UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Biología Molecular
“Regulación de la expresión de tirosina hidroxilasa por
transcritos quimera y función de la dopamina en la
cardiogénesis”
Memoria presentada por Óscar Bártulos Encinas para optar al grado de Doctor en Biología por la Universidad Autónoma de
Madrid. Vº Bº de la Directora de Tesis, Vº Bº del Tutor, Catalina Hernández Sánchez José Manuel Cuezva Marcos
Óscar Bártulos Encinas
Madrid, Marzo de 2009
A mis padres, hermanos y sobrino
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar me gustaría agradecer a la Dra. Flora de Pablo la confianza
depositada en mí, cinco años atrás, para hacer la Tesis Doctoral en su laboratorio, y a la
Dra. Catalina Hernández por su labor de dirección y guía.
A los antiguos miembros del laboratorio; Tere, Gaizka, Alicia. Gaizka, fuiste mi
salvación en este sitio rodeado de mujeres. A Alicia y Tere de las que aprendí mucho, y
me hicieron sentar a recapacitar en no pocas ocasiones (no es fácil). A Silvia, Bea, Eva,
Héctor, Rosa, Mario, el Dr. Carlos Vicario, la Dra. Ana Valenciano, porque a pesar de
ser tan distintos, de todos he aprendido algo (espero que lo mejor).
A los Drs. Enrique de la Rosa, Teresa Suárez y Patricia Boya, por vuestras
críticas constructivas en los seminarios, y los conocimientos adquiridos. A Tany, por las
curradas que te has pegado para mantener los cimientos de nuestro subgrupo. A Kike y
Patri V, que tienen una paciencia infinita conmigo. A Jimena por las risas y hurtos
mutuos. A Ana R, porque te tiende una mano siempre que lo necesitas. A Ane y María,
que soportan casí a diario mis bromas. A Ana A, Marian, Natalia, Sergio, Marta, Carol,
Violeta y Reda, por los buenos momentos que hemos pasado en y fuera del laboratorio.
A “Producciones 107”, la amistad más allá de la ciencia; Asier, Rodrigo y Carlos
que junto con Dey y Kike “soportan” a diario mis payasadas (bueno, las sufrimos
mutuamente). Estoy seguro que nuestro futuro no está detrás de las cámaras y que algún
día viviremos de la ciencia (no sé como, pero lo haremos).
A las personas con las que he compartido tertulias y debates en torno a la barra
de un bar, o de varios y excursiones extraescolares de alto riesgo; Blas, Juán, Gonzalo,
Raquel (Kike), Fer (Marian), Alicia (Asier), Luque, Mikel, Úrsula, Eva, Carmen (Cajal),
Anakris, Lu, Isa.
A la gente de los servicios del CIB, porque hacéis que las tareas cotidianas sean
mucho más fáciles. A Isabel, Manolo y Paco del animalario (aunque no os lo creáis en
mi Tesis también he tocado ratones). A las chicas de esterilización, compras, los chicos
de mantenimiento, los porteros, los de seguridad, informática, almacén… A las chicas
de la limpieza, y en especial a las que son “nuestras chicas de la limpieza”, Aurora y
Gisela. A la gente de comedor/cafetería, y en particular a Pilar y a Marcos, por saber
darnos el trato especial que todo becario se merece.
A Manolo y a Rocío por acogerme durante el primer año de “incertidumbre” de
mi Tesis. A Victor y a Ana, la conexión entre el mundo civilizado (mi pueblo) y la
ciudad deshumanizada (Madrid).
AGRADECIMIENTOS
A mis dos familias de adopción en Madrid: César, Javi, Ahmad, Rebeca y David
(me costó un año pero creo que ya sabes la diferencia entre un ratón y una rata) por un
lado y Ricardo, Fuche, Pablo por el otro, habéis sido el punto de desconexión en este
loco mundo de la ciencia.
A la Dra. Carmen López y al Dr Virginio García de la Universidad de
Extremadura, por abrirme las puertas de su laboratorio en varias ocasiones a lo largo de
mi Tesis. Sin vuestra ayuda gran parte de esta Tesis no se hubiese podido llevar a cabo.
Gracias a Paloma por su apoyo logístico, su paciencia y comprensión. A Carlos (full
time), por su ayuda y las conversaciones hablando de “la otra ciencia”. A Nati y a
Mamen con las que empezaron las conversaciones de “la otra ciencia” antes de que
Carlos llegase al laboratorio. Gracias a Ricardo, que en no pocas ocasiones sufrió
nuestros horarios laborales.
A la Dra. Amelia Aránega, de la Universidad de Jaén, que me permitió conocer
y trabajar en su laboratorio durante un mes, y a la gente de su laboratorio, Estefanía,
Paco (entre político y cómico), Ana, Débora, Mapi y Ángel.
A los Drs. Deborah Henderson y Bill Chaudhry de la Universidad de Newcastle
por la atención prestada durante mi estancia y por dejar a mi libre disposición el
material de su laboratorio. También quiero agradecer el apoyo logístico de Kirsty, Tom
y Dom, que facilitaron gran parte de mi trabajo. El cansancio permanente que sufrí en
Newcastle, que incluso llegué a pensar que podría tratarse de alguna enfermedad, se lo
debo a aquellas personas que como Ferrán, María, Ana, Marina, Sebastian, Bianca,
Janina, Silvia, Alba y Juanma (nótese que hay alemanes, así que inglés practiqué), me
“obligaban” a hacer jornadas próximas a las 24 horas. Gracias a vosotros se hizo más
llevadero. Gracias a la gente de Newcastle, con la que intenté (en vano) practicar una
fonética que para la gente del “olé”, “toros” y “sevillanas” nos es desconocida.
A la Dra. Aixa Morales del Instituto Cajal, que al igual que varias almas
caritativas también me cedió espacio, material y conocimientos en su laboratorio,
aunque no se vea reflejado en esta Tesis.
Gracias a todos y todas, de corazón.
ABREVIATURAS
aa: aminoácido.
AADC: aminoácido aromático descarboxilasa.
AMHC-1: del inglés Auricular Myosin Heavy Chain 1.
α-MHC: del inglés alpha Myosin Heavy Chain.
AMPc: adenosinmonofosfato cíclico.
AMPT: alfa metilparatirosina.
AR: ácido retinóico.
BCIP: del inglés 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate.
β-Globin: globina β adulta.
βH1: globina β embrionaria.
BMP: del inglés Bone Morphogenetic Protein.
BSA: del inglés Bovine Serum Albumin.
CCP: campo cardíaco primario.
CCS: campo cardíaco secundario.
CD31: del inglés Cluster of Differentiation 31. También llamado PECAM-1.
CD34: del inglés Cluster of Differentiation 34.
cDNA: del inglés complementary Deoxyribonucleic Acid.
CE: cuerpo embrionario.
cols: colaboradores.
COMT: catecoloximetiltransferasa.
CT: célula troncal
cTH: del inglés chicken Tyrosine Hydroxylase.
Cx: conexina.
DAB: 3-3´diaminobenzidina.
DABCO: 1,4 diazabicilo (2,2,2) octano.
DAPI: 1,4-diamino-2-fenilindol.
DβH: dopamina β-hidroxilasa.
dCTP: del inglés 2’-deoxycytidine 5’-triphosphate. DHBA: 3,4-dihidroxibenzilamina.
DMEM: del inglés Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium.
DNA: del inglés Deoxyribonucleic Acid.
dNTP: del inglés deoxynucleotide triphosphate.
DEPC: dietilpirocarbonato.
DPBS: del inglés Dulbecco Phosphate Buffered Saline.
I
ABREVIATURAS
DRB: 5,6-dicloro-1β-D-ribofuranosilbenzimidazol.
DTT: ditiotreitol.
E: día embrionario.
EC: del inglés Early Chick culture.
EDTA: etilendiaminotetraacético.
ErbB: Epidermal growth factor receptor.
ERK: del inglés Extracelular signal- Regulated Kinase.
FBS: del inglés Fetal Bovine Serum.
FCS: del inglés Fetal Calf Serum.
Fig: figura.
FITC: del inglés Fluorescein Isothiocyanate.
FGF: del inglés Fibroblast Growth Factor.
Flk1: VEGF2R, del inglés Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2.
g: gramo.
GAPDH: del inglés Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase.
GFP: del inglés Green Fluorescent Protein.
HEK293T: del inglés Human Endothelial Kidney with SV40 large T antigen.
Hfr: del inglés Heart forming region.
HNK 1: del ingles Human Natural Killer 1.
HPLC: del inglés High Performance Liquid Chromatography.
HS: del inglés Horse Serum.
hpf: del inglés hours post fertilization.
ICA: del inglés Intrinsic Cardiac Adrenergic.
IRES: del inglés Internal Ribosome Entry Site.
Irx: del inglés Iriquois.
Isl1: del inglés Islet1.
JNK: del inglés Jun N-terminal Kinase.
kb: kilobase
l: litro.
L-DOPA: L-3,4-dihidroxifenilalanina.
LIF: del inglés Leukaemia Inhibitory Factor.
MAO: monoaminooxidasa.
MEF2C: del inglés Myocyte Enhacer Factor 2C.
mg: miligramo.
II
ABREVIATURAS
mHBH: meta-hidroxibenzilhidrazina.
ml: mililitro.
mm: milímetro.
mM: milimolar.
mRNA: del inglés messenger Ribonucleic Acid.
mTH: del inglés mouse Tyrosine Hydroxylase.
mV: milivoltio.
NBT: del inglés Nitro Blue Tetrazolium.
Neo: neomicina.
NF: estadios embrionarios de Xenopus de Nieuwkoop y Faber.
ng: nanogramo.
NGS: del inglés Normal Goat Serum.
NIH3T3: del inglés National Institutes of Health 3T3
Nkx: Nk2 transcription factor.
Nppa: del inglés Natriuretic peptide precursor A.
NRG1: neuregulina 1.
OA1: del inglés Ocular Albinism type 1.
pb: pares de bases.
PBS: del inglés Phosphate Buffered Saline.
PBT: PBS-Tween.
PBTx: PBS-Tritón.
PCR: del inglés Polymerase Chain Reaction.
PFA: paraformaldehído.
PNMT: del inglés Phenyletanolamine-N-methyltransferase.
PKC: proteína kinasa C.
p/v: peso/volumen.
qPCR: del inglés quantitative Polymerase Chain Reaction.
qTH: del inglés quail Tyrosine Hydroxylase.
RALDH: del inglés Retinoic Acid Dehydrogenase.
RNA: del inglés Ribonucleic Acid.
rRNA: del inglés ribosomal Ribonucleic Acid.
r.p.m.: revoluciones por minuto.
RT: del inglés Reverse Transcription.
RXR: del inglés Retinoid-X-Receptor.
III
ABREVIATURAS
SCL: del inglés Stem Cell Leukaemia.
SDS: del inglés Sodium Dodecyl Sulphate.
SHO: Síndrome Holt-Oram.
St: del inglés Stage.
TAE: Tris-Acetato-EDTA.
TBE: Tris-Borato-EDTA.
Tbx: del inglés TATA-box protein.
TE: Tris-EDTA.
TGFβ: del inglés Transforming Growth Factor β.
TH: Tirosina Hidroxilasa
TH-INS: trancrito quimera de tirosina hidroxilasa e insulina.
tRNA: del inglés transfer Ribonucleic Acid.
TT2: troponina T2.
U: unidades.
V: voltio.
VMHC-1: del inglés Ventricular Myosin Heavy Chain 1.
v/v: volumen/volumen.
xTH: del inglés Xenopus Tyrosine Hydroxylase.
3-I-Tyr: del inglés 3-Iodo-Tyrosine.
μCi: microcurie.
µl: microlitro.
µg: microgramo.
µm: micrómetro.
µM: micromolar.
IV
In all science, error precedes the truth,
and is better it should go first than last.
Hugh Walpole.
Science is organized knowledge.
Wisdom is organized life.
Immanuel Kant.
ÍNDICE
V
ÍNDICE
VII
Página
SUMMARY. 1
I.-INTRODUCCIÓN. 3
1.-La tirosina hidroxilasa: inicio de la síntesis de catecolaminas 6
2.-La tirosina hidroxilasa: la proteína y el gen. 7
3.-Receptores para catecolaminas. 9
4.-Presencia y función de las catecolaminas. 10
4.1.-En el organismo adulto. 10
4.2.-En el desarrollo embrionario. 11
4.2.1.-En el desarrollo embrionario del corazón. 12
5.-El corazón adulto en distintas especies. 12
6.-Formación del corazón embrionario. 14
6.1.-Formación del asa cardíaca. 14
6.2.-Los campos cardíacos primario y secundario. 16
6.3.-El sistema de conducción cardíaco. 18
7.-Señales que actúan positiva y negativamente en el desarrollo
embrionario del corazón. 19
7.1.-BMP. 20
7.2.-FGF. 20
7.3.-Wnt. 21
7.4.-Ácido retinóico. 21
7.5.-Neuregulina1. 21
8.-Factores de transcripción implicados en el desarrollo
embrionario del corazón. 22
8.1.-Familia Nkx2.X. 22
8.2.-Familia GATA. 23
8.3.-Familia Tbx. 24
8.4.-Familia Irx. 26
II.-OBJETIVOS. 29
III.-MATERIALES Y MÉTODOS. 33
1.-Animales de experimentación. 35
2.-Cultivo EC para embriones de pollo. 35
3.-Implantación de microesferas acrílicas de heparina. 37
4.-Electroporación. 37
ÍNDICE
VIII
5.-Cultivo de líneas celulares inmortalizadas. 39
6.-Transfecciones celulares. 39
7.-Cultivo de células troncales de ratón: línea celular E14. 40
8.-Diferenciación de las células troncales a cardiomiocitos. 41
8.1.- Disposición de las células en “gotas colgantes”. 41
8.2.-Recolección de cuerpos embrionarios (CE). 41
8.3.-Siembra de CE en superficie adherente. 42
9.-Tratamiento de las células E14 con L-DOPA y dopamina. 43
10.-Extracción de RNA. 44
11.-RT. 44
12.-PCR. 44
12.1.-PCR a tiempo final. 44
12.2.-PCR cuantitativa (qPCR). 45
12.2.1.-Utilización del sistema Oligo LUX™. 45
12.2.2.-Utilización del sistema Universal probe. 46
13.- Estabilidad del mRNA. 47
14.- Experimento de pulso-caza e inmunoprecipitación. 48
15.-Generación de sondas. 48
15.1.-cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2 en pCIneo. 48
15.2.-cTH y cTH-INS1 con epítopo V5. 49
15.3.-Tbx5 en pCR® II TOPO®. 49
15.4.-cTH en pCAGGS y pCAGGS-STOP-IRES-GFP. 49
15.5.-mTH en pCR® II TOPO®. 49
15.6.-Sonda de cDNA de cTH. 49
15.7.-Sonda de DNA genómico de cTH. 50
15.8.-Sonda de Neo. 50
15.9.-Sonda de DNA genómico de mTH. 50
15.10.-Sondas de VMHC-1, AMHC-1 y Nkx2.5. 50
16.- Southern Blot. 50
17.- Norhern Blot. 51
18.- Extracción protéica y Western Blot. 52
19.- Medida de catecolaminas por HPLC. 53
20.-Inclusión y secciones en parafina. 54
21.-Hibridación in situ. 54
ÍNDICE
IX
21.1.-Síntesis de ribosondas. 54
21.2.-Hibridación y revelado. 55
22.-Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. 57
22.1.-Inmunohistoquímica en embrión completo de pollo. 57
22.2.-Inmunohistoquímica en secciones. 57
22.3.-Inmunohistoquímica tras hibridación in situ. 58
22.4.-Inmunofluorescencia en secciones de embrión de
pollo. 58
22.5.-Inmunofluorescencia en cuerpos embrionarios. 59
23.-Tinción con hematoxilina-eosina. 59
24.-Análisis estadístico de los datos. 60
25.-Genotipado de los ratones THKO. 60
IV.-RESULTADOS. 65
1.-Identificación de transcritos quiméricos de tirosina
hidroxilasa e insulina: cTH-INS1 y cTH-INS2. 67
2.-Análisis del número de copias del gen cTH en el genoma
de pollo. 69
3.-Análisis de la expresión de cTH-INS1 en el embrión de pollo. 70
4.-Análisis in silico de las proteínas cTH, cTH-INS1 y
cTH-INS2. 73
5.-Expresión proteica de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2 en
células transfectadas. 75
6.-Niveles y estabilidad transcripcional de los transcritos cTH
y cTH-INS1. 76
7.-Estabilidad de las proteínas formadas a partir de cTH y
cTH-INS1. 77
8.-Actividad enzimática de las proteínas cTH, cTH-INS1 y
cTH-INS2. 78
9.-Los transcritos quimera cTH-INS1 y cTH-INS2 en otras
especies. 79
10.-Análisis de la expresión de cTH. 80
11.-Medida de las catecolaminas en embriones de pollo por
HPLC. 84
12.-Efecto de la L-DOPA y de la dopamina administradas
ÍNDICE
X
en microesferas acrílicas de heparina. 85
13.-El efecto de la L-DOPA es región y estadio-dependiente. 87
14.-Efecto de la inhibición de la producción endógena de
L-DOPA y dopamina. 89
15.-Efecto de la sobreexpresión de cTH en el corazón embrionario
de pollo. 90
16.-Efecto del bloqueo de la expresión endógena de cTH mediado
por morfolinos. 93
17.-Análisis de la expresión de TH en embriones de otras
especies. 94
17.1.-Estudio de la expresión de la mTH en el embrión
de ratón. 94
17.2.-Estudio de la expresión de xTH en el embrión de
Xenopus laevis. 96
18.-Células troncales: efecto de la L-DOPA y de la dopamina sobre
la expresión de marcadores cardíacos. 97
19.-Células troncales: efecto de la L-DOPA y la dopamina sobre
la diferenciación hacia el linaje eritrocítico. 101
V.-DISCUSIÓN. 103
1.-Los transcritos quimera TH-INS1 y TH-INS2, una regulación
inusual. 105
2.-Expresión y actividad enzimática de la TH durante el
desarrollo embrionario. 108
3. -Análisis del efecto de la L-DOPA y dopamina en el
desarrollo embrionario del corazón de pollo. 109
4.-Análisis del efecto de la L-DOPA y de la dopamina en la
diferenciación de células troncales. 112
VI.-CONCLUSIONES. 115
VII.-BIBLIOGRAFÍA. 119
SUMMARY A paradigm in molecular biology, lasting for more than two decades, was that
one gene gave rise to one protein. Nowadays, it is well-known that one gene can give
multiple mRNAs by the usage of different transcription start sites and different
polyadenylation sites, and by alternative splicing. Another unexpected source of
variability is the formation of transcription induced chimeras (TIC), mRNAs composed
of two gene sequences. In this Thesis we describe for the first time TIC in birds. We
have found two TIC in chick and quail embryos which contain tyrosine hydroxylase
(TH) and insulin gene sequences. The TIC, named TH-INS1 and TH-INS2 differ in
their insulin sequence content. TH-INS1 and TH-INS2 proteins correspond to truncated
TH forms that lack the tetramerization domain (TH-INS2) or replace the tetramerization
domain with a new amino acid sequence (TH-INS1). Both TH isoforms serve to
regulate TH activity, because their enzymatic activity is 6 to 7 times lower than that of
canonical TH, and the TIC regulate insulin production since insulin mRNA is
interrupted.
TH is the rate limiting enzyme in catecholamines biosynthesis that catalyzes the
convertion of L-tyrosine to L-DOPA (catecholamine precursor). We describe in this
work the expression pattern of TH during the early chick embryo development.
Functional TH is detected since St8, with expression restricted to the heart primordium.
Some authors have proposed a role for catecholamines during heart development
(Sarasa and Climent, 1991; Zhou et al., 1995; Kobayashi et al., 1995; Thomas et al.,
1995). In this study we show that L-DOPA and dopamine (first catecholamine in
catecholamines biosynthesis pathway) added to chick embryos in specific positions,
induced the ectopic expression of cardiac markers such as Tbx5, Nkx2.5, AMHC-1
(atrial myosin), VMHC-1 (ventricular myosin). Moreover, these cells not only express
cardiac markers but also are morphologically and ultrastructurally cardiomiocytes-like.
In contrast, inhibition of endogenous L-DOPA and dopamine production in chick
embryos inhibits AMHC-1 and VMHC-1 expression. Using a genetical manipulation
approach, we have found that TH over-expression in chick embryos, induces AMHC-1
and VMHC-1 expression. On the other hand, TH blocking by morpholinos inhibits
AMHC-1 expression.
We also demonstrate in this Thesis the implication of L-DOPA and dopamine in
mouse embryonic stem cells cardiac differentiation. L-DOPA and dopamine induced the
expression of the cardiac markers Nkx2.5, GATA4, Tbx5, αMHC and TT2. In parallel,
we observed that L-DOPA and dopamine blocked the erytroid lineage differentiation.
1
I.-INTRODUCCIÓN
3
INTRODUCCIÓN
Durante el desarrollo embrionario se producen procesos de proliferación, muerte, diferenciación y migración celular, por los que a partir de una única célula, el cigoto, se originan diferentes tipos celulares que se organizan para formar los órganos y tejidos que constituyen un individuo. Estos procesos están finamente orquestados por factores de transcripción responsables de la activación o inhibición de programas genéticos específicos, y por una red de moléculas reguladoras de diferente naturaleza química. Recientemente, se ha visto que hormonas peptídicas como la hormona del crecimiento, prolactina e insulina se sintetizan en el embrión antes de la diferenciación de las glándulas endocrinas encargadas de su producción en el organismo adulto (De Pablo y Roth, 1990; Yang y cols., 1999; Hernández-Sánchez y cols., 2006 (referencia 89); Sanders y Harvey, 2004). Las regiones del embrión en las que se producen estas hormonas son diferentes a las del organismo adulto. Por ejemplo, la insulina se genera en las células β-pancréaticas de vertebrados adultos, mientras que en el embrión en gastrulación y neurulación se encuentra ampliamente distribuida en las tres capas embrionarias (De Pablo y Roth, 1990; Pérez-Villamil y cols., 1994; Hernández-Sánchez y cols., 2002). Estas hormonas peptídicas presentes en los estadios iniciales del desarrollo embrionario, tienen un papel autocrino/paracrino distinto del papel endocrino que presentan en el organismo adulto. Así, la insulina en el organismo adulto es conocida como la hormona metabólica crítica en el anabolismo de los carbohidratos, mientras que en el embrión de pollo prepancreático (gastrulación y neurulación), la insulina y su precursor la proinsulina son factores de supervivencia celular (Morales y cols., 1997; Hernández-Sánchez y cols., 2002), además, la proinsulina está involucrada en la diferenciación cardíaca (Mansilla y cols., 2005). La prolactina en el organismo adulto regula el ciclo reproductivo, y estimula la secreción láctea en mamíferos. Durante el desarrollo embrionario, la prolactina presenta propiedades angiogénicas o anti-antigiogénicas, dependiendo de si actúa la molécula completa o sólo un fragmento de ella, respectivamente (Struman y cols., 1999). La hormona del crecimiento presenta efecto condrogénico y angiogénico en embrión de pollo (Meier y Solursh, 1973; Gould y cols., 1995), y efecto antiapoptótico en embriones bovinos en fase de blastocisto (Kölle y cols., 2003).
Un patrón de expresión y una función embrionarias distintas a las presentes en los organismos postnatales podrían requerir mecanismos de regulación alternativos. En los últimos años, nuestro grupo ha descrito la generación de transcritos de insulina embrionarios alternativos al transcrito expresado en el páncreas (Hernández-Sánchez y cols., 2003; Mansilla y cols., 2005) que difieren de éste en su actividad traduccional. Caracterizando los transcritos alternativos de insulina, hemos hallado una inesperada expresión temprana del gen de la tirosina hidroxilasa (TH). En este proyecto de Tesis
5
INTRODUCCIÓN
Doctoral he abordado la caracterización de la enzima TH como un nuevo elemento importante en la regulación del desarrollo cardíaco.
1.-La tirosina hidroxilasa: inicio de la síntesis de catecolaminas. La TH (E.C. 1.14.16.2) es la enzima limitante en la biosíntesis de catecolaminas (Nagatsu y cols., 1964; Levitt y cols., 1965) (Fig. 1), pertenece al grupo de las monooxigenasas y cataliza la conversión de L-tirosina a L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). La dopamina es la primera catecolamina que se forma en la ruta, mediante descarboxilación de la L-DOPA por la aminoácido aromático descarboxilasa (AADC), que elimina el grupo ácido de la cadena lateral. La siguiente reacción de la ruta, catalizada por la dopamina β-hidroxilasa (DβH), convierte la dopamina en noradrenalina y esta pasa a adrenalina por la feniletanolamina-N-metiltransferasa (PNMT).
En los organismos postnatales, las enzimas implicadas en la biosíntesis de catecolaminas tienen expresión específica de tejido, excepto la AADC, que es ubicua. Los principales sitios de síntesis de catecolaminas son, en el organismo adulto, el sistema nervioso central y periférico (sistema nervioso simpático) y en las glándulas adrenales. En el sistema nervioso central, se encuentran las neuronas dopaminérgicas (productoras de dopamina) localizadas en el cerebro medio, en la Substantia nigra y en el área tegmental ventral. La noradrenalina se produce en el sistema nervioso central, principalmente en el Locus coeruleus, situado en el tronco del encéfalo, en las inervaciones simpáticas de la mayor parte de los órganos, y en menor proporción en la médula adrenal. La adrenalina se sintetiza mayoritariamente en la médula adrenal, y en una proporción muy baja en el sistema nervioso central. Las catecolaminas contienen en su estructura un grupo catecol (un anillo bencénico con dos grupos hidroxilos), y un grupo amino en la cadena lateral alifática. En los organismos postnatales, la dopamina y noradrenalina actúan como neurotransmisores sobre las terminales post-sinápticas, y en algunos casos, sobre las propias terminales pre-sinápticas desde las que son liberadas. La adrenalina actúa principalmente siendo liberada al torrente sanguíneo desde la médula adrenal. Las catecolaminas son catabolizadas por dos enzimas que presentan expresión ubicua en el organismo: la monoaminooxidasa (MAO) y la catecoloximetiltransferasa (COMT).
6
INTRODUCCIÓN
TH AADC
DβH PNMT
DβH
Noradrenalina
(Norepinefrina)
Adrenalina
(Epinefrina)
L-Tirosina
NH3
OH
CH2
C
COOH
H
OH
OH
NH3
CH2
C OHH
OH
Dopamina
CH2
NH3
CH2
OH
NH3
L-DOPA
CH2
C
COOH
H
OH
OH
NH2
CH2
C OHH
CH3
OH
OH
TH AADC
DβH PNMT
DβH
Noradrenalina
(Norepinefrina)
Adrenalina
(Epinefrina)
L-Tirosina
NH3
OH
CH2
C
COOH
H
OH
CH2
C
COOH
H
OH
OH
NH3
CH2
C OHH
NH3
CH2
C OHH
OH
Dopamina
CH2
NH3
CH2
OH
Dopamina
CH2
NH3
CH2
OH
NH3
L-DOPA
CH2
C
COOH
H
OH
OH
L-DOPA
CH2
C
COOH
H
OH
OH
NH2
CH2
C OHH
CH3
OH
OH
NH2
CH2
C OHH
CH3
OH
OH
Figura 1.-Ruta de biosíntesis de catecolaminas. Sobre cada flecha se indica la enzima que cataliza la reacción. TH: tirosina hidroxilasa; AADC: aminoácido aromático descarboxilasa; DβH: dopamina β-hidroxilasa; PNMT: feniletanolamina N-metiltransferasa.
2.-La tirosina hidroxilasa: la proteína y el gen.
La TH está formada por unos 500 aminoácidos (aa) (528 en humano, 498 en rata y ratón, 491 en pollo y 454 en Caenorhabditis elegans). Presenta en todas las especies un dominio regulador situado en el extremo amino terminal, un dominio catalítico y un dominio de tetramerización situados en el extremo carboxilo terminal. En la TH de rata, la mejor caracterizada estructuralmente, el dominio regulador comprende los primeros 155 aa del extremo amino terminal (Daubner y cols., 1993). El extremo carboxilo terminal (aa 156-498), compuesto por 14 hélices α y 8 láminas β (Goodwill y cols., 1997), contiene el dominio catalítico entre los aa 188 y 456 (Lohse y Fitzpatrick, 1993), y el dominio de tetramerización entre los aa 457 y 498 (Goodwill y cols., 1997) (Fig. 2A). El núcleo central del dominio de tetramerización está formado por los 24 residuos de la hélice α-14, en los que reside un heptámero o cremallera de leucinas (L) (Fig. 2A). Cada monómero de TH se une a otro para formar dímeros, y estos se unen a través del dominio de tetramerización para formar homotetrámeros (Fig. 2B) (Daubner y cols., 1993).
7
INTRODUCCIÓN
VPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYKHGEPIPHV
EYTAEEIATWKEVYVTLKGLYATHACREHLEGFQLLERYCGYREDSIPQLEDVSRFLKER
TGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADR
TFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTVYWFTVEFGLCKQNGELKAYGAGLLSSYGELLHS
LSEEPEVRAFDPDTAAVQPYQDQTYQPVYFVSESFNDAKDKLRNYASRIQRPFSVKFDPY
TLAIDVLDSPHTIQRSLEGVQDELHTLAHALSAIS
α-1 α-2
α-3 α-4 α-5
α-6 α-7a α-7b α-8
α-8 α-9 α-10 α-11
α-12 α-13
α-14
β-1 β-2
β-3 β-4
β-5 β-6 β-7
β-8
164
224
284
344
404
464
A
B
VPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYKHGEPIPHV
EYTAEEIATWKEVYVTLKGLYATHACREHLEGFQLLERYCGYREDSIPQLEDVSRFLKER
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LSEEPEVRAFDPDTAAVQPYQDQTYQPVYFVSESFNDAKDKLRNYASRIQRPFSVKFDPY
TLAIDVLDSPHTIQRSLEGVQDELHTLAHALSAIS
α-1 α-2
α-3 α-4 α-5
α-6 α-7a α-7b α-8
α-8 α-9 α-10 α-11
α-12 α-13
α-14
β-1 β-2
β-3 β-4
β-5 β-6 β-7
β-8
164
224
284
344
404
464
Aα-1 α-2
α-3 α-4 α-5
α-6 α-7a α-7b α-8
α-8 α-9 α-10 α-11
α-12 α-13
α-14
β-1 β-2
β-3 β-4
β-5 β-6 β-7
β-8
α-1 α-2
α-3 α-4 α-5
α-6 α-7a α-7b α-8
α-8 α-9 α-10 α-11
α-12 α-13
α-14
β-1 β-2
β-3 β-4
β-5 β-6 β-7
β-8
164
224
284
344
404
464
A
B
Figura 2.-Estructura tridimensional de la TH. (A) Estructura secundaria del extremo carboxilo terminal de la TH de rata, desde el aminoácido 164. Las α-hélices y las β-láminas se muestran numeradas. Los aa del dominio de tetramerización aparecen bordeados por un rectángulo azul, y los aminoácidos de la cremallera de leucinas (L) aparecen resaltados en verde. Los aa de unión a hierro aparecen resaltados en rojo. (B) Estructura tetramérica de la TH de rata (extraída de Goodwill y cols., 1997). Cada monómero aparece representado en un color y etiquetado con números romanos.
La actividad enzimática de la TH depende de su estado de oligomerización. La
forma completamente funcional es la tetramérica, mientras que las formas monoméricas y diméricas presentan actividad parcial (Lohse y Fitzpatrick, 1993; Vrana y cols., 1994).
La TH es activada mediante fosforilación en cuatro residuos de serina del dominio regulador por varias kinasas: la proteína kinasa A (Joh y cols., 1978), la proteína kinasa II dependiente de calcio-calmodulina (Yamauchi y cols., 1981), la proteína kinasa C (PKC) (Albert y cols., 1984), y kinasas ERK (Haycock y cols., 1992). Los cambios alostéricos producidos por mucopolisacáridos sulfurados (Kuczenski y
8
INTRODUCCIÓN
Mandell, 1972) también activan la enzima. Por el contrario, los productos de la ruta, la dopamina, noradrenalina y adrenalina, bloquean la actividad enzimática de la TH (Andersson y cols., 1988 y 1992; Gordon y cols., 2008).
El gen de la TH presenta una organización sinténica con el gen de la insulina, situándose el gen de la TH en posición 5´ con respecto al de la insulina. Esta organización en tándem se mantiene desde invertebrados (Drosophila melanogaster, C. elegans) a vertebrados (Homo sapiens, Mus musculus, Gallus gallus). La distancia intergénica es variable dependiendo de las especies, llegando a ser de 14 kilobases (kb) en pollo, mientras que en humanos es aproximadamente de 2 kb.
El gen de la TH está formado por 14 exones en humanos y 13 exones en rata, ratón y pollo. Los niveles de mRNA están regulados positivamente por glucocorticoides y AMPc (Lewis y cols., 1983 y 1987; Coker y cols., 1988). El ácido retinóico, dependiendo del tipo celular, regula positiva o negativamente los niveles de mRNA de TH, aumentándolos en células de neuroblastoma humanas y células PC12 (Jeong y cols., 2006) y disminuyéndolos en neuronas simpáticas de rata en cultivo (Kobayashi y cols., 1994). En humanos los exones 1 y 2, y en rata los exones 2 y 11 presentan procesamiento alternativo, generando proteínas TH que difieren en el dominio regulador (Grima y cols., 1987; Lewis y cols., 1993; Schussler y cols., 1995). El mRNA de TH es estabilizado por la PKC (Vyas y cols., 1990) y su traducción es activada por la L-DOPA (Rodríguez-Martín y cols., 2001).
3.-Receptores para catecolaminas. Las catecolaminas ejercen su función principalmente a través de receptores de membrana acoplados a proteínas G. Los receptores dopaminérgicos son específicos para dopamina, y los adrenérgicos unen noradrenalina y con mayor afinidad adrenalina. Se han descrito 5 receptores para dopamina (D1-D5) que se clasifican en dos familias: D1 y D2. Dentro de la familia D1, se encuentran los receptores D1 y D5. A la familia D2 pertenecen los receptores D2, D3 y D4. Los receptores de la familia D1 están acoplados a proteínas Gs, y transducen la señal estimulando la producción de AMPc. Los receptores de la familia D2 están acoplados a proteínas Gαi y Gαo que inhiben la formación de AMPc, activan canales de K+ y reducen la entrada de Ca2+ a través de canales dependientes de voltaje.
Los receptores adrenérgicos se clasifican en dos familias: α y β. La familia α a su vez se subdivide en: α1A, α1B, α1D, α2A, α2B y α2C. La familia β, se subdivide en β1, β2 y β3 (Goodman y Gilman, 2007). Los receptores α1 están acoplados a proteínas Gq, los α2 a proteínas Gi o Go (Aantaa y cols., 1995; Bylund, 1992) y los receptores β, a proteínas Gs (Lefkowitz, 2000).
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INTRODUCCIÓN
La L-DOPA, aparte de intermediario metabólico de la ruta de biosíntesis de catecolaminas, así como de la ruta de biosíntesis de melanina, presenta efectos fisiológicos sobre la proliferación y diferenciación celular. Recientemente se ha comprobado que la L-DOPA se une al receptor de membrana OA1, también acoplado a proteínas G (López y cols., 2008), que se expresa en células pigmentadas.
4.-Presencia y función de las catecolaminas:
4.1.-En el organismo adulto. En el organismo adulto, las catecolaminas ejercen su acción como neurotransmisores y como hormonas. La función neurotransmisora la llevan a cabo la dopamina y noradrenalina en el sistema nervioso central y la noradrenalina en el sistema nervioso simpático. La función hormonal la lleva a cabo principalmente la adrenalina y, en menor medida, la noradrenalina, secretadas desde la médula adrenal. Las neuronas dopaminérgicas de la Substantia nigra controlan el movimiento, y su degeneración produce la enfermedad de Parkinson (Barzilai y Melamed, 2003). Las neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral emiten sus proyecciones al Nucleus acumbens, al núcleo estriado dorsal, la corteza, y otras áreas límbicas del cerebro implicadas en el control del aprendizaje (Day, 2008) y del comportamiento emocional (Tzschentke y Schmidt, 2000). El funcionamiento anormal de estas neuronas está implicado en trastornos del comportamiento como el trastorno bipolar (Miklowitz y Johnson, 2006), depresión melancólica (Malhi y Berk, 2007) y esquizofrenia (Murray y cols., 2008).
Las neuronas productoras de noradrenalina envían sus proyecciones al hipotálamo, tálamo, sistema límbico y corteza cerebral, y están implicadas en las situaciones de vigilia y en la memoria emocional. La noradrenalina también se ha asociado a trastornos del comportamiento como el trastorno de falta de atención/hiperactividad (Biederman y Spencer, 1999). La noradrenalina presente en el área subcortical es la encargada del control muscular (Lambert y cols., 1997). Tanto la noradrenalina como la adrenalina aumentan la frecuencia cardíaca y la presión sanguínea sistólica y disminuyen el flujo sanguíneo renal. Sin embargo, la adrenalina produce vasodilatación vascular periférica, mientras que la noradrenalina, globalmente produce vasoconstricción.
La adrenalina prepara al organismo para la reacción conocida como de “lucha o huida”, que consiste en un aumento de las frecuencias cardíaca y respiratoria, y dilatación de las pupilas.
10
INTRODUCCIÓN
4.2.-En el desarrollo embrionario. Las catecolaminas, las enzimas de su ruta de biosíntesis y los receptores adrenérgicos y dopaminérgicos han sido detectados en estadios embrionarios previos a la formación de las estructuras encargadas de su síntesis en el organismo adulto. En embriones de pollo, las enzimas aparecen de forma secuencial, detectándose la TH desde día embrionario 1 (E1), la AADC desde E2 y las enzimas DβH y PNMT desde E4 y E6 respectivamente. La L-DOPA se detectó desde E1, la dopamina desde E2, y la noradrenalina y la adrenalina desde E3 (Ignarro y Shideman, 1968). La detección de noradrenalina y adrenalina, previa a la detección de las enzimas que catalizan su producción, sugiere que o bien las enzimas no se encontraron por la falta de sensibilidad de las técnicas usadas en la época, o bien que hay una incorporación de noradrenalina y adrenalina por parte del embrión a partir de la yema del huevo.
En embriones de ratón los mRNAs de los receptores adrenérgicos α2c , β2 y β3 y las proteínas de α2c , β2, se detectaron en la mórula de 8 y 16 células y en el blastocisto (Cikos y cols., 2005 y 2007). La función de las catecolaminas embrionarias es diferente a la descrita en organismos postnatales. Lawrence y Burden en 1973 comprobaron tras la administración de AMPT (inhibidor de la TH) o nialamida (inhibidor de la MAO) al embrión de pollo, que las catecolaminas están implicadas en los movimientos morfogenéticos, cierre de neuroporos y torsión del embrión. Sarasa y Climent (1987) observaron que la inyección sub-blastodérmica de catecolaminas en embriones de pollo producía una modificación de los movimientos morfogenéticos que tienen lugar durante la gastrulación, dando lugar a un engrosamiento de la línea primitiva. Los ratones nulos para el gen de la TH (Zhou y cols., 1995; Kobayashi y cols., 1995) así como para el gen de la DβH (Thomas y cols., 1995) son letales embrionarios. El análisis fenotípico de ambos modelos indica que la letalidad es producida por fallo cardíaco. Los ratones albinos mutantes en el gen de la tirosinasa, enzima implicada en la síntesis de melanina que genera L-DOPA como metabolito intermediario, presentan deficiencias visuales. La falta de L-DOPA en la retina embrionaria produce alteraciones en procesos de proliferación y diferenciación celular de la neuro-retina (Ilia y Jeffery, 1999).
En el telencéfalo de embrión de ratón de E15, la dopamina, a través de receptores D1, induce la diferenciación neural, y a través de receptores D2, la proliferación de los precursores gliales (Popolo y cols., 2004). En el neoestriado de embrión de ratón de E13, la dopamina favorece la progresión de la fase G1 a S del ciclo celular, cuando activa receptores D2, mientras que la reduce cuando activa receptores D1 (Ohtani y cols., 2003).
11
INTRODUCCIÓN
4.2.1.-En el desarrollo embrionario del corazón. En 1996, Huang y colaboradores describieron por primera vez la presencia de
células con capacidad para sintetizar catecolaminas en el corazón embrionario y adulto humano, y en el corazón adulto de rata, que denominaron células ICA (del inglés Intrinsic Cardiac Adrenergic). Estas células que se encontraban aisladas o formando grupos en aurículas y ventrículos, o asociadas a la microvasculatura, expresan las enzimas de la ruta de biosíntesis de catecolaminas y, al contrario que las neuronas del sistema nervioso simpático, presentan vesículas claras por microscopía electrónica.
Posteriormente, Ebert y Thompson (2001) describieron la presencia transitoria de células ICA en el corazón de embriones de rata de E11,5, estadio previo a la inervación simpática del corazón, en las regiones que posteriormente dan lugar a los nodos sinoauricular y aurículo-ventricular. Estas células no se detectaron a partir de E12,5.
En corazones de embriones de pollo, la noradrenalina y la adrenalina se detectaron desde E3, la L-DOPA desde E4 y la dopamina desde E6 (Ignarro y Shideman, 1968).
Varios estudios sugieren que las catecolaminas podrían tener un papel en la formación del corazón. Embriones de pollo inyectados en la cavidad sub-blastodérmica con dopamina, presentaban corazones de mayor tamaño que los controles (Sarasa y Climent, 1987). Así mismo, las células de estos embriones inyectados con dopamina, sometidas a disgregación celular y posterior reagregación, daban lugar principalmente a células cardíacas. De igual forma, regiones caudales de embrión de pollo en gastrulación, las cuales no están determinadas a formar parte del corazón, cultivadas en presencia de dopamina se diferenciaban a cardiomiocitos, de una forma dosis dependiente (Sarasa y Climent, 1991). Como hemos mencionado, los ratones nulos tanto para el gen de la TH (Zhou y cols., 1995; Kobayashi y cols., 1995) como el de la DβH (Thomas y cols., 1995) son letales embrionarios. Ambos presentan bradicardia, y en algunos de ellos se aprecia dilatación auricular y desorganización de los cardiomiocitos ventriculares.
5.-El corazón adulto en distintas especies. El corazón es el órgano encargado de bombear la sangre a las diferentes regiones del organismo. El corazón más rudimentario se encuentra en Drosophila, y está formado por un tubo en forma de U, que se conoce como vaso dorsal (Fig. 3A). En peces, el corazón también es tubular, pero se encuentra regionalizado; está formado por un ventrículo y una aurícula que no presentan separación física, pero sí válvulas rudimentarias (Fig. 3B). En anfibios, así como en la mayoría de los reptiles, el corazón es tricamérico, y está formado por dos aurículas y un ventrículo no tabicado, altamente
12
INTRODUCCIÓN
trabeculado. Entre las aurículas y el ventrículo se encuentra la válvula aurículo-ventricular (Fig. 3C). En aves y mamíferos, el corazón es tetracamérico, compuesto por dos aurículas separadas por el septo interauricular y dos ventrículos separados por el septo interventricular (Fig. 3D).
En vertebrados, el corazón está rodeado de una capa de células epiteliales denominada epicardio. Entre el epicardio y el miocardio se encuentra el subepicardio, una región de matriz extracelular y células mesenquimales (Muñoz-Chapuli y cols., 2002).
C
A B
C
Aurícula izquierda
Aurícula derecha
Tracto de salida
Septo auricular
Válvula aurículo-ventricular
Ventrículo
D
Ventrículo izquierdo
Ventrículo derecho
Aurícula derecha
Aurícula izquierdaNodo
sinoauricular
Nodo aurículo-ventricular
Ramificaciones del Haz de His
C
A
C
A BB
C
Aurícula izquierda
Aurícula derecha
Tracto de salida
Septo auricular
Válvula aurículo-ventricular
Ventrículo
C
Aurícula izquierda
Aurícula derecha
Tracto de salida
Septo auricular
Válvula aurículo-ventricular
Ventrículo
D
Ventrículo izquierdo
Ventrículo derecho
Aurícula derecha
Aurícula izquierdaNodo
sinoauricular
Nodo aurículo-ventricular
Ramificaciones del Haz de His
D
Ventrículo izquierdo
Ventrículo derecho
Aurícula derecha
Aurícula izquierdaNodo
sinoauricular
Nodo aurículo-ventricular
Ramificaciones del Haz de His
(A) Dibujo modificado de Zaffran y Frasch (2002) del corazón tubular (C) de Drosophila. (B) Foto de una sección transversal de corazón adulto de pez cebra (extraída de Lohr y Yost, 2000). (C) Dibujo del corazón adulto de Xenopus (modificada de Lohr y Yost, 2000). (D) Dibujo representativo del corazón adulto de aves y mamíferos (extraído de Moorman y Christoffels, 2003). A: aurícula; AO: aorta; BA: Bulbus arteriosus; SV: Sinus venosus; Tr: trabécula; V: ventrículo.
Figura 3.-Diferentes tipos de corazón adulto.
13
INTRODUCCIÓN
6.-Formación del corazón embrionario. El corazón es el primer órgano que se forma, apareciendo las primeras
estructuras cardíacas en la fase final de la gastrulación. 6.1.-Formación del asa cardíaca. Al inicio de la gastrulación, el embrión está formado por dos capas
embrionarias, el epiblasto y el hipoblasto. Durante la gastrulación, las células del epiblasto migran convergiendo en la línea primitiva (Fig. 4A) e ingresan a través de ésta, dando lugar a un embrión formado por tres capas embrionarias (ectodermo, endodermo y mesodermo). Durante este proceso, las células del epiblasto sufren la primera transición epitelio-mesénquima.
En el embrión de pollo de estadio (St) 3 de Hamburger y Hamilton (1951) las células que van a originar el corazón migran a través de los 2/3 más rostrales de la línea primitiva (Fig. 5A). A su vez, la migración de los precursores cardíacos está regionalizada rostro-caudalmente, así, las células que migran más rostralmente formarán el polo arterial (Bulbus cordis), seguidas de las del ventrículo, aurícula y polo venoso (Sinus venosus) (García Martínez y Schoenwolf, 1993) (Fig. 5A). En ratón, a diferencia del pollo, esta migración no está regionalizada, al encontrarse miocardiocitos provenientes de una misma célula progenitora a lo largo del tubo cardíaco (Meilhac y cols., 2003).
Un subconjunto de las células mesodérmicas que ingresan por la línea primitiva migran antero-lateralmente, situándose a ambos lados de la línea primitiva (Rosenquist, 1970; Yang y cols., 2002), formando en St5 de pollo o E7,5 de ratón dos regiones separadas y pareadas conocidas como Hfr (del inglés Heart forming region) (Fig. 4B) (Tabla 1). En este momento, en el mesodermo de la placa lateral se distinguen dos regiones: el mesodermo dorsal somático y el mesodermo ventral esplácnico, dejando entre ambos un hueco que corresponde a la cavidad celómica (Abu-Issa y Kirby, 2007). El mesodermo esplácnico se corresponde con el mesodermo precardiogénico (Virágh y cols., 1989). Los precursores cardíacos continúan migrando hacia la región anterior y medial del embrión, formando los primordios cardíacos (Fig. 4C), que se sitúan en posición caudal con respecto a la cabeza, y se aproximan a la línea media para fusionarse (Fig. 4D) (Wagner y Siddiqui, 2007).
En pollo, el momento de la fusión de los primordios cardíacos es un tema controvertido. Así, para algunos autores esta fusión se produce en St6 (DeHaan, 1963; Jiang y cols., 1998; Bruneau y cols., 1999; Yamada y cols., 2000), mientras que otros consideran que se produce en St9 (Stalsberg y DeHaan, 1969; Colas y cols., 2000). Previo a la fusión de los primordios cardíacos, las células del mesodermo cardíaco se diferencian en progenitores miocárdicos y endocárdicos (Lough y Sugi, 2000).
14
INTRODUCCIÓN
A
St3
LP
B
St5
LP
Hfr NH
E
St10
S
CTC
F
St11
S
ACC
C
PCS
NH
St7
D
St9
C
PC
En embrión de pollo de St10 (Abu-Issa y Kirby, 2007; Moorman y cols., 2007)
(Fig. 4E) y en embrión de ratón de E7,8 (Abu-Issa y Kirby, 2007) los primordios cardíacos ya fusionados forman el tubo cardíaco lineal, que está conectado al embrión a través del mesocardio dorsal (Snarr y cols., 2008). El tubo está compuesto por una capa externa de miocardio y otra interna de endocardio, conectadas por matriz extracelular (Eisenberg y Markwald, 1995).
Figura 4.-Representación esquemática de los estadios iniciales del desarrollo embrionario del corazón de pollo. (A) Movimientos de las células del epiblasto (flechas) en embrión de St3 para formar el mesodermo. (B) Embrión de St5 en el que se representan las células del Hfr como líneas discontinuas. (C) Embrión de St 7 en el que se muestran los primordios cardíacos (PC) aproximándose a la linea media del embrión. (D) Embrión de St9 en el que los primordios cardíacos (PC) en posición caudal con respecto a la cabeza (C) se han fusionado. (E) En el embrión de St10 se forma el tubo cardíaco (TC) en la posición medial del embrión. (F) En St11, el tubo cardíaco se ha girado hacia la derecha para formar el asa cardíaca (AC). LP: línea primitiva; NH: Nódulo de Hensen; S: somita.
S
A
St3
LP
St3
LPLP
B
St5
C
LP
Hfr NH
St5
PCS
NH
PCS
NHLP
Hfr NH
St7St7
E
St10
S
CTC
St10
S
CTC
F
St11
S
ACC
D
St11
S
ACCC
PCS
St9
C
PCS
St9
15
INTRODUCCIÓN
Conforme avanza el desarrollo, el tubo cardíaco se elonga tanto por el polo arterial (porción rostral) como por el polo venoso (porción caudal) y en St11 (E1,5) en embrión de pollo y E8,5 en embrión de ratón (Tabla 1), se curva hacia la derecha para formar el asa cardíaca (Männer, 2004). Este plegamiento restringe la presencia de mesocardio dorsal a las regiones anterior y posterior del corazón (Drake y cols., 2006). Durante la formación del asa cardíaca, las cámaras ventriculares pasan de estar alineadas rostro-caudalmente, a tener un alineamiento izquierda/derecha (Brown y Anderson, 1999; Männer, 2000).
6.2.-Los campos cardíacos primario y secundario (CCP y CCS). Estudios realizados en los últimos años, han puesto de manifiesto la existencia
de otra fuente de precursores cardíacos mesodérmicos, procedentes del que ha sido denominado campo cardíaco secundario (CCS) (Srivastava, 2006; Buckingham y cols., 2005). Las células del CCS expresan marcadores moleculares específicos como Isl1, FGF8 o FGF10 en ratón y FGF8 y HNK1 en pollo.
La contribución de las células del CCS a la formación del corazón varía entre ratón y pollo.
En embrión de ratón, las células del CCS se localizan en el mesodermo faríngeo (Kelly y cols., 2001; Cai y cols., 2003), y contribuyen a la formación del tracto de salida, el ventrículo derecho, así como determinadas regiones auriculares (Kelly y cols., 2001; Cai y cols., 2003; Zaffran y cols., 2004; Ilagan y cols., 2006) (Fig. 5C).
En embrión de pollo, la localización del CCS varía dependiendo de los estudios. Waldo y colaboradores sitúan el CCS en una posición posterior y adyacente al tracto de salida del corazón (Waldo y cols., 2001) (Fig. 5B en naranja), mientras que Mjaatvedt y colaboradores (Mjaatvedt y cols., 2001) postulan que las células del CCS se encuentran en el mesodermo faríngeo craneal, extendiéndose a los arcos faríngeos (Fig. 5B en azul). Las células del CCS en embrión de pollo contribuyen únicamente a la formación del tracto de salida del corazón (Fig. 5B).
Actualmente, la definición de uno o dos campos cardíacos es un tema controvertido. Algunos autores consideran que existe un único campo cardíaco en el que las células mesodérmicas sufren dos oleadas de diferenciación separadas en el tiempo (Moorman y col., 2007).
16
INTRODUCCIÓN
St3 St12
A
VD
AIAD
VI
TSVI
TS
PC
CCS
CCS
AFAF
TCAC
E7,5 E8 E8,5 E10,5
C
AF AFTS
VD
AI
AD
VI
TS
TSP
VD
AI
AD
VIAC
St16 St22 St16 St22
AC
BTSD
St3 St12
A
VD
AIAD
VI
TSVI
TS
PC
CCS
CCS
AFAF
TCAC
E7,5 E8 E8,5 E10,5
VD
AIAD
VI
TSVI
TS
PC
CCS
CCS
AFAF
TCAC
E7,5 E8 E8,5 E10,5
C
AF AFTS
VD
AI
AD
VI
TS
TSP
VD
AI
AD
VIAC
St16 St22 St16 St22
AC
BTSD
C
AF AFTS
VD
AI
AD
VI
TS
TSP
VD
AI
AD
VIAC
St16 St22 St16 St22
AC
BTSD
(A) Dibujo de la regionalización de la línea primitiva de embrión de pollo de St3 y la contribución de las
células que migran a través de ella al corazón de St12. V: ventrículo; sv/a: Sinus venosus/aurícula.
(B) Posición en el embrión de pollo de St16 de las células del CCS y su contribución a la formación del corazón tetracamérico de St22 según los resultados de Waldo y colaboradores (2001) (en naranja) y de Mjaatvedt y colaboradores (2001) (en azul).
(C) Posición y contribución de las células del CCP (rojo) y del CCS (verde) a la formación del corazón tetracamérico de ratón.
AC: asa cardíaca; AD: aurícula derecha; AF: arcos faríngeos; AI: aurícula izquierda; CCS: campo cardíaco secundario; PC: primordios cardíacos; TC: tubo cardíaco; TS: tracto de salida; TSD: tracto de salida distal; TSP: tracto de salida proximal; VD: ventrículo derecho; VI: ventrículo izquierdo.
Figura 5.-Contribución de las células del CCP y CCS a la formación del corazón en pollo y ratón.
Todos los dibujos de esta figura han sido modificados de Buckingham y colaboradores (2005).
17
INTRODUCCIÓN
Tabla 1.-Desarrollo embrionario temprano del corazón de pollo y ratón.
Pollo RatónMigración precursores cardíacos St4 E7(gastrulación)
Posicionamiento precursores en St5 E7la placa lateral
Formación del tubo cardíaco St9 E8
Contracción cardíaca St10 E8,5
Formación del asa cardíaca St11 E8,5
Datos extraídos de Evans (1999). St: estadios de pollo establecidos por Hamburger y Hamilton (1951). St: HH E: estadios de ratón en días embrionarios.
6.3.-El sistema de conducción cardíaco. El sistema de conducción está formado por el nodo sinoauricular, el nodo
aurículo-ventricular, el haz de His y las fibras de Purkinje (Fig. 3D). El nodo sinoauricular está situado en la parte derecha del corazón, en contacto
directo con la vena cava (Mommersteeg y cols., 2007). El nodo aurículo-ventricular se encuentra entre la aurícula y el ventrículo derecho (Boullin y Morgan, 2005). El haz de His se extiende a lo largo del septo interventricular, y se ramifica en tres: una ramificación hacia el ventrículo derecho, y las otras dos hacia las regiones anterior y posterior del ventrículo izquierdo. De las ramificaciones salen unos filamentos conocidos como las fibras de Purkinje.
El nodo sinoauricular es el marcapasos del corazón, lugar donde se origina el impulso eléctrico, que es transmitido al nodo aurículo-ventricular, se propaga por el haz de His a las fibras de Purkinje y éstas transmiten el impulso eléctrico a los cardiomiocitos del ventrículo (Canale y cols., 1986). Las células de los nodos sinoauricular y aurículo-ventricular presentan un menor número de fibras sarcoméricas que los miocardiocitos del “miocardio de trabajo” de las aurículas y ventrículos especializados en la contracción celular.
Aunque todos los elementos del sistema de conducción se originan a partir del mesodermo precardiogénico (Wu y cols., 2006) ha habido cierta controversia en el mecanismo por el que ocurre la diferenciación de las células mesodérmicas para formar los nodos sinoauricular y aurículo-ventricular. Algunos grupos apoyan la idea de que las células del miocardio primitivo que van a formar parte de los nodos “escapan” a la
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INTRODUCCIÓN
diferenciación a cardiomiocitos de trabajo (Moorman y Christoffels, 2003; Moorman y cols., 1998). Sin embargo, Cheng y colaboradores (1999) apoyan la idea de que las células de los nodos se forman mediante el reclutamiento de miocardiocitos de la aurícula. La aparición reciente del ratón nulo del gen Tbx3, cuya expresión está restringida al nodo sinoauricular, y los estudios de trazado de linaje con el ratón Cre bajo las secuencias reguladoras de Nppa, sustentan la idea de la proliferación celular en el nodo sinoauricular y descartan la teoría del reclutamiento de los miocardiocitos auriculares (Hoogaars y cols., 2007).
Se piensa que los haces de His derivan de las trabéculas de los ventrículos (Vassall-Adams, 1982; Moorman y cols., 1998) y al igual que éstas poseen un bajo potencial contráctil, y alto contenido en uniones Gap (Canale y cols., 1986), ricas en Cx40 y Cx43 (Fromaget y cols., 1992; Gourdie y cols., 1992).
7.-Señales que actúan positiva y negativamente en el desarrollo embrionario del corazón.
Durante el desarrollo embrionario, las células de los distintos territorios sufren procesos de especificación, determinación y diferenciación para dar lugar a los diferentes tejidos del organismo adulto. Hasta la fecha, no se conocen marcadores de especificación cardíaca, con lo que es muy difícil determinar el momento exacto en el que se produce. La determinación cardíaca es un proceso irreversible en el que las células están destinadas a la diferenciación a alguno de los linajes cardíacos. Esta determinación, en aves ya ha sucedido durante la etapa de gastrulación (St4-St5) (Montgomery y cols., 1994; Antin y cols., 1994). En la diferenciación de las células del mesodermo para dar lugar a células cardíacas están implicadas interacciones entre las tres capas embrionarias: ectodermo, endodermo y mesodermo.
Las señales inductivas de cardiogénesis se generan en el mesodermo y/o endodermo antero-lateral. Mediante experimentos de explantes en embriones de ratón (Tam y cols., 1997) y de pollo (Inagaki y cols., 1993) comprobaron que las células de las regiones caudales de la línea primitiva, transplantadas a la región antero-lateral (región precardiogénica) daban lugar a cardiomiocitos, en lugar de células sanguíneas (su destino natural). Sin embargo, el grado de implicación que se ha asignado al mesodermo y al endodermo antero-lateral en la inducción de la cardiogénesis depende de la especie y de la aproximación experimental realizada.
Utilizando experimentos de co-cultivo en embriones de pollo se ha demostrado que las señales inductivas del corazón proceden del endodermo anterior, y no del mesodermo precardiogénico (Schultheiss y cols., 1995; Yatskievych y cols., 1997). En anfibios, la eliminación del endodermo bloquea la formación del corazón (Jacobson, 1960; Nascone y Mercola, 1995). Sin embargo, la ablación genética en embrión de pez
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INTRODUCCIÓN
cebra (Alexander y cols., 1999), o la ablación quirúrgica del endodermo en embrión de pollo (Gannon y Bader, 1995) no bloquea la cardiogénesis.
El ectodermo induce la cardiogénesis al interactuar con las señales negativas provenientes de la placa neural (Jacobson, 1960).
Dentro de las señales inductivas de cardiogénesis se encuentran las BMP, los FGF, el ácido retinóico, y la neuregulina1. Los factores Wnt actúan como inductores o inhibidores dependiendo del momento del desarrollo.
7.1.-BMP. Las BMP pertenecen a la superfamilia de TGFβ. De los 20 miembros
identificados son la BMP2 y la BMP4 a las que se les ha asignado una función en la diferenciación cardíaca. BMP2 es detectada por PCR en células del endodermo antero-lateral de St6 de pollo (Lough y cols., 1996). Sin embargo, BMP2 por sí sola no induce la diferenciación del mesodermo precardiogénico de St6, necesita de la cooperación con FGF para mimetizar el efecto inductor del endodermo lateral anterior (Lough y cols., 1996).
De forma ectópica BMP2 induce la expresión de marcadores cardíacos como Nkx2.5, GATA4 (Schulteiss y cols., 1997; Andree y cols., 1998) y Tbx2 (Yamada y cols., 2000).
BMP2 y BMP4 inducen la expresión de marcadores cardíacos en mesodermo antero-medial, no precardiogénico, de embriones de pollo en gastrulación (Schulteiss y cols., 1997), y necesitan de la cooperación con FGF4 para inducir la diferenciación cardíaca en el mesodermo posterior (Ladd y cols., 1998; Barron y cols., 2000).
7.2.-FGF. Los FGF son una extensa familia de proteínas que regulan la proliferación,
migración y diferenciación celular durante el desarrollo embrionario. La expresión de FGF8 ha sido detectada en el endodermo antero-lateral de St6
de pollo (Parlow y cols., 1991) y en el endodermo visceral de embrión de ratón de E6,25, equivalente al endodermo antero-lateral de pollo. En estadios posteriores, el FGF8 es detectado en embrión de ratón en el endodermo definitivo, así como en el mesodermo precardiogénico adyacente (Crossley y Martin, 1995).
Tanto en embrión de pollo como de ratón, el FGF8 actúa en la inducción del mesodermo precardiogénico en cooperación con la BMP2. Además, en embrión de ratón, el FGF8 está implicado en la inducción del CCS (Brown y cols., 2004; Ilagan y cols., 2006).
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INTRODUCCIÓN
7.3.-Wnt. Los miembros de la familia de glucoproteínas Wnt son factores excretados a la
matriz extracelular. Los factores Wnt activan o inhiben la cardiogénesis dependiendo del factor y del momento del desarrollo embrionario (Naito y cols., 2006). Tres factores Wnt han sido ampliamente estudiados por su implicación en el desarrollo cardiaco: Wnt3a, Wnt8c y Wnt11.
Wnt3a y Wnt8c se expresan en la línea primitiva de embrión de pollo durante la gastrulación (Marvin y cols., 2001). Wnt3a y Wnt8c señalizan a través de la vía Wnt/β-catenina. La activación de la vía Wnt/β-catenina promueve la diferenciación del mesodermo hacia el linaje cardíaco en las primeras fases de la cardiogénesis (Naito y cols., 2006), inhibiendo la diferenciación a células cardíacas en etapas más avanzadas de la cardiogénesis (Scheider y Mercola, 2001; Marvin y cols., 2001).
Wnt11 se expresa de forma predominante en el mesodermo precardiogénico de embriones de Xenopus (Pandur y cols., 2002) y activa la cardiogénesis a través de la vía Wnt/JNK.
7.4.-Ácido retinóico (AR). El AR es un morfógeno derivado de la vitamina A y está implicado en la
supervivencia, proliferación y diferenciación celular durante el desarrollo embrionario. El ratón nulo para RALDH2, enzima necesaria para la síntesis de AR presenta
disminución del tamaño auricular, así como del polo venoso (Niederreither y cols., 2001). Recientemente, Ryckebusch y colaboradores (2008) han mostrado que en este ratón hay una expansión caudal de la expresión de los marcadores moleculares del CCS: Isl1, FGF8 y Tbx1. Los progenitores del CCS del ratón nulo no se diferencian correctamente en cultivo.
Por otro lado, el ratón nulo para RXR alfa, un receptor para AR, presenta pérdida de proliferación de los cardiomiocitos ventriculares de la región compacta y disminución del miocardio trabecular (Sucov y cols., 1994; Gruber y cols., 1996).
En embriones de pollo en cultivo, el AR provoca la expansión del patrón de expresión de Tbx5 y GATA4 (Liberatore y cols., 2000), expandiendo el dominio auricular a la región ventricular.
7.5.-Neuregulina1 (NRG1). Las neuregulinas son ligandos que median la interacción célula-célula a través
de receptores de la familia ErbB. En el ratón nulo de los genes NRG1, ErbB2 o ErbB4, se produce la pérdida de
trabeculación en la curvatura externa del asa cardíaca, destinada a formar los ventrículos
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INTRODUCCIÓN
(Meyer y Birchmeier, 1995; Kramer y cols., 1996; Gassmann y cols., 1995; Lee y cols., 1995).
8.-Factores de transcripción implicados en el desarrollo embrionario del corazón. Los múltiples factores de transcripción implicados en el desarrollo cardíaco se encuentran distribuídos principalmente en cuatro grandes familias: Nkx2.X, Tbx, GATA e Irx.
8.1.-Familia Nkx2.X Los Nkx2.X son genes homeóticos que comparten el dominio Nk2. En vertebrados,
se han descrito 10 genes Nkx2.X, de los cuales a la mitad de ellos se les ha atribuído alguna función durante el desarrollo embrionario del corazón; Nkx2.3, Nkx2.5, Nkx2.6, Nkx2.7. El gen Nkx2.3 se expresa en células del mesodermo precardiogénico de embrión de estadio NF 13 de Xenopus (Evans y cols., 1995) y en corazón de St18 de pollo (Buchberger y cols., 1996).
El gen Nkx2.5 se expresa desde gastrulación en endodermo y mesodermo de Xenopus, pollo y ratón (Schultheiss y cols., 1995; Tonissen y cols., 1994; Lints y cols., 1993; Tanaka y cols., 1998) y es el primer marcador de diferenciación cardíaca en Drosophila, Xenopus, pez cebra, pollo y ratón (Azpiazu y Frasch, 1993; Schultheiss y cols., 1995; Chen y Fishman, 1996; Tonissen y cols., 1994; Tanaka y cols., 1998). En pollo la expresión de Nkx2.5 es detectada desde St5 en la Hfr (Schultheiss y cols., 1995) y en ratón desde E7,5 en los primordios cardíacos (Komuro e Izumo, 1993; Lints y cols., 1993).
Nkx2.6 se expresa en corazón de ratón desde E8,5 (Biben y cols., 1998). La expresión de Nkx2.7 se detecta en el endodermo faríngeo y el mesodermo
precardiogénico de embriones de pez cebra desde las 10 hpf (Lee y cols., 1996). De los cuatro genes Nkx2.X que se expresan en regiones cardiogénicas, es a
Nkx2.5 al que se le ha atribuido un papel más relevante en la cardiogénesis. Tinman, el ortólogo de Nkx2.5 en Drosophila es requerido para la formación del vaso dorsal y para la especificación de los progenitores celulares que lo forman (Azpiazu y Frasch, 1993; Bodmer, 1993). El ratón nulo de Nkx2.5, a diferencia de lo que ocurre en Drosophila, sí llega a formar el tubo cardíaco, pero muere entre E9 y E10, presentando defectos morfogenéticos en la formación del tubo cardíaco y falta de los cojinetes endocárdicos (Lyons y cols., 1995).
El análisis del ratón nulo y del pez cebra tratado con morfolinos muestra que Nkx2.5 actúa a dos niveles. En primer lugar controla la proliferación o diferenciación de las células auriculares, como se muestra por el exceso de células encontradas en la región auricular del ratón nulo de Nkx2.5 (Prall y cols., 2007), y en embriones de pez cebra tratados con morfolinos contra Nkx2.5 (Targoff y cols., 2008). Por otro lado,
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INTRODUCCIÓN
Nkx2.5 también controla la contribución celular en la formación ventricular. En el ratón nulo de Nkx2.5, las células del CCS son incapaces de llegar al ventrículo (Prall y cols., 2007), y en los embriones de pez cebra tratados con morfolinos aparece un número inferior de células en el ventrículo, con respecto a los controles (Targoff y cols., 2008).
Se ha postulado que el fenotipo menos severo observado en mutantes de Nkx2.5 en vertebrados respecto a Drosophila puede deberse a la redundancia de función del subgrupo de genes Nkx2.X expresado en corazón. A favor de la redundancia de función de los factores Nkx2.X están los experimentos realizados en Xenopus. En embriones de Xenopus se bloqueó la diferenciación cardíaca mediante el uso de dominantes negativos contra Nkx2.3 y Nkx2.5 (Fu y cols., 1998) o utilizando proteínas Nkx2.3 y Nkx2.5 truncadas (Grow y Krieg, 1998). Este bloqueo se revirtió al sobreexpresar cualquiera de los dos factores de transcripción. En contra de la redundancia de función están los modelos genéticos de ratón. Por el patrón de expresión, Nkx2.6 podría estar compensando la falta de Nkx2.5, sin embargo, el ratón nulo de Nkx2.6 no presenta ningún tipo de alteración cardíaca y muere en edad postnatal (Tanaka y cols., 2000). El doble nulo de Nkx2.5/Nkx2.6, presenta un fenotipo muy similar al nulo de Nkx2.5: letal embrionario antes de E11 y retraso en la diferenciación de cardiomiocitos de la aurícula (Tanaka y cols., 2001).
En ratón se ha descrito que Nkx2.5 es haploinsuficiente, presentando los ratones heterocigotos dismorfogénesis valvular y en septación cardíaca (Biben y cols., 2000). En humanos, Nkx2.5 también es haploinsuficiente, y se han encontrado mutaciones que producen pérdida de función que conducen a enfermedades cardíacas congénitas que llegan a interrumpir la septación del corazón (Schott y cols., 1998) (Tabla 2).
En pez cebra, Nkx2.5 coopera con Nkx2.7. Tanto el bloqueo de Nkx2.5 como el bloqueo de Nkx2.7 impiden la formación del asa cardíaca (Targoff y cols., 2008).
8.2.-Familia GATA. Los factores de transcripción GATA están representados en vertebrados por 6
miembros (GATA1 a GATA6). Gata4/5/6 se expresan en tejidos mesodérmicos y endodérmicos (Molkentin,
2000). Algunos miembros de esta familia se expresan coincidentemente con Nkx2.5. En embrión de pez cebra de 10 somitas (<24 hpf) la expresión de Gata4 coincide con la expresión de Nkx2.5 en células precardiogénicas (Serbedzija y cols., 1998). En embrión de pollo desde St7, el gen Gata5 presenta el mismo patrón de expresión en mesodermo precardiogénico que Nkx2.5 (Laverriere y cols., 1994). En Xenopus, los genes Gata4, Gata5 y Gata6 presentan un patrón de expresión similar y coincidente con el de Nkx2.5 en el mesodermo precardiogénico de embriones de NF 22, así como en el corazón de embriones de NF 30 (Jiang y Evans 1996).
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INTRODUCCIÓN
En Drosophila, se ha demostrado la coexpresión de pannier (ortólogo de los genes Gata) y tinman, así como su capacidad de formar heterodímeros (Gajewski y cols., 1999). En vertebrados, también ha sido demostrada la interacción entre GATA4 y Nkx2.5, mediando la regulación transcripcional de genes cardíacos (Shiojima y cols., 1999) así como la regulación transcripcional cruzada entre genes Gata y Nkx (Davis y cols., 2000).
En Drosophila, el nulo de pannier, presenta pérdida de cardiomiocitos. El ratón nulo para Gata4 (Kuo y cols., 1997; Molkentin y cols., 1997), el nulo de pez cebra para Gata5 (Reiter y cols., 1999), así como la triple regulación a la baja (knock-down) de Gata4/5/6 en pollo (Jiang y cols., 1998), producen defectos cardíacos tales como la falta de fusión de los primordios cardíacos bilaterales, disminución de la expresión de Nkx2.5, y reducción del número de cardiomiocitos.
Los genes Gata, de la misma forma que los Nkx, tienen funciones redundantes, como ocurre para Gata4 y Gata6 en la diferenciación de cardiomiocitos de ratón (Zhao y cols., 2008), o para Gata5 y Gata6 en la determinación del linaje cardíaco en pez cebra (Holtzinger y Evans, 2007).
Además, Gata4 en humanos también es haploinsuficiente, como revelan las mutaciones “sin sentido” (missense), o de cambio de fase (frame-shift) encontradas en pacientes con enfermedades cardíacas congénitas (Garg y cols., 2003) (Tabla 2).
8.3.-Familia Tbx. De los 18 genes Tbx presentes en vertebrados (Papaioannou, 2001), 6 han sido
descritos como implicados en el desarrollo embrionario del corazón: Tbx1, Tbx2, Tbx3, Tbx5, Tbx18 y Tbx20.
Los genes Tbx que se expresan en corazón se dividen en dos subfamilias, Tbx1 y Tbx2. La subfamilia Tbx2, que incluye Tbx2, Tbx3 y Tbx5, se puede subdividir a su vez, en activadores y represores. De esta forma, se ha comprobado que Tbx2 y Tbx3, pertenecerían a la subdivisión de represores, al reprimir ambos la expresión de los genes Nppa y Cx40 (Habets y cols., 2002; Hoogaars y cols., 2004). Por el contrario, Tbx5 activa la expresión de Nppa y Cx43 (Bruneau y cols., 2001 (referencia 28)).
El gen Tbx1 se expresa en cardiomiocitos y células endoteliales del tracto de salida del corazón de ratón desde E9 (Yamagishi y cols., 2003; Brown y cols., 2004; Xu y cols., 2004).
Tbx1 presenta dos funciones en la formación del tracto de salida. Por un lado, tiene un papel en determinar el número de células (cardiomiocitos y células endoteliales) que contribuyen a la formación del tracto de salida, regulando la proliferación de las células del CCS, posiblemente vía FGF10. Por otro lado, las células que expresan Tbx1 también contribuyen a la formación del septo aorto-pulmonar (entre
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INTRODUCCIÓN
las arterias aorta y pulmonar) (Xu y cols., 2004). El gen Tbx1 es haploinsuficiente, dando lugar en humanos al Síndrome de DiGeorge, con anomalías en el tracto de salida del corazón, así como en los arcos faríngeos (Baldini, 2004) (Tabla 2).
Los genes Tbx2, Tbx3, Tbx5 y Tbx20, inicialmente comparten los territorios de expresión en los primordios cardíacos de embriones de pollo (Yamada y cols., 2000; Iio y cols., 2001).
Tbx2 se expresa en el miocardio del canal atrio-ventricular adyacente a las válvulas tricúspide y mitral, así como en el septo auricular en el corazón tetracamérico de pollo de E6 (Plageman y Yutzey, 2005).
Tbx3 se expresa en el nodo sinoauricular de corazones de embriones y de ratones adultos (Stieber y cols., 2004).
Los ratones nulos para el gen Tbx3 indican que éste está implicado en la especificación de la región sinoauricular inhibiendo la expresión de genes del miocardio auricular y activando la expresión de genes específicos del nodo sinoauricular. La expresión de Tbx3 en la región auricular da lugar a la aparición de marcapasos ectópicos (Hoogaars y cols., 2007).
Tbx5 se expresa en los primordios bilaterales del corazón de Xenopus y pez cebra (Chapman y cols., 1996) y en las crestas cardíacas de ratón (Plageman y Yutzey, 2004). En el corazón tetracamérico de E6 de pollo, y E13,5 de ratón, Tbx5 se expresa en la región auricular, ventrículo izquierdo y septo interventricular (Plageman y Yutzey, 2005; Bruneau y cols., 1999).
Tbx5 ha sido implicado en la proliferación de cardiomiocitos (Hatcher y cols., 2001), y en la migración de las células del proepicardio (Hatcher y cols., 2004). El ratón nulo para Tbx5 (Bruneau y cols., 2001 (referencia 28)), y los embriones de Xenopus tratados con dominantes negativos de Tbx5 (Horb y Thomsen, 1999) presentan alteraciones en la estructura sinoauricular y disminución de la expresión de Nkx2.5. En el ratón nulo de Tbx5, además se inhibe la expresión de otros factores de transcripción como GATA4 e Irx4. Por otro lado, la sobreexpresión de Tbx5 en la región ventricular, produce morfogénesis ventricular aberrante (Liberatore y cols., 2000). El gen Tbx5 también es haploinsuficiente, encontrándose mutaciones en humanos que dan lugar al Síndrome de Holt-Oram (SHO) (Basson y cols., 1997) (Tabla 2). Este síndrome se caracteriza por la aparición de defectos en la septación auricular, y problemas en el sistema de conducción cardíaco. Recientemente se ha mostrado que en el SHO la haploinsuficiencia de Tbx5 provoca problemas en la función diastólica del corazón, alterando la relajación de los cardiomiocitos ventriculares (Zhu y cols., 2008).
Mediante ensayo de doble híbrido se ha demostrado la interacción física de Tbx5 y Nkx2.5 (Hiroi y cols., 2001).
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INTRODUCCIÓN
El gen Tbx18 en ratón, pollo y pez cebra se expresa en el proepicardio (Kraus y cols., 2001; Begemann y cols., 2002; Tanaka y Tickle, 2004). Las células del proepicardio dan lugar a células mesenquimales que migran y forman el epicardio (Virágh y Challice, 1981), y a la vasculatura coronaria (Pérez-Pomares y cols., 2002). En ratón y en pollo, la expresión de Tbx18 se mantiene en el epicardio (Kraus y cols., 2001; Plageman y Yutzey, 2005).
El ratón nulo de Tbx18 es viable hasta el nacimiento (Bussen y cols., 2004), mientras que los ratones que tienen fallos en el desarrollo del epicardio no sobreviven más allá de E15 (Chen y cols., 2002). Esto indica que aunque Tbx18 esté involucrado en el desarrollo del epicardio, no es imprescindible.
Tbx20 se expresa en las dos aurículas y en los primordios de las válvulas tricúspide y mitral en el corazón de pollo de E6 (Plageman y Yutzey, 2005).
8.4.-Familia Irx. La familia Irx son genes homeóticos, representados en vertebrados por 6
miembros (Irx1-Irx6) que comparten un dominio de 13 aminoácidos denominado Iro box (Gómez-Skarmeta y Modolell, 2002). Los genes Irx1/2/4/5 presentan expresión en el corazón (Christoffels y cols., 2000; Bruneau y cols., 2001 (referencia 25), pero hasta el momento solo han sido atribuidas funciones cardíacas a los genes Irx4 e Irx5.
La expresión del gen Irx4 es detectada desde E8,5 en ratón (Bruneau y cols., 2000) y desde St10 en pollo (Bao y cols., 1999), en ambos casos restringida a la región ventricular. Su expresión ventricular se mantiene a lo largo del desarrollo.
La sobreexpresión de Irx4 en pollo, mediante la utilización de vectores virales, induce la expansión de marcadores ventriculares a la región auricular, y la disminución de la expresión de genes auriculares. El bloqueo de Irx4 utilizando dominantes negativos, produce el efecto contrario, es decir, se expande la expresión de marcadores auriculares a la región ventricular, disminuyendo la expresión de marcadores ventriculares (Bao y cols., 1999). Los ratones nulos para Irx4 poseen una morfología cardíaca normal, pero desarrollan durante la edad adulta hipertrofia cardíaca, y defectos en la función contráctil. Estas cardiomiopatías vienen precedidas de un patrón de expresión alterado de los genes del ventrículo (Bruneau y cols., 2001).
La expresión del gen Irx5 se detecta desde E9,5 (Bruneau y cols., 2000), indistintamente en aurícula y ventrículo.
El ratón nulo de Irx5 no presenta problemas de supervivencia embrionaria, y es completamente fértil. Sin embargo, estos ratones tienen problemas en la repolarización cardíaca (Costantini y cols., 2005).
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INTRODUCCIÓN
Tabla 2.-Genes implicados en el desarrollo embrionario del corazón, y defectos producidos por su ausencia.
Defectos cardíacos Síndrome en humanosNkx2.5 septación auricular y ventricular, sistema de conducción
ventrículo izquierdo
ventrículo derecho anómaloA4 septación auricular y ventricular
x1 tracto de salida Di George
x3 nodo sinoauricular
x5 septación auricular y ventricular, sistema de conducción Holt-Oramx20 no formación de cámaras, no formación tracto salida
f8 tracto de salida
f10 No muestra
aurícula y ventrículo único, no tracto de salida
polo venoso
Hand1Hand2GAT
Tb
TbTbTb
FgFgIsl1
Pitx2c
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II.-OBJETIVOS
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OBJETIVOS
La hipótesis general de este trabajo es que las catecolaminas se expresan y
actúan como moléculas reguladoras durante el desarrollo embrionario y,
específicamente, están implicadas en el desarrollo embrionario del corazón.
El objetivo global de esta Tesis es la caracterización de los transcritos quimera
generados a partir de los genes de la tirosina hidroxilasa (TH) e insulina (TH-INS1 y
TH-INS2), determinar el patrón de expresión de la TH, y definir la función de la L-
DOPA y la dopamina en las primeras etapas del desarrollo cardíaco.
Como objetivos concretos abordamos:
Objetivo 1: El análisis de la estructura de los transcritos quimera TH-INS1 y TH-INS2
así como de la actividad de las proteínas generadas a partir de éstos.
Objetivo 2: La caracterización del patrón de expresión y la actividad de la TH durante
los primeros estadios del desarrollo embrionario de pollo. Implicación de la L-DOPA y
de la dopamina durante las primeras fases del desarrollo embrionario del corazón de
pollo.
Objetivo 3: Determinar la presencia de TH en estadios embrionarios de otras especies:
ratón y Xenopus laevis.
Objetivo 4: Valorar el efecto de la L-DOPA y de la dopamina sobre la diferenciación
de células troncales a cardiomiocitos.
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III.-MATERIALES Y MÉTODOS
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MATERIALES Y MÉTODOS
1.-Animales de experimentación.
Los embriones de pollo (Gallus gallus) (Fig. 6A) se obtuvieron tras la incubación de
huevos fertilizados a 38ºC y 60-80% de humedad relativa. Se utilizaron embriones de la raza
Isa Brown (Granja Santa Isabel, Córdoba, España), salvo en los experimentos de los
transcritos de tirosina hidroxilasa (TH), en los cuales se utilizaron embriones de la raza White
Leghorn (Granja Rodríguez-Serrano, Alba de Tormes, Salamanca, España). Los embriones
se estadiaron conforme a lo establecido por Hamburger y Hamilton (1951).
Los huevos fertilizados de codorniz (Coturnix coturnix) fueron cedidos amablemente
por el Dr. Virginio García Martínez de la Facultad de Medicina de la Universidad de
Extremadura. Se incubaron y estadiaron de la misma forma que los de pollo.
Los ratones silvestres que se utilizaron en este estudio, así como los THKO (del
inglés Tyrosine Hydroxylase Knock Out) eran de la estirpe C57/BL6. Los ratones TH+/-
(heterocigotos para el gen TH) fueron cedidos amablemente por el Dr. Richard D. Palmiter
de la Universidad de Washington (Seattle, EEUU). Todos los animales se mantuvieron en el
Centro de Investigaciones Biológicas en ciclos de 12 horas de luz, 12 de oscuridad a una
temperatura de 20ºC con comida y bebida ad libitum. La manipulación de los mismos se
realizó conforme a la normativa vigente en la Unión Europea.
Los embriones de Xenopus (Xenopus laevis) (Fig. 6C) fueron cedidos amablemente
por las Dras. Ana Isabel Valenciano y María Jesús Delgado de la Facultad de Biología de la
Universidad Complutense de Madrid. Se estadiaron según lo descrito por Nieuwkoop y
Faber (1956).
2.-Cultivo EC (del inglés Early Chick) para embriones de pollo.
El cultivo EC, es una variante del cultivo de New, descrito por Chapman y
colaboradores (2001).
El huevo se abrió utilizando unas pinzas con punta roma. Se eliminó la clara más
densa, y la yema se vertió en una placa Petri. Dicha yema se pasó de una placa Petri a otra
hasta conseguir que el embrión quedase centrado en la superficie de la yema. Los restos de
clara que rodeaban al embrión se eliminaron utilizando pañuelos de papel. Sobre el embrión
se colocó un arito de papel de filtro (cuadradito de papel de filtro de 20 mm X 20 mm
(Whatman, EEUU), que poseía cuatro perforaciones en su interior, formando un dibujo que
asemejaba a un trébol de cuatro hojas. Se recortó la membrana vitelina alrededor de dicho
cuadradito de papel con unas tijeras con punta angular. Se levantó el arito de papel,
procurando que el embrión no se desprendiese del mismo. Para ello, el arito se sujetó con
35
MATERIALES Y MÉTODOS
unas pinzas y se levantó oblicuamente, facilitando así que los restos de yema no quedasen
adheridos al embrión. El embrión adherido al arito de papel de filtro, se colocó con la parte
ventral hacia arriba, sobre una placa de 35 mm de diámetro que contenía el medio de cultivo
semisólido. Este medio estaba compuesto por una mezcla de 50% de 123 mM NaCl con
0,6% de agar (Pronadisa, Madrid, España) y 50% de ovoalbúmina extraída de huevos no
incubados.
A.-ESTADIOS EMBRIONARIOS DE POLLO
B.-ESTADIOS EMBRIONARIOS DE RATÓN
C.-ESTADIOS EMBRIONARIOS DE Xenopus
F
igura 6.-Estadios embrionarios más representativos de las especies utilizadas a lo largo de la Tesis. (A) De izquierda a derecha se muestran fotos de embriones de pollo de St3, St4, St5, St8-, St8 y St10 (vista ventral en todos ellos). (B) De izquierda a derecha se muestran fotos de embriones de ratón de E8,5 (vista ventral); E9,5; E10,5; E11,5; E12,5 y E13,5 (E9,5-E13,5, vista lateral). (C) De izquierda a derecha se muestran dibujos de embriones de Xenopus extraídos de www.xenbase.org/xenbase/original. Se muestran: NF 10 (vista anterior), NF 12 (vista del polo vegetativo), NF 15, NF 19, NF 20, NF 21 (NF 15-NF 21, vista anterior), NF 22 (vista lateral).
36
MATERIALES Y MÉTODOS
3.-Implantación de microesferas acrílicas de heparina.
Estos experimentos se realizaron en colaboración con la Dra. Carmen López
Sánchez de la Universidad de Extremadura.
Las microesferas acrílicas de heparina (Sigma, St Louis, MO, EEUU), son usadas
habitualmente en biología del desarrollo por su capacidad de adherir a su superficie
diferentes sustancias tales como ácido retinóico, factores de crecimiento (FGFs, etc). El tipo
de unión o adhesión de dichas moléculas, así como la forma de liberación de las mismas se
desconoce. Estas microesferas son útiles para ver el efecto local de la sustancia de interés en
una región determinada del embrión.
Las microesferas se seleccionaron en función del tamaño, utilizándose en nuestro
estudio aquellas que poseían 100-150 μm de diámetro. Estas microesferas se incubaron
durante al menos 2 horas a 4ºC, en una gota que contenía la sustancia objeto de estudio a la
concentración deseada. Como control de la L-DOPA y de la dopamina se usaron
microesferas incubadas en PBS (Oxoid, Hampshire, Inglaterra). Como control de la 3-I-Tyr
(del inglés 3-Iodo-Tyrosine) (Sigma), un inhibidor de la tirosina hidroxilasa, así como de la
3-hidroxibenzilhidrazina (mHBH) (Sigma), inhibidor de la aminoácido aromático
descarboxilasa (AADC), se usaron microesferas incubadas en HCl, al ser éste utilizado para
la disolución de la droga.
Las microesferas se implantaron en los embriones de estadios y posiciones descritas
en el capítulo de Resultados (apartados 12, 13 y 14). Para ello, se colocaron los embriones en
cultivo EC (descrito en el apartado 2), con la parte ventral hacia arriba. Se realizó una
pequeña incisión en el endodermo del embrión en la posición deseada, utilizando para ello
espinas de cactus. Las microesferas se depositaron dentro de la incisión con unas pinzas y
utilizando de nuevo una espina de cactus, se implantaron en la cavidad existente entre el
endodermo y el ectodermo embrionario.
Una vez implantada la microesfera, los embriones se incubaron a 38ºC y 60-80% de
humedad relativa por el tiempo indicado. Transcurrido el tiempo, los embriones se fijaron en
4% PFA en PBS-DEPC (PBS, 0,1% dietilpirocarbonato) y se procesaron para hibridación in
situ o inmuhistoquímica.
4.-Electroporación.
Los embriones se extrajeron del huevo con aritos de papel de filtro y se
colocaron en cultivo EC (apartado 2). Se eligieron aquellos cuyos estadios embrionarios
estaban entre St3 y St3+. Dichos embriones se colocaron con la parte ventral hacia
37
MATERIALES Y MÉTODOS
arriba, sobre una placa que contenía el electrodo negativo de platino (CUY701P2E)
(Sonidel, Dublín, Irlanda). Se inyectó el plásmido (ver más abajo) o morfolino (Gene
Tools, OR, EEUU) de interés en la región de la línea primitiva en la que los precursores
cardíacos están migrando (Fig. 7A) (García-Martínez y Schoenwolf, 1993). Para ello se
utilizó un microinyector INJECT+MATIC (J.A.Gavy, Inject Matic, Ginebra, Suiza) y
capilares de borosilicato (World Precision Instruments, Florida, EEUU). El electrodo
positivo de platino (CUY613P2) (Sonidel) se colocó rápidamente sobre la zona de
inyección, y se electroporó utilizando un electroporador TSS20 Ovodyne Electroporator
(Intracel, Reino Unido) de onda cuadrada. Las condiciones de electroporación fueron: 5
mV, 5 pulsos, 40 milisegundos/pulso, con un intervalo de 990 milisegundos entre
pulsos.
Para preparar la solución de electroporación se utilizó 0,1% de Fast Green
(Sigma) para los plásmidos o azul de metileno para los morfolinos como marcadores de
la zona de inyección (Fig. 7B).
Para la sobreexpresión del cDNA de la tirosina hidroxilasa de pollo (cTH, del
inglés chicken Tyrosine Hydroxylase) se realizaron dos aproximaciones: 1)
coelectroporación de pCAGGS y pCX-EGFP (cedidos por la Dra. Aixa Morales); 2)
electroporación del vector bicistrónico pCAGGS-STOP-IRES-GFP (los vectores se
describen en el apartado 15). En la coelectroporación se usaron 3 µg/µl de pCAGGS
(control) o pCAGGS-cTH y 1 µg/µl de pCX-EGFP. En la electroporación con el
plásmido bicistrónico se usó una concentración de 3 µg/µl pCAGGS-STOP-IRES-GFP
(control) o pCAGGS-cTH-STOP-IRES-GFP.
Para el bloqueo de la expresión de cTH se electroporó un morfolino dirigido
contra la región 5´ no traducida e inicio de la traducción del mRNA de cTH (P14)
(Tabla 4). Como control se utilizó un morfolino contra el mRNA de luciferasa (Gene
Tools).
En los embriones electroporados se realizó un seguimiento bajo la lupa de fluorescencia (Leica, Westland, Alemania), de la migración de las células electroporadas, por la expresión de la GFP en el caso de los plásmidos o bien por la 3´ carboxifluoresceína presente en los morfolinos. Los embriones se fijaron en 4% PFA en PBS en los estadios indicados y se procesaron para inmunohistoquímica e hibridación in situ.
38
MATERIALES Y MÉTODOS
CrC0.5
C1
C1.5C2
C2.5C3Cc
Bc
Au
Sv
V
A B
5.-Cultivo de líneas celulares inmortalizadas.
La línea de fibroblastos de ratón NIH3T3, así como la línea de riñón embrionario
humano HEK293T (del inglés Human Endothelial Kidney with SV40 large T antigen) se
cultivaron en medio DMEM (del inglés Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)
suplementado con 10% de FBS (del inglés Fetal Bovine Serum), 2 mM de glutamina y 1%
de penicilina/estreptomicina (todo de Gibco, Carlsbad, CA, EEUU).
La línea celular PC12 (feocromocitoma de rata) se cultivó en DMEM suplementado
con 10% HS (del inglés Horse Serum), 5% FBS y 1% penicilina/estreptomicina (todo de
Gibco).
Estas líneas celulares se crecieron a 37 ºC y 5% de CO2.
6.-Transfecciones celulares.
Generalmente las transfecciones de plásmidos se realizaron cuando se alcanzó un
60%-80% de confluencia celular. Las células NIH3T3, HEK 293T y PC12 se transfectaron
CrC0.5
C1C1.5
C2C2.5
C3Cc
CrC0.5
C1
C1.5C2
C2.5C3Cc
Bc
Au
Sv
V
A
CrC0.5
C1
C1.5C2
C2.5C3Cc
Bc
Au
Sv
V
CrC0.5
C1
C1.5C2
C2.5C3Cc
CrC0.5
C1
C1.5C2
C2.5C3Cc
CrC0.5
C1
C1.5C2
C2.5C3Cc
Bc
Au
Sv
V
A B
CrC0.5
C1C1.5
C2C2.5
C3Cc
B
CrC0.5
C1C1.5
C2C2.5
C3Cc
Figura 7.-Regionalización de la línea primitiva en St3-St3+. (A) García-Martínez y Schoenwolf (1993) dividieron la línea primitiva en ocho regiones de 125 µm cada una (Cr, C0.5, C1, C1.5, C2, C2.5, C3 y Cc). Las regiones C0.5 y C1 originan el Bulbus cordis (Bc). La región auricular (Au), ventricular (V) y polo venoso (Sv, Sinus venosus) se forman a partir de las regiones C1.5-C2.5. El dibujo de la izquierda muestra la regionalización de la línea primitiva de St3. En el dibujo de la derecha se representa un corazón en asa cardíaca de St11, así como el origen de las diferentes regiones del mismo. (B) Foto de embrión de St3+ en la que se muestra la regionalización de la línea primitiva. Este embrión ha sido electroporado, tras la inyección del vector bicistrónico en la región C2 (flecha negra). Alrededor del lugar de inyección se ven restos del Fast Green utilizados para indicar el área de inyección.
39
MATERIALES Y MÉTODOS
mediante el reactivo Lipofectamine™ Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Los cDNA de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2 (transcritos
quimera de la tirosina hidroxilasa e insulina) (apartado 15.1), se transfectaron en el vector de
expresión de mamíferos pCIneo (Promega, EEUU). Las células se transfectaron utilizando
cantidades similares de ambas construcciones, salvo para el caso de los ensayos de actividad
enzimática. En este caso se trató de obtener niveles de proteína cTH y cTH-INS1 similares,
modificando los niveles de cada construcción utilizados para la transfección. Para que los
niveles de DNA utilizados en la transfección fuesen iguales para ambas construcciones, se
utilizó el vector vacío, equiparando de esta forma los niveles plasmídicos de partida. Las
células se procesaron transcurridas 24 ó 48 horas para extracción de RNA, inmunodetección
tipo Western Blot, o medida de la L-DOPA.
7.-Cultivo de células troncales de ratón: línea celular E14Tg2a.IV (E14).
Los experimentos con la línea E14Tg2a.IV se realizaron en el Centre for Life de la
Universidad de Newcastle (Reino Unido), en el laboratorio de la Dra. Deborah Henderson.
La línea de células troncales embrionarias de ratón E14 se mantuvo en condiciones
indiferenciadas cultivándolas en botellas de cultivo de 25 cm2 recubiertas de 0,1% gelatina a
37ºC de temperatura y 5% CO2. Para preparar las botellas de cultivo, éstas se incubaron con
una solución de 0,1% gelatina (Sigma) en DPBS (Dulbecco PBS) (Invitrogen) a 37ºC
durante al menos 5 minutos. Transcurrido este tiempo se eliminó el exceso de gelatina y se
dejaron secar en el incubador durante 5 minutos.
Las células se expandieron a una dilución 1:8 cada dos días. Para ello se lavaron con
3 ml de DPBS y se levantaron de la superficie de cultivo incubando con 1 ml 0,05% de
tripsina-EDTA (Invitrogen) a 37ºC durante 5 minutos. A continuación se detuvo la acción de
la tripsina añadiendo 4 ml de medio de proliferación. Las células se centrifugaron a 1000
r.p.m. durante 4 minutos, y el precipitado celular obtenido se resuspendió en medio de
proliferación. El medio de proliferación estaba compuesto por DMEM con glutamina,
piruvato, 4,5 g/l de glucosa, suplementado con 1% glutamina, 1% aminoácidos no
esenciales, 0,1% 2-mercaptoetanol, 1% penicilina/estreptomicina y 10% FBS (especial para
células troncales embrionarias) (todo de Invitrogen). El estado indiferenciado se mantuvo
añadiendo 106 unidades de ESGRO® LIF (del inglés Leukaemia Inhibitor Factor)
(Chemicon, Temecula, CA, EEUU) por litro de medio de cultivo (Tabla 3).
40
MATERIALES Y MÉTODOS
8.-Diferenciación de las células troncales a cardiomiocitos.
La diferenciación de células troncales embrionarias se logró usando medio de
diferenciación y cultivando las células en placas bacteriológicas de 100 mm de diámetro
mediante una variación del método de “gota colgante” descrito por Wobus (Wobus y cols.,
1991). Dicho procedimiento permitió la agregación de las células troncales embrionarias
para formar los denominados cuerpos embrionarios (CE) simples (Fig. 8).
8.1.- Disposición de las células en “gotas colgantes”. (Día 0)
Las células indiferenciadas creciendo en medio de proliferación se lavaron con
DPBS, se despegaron de la placa de cultivo con tripsina, y se centrifugaron para eliminar la
tripsina. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado celular obtenido se resuspendió en
medio de diferenciación. Se realizó un recuento del número de células. Se preparó una
suspensión celular de 1,5 104 células/ml en medio de diferenciación. Se sembraron 10-15 ml
de la suspensión celular en una placa Petri de bacterias, para evitar que las células se
adhiriesen a la superficie de la placa. A partir de esta suspensión celular se sembraron gotas
de 20 μl (300 células/gota) utilizando una pipeta multicanal o repetidora sobre la cara interna
de la tapa de una placa de cultivo P100 (10 cm de diámetro) (Fig. 8B). En la base de la placa
se pusieron aproximadamente 10 ml de DPBS, que servirían para mantener unas condiciones
de humedad óptimas, evitando que las gotas se secasen. Se volteó la tapa conteniendo las
gotas sobre la base de la placa con cuidado para que éstas no cayeran ni se mezclasen entre
sí. Las placas que contenían las gotas colgantes se incubaron a 37ºC y 5% CO2 durante dos
días (Fig. 8A).
El medio de diferenciación estaba compuesto de DMEM con L-glutamina, piruvato
y 4,5 g/l glucosa, 20% FBS (suero de uso regular), 1% glutamina, 1% aminoácidos no
esenciales, 0,1% 2-mercaptoetanol (todo de Invitrogen) (ver Tabla 3).
8.2.-Recolección de cuerpos embrionarios (CE). (Día 2)
Después de dos días de incubación de las gotas colgantes, las células se habían
agregado y habían formando pequeños CE. Las gotas que contenían los CE se recogieron
una a una con una pipeta P1000 para evitar dañar las estructuras. Se depositaron en una placa
Petri de bacterias, para evitar su adhesión a la superficie de la placa, a la cual se le añadieron
previamente 10-12 ml de medio de diferenciación. El número de gotas a depositar sobre cada
placa fue variable y dependía del número de CE formados (aproximadamente 50 por placa).
Estos CE se cultivaron en suspensión a 37ºC y 5% CO2 durante tres días (Fig. 8A).
41
MATERIALES Y MÉTODOS
Células troncales enproliferación
Día 0 de experimento Células troncales se depositan sobre la tapa de la placa y se cultivan por el método de “gota colgante”.
Día 2 de experimento Los CE formados se cultivan en suspensión.
Día 5 de experimento Los CE se plaquean en una placa de 96 pocillos.
Día 5 – Día 10 de experimentoLos CE en una placa de 96 pocillos comienzan a desarrollar áreas de latido.
2 días a 37ºC y 5% CO2
3 días a 37ºC y 5% CO2
A
B
Figura 8.-Diferenciación de las células troncales E14. (A) Las células E14 en su estado indiferenciado, proliferan sobre una capa de 0,1% gelatina. Para la diferenciación de las células se utiliza el método de “gota colgante”. El día 0 de experimento, las células troncales se disponen en gotas colgantes sobre la tapa de una placa de Petri. El día 2 de experimento los CE formados en las gotas colgantes se transfieren a una placa de Petri, para que las células de los CEcontinúen proliferando en suspensión. El día 5 de experimento los CE (de mayor tamaño) se plaquean en una placa de 96 pocillos. (B) Foto en la que se muestra la disposición de las células en gotas colgantes.
8.3.-Siembra de CE en superficie adherente (Día 5).
Pasados tres días, los CE en suspensión habían proliferado y habían adquirido un
tamaño fácilmente visible. Los CE se recogieron en el menor volumen posible y se
depositaron en una placa que contenía unos 10 ml de medio de diferenciación sin suero.
Cada uno de estos CE se recogió con 270 µl de medio de diferenciación sin suero, se sembró
en una placa de 96 pocillos (un CE por pocillo) y se incubaron a 37ºC y 5% CO2.
42
MATERIALES Y MÉTODOS
Transcurridas unas 5 horas, los CE se habían adherido a la superficie de la placa y
habían comenzado a expandirse para formar CE císticos. En los CE císticos podían
observarse, entre otros tipos celulares, áreas de contracción espontánea, que contenían
cardiomiocitos. El período de tiempo transcurrido desde que se sembraron en placa de 96
pocillos hasta que se observaron las áreas de latido fue variable (1-4 días).
Tabla 3. Composición de los medios de cultivo utilizados para las células troncales.
Proliferación Diferenciación E14 E14
DMEM 434 ml 194,75 ml
FBS 50 ml (10%) 50 ml (20%) Especial cél. troncales Suero de uso regular
2-mercapto- 0,5 ml (0,1%) 0,25 ml (0,1%)etanol (10mM)Aminoácidos 5 ml (1X) 2,5 ml (1X)no esenciales(100X)Glutamina 5 ml (1%; 2 mM) 2,5 ml (200 mM) (1%; 2 mM)Penicilina/ 5 ml (100 U/ml)Estreptomi-cina (104 U/ml)LIF 0,5 ml
(106 U/ml)
9.-Tratamiento de las células E14 con L-DOPA y dopamina.
Tanto para la L-DOPA como para la dopamina, se preparó una solución madre de 5
mM en H2O estéril. Ambas drogas se aplicaron el día 5 de experimento (Fig. 8A). A la placa
Petri conteniendo 10 ml de medio de diferenciación sin suero, se le añadió L-DOPA o
dopamina a una concentración final de 10 μM. A la placa control se le añadió el volumen
equivalente de H2O. Cada día se renovaron 200 de los 270 μl de medio que contenía cada
pocillo con medio de diferenciación sin suero conteniendo el tratamiento farmacológico. A
los 5 días se juntaron los CE del mismo tratamiento, se les extrajo el RNA y se procesaron
para PCR cuantitativa (qPCR, del inglés quantitative Polymerase Chain Reaction).
43
MATERIALES Y MÉTODOS
10.-Extracción de RNA.
El RNA total se extrajo usando Trizol® (Invitrogen), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Todos las soluciones utilizadas se autoclavaron o se prepararon
con agua autoclavada 2 veces. La integridad del RNA fue verificada por electroforesis en
gel de agarosa.
En los casos en que se disponía de poco material: Hfr (del inglés Heart forming
region), primordios cardíacos, asas cardíacas de pollo y muestras de células troncales, se
añadió 1 μl de glucógeno (Invitrogen) a 20 μg/μl, para facilitar la precipitación del RNA.
11.-RT.
Para las reacciones de transcripción reversa (RT, del inglés Reverse Transcription) se
utilizaron 1-5 μg de RNA total, Oligo dT, y la enzima Superscript III (Invitrogen), de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cuando las muestras de RT se procesaron para qPCR, la transcripción reversa se
realizó con oligonucleótidos sintéticos degenerados p(dN)6 (Invitrogen), siguiendo las
instrucciones del fabricante.
12.-PCR.
12.1.-PCR a tiempo final.
Los cebadores utilizados específicamente en cada experimento están referidos a lo
largo de Resultados y listados en la Tabla 4. Típicamente las reacciones de amplificación se
realizaron con 2 μl del producto de RT en un volumen final de 50 μl, y la amplificación se
llevó a cabo generalmente con Taq polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA,
EEUU). Cuando el producto de la amplificación iba a ser clonado, se utilizó la enzima
Elongasa (Invitrogen) o High Fidelity (Roche Diagnostics, Manheim, Alemania), para
minimizar errores introducidos por otras polimerasas. En los casos en que se disponía de
poco material de partida, también se utilizó como enzima la High Fidelity por su mayor
rendimiento. Las condiciones estándar de amplificación fueron: 1 ciclo a 94º C 2 minutos,
35 a 40 ciclos a 94º C 30 segundos, 58º C 30 segundos y 68º C 1 minuto. Para amplificar el
cDNA de GAPDH se realizaron entre 20 y 25 ciclos, en condiciones como las descritas.
El resultado de las amplificaciones se analizó en geles de agarosa al 0,8 ó 2%
conteniendo bromuro de etidio.
44
MATERIALES Y MÉTODOS
Tabla 4.-Secuencia de cebadores, así como del morfolino contra cTH utilizado en la electroporación.
CEBADOR SECUENCIAS DEL CEBADOR 5´ A 3´ GEN ESPECIE CADENAC A C G A G T G A A G A T G C C A A C TH pollo sentidoG T T A C A G A C T A G G A A C A G G G TH pollo antisentidoG C T A G T T G C A G T A G T T C T C C A G T T insulina pollo antisentidoT G C C T G C A A G G A G T A C C T A G TH pollo sentidoC A C C A T G C C A A C C C C C A A C A Gtw-TH pollo sentidoA A G C T C G T A A C A T G G C G G A C cTbx5 pollo sentidoT T A G C T G T T C T C G C T C C A C T cTbx5 pollo antisentidoA C A G A A C T C G G G A C C A C C TH ratón sentidoA C A C A T G G G A A A G C C T C T G TH ratón antisentidoA T C C A C A T T C G T G T T G C T G C TH ratón sentidoT T G G A C T C T C A G G A G C C A A C TH ratón antisentidoG C T A T T G G G C G A A G T G C C G G neomicina sentidoG G C A A G C A G G C A T C G C C A T G neomicina antisentidoG G G T T G G T C A C T C T T C C A C GG C A G G G C T C C T G T C T T C C T A TH pollo sentidoA C A G C A T C G A G C T C C T G G A C A TH pollo sentidoG C T C T C C A C A C A C C A G G T G A insulina pollo antisentidoC C C T G T T C C T A G T C T G T A A C TH pollo sentidoG G C T G G G A G T C T T T C C A G T G T TH ratón sentidoG G A C C C A C A G A A G C C T G G C A TH ratón antisentidoC A G C A G A G G C A G C A G C A T G TH ratón sentidoG G A G G A C A C A G A C A T T C T T A C TH ratón antisentidoG G A A T G T G T G C G A G G C C A G neomicina antisentidoT T G T C A G A T G A G C C A G A G G T TH Xenopus sentidoG C T G A G T T C A G A A C T T C A A T G TH Xenopus antisentido
P1P2P3P4P5P6P7P8P9P10P11P12P13P14 C A T C TP15P16P17P18P19P20P21P22P23P24P25
En esta tabla TH= tirosina hidroxilasa. El morfolino contra TH, P14 presenta resaltadas en rojo las tres bases que
hibridan con el codón de inicio de la traducción de la TH de pollo.
12.2.-PCR cuantitativa (qPCR).
La qPCR se realizó mediante dos métodos que variaban en el sistema de detección
del producto amplificado:
12.2.1.-Utilización del sistema Oligo LUX™.
Para la detección de los productos de amplificación se utilizó uno de los cebadores de
cada pareja marcado con FAM (Invitrogen), fluoróforo que emite fluorescencia sólo cuando
está unido al DNA de doble cadena. Los niveles de fluorescencia se detectaron en cada ciclo
durante la elongación de los productos, de manera que al final de la reacción se tenía una
representación del incremento de fluorescencia por ciclo de PCR. Para cada reacción de
qPCR, se utilizó 1 μl del producto de RT, en un volumen final de 25 μl, y el kit Core
(Invitrogen). Puesto que cada producto amplificado tenía una cinética diferente, fue
necesario utilizar una curva estándar para cada uno, por lo que se determinó la cantidad de
cada amplicón por extrapolación a la curva. Para las muestras de embrión de pollo,
típicamente se utilizó como curva estándar RT de embrión de pollo de St10. Cuando se
45
MATERIALES Y MÉTODOS
analizó la expresión del transcrito cTH-INS1 con respecto al mRNA de cTH e insulina, se
utilizó el vector pCIneo que contenía la construcción cTH-INS1 en la que el punto más
concentrado contenía 10 picogramos de vector en los 25 μl de reacción y los demás, hasta
seis puntos, eran diluciones seriadas 1:10 (hasta 0,0001 picogramos). Como gen
normalizador se utilizó la GAPDH.
Típicamente, las qPCR se realizaron con 1 μl de RT (10 μl de una dilución 1/10), 1
μl H2O, 12,5 μl Mix, 0,5 μl de Rox y 0,5 μl de cada uno de los cebadores (concentración
madre a 100 μM). La qPCR se realizó en el aparato ABI Prism 7700 (Applied Biosystems).
El Análisis de los datos se realizó con el programa ABI Prism Sequence Detection
System .
12.2.2.-Utilización del sistema Universal probe.
En el segundo sistema de detección de la qPCR, se utilizó TaqMan Universal PCR
Master Mix, No AmpErase UNG (Applied Biosystems) y sondas de The Universal Probe
Library (UPL) (Roche Applied Science) para la detección. Esta reacción se llevó a cabo en
la Unidad de Genómica del Parque Científico de Madrid, en la Facultad de Biología de la
Universidad Complutense de Madrid.
Típicamente, las qPCR se realizaron con 0,5 μl de RT, 5,4 μl H2O, 10 μl Master Mix,
0,2 μl de sonda y 0,2 μl de cada uno de los cebadores.
Para el análisis de las células troncales de ratón se utilizó como gen normalizador el
18S rRNA y como curva estándar RT de RNA de corazón embrionario de 14,5 días.
La qPCR se realizó con el ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied
Biosystems).
El listado de cebadores utilizados en ambos casos aparece enumerado en la Tabla 5.
46
MATERIALES Y MÉTODOS
Tabla 5.-Cebadores utilizados en la qPCR.
En azul se muestran los cebadores del sistema Universal probe y en gris los cebadores del sistema Oligo LUX™.
SONDA SECUENCIA DEL CEBADOR 5´- 3´ GEN ESPECIE CADENA16 GTCTGGGGACCTGTCTGC Nkx2.5 ratón sentido
AGTAGGCCTCGGGCTTGA Nkx2.5 ratón antisentido17 GACGACGTGGAGGACGAC Tbx2 ratón sentido
CCAGCTTGTGGAACTGGTC Tbx2 ratón antisentido9 CGAAGTGGGCACAGAGATG Tbx5 ratón sentido
CACCTTCACTTTGTAACTAGGAAACA Tbx5 ratón antisentido69 AGGCTCACTTCGAGAACAGG TT2 ratón sentido
TCCTGTCTTTGAGGGAAATCA TT2 ratón antisentido13 CCCCAATCTCGATATGTTTGA GATA4 ratón sentido
ATGGCCCCACAATTGACA GATA4 ratón antisentido10 TCAAGAGTCATAAAATTCCTGCTG MEF2C ratón sentido
GGATGGTAACTGGCATCTCAA MEF2C ratón antisentido84 CGGAAACTGAAAGCGAAAG aMHC ratón sentido
TCCTCGATCTTGTCGAACTTG aMHC ratón antisentido6.1 GGTGGAGGTACTAGCTGACCA RUNX1 ratón sentido
GCCAGTGAGTGGGTAGCAC RUNX1 ratón antisentido71 CTGTGGCAGCTCTCTGGAT SCL ratón sentido
GGTGTTGGCTCCTCTGTGTAA SCL ratón antisentido22.1 ACCAGAGACCCTCGTTTTCA FLK1 ratón sentido
CATTTGCTTGCAGGAGGTTT FLK1 ratón antisentido25 CAAGCATCTGGGATAAAGTGG βH1 ratón sentido
ATCAGGAGCCTTCCCAGAGT βH1 ratón antisentido66 TGCACCTGACTGATGCTGA β-Globin ratón sentido
CATCGGCGTTCACCTTTC β-Globin ratón antisentido30 GCTGGTGCTCTATGCAAGC CD31 ratón sentido
ATGGATGCTGTTGATGGTGA CD31 ratón antisentido32 AGGCTGATGCTGGTGCTAGT CD34 ratón sentido
CAGGCCTAACCTCAGACTGG CD34 ratón antisentido70 TGCGAGTACTCAACACCAACA 18S ratón sentido
TTCCTCAACACCACATGAGC 18S ratón antisentidoTTCACTGAGAAGGGCCTCTTGA cTH pollo sentidoCACAGGAGGACCAGAACTACCAGCCTG5G cTH pollo antisentidoCCCTGGAACCAGCTATGCAG insulina pollo sentidoCTACCTGCACGCTCTCCACACACCAGG5AG insulina pollo antisentidoACGAGCCCTACACCCACAGC cTH-INS1 pollo sentidoGATCCGCAGAAGAGGCAGTGATCGGA5C cTH-INS1 pollo antisentidoCCATGTTTGTGATGGGTGTCAA GAPDH pollo sentidoCAACTGAAGGGTGCCAGGCAG5TG GAPDH pollo antisentido
13.- Estabilidad del mRNA.
Para el estudio de la estabilidad de los transcritos de cTH y de cTH-INS1, las células
transfectadas se trataron con 100 μM de 5,6-dicloro-1β-D-ribofuranosilbenzimidazol (DRB)
(Sigma), un inhibidor específico de la RNA polimerasa II, a las 48 horas de la transfección.
Las células se procesaron a las 0, 3, 6, 12 ó 25 horas después de haber añadido el inhibidor,
para la extracción del RNA y posterior detección por Northern Blot.
47
MATERIALES Y MÉTODOS
14.- Experimento de pulso-caza e inmunoprecipitación.
Transcurridas 20 horas después de la transfección, las células HEK293T se
incubaron durante 1 hora a 37ºC en 1 ml/pocillo de medio sin Met/Cys. El medio sin
Met/Cys se reemplazó por 300 μl/pocillo de medio sin Met/Cys, que contenía 50 μCi de [35S
] Met/Cys ProMix (Amersham Pharmacia Biotech, Essex, Reino Unido). Pasada la hora de
incubación, el medio se reemplazó por medio de cultivo completo no radiactivo. Las células
se lisaron a los tiempos indicados (0, 1, 2 y 4 horas), con 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 120 mM
NaCl, 0,5% NP40 (Sigma), y un cocktel inhibidor de proteasas mini EDTA free (Roche).
Las muestras se homogeneizaron, y se clarificaron por centrifugación. El
homogenado se incubó con un anticuerpo de conejo anti-TH (Chemicon) y proteína A-
Sepharosa (Amersham), durante 16 horas a 4ºC. El inmunoprecipitado se lavó 4 veces con
tampón RIPA (50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,1% de
SDS (del inglés Sodium Dodecyl Sulphate) y 1% de ácido deoxicólico) y 1 vez con tampón
TBS (20 mM de Tris-HCl pH 7,5 y 140 mM de NaCl), y se resolvió en un gel de
poliacrilamida al 10% NuPAGE (Invitrogen). El gel se fijó en una solución de 50% metanol,
10% ácido acético en H2O durante 30 minutos. Se secó con una solución de 40% metanol,
10% ácido acético, 5% glicerol en H2O.
La cuantificación de las proteínas cTH y cTH-INS1 se realizó mediante exposición
en pantalla Fuji usando el programa Image-Gauge.
15.-Generación de sondas.
15.1.-cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2 en pCIneo.
El clonaje de cTH y cTH-INS1 en pCIneo se realizó por RT-PCR a partir de RNA
total de embrión de St10, utilizando los cebadores P1 y P2 para cTH, y P1 y P3 para cTH-
INS1 (Tabla 4). Los fragmentos de amplificación se clonaron inicialmente en el vector
pCR® II TOPO® (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Posteriormente, el fragmento clonado se escindió con la enzima EcoRI, y se clonó en
pCIneo, linearizado con EcoRI.
El clonaje del cTH-INS2 (segundo transcrito quimera de insulina y tirosina
hidroxilasa) se realizó en cuatro pasos: 1.-) RT-PCR de RNA de St4 para amplificar el
extremo 3´ de cTH-INS2 utilizando como cebadores P4 y P3. Extracción de gel de la banda
correspondiente al cTH-INS2, de 843 pares de bases (pb). Clonaje del fragmento anterior en
pCR® II TOPO®; 2.-) Escisión con HindIII de la mitad 5´ del cDNA de cTH presente en el
48
MATERIALES Y MÉTODOS
pCR® II TOPO®-cTH; 3.-) Subclonaje del fragmento 5´ del cDNA de cTH (paso 2) en el
vector pCRII-cTH-INS2 (paso 1), linearizado con HindIII; 4.-) Escisión del cDNA de cTH-
INS2 (paso 3) con EcoRI y clonaje del mismo en pCIneo linearizado con EcoRI.
15.2.-cTH y cTH-INS1 con epítopo V5.
Este clonaje se realizó utilizando el sistema Gateway (Invitrogen) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Brevemente: 1.-) RT-PCR con los cebadores P5 y P2 para cTH
y P5 y P3 para cTH-INS1, utilizando como moldes pCIneo-cTH y pCIneo-cTH-INS1
respectivamente; 2.-) Ligación de los fragmentos amplificados en el vector pENTR-D
TOPO® (Invitrogen); 3.-) Recombinación homóloga entre pENTR-D TOPO® cTH/cTH-
INS1 y pcDNA 3.1/nV5-DEST (Invitrogen).
15.3.-Tbx5 en pCR® II TOPO®.
Para la sonda del Tbx5 de pollo se realizó RT-PCR de RNA de embrión de St10
usando los cebadores P6 y P7. El fragmento amplificado, de 1576 pb, se clonó en el vector
pCR®II-TOPO®.
15.4.-cTH en pCAGGS y pCAGGS-STOP-IRES-GFP.
El cDNA de cTH se liberó de pCIneo-cTH cortando con EcoRI y se clonó en
pCAGGS y en pCAGGS-STOP-IRES-GFP tras cortarlos con esta misma enzima.
15.5.-mTH en pCR® II TOPO®.
El cDNA de TH de ratón (mTH, del inglés mouse Tyrosine Hydroxylase) se clonó
mediante RT-PCR a partir de RNA de cerebro adulto de ratón utilizando los cebadores P8 y
P9. El fragmento amplificado de 1619 pb se clonó en el vector pCR®II-TOPO®. Este
fragmento se subclonó en pBluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU) debido a la
imposibilidad de obtener suficiente cantidad de plásmido a partir de la construcción pCR®II-
TOPO®-mTH. Para ello se liberó el cDNA de pCR®II-TOPO®-mTH con la enzima Eco
RI, y se clonó en pBluescript II SK+, previamente cortado con la misma enzima.
15.6.- Sonda de cDNA de cTH.
La sonda incluye la secuencia comprendida entre los exones 7 y 13 (806 pb) de cTH.
La sonda se generó escindiendo pCIneo-cTH con HindIII y XbaI. HindIII corta en el exón 7
de cTH y XbaI corta en el vector pCIneo, 18 pb por debajo (downstream) del cDNA de cTH.
49
MATERIALES Y MÉTODOS
15.7.- Sonda de DNA genómico de cTH.
Se generó mediante PCR de DNA genómico de embrión de día embrionario 4 (E4),
utilizando los cebadores P15 y P2, situados en los exones 11 y 13 de la cTH respectivamente.
El fragmento amplificado, de 2891 pb se insertó en el vector pCR II®TOPO® (Invitrogen).
15.8.- Sonda de Neo.
Se generó por PCR de DNA genómico de ratón transgénico con los cebadores P12 y
P13, para amplificar el casete Neo.
15.9.- Sonda de DNA genómico de mTH.
Se generó por PCR de DNA genómico de ratón silvestre con los cebadores P10 y
P11, obteniéndose un fragmento de aproximadamente 800 pb. Debido a la aparición de otras
amplificaciones además de la amplificación que correspondía al tamaño esperado, la banda
de DNA de interés se extrajo de un gel de 1% agarosa en Tris-Acetato-EDTA (TAE) con el
DNA Gel Extraction Kit (Millipore, MA, EEUU). Tras la purificación se insertó en pCR
II®TOPO®.
La identidad y fidelidad de todos los productos amplificados se verificó por
secuenciación de los mismos.
15.10.-Sondas de VMHC-1, AMHC-1 y Nkx2.5.
Las sondas para detectar VMHC-1 (del inglés Ventricular Myosin Heavy Chain 1) y
de AMHC-1 (del inglés Auricular Myosin Heavy Chain 1) fueron cedidas por Dr. D. Bader
(Bisaha y Bader, 1991). Para Nkx2.5 fue cedida por Dr. T.M. Schultheiss (Schultheiss y
cols., 1995).
16.- Southern Blot.
Se digirieron 20 μg de DNA genómico de pollo o 10 μg de DNA genómico de ratón
con las enzimas indicadas.
Las digestiones se corrieron en un gel de agarosa al 1%, durante 6 horas a un voltaje
constante de 70 V. El gel se trató con las siguientes soluciones: primero 15 minutos con
solución de depurinación (0,5 M HCl), después 30 minutos con solución de
desnaturalización (0,5 N NaOH y 1,5 M NaCl), y finalmente 30 minutos con solución de
neutralización (0,5 M Tris-HCl, pH 8). Con este tratamiento se consiguió la fragmentación
del DNA, lo que facilitó la transferencia de productos de alto peso molecular.
50
MATERIALES Y MÉTODOS
La transferencia de los productos de las digestiones enzimáticas se realizó por
capilaridad durante 16 horas, a una membrana de nylon (Schleicher & Schuell, Dassel,
Alemania). Se fijó el DNA a la membrana por luz ultravioleta (UV) con el horno
Stratalinker (Stratagene).
El DNA genómico de pollo se obtuvo a partir de patas de embriones de E4. El DNA
genómico de ratón se extrajo de una porción de cola de 1 cm. Una pequeña porción de tejido
muscular de pollo proveniente de la pata, o la porción de cola del ratón se lisaron en un
tampón que contenía 40 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 0,5% SDS y 200 mM NaCl
con 0,3 mg de proteinasa K (Roche Diagnostics) toda la noche a 55ºC. Posteriormente, se
llevó a cabo una extracción con 1/2 volumen de fenol y 1/2 volumen de cloroformo,
seguida de una segunda extracción con 1 volumen de cloroformo. El DNA se precipitó con
0,1 volúmenes de 3 M acetato sódico pH 5,2 y 2 volúmenes de 96% etanol frío. Tras dos
horas a -80ºC ó 18 horas a -20ºC se centrifugó a 14,800 xg durante 30 minutos. El
precipitado se lavó con 70% etanol y se resuspendió en TE (10 mM de Tris- HCl pH 7,4 y 1
mM de EDTA a pH 8).
El marcaje de las sondas se realizó con [32P]- dCTP, utilizando el Prime-It® II
Random Primer Labeling Kit (Stratagene).
La membrana se prehibridó a 42º C con una solución que contenía 50% formamida,
1X Denhardt [0,02% de ficol, 0,02 % de polivinilpirrolodona y 0,02 % de BSA (del inglés
Bovine Serum Albumin)], 1% de SDS, 5X SSC (150 mM de NaCl y 15 mM de citrato
sódico a pH 7,2) y 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón (Invitrogen) durante al menos
2 horas; posteriormente se hibridó a 42º C durante 16 horas con la solución de
prehibridación, a la que se le añadieron 1,5-2,0 x 106 cuentas por millón/ml (cpm/ml) de la
sonda. Tras la incubación se retiró la solución de hibridación y se realizaron dos lavados de
15 minutos con 2X SSC a temperatura ambiente y uno con 2X SSC y 0,5 % de SDS 30
minutos a 62,5ºC.
La intensidad de las bandas se midió por exposición en pantalla Fuji y lectura con un
aparato Fuji Film FLA 3000.
17.- Norhern Blot.
10 μg de RNA total de células transfectadas se resuspendieron en un tampón que
contenía 50% de formamida, 17% de formaldehído, 1X MOPS (20 mM de ácido sulfónico
4-morfolinopropano, 5 mM de acetato sódico y 1 mM de EDTA) y 170 ng/µl de bromuro de
etidio. El RNA se separó en un gel al 1,25% de agarosa que contenía MOPS y 17 % de
51
MATERIALES Y MÉTODOS
formaldehído, y se transfirió por capilaridad durante 16 horas a una membrana de nylon
(Schleicher & Schuell); seguidamente, el RNA se fijó a la membrana por radiación UV en
un horno Stratalinker (Stratagene).
La membrana se hibridó a 42ºC con la solución de prehibridación (50% de
formamida, 1X Denhardt, 1% de SDS, 5X SSC y 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón)
durante 2 horas. Posteriormente se incubó unas 16 horas con la solución de prehibridación
pero conteniendo además 5% de sulfato de dextrano y 1,5 x 106 cpm/ml de la sonda
marcada con [32P]dCTP. La membrana se lavó con 1X SSC y 0,5% de SDS durante 20
minutos a temperatura ambiente seguido de tres lavados con 0,2 X SSC y 0,5% de SDS de
15 minutos a 68ºC .
La sonda pCIneo-cTH (apartado 15.1) se utilizó para la detección del mRNA de
cTH, así como el de cTH-INS1.
Las mismas membranas se sometieron a una segunda hibridación con una sonda de
la GAPDH, o del 18S rRNA que permite normalizar la carga relativa. Previamente, se
realizó la limpieza de la membrana de la hibridación anterior con 0,1X SSPE (15 mM NaCl,
1 mM NaH2PO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) y 0.5% de SDS, calentado hasta ebullición (2
lavados de 15 minutos).
La intensidad de las bandas se midió por exposición en pantalla Fuji y lectura con un
aparato Fuji Film FLA 3000, para su posterior cuantificación con el programa Image-Gauge
(Fuji).
18.- Extracción protéica y Western Blot.
Para la extracción de proteína, las células se lisaron en 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5,
300 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, 1% de Triton X-100 y un cóctel de inhibidores de
proteasas mini EDTA free (Roche). Los homogeneizados se mantuvieron 15 minutos en
agitación a 4ºC y se clarificaron por centrifugación.
Para la inmunodetección en membrana (Western Blot), el contenido de proteína de
los sobrenadantes se midió con el Kit BCA protein assay (Pierce, Rockford, EEUU).
Generalmente, entre 20 y 80 μg de extracto proteico se fraccionó en un gel al 10% NuPage
(Invitrogen) y se transfirió a membranas de nitrocelulosa mediante un sistema de
transferencia húmeda (Biorad, CA, EEUU), utilizando métodos estándar. Las membranas se
bloquearon con 3% BSA en PBST (PBS y 0.05% Tween 20) durante 1 hora a temperatura
ambiente.
52
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la detección de la TH se utilizaron dos anticuerpos (ambos de Chemicon), uno
de conejo, y otro de ratón, evitando de esta forma reacciones cruzadas. La membrana se
incubó con anticuerpo anti-TH 1:5000 durante 16 horas a 4ºC, seguido de una incubación
con anticuerpo anti-IgG de ratón o conejo acoplado a peroxidasa (Sigma) 1:10000 durante 1
hora. Para la detección del epítopo V5, la membrana se incubó con un anticuerpo anti V5
1:5000 (Invitrogen) durante 16 horas a 4ºC, seguido de una incubación con anticuerpo anti
IgG de ratón acoplado a peroxidasa (Sigma), 1:10000 durante 1 hora.
Los anticuerpos se prepararon en 1% BSA en 0,1% PBST y los lavados entre
anticuerpos se realizaron con PBST. Finalmente se reveló la señal con el sistema
SuperSignal (Pierce) exponiendo la membrana a películas X-Omat (Kodak, NY, EEUU).
Para normalizar la carga relativa, las mismas membranas se volvieron a hibridar con
anticuerpo anti-β-tubulina de ratón 1:10000 (Sigma), o anti-actina de cabra 1:1000 (Santa
Cruz Biotechnology, CA, EEUU). Para ello, se realizó previamente una limpieza de la
membrana con una solución de 0,1% de rojo Ponceau S en 5% de ácido acético durante 30
minutos.
Las bandas específicas se cuantificaron en un densitómetro (Biorad) con la ayuda
del programa Quantity One.
19.- Medida de catecolaminas por HPLC.
Estos experimentos se realizaron en colaboración con la Dra. Ana Isabel Valenciano,
de la Facultad de Biología de la Universidad Complutense de Madrid.
Las muestras se lisaron con 0,3 N HClO4, 0,4 M bisulfito sódico y 0,4 mM EDTA.
Como estándar interno, la solución llevaba 3,4-dihidroxibenzilamina (DHBA) (100
pmol/ml). Las muestras se sonicaron y centrifugaron a 15000 xg durante 5 minutos a 4ºC. La
L-DOPA y dopamina se cuantificaron a partir de un volumen de 20 μl, obtenidos del
sobrenadante, mediante HPLC según lo descrito en De Pedro y colaboradores (1997). A
dicho método de cuantificación se le introdujeron ciertas modificaciones: la fase móvil
estaba formada por 10 mM ácido fosfórico, 0,1 mM EDTA, 0,4 M octanosulfonato de sodio
y 3% acetonitrilo (pH 3,1). El potencial del electrodo analítico fue de 200 mV. Las proteínas
insolubles en HClO4, se resuspendieron en 0,5 N NaOH, y se cuantificaron mediante el
Método de Lowry.
.
53
MATERIALES Y MÉTODOS
20.-Inclusión y secciones en parafina.
Los embriones de pollo se extrajeron del huevo con aritos de papel (ver apartado 2)
en PBS frío. Se fijaron en 4% PFA en PBS-DEPC durante 16 horas a 4ºC.
Los embriones de ratón se extrajeron de las deciduas en PBS frío y se fijaron en 4%
PFA en PBS-DEPC durante al menos 16 horas a 4ºC. El tiempo de fijación se aumentó para
embriones de estadios más avanzados, llegando a ser de 3 días en el caso de los E15,5. El
estadio embrionario se determinó estableciendo como día 0,5 el día en el que se detectó el
tapón en las madres. Éstas se sacrificaron por dislocación cervical.
Los embriones de pollo y ratón se deshidrataron tras la fijación en etanoles al 50%,
70%, 90% y 100% a temperatura ambiente. Se incubaron secuencialmente en 50% etanol/
50% Histoclear (National Diagnostics, Atlanta GA, EEUU) a temperatura ambiente, seguido
de 100% Histoclear a temperatura ambiente (2 veces). Se pasaron a 50% Histoclear/50%
parafina (Paraplast Plus embedding media, Sigma) a 58-60ºC, y finalmente 100% parafina.
Se realizaron varios cambios de 100% parafina a 58-60ºC. El tiempo de cada uno de estos
pases fue dependiente del estadio embrionario (deshidrataciones: pollo 5 minutos; ratón
E8,5-30 minutos, E11,5-1 hora, E13,5-2 horas; 100% Histoclear: pollo 3-5 minutos; ratón
E8,5-10 minutos, E11,5 y E13,5-20 minutos; 50% Histoclear/50% parafina: pollo 5 minutos;
ratón E8,5-15 minutos, E11,5-20 minutos, E13,5-30 minutos; parafina: pollo 5-10 minutos;
ratón E8,5-20 minutos, E11,5-40 minutos, E13,5-1 hora).
Los embriones incluidos en parafina se cortaron en secciones de 8 µm en un
microtomo (Leica, Alemania). Las secciones se dejaron secar durante 16 horas a 37ºC.
21.-Hibridación in situ.
Las hibridaciones in situ en embrión de pollo se realizaron en colaboración con la
Dra. Carmen López Sánchez de la Universidad de Extremadura.
La hibridación in situ para pollo y ratón se realizó conforme a lo especificado en
Nieto y colaboradores (1996).
21.1.-Síntesis de ribosondas.
Se digirieron 10 μg del plásmido con 100 unidades de la enzima apropiada, durante 2
horas, a la temperatura a la cual es activa dicha enzima. Transcurrido este tiempo, se
comprobó que todo el vector presente en la muestra estaba linearizado mediante
electroforesis de 200-300 ng del DNA de la digestión y 200-300 ng del plásmido no
digerido, en un gel de agarosa al 1% en Tris-Borato-EDTA (TBE). El plásmido
54
MATERIALES Y MÉTODOS
completamente linearizado se extrajo con un volumen de fenol/cloroformo/isoamil alcohol
(25:24:1) seguido de una segunda extracción con un volumen de cloroformo/isoamil alcohol
(24:1). El plásmido linearizado, se precipitó con 2,5 volúmenes de etanol absoluto y 0,1
volúmenes de 3 M acetato sódico pH 5,2 durante al menos 1 hora a - 20ºC. El precipitado
obtenido se lavó con un volumen de 70% etanol. Se dejó secar a temperatura ambiente
durante 5 minutos, y se resuspendió en 50 μl de agua libre de nucleasas.
Para la síntesis de la ribosonda se incubó 1 μg de plásmido linearizado con una
mezcla que contenía: 2 μl de 10X tampón de transcripción, 2 μl de 0,1 M ditiotreitol (DTT),
2 μl de 10X nucleótidos marcados con digoxigenina, 0,5 μl de inhibidor de RNasas, 1 μl de
RNA polimerasa adecuada (típicamente SP6, T7 ó T3) (todo de Roche) y hasta completar un
volumen de 20 μl con agua libre de RNasas, a 37ºC durante 2 horas. La ribosonda sintetizada
se precipitó con 16,4 μl de agua libre de nucleasas, 1,6 μl de 0,5 M EDTA, 2 μl de 8 M
cloruro de litio y 120 μl de etanol absoluto durante 2 horas a -20ºC. Se centrifugó
transcurrido este tiempo a 12000 r.p.m. durante 20 minutos a 4ºC. El precipitado obtenido se
lavó con 70% etanol y se centrifugó a 9000 r.p.m. durante 10 minutos 4ºC. Se resuspendió
en 100 μl de 10 mM EDTA. Para comprobar la calidad de las sondas generadas, éstas se
fraccionaron en geles de agarosa 0,8% (p/v) en TBE.
21.2.-Hibridación y revelado.
Los embriones completos se fijaron en 4% PFA en PBS, previamente tratado
con DEPC y esterilizado, durante al menos 16 horas a 4oC. Se lavaron con PBTx (PBS-
DEPC, 0,1% Tritón X-100) y a continuación se deshidrataron mediante incubaciones
de 10 minutos en soluciones seriadas de metanol en PBTx a concentraciones crecientes
(25%, 50%, 75%) y finalmente dos incubaciones de 10 minutos con 100% metanol. La
rehidratación de las muestras se realizó con las mismas soluciones de metanol en
sentido inverso y se lavaron dos veces con PBTx, (5 minutos cada vez).
Para eliminar la actividad peroxidasa endógena de las muestras, éstas se trataron
con 1% H2O2 durante 5-30 minutos dependiendo del estadio embrionario (por ejemplo,
15 minutos para St10) a temperatura ambiente y en oscuridad, lavándolas
posteriormente con PBTx durante 5 minutos.
Para mejorar su permeabilización, las muestras se trataron con 10 μg/ml de
proteinasa K (Promega) durante un tiempo variable dependiendo del estadio (pollo: 4
minutos para St4-7; 7 minutos St7-10; 9 minutos St11-13. Ratón: 10 minutos E9,5; 15
minutos E10,5; 30 minutos E13,5) a temperatura ambiente y se lavaron con PBTx
55
MATERIALES Y MÉTODOS
durante 5 minutos. Posteriormente se refijaron los embriones con 4% PFA en PBTx
durante 20 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con PBTx 5 minutos.
Los embriones se preincubaron con solución de hibridación durante 5 minutos a
57-60oC. Dicha solución estaba compuesta de una mezcla de 50% de formamida (v/v),
5X SSC, 2% de Boehringer Blocking Powder (p/v) (Roche), 0,1% de Tritón X-100
(v/v), 50 μg/ml de heparina (Sigma), 1 mg/ml de t-RNA (Sigma), 5 mM EDTA, 0,1%
de CHAPS (p/v) (Calbiochem, Alemania) en agua DEPC. A los 5 minutos se reemplazó
con solución de hibridación fresca, y se continuó la preincubación durante 4 a 16 horas
a la misma temperatura. Las ribosondas se desnaturalizaron en solución de hibridación a
70oC durante 5 minutos y se enfriaron en hielo. Transcurrido el tiempo de
preincubación, los embriones se incubaron en el tampón de hibridación conteniendo
1μg/ml de la ribosonda durante al menos 16 horas a 57-60oC. Los embriones se lavaron
5 veces a la misma temperatura de hibridación, con 2X SSC, 0,1% CHAPS (p/v)
durante 5 minutos las dos primeras y 20 minutos las 3 restantes. Posteriormente se
lavaron 3 veces con 0,2X SSC, 0,1% CHAPS, durante 20 minutos cada vez seguidos de
tres lavados con 0,1% KTBT (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM KCl,
0,1% Tritón X-100) durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente.
Finalmente se procedió al revelado de la hibridación in situ: los embriones se
bloquearon con 15% FBS (v/v), 0,7% de Boehringer Blocking Powder en 0,1% KTBT
durante 2-3 horas a 4oC. Posteriormente se incubaron en anticuerpo de oveja anti-
digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina 1/1000 (Roche) en solución de bloqueo
fresca, durante al menos 16 horas a 4oC. Tras la incubación se lavaron los embriones
con 0,3% KTBT (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,3% Tritón
X-100) durante al menos 3 horas cambiando la solución cada 30 minutos y un último
lavado durante 16 horas a 4ºC. Posteriormente se realizaron 3 lavados de 15 minutos
cada uno con NTMT (100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1%
Tween20 (Biorad), 1 mM levamisol (Sigma)). Los embriones se incubaron en
oscuridad con 3 μl de NBT (del ingles Nitro Blue Tetrazolium) y 2,3 μl de BCIP (5-
bromo-4-cloro-3-indosil-fosfato) (ambos de Roche) en 1 ml de NTMT. Cuando el
desarrollo del color azul típico del NBT/BCIP fue óptimo, la reacción se paró lavando
los embriones con 0,3% KTBT. Se transparentaron con 70% glicerol, y se visualizaron
y fotografiaron en un microscopio Leica bajo la luz visible utilizando una placa de 2%
agarosa como soporte.
56
MATERIALES Y MÉTODOS
22.-Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia.
22.1.-Inmunohistoquímica en embrión completo de pollo.
Los embriones completos se fijaron durante 16 horas a 4ºC, con 4% PFA en
PBS. La inmunohistoquímica se realizó como se describe en Patel y colaboradores
(1989).
Los embriones fijados se lavaron con PBS 2 veces, 5 minutos cada vez, con
PBTx (PBS, 0,2% BSA, 0,1% Tritón X-100), 2 veces durante 5 minutos, y otras 3 veces
30 minutos cada vez. Los embriones se bloquearon en PBTx con 5% NGS (del inglés
Normal Goat Serum) (Sigma) (PBT+N) durante 2 horas. Se retiró esta solución y se
añadió anticuerpo de conejo anti-TH 1/50 (Chemicon) ó anticuerpo de ratón anti MF20
1/200 (Hybridoma Bank Developmental Studies, Iowa, EEUU) (Sato y Yost, 2003) en
PBT+N fresco. Se incubó durante 16 horas a 4ºC. Se lavaron en PBTx 3 veces, 5
minutos seguidas de 4 veces, 30 minutos cada vez. Se incubaron en PBT+N durante 30
minutos. Se añadió el anticuerpo anti-conejo (para TH) o anti-ratón (para MF20)
conjugado con peroxidasa en PBT+N fresco. Se incubaron durante 16 horas a 4ºC. Se
lavaron en PBTx 3 veces, 5 minutos cada vez, seguido de 4 lavados de 30 minutos cada
uno. Para el revelado, se incubaron los embriones en la Solución A (33%
diaminobenzidina (DAB), 66% PBTx) durante 10 minutos. Transcurrido este tiempo, se
añadió una mezcla de 1/75 Solución B (0,3% H2O2 en H2O destilada) en Solución A
fresca. Cuando el color marrón característico se hizo patente, la reacción se paró con
PBS. Se visualizaron y fotografiaron en un microscopio Leica bajo la luz visible.
22.2.-Inmunohistoquímica en secciones.
Los portas conteniendo secciones de embriones en parafina (apartado 20) se
introdujeron en Histoclear 2 veces, durante 10 minutos cada vez. Cuando la parafina se
eliminó por completo de las secciones, estas se rehidrataron en 100%, 90%, 70% y 50%
etanol durante 2 minutos en cada uno de los alcoholes, salvo en el caso del 100% etanol,
que se realizaron dos cambios de 2 minutos cada uno. Se lavaron con PBS durante 5
minutos. Las peroxidasas endógenas se inactivaron con 3% H2O2 durante 5 minutos. Se
aclararon con H2O destilada y se lavaron con TBS-Tx (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150
mM NaCl, 0,5% Triton X-100 en H2O destilada), 3 veces durante 5 minutos. Se
bloquearon con 10% FCS (del inglés Fetal Calf Serum) en TBS-Tx durante 30 minutos.
Los portas se colocaron en una cámara húmeda y se incubaron con 90-100 μl de
57
MATERIALES Y MÉTODOS
anticuerpo de ratón anti-TH 1/50 (Sigma) en TBS-Tx con 2% FCS. Cada porta se cubrió
con Parafilm® para evitar la evaporación de la solución añadida y se incubaron durante
16 horas a 4ºC. Se lavaron con TBS-Tx, 3 veces durante 5 minutos. Se incubaron con
90-100 μl de anticuerpo biotinado de conejo contra ratón 1/100 (Dako), durante 1 hora a
temperatura ambiente. Los portas se cubrieron de nuevo con Parafilm® para evitar la
evaporación.
El revelado se realizó utilizando el Vectastain ABC Kit. Se preparó el complejo
AB del Vectastain ABC Kit, 30 minutos antes de utilizarlo, mezclando en oscuridad 250
μl de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 4,75 ml de H2O, una gota del reactivo A y una gota del
reactivo B.
Tras la incubación con el anticuerpo secundario, los portas se lavaron con TBS-
Tx, 3 veces durante 5 minutos cada vez. Se añadieron 100 μl del complejo AB sobre las
secciones y se incubaron durante 30 minutos. En este caso los portas no se cubrieron
con Parafilm®. Se lavaron con TBS-Tx, 3 veces durante 5 minutos cada vez y se reveló
con DAB (Sigma) durante 30 minutos en oscuridad o hasta que el color marrón
característico era patente, a temperatura ambiente.
Para contrastar la zona marcada con el resto de los tejidos, las secciones se
tiñeron con 0,5% de verde de metilo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se
lavaron con H2O 3 veces (10 inmersiones; 10 inmersiones; 30 segundos) y con butanol
3 veces (5 inmersiones; 5 inmersiones; 20 segundos). Se introdujeron en Histoclear 2
veces, 10 minutos cada vez y se montaron con Histomount™ (National Diagnostics).
Se visualizaron y fotografiaron en un microscopio Leica bajo la luz visible.
22.3.-Inmunohistoquímica tras hibridación in situ.
En los casos en los que se realizó tras hibridación in situ, se siguió el protocolo
de López-Sánchez y colaboradores (2004).
22.4.-Inmunofluorescencia en secciones de embrión de pollo.
Las secciones se desparafinaron con Histoclear 2 veces durante 10 minutos cada
vez y se rehidrataron como se reseña en el apartado 22.2.
Las secciones se lavaron con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez y con PBTx
(PBS, 0,5% Triton X-100) durante 10 minutos. Se bloquearon con 10% NGS en PBS
durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo policlonal de
conejo anti-TH 1/50 (Chemicon) en solución de bloqueo durante 16 horas a 4ºC. Se
58
MATERIALES Y MÉTODOS
lavaron con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez. Se bloquearon de nuevo durante 10
minutos en solución de bloqueo y se incubaron con anticuerpo de cabra contra conejo
1/200 marcado con Alexa 488 (Sigma) en solución de bloqueo fresca durante 1 hora a
temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de incubación se lavaron con PBS 3
veces, 10 minutos cada vez y se montaron con 4% DABCO (p/v) y 70% glicerol (v/v),
al cual se le añadió 1µg/ml de DAPI. Las fotos se tomaron en un microscopio confocal
de Leica.
22.5.-Inmunofluorescencia en cuerpos embrionarios (CE).
Los CE formados a partir de las células troncales E14 se plaquearon el día 5
(Fig. 8A) sobre cubreobjetos circulares previamente tratados con 0,1% gelatina en PBS.
Se fijaron con 4% PFA en PBS a diferentes tiempos durante 10 minutos a 4ºC.
Los CE se lavaron con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez y con PBTx (PBS, 0,5%
Triton X-100) durante 10 minutos. Se bloquearon con 10% FCS en PBS y se incubaron
con anticuerpo de ratón anti-TH 1/100 (Sigma) en solución de bloqueo durante 16 horas
a 4ºC. Se lavaron con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez y se bloquearon de nuevo
durante 10 minutos en solución de bloqueo. Los CE se incubaron con anticuerpo de
conejo contra ratón 1/50 marcado con FITC (del inglés Fluorescein Isothiocyanate)
(Dako) y 1/40 de faloidina marcada con rodamina (Invitrogen) en solución de bloqueo
fresca durante 2 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de incubación se
lavaron con PBS 3 veces, 10 minutos cada vez y se montaron con Histomount™. Las
fotos se tomaron en un microscopio confocal de Leica.
23.-Tinción con hematoxilina-eosina.
Se desparafinaron las secciones con Histoclear 2 veces durante 10 minutos cada
vez. Se rehidrataron con soluciones seriadas de 100%, 90% ,70%, y 50% etanol durante
10 minutos en cada una salvo en 100%, que se realizaron 2 veces durante 10 minutos
cada vez. Se introdujeron en 0,5% hematoxilina (Sigma) durante 10 minutos. Se lavaron
bajo agua corriente para eliminar los restos de hematoxilina, hasta que se identificó un
color violeta característico. En los casos en que no apareció, quedándose las secciones
con un color oscuro, los portas se introdujeron en alcohol ácido durante 5 minutos. Se
lavaron de nuevo bajo agua corriente. Se introdujeron en 1% eosina (Sigma) durante 5
minutos. Se deshidrataron en soluciones seriadas de etanoles 50%, 70%, 90% y 100%
durante 10 minutos en cada una salvo en el caso del 100% que se realizaron 2 veces, 10
59
MATERIALES Y MÉTODOS
minutos cada vez. Se introdujeron de nuevo en Histoclear 2 veces durante 10 minutos
cada vez. Los portas se montaron con Histomount™. Se visualizaron y fotografiaron en
un microscopio Leica bajo la luz visible.
24.-Análisis estadístico de los datos.
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS (del inglés Statistical
Package for the Social Sciences) (Chicago, EEUU).
25.-Genotipado de los ratones THKO.
En 1995, el grupo del Dr. R.D. Palmiter generó dos líneas de ratones THKO (del
inglés Tyrosine Hydroxylase Knock-Out) que denominaron Th4 y Th5 y se diferenciaban en
la región del gen de mTH (del inglés mouse Tyrosine Hydroxylase) que había sido
reemplazado por el casete Neo (Fig. 9). En ambas líneas, los ratones nulos (THKO), son
letales embrionarios entre E11,5 y E15,5 (Zhou y cols., 1995).
El análisis histológico de los mismos mostraba acumulación de sangre en los grandes
vasos sanguíneos, en el hígado y alteraciones estructurales del corazón. En E13,5 los ratones
nulos presentaban dilatación y adelgazamiento auricular, así como desorganización y
heterogeneidad de tamaño de los cardiomiocitos en algunas regiones ventriculares (Zhou y
cols., 1995).
Nuestro grupo solicitó al Dr. Palmiter el ratón THKO que amablemente nos cedió.
Recibimos 8 ratones (2 machos y 4 hembras), que según indicaciones del Dr. Palmiter
correspondían a la línea Th4.
Para el genotipado de los mismos se utilizaron los cebadores P19, P20, P12 y P13.
Los cebadores P19 y P20 amplifican una región de 185 pb del intrón 1 de la mTH (ausente
en el alelo nulo). Los cebadores P12 y P13 amplifican una región de 310 pb del casete Neo.
De esta forma, en los ratones heterocigotos aparecerían dos bandas, de 310 y 185 pb, en los
ratones silvestres una banda de 185 pb, y en los mTHKO una banda de 310 pb (Fig. 9A).
Después de analizar aproximadamente 200 embriones de varias camadas de cruces
heterocigotos, de estadios embrionarios previos a E11,5 (E6,5, E7,5, E8,5), no se detectó
ningún embrión nulo para mTH, aunque sí aparecían silvestres y heterocigotos (Fig. 9B).
60
MATERIALES Y MÉTODOS
A
P21+P22= 330 pb
P21+P23= 280 pb
-Silvestre: 330 pb
-mTH+/-: 330 pb + 280 pb
-mTHKO: 280 pb
Alelo mTH nulo (línea Th4)
2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
P12 P13
Pgk NeoR
10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
Pgk NeoR
c
1 2P21 P23
Alelo mTH nulo (línea Th5)
Pgk NeoR
Alelo mTH silvestre
1 2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeIP21
ApaI
P22
P19 P20
P19+P20= 185 pb
P12+P13= 310 pb
-Silvestre: 185pb
-mTH+/-: 310 pb + 185 pb
-mTHKO: 310 pb
GENOTIPADO Th4 GENOTIPADO Th5
C
H 2O+/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/-+/+ +/+
x+/-+/-
B
Progenito
r 1*
Progenito
r 2*
Progenito
r 3*
Progenito
r 4
Progenito
r 5
Progenito
r 6
Progenito
r 7
Progenito
r 8
A
P21+P22= 330 pb
P21+P23= 280 pb
-Silvestre: 330 pb
-mTH+/-: 330 pb + 280 pb
-mTHKO: 280 pb
Alelo mTH nulo (línea Th4)
2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
P12 P13
Pgk NeoR
10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
Pgk NeoR
c
1 2P21 P23
Alelo mTH nulo (línea Th5)
Pgk NeoR
Alelo mTH silvestre
1 2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeIP21
ApaI
P22
P19 P20
P19+P20= 185 pb
P12+P13= 310 pb
-Silvestre: 185pb
-mTH+/-: 310 pb + 185 pb
-mTHKO: 310 pb
GENOTIPADO Th4 GENOTIPADO Th5
A
P21+P22= 330 pb
P21+P23= 280 pb
-Silvestre: 330 pb
-mTH+/-: 330 pb + 280 pb
-mTHKO: 280 pb
Alelo mTH nulo (línea Th4)
2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
P12 P13
Pgk NeoR
Alelo mTH nulo (línea Th4)
2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
P12 P13
Pgk NeoR
10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
Pgk NeoR
c
1 2P21 P23
Alelo mTH nulo (línea Th5)
Pgk NeoR
10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeI
Pgk NeoR
c
1 2P21 P23
Alelo mTH nulo (línea Th5)
Pgk NeoR
Alelo mTH silvestre
1 2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeIP21
ApaI
P22
P19 P20
Alelo mTH silvestre
1 2 3 10
XbaI SstII
promotor11 12
SpeIP21
ApaI
P22
P19 P20
P19+P20= 185 pb
P12+P13= 310 pb
-Silvestre: 185pb
-mTH+/-: 310 pb + 185 pb
-mTHKO: 310 pb
GENOTIPADO Th4 GENOTIPADO Th5
C
H 2O+/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/-+/+ +/+
x+/-+/-
B
Progenito
r 1*
Progenito
r 2*
Progenito
r 3*
Progenito
r 4
Progenito
r 5
Progenito
r 6
Progenito
r 7
Progenito
r 8
C
H 2O+/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/-+/+ +/+H 2O+/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/-+/+ +/+
x+/-+/-
x+/-+/- +/-+/-
B
Progenito
r 1*
Progenito
r 2*
Progenito
r 3*
Progenito
r 4
Progenito
r 5
Progenito
r 6
Progenito
r 7
Progenito
r 8
Progenito
r 1*
Progenito
r 2*
Progenito
r 3*
Progenito
r 4
Progenito
r 5
Progenito
r 6
Progenito
r 7
Progenito
r 8
Figura 9.-Estategia para el genotipado de ratones Th4 y Th5. (A) Esquema en el que se representan el extremo 5´ de los alelos silvestre y alelos nulos de mTH de las líneas de ratones Th4 y Th5. Se muestran los cebadores utilizados para el genotipado de ambas líneas por PCR, así como los tamaños de los fragmentos esperados. (B) Genotipado de los ratones, siguiendo las pautas indicadas en A para la línea Th4. Se muestra en el panel inferior el resultado del genotipado de una camada de embriones de E10,5. (C) El genotipado de los 8 ratones progenitores por PCR, con los cebadores descritos en A para la línea Th5, muestra que solo 3 de los 8 podrían ser ratones Th5 (*). Los dos flechas indican los alelos silvestre (flecha superior) y alelo interrumpido (flecha inferior) de mTH.
61
MATERIALES Y MÉTODOS
Por tanto, descartamos la posible contaminación del DNA genómico obtenido de los
sacos embrionarios, con DNA genómico de la madre.
Ante estos resultados el Dr. Palmiter, nos informó de que probablemente nos había
enviado la línea Th5, en lugar de la Th4 (Zhou y cols., 1995).
Para el genotipado de esta línea se utilizaron los cebadores P21, P22 y P23. La
combinación de los tres cebadores en la misma reacción de amplificación nos permite
distinguir los tres genotipos. Así, los cebadores P21 y P22 amplifican una región de 330 pb
que incluye el exón 2 completo de la mTH. Los cebadores P21 y P23 amplifican el alelo
nulo, al hibridar este último con el casete Neo, obteniéndose un fragmento de 280 pb (Fig.
9A). Con este nuevo sistema de genotipado, si el casete Neo no estaba insertado en la región
de la mTH mencionado más arriba, aparecería una única banda correspondiente al alelo
silvestre. El análisis de los 8 ratones progenitores enviados por el Dr. Palmiter reveló que
sólo 3 de los 8 eran realmente ratones de la línea Th5 (Fig. 9C).
Para confirmar este resultado se realizó un análisis por Southern Blot. A partir de
cada una de las muestras de DNA genómico de los progenitores se realizaron dos
digestiones: una con la enzima ApaI, y otra con SpeI. Los DNAs digeridos con ApaI se
hibridaron con una sonda contra el casete Neo. El tamaño de banda esperado es de 3379 pb
si el casete Neo se encontrase en el alelo mTH, y los ratones perteneciesen a la cepa Th5.
Como se muestra en la Fig. 10A, tan solo 3 de los 8 ratones progenitores pertenecían a dicha
cepa. Como control se utilizaron dos ratones silvestres (carecen de casete Neo), que no
muestran banda tras la hibridación con la sonda Neo (Fig. 10A). Los otros 5 ratones
progenitores presentan una banda para Neo, pero no está localizada en el lugar indicado para
la línea Th5.
Los DNAs digeridos con SpeI se hibridaron con una sonda de DNA genómico de
mTH, que permitiría diferenciar el alelo silvestre de 8,4 Kb del alelo nulo de 6,8 Kb. Este
segundo Southern Blot terminó de confirmar que tan solo 3 de los 8 ratones progenitores
eran heterocigotos de la línea Th5 (Fig. 10B). Por tanto los otros 5 ratones, a pesar de
contener el casete Neo, pertenecerían a ratones transgénicos con otro tipo de mutación o
inserción génica.
62
MATERIALES Y MÉTODOS
A
3 Kb
Silvestre
Silvestre
Progenitor 1
*
Enzima: ApaI
Sonda: Neo
Tamaño esperado si el casete Neo estuviese en el alelo mTH: 3379 pb
GENOTIPADO DE PROGENITORES POR SOUTHERN BLOT.
Progenitor 2
*
Progenitor 3
*
Progenitor 4
Progenitor 5
Progenitor 6
Progenitor 7
Progenitor 8
Enzima: SpeI
Sonda: DNA genómico de mTH
Tamaños esperados:
+Alelo silvestre ˜ 8,4 kb
+Alelo nulo ˜ 6,8 kb
6 kb
8 kb
B
Silvestre
Silvestre
Progenitor 1
*
Progenitor 2
*
Progenitor 3
*
Progenitor 4
Progenitor 5
Progenitor 6
Progenitor 7
Progenitor 8
A
3 Kb
Silvestre
Silvestre
Progenitor 1
*
Enzima: ApaI
Sonda: Neo
Tamaño esperado si el casete Neo estuviese en el alelo mTH: 3379 pb
GENOTIPADO DE PROGENITORES POR SOUTHERN BLOT.
Progenitor 2
*
Progenitor 3
*
Progenitor 4
Progenitor 5
Progenitor 6
Progenitor 7
Progenitor 8
A
3 Kb
Silvestre
Silvestre
Progenitor 1
*
Enzima: ApaI
Sonda: Neo
Tamaño esperado si el casete Neo estuviese en el alelo mTH: 3379 pb
GENOTIPADO DE PROGENITORES POR SOUTHERN BLOT.
Progenitor 2
*
Progenitor 3
*
Progenitor 4
Progenitor 5
Progenitor 6
Progenitor 7
Progenitor 8
Enzima: SpeI
Sonda: DNA genómico de mTH
Tamaños esperados:
+Alelo silvestre ˜ 8,4 kb
+Alelo nulo ˜ 6,8 kb
6 kb
8 kb
B
Silvestre
Silvestre
Progenitor 1
*
Progenitor 2
*
Progenitor 3
*
Progenitor 4
Progenitor 5
Progenitor 6
Progenitor 7
Progenitor 8
Enzima: SpeI
Sonda: DNA genómico de mTH
Tamaños esperados:
+Alelo silvestre ˜ 8,4 kb
+Alelo nulo ˜ 6,8 kb
6 kb
8 kb
B
Silvestre
Silvestre
Progenitor 1
*
Progenitor 2
*
Progenitor 3
*
Progenitor 4
Progenitor 5
Progenitor 6
Progenitor 7
Progenitor 8
Figura 10.-Genotipado de ratones progenitores por Southern Blot. (A) Southern Blot realizado tras digerir el DNA genómico de los 8 ratones progenitores con la enzima de restricción ApaI, utilizando una sonda que hibrida con el casete Neo. (B) Southern Blot realizado tras digerir el DNA genómico de los 8 ratones progenitores con la enzima de restricción SpeI, utilizando una sonda de DNA genómico que hibrida con el alelo mTH. En ambos Southern Blot se han introducido dos muestras de ratones silvestres (en los extremos de la foto) como control negativo.
63
IV.-RESULTADOS
65
RESULTADOS
En vertebrados se conoce muy bien el papel postnatal de la insulina como
hormona anabólica, esencial para el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. Su
biosíntesis en las células beta del páncreas ha sido considerada un modelo de expresión
tejido-específica. Sin embargo, estudios en invertebrados y en estadios embrionarios en
vertebrados han mostrado que la insulina y su precursor la proinsulina, tienen funciones
diferentes a su papel metabólico, como la regulación del tamaño celular, el control de
life span y la supervivencia celular (Hernández-Sánchez y cols., 2006 (referencia 89)).
Paralelamente a estas nuevas funciones, se han comenzado a describir distintos
mecanismos de regulación génica a los descritos para la insulina pancreática.
Recientemente, nuestro grupo ha descrito la presencia de transcritos embrionarios de
insulina alternativos al transcrito pancreático (Hernández-Sánchez y cols., 2003;
Mansilla y cols., 2005) que difieren de éste en su actividad traduccional. Entre los
mRNA de insulina, que encontraron inicialmente las Dras. Catalina Hernández y Alicia
Mansilla, en el embrión de pollo prepancreático había un transcrito quimera formado
por la fusión del mRNA de la tirosina hidroxilasa y el de la insulina; a este transcrito le
llamaron cTH-INS1. Cuando yo entré a formar parte del laboratorio, me incorporé al
proyecto cuyo objetivo era la caracterización del transcrito quimera cTH-INS1.
1.-Identificación de transcritos quiméricos de tirosina hidroxilasa e insulina: cTH-
INS1 y cTH-INS2.
En el genoma de pollo los genes de la tirosina hidroxilasa y de la insulina se
encuentran en tándem en el cromosoma 5, situándose el gen de la TH 5´ respecto al gen
de la insulina. Esta organización sinténica se mantiene desde invertebrados
(Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster) a vertebrados (pollo, ratón,
humano). En pollo, el gen de la TH está formado por 13 exones codificantes, y el gen de
la insulina por 3 exones, de los cuales son codificantes el 2 y el 3 (Fig. 11A). El
transcrito cTH-INS1 comprende los 12 primeros exones y la parte 5’ del exón 13,
excluyendo el codón de terminación de la traducción, de la cTH fusionados a los exones
2 y 3 de la insulina (Fig. 11A). El exón 13 de la cTH contiene un sitio donador de
procesamiento interno que interacciona mediante una reacción de transesterificación
con el sitio aceptor de procesamiento del exón 2 de la insulina.
Durante el análisis de la expresión del transcrito cTH-INS1 mediante RT-PCR a
partir de RNA de embrión de pollo de St10, encontramos un segundo transcrito quimera.
67
RESULTADOS
AAAA
TIROSINA HIDROXILASA (gen)
INSULINA (gen)
TIROSINA HIDROXILASA (gen)
INSULINA (gen)
TIROSINA HIDROXILASA (gen)
INSULINA (gen)
TIROSINA HIDROXILASA (gen)
INSULINA (gen)
4652 pb
C
396220154
pbP16+P3
P16+P17
cTH-INS1cTH-INS2
…TGGCAG
Figura 11.-Formación y caracterización de los transcritos quimera cTH-INS1 y cTH-INS2. (A) Representación esquemática de los genes de la tirosina hidroxilasa e insulina de pollo, situados en el cromosoma 5. Los exones se representan como rectángulos (azules para cTH y verdes para insulina). Las regiones 5´ y 3´ no traducidas de la cTH y de la insulina se muestran con rectángulos con rayas azules. Los intrones, así como la región intergénica aparecen como líneas horizontales entre los exones. Bajo el esquema de los genes de cTH e insulina aparecen los transcritos cTH-INS1 y cTH-INS2. Ambos contienen los 12 primeros exones completos de cTH así como las primeras 109 pb del extremo 5´ del exón 13 y difieren en la región de la insulina contenida en sus secuencias. cTH-INS1 contiene los exones 2 y 3 de la insulina, y cTH-INS2, únicamente el exón 3. Se indican los cebadores utilizados en la RT-PCR, al igual que la longitud de los fragmentos de amplificación obtenidos. (B) En el exón 13 de cTH se encuentra el sitio donador de procesamiento (en marrón) para la formación de los transcritos quimera. El sitio aceptor de procesamiento se encuentra en el exón 2, en el caso de cTH-INS1, o en el exón 3, en el del cTH-INS2, de la insulina (en ambos casos se muestra en marrón). Bajo la secuencia de nucleótidos se muestra la secuencia de aa correspondiente. (C) RT-PCR de embrión de pollo de St10.
TGAGCAGTCCCTTGC…
…CTCTAG GCCTCCCCCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
TH de pollo (exón 13)
Insulina de pollo (exón 2)
Insulina de pollo(exón 3)E S
STOP
LSH
A S P S ScTH-INS1
cTH-INS2
B
V
1
114751 pb
16402 pb
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3
cTH-INS1 cTH-INS2P16 P3P17 P16 P3
395 pb206 pb 191 pb
2 3 4 5 6 7 8 91011 12 13 31 2 3 4 5 6 7 8 91011 12 131 2
Sitio donador de
procesamiento
Sitio aceptor de
procesamiento (1)
Sitio aceptor de
procesamiento (2)
4652 pb
C
396220154
pbP16+P3
P16+P17
cTH-INS1cTH-INS2
…TGGCAG GTCCCTTGC…
…CTCTAG GCCTCCCCCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
TGAGCA
TH de pollo (exón 13)
Insulina de pollo (exón 2)
Insulina de pollo(exón 3)E S
STOP
LSH
A S P S ScTH-INS1
cTH-INS2
B
V
1
114751 pb
16402 pb
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3
cTH-INS1 cTH-INS2P16 P3P17 P16 P3
395 pb206 pb 191 pb
2 3 4 5 6 7 8 91011 12 13 31 2 3 4 5 6 7 8 91011 12 131 2
Sitio donador de
procesamiento
Sitio aceptor de
procesamiento (1)
Sitio aceptor de
procesamiento (2)
C
396220154
pbP16+P3
P16+P17
cTH-INS1cTH-INS2
…TGGCAG GTCCCTTGC…
…CTCTAG GCCTCCCCCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
TGAGCA
TH de pollo (exón 13)
Insulina de pollo (exón 2)
Insulina de pollo(exón 3)E S
STOP
LSH
A S P S ScTH-INS1
cTH-INS2
B
V
1
C
396220154
pbP16+P3
P16+P17
cTH-INS1cTH-INS2
C
396220154
pbP16+P3
P16+P17
cTH-INS1cTH-INS2
396220154
pbP16+P3
P16+P17
396220154
pbP16+P3
P16+P17
cTH-INS1cTH-INS2
…TGGCAG GTCCCTTGC…
…CTCTAG GCCTCCCCCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
TGAGCA
TH de pollo (exón 13)
Insulina de pollo (exón 2)
Insulina de pollo(exón 3)E S
STOP
LSH
A S P S ScTH-INS1
cTH-INS2
B
V
…TGGCAG GTCCCTTGC…
…CTCTAG GCCTCCCCCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
TGAGCA
TH de pollo (exón 13)
Insulina de pollo (exón 2)
Insulina de pollo(exón 3)E S
STOP
LSH
A S P S ScTH-INS1
cTH-INS2
B
V
1
114751 pb
16402 pb
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3
cTH-INS1 cTH-INS2P16 P3P17 P16 P3
395 pb206 pb 191 pb
2 3 4 5 6 7 8 91011 12 13 31 2 3 4 5 6 7 8 91011 12 131 2
Sitio donador de
procesamiento
Sitio aceptor de
procesamiento (1)
Sitio aceptor de
procesamiento (2)
114751 pb
16402 pb
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3
Sitio donador de
procesamiento
Sitio aceptor de
procesamiento (1)
Sitio aceptor de
procesamiento (2)
cTH-INS1 cTH-INS2P16 P3P17 P16 P3
206 pb 191 pb
2 3 4 5 6 7 8 91011 12 13 31 2 3 4 5 6 7 8 91011 12 131 2
395 pb
68
RESULTADOS
Utilizando los cebadores P16, localizado en el exón 13 de cTH, y P3, localizado en el
exón 3 de la insulina (Fig. 11A), se amplificaron dos bandas. Cuando la amplificación
se realizaba con los cebadores P16 y P17, localizado este último en el exón 2 de la
insulina, aparecía una única banda (Fig. 11C). Tras la secuenciación de las bandas, se
comprobó que la de mayor tamaño (395 pb) correspondía al transcrito cTH-INS1,
siendo la de menor peso molecular (191 pb) una nueva forma quimérica que
denominamos cTH-INS2. En esta nueva quimera, el sitio donador interno del exón 13
de la cTH realiza la reacción de transesterificación con el aceptor del exon 3 de la
insulina, así la forma cTH-INS2 contiene la misma secuencia del mRNA de cTH que el
cTH-INS1, pero sólo el exón 3 de la insulina.
2.-Análisis del número de copias del gen cTH en el genoma de pollo.
Para discernir si las quimeras eran un producto de la trascripción de dos genes
independientes o eran producto de un gen quimérico no anotado en el genoma de pollo
(Hillier y cols., 2004), se realizó un estudio por Southern blot. DNA genómico de pollo se
digirió con tres enzimas de restricción (BamHI, EcoRI y HindIII) y se hibridó sucesivamente
con una sonda de DNA genómico y otra de cDNA de cTH (apartados 15.7 y 15.6,
respectivamente, de Materiales y Métodos).
El patrón de bandas que se obtuvo en ambas hibridaciones era equivalente y estaba
de acuerdo al tamaño esperado según la secuencia publicada del genoma de pollo (Hillier y
cols., 2004) (Fig. 12). De esta forma se confirmó la existencia de un único gen para cTH en
pollo, al igual que previamente se había descrito un único gen para la insulina (Perler y cols.,
1980), descartando así la existencia de un gen quimérico.
69
RESULTADOS
Tamaños esperados:
-Sonda de DNA genómico:
-BamHI: 3880 pb, 5012 pb; -EcoRI: 12020 pb; -HindIII: 7411 pb
-Sonda de cDNA:
-BamHI: 3880 pb; 5012 pb; -EcoRI: 5539 pb; 12020 pb; -HindIII: 7411 pb
EcoRIHindIII
12 Kb
5,5 Kb
3,8 Kb
7 Kb
5 Kb
BamHI
ASonda de DNA genómico
B
7 Kb5,5 Kb
5 Kb3,8 Kb
BamHIEcoRI
HindIII
12 Kb
Sonda de cDNA
Tamaños esperados:
-Sonda de DNA genómico:
-BamHI: 3880 pb, 5012 pb; -EcoRI: 12020 pb; -HindIII: 7411 pb
-Sonda de cDNA:
-BamHI: 3880 pb; 5012 pb; -EcoRI: 5539 pb; 12020 pb; -HindIII: 7411 pb
EcoRIHindIII
12 Kb
5,5 Kb
3,8 Kb
7 Kb
5 Kb
BamHI
ASonda de DNA genómico
Tamaños esperados:
-Sonda de DNA genómico:
-BamHI: 3880 pb, 5012 pb; -EcoRI: 12020 pb; -HindIII: 7411 pb
-Sonda de cDNA:
-BamHI: 3880 pb; 5012 pb; -EcoRI: 5539 pb; 12020 pb; -HindIII: 7411 pb
EcoRIHindIII
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5 Kb
BamHI
ASonda de DNA genómico
EcoRIHindIII
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BamHI
ASonda de DNA genómico
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5 Kb
BamHI
ASonda de DNA genómico
B
7 Kb5,5 Kb
5 Kb3,8 Kb
BamHIEcoRI
HindIII
12 Kb
Sonda de cDNAB
7 Kb5,5 Kb
5 Kb3,8 Kb
BamHIEcoRI
HindIII
12 Kb
Sonda de cDNA
Figura 12.-Análisis del número de copias génicas para cTH por Southern Blot. Los tamaños observados utilizando la sonda de DNA genómico de cTH (A) o la sonda de cDNA de cTH (B) son los mismos que los tamaños esperados, según la secuencia de DNA genómico publicada en las bases de datos.
3.-Análisis de la expresión de cTH-INS1 en el embrión de pollo.
Se estudió la expresión de la quimera más abundante, cTH-INS1, en el
desarrollo embrionario mediante RT-qPCR. El transcrito cTH-INS1 se detectó desde
estadios de gastrulación (St4) y sus niveles aumentaron desde gastrulación al inicio de
la neurulación (St8), manteniéndose los niveles a lo largo de la neurulación (St8 y St10).
Un patrón semejante se observó para los mRNA de insulina y de cTH (Fig. 13).
70
RESULTADOS
mR
NA/
GA
PDH
mR
NA
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Insulina total cTH-INS1 cTH total
St 4
St 8
St 10 ***
*
*
mR
NA/
GA
PDH
mR
NA
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Insulina total cTH-INS1 cTH total
St 4
St 8
St 10 ***
*
*
Figura 13.-Regulación de la expresión de cTH-INS1 en gastrulación y neurulación. RT-qPCR de RNA de embriones de pollo de los estadios indicados. Los niveles de cada mRNA están normalizados respecto al mRNA de la GAPDH y relativizados con respecto a St4. Se muestran los datos representados por sus medias + desviación estándar. Las comparaciones se realizaron con el Test de Dunnet. * p≤0,05 ** p≤0,01
Seguidamente, comparamos la abundancia relativa del transcrito cTH-INS1 en
embriones de St8, en páncreas, donde hay alta expresión de insulina, y en la Substantia
nigra, que presenta altos niveles de cTH.
Las proporciones del mRNA de cTH-INS1 fueron diferentes en los tres tejidos
analizados. Respecto al mRNA de insulina, la abundancia relativa más alta se halló en el
embrión St8 (11,2%) mientras que la más baja fue en el páncreas embrionario de día 13
(0,01%) (Fig. 14A). Por el contrario, la ratio más alta del transcrito cTH-INS1 respecto
al mRNA de cTH, fue en el páncreas de E13, (5,4%) y la más baja en la Substantia
nigra, (0,1%) (Fig. 14B). Otro resultado interesante es que los niveles del mRNA de
cTH-INS1 en embrión de pollo de St8 eran 3 veces superiores que los detectados en
Substantia nigra de E18 (Fig. 15A), mientras que los niveles de cTH total eran 5 veces
inferiores en embrión de St8 respecto a Substantia nigra (Fig. 15B). Este resultado va
en contra de que las quimeras se originen como consecuencia de un fallo transcripcional
estocástico por el que la maquinaria de transcripción ignoraría la terminación de la
transcripción del gen de cTH, y continuaría transcribiendo el gen de la insulina. Tal tipo
71
RESULTADOS
de fallo implicaría mayores niveles de cTH-INS1 en los tejidos como la Substantia
nigra, con mayor tasa de transcripción del gen de cTH.
0.001
0.01
0.1
1
10
100
cTH
-INS1
(mR
NA)
/insu
lina
(mR
NA)
(% d
el to
tal d
e lo
s tra
nscr
itos
de in
sulin
a) A
St8 Páncreas embrionario E13Substantia nigra E18
Páncreas embrionario E13
0.001
0.01
0.1
1
10
100
cTH
-INS1
(mR
NA
)/cTH
(mR
NA)
(% d
el to
tal d
e tra
nscr
itos
de c
TH)
St8 Substantia nigra E18
B
0.001
0.01
0.1
1
10
100
cTH
-INS1
(mR
NA)
/insu
lina
(mR
NA)
(% d
el to
tal d
e lo
s tra
nscr
itos
de in
sulin
a) A
St8 Páncreas embrionario E13Substantia nigra E18
0.001
0.01
0.1
1
10
100
cTH
-INS1
(mR
NA)
/insu
lina
(mR
NA)
(% d
el to
tal d
e lo
s tra
nscr
itos
de in
sulin
a) A
St8 Páncreas embrionario E13Substantia nigra E18
Páncreas embrionario E13
0.001
0.01
0.1
1
10
100
cTH
-INS1
(mR
NA
)/cTH
(mR
NA)
(% d
el to
tal d
e tra
nscr
itos
de c
TH)
St8 Substantia nigra E18
B
Páncreas embrionario E13
0.001
0.01
0.1
1
10
100
cTH
-INS1
(mR
NA
)/cTH
(mR
NA)
(% d
el to
tal d
e tra
nscr
itos
de c
TH)
St8 Substantia nigra E18
B
Figura 14.-Niveles de expresión de cTH-INS1 en relación a los niveles de insulina y cTH totales. Los niveles de mRNA de insulina total, cTH total y cTH-INS1 se cuantificaron por RT-qPCR. Representación de los niveles de cTH-INS1, con respecto a los niveles de insulina total (A) y cTH total (B). Se muestran los valores de la media + desviación estándar de un experimento realizado por duplicado.
72
RESULTADOS
A
B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
St8 Substantia nigra
cTH-
INS1
(mRN
A)/G
APDH
(mRN
A)
cTH-INS1/GAPDH
Substantia nigra
0
5
10
15
20
25
30
35
40
St8 Substantia nigra
cTH
(mRN
A)/ G
APDH
(mRN
A)
cTH/GAPDH
Substantia nigra
A
B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
St8 Substantia nigra
cTH-
INS1
(mRN
A)/G
APDH
(mRN
A)
cTH-INS1/GAPDH
Substantia nigra
0
5
10
15
20
25
30
35
40
St8 Substantia nigra
cTH
(mRN
A)/ G
APDH
(mRN
A)
cTH/GAPDH
Substantia nigra0
5
10
15
20
25
30
35
40
St8 Substantia nigra
cTH
(mRN
A)/ G
APDH
(mRN
A)
cTH/GAPDH
Substantia nigra
Figura 15.-Niveles de cTH-INS1 y de cTH en St8 y en Substantia nigra. Los niveles de mRNA cTH y cTH-INS1 se detectaron mediante RT-qPCR. Se representan los niveles de cTH-INS1 (A) y cTH (B) corregidos por el mRNA de la GAPDH. Se muestran los valores de la media ± desviación estándar de un experimento realizado por duplicado.
4.-Análisis in silico de las proteínas cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2.
La forma canónica de la proteína TH de pollo está formada por 491 aa
distribuidos en un dominio regulador, un dominio catalítico y un dominio de
tetramerización. En este último, situado en el extremo carboxilo terminal, se encuentra
un heptámero de leucinas (cremallera de leucinas) que son necesarias para la
oligomerización de la molécula (Fig. 16).
73
RESULTADOS
16
24
32
40
Figura 16.-CompAlineamiento de ea d
Como se ha mencionado anteriormente, la utilización del sitio donador de
procesamiento interno del exón 13 de la cTH excluye los últimos 48 nucleótidos
codificantes (dominio de tetramerización) y el codón de parada de la traducción de la
cTH, de tal forma que el marco de lectura de la cTH se extiende en el de la insulina,
aunque no mantiene la fase de lectura con el marco de la insulina. Así, la quimera cTH-
INS1 codifica para una nueva isoforma de cTH que comparte el dominio regulatorio y
catalítico con la cTH codificada por el mRNA completo, pero carece de los últimos 16
aa del dominio de tetramerización. Éstos son reemplazados por una extensión de 67
nuevos aa que no tienen homología con ninguna de las proteínas descritas hasta el
momento en las bases de datos. En la quimera cTH-INS2 se introduce un codón de
aración de las secuencias aminoacídicas de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2. las secuencias de aa de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2. Las leucinas (L) resaltadas en rojo
n cTH constituyen la cremallera de leucinas del dominio de tetramerización. En cTH-INS1 y cTH-INS2 parecen rodeados con un círculo rojo los aa que ocupan la posición de las leucinas que en cTH forman el ominio de tetramerización. Aparece en verde en la cTH-INS1 la extensión de 67 aa que difiere de cTH.
81
1
1
1
1
481
cTH cTH-INS1 cTH-INS2
MPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFF
MPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFF
MPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFF
MLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWF
MLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWF
MLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWF
PRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTH
PRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTH
PRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTH
ACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEP
ACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEP
ACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEP
DCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDE
DCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDE
DCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDE
SWLSGSDHCL FWLSLSFLAL EPAMQLPTST SVAPTWWRLS TWCVESVASS TPPKPDGMSS SP
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HS SVRDELE L
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HSLESASPSS
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HSLES
HSLINA I SLNV
1
81
1
1
1
1
481
cTH cTH-INS1 cTH-INS2
16
24
32
40
MPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFF11 MPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFF
MPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFFMPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFF
MPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFFMPTPNISTSA AKGFRRAVSE LDSKQAEAIM SPRFIGRRQS LIEDARKERE AAAAATDAAE STETIVFEEK DGRAMLNLFF
MLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWFMLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWF
MLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWFMLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWF
MLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWFMLKGAKTSPL SRALKVFETF EAKIHHLETR LSRKPREGTA ELEYFVRCEV HSSDLNTFIS SIKRVAEDVR TTKEDKFHWF
PRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTHPRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTH
PRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTHPRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTH
PRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTHPRKICELDKC HHLVTKFDPD LDLDHPGYSD QVYRQRRKSI AEIAFHYKHG DPIPRVEYTA EETATWKEVY STLKSLYPTH
ACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEPACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEP
ACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEPACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEP
ACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEPACKEYLEAFN LLEKFCGYNE NNIPQLEEVS RFLKERTGFQ LRPVAGLLSA RDFLASLAFR VFQCTQYIRH ASSPMHSPEP
DCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDEDCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDE
DCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDEDCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDE
DCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDEDCCHELLGHV PMLADKTFAQ FSQDIGLASL GATDEEIEKL ATLYWFTVEF GLCRQNGIVK AYGAGLLSSY GELIHSLSDE
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HS SVRDELE L
SWLSGSDHCL FWLSLSFLAL EPAMQLPTST SVAPTWWRLS TWCVESVASS TPPKPDGMSS SP
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HS SVRDELE L
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HSLESASPSS
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HSLES
HSLINA I SLNV
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HSLESASPSS
PEVRDFDPDA AAVQPYQDQN YQPVYFVSES FSDAKNKLRN YAAHIKRPFS VKYEPYTHSI ELLDSPQTIC HSLES
cTH cTH-INS1 cTH-INS2
HSLINA I SLNV
SWLSGSDHCL FWLSLSFLAL EPAMQLPTST SVAPTWWRLS TWCVESVASS TPPKPDGMSS SP
74
RESULTADOS
parada de la traducción prematuro que da lugar a una cTH truncada en los últimos 16 aa.
(Fig. 11B y 16).
5.-Expresión proteica de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2 en células transfectadas.
Para analizar la expresión proteica a partir de los transcritos quimera y confirmar
la predicción in silico, los cDNA de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2 se clonaron en el
vector de expresión pCIneo (apartado 15.1 de Materiales y Métodos) y se transfectaron
en la línea celular HEK293T. A las 24 horas de la transfección, las células se procesaron
para Western Blot con un anticuerpo dirigido contra la proteína TH completa. Como se
muestra en la Figura 17A el anticuerpo reconoció las tres isoformas de cTH que
presentaban una leve diferencia en su movilidad electroforética, de acuerdo con el
estudio in silico (cTH-INS1 542 aa; cTH 491 aa; cTH-INS2 475 aa) (Fig. 17A).
Notablemente, los niveles de la isoforma cTH-INS1 eran mucho menores que los de
cTH y cTH-INS2. Los mismos resultados se obtuvieron cuando los cDNA de cTH,
cTH-INS1 y cTH-INS2 se transfectaron en la línea celular NIH3T3 (no mostrado).
La línea celular PC12 procede de un feocromocitoma de rata y expresa
endógenamente el gen de la TH. Para comprobar que las diferencias en los niveles de
expresión de las proteínas transfectadas se mantenían en un sistema que expresa de
forma natural la proteína TH, se transfectaron los cDNA de cTH y cTH-INS1, en las
células PC12. Para distinguir la TH endógena de la expresada a partir de los cDNA
transfectados, a éstos se les incorporó la secuencia codificadora para el epítopo V5 en el
extremo 5’, de tal forma que el epitopo V5 aparece fusionado al extremo amino terminal de
las proteínas transfectadas, evitando así interferencia con el dominio de tetramerización de la
TH. Utilizando un anticuerpo contra el epítopo V5, se comprobó que en las células PC12
también los niveles de la proteína formada a partir del cTH-INS1 seguían siendo inferiores a
los de la proteína cTH (Fig. 17C).
75
RESULTADOS
A
cTH cTH-INS1 cTH-INS2
Isoformasde TH
β-tubulina
C
Anti- V5
cTH cTH-INS1
B
A
6.-Niveles y estabilidad transcripcional de los transcritos cTH y cTH-INS1.
Para ver si las diferencias observadas en la expresión proteica podrían ser debidas a
diferencias en niveles de mRNA, se analizó la expresión de los transcritos quimera en
comparación con la del transcrito cTH. El Northern Blot del RNA de células transfectadas
mostró que los niveles de expresión de los dos transcritos quimera eran semejantes entre sí y
a los niveles de cTH (Fig. 18A). Además, los experimentos de estabilidad de mRNA
(apartado 13 de Materiales y Métodos) mostraron que las cinéticas de degradación de los
AUGV5
cTH
AUG AUGV5
cTH-INS1
cTH cTH-INS1 cTH-INS2
Isoformasde TH
β-tubulina
A
cTH cTH-INS1 cTH-INS2
Isoformasde TH
β-tubulina
C
Anti- V5
cTH cTH-INS1
C
Anti- V5
cTH cTH-INS1
Anti- V5
cTH cTH-INS1cTH cTH-INS1
B
AUGV5
cTH
AUG AUGV5
cTH-INS1
B
AUG
cTH
V5 AUGV5 AUG
cTH
V5
AUG AUGV5 AUG AUG
cTH-INS1
V5
Figura 17.-Expresión proteica a partir de los transcritos de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2. (A) Western Blot para TH de extractos proteicos de células HEK293T transfectadas con los cDNA de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2. Se muestran triplicados de cada construcción. Como control de carga se utilizó la proteína β-tubulina. (B) Representación esquemática de las construcciones cTH y cTH-INS1 fusionados al epítopo V5. (C) Western Blot de extractos proteicos de células PC12 transfectadas con las construcciones representadas en (B). Se muestran triplicados de cada construcción.
76
RESULTADOS
transcritos quimera y de cTH eran equivalentes (Fig. 18B y C), confirmando así que las
variaciones en expresión protéica no eran debidas a diferencias en los niveles de mRNA.
GAPDHmRNA
THmRNA
cTH cTH-INS2cTH-INS1A
0
50
100
150
200
0 3 6 12 25Horas de incubación con DRB
% c
TH(m
RN
A)/ 1
8S (r
RN
A) cTH
cTH-INS1
C
0 3 6 12 25 0 3 6 12 25
cTH-INS1 cTHB
THmRNA
18SrRNA
GAPDHmRNA
THmRNA
cTH cTH-INS2cTH-INS1A
GAPDHmRNA
THmRNA
cTH cTH-INS2cTH-INS1A
0
50
100
150
200
0 3 6 12 25Horas de incubación con DRB
% c
TH(m
RN
A)/ 1
8S (r
RN
A) cTH
cTH-INS1
C
0
50
100
150
200
0 3 6 12 25Horas de incubación con DRB
% c
TH(m
RN
A)/ 1
8S (r
RN
A) cTH
cTH-INS1
0
50
100
150
200
0 3 6 12 25Horas de incubación con DRB
% c
TH(m
RN
A)/ 1
8S (r
RN
A) cTH
cTH-INS1
C
0 3 6 12 25 0 3 6 12 25
cTH-INS1 cTHB
THmRNA
18SrRNA
0 3 6 12 25 0 3 6 12 25
cTH-INS1 cTH
0 3 6 12 25 0 3 6 12 25
cTH-INS1 cTHB
THmRNA
18SrRNA
Figura 18.-Estabilidad transcripcional de cTH y cTH-INS1. (A) Northern Blot para TH, de extractos de RNA de células HEK293T transfectadas con los cDNAs de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2. Los niveles, corregidos por la GAPDH son 1,95 ± 0,21 para cTH, 2,34 ± 0,45 para cTH–INS1 y 1,77 ± 0,32 para cTH–INS2. Se presentan triplicados de cada una de las construcciones. (B) Northern Blot que muestra la cinética de degradación de los transcritos cTH y cTH-INS1. Los RNAs de células HEK293T transfectadas con cTH o cTH-INS1 se extrajeron a los tiempos indicados tras la adición de DRB (inhibidor de la polimerasa II) y se utilizaron para Northern Blot. Como control de carga se utilizó el 18S rRNA, que es transcrito por la RNA polimerasa III. (C) Gráfica en la que se representa la cinética de desaparición de los transcritos cTH y cTH-INS1. Se muestran los niveles de cada transcrito corregidos por los niveles de 18S rRNA.
7.-Estabilidad de las proteínas formadas a partir de cTH y cTH-INS1.
Dado que los niveles de mRNA de cTH y cTH-INS1 son semejantes, seguidamente
analizamos si las diferencias en niveles proteicos podrían venir determinados por una
diferente eficiencia en la traducción, o bien por diferencias en la estabilidad de las proteínas.
Mediante experimentos de pulso-caza e inmunoprecipitación en células transfectadas con los
cDNA de cTH y cTH-INS1, comprobamos que la eficiencia de traducción de cTH-INS1 era
incluso mayor que la de cTH, como se ve reflejado en el punto de 0 horas de la Figura 19A.
Sin embargo, la cinética de degradación de la proteína cTH-INS1 es bastante más rápida que
la de cTH (Fig. 19A y B). Así, la vida media es de 2 horas y 45 minutos para cTH, siendo
tan solo de 48 minutos para cTH-INS1. Esta diferencia en estabilidad podría ser la
responsable de los bajos niveles de expresión de la proteína TH-INS1.
77
RESULTADOS
cTH
cTH-INS1
0 1 2 4
Horas después de la caza
A B
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 4
% d
e pr
oteí
na m
arca
da cTH
cTH-INS1
Tiempo (horas)
cTH
cTH-INS1
0 1 2 4
Horas después de la caza
A
cTH
cTH-INS1
0 1 2 4
Horas después de la caza
cTH
cTH-INS1
0 1 2 4
Horas después de la caza
A B
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 4
% d
e pr
oteí
na m
arca
da cTH
cTH-INS1
Tiempo (horas)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 4
% d
e pr
oteí
na m
arca
da cTH
cTH-INS1
Tiempo (horas)
Figura 19.-Cinética de degradación de las proteínas cTH y TH-INS1. (A) Inmunoprecipitación de las proteínas cTH y cTH-INS1 tras un experimento de pulso-caza en células HEK293T transfectadas con los cDNAs de cTH y cTH-INS1. Las muestras se presentan por duplicado para cada uno de los tiempos. (B) Representación gráfica de la cinética de degradación de las proteínas cTH y cTH-INS1. En cada punto de la gráfica se muestra el error estándar de la media.
8.-Actividad enzimática de las proteínas cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2.
En condiciones nativas, la proteína TH oligomeriza a través de la cremallera de
leucinas del dominio de tetramerización para formar un homotetrámero que es la forma
completamente funcional, mientras que el monómero solo tiene un 25% actividad (Vrana y
cols., 1994). Dado que las isoformas generadas a partir de los transcritos quimera tienen
cambios en la composición de aa del dominio de tetramerización, en el caso de cTH-INS1, o
carecen completamente del mismo, como cTH-INS2 (Fig. 16), estas dos proteínas podrían
tener una actividad enzimática distinta de la cTH canónica. Como la TH cataliza la
conversión de L-tirosina a L-DOPA, se midieron los niveles de L-DOPA mediante HPLC en
células HEK293T transfectadas con los cDNAs de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2. Para
conseguir niveles equivalentes de las tres proteínas las células se transfectaron con diferentes
cantidades de vector (apartado 6 de Materiales y Métodos). Las células que expresaban cTH-
INS1 y cTH-INS2 contenían 6 y 7 veces, respectivamente, menos L-DOPA que las células
que expresaban cTH (Fig. 20).
78
RESULTADOS
010203040506070
cTH(300 ng)
cTH(100 ng)
cTH-INS1(2 µg)
pmol
L-D
OPA
/ mg
prot
eina
Isoformasde TH
β-Actina
A
0
20
40
60
80
100
cTH(2 μg)
cTH-INS2(2 μg)
pmol
L-D
OPA
/ mg
prot
eina
Isoformasde TH
B
β-Actina
010203040506070
cTH(300 ng)
cTH(100 ng)
cTH-INS1(2 µg)
pmol
L-D
OPA
/ mg
prot
eina
Isoformasde TH
β-Actina
A
010203040506070
cTH(300 ng)
cTH(100 ng)
cTH-INS1(2 µg)
pmol
L-D
OPA
/ mg
prot
eina
010203040506070
cTH(300 ng)
cTH(100 ng)
cTH-INS1(2 µg)
pmol
L-D
OPA
/ mg
prot
eina
Isoformasde TH
β-Actina
A
0
20
40
60
80
100
cTH(2 μg)
cTH-INS2(2 μg)
pmol
L-D
OPA
/ mg
prot
eina
Isoformasde TH
B
β-Actina
0
20
40
60
80
100
cTH(2 μg)
cTH-INS2(2 μg)
pmol
L-D
OPA
/ mg
prot
eina
Isoformasde TH
B
β-Actina
Figura 20.-Actividad enzimática de cTH, cTH-INS1 y cTH-INS2. (A) Niveles de L-DOPA medidos por HPLC en células que expresan cTH o cTH-INS1. Bajo la gráfica se muestra la expresión de la proteína de un experimento representativo mediante el Western Blot. Como control de carga se utilizó β-actina. (B) Niveles de L-DOPA medidos por HPLC en células que expresan la proteína cTH-INS2 en comparación a los niveles detectados en células que expresan cTH. Las gráficas representan la media y desviación estándar de 3 experimentos.
9.-Los transcritos quimera cTH-INS1 y cTH-INS2 en otras especies.
Los transcritos quimera se buscaron en líneas celulares de otras especies y en
embriones de codorniz, ratón, pez cebra y Xenopus laevis por RT-PCR, utilizando un
cebador sentido dirigido contra el extremo 3´ de la región codificante de la TH, y un cebador
antisentido dirigido contra la secuencia codificante de la insulina.
Los transcritos TH-INS1 y TH-INS2 sólo se detectaron en embriones de codorniz y
en la línea celular RTC5, derivada de retina de codorniz (Fig. 21). Los transcritos quimera en
esta especie se forman de una forma semejante a los de pollo, es decir, utilizan un sitio
donador de procesamiento interno en el exón 13 de qTH y el sitio aceptor de procesamiento
del exón 2 ó del exón 3 de la insulina, formando así los transcritos qTH-INS1 y qTH-INS2
respectivamente (Fig. 21). Ambos productos de PCR se secuenciaron, descartando de esta
forma la posibilidad de contaminación con amplificaciones de los transcritos quimera de
pollo.
79
RESULTADOS
RTC 5St10 codorniz
396220154
TH-INS1TH-INS2
A
…CTCTAG
En este momento del proyecto nos plantemos que, para poder caracterizar la función
de los transcritos quimera en el embrión, primero era necesario caracterizar el patrón de
expresión y función de la cTH e insulina canónicas. De la expresión, regulación y función de
la insulina embrionaria conocíamos varios aspectos por estudios previos de nuestro grupo
(Morales y cols., 1997; Díaz y cols., 1999; Díaz y cols., 2000; Valenciano y cols., 2006). Sin
embargo, poco o nada se sabía de la expresión y función de la TH en el embrión temprano,
objetivos en los que se ha centrado el resto de mi proyecto de Tesis Doctoral.
10.-Análisis de la expresión de cTH.
La caracterización del patrón de expresión del gen de la cTH a lo largo del desarrollo
se realizó por hibridación in situ en embrión completo de pollo. El mRNA de cTH se detectó
a partir de St8 y su expresión estaba restringida a los primordios cardíacos (Fig. 22A).
Secciones trasversales mostraron que el mRNA de la cTH se encuentra en el mesodermo
esplácnico que dará lugar al corazón (Fig. 22I). La expresión en los primordios cardíacos se
Figura 21.-Los qTH-INS1 y qTH-INS2 (quail TH-INS1/2) están presentes en embriones de codorniz así como en la línea celular RTC5. (A) Detección mediante RT-PCR de los transcritos quimera en embrión de codorniz y en la línea celular RTC5 (B) Formación de las quimeras qTH-INS1 y qTH-INS2. Bajo la secuencia de nucleótidos se muestra la secuencia de aa para la cual codifican.
TGAGCAATCCCCTGC…
…GCCTCCCTCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
TH de codorniz (qTH)
Insulina de codorniz (exón 2)
Insulina de codorniz(exón 3)E S
STOP
LSH
A S L S SqTH-INS1
qTH-INS2
B
RTC 5St10 codorniz
396220154
TH-INS1TH-INS2
RTC 5St10 codorniz
396220154
TH-INS1TH-INS2
A
…CTCTAG TCCCCTGC…
…GCCTCCCTCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
TGAGCAA
TH de codorniz (qTH)
Insulina de codorniz (exón 2)
Insulina de codorniz(exón 3)E S
STOP
LSH
A S L S S
B
…CTCTAG TCCCCTGC…
…GCCTCCCTCAGCTCA…
…CACTCCCTGGAGAGT GTA…
B
qTH-INS1
qTH-INS2TGAGCAA
TH de codorniz (qTH)
Insulina de codorniz (exón 2)
Insulina de codorniz(exón 3)E S
STOP
LSH
A S L S SqTH-INS1
qTH-INS2
80
RESULTADOS
mantiene en St9 (Fig. 22C). En St10, la señal se atenúa en la región ventricular (Fig. 22D),
quedando restringida a partir de St11, al menos hasta St14, a la región auricular y polo
venoso (Fig. 22E-H). Como se aprecia en la sección trasversal del embrión de St13, a nivel
auricular, la expresión se localiza en la capa del miocardio (Fig. 22J).
Además de la expresión localizada en la región cardíaca, también se detectó
expresión transitoria del mRNA de cTH en la región caudal de embriones desde St12 a St14
(Fig. 22F-H) restringida a la capa ectodérmica (Fig. 22K y L).
ASt8
(4 somitas) BSt8
(6 somitas)
H St14G St13
C St9 D St10 E St11 F St12
L St13
Para verificar que el patrón de expresión del mRNA de cTH se corresponde con la
expresión de la proteína, se realizó inmunohistoquímica en embrión completo. La proteína
se detectó desde St9 asociada a los primordios cardíacos (Fig. 23A), concretamente al
mesodermo esplácnico (Fig. 23E). En St11 (Fig. 23B), St13 (Fig. 23C) y St14 (Fig.
23D) la expresión de la proteína cTH, al igual que el mRNA, se restringe al polo
venoso y región auricular.
Figura 22.-Patrón de expresión de cTH por hibridación in situ. Expresión del mRNA de cTH en embrión completo de pollo desde St8 (A) a St14 (H). (I) Sección transversal de embrión de St8 al nivel que se indica en A con una línea negra. (J) Sección transversal de embrión de St13 al nivel que se indica en G con una línea negra. (K y L) Secciones transversales de embrión de St13, al nivel que se indica en G con líneas amarilla (K) y roja (L). Las flechas amarillas indican la expresión del mRNA de cTH en la región cardíaca. Las flechas rojas indican la expresión del mRNA de cTH en la región caudal. ad: aorta dorsal; e: endocardio; ec: ectodermo; md: mesocardio dorsal; mec: mesodermo esplácnico del corazón.
ec
K St13
ec
J St13
e
ad
md
I St8mecmec
ASt8
(4 somitas)AASt8
(4 somitas) BSt8
(6 somitas)BBSt8
(6 somitas)
H St14H St14G St13G St13
C St9C St9 D St10D St10 E St11E St11 F St12F St12
L St13
ec
L St13
ec
K St13
ec
K St13
ec
J St13
e
ad
md
I St8mecmec
J St13
e
ad
md
I St8mecmec
81
RESULTADOS
A St9 St11B St13C St14D
En estadios posteriores, la presencia de la proteína cTH se analizó por
inmunohistoquímica fluorescente en secciones transversales. En St21 se detectó señal
positiva para cTH en el epicardio y en una región entre aurícula y ventrículo, que por su
posición anatómica corresponde al proepicardio (Fig. 24). La identidad de esta región
debe ser confirmada en futuros experimentos con marcadores específicos.
Aunque por hibridación in situ no obtuvimos señal específica para el mRNA de
la cTH en estadios anteriores a St8, se había detectado el mRNA de cTH en St4 por RT-
qPCR (Fig. 13). Para ver si en fase de gastrulación, cuando se define la región
precardiogénica o Hfr, la expresión de cTH también se asocia a esta región,
comparamos por RT-qPCR los niveles de mRNA en las regiones precardiogénicas,
respecto al embrión completo de diferentes estadios. Como se muestra en la Figura 25, la
expresión de cTH está enriquecida en la Hfr de embrión de St5 y en los primordios cardíacos
de St8, mientras que en St10 se encuentra en proporciones equivalentes en el asa cardíaca
que en el resto del embrión.
Figura 23.-Patrón de expresión de cTH por inmunohistoquímica. Expresión de la proteína cTH en embrión completo de pollo de St9 (A), St11 (B), St13 (C) y St14 (D). (E) Sección transversal de embrión de St9 al nivel que se indica en A con una línea negra. Las flechas rojas indican la región de expresión de la proteína cTH en el corazón. cn: crestas neurales; mec: mesodermo esplácnico cardíaco.
cn
mecmec
E
A St9A St9 St11B St11B St13C St13C D St14D St14cn
mecmec
E
cn
mecmec
E
82
RESULTADOS
A BA B
10X
Au V
20X
Au
V
Ep
10X
Au V
10X
Au V
20X
Au
V
Ep
20X
Au
V
Ep
Figura 24.-Expresión de la proteína cTH en St21 de pollo. (A) Inmunofluorescencia para cTH en sección sagital de pollo de St21. (B) Ampliación de la región señalada con un rectángulo rojo en A. cTH se detecta en una región existente entre aurícula (Au) y ventrículo (V), que corresponde al proepicardio (rodeado por linea discontinua en B), así como en el epicardio (Ep, en B).
0,1
1
10
100
1000
St 5 St 8 St 10 Hfr TE Asa st10
cTH
(mR
NA
)/ G
APD
H (m
RN
A)
St10PC Asa St10
HfrSt10St8St5
0,1
1
10
100
1000
St 5 St 8 St 10 Hfr TE Asa st10
cTH
(mR
NA
)/ G
APD
H (m
RN
A)
0,1
1
10
100
1000
St 5 St 8 St 10 Hfr TE Asa st10
cTH
(mR
NA
)/ G
APD
H (m
RN
A)
St10PC Asa St10
HfrSt10St8St5
Figura 25.-Expresión de cTH por RT-qPCR en embriones completos y zona cardiogénica. Representación de la expresión de cTH mediante RT-qPCR en embrión completo de pollo (St5, St8, St10) y en regiones concretas como Hfr de St5, primordios cardíacos de St8 (PC), o asa cardíaca de St10. Los niveles de cTH están corregidos por los niveles de GAPDH y las cantidades obtenidas están relativizadas con respecto a St5, al cual se le ha asignado el valor de 1. Los datos se muestran como la media + desviación estándar.
83
RESULTADOS
11.-Medida de las catecolaminas en embriones de pollo por HPLC.
La actividad enzimática de la TH está regulada por modificaciones
postraduccionales como fosforilaciones en el dominio regulatorio, que mantienen el
estado tetramérico de la proteína, y requiere de la presencia de cofactores como el hierro
y la tetrahidrobiopterina (Fitzpatrick, 1989; Nagatsu, 1981). Para analizar la
funcionalidad de la cTH embrionaria, se midieron los niveles de L-DOPA y dopamina
en embrión completo. La L-DOPA es el producto directo de la reacción catalizada por
la TH, y la dopamina es el resultado de la descarboxilación de la L-DOPA por la AADC,
de expresión ubicua (Fig. 1). Como se muestra en la Figura 26, se detectaron L-DOPA
y dopamina tanto en St8 como en St10, siendo los niveles de ambas mayores en St10.
La presencia de L-DOPA y dopamina, indica que el embrión de pollo tendría enzimas
cTH y AADC funcionales desde, al menos, St8.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
St 8 St 10
NIV
ELES
en
pmol
/em
brió
n
L-DOPADopamina
Figura 26.-Niveles de L-DOPA y dopamina en embriones de pollo. Medida por HPLC de la producción de L-DOPA y dopamina en embrión de pollo de St8 y St10. Se muestran los datos en pmol/embrión, correspondientes a las medias ± la desviación estándar de 3 conjuntos de 15 embriones cada uno para el caso de St10, ó 2 conjuntos de 30 embriones cada uno para el caso de St8. El nivel de dopamina en St8 no presenta barra de desviación estándar por detectarse dopamina solo en uno de los dos conjuntos de embriones analizados.
En conjunto, estos resultados muestran que hay expresión de mRNA y proteína
de cTH en el embrión temprano, previa a la formación de conexiones nerviosas, y que
esta cTH es funcional. El patrón de expresión tanto del mRNA como de la proteína está
84
RESULTADOS
asociado a la región cardíaca a lo largo del desarrollo temprano, lo que sugiere que la
cTH podría tener un papel en el desarrollo del corazón. Para analizar esta posible
función, realizamos experimentos farmacológicos y genéticos de ganancia y pérdida de
función en embriones.
12.-Efecto de la L-DOPA y de la dopamina, administradas en microesferas
acrílicas de heparina.
Las microesferas acrílicas de heparina se utilizan en biología del desarrollo para ver
el efecto local de factores de crecimiento u otras moléculas, sin alterar el desarrollo de
regiones adyacentes. Utilizando esta metodología (descrita en el apartado 3 de Materiales y
Métodos), se aplicaron exógenamente L-DOPA o dopamina en la región precardiogénica,
Hfr, del embrión de St5, donde previamente había sido detectada la expresión del gen de la
cTH por RT-qPCR. Las microesferas incubadas con 10 μM L-DOPA o dopamina se
implantaron en embriones en cultivo entre el endodermo y el ectodermo, lateralmente a la
Hfr (Fig. 27). Tras 18-24 horas de desarrollo adicional con las microesferas, en los
embriones que habían alcanzado el St10-11 se analizó la expresión de factores de
transcripción y de proteínas contráctiles mediante hibridación in situ. Tanto la L-DOPA
como la dopamina indujeron la expresión ectópica de los mRNA de factores de transcripción
implicados en la determinación del linaje cardíaco como Nkx 2.5 (Fig. 27B y H) y Tbx5
(Fig. 27C e I). Así mismo, la L-DOPA y la dopamina inducían la expresión ectópica de los
mRNA de proteínas contráctiles implicadas en la formación de las sarcómeras, como la
miosina ventricular (VMHC-1) (Fig. 27D y J) y auricular (AMHC-1) (Fig. 27E y K).
Además, mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo general contra la cadena pesada
de la miosina (MF20), confirmamos que la expresión ectópica de estos mRNA se
correspondía con la de la proteína (Fig. 27F y L).
Seguidamente estudiamos si las células adyacentes a la microesfera, además de
expresar marcadores cardiacos, presentaban características morfológicas y estructurales
semejantes a las de cardiomiocitos. Cortes semifinos de esta región mostraron que las
células adyacentes a la microesfera (Fig. 28A) presentaban morfología similar a las
células del miocardio del asa cardíaca (Fig. 28D). El análisis mediante microscopía
electrónica de transmisión de estas células mostró que presentaban sarcómeras
organizadas, en las que se podían distinguir las bandas A e I y el disco Z (Fig. 28B).
Los discos Z son indicativos de cierto grado de madurez de las células cardíacas. Por
85
RESULTADOS
tanto, la dopamina no sólo induce la expresión de genes cardíacos sino también
características estructurales de cardiomiocitos.
Figura 27.-La L-DOPA y la dopamina inducen de forma ectópica la expresión de marcadores cardíacos. (A) Micrografía de embrión de pollo de St5 donde se indica rodeada en rojo, a ambos lados de la línea primitiva, la región Hfr. Microesferas acrílicas de heparina recubiertas de L-DOPA (B-F) o dopamina (H-L), implantadas en embrión de pollo de St5 en posición lateral a la Hfr (rectángulo rojo en G). Los embriones fueron analizados en St10-11 mediante hibridación in situ en embrión completo para cNkx2.5 (B y H), Tbx5 (C e I), VMHC-1 (D y J), AMHC-1 (E y K). Inmunohistoquímica en embrión completo con MF20 (F y L). (G) Diagrama de embrión de pollo de St5 donde se indica la posición de la Hfrmediante un rectángulo rojo y la de la microesfera (círculo rojo) en el momento de su implantación. Con flechas amarillas se indica la posición en la que se encuentran las microesferas. PCf: proceso cefálico; NH: Nódulo de Hensen; LP: línea primitiva.
PCf
NHLP
PCf
LP
NH
G
A Nkx-2.5B
L-DOPA
Tbx5C
L-DOPA
VMHC-1D
L-DOPA
AMHC-1E
L-DOPA
MF20F
L-DOPA
Nkx-2.5H
Dopamina
Tbx5I
Dopamina
VMHC-1J
Dopamina
AMHC-1K
Dopamina
MF20L
Dopamina
PCf
NHLP
PCf
NHLP
PCf
LP
NH
G
A
PCf
LP
NH
G
A Nkx-2.5B
L-DOPA
Nkx-2.5B
L-DOPA
Tbx5C
L-DOPA
Tbx5C
L-DOPA
VMHC-1D
L-DOPA
VMHC-1D
L-DOPA
AMHC-1E
L-DOPA
AMHC-1E
L-DOPA
MF20F
L-DOPA
MF20F
L-DOPA
Nkx-2.5H
Dopamina
Nkx-2.5H
Dopamina
Tbx5I
Dopamina
Tbx5I
Dopamina
VMHC-1J
Dopamina
VMHC-1J
Dopamina
AMHC-1K
Dopamina
AMHC-1K
Dopamina
MF20L
Dopamina
MF20L
Dopamina
86
RESULTADOS
40x
A
10x
13.-El efecto de la L-DOPA es región y estadio-dependiente.
Para analizar si existía regionalización en la Hfr respecto a la acción de la cTH,
implantamos microesferas impregnadas en L-DOPA dentro de la Hfr de embriones de
St5 (Fig. 29A). En este caso no se observó expresión ectópica de los marcadores
cardíacos AMHC-1, VMHC-1 y MF20 (Fig. 29A), a diferencia de lo obtenido cuando
las microesferas se implantaron lateralmente a la Hfr (Fig. 27).
Figura 28.-Morfología y ultraestructura de las células que rodean las microesferas recubiertas con dopamina. (A, C y D) Tinción con hematoxilina-eosina de cortes semifinos de un embrión de St11 al que se le implantó una microesfera recubierta con dopamina en St5. (A) Sección de la microsfera. Las flechas rojas señalan las células que rodean la microesfera (flecha amarilla). (B) Foto con microscopio electrónico de transmisión de una de las células que rodean la microesfera con dopamina. Las flechas azules señalan los discos Z dentro de las sarcómeras. Se muestran delimitadas con corchetes una banda A (blanco) y una banda I (rojo). La flecha roja señala un desmosoma. (C) Sección sagital de embrión de pollo de St10-11. (D) Ampliación 40X al nivel que se indica con un rectángulo amarillo en C. m: miocardio; e: endocardio; f: tejido faríngeo.
f
m
e
C
40x f
m
D
BZ Z
AI
40x
A
10xf
m
e
C
Z Z
AI
B
40x f
m
D
87
RESULTADOS
A
CB
LP
NH CGM
a b
LP
NH CG
M
St4a
b
St4
PCf
LP
NH
Hfr
M
St5
a b c d
A
CB
LP
NH CGM
a b
LP
NH CGM
LP
NH CGM
a b
LP
NH CG
M
St4a
b
LP
NH CG
M
St4a
b
St4
PCf
LP
NH
Hfr
M
St5
a b c d
St4
PCf
LP
NH
Hfr
M
St5
a b c d
Figura 29.-El efecto de L-DOPA es específico de la región y estadio embrionario. (A panel a) Diagrama de embrión de pollo de St5 donde se indica la posición de la Hfr mediante un rectángulo rojo y la de la microesfera (M) en el momento de su implantación. Los embriones fueron analizados en St10-11 mediante hibridación in situ en embrión completo para VMHC-1 (A panel b), AMHC-1 (A panel c), y doble hibridación para AMHC-1 e inmunohistoquímica para MF20 (A panel d).(B panel a) Diagrama de embrión de pollo de St4 donde se indica la posición de la microesfera en el momento de su implantación en la cresta germinal (CG). Los embriones fueron analizados en St8 mediante hibridación in situ para cNkx2.5 (B panel b). (C panel a) Diagrama de embrión de pollo de St4 donde se indica la posición de la microesfera en el momento de su implantación lateral al Nódulo de Hensen (NH). Los embriones fueron analizados en St10 mediante doble hibridación para VMHC-1 e inmunohistoquímica para MF20 (C panel b). LP: línea primitiva; PCf: proceso cefálico.
Para comprobar si la L-DOPA tenía efecto en la inducción de marcadores
cardíacos fuera de las regiones precardiogénicas, se implantaron microesferas en
embriones en St4, previamente a la formación de la Hfr. Las microesferas aplicadas en
el interior de las crestas germinales de St4 no indujeron la expresión ectópica de Nkx2.5
(Fig. 29B panel b). Tampoco se observó inducción de los marcadores cardíacos
88
RESULTADOS
VMHC-1 y MF20, cuando las microesferas se implantaron en posición lateral al Nódulo
de Hensen en St4 (Fig. 29C panel b).
Estos resultados sugieren que la acción inductora de la L-DOPA está restringida
a las células presentes en una posición lateral con respecto a la Hfr.
14.-Efecto de la inhibición de la producción endógena de L-DOPA y dopamina.
Los experimentos descritos hasta ahora muestran la capacidad inductora de
cardiogénesis de la L-DOPA y la dopamina aplicadas exógenamente. Con el fin de
demostrar que la L-DOPA y/o la dopamina endógenas están implicadas en los pasos
iniciales del desarrollo del corazón, se bloquearon farmacológicamente las enzimas
encargadas de su síntesis.
Se aplicaron microesferas impregnadas en 3-yodotirosina (3-I-Tyr), un inhibidor
de la TH, o en 3-hidroxibenzilhidrazina (mHBH), un inhibidor de la AADC (Fig. 1) dentro
de la Hfr de embriones de St5 durante 4-8 horas. Como se muestra en la Figura 30 la
adición de 3-I-Tyr o mHBH disminuían la expresión de las miosinas cardíacas VMHC-1
(Fig. 30 C y G) y AMHC-1 (Fig. 30D y H). Sin embargo, la expresión de Tbx5, no se vio
alterada con ninguno de los dos inhibidores (Fig. 30B y F). Este efecto inhibitorio se revertía
a tiempos más largos de incubación (más de 12 horas).
89
RESULTADOS
15.-Efecto de la sobreexpresión de cTH en el corazón embrionario de pollo.
Para confirmar los resultados de los estudios farmacológicos descritos anteriormente,
se realizaron experimentos genéticos de ganancia de función mediante la electroporación del
cDNA de la cTH. Embriones de St3 y St3+ en cultivo EC (apartado 2 de Materiales y
Métodos) se electroporaron en la región rostral de la línea primitiva (apartado 4 de
Materiales y Métodos), región por la que migran los precursores cardiacos que formarán la
Hfr y posteriormente darán lugar al corazón (García Martínez y Schoenwolf, 1993). Tras la
Figura 30.-Efecto de la inhibición de la L-DOPA o la dopamina endógenas. (A) Micrografía de embrión de pollo de St5 en la que se indica rodeado en rojo, a ambos lados de la línea primitiva, la región Hfr. Microesferas impregnadas con 3-I-Tyr, inhibidor de la TH (B-D) o con mHBH, inhibidor de la AADC (F-H), fueron implantadas dentro de la Hfr de embrión de St5. Los embriones se procesaron a las 4-8 horas para hibridación in situ para Tbx5 (B y F), VMHC-1 (C y G) y AMHC-1 (Dy H). (E) Diagrama de embrión de pollo de St5 en el que se muestra la Hfr mediante un rectángulo rojo y la posición de la microesfera (círculo rojo) en el momento de la implantación. Las flechas amarillas indican la posición de la microesfera dentro del embrión. LP: línea primitiva; NH: Nódulo de Hensen; PCf: proceso cefálico.
B Tbx5
3-I-Tyr
D AMHC1
3-I-Tyr
C VMHC1
3-I-Tyr
H AMHC1
mHBH
G VMHC1
mHBH
F Tbx5
mHBHPCf
LP
NH
E
PCf
NHLP
A
3-I-Tyr 3-I-Tyr 3-I-TyrPCf
NHLP
A B Tbx5 C VMHC1 D AMHC1
mHBH mHBH mHBHPCf
LP
NH
F Tbx5 H AMHC1G VMHC1E
90
RESULTADOS
electroporación, los embriones continuaron su desarrollo en cultivo durante 12-24 horas. El
vector bicistrónico empleado en la electroporación (pCAGGS-cTH-STOP-IRES-GFP)
contiene el cDNA de la GFP como gen reportero y el cDNA de la TH de pollo. La expresión
de GFP nos permitió identificar las células electroporadas y, mediante hibridación in situ e
inmunohistoquímica para cTH, verificamos que el patrón de expresión de GFP y de cTH en
los embriones electroporados era esencialmente idéntico (Fig. 31), validando así la expresión
de GFP como indicativa de la expresión de cTH. Además, mediante experimentos de HPLC
comprobamos que la sobreexpresión de cTH resultaba en un aumento de los niveles de L-
DOPA en el embrión electroporado (Fig. 31C).
A B
C
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
St8 St8 Elec cTH
L-DOPA
A B
C
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
St8 St8 Elec cTH
L-DOPA
Figura 31.-El cDNA de cTH se transcribe y traduce eficientemente en las células electroporadas. Embriones de St3-St3+ en cultivo EC se electroporaron con el vector bicistrónico pCAGGS-cTH-STOP-IRES-GFP. (A) Hibridación in situ para cTH en embrión completo de St8. El panel de la izquierda muestra la fluorescencia de la GFP. (B) Inmunohistoquímica en embrión completo de St8 para cTH. La foto de la izquierda muestra la fluorescencia de la GFP. (C) Niveles de L-DOPA medidos por HPLC. Se muestran los datos en pmol/embrión correspondientes a la media ± desviación estándar de dos conjuntos de 30 embriones cada uno para St8, y los niveles de un grupo de 6 embriones de St8 electroporados con el cDNA de la cTH (St8 Elec cTH).
91
RESULTADOS
El análisis de los embriones electroporados mostró un aumento en los niveles de
expresión de las miosinas cardíacas VMHC-1 y AMHC-1, en el corazón de los embriones
electroporados, con el vector pCAGGS-cTH-STOP-IRES-GFP, respecto a embriones no
electroporados o a embriones electroporados con el vector pCAGGS-STOP-IRES-GFP que
no contiene el cDNA de la cTH (Fig. 32). Además, se observó cierta expansión rostral de la
expresión de AMHC-1 (flecha amarilla en Fig. 32I). Este efecto no era consecuencia de la
electroporación, ya que no se detectaron cambios en los niveles de expresión de VMHC-1 ni
de AMHC-1 entre embriones electroporados con el vector pCAGGS-STOP-IRES-GFP y
embriones no electroporados (para VMHC-1 comparar Fig. 32B y Fig. 32E, y para AMHC-
1 comparar Fig. 32G y Fig. 32J). A pesar de la presencia de células electroporadas fuera del
asa cardíaca, no se detectó expresión de VMHC-1 ni de AMHC-1 fuera del corazón.
E
No Electroporado
VMHC-1
G
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
AMHC-1 J
No Electroporado
AMHC-1F
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
GFP H
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
GFP I AMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
B VMHC-1
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
A GFP
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
C GFP
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
D VMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
E
No Electroporado
VMHC-1
G
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
AMHC-1 J
No Electroporado
AMHC-1F
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
GFP H
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
GFP I AMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
B VMHC-1
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
A GFP
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
C GFP
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
D VMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
E
No Electroporado
VMHC-1E
No Electroporado
VMHC-1
G
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
AMHC-1G
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
AMHC-1 J
No Electroporado
AMHC-1J
No Electroporado
AMHC-1F
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
GFPF
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
GFP H
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
GFPH
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
GFP I AMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
I AMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
B VMHC-1
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
B VMHC-1
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
A GFP
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
A GFP
pCAGGS-STOP-IRES-GFP
C GFP
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
C GFP
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
D VMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
D VMHC-1
pCAGGS-cTH-
STOP-IRES-GFP
Figura 32.- Efecto de la sobreexpresión del cDNA de cTH. Los embriones en St3 se electroporaron con el vector control pCAGGS-STOP-IRES-GFP (A, B, F y G) o con el vector que sobreexpresa cTH, pCAGGS-cTH-STOP-IRES-GFP (C, D, H, I). Hibridación in situpara VMHC-1 en embriones de St8 (B, D y E). Hibridación in situ para AMHC-1 en embriones de St11(G, I, J). A ,C, F y H muestran la fluorescencia de la GFP en los embriones electroporados. Cada serie horizontal está hecha en el mismo experimento y es por tanto comparable. Entre experimentos puede haber variación de intensidad de señal tras la hibridación in situ para el mismo marcador. La flecha amarilla en I indica expansión de la regionalización de AMHC-1.
92
RESULTADOS
16.-Efecto del bloqueo de la expresión endógena de cTH mediado por morfolinos.
Los experimentos con inhibidores farmacológicos de la producción de L-DOPA y
dopamina están limitados a tiempos cortos (4-8 horas) ya que su efecto se revierte a las 12
horas. Para conseguir un bloqueo mantenido de la cTH endógena se diseñó un morfolino
antisentido dirigido contra el inicio de la traducción del mRNA de cTH. El morfolino contra
la cTH se electroporó en embriones de St3-St3+ como se describe en el apartado 4 de
Materiales y Métodos. Como control negativo se electroporó un morfolino contra la
luciferasa, gen que no se expresa en el pollo. Ambos morfolinos están marcados con
fluoresceína, lo que nos permitió identificar las células que habían incorporado el
oligonucleótido. Los embriones electroporados con el morfolino contra cTH presentaban
expresión reducida de AMHC-1 (comparar Fig. 33I y Fig. 33G) y VMHC-1 (comparar Fig.
33D y Fig. 33B). Sin embargo, los embriones electroporados con el morfolino contra
luciferasa no presentaban cambios en los niveles de AMHC-1 ni de VMHC-1, respecto a los
no electroporados (comparar Fig. 33G y Fig. 33J; Fig33B y Fig. 33E).
En conjunto, los resultados de los experimentos farmacológicos y genéticos
indican que la cTH está implicada en la diferenciación cardíaca y es necesaria su
expresión para un correcto desarrollo del corazón.
B
MorfolinoLuciferasa
VMHC-1 D
Morfolino cTH
VMHC-1 E
No Electroporado
VMHC-1
G
MorfolinoLuciferasa
AMHC-1 I
Morfolino cTH
AMHC-1
A
MorfolinoLuciferasa
Fluoresceína C
Morfolino cTH
Fluoresceína
F
MorfolinoLuciferasa
Fluoresceína H
Morfolino cTH
Fluoresceína
No Electroporado
J AMHC-1
No Electroporado
B
MorfolinoLuciferasa
VMHC-1 D
Morfolino cTH
VMHC-1 E
No Electroporado
VMHC-1
G
MorfolinoLuciferasa
AMHC-1 I
Morfolino cTH
AMHC-1
A
MorfolinoLuciferasa
Fluoresceína C
Morfolino cTH
Fluoresceína
F
MorfolinoLuciferasa
Fluoresceína H
Morfolino cTH
Fluoresceína
No Electroporado
J AMHC-1
No Electroporado
Figura 33. Efecto de la electroporación de morfolinos. Los embriones en St3 se electroporaron con el morfolino control contra luciferasa (A, B, F y G) o con el morfolino contra cTH (C, D, H e I). Hibridación in situ para VMHC-1 en embriones de St10 (B, D y E). Hibridación in situ para AMHC-1 en embriones de St9 (G, I, J). A ,C, F y H muestran la fluorescencia del morfolino en los embriones electroporados. Cada serie horizontal está hecha en el mismo experimento y es por tanto comparable. Entre experimentos puede haber variación de intensidad de señal tras la hibridación in situ para el mismo marcador.
93
RESULTADOS
17.-Análisis de la expresión de TH en embriones de otras especies.
17.1.-Estudio de la expresión de la mTH en el embrión de ratón.
Se analizó la expresión del mRNA de mTH en el embrión completo de ratón
desde gastrulación (E6,5) hasta el principio de la organogénesis (E9,5), mediante RT-
PCR.
Como se muestra en la Figura 34, se detectó el mRNA de mTH desde E6,5,
equivalente a un embrión de St4 de pollo, en adelante. Esta expresión es previa a la
reportada en la literatura en embriones de E8,5 (Zhou y cols., 1995).
E6,5E7,5
E8,5E9,5
H 2OE6,5E7,5
E8,5E9,5
H 2O
Figura 34.-Detección del mRNA de mTH por RT-PCR. Expresión del mRNA de mTH, analizada por RT-PCR, en embriones completos de ratón de E6,5, E7,5, E8,5 y E9,5. Como control negativo de la PCR se utilizó H2O.
Para comprobar si la expresión del mRNA de mTH se correspondía con la
presencia de L-DOPA y dopamina en el embrión, se midieron los niveles de éstas por
HPLC en embriones completos de E7,5, E8,5 y E9,5. Como se muestra en las Figuras
35 A y B, se detectaron tanto L-DOPA como dopamina desde E7,5, y los niveles de ambas
aumentaron conforme avanza el desarrollo embrionario.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
E7,5 E8,5 E9,5
Dopamina(pmol/embrión)
B
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
E7,5 E8,5 E9,5
L-DOPA(pmol/embrión)
A
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
E7,5 E8,5 E9,5
Dopamina(pmol/embrión)
B
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
E7,5 E8,5 E9,5
L-DOPA(pmol/embrión)
A
Figura 35.-Detección de L-DOPA y dopamina por HPLC en embriones de ratón. Representación gráfica de los niveles de L-DOPA (A) y dopamina (B) en embriones completos de ratón de E7,5, E8,5 y E9,5. Se representan los datos en pmol/embrión.
94
RESULTADOS
Estos resultados indican que, al igual que en el pollo, la TH se expresa en el
embrión de ratón desde la etapa de gastrulación. Sin embargo, no se obtuvo señal
especifica en experimentos de hibridación in situ en embriones completos de ratón de
E7,5, E9,5 y E10,5. La misma ribosonda dio hibridación positiva en la Substantia nigra
en secciones de cerebro de ratón adulto, confirmando que la sonda era adecuada, por lo
que la falta de señal en los embriones analizados se atribuye a que los niveles de mRNA
de mTH están por debajo de la sensibilidad de la hibridación in situ. En estadios
posteriores (E13,5), encontramos expresión de la proteína en una área entre la vena cava
y la aurícula derecha que anatómicamente se corresponde con el nodo sinoauricular
(NSA) (Fig. 36), el marcapasos del corazón donde se origina el impulso eléctrico.
C
AD
VD VI
VC AINSA
5X D
SNS
10X
B
AIVC
AD
SNS SNS
NSA
10XA
SNSSNSVC
AIAD
VDVI
NSA
5X
C
AD
VD VI
VC AINSA
5XC
AD
VD VI
VC AINSA
5X D
SNS
10XD
SNS
10X
B
AIVC
AD
SNS SNS
NSA
10XB
AIVC
AD
SNS SNS
NSA
10XA
SNSSNSVC
AIAD
VDVI
NSA
5XA
SNSSNSVC
AIAD
VDVI
NSA
5X
Figura 36.- Expresión de la proteína mTH en corazón de ratón de E13,5. (A y B) Inmunohistoquímica de mTH en secciones trasversales de corazón de ratón de E13,5. Las flechas amarillas señalan el nodo sinoauricular (NSA). (C y D) Control negativo de la inmunohistoquímica. B y D son ampliaciones de las regiones representadas con un rectángulo rojo en A y C. AD: aurícula derecha; AI: aurícula izquierda; VD: ventrículo derecho; VI: ventrículo izquierdo; VC: vena cava; NSA: nodo sinoauricular; SNS: sistema nervioso simpático.
95
RESULTADOS
17.2.-Estudio de la expresión de xTH en el embrión de Xenopus laevis.
Mediante RT-PCR, analizamos la expresión de xTH en estadios NF 11, NF 14 y NF
19, previos a la formación del tubo cardíaco (NF 31-33). Aunque débilmente, se detectó el
transcrito de xTH desde NF 14 y claramente en NF 19 (Fig. 37), estadios entre la
especificación cardíaca (NF 12-14, equivalente a St5 de pollo y E6,5 de ratón) y la migración
de los progenitores cardíacos hacia la línea media ventral (NF 26-28, equivalente a St7 de
pollo y E7,5 de ratón) (Warkman y Krieg, 2007).
NF 11
NF 14
NF 19
NF 11
NF 14
NF 19
+RT -RT
NF 11
NF 14
NF 19
NF 11
NF 14
NF 19
+RT -RT
Figura 37.-Expresión de xTH en embriones de Xenopus laevis. RT-PCR de mRNA de embriones completos de Xenopus laevis de estadios NF 11, NF 14 y NF 19. Como control negativo se muestra la PCR realizada a partir de RT a las que no se añadió la transcriptasa reversa (-RT).
También analizamos los niveles de L-DOPA y dopamina en embriones completos de
estadios NF 10, NF 12, NF 15, NF 19, NF 20, NF 21 y NF 22, por HPLC. Se encontró L-
DOPA desde estadio NF 10 (Fig. 38A), estadio previo a la gastrulación, y dopamina desde
estadio NF 12 (Fig. 38B), estadio en el cual se está produciendo la especificación cardíaca
(Lohr y Yost, 2000; Warkman y Krieg, 2007).
96
RESULTADOS
0
Representación gráfica de los niveles de L-DOPA (A) y dopamina (B), cuantificados mediante HPLC. Los datos se muestran en pmol/embrión.
18.-Células troncales: efecto de la L-DOPA y de la dopamina sobre la expresión de
marcadores cardíacos.
Con el fin de utilizar un modelo in vitro que nos facilitase el eventual estudio del
mecanismo de acción de la L-DOPA y de la dopamina sobre el desarrollo cardíaco, se
analizó el efecto de estas moléculas en células troncales de ratón durante el proceso de
diferenciación a cardiomiocitos.
Las células troncales poseen la potencialidad de diferenciarse a cualquier tipo de
tejido embrionario. Utilizando diferentes técnicas de diferenciación, se ha conseguido que
den lugar a neuronas, cardiomiocitos y otros tipos celulares. En nuestros estudios hemos
utilizado la línea de células troncales de ratón E14Tg2a.IV (E14). Como se describe en el
apartado 8.1 de Materiales y Métodos, las células E14 cultivadas por el método de “gota
colgante” forman cuerpos embrionarios (CE), que poseen una representación de las tres
capas embrionarias: endodermo, mesodermo y ectodermo. Estos CE, tras el plaqueo sobre
una superficie adherente, presentan áreas de latido. Para analizar el efecto de la cTH en la
diferenciación cardíaca, los CE se trataron con 10 µM de L-DOPA o dopamina en el día del
plaqueo (día 5 de experimento, Fig. 8 y apartado 9 de Materiales y Métodos), durante 5 días,
Figura 38.-Detección de L-DOPA y dopamina en embriones de Xenopus laevis.
0,005
0,01
015
0,02
025
0,03
035
NF 10 NF 12 NF 15 NF 19 NF 20 NF 21 NF 22
0,
0,
0,
L-DOPA(pmol/embrión)
A
00,0020,0040,0060,0080,01
0,0120,014
NF 12 NF 15 NF 20 NF 21 NF 22
Dopamina(pmol/embrión)
B
0
005
0,01
015
0,02
025
0,03
035
NF 10 NF 12 NF 15 NF 19 NF 20 NF 21 NF 22
0,
0,
0,
0,
L-DOPA(pmol/embrión)
A
0
005
0,01
015
0,02
025
0,03
035
NF 10 NF 12 NF 15 NF 19 NF 20 NF 21 NF 22
0,
0,
0,
0,
L-DOPA(pmol/embrión)
A
00,0020,0040,0060,0080,01
0,0120,014
NF 12 NF 15 NF 20 NF 21 NF 22
Dopamina(pmol/embrión)
B
00,0020,0040,0060,0080,01
0,0120,014
NF 12 NF 15 NF 20 NF 21 NF 22
Dopamina(pmol/embrión)
B
97
RESULTADOS
renovando diariamente 200 µl de los 270 µl del medio de cultivo. Durante el cultivo no se
observaron diferencias entre los CE controles o los tratados con L-DOPA o dopamina en el
número de CE con áreas de latido, ni en el momento de su aparición (Fig. 39). Sin embargo,
el análisis de los niveles de expresión de factores de transcripción y proteínas contráctiles
cardíacas mostró una estimulación en varios de ellos. Así, el tratamiento con dopamina
aumentó la expresión de los factores de transcripción Nkx2.5, GATA4 y Tbx5 siendo más
notable en el caso de Nkx2.5. La L-DOPA también incrementó los niveles de Nkx2.5 y
GATA4 (Fig. 40). Además, se observó un aumento en la expresión de proteínas contráctiles
como αMHC y TT2 (Fig. 40). Ni L-DOPA ni dopamina estimularon la expresión del factor
de transcripción mesodérmico MEF2C.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10
% C
Es
CO
N Á
REA
S D
E L
ATI
DO
ControlL-DOPADopamina
Figura 39.-Efecto de la L-DOPA y la dopamina en la aparición de las áreas de latido. Gráfica del porcentaje de CE con áreas de latido tras el tratamiento con L-DOPA, dopamina o agua (control), desde el día 6 de experimento. Se muestran datos correspondientes a un experimento representativo de 5.
98
RESULTADOS
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Nkx2.5 Mef2C GATA4 Tbx5 Tbx2 αMHC TT2
VAR
IAC
ION
ES R
ESPE
CTO
AL
CO
NTR
OL
Control
Dopamina
L-DOPA
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Nkx2.5 Mef2C GATA4 Tbx5 Tbx2 αMHC TT2
VAR
IAC
ION
ES R
ESPE
CTO
AL
CO
NTR
OL
Control
Dopamina
L-DOPA
Figura 40.-La L-DOPA y la dopamina inducen la expresión de marcadores cardíacos. RT-qPCR de RNA de CE de células E14: todos los CE del mismo tratamiento se procesaron para extracción de RNA seguida de RT-qPCR. Representación gráfica de los niveles de expresión de los mRNA de Nkx2.5, Mef2c, GATA4, Tbx5, Tbx2, αMHC y TT2 tras el tratamiento con L-DOPA o dopamina. Todos los valores se muestran corregidos por los niveles del 18S rRNA y relativizados con respecto al control al que se le adjudicó el valor 1. Se muestra la media de 3 experimentos realizados por triplicado más la desviación estándar de la media.
Seguidamente, analizamos si los CE expresaban endógenamente el gen de la mTH.
El transcrito de mTH se detectó en las células troncales proliferativas (CT) y en los CE, y los
niveles de mRNA de mTH aumentaron durante la diferenciación (Fig. 41) (comparar CE 5 y
10 días de diferenciación). Mediante inmunohistoquímica analizamos la expresión de mTH
en los CE de día 8 de experimento, y en paralelo teñimos con faloidina fluorescente los
filamentos de actina. Esta tinción se hace más patente en células con alto contenido en actina,
como es el caso de los cardiomiocitos. Como se muestra en la Figura 42, tanto los CE
controles como los tratados con L-DOPA o dopamina presentaban amplias áreas de
expresión de mTH que sólo parcialmente coincidían con el marcaje con faloidina. Estos
resultados indican que la expresión de mTH aumenta durante el proceso de diferenciación de
los CE, aunque sólo una pequeña porción de las células que expresaban mTH eran
cardiomiocitos, como se puso de manifiesto por la tinción con faloidina.
99
RESULTADOS
00,005
0,010,015
0,020,025
0,030,035
0,040,045
ES EB (5 días) EB (5+5 días)
mTH
mR
NA
/18S
rR
NA
CE 5 CE 10CT0
0,005
0,010,015
0,020,025
0,030,035
0,040,045
ES EB (5 días) EB (5+5 días)
mTH
mR
NA
/18S
rR
NA
CE 5 CE 10CT
Figura 41.- Expresión del mRNA de mTH durante la diferenciación cardíaca de las células E14. RT-qPCR de RNA de células troncales no diferenciadas (CT), cuerpos embrionarios en el día 5 de la diferenciación (CE5) y cuerpos embrionarios en el día 10 de la diferenciación (CE10). Los resultados muestran la media más la desviación estándar de 4 experimentos.
A
B C
CONTROL
L-DOPA DOPAMINA
A
B C
CONTROL
L-DOPA DOPAMINA
Figura 42.-Expresión de mTH en cuerpos embrionarios de la línea E14. Detección de mTH mediante inmunohistoquímica fluorescente en un CE control (A), CE con L-DOPA (B) y un CE con dopamina (C) en el día 8 de experimento. (A, B y C) Los cuatro paneles muestran tinción con faloidina (rojo), inmunofluorescencia para mTH (verde), foto con luz visible del CE (foto inferior izquierda) y superposición de foto con luz visible, faloidina y mTH (foto inferior derecha).
100
RESULTADOS 19.-Células troncales: efecto de la L-DOPA y la dopamina sobre la diferenciación hacia
el linaje eritrocítico.
Durante el proceso de diferenciación a cardiomiocitos de la línea E14, se observó la
aparición de eritrocitos en aproximadamente el 60% de los CE diferenciados en condiciones
control (sin L-DOPA o dopamina) (Fig. 43 y Fig. 44), y su presencia no dependía de si el
CE presentaba áreas de latido o no. Sin embargo, ninguno de los CE diferenciados en
presencia de L-DOPA o dopamina contenía eritrocitos (Fig. 43 y Fig. 44).
A B CCONTROL L-DOPA Dopamina
A B CCONTROL L-DOPA Dopamina
Figura 43.-Ausencia de eritrocitos en los CE de E14 tratados con L-DOPA o dopamina. Fotos de un CE control (A), tratado con L-DOPA (B) o con dopamina (C) tomadas al final del experimento (día 10).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
NÚ
MER
O D
E C
Es C
ON
ER
ITR
OC
ITO
S
24/36 24/36 24/36 24/36 24/36
ControlL-DOPADopamina
66,6%58,3%
66,6%75%
54,2%
0% 0% 0% 0% 0%0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
NÚ
MER
O D
E C
Es C
ON
ER
ITR
OC
ITO
S
24/36 24/36 24/36 24/36 24/36
ControlL-DOPADopamina
66,6%58,3%
66,6%75%
54,2%
0% 0% 0% 0% 0%
Figura 44.-Cuantificación del número de CE en los que se detectó presencia de eritrocitos. Representación del número y porcentaje de CE controles, tratados con L-DOPA o dopamina, que presentaban eritrocitos el día 10 del experimento. En el eje de abscisas se muestra el número de CEanalizados en cada experimento, que fue de 24 para los controles, y 36 para los tratados con L-DOPA o dopamina. Se determinó la presencia de eritrocitos por la aparición de células con coloración rojiza dentro del CE.
101
RESULTADOS
Esta observación se confirmó cuando se midieron mediante RT-qPCR los niveles del
mRNA de la globina beta adulta (βGlobin) y los de la globina beta embrionaria (βH1) (Fig.
45). Además, analizamos la expresión de otros genes del linaje hematopoyético como SCL,
Runx1, CD34 y genes de linaje endotelial (FLK1 y CD31). Se observó un aumento en la
expresión de Runx1 y una disminución de los niveles de SCL, en respuesta a la adición de L-
DOPA y dopamina, mientras que en los otros marcadores no se observaron variaciones.
Aunque harán falta más experimentos para determinar el papel específico de L-DOPA y
dopamina en la hematopoyesis, estos resultados sugieren que ambas moléculas podrían estar
implicadas en este proceso.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
RUNX1SCL
FLK1
bH1
bGlobinCD31
CD34 BYPAX6
VAR
IAC
ION
ES R
ESPE
CTO
AL
CO
NTR
OL
C1 DM1DOPA1
ControlDopaminaL-DOPA
ββ
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
RUNX1SCL
FLK1
bH1
bGlobinCD31
CD34 BYPAX6
VAR
IAC
ION
ES R
ESPE
CTO
AL
CO
NTR
OL
C1 DM1DOPA1
ControlDopaminaL-DOPA
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
RUNX1SCL
FLK1
bH1
bGlobinCD31
CD34 BYPAX6
VAR
IAC
ION
ES R
ESPE
CTO
AL
CO
NTR
OL
C1 DM1DOPA1
ControlDopaminaL-DOPA
ββ
Figura 45.-Efecto de la L-DOPA y la dopamina en la hematopoyesis. El tratamiento con L-DOPA y dopamina se realizó en los CE durante 5 días desde el día del plaqueo de los mismos (día 5). Representación de los niveles de expresión de los mRNAs de Runx1, SCL, Flk1, βH1, βGlobin, CD31 y CD34 tras el tratamiento con L-DOPA o dopamina. Todos los valores se muestran corregidos por los niveles del 18S rRNA y relativizados con respecto al control al que se le dio el valor 1. Los resultados muestran la media más la desviación estándar de 3 experimentos.
102
V.-DISCUSIÓN
103
DISCUSIÓN
En esta Tesis Doctoral se caracteriza por primera vez la presencia de transcritos
quimera en embriones de pollo y codorniz, generados a partir de dos genes
independientes, el gen de la TH y el de la insulina. Las proteínas generadas por los
transcritos quimera son nuevas isoformas de la TH, que poseen menor actividad
enzimática que la TH canónica.
En este trabajo también se muestra la expresión del gen de la cTH desde los
estadios iniciales del desarrollo embrionario del corazón de pollo, previos al
establecimiento de las conexiones nerviosas. Además, se pone de manifiesto una
función totalmente nueva de la L-DOPA y la dopamina en la diferenciación de las
células cardíacas.
1.-Los transcritos quimera TH-INS1 y TH-INS2, una regulación inusual.
Los transcritos quimera TH-INS1 y TH-INS2 formados por la fusión del mRNA
de la TH y el de la insulina, comparten la misma secuencia de TH (los 12 primeros
exones y la parte 5’ del exón 13) pero difieren en la secuencia de insulina que contienen;
el TH-INS1 contiene los exones 2 y 3 mientras que el TH-INS2 sólo el exón 3 de la
insulina (Fig. 11). En la formación de ambas quimeras se excluye el codón de
terminación de la traducción de la TH, de tal forma que el marco de lectura de la TH se
prolonga con el de la insulina, aunque no mantiene la fase de lectura con éste. Las dos
nuevas isoformas de TH generadas a partir de los transcritos quimera comparten el
dominio regulador y catalítico con la TH canónica, pero carecen de los últimos 16
aminoácidos del extremo C-Terminal. La diferencia en el dominio de tetramerización
podría ser la causante de que ambas isoformas presenten entre 6-7 veces menos
actividad enzimática que la TH canónica. Experimentos previos por Vrana y
colaboradores (1994) apoyan esta posibilidad, ya que observaron que la ausencia de la
cremallera de leucinas del dominio de tetramerización no permite la oligomerización de
la proteína y disminuye en gran medida su actividad enzimática. Además, los niveles de
la proteína TH-INS1 en células transfectadas son significativamente inferiores a los de
las proteínas TH-INS2 y TH, debido a una mayor tasa de degradación. La inestabilidad
de la isoforma TH-INS1 podría ser debida a la extensión de 67 aminoácidos en el
dominio C-Terminal, ya que ésta es la principal diferencia respecto a la TH canónica y
única respecto a la TH-INS2. Aunque la comparación de esta secuencia con diferentes
bases de datos no dio homología con ninguna proteína conocida, es posible que en estos
67 aa exista alguna secuencia de reconocimiento por la maquinaria de degradación de
105
DISCUSIÓN proteínas, o bien la estructura secundaria generada por esta secuencia de lugar a un
plegamiento anómalo de la proteína que provocaría su rápida degradación.
El transcrito quimera TH-INS1 contiene también el marco de lectura de la
insulina, solapante con el de la TH. En células trasfectadas, este transcrito quimera
produce bajos pero detectables niveles de proinsulina (Hernández-Sánchez y cols., 2006
(referencia 92), por lo que también podría ser considerado como un transcrito
bicistrónico.
El transcrito TH-INS1, la quimera más abundante, se detecta desde gastrulación
(St4), y sus niveles aumentan entre gastrulación y neurulación (St8) (Fig. 13). El
análisis de la abundancia relativa del transcrito TH-INS1 respecto al mRNA de TH y de
insulina muestra que su proporción varía dependiendo del tejido (Fig. 14). Estos
resultados indican que los mRNA quimeras no son consecuencia de errores accidentales
en la terminación de la transcripción del gen de la TH. Es de esperar que tales errores
sean eventos estocásticos no regulados. Por el contrario, los niveles de expresión del
transcrito TH-INS1 están regulados en el desarrollo y son tejido-específicos. Además,
los niveles del mRNA de TH-INS1 en el embrión en neurulación son 3,5 veces
superiores a los encontrados en la Substantia nigra, a pesar de que los niveles de mRNA
de TH totales en el embrión St8 son 5,3 veces inferiores a los de la Substantia nigra
(Fig. 15). Este resultado rebate que las quimeras se originen por error transcripcional,
hipótesis que sería apoyada en el caso de encontrar mayor proporción de quimeras en
los tejidos donde el gen situado 5’ (TH) fuese más activo (como en la Substantia nigra).
Hay dos posibles mecanismos en el origen de los transcritos quimera. Por una
parte, se ha sugerido que las quimeras son consecuencia de una transcripción continua
del gen situado 5’, que ocurre de forma regulada como es el caso de muchos virus
(Pachl y Young, 1976; Masters y Samuel, 1984). Alternativamente, el mRNA quimera
se podría haber originado por el procesamiento en trans entre los pre-mRNA
individuales de cada gen, como ocurre en nemátodos y en algunos casos de mamíferos
(Sullivan y cols., 1991; Nilsen, 1989; Li y cols., 1999; Fischer and cols., 2008). Hay
varios hechos que, en nuestra opinión, favorecen la hipótesis de la transcripción
continuada en la generación de las quimeras TH-INS1 y 2: i) los genes de TH e insulina
se sitúan en el mismo cromosoma, en tándem y en la misma orientación; ii) la distancia
intergénica es relativamente corta en vertebrados; iii) la sintenia TH-insulina se
conserva desde invertebrados a mamíferos, hecho que hace pensar que esta disposición
en tándem está sujeta a presión selectiva para la formación de las quimeras. De todas
106
DISCUSIÓN formas, es necesario llevar a cabo experimentos específicos para descartar la hipótesis
del procesamiento en trans.
A pesar de que la sintenia TH-insulina se mantiene a lo largo de la filogenia,
sólo hemos podido encontrar las quimeras en otra especie avícola, la codorniz. No las
hemos detectado ni en ratón ni en Xenopus, donde sí encontramos expresión de los
transcritos individuales (datos no mostrados). Aunque estos resultados indican que la
formación de quimeras TH-INS está limitada a aves, es posible que en las otras especies
se restrinja a tejidos o estadios del desarrollo no analizados. Tampoco podemos
descartar que los niveles de expresión estén por debajo del límite de detección de la
técnica empleada o que las potenciales quimeras se constituyan de forma diferente a lo
descrito para pollo y codorniz.
TH-INS1 y TH-INS2 son los primeros transcritos quimera descritos en aves
generados a partir de las secuencias de dos genes endógenos. Previamente, Proux y
colaboradores en 1996, habían descrito la presencia de transcritos quimera en células de
neuro-retina de embrión de pollo infectadas con el retrovirus RAV-1, formadas por la
secuencia de un gen vírico y la secuencia de un gen endógeno de pollo.
Aunque se requieren más experimentos para entender la relevancia fisiológica de
la formación de quimeras TH-INS, nosotros hemos probado que al menos influyen en la
expresión de TH y de insulina. Primero se produce una disminución en los niveles de
los transcritos completos de TH e insulina, ya que una proporción de éstos pasaría a
formar parte de los transcritos quimera. En el caso de la transcripción continuada,
además, se restringiría la iniciación de la transcripción a nivel del promotor de la
insulina. En cuanto a la proteína, los niveles de TH e insulina generados por el transcrito
quimera TH-INS1 son significativamente inferiores a los producidos por los transcritos
completos de TH e insulina y las isoformas TH-INS 1 y 2 presentan menor actividad
enzimática que la forma canónica de TH. En conjunto, estos resultados sugieren que la
generación de las quimeras TH-INS aportan un nuevo nivel de regulación
transcripcional y post-transcripcional del locus TH/insulina. La secuenciación del
genoma de diferentes especies ha puesto de manifiesto que la complejidad biológica de
los organismos no reside exclusivamente en el número de genes de su genoma, sino que
cambios en los mecanismos de regulación también contribuyen a la generación de
complejidad y diversidad biológica.
107
DISCUSIÓN 2.-Expresión y actividad enzimática de la TH durante el desarrollo embrionario.
En los organismos postnatales, la expresión de la TH ha sido utilizada como
marcador de neuronas dopaminérgicas, noradrenérgicas y adrenérgicas. Sin embargo,
nosotros hemos visto que durante el desarrollo embrionario hay expresión del gen de la
TH en estadios previos a la formación de neuronas (E3,5). Además de encontrar el
mRNA y la proteína cTH, se detectaron L-DOPA y dopamina por HPLC (Fig. 26) en
estadios previos al establecimiento de conexiones nerviosas simpáticas en el embrión de
pollo (E5,5) (Miyakawa y cols., 2004). El mRNA de la cTH se encuentra asociado en
pollo desde estadios de gastrulación a las regiones pre-cardíacas y cardíacas. En St5
(gastrulación) mediante RT-qPCR se detecta el mRNA de la cTH enriquecido en la Hfr.
Posteriormente, en el embrión de St8, el transcrito de cTH se concentra en los
primordios cardiacos (Fig. 25), expresión que se mantiene en St9 y St10. Desde St11 a
St14, el mRNA de cTH detectado en el asa cardíaca se restringe a la región auricular
(Fig. 22E-H). En estadios previos a St8, no hemos detectado señal específica para el
mRNA de la cTH mediante hibridación in situ, aunque sí se detecta su presencia por
RT-PCR, probablemente debido a la diferencia de sensibilidad de ambas técnicas. La
expresión del mRNA de la cTH en la región cardíaca coincide ampliamente con la
observada para la proteína, aunque ésta se detecta por primera vez en St9,
probablemente debido al desfase entre síntesis de mRNA y de proteína. Además, entre
St12 y St14, por hibridación in situ, hemos encontrado expresión transitoria del mRNA
de cTH en la región caudal; sin embargo, no hemos observado correspondencia con la
expresión de la proteína. Esta discrepancia no parece ser debida al atrapamiento no
específico de la sonda utilizada en la hibridación in situ ya que secciones de esta región
caudal muestra señal específica en el ectodermo (Fig. 22K y L). Una posible
explicación es que el transcrito que se expresa en la región caudal produzca niveles muy
bajos o no produzca proteína como es el caso del transcrito quimera TH-INS1 descrito
anteriormente. En futuros experimentos se analizará la población de transcritos de cTH
de esa región.
Este resultado indica que la cTH embrionaria es enzimáticamente activa, aunque
no podemos descartar que parte de la L-DOPA y dopamina encontradas sean maternas,
captadas por el embrión a partir de la yema del huevo (Ignarro y Shideman, 1968). En
otras especies analizadas, también hemos encontrado expresión del gen de la TH en
etapas previas a la formación del tubo cardíaco. En el embrión de Xenopus se observó
expresión del gen de xTH desde la fase de neurulación (NF 14). Sin embargo, la L-
108
DISCUSIÓN DOPA y la dopamina se detectaron desde la gastrulación (NF 10). Esto puede ser
debido a que bajos niveles de mRNA de xTH (no detectables por RT-PCR) permitan la
acumulación significativa de L-DOPA y dopamina o que la L-DOPA y dopamina
encontradas en el embrión sean de aporte materno. Asimismo, en el embrión completo
de ratón se encontró por RT-PCR el mRNA de mTH desde la gastrulación (E6,5) (Fig.
34), y en corazón desde E8,5 en adelante (E. Martínez-Campos, comunicación personal).
Sin embargo, los repetidos intentos de caracterizar su patrón de expresión por
hibridación in situ e inmunohistoquímica en estadios tempranos han sido infructuosos.
Estos resultados indican que aunque haya expresión del gen de la mTH desde
gastrulación, los niveles de mRNA y proteína mTH (si se traduce) están por debajo de
la sensibilidad de dichas técnicas. Por otra parte, la L-DOPA y la dopamina se detectan
en embriones completos de ratón desde E7,5 (Fig. 35), y en corazones embrionarios
desde E8,5 (no mostrado). La L-DOPA y la dopamina encontradas en el embrión,
además de ser producidas por el propio embrión, podrían al menos en parte, ser
proporcionadas por la madre. De experimentos de Zhou y colaboradores (1995),
sabemos que la L-DOPA atraviesa la placenta, ya que el aporte exógeno de L-DOPA a
madres heterocigotas para el gen de TH rescata la letalidad embrionaria de los ratones
nulos de TH.
En estadios más avanzados, cuando el corazón está tabicado (E13,5), hemos
observado expresión de la proteína mTH en el nodo sinoauricular del corazón,
considerado el marcapasos del corazón (Fig. 36).
3. -Análisis del efecto de la L-DOPA y la dopamina en el desarrollo embrionario
del corazón de pollo.
La presencia de cTH desde los estadios iniciales del desarrollo del corazón,
previo a la inervación simpática (posterior a E5) (Kirby y cols., 1980), indica que las
catecolaminas podrían actuar de forma autocrina/paracrina en la formación del corazón.
Mediante la administración exógena de L-DOPA o de dopamina, hemos demostrado
que ambas inducen la expresión ectópica de diversos marcadores cardíacos, como los
factores de transcripción Nkx2.5 y Tbx5 (Fig. 27), implicados en la diferenciación del
linaje cardíaco, y las proteínas contráctiles AMHC-1 y VMHC-1 (Fig. 27). El análisis
de la ultraestructura de las células en las que se induce esta expresión muestra una
morfología similar a la de cardiomiocitos, con fibras contráctiles organizadas en
sarcómeras (Fig. 28).
109
DISCUSIÓN
La capacidad cardio-inductora de estas moléculas sólo se observa cuando son
administradas en regiones concretas del embrión, y en determinados estadios
embrionarios. Así, hemos observado que la L-DOPA no tiene efecto cuando se aplica
previamente al establecimiento de la Hfr, en las crestas germinales o en posición lateral
al Nódulo de Hensen en St4. Sin embargo, FGF2 y FGF4 aplicados en las crestas
germinales, sí inducen la expresión de marcadores cardíacos como Nkx2.5 (López-
Sánchez y cols., 2002). Por otro lado, en St5 sólo hay inducción cuando se aplica en
posición lateral pero no dentro de la Hfr (Fig. 29). Experimentos previos muestran que
el mesodermo embrionario presenta diferentes respuestas al mísmo estímulo. Así,
BMP2 induce la expresión de marcadores cardíacos en el mesodermo anterio-medial
(Schulteiss y cols., 1997), pero no en el mesodermo posterio-caudal (Barron y cols.,
2000).
Estos resultados sugieren que la L-DOPA tiene restringida su capacidad
inductora a una subpoblación concreta de precursores con potencialidad de
diferenciación cardiaca y/o su acción está condicionada a la presencia o ausencia de
otras señales inductoras o inhibitorias respectivamente. Asimismo, el bloqueo de la
producción endógena de L-DOPA y dopamina, mediante la administración de
inhibidores de las enzimas encargadas de su síntesis, inhibe la expresión de los mRNA
de las proteínas contráctiles AMHC-1 y VMHC-1 (Fig. 30), aunque no afecta a la
expresión del mRNA del factor de transcripción Tbx5. Estos resultados sugieren que la
L-DOPA y la dopamina embrionarias son necesarias para la expresión de las proteínas
contráctiles, pero no son imprescindibles para la expresión de Tbx5. El efecto de la
inhibición farmacológica de la actividad enzimática de la cTH endógena con 3-I-Tyr se
revierte a las 8 horas del tratamiento. La inhibición también fue transitoria cuando se
usó otro inhibidor de la TH, la AMPT, si bien éste en las células PC12 presenta un
efecto inhibitorio más potente y prolongado que la 3-I-Tyr (resultado no mostrado).
Aunque la L-DOPA ha sido clásicamente considerada sólo un producto
intermediario en la síntesis de catecolaminas (Fig. 1), en la retina embrionaria de ratón
se ha mostrado que también tiene una función biológica independiente de las
catecolaminas (Lavado y cols., 2006) y, recientemente, se ha identificado su receptor
(López y cols., 2008). No obstante, nuestros resultados sugieren que en el caso del
desarrollo cardiaco, la dopamina es la molécula biológicamente activa. La L-DOPA y la
dopamina estimulan los mismos genes (Fig. 27) y, tanto la inhibición de la producción
endógena de L-DOPA como la de dopamina, tienen el mismo efecto sobre la expresión
110
DISCUSIÓN de los genes cardiacos (Fig. 30). Probablemente, la L-DOPA aplicada exógenamente es
convertida por la AADC, enzima de expresión ubicua, en dopamina, la cual ejerce su
función sobre la expresión de los marcadores cardíacos.
Los experimentos de ganancia de función mediante la sobreexpresión del cDNA
de la cTH confirmaron la estimulación de la expresión de factores de transcripción y
proteínas contráctiles cardiacas (Fig. 32). Cabe resaltar que, a pesar de haber
sobreexpresión de cTH en células no integradas en el corazón de los embriones
electroporados, no se observó expresión ectópica de proteínas cardíacas en estas células.
Estos resultados, al igual que los de los implantes de microesferas impregnadas de L-
DOPA discutidos anteriormente, indican que la cTH sólo actúa sobre ciertas células con
capacidad de diferenciación a cardiomiocitos, o bien que su acción está condicionada a
la presencia o ausencia de otras señales.
Los experimentos de electroporación, además, han puesto de manifiesto otra
posible función de la cTH en la formación del corazón: la regulación de la
regionalización. Uno de los primeros eventos en la regionalización del corazón es la
especificación de los sectores auricular y ventricular, que se pone de manifiesto por la
restricción de la expresión de la miosina ventricular a la región rostral del tubo y de la
auricular a la región caudal (Bao y cols., 1999). La sobreexpresión de cTH que hemos
inducido en embriones de pollo, expande anteriormente el territorio de expresión de
AMHC-1 (Fig. 32I). Aunque estos resultados son preliminares, y es necesario
confirmarlos con el análisis de otros marcadores, sugieren que la TH interviene en la
regionalización o especificación del sector sinoauricular. Esta hipótesis también está
sustentada por el patrón de expresión de la TH endógena en el embrión de pollo: a partir
de St10-11 la expresión de cTH comienza a restringirse a la región caudal del tubo
cardíaco (Fig. 22D-H) que dará lugar a la región auricular y al nodo sinoauricular. En
embriones de pollo en St11, la región auricular actúa como marcapasos del corazón,
función que queda relegada al nodo sinoauricular en estadios posteriores. Igualmente,
en corazón de ratón de E13,5 hemos encontrado expresión de mTH específicamente en
el nodo sinoauricular (Fig. 36). Anteriormente, Ebert y Thompson (2001) habían
descrito la expresión transitoria de las enzimas de la ruta de biosíntesis de catecolaminas,
en regiones que dan lugar a los nodos sinoauricular y aurículo-ventricular. Incluso,
estudios recientes de linaje proponen que las células ICA (células productoras de
catecolaminas) son precursoras de todos los tipos celulares del corazón (Ebert and
Taylor, 2006; Ebert y cols., 2008).
111
DISCUSIÓN
En estudios preliminares de bloqueo de la expresión de cTH con morfolinos, los
embriones desarrollan corazones anormales y muestran una reducción en la expresión
de los mRNA de AMHC-1 y VMHC-1 (Fig. 33). Ante estos resultados, sorprende que
el ratón nulo para el gen de TH no presente mayores alteraciones estructurales. Aunque
no podemos descartar que esto sea debido a diferencias interespecíficas, es posible que
otras moléculas estén compensado la carencia de catecolaminas en el proceso de
cardiogénesis o que el aporte materno de catecolaminas supla al menos parcialmente el
déficit embrionario.
A la luz de nuestros resultados, y los de otros grupos, nos atrevemos a proponer
que la TH juega un papel importante en la cardiogénesis, primero permitiendo o
favoreciendo la diferenciación hacia el linaje de cardiomiocitos, y posteriormente en la
especificación del sistema de conducción, en particular del nodo sinoauricular. Esta
hipótesis encaja con la teoría propuesta en los años 50 del siglo pasado, en la que se
postulaba que en etapas tempranas del desarrollo embrionario los neurotransmisores
regularían actividades morfogenéticas como proliferacion, diferenciacion, movilidad
celular y metamorfosis. Uno de los casos más conocidos es el de la serotonina
(Buznikov, 1991; Buznikov y cols., 2001).
4.-Análisis del efecto de la L-DOPA y de la dopamina en la diferenciación de
células troncales.
Las células troncales se aislaron por primera vez en embriones pre-implantados
de ratón (Evans y Kaufman, 1981), y tienen la propiedad de que en cultivo se
diferencian a diferentes tipos celulares (Narayan y cols., 2006; Klug y cols., 1996;
Laflame y cols., 2005; Ben-Hur y cols., 2004; Keirstad y cols., 2005; Jiang y cols.,
2007), que podrían ser utilizados para terapia en medicina regenerativa.
En esta Tesis Doctoral hemos analizado el efecto de la L-DOPA y de la
dopamina en la diferenciación de las células troncales de ratón E14Tg2a.IV a
cardiomiocitos. Mediante el método de cultivo en “gota colgante”, las células troncales
forman estructuras tridimensionales denominadas CE, en los que aparece una
representación celular de las tres capas embrionarias. Posteriormente, comienzan a
aparecer áreas de latido (Boheler y cols., 2002). Dentro del CE coexisten cardiomiocitos
con diferente grado de diferenciación, desde más indiferenciados, similares a las células
“marcapaso” del corazón, a los más organizados, que se asemejan a cardiomiocitos
auriculares y ventriculares (Hescheler y cols., 1997).
112
DISCUSIÓN
Aunque la L-DOPA y la dopamina no afectaron al número de CE que
presentaban áreas de latido (Fig. 39), ni al número de áreas de latido por CE, ni a la
frecuencia de latido (datos no mostrados), se observó un aumento de la expresión de los
mRNA de los factores de transcripción implicados en el desarrollo cardíaco Nkx2.5,
GATA4 y Tbx5. La L-DOPA y la dopamina indujeron adicionalmente la expresión de
los mRNAs de las proteínas TT2 y α-MHC, implicadas en la contracción (Fig. 40).
Además, los CE expresan endógenamente el gen de la mTH (Fig. 41 y 42), y los niveles de
mRNA de mTH aumentan con la diferenciación, por lo que la mTH endógena podría estar
implicada en el proceso de diferenciación cardíaca de las células troncales. De hecho, en un
experimento preliminar hemos observado que el bloqueo farmacológico de la mTH
utilizando la 3-I-Tyr, inhibe la expresión de Nkx2.5, GATA4 y Tbx5 (datos no
mostrados). Estos resultados indicarían que la expresión endógena de la mTH en las
células troncales es necesaria para la diferenciación de estas células a cardiomiocitos.
Durante el proceso de diferenciación a cardiomiocitos, en un 60% de los CE
controles aparecieron de forma espontánea eritrocitos, no observándose nunca en los CE
tratados con L-DOPA o dopamina (Fig. 43 y 44). Además, tanto la L-DOPA como la
dopamina inhibieron la expresión de las globinas beta adulta y embrionaria (Fig. 45). Se
requieren más experimentos para dilucidar la función de la L-DOPA y de la dopamina
durante la hematopoyesis.
El incremento en los niveles de expresión de los mRNA de los factores de
transcripción y proteínas contráctiles, así como la inhibición de los niveles de expresión de
las globinas beta, es probable que sea debido exclusivamente a la acción de la L-DOPA o
dopamina, y no a la interacción de las mismas con otros factores, ya que el tratamiento se
realizó en medio sin suero.
La estimulación de la diferenciación de las células troncales a cardiomiocitos por la
L-DOPA y por la dopamina, tiene dos implicaciones fundamentales. Por un lado, nos
proporciona un sistema in vitro, que en gran parte recapitula el proceso de diferenciación
cardiaca in vivo, como sistema modelo donde analizar el mecanismo de acción de estas
moléculas. Además, podrían suponer un importante avance en la obtención de
cardiomiocitos a partir de células troncales o de precursores de diferente origen y su posterior
uso en terapia regenerativa. De hecho, parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han
dado lugar a la solicitud de una patente: “Uso de catecolamina para la diferenciación de
células madre a cardiomiocitos” (Solicitud España P200802422).
113
VI.-CONCLUSIONES
115
CONCLUSIONES
1.-Los transcritos quimera TH-INS1 y TH-INS2, identificados en embriones de pollo y
codorniz, están formados por la secuencia de 12 de los 13 exones del gen de la tirosina
hidroxilasa (TH) y el extremo 5´ del exón 13, fusionada a la secuencia de los exones 2 y
3 del gen de la insulina en el TH-INS1, o la secuencia del exón 3 del gen de la insulina
en el TH-INS2.
2.-Las proteínas formadas a partir de los transcritos TH-INS1 y TH-INS2 son formas
truncadas de la proteína TH que, en células transfectadas, presentan una actividad
enzimática 6 y 7 veces inferior al de la proteína TH canónica, respectivamente.
3.-La expresión del mRNA de la TH es detectada en embrión de pollo desde el St4
(gastrulación) por RT-qPCR, y desde el St8 (neurulación) por hibridación in situ,
restringida al mesodérmo esplácnico de la región cardíaca. Entre St11 y St14 la
expresión se localiza específicamente en la región auricular del corazón. El mRNA de la
TH también presenta una expresión transitoria en el ectodermo de la región caudal entre
St12 y St14. La expresión de la proteína TH es detectada desde el St9 en el mesodermo
esplácnico de la región cardíaca.
4.-En ratón, la expresión del mRNA de la TH también ha sido observada en embrión
completo desde E6,5 (gastrulación) por RT-PCR, y la expresión de la proteína TH está
presente en el corazón del E13,5, aunque restringida al nodo sinoauricular. En
embriones de Xenopus laevis, el mRNA de la TH es detectado desde NF 19, estadio
previo a la formación del tubo cardíaco.
5.-La L-DOPA y la dopamina administradas en embriones de pollo en cultivo, en
posición lateral al Hfr, inducen la expresión ectópica de los marcadores cardíacos
Nkx2.5, Tbx5, AMHC-1 y VMHC-1. Las células en las que se induce esta expresión
presentan morfología y ultraestructura similares a cardiomiocitos.
6.-La inhibición de la producción endógena de L-DOPA y de dopamina en embriones
de pollo, mediante el uso de inhibidores farmacológicos de las enzimas encargadas de
su síntesis, inhibe la expresión de los marcadores cardíacos AMHC-1 y VMHC-1.
117
CONCLUSIONES
7.-La sobreexpresión de la TH, mediante electroporación, en células de embrión de
pollo destinadas a formar parte del corazón, induce la expresión de los marcadores
cardíacos AMHC-1 y VMHC-1. El bloqueo de la expresión de la TH en embriones de
pollo mediante el uso de morfolinos inhibe la expresión de AMHC-1 y de VMHC-1.
8.-La L-DOPA y la dopamina inducen la expresión de los marcadores cardíacos Nkx2.5,
GATA4, Tbx5, troponina T2 y α-MHC durante la diferenciación de células troncales de
ratón a cardiomiocitos. La L-DOPA y la dopamina bloquean la diferenciación de las
células troncales de ratón al linaje eritrocítico.
9.-En conjunto, nuestros datos aportan la primera descripción de quimerismo inducido
por transcripción génica (TIC) en aves, en el locus TH-INS, y demuestran una función
de la enzima TH en la cardiogénesis.
118
VII.-BIBLIOGRAFÍA
119
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