UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDUNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE FARMACIAFACULTAD DE FARMACIADEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍADEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA
BASES MOLECULARES DEL ACOPLAMIENTO INTERCELULAR EN EL SINCITIO PANGLIAL
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TUTELADO
Autor: Ilaria FascianiAutor: Ilaria Fasciani Directores: Dr. Luis C.Barrio y Dr. Daniel González NietoDirectores: Dr. Luis C.Barrio y Dr. Daniel González Nieto Tutor: Dra. Marisol Fernández-AlfonsoTutor: Dra. Marisol Fernández-Alfonso Lugar de realización: Unidad de Neurología experimental. Lugar de realización: Unidad de Neurología experimental.
Departamento de investigación. Departamento de investigación.
Hospital Ramón y CajalHospital Ramón y Cajal
Junio 2009Junio 2009
COMUNICACIÓN INTERCELULAR A TRAVÉS DE CANALES
M1M2 M3 M4
E1 E2
NTCTCL
Conexina (Cx)Conexón
(hemicanal)Canal
Intercelular
6 Cx’s 2 hemicanales
ASTROCITOS OLIGODENDROCITOS
Cx30
Cx26
Cx43
Cx46.6 Cx32
Cx31.3
ENFERMEDAD DE PELIZAEUS-MERZBACHER
SINCITIO PANGLIAL
PMLD (Cx46.6) WT
ARN 5’ AUG ACC AAC AUG AGC TGG AGC TTC ..TGA 3’1 2 3 4 STOP
Met MetThr Asn TrpSer Ser Phe
NT de Cx26
OBJETIVOS
1. Caracterización de los canales de la Cx-46.6 humana: Identificación del sitio de iniciación de la traducción del mRNA Estudio de las propiedades de regulación por voltaje y por pH
2. Determinación de las propiedades de los canales implicados en el acoplamiento astrocito-oligodendrocito.
METODOLOGÍA
3) ENSAYO EN EL SISTEMA DE EXPRESIÓN DE LOS OOCITOS DE XENOPUS
Canales intercelulares
1) CLONAJE Y MUTAGENESIS
2) TRANSCRIPCIÓN IN VITRO
4) INMUNODETECCIÓN
pBSXG
PCR Stu1
5) CONDUCTANCIA INTERCELULAR Gj (DOBLE FIJACIÓN DE VOLTAJE)
“LIGACIÓN”
6) pHi
580 nm
630 nm
pHi
7.23 pH i 5.73
ROI-2
ROI-1
ROI-1
ROI-2
PROTEÍNA TOTAL
PROTEÍNA SUPERFICIE
C-SNARF
STOPATG
HCX46.6 GENÓMICO
+Met4
Met1&4Met1&4
Met4
( g/ l)[RNA]
Co
nd
uct
anci
a In
terc
elu
lar
(S
) (2
4 h.
a.p)
05
1015202530354045505560
2.01.00.50.10.050.0250.005
N=3n=8
N=4n=21
N=10n=48
N=4n=13
N=3n=16
N=3n=13
N=3n=14
N=4n=13
N=5n=13
Met4Met1&4
1) IDENTIFICACIÓN DEL SITIO DE INICIACIÓN de la Cx46.6.
ARN Met1&4 5’ AUG ACC AAC AUG. . . . . . .TGA 3’ 440aa1 2 3 4 STOP
Met MetThr Asn
ARN Met4 5’ .........................AUG. . . . . . .TGA 3’ 437aa
0.0e+02.5e+55.0e+57.5e+51.0e+60
10
20
30
40
50
60
C
on
du
tan
cia
Inte
rcel
ula
r
(S
)(4
8 h
. a. i.
, 24
h. a
. p)
0.025
0.05
0.5
0.1
Met1&4Met4
Cx46.6 EN SUPERFICIE (UA; 48 h.a.i.)
0.0e+0 5.0e+5 1.0e+6 1.5e+60.0e+0
2.5e+5
5.0e+5
7.5e+5
1.0e+6
Cx4
6.6
EN
SU
PE
RF
ICIE
(U
A)
Met40.05
Met1-41.0
Met1-40.5
Met40.025
TOTAL DE Cx46.6 (UA)
Met
1&4
(0.1
)
100kDa
cont
rol
Met
4 (0
.1)
52kDaBC
500
Met1-4HCx46.6
Met4HCx46.6
CONTROL0
100200300400
52 k
Da
52kDa 52 k
Da
0100200300400500
Met1-4HCx46.6
Met4CONTROL
Vj
Ij
100mV
+120
-120
1 s
50nA
100
Vj
Ij
100mV
+120
-120
1 snA
-120 -80 -40 0 40 80 120
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2
Vj
Gj
-120 -80 -40 0 40 80 120
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2
Vj
Gj
Met1&4 Met4 Met1&4/Met4
Vj
Ij
100mV
+120
-120
1 s
100nA
-120 -80 -40 0 40 80 120
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.4
Gj
V j
amp
litu
de
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 -120 mV
amp
litu
de
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 +120 mV
1+2
21
21
1+2
ms ms 0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 -120 mV
am
pli
tud
e
msa
mp
litu
de
+120 mV
1 1
1 1
ms
am
pli
tud
e
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 -120 mV
t1+t2
t1
t2
ms
am
pli
tud
e
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 +120 mV
t1
t2
t1+t2
ms
2. PROPIEDADES DE LOS CANALES DE LA Cx46.6 2.1. REGULACIÓN POR VOLTAJE
CANALES OLIGODENDROCITARIOS, ASTROCITARIOS Y OLIGODENDROCITARIOS-ASTROCITARIOS
CANALES ASTROCITO-OLIGODENDROCITO
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Co
nd
uc
tan
cia
In
terc
elu
lar
(S
)(2
4 h
.a.p
)
NC NC NC NC NC NC
N=7n=27
N=4n=18
N=6n=30
N=5n=28
N=4n=18
N=4n=15
N=4n=18
N=4n=14
N=3n=16
N=3n=15
Met1&4/hCx43 Met4/hCx43 hCx43
Vj
Ij
1 s
40nA
100mV
+120
-120
-120 -80 -40 0 40 80 120
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2
Vj
Gj
jV
jI
+120
100mV
-120
1 snA100
-120 -80 -40 0 40 80 120
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.4
Vj
Gj
-120 -80 -40 0 40 80 120
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.4
Vj
Gj
LOS CANALES ASTROCITARIOS y ASTROCITARIOS-OLIGODENDROCITARIOS
am
pli
tud
e
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 -120 mV
1
2
+2
msa
mp
litu
de
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 +120 mV
1 2
+2
ms
am
pli
tud
e
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 +120 mV
12
+2
ms
am
pli
tud
e
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 -120 mV
1
ms
am
pli
tud
e
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 -120 mV
1+2
21
ms
am
pli
tud
e
0 5000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 +120 mV
21
1+2
ms
100mV
jV
+120
50nA
Ij
1 s
-120
CONCLUSIONES
1) Los estudios realizados para identificar cuál es la metionina iniciadora en la Cx46.6 indican que el mRNA se transduce a partir del primer triplete AUG presente en el extremo 5’ de su secuencia. Como consecuencia de ello, el número de residuos aminoacídicos de la Cx46.6 es de 440.
2) El triplete de aminoácidos Met-Thr-Asn presente en el extremo 5’ del dominio amino-terminal de la Cx46.6 es un importante determinante molecular de las caracteristicas funcionales del canal y de las propiedades de regulación por voltaje y por pH.
3) La Cx46.6 oligodendrocitaria es capaz de formar canales con la Cx43 astrocitaria, formando unas uniones de tipo rectificador en función del voltaje. Esta rectificación se origina como consecuencia de la diferencia de permeabilidad entre los hemicanales que constituyen los canales de Cx46.6-Cx43 e implica unidireccionalidad para la difusión de iones y moléculas.
Top Related