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2장. 미생물의 분자육종
1. 돌연변이
2. 재조합
3. 대사제어발효
4. 유전자 조작
경북대학교 미생물공학연구실KNUmbl
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균주육종의 목적
생명현상은 유전자에 의해 결정--유전자 변화로 균주 육종 또는 개량 가능
-돌연변이, 유전적 재조합, 대사제어(조절)의 해제, 유전자 조작(유전공학)
균주 육종의 목적: 경제성, 관리 용이성
1) 산물의 수율 증대: 원료에 대한 수율 및 생산성 고--경제성
2) 값싼 기질 이용--경제성
3) 고농도 배지 성분에 대한 내성 증가--고농도발효법--시설 감소
: 내당성이 가장 중요
4) 발효시간의 단축--시설의 감소
5) 부산물 생산 감소--정제공정의 단순화--정제 및 제품화 용이
6) 점도 증가 및 거품 발생 감소--통기 목적
7) Phage에 대한 내성 증가
8) 새로운 대사산물의 생산
9) 기타 :
발효설비 및 공정에 적합
내열성 강(높은 발효온도에 내성)
생리적 성질의 안정성
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2-1. 돌연변이(mutation)
: DNA 구조 변화 -- 단백질의 변화 -- 세포 형질 변화 : 물질 합성, 분해 등 대사
* 표현형(phenotype) : 세포의 형질이 발현되는 형 -- Ura-, Trp-, Xyl-,
- 합성유전자의 변이로 합성효소 실활 : 합성불가
- 분해유전자의 변이로 분해효소 실활 : 분해불가
* 유전자형(genotype) : 유전자의 형태 표시
- 세균의 경우 : Xyl [WT] – xyl [mt]
- 효모의 경우 : XYL [WT] – xyl [mt]***유전자가 여러 개인 경우 번호 또는 알파벳 붙임 - URA3,
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1. 돌연변이와 수복기구
가. 돌연변이 기작
1) 유전자 변화: 유전자 염기서열의 변화염기치환(substitution)-점(point)변이 *GAT(Asp) - CAT(His), GCT(Ala) 염기부가(addition)/결실(deletion): 1개 이상 염기 첨가/결실: 구조이동변이
2) 유전자군 변화(chromosome mutation): 유전자의 순서가 변화유전자 중복(duplication): " 중복 a b c a b c d e유전자 전좌(translocation): " 위치 이동 a b d e c유전자 역위(inversion): " 위치 뒤바뀜 a b d c e
3) genome 변화(genome mutation) : chromosome의 수가 변화-개체에서 중요: 염색체의 이상으로 유전병 발생
(효모 2n=32, 사람 2n=46, 잉어 2n=104)-단수체 세균, 집단으로 존재하는 배수체 경우 - 무관 또는 특정 세포 문제
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나. 변이의 수복(repair) : 염기 변화 회복-- 원래의 유전형질 회복* UV에 의한 변이 : thymine dimer 형성 –복제 방해
1) Photoreactivation (광재부활)
2) Excision repair (제거수복)
3) Recombinational (재조합수복)
4) SOS 수복 : DNA polymerase에 이상
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다. 변이원(변이제, Mutagen): 변이를 유발시키는 물질--변이제가 수소결합 특성변화--염기쌍의 변화
1) HNO2(아질산): 염기 deamination(탈아미노반응) 촉매: base-NH2 + H2O -- base-OH + NH3
A(6-amino-Pu) to H, C(2-oxy-4-amino-Py) to U의 deamination--변이G(2-amino-6-oxy Pu) to X(C와 base pair) : 변이 X
2) Alkylating agent(알킬화제): 염기를 alkylation-주로 ethylation or methylation--주로 G의 7 위치-염기의 수소결합 특성 변화 - 복제 시 GC to AT-UV외에 가장 강력--모든 생물에 적용예) sulfate 계: DMS, DES(sulfate),
sulfonate 계: EMS, MMS, EES(sulfonate)
O∥
R-O-S-O-R'∥Osulfate
O∥R-S-O-R'∥Osulfonate
Cytosine
Adenine
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3) 염기유사물질(Base analog)
: 5-Bromouracil(A or G 와 염기쌍), 2-Aminopurine(T or C와 염기쌍)
* 5-BU (bromouracil)
-복제 시 T 대신 삽입하여 A와 base pair--tautomerization 후 G와 pair
4) NTG(MNNG, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)
G 를 7-methyl G로 변화(T와 base pair로 GC to AT)
--세균, 방선균, 효모, 곰팡이, 동식물
NH2NH=C
NH2guanidine
CH3N
NH=C NONH-NO2 MNNG
keto form: A와 수소결합 enol form: G와 수소결합
CH3이면 thymine
Tautom eri zationH
OH
N
N
BrN
N
H
H
O
O
H
Br
H
O1
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5) acridine 유도체: intercalating reagent
: DNA 1bp와 길이 유사
- acriflavine, proflavine, acridine orange 등
- G와 결합하여 인접 bp 사이에 intercalation
- 복제 시 염기 결실 및 첨가: frame shift
6) 자외선(UV radiation): 15W, 10-40㎝, 10-70sec
가) 단파장 UV(200-300nM): pyrimidine dimer 또는 GC to AT
- 암실이나 600㎚ 이상에서 또는 repair inhibitor(ex. caffeine)처리
나) 장파장 UV(300-400nM): 변이력 약
- 상보적 가닥과 cross-link되어 변이
- photoreactivation X
7) NH2OH(hydroxylamine)
Cytosine + NH2OH -- 2-oxy-4-hydroxylamine Py + NH3
A와 염기 쌍 형성
8) Transposable elements : DNA의 임의부위에 삽입
- 다른 유전자의 중간에 삽입되어 그 유전자를 변이
- 어떤 것은 전사종지 신호 함유
NHOH
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* Transposable element의 특성
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1) Transposition-증식 중 genome의 임의의 부위에 삽입-B에 transposon이 생겨남
2) Transposable element의 duplication: 동일 DNA상에 transposon이 하나 더 생겨남
3) Transposable element의 insertion: 여러 부위에 insertion 가능
TnpA(transposase)
B+A A
B
cointegrate:transposon이 duplicate
A + BTnpR(resolvase)
WT DNA Tn
or or
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2. 변이주의 종류-대사산물의 생산량 감소, 대사산물의 다량생산 (주목적) : 생화학적 변이주
가. 변이주의 종류
1) 영양요구성 변이주 (auxotrophic mutant) : 생육에 특정 영양물질 요구
: Ura-, His-, Ade- (phenotype)
2) 대사조절 변이주 (regulatory mutant): 대사조절 단백질 변이 –조절현상 변화
: gal80, xylR, arg80 (argRI), arg81 (argRII), car80 (cargRI) 등
3) 내성 변이주 (resistant mutant) : drug, analog에 대한 내성이 변화
– 저항성, 감수성 : Apr, 5-FTr, Mets
4) 치사변이주 (lethal mutant) : 생명현상에 중요한 유전자의 변이–변이주 사멸
5) 조건 치사변이주 (conditionally lethal mutant)
: 특정조건에서 생육이 불가능한 변이주
* 온도 감수성 변이주--30, 42oC --DNA polymerase I 조건치사 변이 경우
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나. 변이의 종류
1) 변이제 사용 유무에 따라
가) 자연변이(spontaneous mutation) : 변이제 사용 무---10-6-10-7/generation
나) 인공변이(artificial mutation=induced mutation) : 변이제 사용하여 변이
2) 변화부위에 따라
가) Point mutation : 한 개의 염기쌍이 변화한 것
나) Multiple mutation : 두 개 이상의 염기쌍이 변화
3) 아미노산의 변화에 따라 ***유전암호 : ..\유전암호.ppt
가) Same sense mutation : 변화 무 – GCG, GCA, GCT, GCC 모두 Ala 암호화
나) Missense mutation : 다른 아미노산으로 변화
다) Nonsense mutation : 중간에 stop codon 생성
4) 기타
가) Temperature sensitive mutation (ts mutation, 온도감수성 변이)
: 특정온도에서만 변이 발현(high or low temperature)
나) 구조이동변이 (frame shift mutation) : 변이부위 이하의 모든 코돈이 변화
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다. 복귀 돌연변이 (reversion) : back mutation, reverse mutation
: 2차 변이에 의해 원래의 표현형을 회복하는 현상
-- 원래 유전자형을 회복하는 경우 및 회복 못하는 경우 두 가지 모두
1) 원래 유전자형을 회복하는 경우
: 변이 부위가 원래의 염기서열로 변화하여 유전자형 회복
- 치환된 염기쌍이 변이에 의해 원래로 되돌아 감
삽입된 염기쌍의 deletion
결실된 염기쌍이 insertion
- 실제로는 거의 무
2) 원래 유전자형을 회복 못하는 경우 : 대부분
: 동일부위 및 다른 부위의 재변이로 원래의 표현형을 회복
- 변이 유전자 내부(intragenic reversion), 외부(intergenic reversion) 재변이
표현형질
wild type mutant typemutation
reversion
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가) Intragenic reversion: 동일 유전자내 재변이에 의해 원래 표현형을 회복
(1) Charged amino acid의 경우
* 아미노산의 전하
- pH의 변화에 따라 하전 변화
* 산성 및 염기성아미노산 – 단백질 구조에 중요- Asp. Glu. : 산성아미노산
- His. Arg. Lys. : 염기성 아미노산
* 변이: 아미노산이 반대 하전의 아미노산으로 변화: 단백질 3차구조 변화
- 변이 아미노산이 원래 동일 아미노산으로 변화 - 염기서열 다를 수 있음
- 변이 아미노산이 원래 하전의 다른 아미노산으로 변화
- 변이부위 원래 아미노산과의 결합부위가 반대 하전의 아미노산으로 변화
+
-
-
+
+
-or+ +mutation reversion
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(2) Hydrophobic region의 경우
: 변이 아미노산과의 결합부위가 비공유결합 가능 아미노산으로 변이
(3) 구조이동변이(frame shift 변이)의 경우
: 변이 하류의 재변이에 의해 reading frame이 회복
-- 재변이는 변이에 인접하는 부위에서 발생
-- 몇 개의 아미노산은 변화할 수 있음
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나) intergenic reversion : 다른 유전자의 재변이에 의해 원래 표현형을 회복
(1) protein-protein interaction : 한 단백질이 두개 이상의 subunit로 구성된 경우
- 변이 : protein A의 변화로 protein B와 interaction 불가능: 표현형이 변화
- reversion : protein B가 변이된 단배질 A와 interaction 가능하게 변화
(2) chain termination mutation : 번역 stop codon의 생성
: GAG, AAG, CAG, TGG, TTG, TCG, TAT, TAC--- 1bp의 변화로 TAG 생성
- 아미노산을 연결하는 경우 가끔 있음 : suppression
(3) missense mutation의 경우
Val(nonpolar) - 변이로 Asp(polar) - suppression에 의해 Ala(nonpolar)로 번역
- mutant tRNA : anticodon의 변화로 두개의 코돈 동일하게 인식 가능
* missense suppressor tRNA
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Reversion(=back mutation)을 이용한 발암물질의 검색
- Ames test – Bruce Ames 개발
: 미생물을 이용한 특정 물질의 돌연변이원성의 조사
His-
생육에 histidine 요구최소 배지에 생육불가능
His+
최소 배지에서 생육가능Mutagen(possible carcinogen)
2nd mutation
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균주 및 방법
1) 균주: Salmonella enterica serovar. Typhimurium TA98과 TA100
: His- : histidine 요구주 - 염기치환 또는 구조이동 변이주
- histidine이 없는 최소배지에서 생육 불가
- 일부 복귀돌연변이는 가능
- histidine이 없는 최소배지에서 소수의 콜로니 형성
2) 배지: 고체 최소배지 - 미량의 histidine을 함유
: 변이주 약간의 균체가 증식 가능, 그러나 콜로니 형성 불가능 정도의 양
3) 방법
: 위의 고체 배지에 His- 균체 (조사물질 혼합 및 미혼합) 도말 배양
: 각각의 경우의 형성한 콜로니 수 조사
: 조사물질 첨가 경우 무첨가보다 콜로니 수 증가 : 돌연변이원성 유
: 콜로니 수의 차이에 따라 변이원성 강도 추정
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-식품 추출물 첨가하여 최소배지에 생육하면 식품이 돌연변이원성 여부 결정-변이제와 식품추출물 첨가 시 최소배지에 생육 안하면 식품이 항돌연변이원성
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3. 돌연변이주의 유도와 분리
가. 미생물의 성상
1) 세균, 효모 : 단수체(haploid, 1배체, n체) 세포 사용
-배수체 열성의 경우 변이 발현 X --상동염색체
-초기 대수증식기의 세포가 유리: 원심분리 후 세척하여 사용
2) 방선균, 곰팡이: 포자 이용(포자분리 설명) - 염색체 간단, 높은 변이빈도
나. 처리방법
: 변이 처리시의 세포농도: 10 8 cfu/ml가 적당--99% 사멸 시 10 6 cfu/ml
: 온도, pH, mutagen 농도, exposure time, growth phase
* 변이율 : 변이의 빈도 - 사멸율과 직접 관련
- 적당한 사멸율 조건에서 처리하는 것이 중요
사멸율% = (처리 전 생세포 수 - 처리후 생세포 수)/ 처리전 생세포 수 × 100
생존율% = 처리후의 생세포 수 / 처리전 생세포 수 × 100
* 사멸곡선(death curve, dose response curve) = 생존곡선(survival curve)
: 변이제 처리량 또는 처리시간에 따른 미생물 사멸율(생존율) 관계
- UV: 사멸율 99% - 99.9%, MNNG: 사멸율 50%에서 변이 최대
처리량 또는 처리시간
생존율%
사멸율%
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C. 변이주의 분리 및 선별
1) 직접선별법: 내성변이주(resistant mutant)--특정 조건에서 생육가능 변이주
-항생제 내성 변이주: 변이제 처리 후 항생제 첨가배지에서 분리
--내성이 없는 친주 세포 사멸
-Analog 내성 변이주: 대부분이 대사조절 변이주
2) 간접선별법: 특정 조건에서 생육이 불가능한 변이주
-친주만 생육하게 배양--증식하는 세포를 제거
-변이주 빈도 10-100배 농축(농축법)
-후에 복사법으로 변이주 생육 가능 및 불가능 조건에서 분별
가) 페니실린 농축법(penicillin screening) : 세균
-변이제 처리 후 친주만 자라게 배양—Pen처리나) 여과 농축법(filteration enrichment): 포자
-변이제 처리 후 친주만 자라게 배양 여과(균사만 제거)
약제첨가배지, 일반배지
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2-2. 재조합
* 재조합(genetic recombination)—세포 내 유전자 재조합을 유도
: 새로운 형질을 가진 개체의 생성 --유리한 형질을 가진 세포가 목적
1. 교배(mating) : 세포와 세포 접촉에 의한 DNA의 이동
- 2n체 세포의 경우 : 배우자간의 교잡에 의한 재조합
- 다른 유전자도 동시에 이동--몇 세대에 걸쳐 선별--근연의 종에 한정
2. 접합(conjugation) : 세균의 경우
: F 플라스미드가 성선모를 통하여 일부의 유전자 이동—conjugation
***접합 : ..\접합.ppt
AAbb ----- Ab
diploid gamete mating ----- AaBb
aaBB ----- aB
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3. 형질전환(transformation)
: 공여세포(donor)로부터 분리한 DNA를 직접 수용세포(recipient)에 이동
1) Competent cell : DNA 분자의 흡수능력이 있는 세포
--화학적처리: CaCl2 처리: E. coli, LiAc 처리: S. cerevisiae
2) 전기충격법(electroporation): 수만 볼트로 순간적 충격
4. 형질도입(transduction): 바이러스에 의한 유전자 이동 ***..\바이러스생활사.ppt
5. 세포융합(cell fusion)
: 세포벽을 제거한 원형질체(protoplast)의 융합(fusion)에 의한 DNA의 이동
--원래는 고등동식물에 처음 사용--미생물에도 이용 가능
1) 세포벽의 제거: 세포의 protoplast(원형질체) 화
* 세포벽 용해효소: Zymolyase, lysozyme, chitinase, cellulase
2) 원형질체 융합 : 두 개의 원형질체 혼합--융합촉진제 PEG 첨가
3) 융합체(fusant)의 재생(regeneration) : 재생용 최소배지
4) 융합체의 선별 및 분리
용균
용원화 유발
임의 부위염색체 DNA 함유
특정 부위염색체 DNA 함유
다른 수용세포에 감염:염색체 DNA도 동시 이동
파아지 감염
염색체 DNA
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2-3. 대사제어발효
1. 대사 조절
가. 대사조절 현상
1) 특정 기질이 증가
ㅇ 기질대사 효소들의 활성 증가: 효소 활성화, 활성촉진(enzyme activation)
ㅇ " 합성 증가: 효소의 유도(enzyme induction)
ㅇ 타 기질 대사효소의 합성 감소: 이화물 억제 (catabolite repression)
2) 특정 최종산물의 증가 : 최종산물조절--최종산물 저해, 최종산물 억제
ㅇ 최종산물 합성 효소들의 활성 감소: 최종산물 저해 (feedback inhibition)
ㅇ " 합성 감소: 최종산물 억제 (feedback repression)
* 단순조절(coordinate regulation)
: 단일경로에서 최종산물에 의해 효소의 합성 및 활성이 조절
-대부분의 경우 합성 조절의 경우 모든 효소의 합성을 조절,
활성 조절의 경우 key 효소의 활성만 조절
-위피드백 조절 (pseudo-feed back R.) : 최종산물 analogue에 의한 조절
A ── B ── C ── D ── E A ── B ── C ── D ── E
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나. 대사조절기구
1) 효소활성의 조절 : allosteric 효소 - 효과물질에 의한 효소 자체의 구조변화
2) 효소합성의 조절--효과물질에 의한 조절단백의 구조변화--효소합성 조절
다. 분지 대사경로에 있어서 최종산물조절의 양상
1) 협조적 조절(concerted R.): 최종 산물들의 협조적 작용에 의해서만 조절
--E: 조절X, G: 조절 X, E+G: 조절 가능
2) 누적적 조절(cumulative R.): 각각의 최종산물이 일정비율로 조절
--E+G에 의한 조절 = E에 의한 조절 + G에 의한 조절
┌─ D ── E
A ── B ── C ─┤
└─ F ── G
┌─ D ── E
A ── B ── C ─┤
└─ F ── G
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3) 공동적(협동적) 조절(cooperative R.)
: 각각이 약하게 조절, 공동적으로는 각각 합보다 강하게 조절
--E+G에 의한 조절 > E에 의한 조절 + G에 의한 조절
4) Isozyme의 조절: 각각의 최종산물이 isozyme 하나씩만 조절
5) 연쇄적 조절(sequential R) : 최종 산물이 중간산물의 합성 조절
-그 전 단계 대사산물이 축적되어 조절에 관여
┌─ D ── EA ── B ── C ─┤
└─ F ── G
┌─ D ── EA ==== B ── C ─┤
└─ F ── G
┌─ D ── EA ── B ── C ─┤
└─ F ── G
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2. 대사제어발효 : 대사 조절기구 파괴--필요한 대사산물을 축적
가. 1차 대사산물 : 생명유지 필수적 대사산물
--aa, nucleotide, vitamin, 지방산, 당류 – 대부분이 단일경로로 합성1) 최종산물 조절의 해제 ..\대사연관성.ppt
가) 영양 요구성 변이주의 이용: 중간산물 생산 시
--C를 생산: P의 세포 내 농도를 감소시켜야 함
--E3를 변이: C 축적, P 생산 불가 - 배지에 P를 저농도로 첨가해 주어야 생육
나) Analog(ue) 내성변이주의 이용 : 최종산물 생산 시
--유사물질: 대사산물과 화학구조 유사하나 대사는 안됨
* 배지에 최종산물 analog 다량 첨가 – 세포가 최종산물 생산 X - 생육 불가- 생육하는 세포 analog에 의한 조절 해제 (analog 내성 변이주)
- 최종산물에 의한 조절 해제로 최종산물의 생산량 증가
A ── B ── C ── ── P : P는 최종산물로서 E1의 effector, 세포내 일정농도 유지E1 E2 E3
A ── B ── C ── ── PE1 E2 E3 P analog
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다) 복귀돌연변이주의 이용
: 결손된 효소가 다시 합성(효소의 변화)되어 산물 생성--조절 안됨
라) 세포막 투과성의 개량
- 세포막의 인위적 손상, 세포막 이상 변이주
- 산물을 세포 외 분비--조절해제--배지에 축적
예) 글리세롤 요구주에 글리세롤 제한농도 첨가
마) 대사의 bypass : 조절을 받지 않는 기질 또는 전구물질 첨가하여 생산 유도
2) 이화물억제의 해제
가) 탄소원 이화물 억제(CCR-carbon catabolite repression)
: 포도당이 다른 탄소원 이용 방해 (유도효소의 합성 방해) : 포도당 효과
- 이화물 억제 저항성 변이주: 포도당 존재 하에서도 효소가 유도되는 변이주
- 배양조건 개선: 포도당(0.05% 이하) 조금씩 첨가—유가배양 또는 연속배양
나) 질소원 이화물 억제(NCR-Nitrogen catabolite repression)
: 황산암모늄, Asn. 등 – 다른 질소원 이용 방해
- 저항성변이주, 배양조건 개선 등
A ── B ── C ── ── PE1 E2 E3 기질을 A' 또는 B, C 사용--- P 축적
A'
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나. 2차대사산물: 생명유지에 비필수적인 대사산물
예) 항생물질, 색소, 독소 등--대부분 분지경로
1) 효소의 유도
--영양증식기(trophophase)와 생산기(idiophase) 다름
: 증식 말기에 key enzyme 유도되어 생산 - 변이주
2) 최종산물 조절의 해제
가) 영양요구 변이주: C--x---D--배지에 미량의 E 첨가
: C가 전부 X로 전환되어 Z 증가
나) 전구물질 첨가: 배지에 X 첨가--영양증식기에도 생산 가능
3) 이화물 억제의 해제: 1차대사산물의 경우와 동일
4) 무기인산에 의한 조절의 해제
--최적 인산 농도 유지, 인산조절기구 해제 변이주
* 인산: 1차대사 촉진(0.3-300mM), phosphatase의 억제 및 저해
가) 너무 적으면: 균의 생육 불량--균체량 감소
나) 너무 많으면: 2차산물 중간산물 인산화된 상태가 주
--인산 이탈반응 감소로 2차산물 생산 감소
A ── B ── C ── D ── E : 1차대사--- 영양증시기│X ── Y ── Z : 2차대사--- 생산기
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2-4. 유전자 조작 (gene manipulation)
* 유전자 조작=재조합 DNA(recombinant DNA technology)=(분자) 클로닝
: 타종간의 형질 이동 가능--insulin, 성장 호르몬, interferon etc
1. 유전자 조작에 사용되는 효소들
1) 제한효소(restriction enzyme, restriction endonuclease)
: 특정 염기서열을 인식하여 절단하는 endonuclease의 일종
예) EcoRI : GAATTC (접착말단 - cohesive end) - 같은 말단 DNA 연결 가능
예) SmaI : CCCGGG (평활말단 - blunt end) - 아무 평활말단 DNA와 연결 가능
2) Ligase : DNA 두 분자를 서로 연결하는 효소--주로 T4 DNA ligase 사용
3) DNA polymerase : Klenow fragment, T4 DNA polymerase – DNA 인위합성
GAATTCCTTAAG
AATTCG
GCTTAA
CCCGGGGGGCCC
GGGCCC
CCCGGG
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2. 유전자 조작과정
1) 벡터의 절단
2) 외래 DNA 준비
3) 벡터와 외래 유전자의 연결
4) 수용세포 도입
5) 재조합유전자의 발현
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3. 유전자 조작의 개요
가. 목적으로 하는 유전자의 추출, 정제 또는 화학합성
- 외래 DNA(foreign DNA= passenger DNA)
1) 목적 유전자 함유 DNA를 제한효소 절단 후 분리
2) DNA의 합성
가) cDNA : complimentary DNA (상보성 DNA)-mRNA로부터 만든 DNA
***..\DNA로부터 단백질 합성.ppt
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나) 화학합성 : 단백질의 아미노산 서열로부터 코돈에 따라 DNA 합성
* somatostatin : somatotropin release inhibiting hormone (SIH)
- somatotropin(growth hormone), insulin, gastrin 등 분비 저해 호르몬
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다) PCR을 이용한 합성
: 염기서열을 기초로 합성한 프라이머로 특정 DNA 부분을 대량 증폭
반응혼합액 : 주형DNA, primer, dNTP, Taq DNA polymerase, buffer, Mg++ - denaturation(고온) – annealing (저온) – polymerization (72oC) 반복
***PCR : ..\zPCR.
주형 DNA
프라이머
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나. 운반체 DNA(vector, cloning vehicle)와 in vitro 연결 - 재조합 DNA
- 운반체 DNA : 주로 vector plasmid 사용
- 운반체 DNA의 특성: 복제기점, 선택 marker, 클로닝 부위 (절단하여 사용)
- 주로 플라스미드 DNA
pBR322
(4361bp)
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플라스미드
* 플라스미드 : small circular DNA elements
-대부분 세균 세포들이 함유, 일부 진핵미생물도 함유
-다른 세포로 비교적 쉽게 이동 가능
-염색체 DNA와 별개로 독자적 복제 가능
-고복제수(high copy number) 및 저복제수(low copy number) 플라스미드
-종류
1) 약제저항성 : Resistant plasmid
2) 물질의 분해 : Degradation plasmid
3) 성에 관여 : Fertility plasmid
4) 항균성물질 생산 : Col plasmid
세균세포
plasmid
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플라스미드 DNA의 분리
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SDS, NaOH 처리
고농도 염 중화
원심분리하여 상등액모아서 에탄올 침전
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다. 수용세포 또는 숙주세포(host cell)내로 도입 --형질전환
- 화학적 방법 및 전기적 방법
라. 형질전환 세포 검출 및 개량 : 형질전환체의 검출
- 수많은 클론 중 목적 클론의 분리, 목적 유전자 분리 및 산물의 검정
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M : DNA size marker1, 4 : 벡터 플라스미드2, 5 : DNA 단편3, 6 : 재조합 플라스미드
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* Agarose gel 전기영동 – DNA 전기영동
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◆ Agarose gel 전기영동 (electrophoresis)
: agarose gel 전기영동 - EtBr 염색 후 UV 하 관찰 – 크기에 따라 분리 확인
* agarose : 고온에서 용해, 저온에서 응고
전기영동장치
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* Polyacrylamide gel 전기영동 – 단백질 전기영동
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* 단백질의 대량생산 예
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