Wang j tm shift primers-final_2

Eco-Efficient Agriculture for the Poor

High-throughput SNP genotyping by

single-tube PCR with Tm-shift primers

Claritza M.G

Wang Jun et al .2005


INTRODUCTION:


Perfil de Amplificación

Hot Start 95°C 12 min

1 95°C 20 seg Denaturac

2 Tm 1min Annealing

3 72°C 30 seg 40 ciclos Extension

5 72°C 5 min Ext. Final

6 10°C 5 min

Condiciones _Articulo (wang,J. 2005)

Reactivos [ ] Stock [ ] Final VT= 15µL

Agua - - 2.1 µL

Buffer 10X 1X 1.5 µL

MgCl2 25 mM 2 mM 1.2 µL

dNTPs 20 mM 0.2 mM 0.15 µL

Primer Fa 10 µM 0.2 µM 0.3 µL

Primer Fb 10 µM 0.2 µM 0.3 µL

Primer R 10 µM 0.2 µM 0.3 µL

SyBRGreen 1X 0.2X 3 µL

DMSO 100% 5% 0.75µL

Rox Dye 10 µM 0.25 µM 1 µL

Taq _Gold 5 U/ µL 1.8 U 0.4 µL

D N A 4 ng/µL 1 ng/µL 4 µL


Primer Design

Primer alelo especifico Primer común ( PR)

1.)Tm = 59 -62°C 1.) Tm = 63-70°C

2.)Longitud = 15 -22 pb ó 15-27 pb 2.) Longitud = 22-27 pb

3.) Adicionar en su extremo 5': 3.) Se diseña a 20 pb del SNP

a.)Short-GC = 6 pb al primer con menor Tm ( que tiene 3´A ó T)

b.) Long-GC= 14 pb al primer con mayor Tm ( que tiene 3´G ó C)

4.) Adicionar en su extremo 3' 1 base que identifica el SNP

Tamaño del Amplicon: 40 - 80 pb

SNP

Primer Fa

Primer Fb

Primer R

Primers alelo especificos


Análisis de datos y llamando al genotipo

Análisis de las curvas de melting

Algoritmo de agrupamiento k-medias que calsifica las muestras en 4 categorias basadas en el

centroide más cercano: el programa marca las muestras que pertenecen a un grupo en particular

( t- stadistico alto).Las muestras que se desplazan 1°C después de la normalización: son muestras atipicas

Se utiliza el programaSDS2.1 compatible con el ABI para calcular la derivada negativa del cambio

de fluoresencia:

los valores de melting son exportados a archivo de texto: hoja de Excel ó a un software inde

pendiente que realiza una serie de algoritmos de normalización que permiten lectura semi

automática de los genotipos: Trazan sobre cada muestra un grafico de dispersión de los datos

integrados del area de los 2 picos


Secuencia 26 pb-GC: 1.)Inicialmente Long –GC (26 pb) a 1 solo primer_ éste alelo predominaba en el PCR 2.)En la versión avanzada ( Figura 1):Short-GC (6pb)/ Long –GC (14 pb) a ambos primers. Diferencia de 8 pb permitio proporcionar la temp adecuada para discriminar alelos por diferencias en el Tm 3.)Otras combinaciones. Diferencia de 7-8 pb 4.)La combinación 6 GC/14GC fue la más exitosa en terminos de proporcionar la temp adecuada para discriminar alelos


Principio de método Método de validación


Taq

1.)Mejora la especificidad y discrimina mismatches entre primer-molde

2.)Anticuerpos Antitaq, pueden ser utilizados para un hot start de ésta

enzima y obtener resultados similares a Taq Gold

3.) Mastermix con 40 mM KCl incremente la especificidad y evita

la extensionde primers mismatched

Buffer 10X PH=8 ( 500 mM KCL;100mM T/HCL; 1% Triton x-100; 1mg/ml BSA)

Taq fragmento Stoffel

1.) Mejora mucho más las especificidad y mínimiza la formación

de dimeros de primers

2.) Se activa con calor :Utiliza un hot start ( 95°C por 12 minutos)

Nota : Para la mayoria de las pruebas Taq fragmento stoffel

y taq Gold trabajaron igualmente bien

Taq Gold_version frag Stoffel

Prueba de validación para incrementar la especificidad alelica en el PCR


Genotype Calling


Ventajas de genotipar por Tm shift


KBIOSCIENCE

How KASP work

Kompetitive Allele Specific PCR


X = Datos integrados para el alelo 1

Y = datos integrados para el alelo 2

Allele discrimination SNP Data


GRACIAS

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Technology

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