteolin-7-O-glycoside and caffeic acid gels through a semipermeable
membrane. The results were analyzed by HPLC methodology.
XI
Pharmacological evaluation of the glycogen phosphorylase enzyme (GPa)
inhibition for EET was assessed. The results were expressed as percentage of
inhibition of the enzyme.
The results of this investigation allowed us to demonstrate that there is no
significant variation between the yields of extracts obtained in different regions.
However, this does not imply that geographical variation do not influence in the
abundance of active secondary metabolites.
In reference to the evaluation of the gels transfer, the results showed that
verbascoside cannot penetrate the membrane in vitro, occurring the same to luteolin-7-
O-glycoside unlike caffeic acid which could permeate through the membrane, this led
us to postulate that in vivo verbascoside hydrolysis occur mediated by cutaneous
enzymes releasing caffeic acid conducting to the therapeutic properties of the gel.
In the GPa enzyme inhibition assay, the EET proved to be capable to inhibit the
enzyme in a 51%, assuming a possible hypoglycemic effect.
INTRODUCCIÓN
1
I.- INTRODUCCIÓN Buddleja globosa, nv. matico, Buddlejaceae es un arbusto que se encuentra
distribuido geográficamente entre Chile, Argentina y Perú. En Chile habita desde
Santiago hasta la Patagonia, generalmente en sitios húmedos (Navas, 1979). También
es ampliamente cultivada como ornamento en parques y jardines de Gran Bretaña
(Hougthon, 1984).
La medicina folclórica utiliza esta especie por sus múltiples propiedades
terapéuticas y destaca el uso de las hojas y corteza en infusiones para ayudar en la
cicatrización de heridas, en el tratamiento de quemaduras y de úlceras externas e
internas (Pardo et al., 1993). El decocto de las hojas es utilizado para lavar heridas y
las hojas pulverizadas para el tratamiento de úlceras. El infuso de las hojas se emplea
para tratar la disentería crónica, hemorroides, hepatitis, infecciones urogenitales y
verrugas (Trim y Hill, 1952).
Estudios farmacológicos realizados anteriormente utilizando diferentes extractos
e infusiones de B. globosa, han permitido demostrar su actividad antihepatotóxica del
extracto acuoso de hojas y flores (Houghton y Hikino, 1998). Previamente, Pardo et al.
(1993) demostraron la actividad antibacteriana contra S. aureus y E. coli, del extracto
etanólico de sus hojas. Los extractos acuosos obtenidos de sus hojas presentan
propiedades antioxidantes y cicatrizantes in vitro (Campos y Lissy, 1995; Menash et al.,
1998).
Liao et al., (1999) demostraron la acción antiinflamatoria in vitro de los extractos
lipofílicos de las raíces. Posteriormente Menash et al. (2001) comprobaron que los
extractos lipofílicos obtenidos desde la corteza presentan actividad antifúngica in vitro.
Estudios realizados en nuestro laboratorio también han permitido demostrar los
efectos farmacológicos como cicatrizantes (Miranda et al., 2005), actividad
antiinflamatoria, analgésica y atrapadora de radicales libres de un preparado etanólico
estandarizado (Backhouse et al., 2008a y 2008b). Además se evaluó la eficacia de
INTRODUCCIÓN
2
preparados dermatológicos en base a extractos activos demostrándose la efectividad
de éstos en el tratamiento de los efectos adversos producidos por la quimioterapia
(eritrodisestesia plantar palmar) (Rubio et al., 2004; Araya et al., 2005). También se
evaluó la variación estacional y el impacto del solvente en la actividad analgésica y
antiinflamatoria, encontrándose que todos los extractos evaluados presentaron ambas
actividades farmacológicas, siendo la actividad analgésica mayor a la antiinflamatoria.
Sin embargo, los extractos alcohólicos de las hojas recolectadas en verano fueron más
efectivos que los extractos obtenidos con las hojas recolectadas en otoño. Además no
se encontraron diferencias, tanto químicas como farmacológicas, al usar etanol o
metanol como solvente (Apablaza, 2006).
En la literatura existen diversos trabajos en los cuales se describe el aislamiento
e identificación de numerosos compuestos de B. globosa. En las flores se han
encontrado compuestos tales como acaetina-7-0-rutinósido (linarina), apigenina-7-0-
glucósido, quercetina-3-0-rutinósido (rutina) y escutelareína-7-0-glucósido (Marin et al.,
1979). Desde sus hojas también se han aislado una gran cantidad de compuestos
destacándose principalmente la luteolina-7-0-glucósido (Harborne y Williams, 1971), β-
amirina, acetato de β-amirina, glutinol, esterol condrilasterol, ester metílico del ácido p-
cumárico, ester metílico del ácido ferúlico (López et al., 1979), 7-p-metoxi cinamoil
aucubina, 7-p-metoxi cinamoil catalpósido, equinacósido (Houghton y Hikino, 1989),
verbascósido (Pardo et al., 1993) y angarósido A (Pardo et al., 1997). En la corteza es
importante mencionar la identificación de deoxibuddlejona (Menash et al., 2001). En las
raíces fue posible encontrar buddlejona (Houghton et al., 1996), dihidrobuddledina A,
budledona A y B, buddledina A, B y C y zerumbona (Liao et al., 1999).
A partir de extractos seriados obtenidos desde las hojas de matico, como por
ejemplo desde el extracto hexánico se aisló e identificó una mezcla de α y β-amirinas
como componentes mayoritarios. En relación al extracto de diclorometano se ha
aislado una mezcla de esteroides siendo el glucósido de β-sitosterol el más abundante,
junto con estigmasterol, estigmastenol, estigmastanol, campesterol y β-sitosterol
(Rosales, 2003; Backhouse et al., 2008a). En los extractos hidroalcóholicos es posible
INTRODUCCIÓN
3
encontrar mayoritariamente verbascósido (un feniletanoide) y el 7-O-glucósido de
luteolina (una flavona) (Goîty, 2007; Backhouse et al., 2008a).
El objetivo de este trabajo consistió en valorar la cantidad de verbascósido
presente en el extracto etanólico bioactivo de las hojas de Buddleja globosa (EET), así
como determinar la cesión de este fenilpropanoide y del 7-O-glucósido de luteolina
desde una formulación gel elaborada a base del EET. Lo anterior resulta de gran
importancia para poder asegurar la calidad y eficacia de productos farmacéuticos ya
existentes y futuros elaborados en base a preparados obtenidos desde las hojas de
esta especie.
HIPÓTESIS
4
II.- HIPÓTESIS
La implementación de una metodología analítica por HPLC para cuantificar al
verbascósido presente en las hojas de matico, permitirá estandarizar un extracto
etanólico farmacológicamente activo (EET), permitiendo además la determinación de la
cesión desde una formulación dermatológica de este principio activo.
III.- OBJETIVOS
1.- Objetivos Generales
• Establecer una metodología analítica que permita la cuantificación del
verbascósido en el EET.
• Comparar la influencia de la variación geográfica en el rendimiento de los
diferentes extractos obtenidos desde las hojas de matico.
• Evaluar la cesión del verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina desde una
formulación dermatológica tipo gel en base al EET.
• Determinar el potencial efecto hipoglicemiante del EET.
OBJETIVOS
5
2.- Objetivos específicos
• Obtener el EET desde hojas recolectadas en verano.
• Obtener el rendimiento del fraccionamiento de las hojas recolectadas en el
Campus Antupamu, Universidad de Chile, RM, Santiago y comparar este valor
con el descrito previamente en la literatura para hojas recolectadas en la
localidad de Padre Las Casas, IX Región, Temuco.
• Aislar y purificar el verbascósido y el 7-O- glucósido de luteolina desde el EET.
• Establecer el perfil cromatográfico por HPLC para el EET.
• Cuantificar la cantidad de verbascósido presente en el EET expresado en ácido
cafeico, mediante metodología HPLC.
• Establecer la cesión in vitro del verbascósido y del 7-O-glucósido de luteolina
desde un gel dermatológico en base a EET.
• Evaluar la inhibición de la enzima GPa por parte del EET.
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ANTECEDENTES PREVIOS
7
FIGURA 2: Infrutescencia y arbusto de B. globosa Hope
2.- Usos en la medicina tradicional:
La medicina tradicional ha empleado el matico por sus múltiples propiedades
terapéuticas destacando el uso de las hojas y corteza en infusión, para ayudar en la
cicatrización de heridas, en el tratamiento de quemaduras y de úlceras externas e
internas (Pardo et al., 1993).
El decocto de las hojas es utilizado para lavar heridas y las hojas pulverizadas
para tratar úlceras y viejas heridas. El infuso de las hojas se administra oralmente para
tratar la disentería crónica, hemorroides, hepatitis y catarro. También se ha descrito su
uso para el tratamiento de úlceras y verrugas, usando los jugos e infusiones desde las
hojas. Además se han empleado las hojas como antisépticos urogenitales en la forma
de una infusión (Hougthon, 1984).
3.- Estudios previos de B. globosa:
3.1.- Estudios químicos anteriores
En la literatura existen diversos trabajos donde se describe el aislamiento e
identificación de numerosos compuestos obtenidos a partir de la especie en estudio
(TABLA 1 y 2)
ANTECEDENTES PREVIOS
8
TABLA 1: Compuestos aislados e identificados desde B. globosa
ORGANO
Nº COMPUESTO AUTOR(ES)
FLORES
1 Acacetina-7-O-rutinósido(linarina)
Marin et al., 1979 2 Apigenina-7-O-glucósido
3 Quercetina-3-O-rutinósido(rutina)
4 Escutelarreína-7-O-glucósido
HOJAS
5 Luteolina-7-O-glucósido Hougthon y Menash, 19996 6-hidroxi-luteolina-7-O-glucósido7 Aucubina Hougthon, 19848 Lupeol Marin et al., 19799 Ésteres bis-(2-metil propílico) del
ácido ftálico Calderón y López, 1975
10 Ésteres bis-(2-etil hexílico) del ácido ftálico
11 β-amirina López et al., 1979
12 Acetato de β-amirina13 Glutinol14 Esterol condrilasterol15 Éster metílico del ácido
p-cumarínico16 Éster metílico del ácido ferúlico 17 7-p-metoxi cinamoil catalpósido
Houghton y Hikino, 1989 18 7-p-metoxi cinamoil catalópsido19 Equinacósido20 Verbascósido Pardo et al., 199321 Angarósido A Pardo et al., 1997
CORTEZA
22 Ésteres de ácidos grasos fenólicos Houghton et al., 198923 Deoxibuddlejona Mensah et al., 2000
RAÍCES
24 Buddlejona Hpughton et al., 199625 Dihidrobuddledina A
Liao et al., 1999 26 Buddledona Ay B27 Buddledina A, B y C28 Zerumbona
ANTECEDENTES PREVIOS
9
TABLA 2: Algunos constituyentes químicos de B. globosa.
Nº ESTRUCTURA NOMBRE
FLAVONOIDES
1
Linarina (Acacetina-7-O-rutósido)
2
Escutelarreína-7-O-glucósido
FENILETANOIDES
3
R=H
Verbascósido R= Arabinosa
Angarósido A
IRIDOIDES
4
Aucubina
5
R= H
Catalpol R= CH3
Metilcatalpo
ANTECEDENTES PREVIOS
10
SESQUITERPENOIDES Y
DITERPENOIDES
6
Buddlejona
7
R= OH
Buddledina A R= H
Buddledina B R= OOCCH3
Buddledina C
TRITERPENOIDES
8
β-amirina
9
Lupeol
ANTECEDENTES PREVIOS
11
3.2.- Estudios Farmacológicos anteriores
En la TABLA 3 se resumen algunas propiedades terapéuticas de B. globosa,
además se especifica el tipo de extracto empleado en la determinación de dicha
actividad.
TABLA 3: Resumen de las actividades farmacológicas encontradas en diferentes extractos e infusiones de B. globosa
ACTIVIDAD
EXTRACTO EFECTO AUTOR(ES)
ANTIHEPATOTÓXICA
Extracto acuoso de hojas y flores
Inhibitorio de citotoxicidad inducida en un cultivo de hepatocitos. Efecto debido a los glicósidos fenilpropanoides
Houghton y Hikino, 1988
ANTIBACTERIANA
Extracto etanólico de las hojas
Antibacteriano contra S. aureus y E. coli. Esto condujo a la separación de un nuevo constituyente: verbascósido
Pardo et al., 1993
ANTIOXIDANTE
Infusión de las hojas
Propiedades antioxidantes en un test que midió el decolorado de cationes coloreados preformados
Campos y Lissi, 1995
Extracto seriado de hojas
Otros ensayos efectuados evaluaron las inhibición de la enzima xantino oxidasa, la inhibición de la lipoperoxidación en eritrocitos y el ensayo de decoloración del DPPH
Backhouse et al., 2008
CICATRIZANTE IN VIVO
Extracto acuoso de las hojas
Estimulador leve en la proliferación de fibroblastos de dermis humana
Mensah et al., 1998
ANTECEDENTES PREVIOS
12
ANTIINFLAMATORIA IN VITRO
Extractos lipofílicos de las raíces
Inhibitorio sobre la 5-LOX y la COX
Liao et al ., 1999
ANALGÉSICA Y ANTIINLAMATORIA IN VIVO
Extractos seriados de hojas
Inhibe mediadores involucrados en la cascada de inflamación (AA y TPA). Todos los extractos muetsran actividad farmacológica, siendo el EDCM el más activo
Vargas et al., 2000
Extractos alcohólicos fraccionados de hojas
Actividad analgésica tópica se presentó en los ensayos de aplicación de formalina en la cola y latigazo en la cola (Tail flick test) y analgesia oral en latigazo en la cola y la medición de contorsiones abdominales. La actividad antiinflamatoria tópica fue evaluada con la medición del edema inducido por TPA
Backhouse et al., 2008
ANTIFÚNGICA IN VITRO
Extractos lipofílicos de la corteza
Antifúngico contra tres especies de hongos dermatofíticos
Mensah et al., 2000
MATERIALES Y MÉTODOS
13
V. MATERIALES Y MÉTODOS 1.- Reactivos
Acetonitrilo y metanol para HPLC, ácido fórmico 98-100%, ácido clorhídrico
36%, solventes de grado de laboratorio para las extracciones, columnas
cromatográficas de Sephadex LH-20 y gel de sílice, cromatofolios para cromatografía
en capa fina (c.c.f.), además de solventes p.a para la reacción enzimática, fueron
adquiridos en Merck (Damstadt, Alemania). El agua desionizada fue preparada
empleando un sistema Milipore Mili-Q Plus (Milipore, Bedford, MA, USA).
Sustancias de referencia como ácido cafeico (C0625-25G), enzima glicógeno
fosforilasa (P1261-10MG), glicógeno (G088G-1G), glucosa-1-fosfato (G7018-1G) y
HEPES (H3375-100MG) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Oakville, ON, USA).
El agua desaireada empleada para evaluar la cesión de los principios activos
desde el gel en base a EET, fue preparada por calentamiento a 50°C durante 30
minutos y luego calentamiento a 100°C durante 15 minutos.
2. Estudios químicos
2.1. Obtención de los diferentes extractos de B. globosa
Las hojas de B. globosa con las cuales se efectuaron los estudios fueron
recolectadas en el Campus Antumapu de la Universidad de Chile, Santiago, RM, Chile,
durante el mes de enero del 2008, conservando un testigo herbario (SQF: 22439) en la
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.
El material vegetal seco y molido (1,94 kg) se sometió a extracciones sucesivas
con disolventes de polaridad creciente, obteniendo: 40,15 g de extracto hexano
(EHEX), rendimiento equivalente a 2,1 %; 26,34 g de extracto diclorometano (EDCM),
rendimiento de 1,4% y 1,63 g de extracto etanólico (EET) con un 8,4% de rendimiento.
MATERIALES Y MÉTODOS
14
Cada extracción se realizo hasta total agotamiento del material vegetal,
utilizando temperatura adecuada en el evaporador rotatorio, según el disolvente y
dejando, entre cada extracción, secar el material vegetal a temperatura ambiente antes
de adicionar el nuevo disolvente.
El extracto seleccionado para continuar con el estudio químico fue el etanólico
(EET), con el fin de aislar dos de sus principios activos, verbascósido y el 7-0-glucósido
de luteolina. El EET fue sometido a una previa defecación para eliminar la clorofila
(Sanabria-galindo et al., 1998) antes de su fraccionamiento mediante sucesivas
columnas cromatográficas (CC).
2.2. Estudios cromatográficos
2.2.1. Análisis cualitativo por c.c.f del EET
Las c.c.f se realizaron en cromatofolios de gel de sílice 60 F254 de Merck. Como
fase móvil se empleó la Fase 4A, la cual contiene acetato de etilo: ácido fórmico: ácido
acético: agua (10: 1,1: 1,1: 2,6). Se observaron las placas bajo la luz UV a las
longitudes de onda 254 y 366 mn y se revelaron con 2-aminoetil difenilborinato al 1%
en metanol (NP Natural Products) (D9754-5G, Sigma Aldrich). Los flavonoides
presentaron fluorescencia anaranjada-rojiza y los feniletanoides, amarillo o amarillo
verdoso, al UV-366 nm.
2.2.2. Defecación y Fraccionamiento 2.2.2.1. Defecación del EET
Se decidió efectuar un proceso de defecación previamente al fraccionamiento,
para eliminar la clorofila, ya que ésta interfiere en el aislamiento de los principios
activos, como lo son el verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina. El verbascósido es
uno de los componentes mayoritarios del extracto y al cual se le atribuyen las
MATERIALES Y MÉTODOS
15
propiedades analgésicas de las hojas de matico (Goîty, 2007; Backhouse et al.,
2008a).
• Técnica de defecación
Se pesaron 9,0 g del EET y se disolvieron en 2,5 mL de etanol caliente (a punto
de ebullir) a esta solución se agregó 2,5 mL de una solución B que contenía acetato de
plomo al 4% y ácido acético al 0,5%. Al momento de adicionar la solución B se observó
la formación inmediata de un precipitado de color verde. Luego se sometió el EET a
reiterados procesos de centrifugación conservando siempre el sobrenadante. Este
sobrenadante se llevó a sequedad y se reconstituyó con metanol.
Como el plomo es tóxico e interfiere en los análisis, fue necesario corroborar la
ausencia de este elemento en el extracto obtenido, para ello se tomaron 2 tubos de
ensayos, en uno se adicionó una pequeña alícuota de la muestra (1 mL) y en el otro
(tubo control) una solución de PbSO4 al 1% p/v, a ambos tubos se les debió ajustar a
pH 9 con amoníaco. Luego se adicionó un volumen de 1 mL de Na2CO3 1% p/v a cada
tubo de ensayo. Se observó la presencia de un precipitado blanco y consistente en el
tubo control, pero no en la muestra, lo que confirmó la ausencia de plomo en ésta.
2.2.2.2. Fraccionamiento del EET
Con la finalidad de aislar el verbascósido y el 7-O-glucósido de luteolina se
efectuaron distintas CC con silicagel G-60 y Sephadex LH-20. Las fracciones fueron
analizadas por c.c.f. y utilizando NP como reactivo revelador.
I. Primera CC con gel de sílice G-60 (CC1Sil)
Se efectuó una primera CC exploratoria para estimar las polaridades en las
cuales se extraen los compuestos de interés, teniendo en cuenta antecedentes previos
en la literatura (Goîty, 2007; Backhouse et al., 2008a).
MATERIALES Y MÉTODOS
16
Condiciones de la CC1Sil:
• Diámetro de la columna= 4 cm
• Cuerpo columna= 22,2 cm de altura de silicagel
• Cabeza= 1cm de altura (4 g de muestra más 4 g de silicagel)
• Volumen eluyente= 250 mL
• Tratamientos previos muestra= No se efectúo defecación
Las distintas fracciones fueron obtenidas eluyendo la CC1Sil con disolventes de
orden creciente de polaridad, como se muestra a continuación en la TABLA 4:
TABLA 4: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC1Sil
Como el objetivo de CC1Sil fue estimar una polaridad aproximada para extraer
el verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina y ésta no entregó mayor información,
debido a que se efectuaron cambios significativos de polaridad, se decidió efectuar una
segunda CC la cual se describe a continuación.
II. Segunda CC con gel de sílice G-60 (CC2Sil)
El EET fue sometido a un fraccionamiento mediante la CC2Sil y los cambios de
polaridad de los solventes con que se eluyó esta nueva CC se realizaron en forma más
fina, tal como se muestra en la TABLA 5.
Fracción Solvente Proporción Compuesto
1-2 DCM: AcOEt 50:50 clorofila
3-4 DCM: AcOEt 30:70 clorofila
5-6 AcOEt 100 clorofila 7-8 MeOH 100 verbascósido y 7-O-glucósido de
luteolina
MATERIALES Y MÉTODOS
17
Condiciones de la CC2Sil:
• Diámetro de la columna= 4 cm
• Cuerpo columna= 23 cm de altura de silicagel
• Cabeza= 1,5 cm de altura (4 g de muestra más 4 g de silicagel)
• Volumen eluyente= 500 y 1000 mL
• Tratamientos previos muestra= No se efectúo defecación
TABLA 5: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC2Sil
Tanto en la CC1Sil como la CC2Sil, el principal interferente fue la clorofila, por lo
tanto se decidió pre-tratar el EET antes de fraccionarlo sometiéndolo a un proceso de
defecación para eliminar la clorofila y de este modo se procedió a realizar una tercera
CC denominada CC3Sil.
III. Tercera CC con gel de sílice G-60 (CC3Sil)
Se realizó una tercera CC denominada CC3Sil con el fin de aislar el
verbascósido y el 7-O-glucósido de luteolina. Los resultados de esta CC se muestran
en la TABLA 6.
Fracción Solvente Proporción Volumen Compuesto
1-9 DCM 100 500 mL clorofila
10-11 DCM: AcOEt 80:20 1000 mL clorofila
12-16 DCM: AcOEt 70:30 1000 mL clorofila
17-18 DCM: AcOEt 60:40 1000 mL clorofila
19-20 DCM: AcOEt 50:50 1000 mL clorofila
21-22 DCM: AcOEt 30:70 1000 mL clorofila
23-28 AcOEt 100 1000 mL verbascósido y clorofila
29-40 AcOEt: MeOH 95:5 1000 mL verbascósido y 7-O-
glucósido de luteolina
41-44 MeOH 100 1000 mL
MATERIALES Y MÉTODOS
18
Condiciones de la CC3Sil:
• Diámetro de la columna= 4 cm
• Cuerpo columna= 2 cm de altura de silicagel
• Cabeza= 22,5 cm de altura (4,3 g de muestra más 4,5 g de silicagel)
• Volumen eluyente= 500 mL
• Tratamientos previos muestra= defecación de la muestra
TABLA 6: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC3Sil
En las fracciones 18 a la 74 se observó el verbascósido y en las fracciones 75 a
la 89 se detectó junto al verbascósido el 7-O-glucósido de luteolina.
A continuación fueron seleccionadas las fracciones que contenían una mayor
cantidad de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina por c.c.f.. Estas fracciones
fueron desde la 64 hasta la 71 de la CC3Sil, las que se juntaron en una y dieron origen
al concentrado VI (TABLA 7).
El concentrado VI de CC3Sil (305,2 mg) fue sometido a una purificación por una
cuarta CC de Sephadex LH-20 y que fue denominada CC4Sep.
Fracción Solvente Proporción Volumen Compuesto
1-5 DCM 100 500 mL
6-9 DCM: AcOEt 75:25 500 mL
10-12 DCM: AcOEt 50:50 500 mL
13-17 DCM: AcOEt 25:75 500 mL
18-74 AcOEt 100 500 mL verbascósido
75-89 AcOEt: MeOH 95:5 500 mL verbascósido y 7-O-
glucósido de luteolina
90-91 MeOH 100 500 mL
MATERIALES Y MÉTODOS
19
TABLA 7: Resumen concentrado de CC3Sil
IV. Cuarta CC de Sephadex LH-20 (CC4Seph)
El Sephadex LH-20 (Fluka Chemie, Suiza) permite la separación de los
compuestos según su peso molecular. Previamente se debió preparar la CC para lo
cual se suspendió 30 minutos en metanol y una vez incorporado a la columna se
ambientó agregando tres veces la fase móvil (HEX: DCM: MEOH = 2: 4: 4).
Posteriormente se incorporó el concentrado VI disuelto en la misma mezcla de solvente
y se eluyó con la mezcla mencionada.
Condiciones de la CC4Seph:
• Diámetro de la columna= 5 cm
• Cuerpo columna= 44 cm de altura (en metanol)
• Volumen de muestra= 10 mL saturado con la muestra sin sólido remanente
• Volumen eluyente= 40 mL
• Fase móvil= HEX: DCM: MEOH = 2: 4: 4
CC3Sil
Concentrado Fracciones
I 1-7
II 8-28
III 29-35
IV 36-50
V 51-63
VI 64-71
VII 72-74
VIII 75-78
IX 79-84
X 85-89
XI 90-91
MATERIALES Y MÉTODOS
20
La composición química de cada una de las fracciones eluidas fue monitoreada
por c.c.f., usando como fase móvil 4A y revelando con NP.
De la columna CC4Seph se recolectaron 80 fracciones. Entre las fracciones 37
a la 41 se detectó el 7-O-glucósido de luteolina puro. Desde la 42 y hasta la 48 (106,7
mg) se observó el verbascósido impuro. Con el objetivo de purificar el verbascósido,
las fracciones correspondientes fueron sometidas a una segunda columna de
Sephadex denominada CC5Seph. La TABLA 8 resume los resultados de las columnas
de Sephadex.
V. Quinta CC de Sephadex LH-20 (CC5Seph) Condiciones de la CC5Seph:
• Diámetro de la columna= 5 cm
• Cuerpo columna= 44 cm de altura (en metanol)
• Volumen de muestra= 8 mL saturado con la muestra sin sólido remanente
• Volumen eluyente= 40 mL
• Fase móvil= HEX: DCM: MEOH = 2: 4: 4
De la columna CC5Seph se recolectaron 80 fracciones. Desde la fracción 40
hasta la 55 se obtuvo al verbascósido puro (72,4 mg).
MATERIALES Y MÉTODOS
21
TABLA 8: Resumen concentrado de fracciones de CC4Seph y CC5Seph
Cabe señalar que uno de los objetivos de esta memoria fue obtener una mayor
cantidad de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina, ya que éstos están siendo
empleados en otros estudios en colaboración con otros investigadores y además estos
compuestos aislados fueron utilizados como patrones para la valoración del EET y
posteriormente en la determinación de la cesión de los principios activos desde la
formulación tipo gel, mediante HPLC.
COLUMNA FRACCIONES COMPUESTO
CC4Seph
1-9
10-14
15-21
22-33
31-36
37-40 7-O- glucósido de luteolina
(75,6 mg)
41-48 verbascósido (106,7 mg)
49-54
55-80
CC5Seph
1-39
40-55 verbascósido (72,4 mg)
56-57
58-80
MATERIALES Y MÉTODOS
22
3.- Análisis cuantitativo del EET 3.1.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico obtenido del EET por metodología HPLC
La cuantificación del verbascósido se realizó por HPLC, basándose en la
metodología para la cuantificación de los flavonoides de Gingko biloba (Dubber y
Kanfer, 2004). Esta metodología fue adaptada para nuestros propósitos
estableciéndose las condiciones óptimas para la correcta definición de EET en HPLC.
Estas condiciones corresponden a:
• Columna : C18, LiChroCART® 250-4 Purospher®
STAR RP-18 (5µ). Merck (HX675529)
• Flujo : 0,5 mL/min
• Fase móvil : ácido fórmico 0,1%: acetronitrilo = 70: 30
• Volumen de inyección : 20 μL
• Longitud de onda : 365 nm
Todos los análisis fueron desarrollados en un equipo HPLC Waters 486
acoplado a un detector UV/Visible Waters con arreglo de diodos.
3.2.- Preparación de las soluciones para HPLC
Para obtener la curva de calibración se preparó una solución stock de 1850
ppm de ácido cafeico en metanol LiChrosolv para HPLC. Para el verbascósido se
preparó una solución stock de 300 ppm en metanol. Luego fueron sonicadas durante 5
minutos y filtradas por membrana GV (Durapore) 0,22 μm de poro (GVWP01300) en un
dispositivo Swinnex (SX0001300) adquiridos de Millipore Corp., Billerica, MA, USA y
acoplado a jeringa de vidrio. De la solución anterior de ácido cafeico se obtuvo por
dilución las concentraciones necesarias para los puntos del gráfico área versus
concentración.
MATERIALES Y MÉTODOS
23
4.- Evaluación de la cesión de los principios activos desde el gel de EET 4.1- Elaboración de los geles 4.1.1- Gel de EET al 1%
El siguiente estudio se realizó sobre una formulación preestablecida de un gel a
base de EET al 1% (Mora, 2006) como se muestra en la TABLA 9.
TABLA 9: Formulación gel de EET al 1%
Procedimiento de elaboración del gel:
1. En un recipiente previamente tarado, que contiene aproximadamente 2 tercios
de agua destilada recién hervida, se agregó una cantidad exactamente pesada
de carbomer 940 y 0,1 g de metilparabeno.
2. Se dispersó con agitador con un agitador mecánico a 3000 rpm durante 5
minutos.
3. La dispersión se llevó a pH 6 con una solución de trietanolamina al 20%.
4. Una vez frío el vehículo se agregó el EET disuelto en agua. Se agitó hasta
homogeneidad.
5. Se completó hasta el peso deseado.
Formulación
Materia Prima Cantidad (%)
EET 1,0
Propilenglicol 5,0
Carbomer 940 1,0
Trietanolamina sol. 20% c.s. pH 6
Metilparabeno 0,1
Agua c.s.p. 100
MATERIALES Y MÉTODOS
24
4.1.2.- Vehículo gel de carbomer ultra:
El gel de carbomer fue elaborado pesando 500 g de carbomer ultra y 5 g de
metil parabeno, acompañado de agitación.
4.1.3.- Gel de ácido cafeico al 1%
Debido a que el verbascósido in vivo podría generan ácido cafeico, se preparó
un gel de ácido cafeico al 1%, para lo cual se empleó 30 g del vehículo de carbomer
ultra y se adicionó 0, 31 g de ácido cafeico. Este último debió ser disuelto previamente
en una mezcla de H2O: MeOH (90:10) y posteriormente sonicado durante 5 minutos a
60ºC.
4.1.4.- Gel de 7-O-glucósido de luteolina al 1%
Con el fin de determinar inequívocamente la cesión del 7-O-glucósido de
luteolina, se pesaron 0,33 g de 7-O-glucósido luteolina, luego se disolvió en una
mezcla de H2O: EtOH (50:50) y fue sonicada durante 5 minutos a 60ºC. Posteriormente
se incorporó a 32 g del vehículo gel de carbomer ultra.
4.2.- Equipo de disolución
La cesión fue evaluada en un equipo de disolución Pharma test (type PTW S III)
(FIGURA 3), en las siguientes condiciones:
• Velocidad rotación paleta: 50 rpm
• Temperatura (T): 33ºC
• Volumen agua desaireada por vaso: 900 mL
• Nº de vasos (V) : 8
MATERIALES Y MÉTODOS
25
FIGURA 3: Equipo de disolución Pharma test (type PTW S III)
4.3.- Sistema de incorporación de las muestras al equipo de disolución
Cada uno de los geles fueron incorporados en recipientes, los cuales se
cubrieron en su parte superior con la membrana semipermeable Snake Skin® (3,5
MWCO), la cual cumple con las siguientes especificaciones:
• Tipo de membrana: Celulosa regenerada
• Grosor lámina de membrana: 22-30 µm
• Contenido de glicerol: trazas
• Contenido de azufre: 0.1 -0.15 %
• Contenido de metales pesados: trazas
• Capacidad: sostiene 3,7 mL/cm de muestra
El sistema armado se selló con un soporte adecuado y fue apretado con pinzas
para evitar la filtración de las muestras por los costados, tal como lo muestra la
FIGURA 4.
MATERIALES Y MÉTODOS
26
FIGURA 4: Sistema de incorporación del gel al equipo de disolución
El sistema armado (C, FIGURA 4) se colocó en los vasos del equipo Pharma
test que contenían 900 mL de agua desairada a la temperatura programada en el
equipo, es decir 33ºC.
4.4.- Toma de muestra
Se realizaron dos evaluaciones, tal como lo muestra la TABLA 10.
C
(A) soporte que evita la salida del gel. (B) recipiente contenedor del gel. (C) sistema armado, el cual está conformado por B, cubierto por la membrana y sellado con A y 2 pinzas laterales para prevenir filtraciones del sistema.
B A
MATERIALES Y MÉTODOS
27
TABLA 10: Disposición de las muestras en el equipo de disolución
Se evaluó la cesión durante 3 horas, para lo cual se tomaron muestras de 10
mL cada 30 minutos con reposición del volumen de muestra tomado, para lo cual se
tomaba el volumen correspondiente de agua del V4. Luego las muestras fueron
almacenadas bajo refrigeración a -4ºC para su posterior análisis por metodología
HPLC establecida previamente.
5.- Ensayo de inhibición de la enzima glicógeno fosforilasa (GPa) Este ensayo se basa en un método colorimétrico que detecta la liberación de
fosfato al medio, basado en el método modificado de Martin et al. (1998). En esta
prueba, la enzima GPa de músculo de conejo cataliza la reacción de síntesis de
glicógeno a partir de un partidor de glicógeno, incorporando unidades sucesivas de
glucosa proveniente de la glucosa-1- fosfato y liberando fosfato cuantificable.
5.1.- Preparación de los reactivos Debido a la sensibilidad del ensayo fue necesario tener la precaución de que
todo el material que fue empleado en la preparación de los siguientes reactivos se
encontrara libre de ión fosfato. Por ende, el material fue lavado con jabones libres de
fosfato y posteriormente enjuagados con agua destilada y finalmente con agua Milli-Q.
I II
Vaso Muestra Vaso Muestra
V1 Gel vehículo (blanco) V1 Gel vehículo (blanco)
V2 Gel de EET 1% V2 Gel de EET 10%
V3 Gel de ácido cafeico 1% V3 Gel de 7-O-glucósido de
luteolina 1%
V4 Sin muestra (agua reposición
toma de muestra) V4 Sin muestra (agua reposición
toma de muestra)
MATERIALES Y MÉTODOS
28
a) Solución B: HEPES 50 mM (pH 7,2)
La solución B se empleó para preparar las soluciones de glicógeno, glucosa-1-
fosfato y enzima.
• Para preparar 100 mL de solución B se pesó 1,302 g de HEPES y se agregó
una mínima cantidad de agua Milli-Q que permitió sumergir el detector del
electrodo del medidor de pH previamente calibrado. Posteriormente se agitó
con un magneto hasta obtener una total disolución.
• En agitación constante se ajustó pH agregando lentamente gotas de HCl al
37% p.a. hasta aproximarse a pH 7,8.
• Se diluyó una cantidad de HCl al 37% p.a. y se agregó gota a gota a la solución
hasta alcanzar un pH final de 7,2.
b) Solución BS: Buffer + sales (pH 7,2)
• Para preparar 25 mL de la solución BS se debió pesar 1085 mg de HEPES y se
agregó una mínima cantidad de agua Milli-Q que permitió sumergir el detector
del electrodo del medidor de pH previamente calibrado. Posteriormente se agitó
con un magneto hasta obtener una total disolución.
• En agitación constante se ajustó pH agregando lentamente gotas de HCl al
37% p.a. hasta aproximarse a pH 7,8.
• Se agregó en agitación constante 74,6 mg de KCl, 380,4 mg de EGTA y 95,2
mg de MgCl2.
• Luego se diluyó HCl al 37% a discreción con agua Milli-Q para realizar ajuste de
pH y alcanzar un pH final de 7,2.
c) Solución Glicógeno (gli) 4 mg/mL
• Para una preparar una solución de 10 mL de gli se pesó 40 mg de glicógeno.
• Se llevó a un volumen final de 10 mL con solución de HEPES 50 mM (pH 7,2).
MATERIALES Y MÉTODOS
29
• Se tomaron alícuotas de 200 µL y se almacenaron refrigerados en tubos
eppendorf.
d) Solución glucosa-1-fosfato (G1P) 1 mM
• Para obtener una solución de 25 mL se pesó 9 mg de G1P.
• Se llevó a un volumen final de 25 mL con solución de HEPES 50 mM (pH 7.2).
• Se tomaron alícuotas de 230 µL y se almacenaron refrigerados en tubos
eppendorf.
e) Solución de enzima GPa 100 μg/mL
• Se pesó en un tubo eppendorf de 1 mL, 1 mg de GPa.
• Se traspasó lentamente a un matraz de aforo de 5 mL con 4 porciones de 1000
μL de HEPES 50 mM (pH 7,2).
• Se aforó con HEPES 50 mM (pH 7,2) y se homogenizó lentamente sin agitar.
• Se tomaron alícuotas de 50 μL, las cuales fueron puestas en tubos eppendorf,
luego se adicionaron 50 μL de HEPES 50 mM (pH 7,2) y se homogenizó
lentamente sin agitar. Finalmente los tubos fueron refrigerados a -20ºC.
F) Medio de detención (SD):
• Se pesaron 1000 mg de molibdato de amonio tetrahidratado y 38 mg de
verde malaquita, los cuales fueron disueltos en 100 mL de HCl 1M.
G) Solución de EET 42 mg % (muestra):
• Para preparar 50 ml se pesaron 21, 5 mg del EET y se disolvió en 50 mL de
DMSO.
MATERIALES Y MÉTODOS
30
5.2.- Protocolo del ensayo de evaluación de la actividad inihibidora de la GPa
Todos los ensayos se realizaron en triplicado.
I.- Blanco
Se prepararon en dos tubos eppendorf de 1 mL soluciones blanco que
contenían:
1. 75 μL de BS
2. 150 μL de B
3. 25 μL de DMSO
4. 750 μL de SD
Posteriormente se leyó a 620 nm en espectrofotómetro (UV/Visible Unicam
UV3) en dos celdas (referencia y lectura) y se calibró el equipo a cero base.
II.- Control negativo (CN):
A partir de la solución de GPa 100 μg/mL se preparó un volumen de solución
enzimática de 30 μg/mL con solución B, suficiente para la evaluación de todas las
muestras (en triplicado). Se debió mantener la solución enzimática en frío.
En un tubo eppendorf se adicionó (en el mismo orden):
1. 75 μL de BS
2. 62,5 μL de Gli
3. 25 μL de DMSO
4. Se homogenizó con pipeta
5. 62,5 μL de G1P
6. 25 μL de GPa 35 μg/mL
MATERIALES Y MÉTODOS
31
7. Se cronometró y esperó 20 minutos
8. 750 μL de SD
9. Se cronometró y esperó 5 minutos
10. Se leyó a 620 nm
Para proceder al siguiente paso, la absorbancia debió ser superior a 0,600 e
inferior a 0,800.
III.- Control no enzimático (CNE):
Para determinar la absorbancia de fosfato residual. Se leyó y registró la
absorbancia a 620 nm 5 minutos después de preparar en tubos eppendorf soluciones
que contenían:
1. 75 μL de BS
2. 150 μL de B
3. 25 μL de solución de EET 83 mg%
4. 750 μL de SD
IV.- Evaluación de la actividad inhibidora de la GPa del EET
Tal como fue señalado anteriormente, se procedió en triplicado en tubos
eppendorf de la siguiente forma siguiendo el mismo orden:
1. 75 μL de BS
2. 62,5 μL de Gli
3. 25 μL de solución de EET 83 mg%
4. Se Homogenizó con pipeta evitando salpicaduras
5. 62,5 μL de G1P
6. 25 μL de GPa 30 μg/mL
7. Se cronometró y se esperó 20 minutos
8. 750 μL de SD
MATERIALES Y MÉTODOS
32
9. Se cronometró y esperó 5 minutos
10. Se leyó a 620 nm
Todo el protocolo se encuentra resumido en la TABLA 11, como se muestra a
continuación:
TABLA 11: Protocolo de trabajo del ensayo de inhibición de la enzima GPa
Blanco Control no enzimático
Control negativo
Muestra
Primera
etapa
BS 75 μL 75 μL 75 μL 75 μL
B 150 μL 150 μL --- ---
DMSO 25 μL --- 25 μL ---
Muestra --- 25 μL --- 25 μL
Gli --- --- 62,5 μL 62,5 μL
Preparar cronómetro
Segunda etapa
G1P --- --- 62,5 μL 62,5 μL
GPa --- --- 25 μL 25 μL
Cronometrar 20 minutos
Tercera etapa
SD
750 μL
750 μL
750 μL
750 μL
Cronometrar 5 minutos
Leer a 620 nm
MATERIALES Y MÉTODOS
33
V.- Obtención de los resultados
El porcentaje de inhibición de la GPa fue calculado de la siguiente
manera:
• Primero se calculó la absorbancia (A) corregida:
A corregida= A muestra - A Control fosfato
• Luego el % de actividad de la enzima :
% Actividad= (A corregida / A control negativo)*100
• Para finalizar el % de inhibición enzimática:
% Inhibición = 100 - % Actividad
RESULTADOS Y DISCUSIONES
34
VI.- RESULTADOS Y DISCUSIONES
1.- Estudios químicos 1.1.- Obtención del EET
De la extracción de las hojas secas y molidas de B. globosa recolectada en el
Campus Antumapu de la Universidad de Chile, RM, Santiago, en la época de verano,
se obtuvo el EET con un 8,4% de rendimiento. Si se comparan estos resultados con los
reportados por Goîty (2007), donde en dicha ocasión el material vegetal fue
recolectado en el sector de Padre Las Casas, Temuco, IX Región, obteniéndose en
dicha oportunidad un EET con un rendimiento de 9,0%, además de EHEX y EDCM con
rendimientos de 2,7% y 1,8% respectivamente (FIGURA 5). Estos resultados revelaron
que no existen grandes variaciones entre el material recolectado en la RM en
comparación al obtenido en la IX Región, sin embargo cabe destacar que esto no
permite concluir que la variación geográfica no influye en la abundancia de los
compuestos activos de los extractos.
1 1
d
v
r
p
e
m
m
FIGURA 5:
1.2.- Defeca
1.2.1.- Defe El pr
del contenid
verbascósid
resultó basta
A pe
purificación
eluída junto
misma pola
medida 7-O
An
Material vR
Material R
Material vR
Esquema c
ación y frac
cación del
roceso de d
do de cloro
o y 7-O-gluc
ante bajo (52
esar del baj
del verbasc
o a los princ
ridad donde
O-glucósido
ntumapu-RMVERAN
1,94 Kg de
vegetal agotaRendimiento
vegetal agoRendimiento
vegetal agotRendimiento
comparativoactivo
ccionamient
EET
efecación re
ofila, lo cua
cósido de lu
2,3·%)
jo rendimie
cósido, debi
cipios activo
e obteníamo
de luteolina
M-STGONO
hojas
ado con Hexo: 2,1%
otado con DCo: 1,4%
tado con ETo: 8,4%
o de los renos seriados
to del EET
esultó basta
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teolina. Sin
nto, la defe
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xano
CM
TOH
RE
ndimientos de matico
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Padre Las
1
Material veR
Material vR
Material vR
ESULTADOS
de los difer
o en relación
proceso de
rendimiento
efectiva, y
ntes de este
cOEt al 100
en verbascó
obtuviéramos
Casas-IX RVERANO
1,00 kg de h
egetal agotaRendimiento
vegetal agotRendimiento
vegetal agotaRendimiento
S Y DISCUSIO
rentes extra
n a la dimin
purificación
o de este pro
ya que facil
e tratamient
0%, es decir
ósido y en m
s fracciones
Región- TemOhojas
ado con Hexa: 2,7%
tado con DC: 1,8%
ado con ETO: 9,0%
ONES
35
actos
ución
n del
oceso
itó la
o era
r a la
menor
s con
muco
ano
CM
OH
RESULTADOS Y DISCUSIONES
36
ausencia total de clorofila que se purificaban con mayor facilidad por las CC de
Sephadex LH-20.
1.2.2.- Fraccionamiento del EET
El fraccionamiento del EET en CC de gel de sílice llevó a la obtención de
verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina a partir de las fracciones eluídas con AcOEt
100% hasta AcOEt: MeOH 95:5 (TABLA 6).
De la CC3Sil se obtuvieron 305,2 mg de fracciones ricas en verbascósido, las
cuales fueron sometidas a un nuevo fraccionamiento en la CC4Seph consiguiendo
106,7 mg de verbascósido y 75,6 mg de 7-O-glucósido de luteolina. Los 106,7 mg de
verbascósido se purificaron en una nueva columna de Sephadex LH-20 (CC5Seph),
obteniéndose 72,4 mg de verbascósido puro (TABLA 8).
2.- Análisis cuantitativo del EET 2.1.- Diseño de la metodología HPLC
El trabajo con HPLC permitió visualizar los compuestos presentes en el EET.
Cabe destacar que se logró establecer en este estudio las mejores condiciones para el
trabajo en HPLC, probando diferentes fases móviles, solvente muestra, flujos y
longitudes de onda.
Se pudo constatar que la fase móvil así como el solvente del EET adquirieron
notable importancia en la resolución de los peak, mejorando considerablemente la
apariencia de éstos.
Como conclusión se determinó que las mejores condiciones fueron:
RESULTADOS Y DISCUSIONES
37
• Flujo : 0,5 mL/min
• Fase móvil : ácido fórmico 0,1%: acetronitrilo = 70: 30
• Solvente muestra : MeOH 100%
• Longitud de onda : 365
2.2.- Perfil cromatográfico del EET (HPLC):
Después de determinar las mejores condiciones para trabajar en el HPLC se
estableció el perfil cromatográfico para el EET (recolectado en el campus Antumapu) y
se comparó con el EET obtenido en Padre Las Casas, Temuco, IX Región. Las señales
fueron asignadas según patrones obtenidos anteriormente en el fraccionamiento del
EET.
Los resultados se muestran a continuación en las FIGURAS 6 y 7.
FIGURA 6: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en Padre Las Casas (EET 1,58 mg/mL, en MeOH 100% a 365nm)
verbascósido7-O-glucósido de luteolina
RESULTADOS Y DISCUSIONES
38
FIGURA 7: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en el campus Antumapu (EET 1,87 mg /mL, en MeOH 100% a 365nm)
Los tiempos de retención (Tr) del verbascósido y 7-O-glucósido para los EET
obtenidos desde hojas recolectadas en distintas localidades fueron similares, por ende
podemos concluir que no se observaron diferencias significativas entre el perfil
cromatográfico de los EET recolectadas en distintas regiones.
2.3.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico por metodología HPLC 2.3.1.- Curva de calibración del ácido cafeico
El ácido cafeico (180,15 g/mol) fue empleado como estándar para expresar el
contenido de verbascósido (feniletanoide) presente en el extracto. Se estableció por
regresión lineal la ecuación que representa la curva de calibración como se muestra a
continuación en la TABLA 12 y en la FIGURA 8.
verbascósido
7-O-glucósido de luteolina
RESULTADOS Y DISCUSIONES
39
TABLA 12: Valores de concentración versus área empleados en la curva de calibración del ácido cafeico
Concentración (ppm) Área Promedio
115,625 1523533
1862819,7 1985404
2079522
321,25 4152639
4033562,7 3990560
3957489
462,5 6839473
6983903,7 7081817
7030421
925 15630371
14636158 13920577
14357527
1850 28318420
29064993 28769850
30106708
RESULTADOS Y DISCUSIONES
40
FIGURA 8: Curva de calibración del ácido cafeico
2.3.2.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico
Para evaluar la cantidad del verbascósido presente en EET se inyectó 20 µL del
extracto a una concentración de 1,58 mg/mL en triplicado y se obtuvo un promedio de
integración de las áreas de los cromatogramas de 9329386, posteriormente
reemplazando este valor en la curva de calibración del ácido cafeico se obtuvo una
cantidad de 0,61 mg/mL de verbascósido expresado en ácido cafeico.
3.- Evaluación de la cesión de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina
3.1. Determinación de la cesión del verbascósido
Con el objetivo de evaluar la cesión del verbascósido desde el gel elaborado en
base al EET, se llevó a cabo la primera evaluación de la cesión del gel de EET al 1% y
y = 15966x - 416796R² = 0,9985
-5000000
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
0 500 1000 1500 2000
Àre
a
Concentración ppm
Curva Ácido caféico
RESULTADOS Y DISCUSIONES
41
del gel de ácido cafeico al 1% (FIGURA 10). Las muestras obtenidas fueron analizadas
por HPLC.
Los cromatogramas de las muestras se compararon según los tiempos de
retención (Tr) con los cromatogramas del patrón de ácido cafeico y el gel vehículo
(blanco) demostrando que sólo el ácido cafeico es capaz de atravesar la membrana a
todos los tiempos evaluados, a diferencia del gel de EET que sólo presentó la señal del
gel base (FIGURA 9 y10).
Los resultados obtenidos para el verbascósido coinciden con los resultado de
un ensayo in vitro realizado por Marti-Mestres et al. (2006), ellos evaluaron la cesión
del verbascósido en orejas de cerdo, demostrando que éste no es absorbido y queda
retenido en las primeras capas de la piel. Además teniendo en cuenta que moléculas
con pesos moleculares mayores a 500 no atravesarían la piel y como antecedente
previo se sabe que el verbascósido posee un peso molecular de 624,6 g/mol, resulta
razonable que éste no sea capaz de penetrar la piel, es por esto que se decidió evaluar
la cesión del ácido cafeico, ya que postulamos que lo más probable que ocurra in vivo
sea una hidrólisis del verbascósido mediada por enzimas cutáneas generando ácido
cafeico y este último , quien fue capaz de atravesar la membrana in vitro (FIGURA 10),
sería en parte el compuesto responsable de la actividad farmacológica del EET.
FIGURA 9
9: Cromatoggramas patrrón ácido c
RE
cafeico y ge
ESULTADOS
l vehículo c
S Y DISCUSIO
carbomer u
Patrón
cafe
Tr= 8, 261
Gel veh
Carbome
-Tiempo
30 min.
-Tr= 6, 161
ONES
42
ltra
ácido ico
min
hículo er ultra
muestra:
1 min.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
43
FIGURA 10: Cromatogramas gel de EET al 1% y gel de ácido cafeico al 1%
Gel de EET 1%
-Tiempo muestra:
60 min.
-Tr= 6, 166 min.
Gel ácido cafeico
1%
-Tiempo muestra:
60 min.
-Tr= 6, 674 min.
-Tr= 8,261 min.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
44
3.2. Determinación de la cesión del 7-O-glucósido de luteolina
Debido a los resultados obtenidos en la primera evaluación y con el afán de
encontrar algún otro marcador diferente al verbascósido que fuese cedido por el gel de
EET, se decidió aumentar la concentración del EET en el gel a un 10% y probar
también con un gel de 7-O-glucósido de luteolina al 1%. Los resultados también fueron
negativos a todos los tiempos, ya que tanto el gel de EET al 10% como el gel de 7-O-
glucósido de luteolina al 1% presentaron sólo el peak del gel base, sin embargo en la
situación del 7-O-glucósido de luteolina, flavonoide que presenta un peso molecular de
448,8 g/mol, no se puede descartar que atraviese la piel in vivo.
4.- Ensayo de inhibición de la enzima Glicógeno fosforilasa (GPa)
Los resultados del ensayo se muestran en la TABLA 13 a continuación.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
45
TABLA 13: Resultados del ensayo de inhibición de la GPa
Absorbancia (A)
Promedio
Control negativo
0,735
0,730 0,764
0,691
EET 42 mg %
0,414
0,405 0,354
0,446
Control fosfato
0,029
0,041 0,005
0,088
A corregida 0,364
% Actividad 49,9 %
% Inhibición EET 50,1 %
Los resultados demostraron que el EET presenta un efecto inhibidor de la GPa.
Esta actividad no se había determinado antes para B. globosa. Éste es un resultado
novedoso que abre las puertas a posteriores estudios para las hojas de esta especie
en el ámbito de cuadros hiperglicémicos y del síndrome metabólico.
Como se evaluó sólo el EET no se puede responsabilizar de este efecto a los
principales compuestos de él (verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina), por lo tanto,
se deberían probar los compuestos aislados por separado y evaluar nuevamente la
potencial inhibición de GPa.
CONCLUSIONES
46
VII.- CONCLUSIONES
• El rendimiento del los EHEX, EDCM y EET, obtenidos de las hojas recolectadas
en la localidad de Padre Las Casas, IX Región, no presentaron grandes variaciones en
comparación a los extractos obtenidos de las hojas recolectadas en el Campus
Antumapu de la Universidad de Chile, RM, sin embargo esto no implica que la
variación geográfica no influya en la abundancia de los metabolitos secundarios
activos.
• La defecación es una buena técnica para eliminar la clorofila y de este modo
facilitar la purificación del verbascósido y del 7-O-glucósido de luteolina, sin embargo el
proceso presentó un bajo rendimiento.
• No se apreciaron cambios significativos en los perfiles cromatográficos del EET
obtenido de las hojas recolectadas en el campus Antumapu en comparación al
obtenido de las hojas recolectado en el sector de Padre Las Casas.
• El verbascósido no es capaz de atravesar una membrana semipermeable, a
diferencia del ácido cafeico que si puede hacerlo. Por lo tanto, postulamos que in vivo
lo más probable que ocurra una hidrólisis del verbascósido liberando de este modo al
ácido cafeico, quien generaría el efecto farmacológico.
• El 7-O-glucósido de luteolina no es capaz de atravesar una membrana
semipermeable, pero esto no asegura que in vivo no sea capaz de atravesar la piel
• El EET es capaz de inhibir (50,1%) a la glicógeno fosforilasa, lo que
demostraría que EET podría presentar efecto hipoglicemiante, pero lo más adecuado
sería evaluar los principales componentes aislados del EET de B. globosa para
determinar los responsables de la actividad.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
47
VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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