TM. MSc. José Miguel Amaro
Novedades en el diagnóstico de laboratorio de hongos filamentosos y
levaduras
Examen microscópico directo
Medios de cultivos
Diagnóstico inmuno-micológico
Equipamiento en diagnóstico micológico
Actuales tecnologías
Taxonomía moderna
“The molecular revolution in fungal taxonomy
commenced in the early 1990s, with analyses of
PCR-amplified ribosomal RNA genes (White et
al. 1990). Today, fungal molecular systematics
is a mature discipline in which multi-locus
datasets, extensive taxon sampling, and
rigorous analytical approaches are standard.”
Hibbert DS et al., 2007, Mycological Res 111:509-547
1 hongo = 1 nombre
1 hongo = ¿que nombre?
Después del 1 de enero de 2013, un hongo sólo puede tener un nombre.
Un poco de taxonomía …
ejemplos Aspergillus sección Fumigati
5 clados
30 especies
Los mas significativos en clínica
A. fumigatus
A. lentulus
• Penicillium spp. en el subgenero Biverticillium ahora es género Talaromyces
•Talaromyces marneffei (Penicillium marneffei) •Talaromyces purpurogenus (Penicillium purpurogenum) •Talaromyces aurantiacus (Penicillium aurantiacum) •Talaromyces funiculosus (Penicillium funiculosum)
Examen microscópico directo Preparación a fresco - Para todo tipo de muestras - Observación directa (líquidos) y con clarificadores (con o sin colorantes) – Clarificador: Hidróxido de Potasio (KOH al 10 al 40%). + Glicerol + colorante (azul de Metileno, tinta china) + Dimetilsulfóxido (DMSO) + Lactofenol – Colorantes • Tinta china (de buena calidad) controlar • Calcofluor (microscopio de fluorescencia) controlar Preparación en Frotis – Para material líquido
tinción con Giemsa tinción de Gram
“Nubes” P.jiroveci en LBA (T.Giemsa) Dermatofitos en escamas de piel (KOH)
Paracoccidioides en exudado (T.Giemsa) Flujo vaginal (T.gram)
Cryptococcus en calcofluor Rhizopus sp. en calcofluor
Medios de cultivo
Primarios Básico: Agar Sabouraud-Glucosa (ASG).
Selectivo: ASG + cloranfenicol (CAF) y ASG + CAF + cicloheximida.
Indicador: agar lactrimel, agar cromogénico, DTM.
Secundarios Agar Papa dextrosa: hongos filamentosos Agar Corn Meal + T80: levaduras (microcultivo) Agar Urea de Christensen
Medios de cultivo
Susceptibilidad
RPMI 1640
MH+AM+ Glucosa
Medios de cultivo
Macro + Microscopía Observación a través de las paredes del tubo o placa:
estructuras reproductivas
Montajes directos: Lactofenol (con o sin colorante), azul de lactofenol
Microcultivos o cultivos en lámina
Serología Diagnóstico inmuno-micológico
Anticuerpos Inmunocompetente
Inmunocomprometido Antígenos
Antígenos Cryptococcus
Aglutinación en Látex Muestra: LCR, suero, orina Rápida y Sencilla ( ≈15 min) S 90 % ; E 100 % Detecta 3,2 – 12,5 ng/ml
Inmunocromatografía Muestra: LCR, suero, orina Rápida y Sencilla (≈15 min) S >95 %; E >95 % Pruebas cualitativa y cuantitativa Detecta 1,0 -1,5ng/ml
Antígenos Aspergillus-LFD
Ensayo inmunocromatográfico que detecta una glicoproteína extracelular de A. fumigatus
Tiempo: 20 min aprox
Muestra: suero y LBA
E 98%; S 81,8%
Detecta: ~30ng/ml
Utilidad de la prueba Aspergillus-LFD para el diagnóstico de aspergilosis: primera experiencia en Chile. Alvarez E. 2015
Antígenos Galactomanano - Técnica inmunoenzimática sandwich
- Tiempo: 4 hrs aprox.
- Muestra: suero y LBA
- Punto de corte: 0,5
- Detecta 1 ng/ml.
- S 78% E 81%
No antigénico β-1,3-glucano (BDG)
Método colorimétrico
Tiempo : 1 hr aprox.
S 50 al 90%
E 70 al 100%
Detecta : 60 pg / ml
Excepto en mucormycetes y Cryptococcus spp.
Usado en Pneumocystis jirovecii
BDG GMN
Aspergillus + + Fusarium
Candida + -
Mucormycetes - -
Utilidad de GMN - BDG
Anticuerpos Platelia Candida Ab/Ac/Ak (Bio-Rad)
Ensayo inmunoenzimático indirecto realizado en microplaca para la detección de anticuerpos antimanano de Candida en suero.
Tiempo ejecución 4 hrs aprox.
Punto de corte 5 UA/mL
Galerías bioquímicas
API 32 C
Api Candida
Fungichrom
Equipos
Hemocultivos
Botella Específica Botella recomendada
Equipos
Phoenix/ BD Vitek 2/ BMX
Identificación y sensibilidad Identificación
Antigüedad Presencia en Chile Costos determinación Venta/comodato Biblioteca
Tecnología MALDI-TOF
Biblioteca ≠ biblia
FilmArray
Detección de ADN fúngico A través de la reacción de la Polimerasa en cadena
PCR convencional o PCR Panfúngico
PCR a tiempo real (cuantificar, minimizar, identificar)
Comerciales:
PCR tiempo real de algunas especies de Candida y Aspergillus (Septifast Roche®), Aspergillus spp. o Pneumocystis jirovecii (MycAssay Aspergillus, MycAssay Pneumocystis, Myconostica Ltd).
Combined ITS and D1/D2 Mould Identification to Species Without Morphology: Can it be Done?
Sutton DA*, Thompson EH, Fothergill AW, Fan H, Lindner JR, Vadlamudi K, Wickes
BL, Furmaga WB, Wiederhold NP 2013
Sólo 96 de 292 (32,9%) aislamientos podrían ser identificados a nivel de especies utilizando ITS y D1 / D2 por sí solos y comparando con las secuencias disponibles en GenBank.
2/3 no pueden ser identificados solo comparando con la base de datos y sin conocer la morfología.
Mould Identification by ITS rDNA Sequencing: Ready for Prime Time in the Routine Lab?
Sutton, DA, Thompson EH, Fothergill AW, Wiederhold NP.
2013
38,1% no pudieron ser definitivamente identificado usando en el locus ITS combinado con características fenotípicas
N=462
Conclusiones Primera clave, Microscopio sigue siendo una herramienta clave
en el diagnóstico de hongos.
La segunda clave, personal capacitado, actualizado, con conocimientos y experiencia.
Mejorar uso de herramientas actuales.
La combinación de herramientas siempre hará nuestro diagnostico más certero.
No olvidar que las tecnologías actuales son una muy buena ayuda en el laboratorio, pero son parte de un complemento diagnóstico.
Muchas gracias por su atención.
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